DE69328527T2 - Carboxypeptidase-ähnliches Protein aus Knochen und Verfahren zur dessen Herstellung - Google Patents

Description

• Die Erfindung betrifft ein neues knochenverwandtes Protein. Unter der Bezeichnung OSF-5 gehört dieses Protein zu einer Gruppe von Carboxypeptidasemolekülen. Das OSF-5 kann aus Knochengewebe eines Säugers einschließlich Maus oder Mensch erhalten werden. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur - Produktion des OSF-5 durch rekombinante DNA-Technik unter Verwendung gezüchteter Zellen, wie tierischer Zellen.[0001]
• Metabolische Knochenerkrankungen umfassen Osteoporose, Paget-Erkrankung, Osteomalazie, Hyperostose und Osteopetrose. Osteoporose insbesondere trifft häufig genug auf, um etwa mehr als die Hälfte der Frauen nach der Menopause und ältere Menschen zu befallen, und effektive Methoden für deren Diagnose und Behandlung sind in hohem Maße erwünscht.[0002]
• Metabolische Knochenerkrankungen betreffen eine gewisse Störung des Knochenmetabolismus auf der zellulären Ebene im Knochengewebe. Die Entdeckung, Isolierung und Identifikation von Faktoren, die spezifisch mit dem Knochenmetabolismus assoziiert sind, sind sehr effektiv, um diese Störung zu erhellen.[0003]
• Eine Zelllinie von Osteoblasten, die eine Hauptrolle bei der Osteogenese spielen, wurde erfindungsgemäß verwendet, um einen proteinartigen Faktor, der speziell von dieser Zelllinie produziert wird, zu identifizieren. Daher betrifft die vorliegende Erfindung ein neues Protein mit der Bezeichnung OSF-5, das im wesentlichen knochenspezifisch ist und das eine hohe Homologie mit verschiedenen bekannten Carboxypeptidasen hinsichtlich der Aminosäuresequenz besitzt.[0004]
• OSF-5 kann auch durch die in der vorliegenden Beschreibung beschriebene DNA-Sequenz durch eine übliche, auf dem Fachgebiet bekannte genetische Manipulationstechnik produziert werden. Ferner können das OSF-5 oder dessen Fragment durch die in der Beschreibung beschriebene Aminosäuresequenz mittels eines chemisches Peptid- Syntheseverfahrens produziert werden.[0005]
• Ferner kann das Fragment der DNA-Sequenz des in der vorliegenden Erfindung beschriebenen OSF-5, das eine hohe Spezifität, insbesondere für andere Carboxypeptidasen besitzt, mit einer Länge von 15 bis 50 Basen durch ein übliches chemisches Oligonukleotid-Syntheseverfahren synthetisiert werden. Diese fragmentarische Sequenz kann als DNA-Sonde zum Auffinden und Identifizieren von von Knochen abgeleiteten Zellen verwendet werden. Diese Identifikation von von Knochen abgeleiteten Zellen ist insbesondere zur Ermittlung des Ursprungs von metastatischem oder wiederkehrendem Karzinom nützlich und führt so zu einer geeigneten Therapie für wiederkehrenden Krebs. Von den Teilpeptiden des OSF-5 ist das Peptid in dem Epitopteil, das von Antikörpern erkannt werden kann, zur Herstellung eines monoclonalen Antikörpers, der für OSF-5 spezifisch ist, verwendbar. Der so erhaltene monoclonale Antikörper ist von beachtlichem Wert zur Identifikation von von Knochen abgeleiteten Zellen durch ein immunologisches Gewebszell-Anfärbeverfahren.[0006]
• Das Folgende ist über die Proteine in einer Gruppe von Carboxypeptidasen, zu der OSF-5 gehört, bekannt.[0007]
• Beachtlicher Fortschritt in der Untersuchung von physiologisch aktiven Peptiden macht die Bedeutung von Carboxypeptidasen klarer. Carboxypeptidasen werden grob gemäß ihres aktiven Zentrums in Metallo-Carboxypeptidasen (E.O.3.4. 17), Serin-Carboxypeptidasen (E.C.3.4. 16) und Cystein-Carboxypeptidasen (E.O.3.4. 18) klassifiziert. Diese Carboxypeptidasen setzen für sie spezifische Aminosäuren aus dem C-Terminus eines Peptids oder Proteins frei. Die Metallo-Carboxypeptidasen umfassen basische Carboxypeptidasen, die eng mit Peptidhormonen verwandt sind. Typisch für sie sind die Carboxypeptidasen B, N, H (E) und M. Die Carboxypeptidase B wurde als ein Enzym, das Arginin aus Protamin freisetzt, entdeckt. Es ist als Vorläufer in der Säugerpankreas weit verbreitet, wird im Verdauungstrakt durch die Wirkung von Trypsin aktiviert und spielt eine Rolle bei der Verdauung zusammen mit anderen Verdauungsenzymen. Carboxypeptidasen N (Kininase T) wird in Plasma von Tieren nachgewiesen und desaktiviert Bradykinin und Anaphylatoxin und nimmt so an der Homeostase von Kininen teil. Carboxypeptidase H (Enkephalin-Konvertase) wurde als ein Carboxypeptidase B- artiges Enzym identifiziert, das für die Biosynthese der Enkephaline verantwortlich ist. Dieses Enzym ist an der Verarbeitung von Peptidhormonvorläufern beteiligt und ist in den sekretorischen Granula lokalisiert. Die Carboxypeptidase M ist ein Zellmembran-ständiges Enzym, das die Rezeptorspezifität von Peptidhormonen auf der Zelloberfläche kontrollieren kann. So werden die Funktionen von Carboxypeptidasen in mindestens drei klassifiziert, (1) die Erzeugung von aktiven Peptiden aus inaktiven Peptidvorläufern, (2) die Desaktivierung von aktiven Peptiden und (3) die Veränderung der Rezeptorspezifität von Peptiden (Skidgel, (1988), Trends Pharmacol, Sci., Bd. 9, S. 299-304).[0008]
• Wachstumsfaktoren und lokale Faktoren, wie Parathyroidhormon, Interleukin-1, Calcitonin, transformierender Wachstumsfaktor β (TGF-β), knochenmorphogenetisches Protein (BMP), insulinartiger Wachstumsfaktor (IGF) oder Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) sind am Prozess der Knochenremodellierung beteiligt. Normale Knochenremodellierung wird erhalten, wenn die biologische Aktivität dieser Faktoren streng kontrolliert ist. Vieles ist über den Mechanismus dieser Kontrolle unbekannt, aber einer der möglichen Mechanismen erfolgt über lokale Proteasen. Viele Proteasen sind in vivo vorhanden, von denen Carboxypeptidasen für einen solchen Mechanismus festgestellt werden können. D. h., im Knochengewebe lokalisierte Carboxypeptidasen können die biologische Aktivität der am Knochenmetabolismus beteiligten Peptidfaktoren kontrollieren. Jüngst wurde gezeigt, dass Enkephalinase, eine neutrale Metallo-Endopeptidase, die Knochenresorption in vitro hemmt (Ibbotson et al. (1992), J. Bone Miner. Res., Bd. 7, S. 273-279). So wird langsam Licht auf die durch Proteasen katalysierte Kontrolle des Knochenmetabolismus geworfen.[0009]
• Während der Knochenremodellierung wird das Osteoid durch Collagenase und Plasminogenaktivator (ein Enzym, das Collagenase aktiviert) verdaut, der hauptsächlich in den Osteoblasten synthetisiert werden kann. Als Ergebnis wird die zugrundeliegende calcifizierte Matrix freigelegt, und Osteoblasten werden zur Resorption der Knochenmatrix dorthin gelenkt. Es besteht die Möglichkeit, dass Carboxypeptidasen in die Gruppe der Proteasen eingeschlossen werden, die durch Osteoblasten während des Knochenremodellierungsprozesses synthetisiert werden. Die Carboxypeptidasen können weiter die Abbauprodukte, die durch die Wirkung der Collagenase und des Plasminogenaktivators der Osteoblasten gebildet werden, zersetzen. Sie können auch eine Rolle als Einfänger nach Osteoklasie spielen, d. h. die Rolle, dass sie verdaute Stücke, die durch Säuren oder Proteasen, die von den Osteoblasten sezerniert werden, gebildet wurden, weiter abbauen, wodurch eine Umgebung erzeugt wird, in der die Osteoblasten effizient an der Stelle der calcifizierten Matrix wirken, die die Osteoklasie erlitten hat. Ferner, wenn die Osteoklasten die calcifizierte Matrix absorbieren, werden Wachstumsfaktoren mit TGF-β normalerweise in der inaktiven Form sezerniert. Diese Wachstumsfaktoren können durch Carboxypeptidasen aktiviert werden. Durch Entfernen des C-terminalen Aminosäurerests wird angenommen, dass Carboxypeptidasen Materialien, wie Aminosäuren, bereitstellen, die für die Knochenbildung (Proteinsynthese) durch die Osteoblasten notwendig sind. Jedoch waren Osteoblasten-spezifische Carboxypeptidasen nicht bekannt.[0010]
• So liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, neue Carboxypeptidasen aufzufinden, die speziell in Knochenzellen, insbesondere Osteoblasten, exprimiert werden. Solche von Knochen abgeleitete Carboxypeptidasen können im allgemeinen für die C-terminale Analyse von Proteinen verwendet werden. Ferner kontrollieren sie wegen ihres Ursprungs in Knochen die Aktivität von Peptidhormonen, die auf Knochengewebe einwirken. Daneben fordern sie den Abbau von Osteoidgewebe sowie die Zufuhr von Aminosäuren und wirken als Einfänger. Wegen dieser Wirkungen können mit ihnen vermutlich verschiedene metabolische Knochenerkrankungen behandelt werden.[0011]
• Die cDNA von Maus OSF-5 wurde aus der Maus- Osteoblasten-Zelllinie MC3T3-E1 isoliert. Die cDNA-Bank wurde durch eine Kombination von PCR (Polymerasekettenreaktion) und das Subtraktionsverfahren konstruiert und durch Differential-Screening-Technik cloniert. Der so erhaltene Clon wurde als OSF-5 bezeichnet, und dessen DNA-Sequenz wurde bestimmt. Die Suche durch die gegenwärtig verfügbaren DNA- und Aminosäuresequenz- Datenbanken zeigt, dass die DNA-Sequenz des OSF-5 neu war.[0012]
• OSF-5 besitzt eine typische Signalsequenz (25 Aminosäurereste), die bekanntlich allgemein in einem sekretorischen Protein vorhanden ist, aber enthält keine typische Transmembranregion. OSF-5 besitzt Lysin- und Prolin-reiche Vierfach-Repetiereinheiten, jeweils zusammengesetzt aus 11 Aminosäureresten, Lys-Pro-Lys-Glu-Lys- Pro-Pro-Lys-Ala-Thr-Lys, an den 16, bis 159. Positionen von N-Terminus. Diese 11 Aminosäurereste zeigen eine schwache Homologie mit dem Prolactinrezeptor, Fibroblasten-Wachstumsfaktorrezeptor, gamma-Aminobuttersäurerezeptor, Serotoninrezeptor, Histon H1 usw. An den 423. bis 531. Positionen liegt eine Domäne vor, die mit der Phospholipid-Bindungsregion des Blutgerinnungsfaktors VIII homolog ist. Die Phospholipid-Bindungsregion des Blutgerinnungsfaktors VIII kann an Phospholipide auf der Zellmembranoberfläche binden. So steuert die Domäne OSF-5 selbst auf die Oberfläche der Zellmembran spezieller Zellen (Osteoblasten, Chondrozyten etc.), auf denen OSF-5 wirken soll. Diese Wirkung kann zur zielgerechten Auffindung von OSF-5 in Knochengewebe wie in einem Arzneimittelabgabesystem verwendet werden. An den 544. bis 1027. Positionen liegt eine zur Carboxypeptidase H homologe Domäne vor, die fast alle Regionen der Carboxypeptidase H enthält. Diese Carboxypeptidase-artige Domäne wirkt als Kontrollelement für Peptidhormone und Cytokine während des Prozesses des Knochenmetabolismus.[0013]
• Peptide wurden synthetisiert, die 11 Aminosäureresten (KPKEKPFKATK) an den 116. bis 126. Positionen und 15 Aminosäureresten jeweils an der 482. bis 496. Position (GYEEMTFYGNVDKDT), an der 557. bis 571. Position (SYKDMRQLMKAVDEE), an der 701. bis 715. Position (WAAEEKKWVPYRVPN) und an der 872. bis 886. Position (PHESELPREWENNKE) entsprechen und jeweils von den hydrophilen Regionen von OSF-5 abgeleitet sind. Jedes Peptid wurde mit Ovalbumin konjugiert und zur Immunisierung von Kaninchen verwendet. Anti-OSF-5-Peptid- Antisera wurden erhalten und wurden für die immunhistochemische Detektion von OSF-5 in systemischen Schnitten von neugeborenen Mäusen verwendet. OSF-5 wurde in den Osteoblasten und Chondrozyten nachgewiesen.[0014]
• Allgemein kann OSF-5 direkt aus dem Knochengewebe oder Knorpelgewebe einer menschlichen Rinder-, Mäuse- oder anderen Quelle durch eine bekannte biochemische Technik extrahiert werden.[0015]
• Ferner kann das erfindungsgemäße Maus-OSF-5 zur Isolierung und Identifizierung anderer Säuger-OSF-5- Proteine mit ähnlicher DNA-Sequenz und Aminosäuresequenz verwendet werden. D. h., die DNA, die OSF-5 codiert, kann durch Konstruktion einer cDNA-Bank oder einer genomischen Bank aus mRNA, die aus Vertebraten-Knochengewebe extrahiert wurde, und Verwendung einer Sonde, umfassend ein markiertes Fragment der Maus-DNA-Sequenz, die in der vorliegenden Beschreibung offenbart ist, erhalten werden. Ein cDNA-Clon voller Länge kann durch Kombination der vorstehend beschriebenen und anderer Standardtechniken der Molekularbiologie erhalten werden.[0016]
• Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Polypeptide, die Analoga von OSF-5 umfassen, i. e. Mutanten und Fusionsproteine mit OSF-5-Aktivität, sowie Fragmente, die mindestens 11, bevorzugt 15, insbesondere den Hauptteil des OSF-5, d. h. die Faktor-VIII-artige Domäne und/oder die Carboxypeptidase-artige Domäne, enthalten. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Produktion von OSF-5 durch rekombinante DNA-Technik.[0017]
• Erfindungsgemäß bedeutet der Ausdruck Hybridisierung unter stringenten Bedingungen eine Hybridisierungsbedingung mit einer Salzkonzentration von 6 · SSC (NaCl-Citratpuffer) bei 62 bis 68ºC.[0018]
Kurze Erklärung der Figuren und Tabellen
• [0019]
• Die Fig. 1 ist eine schematische Zeichnung der Struktur des Maus-OSF-5-Vorläuferproteins. OSF-5 wird in vier Regionen aufgeteilt, bestehend aus einer Signalsequenz, einer vierfachen Repetiersequenz aus 11 Aminosäuren, einer Blutgerinnungsfaktor-VIII-artigen Region, die an das Phospholipid auf der Zellmembranoberfläche binden kann, und einer Carboxypeptidase-artigen Region.
• Die Fig. 2 zeigt eine Restriktionskarte der cDNA, die OSF-5 codiert. Die fetten Buchstaben zeigen die Region an, die die Aminosäure von OSF-5 codiert. Es gibt keine KpnI-, HindIII-, SalI- und XbaI-Spaltstellen.
• Die Fig. 3 zeigt die gewebsspezifische Expression von Maus-OSF-5. Diese wurde durch Reinigen von RNA aus verschiedenen Geweben und gezüchteten Zellen, gefolgt von RNA-Dotblotting, analysiert. Dieses Diagramm zeigt die Ergebnisse der Autoradiographie.
• [0020] Die Tabelle 1 zeigt eine Anordnung der Aminosäuresequenzen von Maus-OSF-5 und anderer Carboxypeptidasemoleküle. Gemeinsame Aminosäurereste sind in Form einer Konsensussequenz gezeigt.
• [0021] Die Tabelle 2 zeigt die Fortsetzung der Ausrichtung der Aminosäuresequenzen des Maus-OSF-5 und anderer Carboxypeptidasemoleküle, die in Tabelle 1 gezeigt sind. Gemeinsame Aminosäurereste sind in Form einer Konsensussequenz gezeigt.
• [0022] Die Tabelle 3 zeigt die Fortsetzung der Ausrichtung der Aminosäuresequenzen des Maus-OSF-5 und anderer Carboxypeptidasemoleküle, die in Tabelle 2 gezeigt sind. Gemeinsame Aminosäurereste sind in Form einer Konsensussequenz gezeigt.
• [0023] Die Tabelle 4 zeigt eine Anordnung der Aminosäuresequenzen von Maus-OSF-5 und der Phospholipid-Bindungsregion anderer Blutgerinnungsfaktoren. Gemeinsame Aminosäurereste sind in Form einer Konsensussequenz gezeigt.
• [0024] Es wird erwähnt, dass der Inhalt der japanischen Prioritätsanmeldung Nr. 230029/92 und 324033/92 Teil der vorliegenden Anmeldung ist.
Beispiele
• [0025] Die vorliegende Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele näher beschrieben.
Beispiel 1 Konstruktion einer cDNA-Bank durch Subtraktion und PCR
• [0026] Die Konstruktion einer cDNA-Bank, die für die Osteoblasten-Zelllinie MC3T3-E1 spezifisch ist, wird anschließend beschrieben. Diese cDNA-Bank wird durch eine Kombination des Subtraktionsverfahrens und der PCR konstruiert, wobei das Gen, das in Mauslebergewebe exprimiert wird, subtrahiert wird. Jeder cDNA-Clon besitzt Genfragmente mit einer Durchschnittslänge von etwa 300 Basen und ist dadurch gekennzeichnet, dass das Gen mit einem niedrigen Gehalt amplifiziert wurde.
• [0027] Außer anderweitig angegeben, entsprechen alle Protokolle zur allgemeinen rekombinanten DNA Sambrook et al., "Molecular Cloning Manual" (1989), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, USA. Gesamt-RNAs wurden aus 8 · 10&sup7; MC3T3-E1-Zellen und etwa 1 g Mauslebergewebe durch das Guanidinverfahren extrahiert. Poly-A&spplus;RNAs wurden aus Gesamt-RNAs mittels des im Handel erhältlichen Produkts "Oligo dT Latex mRNA Purification Kit" (Takara Shuzo) gereinigt. cDNAs wurden mit einem cDNA-Synthesekit (Amersham) unter Verwendung von 1 ug jeder Poly-A+RNA als Matrize synthetisiert. Jedoch wurde ein Zufallsprimer anstelle eines Oligo-dT-Primers in einer Menge des 1,5fachen der üblicherweise verwendeten Menge verwendet, wodurch die cDNA-Kettenverlängerung auf eine Durchschnittslänge von etwa 300 Basen beschränkt wurde. Nachdem die cDNAs mit dem vorstehenden Kit doppelsträngig und glattendig gemacht wurden, wurden sie mit T4-DNA- Ligase (Takara Shuzo) an die nachstehend beschriebenen zwei DNA-Linker, i. e. ATOS-1/2 (SEQ ID Nos. 2 und 3 der Sequenztabelle) für die MC3T3-E1-cDNA und ATOS-4/5 (SEQ ID Nos. 4 und 5 der Sequenztabelle) für die Leber-cDNA geknüpft.
• ATOS-1/2:
• ATOS-1 5' CTCTTGCTTGAATTCGGAACTA-3'
• ATOS-2 3'-ACACGAGAACGAACTTAAGCCTGAT-5'
• ATOS-4/5:
• ATOS-4 5' CTCTTGCTTAAGCTTGGACTA-3'
• ATOS-5 3'-ACACGAGAACGAATTCGAACCTGAT-5'
• [0028] Dann wurde jedes Reaktionsprodukt einer DNA- Amplifikation mittels des PCR-Verfahrens (Polymerasekettenreaktion) unter Verwendung von ATOS-1 bzw. ATOS-4 als Primer unterworfen. Die Konzentration der amplifizierten DNA wurde mit dem DNA-Assay-Kit "DNA Dipstick" (Invitrogen) bestimmt. Das Subtraktionsverfahren wurde unter Verwendung von Photobiotin (Pirce) durchgeführt. Photobiotin (20 ng) wurde zu 20 ug der PCR-amplifizierten Leber-cDNA gegeben, und Licht von einer Sonnenlampe, die 10 cm entfernt war, wurde auf die Leber-cDNA für 10 Minuten gerichtet, um sie mit Biotin zu markieren. 3,0 ug der markierten Leber-cDNA wurde mit 0,3 ug nichtmarkierter MC3T3-E1-cDNA zur Hybridisierung versetzt. Dann wurde Streptavidin (Takara Shuzo) umgesetzt, und das Reaktionsgemisch wurde mit Phenol extrahiert, um die der Leber-cDNA gemeinsame cDNA von der M3CT3-E1-cDNA zu entfernen. Das Subtraktionsverfahren wurde wiederholt, um möglichst viel der gemeinsamen cDNA von der MC3T3-E1-cDNA zu entfernen. Die DNA wurde mittels PCR unter Verwendung des vorstehend genannten ATOS-1 amplifiziert, und die DNA- Konzentration wurde gemessen. Diese cDNA (10 ng) wurde mit dem Restriktionsenzym EcoRI gespalten und dann mit T4- Ligase an 1 ug des Phagenvektors lambda gt10 (lambad gt10/EcoRI cloning kit, Stratagene) ligiert, der mit EcoRI gespalten und an den Enden dephosphoryliert worden war. Die so erhaltene rekombinante DNA wurde in lambda- Phagenpartikel unter Verwendung des in-vitro-Verpackungskits "Gigapack-gold" (Stratagene) verpackt. Mit den rekombinanten Phagen wurde E. coli C800 (aufbewahrt als HT003 an Japanese Cancer Research Resources Bank, National Institute of Health of Japan) infiziert, und die Organismen wurden auf ein Agarmedium zusammen mit einem Weichagarmedium zur Bildung von Plaques ausgebracht. Die Effizienz der Infektion wurde zu 3 · 10&sup5; Phagenplaques/ug Vektor-DNA bestimmt.
• [0029] Die so erhaltene cDNA-Bank wurde einem Differentialscreening unterworfen, um Clone mit einer hohen Spezifität für MC3T3-E1 zu selektieren. Spezifisch wurde 2,25 · 10&sup4; Phagen auf insgesamt 10 Platten aufgebracht, und die so erhaltenen Plaques auf jeder Platte wurden auf zwei Nylonmembranfilter (insgesamt 20 Filter) übertragen. Diese Reihe von Plaques wurde einer Plaque-Hybridisierung unter Verwendung von radioaktiv markierter MC3T3-E1-cDNA als Sonde für eine der Reihen und radioaktiv markierter Leber-cDNA als Sonde für die andere Reihe unterworfen. In 273 Clonen wurde Expression mit der MC3T3-E1-cDNA-Sonde, aber nicht mit der Leber-cDNA-Sonde beobachtet. Diese Clone wurden als Minibank in den anschließenden Experimenten verwendet.
Beispiel 2 Isolierung des OSF-5-Clons der Maus
• [0030] Verfahren zur Identifikation eines cDNA-Segments von OSF-5 als MC3T3-EI-spezifischer Clon aus der Minibank, die in Beispiel 1 konstruiert wurde, und zur Clonierung einer cDNA voller Länge aus der cDNA-Bank von MC3T3-E1 unter Verwendung dieses Fragments werden beschrieben.
• [0031] Die Gesamt-RNAs aus MC3T3-E1 und Leber, hergestellt in Beispiel 1, wurden in einer Menge von jeweils 1 ug auf Nylonmembranfilter getröpfelt. 273 Filter wurden hergestellt und zur Hybridisierung verwendet, wie nachstehend beschrieben wird. Getrennt davon wurde die DNA der Insertionen der 273 Phagenclone, die in Beispiel 1 hergestellt wurde, mittels PCR amplifiziert. Diese DNA wurde auf Agarosegel einer Elektrophorese unterworfen, und die Hauptbanden wurden ausgeschnitten, gereinigt und zur Verwendung als Sonde radioaktiv markiert. Ein Clon, der die Expression mit MC3T3-E1-cDNA, aber keine Expression mit Leber-cDNA nach Autoradiographie zeigte, wurde in einen Plasmidvektor recloniert. Spezifisch wurde die DNA der Insertionen mittels PCR amplifiziert und dann gereinigt und wurde anschließend mit dem Restriktionsenzym EcoRI gespalten und in die EcoRI-Spaltstellen des Plasmidvektors pUC118 (Takara Shuzo) recloniert. Die DNA- Sequenz des so erhaltenen Clons wurde mit einem im Handel erhältlichen "DNA Sequence Kit" (Takara Shuzo) unter Verwendung eines Universalprimers bestimmt. Eine Recherche durch DNA- und Proteindatenbanken zeigte, dass die DNA- Sequenz des neuen Clons sich von den vorhandenen DNAs oder Proteinen unterschied. Dieser Clon wurde als pMCLS68 bezeichnet und für die anschließende Clonierung der cDNA voller Länge verwendet.
• [0032] Für die Clonierung der cDNA voller Länge wurde glattendige doppelsträngige cDNA mit dem cDNA-Synthesekit "cDNA Synthesis System Plus" (Amersham) unter Verwendung von 5 ug Poly A + RNA von MC3T3-E1, gereinigt in Beispiel 1, synthetisiert. Die so erhaltene cDNA wurde in den EcoRI/NotI-Adaptor (Takara Shuzo) unter Verwendung von T4- Ligase ligiert, und das Produkt wurde auf Agarosegel elektrophoretisch untersucht, um ein Fragment, das mehr als etwa 700 Basenpaare lang ist, zu reinigen. Dieses Fragment wurde an die EcoRI-Spaltstelle des lambda gt10- Phagenvektors (Stratagene) geknüpft und in Phagenpartikel wie in Beispiel 1 verpackt. Mit den Paketen wurde E. coli wie in Beispiel 1 infiziert, und die Effizienz der Infektion wurde zu 1,5 · 10&sup7; Phagenplaques/ug Vektor-DNA bestimmt. Das vorstehend genannte pMCIS68 wurde zur Verwendung als Sonde radioaktiv markiert, und 1,0 · 10&sup6; Phagenclone der cDNA-Bank wurden mit Plaquehybridisierung durchgemustert. Fünf positive Hybridisierungssignale wurden erhalten, wonach das EcoRI-Fragment des Phagenclons mit der längsten Insertion in die EcoRI-Spaltstelle des Plasmidvektors pUC118 (Takara Shuzo) recloniert wurde. Der so erhaltene Clon wurde als pKOT20 bezeichnet.
Beispiel 3 DNA-Sequenz von Maus-OSF-5
• [0033] Deletionsmutanten von pKOT20 und ein Subclon, der dessen cDNA-Fragment enthält, wurden mit "the Deletion Kit for Kilo Sequence" (Takara Shuzo) durch Spalten in Intervallen von 300 Basenpaaren jeweils in entgegengesetzter Richtung hergestellt. Die DNA-Sequenz jeder Deletionsmutante wurde mit dem automatischen DNA- Sequenator 373A (Applied Biosystems, USA) bestimmt. Die gesamte DNA-Sequenz der cDNA und die von dieser DNA- Sequenz translatierte Aminosäuresequenz sind als SEQ ID No. 1 der Sequenztabelle Nr. 1 gezeigt, wobei der Aminosäurerest dem N-Terminus des vorhergesagten OSF-5- Vorläuferproteins entspricht. Das durch diese cDNA codierte Protein wurde als OSF-5 bezeichnet. Die Struktur des so erhaltenen Maus-OSF-5-Proteins ist schematisch in Fig. 1 gezeigt, und die Restriktionsenzymkarte der cDNA, die Maus-OSF-5 zeigt, ist in Fig. 2 gezeigt. Eine Recherche durch DNA- und Protein-Datenbanken zeigte, dass die so erhaltene DNA-Sequenz die Phospholipid- Bindungsdomäne des Blutgerinnungsfaktors VIII sowie Domänen, die mit allen Domänen der Carboxypeptidase H homolog sind, enthält. Anordnungen der Aminosäuren zwischen Maus-OSF-5 und anderen Carboxypeptidasemolekülen sind in den Tabellen 1 bis 3 gezeigt, und eine Anordnung der Aminosäuren zwischen Maus-OSF-5 und den Phospholipid- Bindungsdomänen anderer Blutgerinnungsfaktoren ist in Tabelle 4 gezeigt.
Beispiel 4 Gewebsspezifische Expression von Maus-OSF-5
• [0034] RNA-Dotblotting wurde durchgeführt, um die gewebsspezifische Expression von Maus-OSF-5 zu untersuchen. Die Gesamt-RNAs von Thymusdrüse, Milz, Gehirn, Niere, Leber, Lunge, Hoden und Herz von Mäusen (gekauft von Nippon Clea) wurden nach dem Guanidinverfahren hergestellt. Osteoblastenreiche Zellen des Schädels wurden aus einer Kultur von neugeborenen Mausschädeln erhalten. Gesamt-RNA wurde aus diesen Zellen wie vorstehend beschrieben extrahiert. Ein ug der Gesamt- RNA jeweils aus den vorstehend genannten Geweben, gezüchteten Schädelzellen, MC3T3-E1 und der Maus- Fibroblasten-Zelllinie NH3T3 (ATCC CRL 1658) wurden auf Nylonmembranfilter (Biodyne, PALL) getropft, durch Erhitzen fixiert und zur Hybridisierung verwendet. Getrennt davon wurde pKOT20 mit SphI gespalten und durch Agarosegelelektrophorese zur Reinigung isoliert. Dann wurde das Isolat radioaktiv markiert und als Sonde verwendet. Die Autoradiographie zeigte eine hohe Expression für die gezüchteten Schädelzellen und für MC3T3-E1 (Fig. 3) an.
Beispiel 5 Herstellung von Anti-OSF-5-Antiseren
• [0035] Zur Herstellung von Anti-Peptid-Antikörpern gegen Maus-OSF-5 wurden insgesamt fünf Peptide, i. e. 11 Aminosäurereste in Positionen 116 bis 126 vom N-Terminus der Repetierdomäne, 15 Aminosäurereste von 482 bis 496 Position der Blutgerinnungsfaktor-VI-artigen Domäne und 15 Aminosäurereste jeweils an den 557. bis 571., den 701. bis 715. und 872. bis 886. Positionen der Carboxypeptidase- artigen Domäne nach dem Festphasen-Syntheseverfahren unter Verwendung eines Peptid-Synthesegeräts (430A, Applied Biosystems) synthetisiert. Die Peptide waren jeweils OSF- 5.1 (KPKEKPPKATK, SEQ. ID No. 6), OSF-5.2 (GYEEMTFYGNVDKDT, SEQ. ID No. 7), OSF-5.3 (SYKDMRQLMKAVDEE, SEQ. ID No. 8), OSF-5.4 (WAAEEKKWVPYRVPN, SEQ. ID No. 9) und OSF-5.5 (PHESELPREWENNKE, SEQ. ID No. 10). Diese synthetischen Peptide wurden jeweils mit Ovalbumin verknüpft, wobei Glutaraldehyd als Kopplungsmittel verwendet wurde, und zur Immunisierung von Kaninchen verwendet. Die so erhaltenen Antiseren konnten zur immunhistochemischen Durchmusterung auf die Anwesenheit von OSF-5 an systemischen Schnitten von neugeborenen Mäusen und zum Nachweis der Expression von OSF-5 in E. coli, Hefe und Tierzellen verwendet werden.
Beispiel 6 Expression von OSF-5 in Tierzellen
• [0036] Das Not-Fragment, das die cDNA-Domäne von Maus-OSF- 5 enthielt, wurde unter Verwendung von pRC/CMV, eines Vektors zur Expression in Tierzellen, cloniert. Die so erhaltene Plasmid-DNA wurde in Chinahamster-Ovarienzellen (CHO) nach dem Calciumphosphat-Fällungsverfahren eingebracht. Die so erhaltenen G418-resistenten Kolonien wurden isoliert und proliferiert, so dass jeder Clon auf OSF-5-Expression durch Northern-Blot-Analyse analysiert wurde. Die clonierten Zellen mit der höchsten Expression von OSF-5 wurden mittels Western-Blot-Analyse analysiert, wobei eine Bande von etwa 80 Kilodalton nachgewiesen wurde.
• [0037] Das erfindungsgemäß bereitgestellte OSF-5 kann als Mittel zur Behandlung metabolischer Knochenerkrankungen und wegen seiner Organspezifität für Knochen auch als Diagnosereagens für metabolische Knochenerkrankungen verwendet werden. Tabelle 1 Tabelle 2 Tabelle 3 Tabelle 4

Claims (12)

1) Protein, umfassend OSF-5 mit einer Aminosäuresequenz an den Positionen 26 bis 1128 von SEQ. ID NO. 1 des Sequenzprotokolls, oder ein Analogon von OSF-5, d. h. Mutanten und Fusionsproteine mit OSF-5-Aktivität oder ein immunogenes Fragment von OSF-5, das mindestens 11, bevorzugt 15, insbesondere den Hauptteil von OSF-5, nämlich die Aminosäuren der Faktor VIII-artigen Domäne und/oder der Carboxypeptidase-artigen Domäne, enthält.

2) Protein, umfassend ein OSF-5-Vorläuferprotein mit einer Aminosäuresequenz an den Positionen 1 bis 1128 einschließlich eines Signalpeptids an den Positionen 1 bis 25 in SEQ. ID. NO. 1 des Sequenzprotokolls, oder ein Analogon des Vorläuferproteins, i. e. Mutanten und Fusionsproteine mit OSF-5-Aktivität oder ein immunogenes Fragment des Vorläuferproteins, das mindestens 11, bevorzugt 15, insbesondere den Hauptteil von OSF-5, nämlich die Aminosäuren der Faktor VIII-artigen Domäne und/oder der Carboxypeptidase-artigen Domäne enthält.

3) DNA oder RNA, die das Protein nach Anspruch 1 oder 2 codiert.

4) DNA oder RNA, die unter stringenten Bedingungen mit der DNA oder RNA nach Anspruch 3 hybridisiert und ein in Anspruch 1 und 2 definiertes Protein codiert.

5) Verfahren zur Produktion eines rekombinanten Säuger-OSF- 5-Proteins nach Anspruch 1 oder eines Analogons davon oder eines Fragments davon, wie in Anspruch 1 definiert, umfassend die Stufen:

(a) Erhalt einer Population von Zellen, die eine heterogene DNA aus den folgenden DNA-Sequenzen umfaßt:

(i) eine Sequenz, die in den Zellen so funktionieren kann, daß sie die Transkription und Translation kontrolliert, und

(ii) eine DNA-Sequenz, die stromabwärts der Kontrollsequenz angefügt ist und das rekombinante Protein codiert, und

(b) Züchten der Population von Zellen unter Bedingungen, die die Produktion des rekombinanten Proteins erlauben.

6) Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Kontrollsequenz weiter eine DNA, die ein Signalpeptid zur extrazellulären Sekretion des rekombinanten Proteins codiert, so enthält, daß die DNA unmittelbar stromaufwärts der DNA-Sequenz, die das rekombinante Protein codiert, positioniert ist.

7) Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, wobei die Population von Zellen Escherichia coli oder Hefe oder Säugerzellen ist.

8) Diagnosereagenz für metabolische Knochenerkrankungen, enthaltend die Gesamtheit oder ein Fragment der DNA oder RNA nach Anspruch 3.

9) Diagnosereagenz für metabolische Knochenerkrankungen, enthaltend das Protein nach Anspruch 1.

10) Polyclonaler oder monoclonaler Antikörper gegen das Protein nach Anspruch 1.

11) Diagnosereagenz für metabolische Knochenerkrankungen, enthaltend den Antikörper nach Anspruch 10.

12) Therapeutisches Mittel gegen metabolische Knochenerkrankungen, enthaltend das Protein nach Anspruch 1.