DE69832447T2

DE69832447T2 - Gen kodierend für Afadin-1

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Publication number: DE69832447T2
Application number: DE69832447T
Authority: DE
Original assignee: JCR Pharmaceuticals Co Ltd; Japan Science and Technology Agency
Current assignee: JCR Pharmaceuticals Co Ltd; Japan Science and Technology Agency
Priority date: 1997-09-22
Filing date: 1998-09-21
Publication date: 2006-08-10
Anticipated expiration: 2018-09-22
Also published as: JP3657751B2; EP0905239A3; EP0905239B1; EP0905239A2; JPH1189572A; DE69832447D1; US6180760B1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein neues aktinfilamentbindendes Protein, „I-Afadin". Genauer bezieht sich die Erfindung auf ein neuartiges tierisches Protein I-Afadin, das an der Zell-Zell-Haftverbindung (Adhärenzjunktion, AJ) beteiligt ist, die eine wichtige Rolle in Entwicklung und Pathogenese spielt.
Bei verschiedenen zellulären Ereignissen wie Zelladhäsion, Zellbewegung und Festlegung der Zellform werden spezialisierte Membrandomänen mit Transmembranproteinen, z. B. Zelladhäsionsmolekülen, Rezeptoren und Kanälen, gebildet, und diese Domänen sind oftmals mit dem Aktincytoskelett assoziiert (Biochem. Biophys. Acta 737: 305–341, 1983; Curr. Opin. Cell Biol. 1: 103–109, 1989; Cell Motil. Cytoskeleton 20: 1–6, 1991; Curr. Opin. Cell Biol. 3: 849–853, 1991; Science 258: 955–964, 1992; Curr. Opin. Cell Biol. 4: 834–839, 1992; Curr. Opin. Cell Biol. 5: 653–660, 1993; Trends Biochem. Sci. 22: 53–58, 1997). Die Verbindung zwischen dem Aktincytoskelett und der Plasmamembran spielt bei diesen zellulären Ereignissen eine Schlüsselrolle, und Proteine, die das Aktincytoskelett mit den Transmembranproteinen verbinden, sind identifiziert worden. Dennoch ist die molekulare Basis der Verbindung zwischen dem Aktincytoskelett und der Plasmamembran nicht vollständig verstanden.
Um diese molekulare Verbindung zu verstehen, sind die Zelladhäsionsstellen eingehend studiert worden (Biochem. Biophys. Acta 737: 305–341, 1983; Curr. Opin. Cell Biol. 1: 103–109. 1989; Cell Motil. Cytoskeleton 20: 1–6, 1991; Curr. Opin. Cell Biol. 3: 849–853, 1991; Science 258: 955–964, 1992; Curr. Opin. Cell Biol. 4: 834–839, 1992; Curr. Opin. Cell Biol. 5: 653–660, 1993; Trends Biochem. Sci. 22: 53–58, 1997). Als Ergebnis sind die mit Aktinfilamenten (F-Aktin) assoziierten Zelladhäsionsstellen in zwei Untergruppen eingeteilt worden: Zell-Zell- und Zell-Matrix-Adhärenzjunktionen. Viele Adapterproteine sind an den Zell-Zell-AJ identifiziert worden, wo Cadherine an der äußeren Zelloberfläche miteinander interagieren (Development 102: 639–655, 1988; Cell Motil. Cytoskeleton 20: 1–6, 1991; Science 251: 1451–1455, 1991; Curr. Opin. Cell Biol. 4: 834–839, 1992; EMBO J. 8: 1711–1717, 1989; Cell 65: 849–857, 1991; Science 251: 1451–1455, 1991; Curr. Opin. Cell Biol. 4: 834–839, 1992). Unter diesen Bindungsproteinen interagiert α-Catenin direkt mit F-Aktin (Pro. Natl. Acad. Sci. USA 92, 8813–8817, 1995). A-Catenin interagiert durch α-Aktinin und/oder ZO-1 auch indirekt mit F-Aktin (J. Cell. Biol. 130: 67–77, 1995; J. Cell. Biol. 138: 181–192, 1997). Weiterhin ist Vinculin, ein anderes F-Aktin-bindendes Protein, an Zell-Zell-AJ's konzentriert, obwohl die Moleküle, mit denen es an der Zell-Zell-AJ interagiert, noch nicht identifiziert worden sind (Cell Motil. Cytoskeleton 20: 1–6, 1991; Curr. Opin. Cell Biol. 4: 834–839, 1992). Im Bereich von Zell-Matrix-AJ's, wo Integrin auf der äußeren Zelloberfläche mit Matrixproteinen interagiert, interagiert die cytoplasmatische Domäne direkt oder indirekt mit F-Aktin-bindenden Proteinen, z. B. α-Aktinin, Vinculin und Talin (Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 11: 379–416, 1995).
Wie oben beschrieben, scheinen viele F-Aktin-bindende Proteine als Adapter zu dienen, die das Aktincytoskelett mit dem Cadherin und Integrin der Plasmamembran verbinden.
Andererseits ist die Verbindung zwischen dem Aktincytoskelett und der Plasmamembran auch bei nervenspezifischen Ereignissen von Bedeutung, beispielsweise bei der Zielsuche des Wachstumskegels und anschließenden Bildung und Aufrechterhaltung synaptischer Verbindungen (Neuron 1: 761–772, 1988; Science 242: 708–715, 1988; Curr. Opin. Neurobiol. 4: 43–48, 1994; Curr. Opin. Neurobiol. 4: 640–647, 1994; Cell 83: 171–176, 1995). Es muss jedoch noch geklärt werden, welche Moleküle bei diesen nervenspezifischen Ereignissen das Aktincytoskelett mit der Plasmamembran verbinden.
Um diese Frage zu beantworten, haben die Erfinder der vorliegenden Anmeldung mehrere neuartige F-Aktin-bindende Proteine aus dem Rattenhirn isoliert und die Struktur der Proteine untersucht, die für Nervengewebe besonders spezifisch und an der Synapse konzentriert sind. Eine Patentanmeldung zu diesem Thema ist bereits eingereicht worden (Japanische Patentanmeldung Nr. 9-92615). Das Protein dieser früheren Anmeldung (nachfolgend gemäß der Nomenklatur des Erfinders als „Neurabin" bezeichnet) besitzt eine F-Aktin-bindende Domäne und eine PDZ-Domäne. Die PDZ-Domäne ist in einer Vielfalt von Proteinen gefunden worden, von denen einige an Zell-Zell-AJ's lokalisiert sind, etwa PSD-95/SAP90 an synaptischen Verbindungen (Neuron 9: 929–942, 1992; J. Biol. Chem. 268: 4580–4583, 1993), Dlg an „septate junctions" (Cell 66: 451–464, 1991), ZO-1 und ZO-2 an „tight junctions" (J. Cell Biol. 193: 755–766, 1986; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3460–3464, 1991; J. Cell Biol. 121: 491–502, 1993; J. Cell Biol. 123: 1049–1053, 1993; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 7834–7838, 1993; J. Cell Biol. 124: 949–961, 1994). Weiterhin haben neuere Untersuchungen gezeigt, dass die DPZ-Domäne an einzigartige C-terminate Motive von Zielproteinen bindet (Trends Biochem. Sci. 21: 455–458, 1996), die in einer großen Anzahl von Transmembranproteinen gefunden werden, etwa dem N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptor und dem Kaliumkanal vom „Shaker-Typ" (Nature 378: 85–88, 1995; Science 269: 1737–1740, 1995; J. Neurosci. 16: 2157–2163, 1996).
Aufgrund der verschiedenen genannten Befunde ist es wahrscheinlich, dass Neurabin, das Protein der vorigen Erfindung der gegenwärtigen Erfinder, als Verbindungsstück zwischen dem Aktincytoskelett und einem Transmembranprotein oder mehreren Transmembranproteinen an Synapsen dient.
Jedoch sind alle Aspekte der molekularen Basis für Zell-Zell-Adhäsion noch nicht aufgeklärt. Diese Aufklärung ist nötig, um weitere aktinfilamentbindende Proteine zu identifizieren. Außerdem besteht die Möglichkeit, dass diese Proteine zum Verständnis, beispielsweise der Infiltrations- und Metastasis-Mechanismen bei Tumoren führen, und es ist zu erwarten, dass dies die Entwicklung von Diagnoseverfahren zur Bestimmung der Bösartigkeit von Karzinomen, therapeutischen Verfahren oder Substanzen zur Behandlung von Karzinomen und dergleichen ermöglichen wird.
Die vorliegende Erfindung ist im Hinblick auf das Gesagte erstellt worden. Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein neuartiges aktives aktinfilamentbindendes Protein zu beschreiben, das zur Zell-Zell-Adhäsion beiträgt, und dabei gleichzeitig seine Struktur (Aminosäurensequenz) und seine Eigenschaften beschreibt.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, geeignetes Material zu beschreiben, um gentechnische Veränderung des aktinfilamentbindenden Proteins zu erlauben.
Somit beschreibt die vorliegende Erfindung aus einem Blickwinkel ein aktinfilamentbindendes Protein, I-Afadin, das die Aminosäurensequenz SEQ ID NO: 1 besitzt. Entsprechende Proteine oder Peptide aus irgendeinem Tier, insbesondere aus Menschen, mit einer Aminosäurensequenz, die im Wesentlichen der aus SEQ ID NO: 1 gleicht, können erhalten werden, obwohl sie keinen Teil der Erfindung darstellen. Wie hier beschrieben, meint „im Wesentlichen gleichen" Proteine, die z. B. 80% oder mehr an Sequenzübereinstimmung besitzen, z. B. 85% oder 90% Übereinstimmung mit der Aminosäurensequenz SEQ ID NO: 1. Peptidfragmente (aus 5 oder mehr Aminosäureresten, z. B. mehr als 20 oder mehr als 50 Reste), z. B. antigene Fragmente können aus erfindungsgemäßen Proteinen, die irgendeine Teilaminosäurensequenz der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 enthalten, oder im Wesentlichen ähnlichen Sequenzen erhalten werden, z. B. aus einer anderen Tierspezies. Diese Peptidfragmente können als Antigene für die Herstellung von Antikörpern verwendet werden. Weiterhin kann das Protein mit beliebigen anderen Proteinen fusioniert werden (z. B. Fluoreszenzproteine oder dergleichen).
Funktionell gleichwertige Varianten oder Vorläufer der oben definierten Proteine oder Peptidfragmente können hergestellt werden, obwohl sie keinen Teil der vorliegenden Erfindung darstellen. „Funktionelle Gleichwertigkeit" ist der Ausdruck, der verwendet wird, um Proteine oder Peptide zu definieren, die mit dem ursprünglichen Protein verwandt sind oder ihm ähneln, wobei die Aminosäurensequenz durch einzelnen oder mehrfachen Austausch, Hinzufügung (z. B. die oben beschriebenen Fusionsproteine) und/oder Deletionen von Aminosäuren verändert worden ist. Er wird ebenfalls verwendet für Sequenzen, in denen die Aminosäuren chemisch verändert worden sind, einschließlich durch Glycosylierung oder Deglycosylierung, aber die dennoch ihre funktionale Aktivität beibehalten, das heißt, die im Stande sind, Antikörper zu induzieren, die erfindungsgemäße Proteine binden, und/oder die dem hier beschriebenen I-Afadin ähnliche F-Aktin-bindende Eigenschaften aufweisen. Funktionell gleichwertige Varianten umfassen natürliche biologische Varianten (z. B. aus verschiedenen Gattungen oder Spezies oder allelischen oder geographischen Varianten derselben Spezies) und Derivate, die durch bekannte Techniken hergestellt wurden.
Das erfindungsgemäße Protein kann durch bekannte Verfahren, insbesondere hier beschriebene Verfahren, aus menschlichen oder tierischen Organen, Zell-Linien usw. isoliert werden und Verfahren zur Herstellung erfindungsgemäßer Proteine, einschließlich der in den Beispielen beschriebenen Schritte, stellen einen weiteren Aspekt der Erfindung dar. Proteine, die durch solche Verfahren erhalten werden können, bilden einen weiteren Aspekt der Erfindung. Wenn das Protein in der Form eines Peptides verwendet wird, kann es auch anhand der erfindungsgemäßen Aminosäurensequenz durch chemische Synthese hergestellt werden. Alternativ kann es durch in-vitro-Synthese unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken mit einem erfindungsgemäßen cDNA-Fragment hergestellt werden.
Beispielsweise können, wenn das Protein durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt wird, Nukleinsäure-Fragmente, z. B. cDNA-Fragmente, in geeignete Expressionsvektoren eingefügt werden, und das erfindungsgemäße Protein kann in den Zellen (z. B. Escherichia coli, Bacillus subtilis, Hefe, tierische Zellen usw.), die mit dem rekombinanten Vektor transfiziert worden sind, im großen Maßstab exprimiert werden. Insbesondere wird beispielsweise, wenn das Protein in einen Mikroorganismus wie E. coli exprimiert wird, ein Expressionsvektor hergestellt, in dem die erfindungsgemäße DNA in einen Expressionsvektor eingefügt wird, der einen Ursprung besitzt, der in den Mikroorganismus repliziert werden kann, außerdem einen Promoter, eine ribosomenbindende Stelle, eine Klonierungsstelle für cDNA und einen Terminator. Wirtszellen werden mit dem Expressionsvektor transformiert, und die erhaltenen Transformanden werden kultiviert, so dass das von der cDNA codierte Protein in dem Mikroorganismus massenproduziert wird. Alternativ kann das Protein als Fusionsprotein mit einem anderen Protein exprimiert werden. Das einfache Protein, das von der cDNA codiert wird, kann dargestellt werden, indem das hergestellte Fusionsprotein mit einer geeigneten Protease geschnitten wird. Wird es gewünscht, dass erfindungsgemäße Protein in Tierzellen zu exprimieren, so wird das cDNA-Fragment in einen Expressionsvektor für tierische Zellen eingefügt, der einen Promoter für Tierzellen, eine Spleißregion und eine Polyadenylierungsstelle besitzt, und der Vektor wird auf solche Weise in die tierischen Zellen eingeführt, dass das erfindungsgemäße Protein exprimiert wird.
Die oben erwähnten Klonierungs- und Expressionsvektoren, die erfindungsgemäße Nukleinsäuremoleküle (unten definiert) enthalten, Verfahren zur Herstellung erfindungsgemäßer rekombinanter Nukleinsäurenmoleküle (darunter die Einfügung von Nukleinsäuresequenzen, die das Protein codieren, in Vektor-Nukleinsäuren), transformierte oder transfizierte prokaryontische oder eukaryontische Wirtszellen, die solche Vektoren enthalten, und die synthetischen Polypeptide, die von diesen Systemen exprimiert werden, bilden weitere Teile der Erindung.
Weiterhin beschreibt die vorliegende Erfindung eine genomische DNA-Sequenz (oder ein Nukleinsäurenmolekül, das die besagte Sequenz enthält), die ein menschliches oder tierisches Gen ist, das das oben genannte Protein codiert, z. B. eine, zu der die cDNA oder eine Teilsequenz derselben komplementär ist, oder die damit hybridisiert.
Passende Hybridisierungsbedingungen werden unten beschrieben. Zum Beispiel kann die Sequenz unter Verwendung der erfindungsgemäßen cDNA oder einer Teilsequenz davon als Sonde aus einer beliebigen genomischen Bibliothek isoliert werden.
Weiterhin beschreibt die vorliegende Erfindung ein Nukleinsäurenmolekül, das eine Nukleotidsequenz umfasst, die die erfindungsgemäßen Proteine codiert. Solche Nukleinsäuremoleküle können einzelsträngige oder doppelsträngige DNA, cDNA oder RNA sein, bevorzugt DNA, und degenerierte, im Wesentlichen homologe und hybridisierende Sequenzen, die imstande sind, das erfindungsgemäße Protein/Polypeptid/Peptid zu codieren, umfassen.
Beispielsweise beschreibt die Erfindung ein cDNA-Molekül, das ein Protein codiert, das die Aminosäurensequenz SEQ ID NO: 1 codiert. In Bezug auf Nukleinsäuremoleküle bezieht sich der Ausdruck "Wesentliche Homologie" auf Sequenzen, die mindestens 80%, bevorzugt mindestens 85% oder 90% Sequenzhomologie aufweisen. Zu hybridisierenden Sequenzen gehören diese, die unter stringenten Bedingungen binden, z. B. 2 × SSC, 65°C (wobei SSC = 0,15 M Natriumchlorid, 0,015 M Natriumcitrat, pH 7,2), wie auch jene, die unter den beschriebenen Bedingungen hybridisieren würden, wäre der genetische Code nicht degeneriert (alternative Codonverwendung).
Ein Klon der erfindungsgemäßen cDNA kann leicht erhalten werden, indem man eine cDNA-Bibliothek aus Rattengewebe mit einer Oligonukleotidsonde, erstellt anhand der Basensequenz des Fragmentes, durchsucht. Alternativ kann die gewünschte cDNA unter Verwendung des Oligonukleotids als Primer mittels der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) synthetisiert werden. Polymorphismen werden als Ergebnis individueller Variation in vielen tierischen Genen gefunden. Daher muss berücksichtigt werden, dass jede cDNA, die einzelne oder mehrfache Einfügungen, Deletionen oder Substitutionen von Nukleotiden enthält, erfindungsgemäß ist, vorausgesetzt, dass sie das erfindungsgemäße Protein codiert. Proteine, die einzelne oder mehrfache Hinzufügungen, Deletionen und/oder Substitutionen von Aminosäuren enthalten, aber die gleiche Aktivität besitzen wie das Protein mit der Aminosäurensequenz aus SEQ ID NO: 1, das heißt funktionell gleichwertige Varianten, können erhalten werden, aber werden nicht von der vorliegenden Erfindung abgedeckt.
cDNA kann einen Teil einer Aminosäurensequenz codieren, das heißt ein Peptidfragment, codiert von einer zusammenhängenden Sequenz von 10 Basenpaare oder mehr (z. B. Oligonukleotide mit 10 bis 20 Basenpaaren). DNA-Fragmente (Sinnstrang und Gegensinnstrang), die eine solche zusammenhängende Sequenz enthalten, können als Sonden für Gendiagnose verwendet werden.
Antikörper können unter Verwendung des aktinfilamentbindenden Proteins I-Afadin als Immunogen hergestellt werden. Antikörper schließen Antigen-bindende Fragmente von Antikörpern (z. B. F(ab)², Fab- und Fv-Fragmente, also Fragmente der variablen Region des Antikörpers) ein. Unter Verwendung des oben beschriebenen Proteins selbst oder eines Teilpeptides (das heißt eines Fragmentes davon) als Antigen können Antikörper als polyklonale oder monoklonale Antikörper durch bekannte Verfahren hergestellt werden.
Die vorliegende Erfindung wird jetzt anhand der nachfolgenden Beispiele beschrieben werden, die nicht als Beschränkungen des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung aufgefasst werden sollten. Bezug wird genommen auf die Figuren:
1 zeigt die Ergebnisse einer Mono-Q-Säulen-Chromatographie: (a) Absorption bei 280 nm (A₂₈₀); (b) "blot overlay" mit [¹²⁵I]-markiertem F-Aktin; und (c) Proteinfärbung nach SDS-Page.
2 zeigt ein Schema der cDNA von I-Afadin (p205) und von s-Afadin (p190).
3 zeigt (a) die F-Aktin-bindende Aktivität verschiedener Fragmente von rekombinantem I-Afadin: links das Ergebnis des "blot overlay" mit [¹²⁵I]-markiertem F-Aktin; rechts das Ergebnis der Western-Blot-Analyse, und (b) Schemazeichnung der Strukturen von I-Afadin und s-Afadin.
4 zeigt die Ergebnisse der Analyse der Gewebsverteilung von I-Afadin: (a) Northern-Blot-Analyse, und (b) Western-Blot-Analyse mit (b1) Antikörper gegen I-Afadin und (b2) Antikörpern gegen I-Afadin und s-Afadin.
5 zeigt die biochemischen Eigenschaften von I-Afadin einschließlich (a) der Hemmung der F-Aktin-Bindungsaffinität von I-Afadin durch Myosin S1, (b) des durch I-Afadin hervorgerufenen Anstiegs der Viskosität von F-Aktin, und (c) der Bindung von 6-I-Afadin-C an F-Aktin.
6 zeigt Photographien, die die Lokalisierung von I-Afadin, E-Cadherin und Vinculin in verschiedenen Ratten- und Mäusegeweben darstellen.
7 zeigt Photographien, die die Lokalisation von I-Afadin und ZO-1 in EL-Zellen darstellen.
8 zeigt Photographien, die die verschiedenen Lokalisationen von I-Afadin, ZO-1 und Desmoplakin darstellen.
9 zeigt Photographien, die die Lokalisation von I-Afadin im Dünndarm der Ratte darstellen.
Beispiel 1: Identifizierung und Reinigung des aktinbindenden Proteins I-Afadin
Wachstumskegel wurden aus fötalem Rattenhirn isoliert und der Blot-Overlay-Methode (Cell Motil. Cytoskeleton, 18: 164–179, 1991) mit [¹²⁵I]-markiertem F-Aktiv unterzogen, um eine Bande zu identifizieren, die einem Molekulargewicht von 205 kDa entsprach (p205). Das Ergebnis der Verdrängungsversuche zeigte, dass das Protein spezifisch an F-Aktiv, aber nicht an G-Aktiv (Aktinmonomer) band, was zeigte, dass das Protein ein F-Aktiv-bindendes Protein war.
Im nächsten Schritt wurde die lösliche Fraktion des fötalen Rattenhirns durch SDS-Page aufgetrennt, und die Proteinbande mit einem Molekulargewicht von 205 kDa wurde durch säulenchromatographische Verfahren wie Q-Sepharose, Phenyl-5PW, Hydroxylapatit und Mono-Q gereinigt. Das Ergebnis der abschließenden Mono-Q-Säulen-Chromatographie ist in 1 dargestellt. In 1 zeigt (a) die Absorption bei 280 nm, (b) das Ergebnis eines Blot-Overlay mit [¹²⁵I] markiertem F-Aktiv und (c) die Proteinbanden nach Färbung mit Coomassie-Brilliantblau. Wie in 1(c) gezeigt, ergab das gereinigte Protein schließlich Banden mit Molekulargewichten von etwa 205 kDa (p205) und etwa 190 kDa (p190). Dann wurden die beiden gereinigten Proteine aus dem Polyacrylamidgel ausgeschnitten, mit einer Protease (Lysyl-Endopeptidase) begrenzt verdaut und einem "peptide mapping" unterzogen. Fünf den beiden Proteinen gemeinsame Peptide wurden isoliert, und teilweise Aminosäurensequenzen wurden getrennt bestimmt. Durch eine Homologiesuche in einer Sequenzdatenbank wurde bestätigt, dass die 5-Peptid-Peaks in signifikantem Maße homolog zu menschlichem AF-6-Protein waren. Die Aminosäurensequenzen der beiden für p205 spezifischen Peptid-Peaks wurden hingegen in keiner gegenwärtigen Proteindatenbank gefunden. Die Ergebnisse legen nahe, dass es sich bei p205 und p190 um mit dem menschlichen AF-6-Protein verwandte Rattenproteine handelte, und dass p190 eine Spleißvariante, ein Homolog oder ein Abbauprodukt von p205 war. Da das p205-Protein außerdem im Bereich der Adhärenzjunktion lokalisiert war, wurde das Protein als "an Adhärenzjunktionen lokalisierte große Spleißvariante des AF-6-Proteins:I-Afadin" bezeichnet (nachfolgend wird das erfindungsgemäße Protein als I-Afadin oder p205 bezeichnet).
Beispiel 2: Klonierung eines Gens für das Aktinfilament-bindende Protein „I-Afadin"
Anhand der in Beispiel 1 erhaltenen partiellen Aminosäurensequenzen des 205-kDa-Proteins I-Afadin wurden 7 Oligonukleotidsonden hergestellt und zum Durchsuchen einer cDNA-Bibliothek aus Rattenhirn verwendet. Hierdurch wurden mehrere einander überlappende Klone, in 2 dargestellt, erhalten. Die Sequenzierungsergebnisse zeigten, dass unter diesen Klonen der Klon Nr. 20 eine codierende Region mit etwa 4,9 kbp enthielt. Die aus dieser codierenden Region abgeleitete Aminosäurensequenz schloss die gesamten Peptide von p205 ein. Weiterhin wurden in der C-terminalen Region zwei für p205 spezifische Peptide identifiziert. Klon 94 enthielt eine codierende Region von etwa 4,5 kbp, die p190 codierte. Jedoch enthielten diese Klone 20 und 94 nicht das Startcodon, das in Klon 84 enthalten war. Daher wurde die vollständige cDNA für p205 aus den Klonen 84 und 20 zusammengesetzt, und die gesamte cDNA für p190 aus den Klonen 84 und 94.
FISH-Analyse (Cytogenet. Cell Genet. 61: 282–285, 1992; Electrophoresis 16: 261–272, 1995) unter Verwendung der Klone 20, 84 und 94 als Sonden zeigte, dass diese Sequenzen auf dem Rattenchromosom Iq12.2 lagen.
Beispiel 3: Expression des F-Aktin-bindenden Proteins I-Afadin in tierischen Zellen
Die in Beispiel 2 hergestellte cDNA für p205 wurde in einen Expressionsvektor eingefügt und in COS-1-Zellen transfiziert. Der Zellextrakt wurde der Blot-Overlay-Methode mit [¹²⁵I]-markiertem F-Aktin unterzogen. Das rekombinante Protein (myc-I-Afadin) zeigte eine Beweglichkeit im SDS-Page und ein Bindungsverhalten gegenüber [¹²⁵I]-markiertem F-Aktin, die der von nativem p205 ähnelten, wie in 3(a) gezeigt. Die Deletionsmutante von p205, der die C-terminalen 156 Aminosäuren fehlten, zeigte hingegen keine F-Aktin-bindende Aktivität. Im Gegensatz hierzu zeigte ein Fusionsprotein aus den C-terminalen 199 Aminosäurenresten von p205 und GTS (Glutathion-S-Transferase) Bindung an [¹²⁵I]-markiertes F-Aktin.
Anhand der beschriebenen Ergebnisse wurde bestätigt, dass das p205-Gen ein Protein aus 1829 Aminosäuren, wie in SEQ ID NO: 1 gezeigt, codiert, ein geschätztes Molekulargewicht von 207667 Dalton besitzt und in seinen C-terminalen 199 Aminosäuren eine F-Aktin-bindende Domäne besitzt. Weiterhin wurde geschlussfolgert, dass das p190-Gen ein Protein codiert, dem am C-Terminus etwa 160 Aminosäurereste fehlen, und eine Spleißvariante des p205-Gens darstellt.
Eine computergestützte Homologiesuche zeigte, dass die Aminosäuresequenz von p190 über die gesamte Länge verteilt, 90% Identität mit menschlichem AF-6-Protein aufweist. Jedoch fehlte dem menschlichen AF-6-Protein und dem p190 die C-terminate Region von p205. Außerdem zeigte die C-terminale F-Aktin-bindende Domäne keine nennenswerte Homologie mit ir gendeinem anderen F-Aktiv-bindenden Protein. Es wurde somit bestätigt, dass p205 ein neuartiges F-Aktiv-bindendes Protein ist, während es sich bei p190 wahrscheinlich um ein Ratten-Gegenstück von menschlichem AF-6 handelt. Wie in 3(b) gezeigt, besitzen sowohl p205 als auch p190 eine PDZ-Domäne.
Beispiel 4: Herstellung von Antikörpern gegen I-Afadin
Unter Verwendung bekannter Methoden und eines synthetischen Peptids, das den Aminosäureresten 1814–1829 von SEQ ID NO: 1 entsprach, als Immunogen wurde ein polyklonaler Kaninchen-Antikörper hergestellt, der spezifisch I-Afadin erkannte. Unter Verwendung eines synthetischen Peptids, das den Aminosäureresten 557–592 aus SEQ ID NO: 1 entsprach, als Immunogen, wurde ein polyklonaler Kaninchen-Antikörper hergestellt, der spezifisch sowohl I-Afadin als auch s-Afadin erkannte.
Beispiel 5: Charakterisierung der Gewebe, die I-Afadin exprimieren
Northern-Blot-Analyse unter Verwendung einer für I-Afadin-cDNA spezifischen Sequenz als Sonde zeigte, dass I-Afadin in allen untersuchten Rattengeweben einschließlich von Herz, Gehirn, Milz, Lunge, Leber, Skelettmuskel, Nieren und Hoden ubiquitär exprimiert wird, wie in 4(a) gezeigt.
Weiterhin wurde durch Western-Blot-Analyse unter Verwendung des Anti-I-Afadin-Antikörpers aus Beispiel 4 nachgewiesen, dass I-Afadin in allen Rattengeweben exprimiert wird, wie in 4(b1) gezeigt. Jedoch wurde, wie in 4(b2) gezeigt, durch Western-Blot-Analyse unter Verwendung des Antikörpers, der sowohl I-Afadin als auch s-Afadin erkennt, gezeigt, dass s-Afadin nur im Gehirn exprimiert wird.
Aus den beschriebenen Ergebnissen wurde geschlossen, dass das erfindungsgemäße I-Afadin in allen Geweben exprimiert wird, während s-Afadin nur im Gehirn exprimiert wird.
Beispiel 6: Biochemische Charakteristika von I-Afadin
Die Blot-Overlay-Untersuchung der Aktiv-Bindungsfähigkeit des in Beispiel 1 erhaltenen 205-kDa-Proteins (I-Afadin) zeigte, dass die Bindung von I-Afadin an F-Aktiv spezifisch durch Myosin S1 inhibiert wird (5(a)), aber die Inhibition durch die Zugabe von Magnesium und ATP aufgehoben wird. Da bekannt ist, dass Myosin S1 ein Protein ist, das seitlich an F-Aktiv binden kann (Science 261: 58–65, 1993; Nature 364: 171–174, 1993), und Magnesium und ATP den Komplex aus F-Aktiv und Myosin zur Auflösung bringen (Biochemistry 14: 2207–2214, 1975) wurde geschlossen, dass I-Afadin an der Seite von F-Aktiv bindet.
Die Veränderung der Viskosität von F-Aktiv infolge von I-Afadin wurde unter Verwendung der Kugelfall-Methode untersucht (Methods Enzymol. 85: 211–233, 1982; J. Biol. Chem. 271: 31775–31778, 1996). Es wurde gefunden, dass I-Afadin dosisabhängig die Viskosität von F-Aktin bis zum etwa 3-fachen des Ausgangswertes erhöht, wie in 5(b) dargestellt. Weiterhin wurde durch stöchiometrische Betrachtung gezeigt, dass His6-I-Afadin-C an F-Aktiv in ei nem molaren Verhältnis von etwa 1 zu 500 bindet, und dass die Gleichgewichtskonstante sich in einer Größenordnung von 10^–7 Mol bewegt (5(c)).
Weiterhin wurde die Wirkung von I-Afadin auf F-Aktiv unter Verwendung von Pyren-konjugiertem Aktiv untersucht. Es wurde gezeigt, dass I-Afadin die Aktiv-Polymerisation nicht beeinflusst.
Beispiel 7: Lokalisierung von I-Afadin
Unter Verwendung des Antikörpers gegen I-Afadin wurden Gefrierschnitte verschiedener Mäuse- und Rattengewebe im Konfokalmikroskop betrachtet, um die Lokalisierung von I-Afadin zu identifizieren.
In der Leber ist I-Afadin in einer gürtelartigen Bundstruktur entlang der Gallenkanälchen lokalisiert (6(a)). Im Dünndarm wurde nach Doppelfärbung mit dem monoklonalen Antikörper gegen E-Cadherin das I-Afadin in einer komplexen verbindenden Region des resorptiven Darmepithels zusammen mit E-Cadherin gefunden, aber war in dieser Region stärker konzentriert als E-Cadherin (6(b1)–(b3) und (c1)–(c3)). Das Herz wurde mit monoklonalen Antikörpern gegen Vinculin doppelt gefärbt. Vinculin ist als Marker nicht nur für Zell-Zell-AJs, sondern auch für Zell-Matrix-AJs bekannt (Cell 18: 193–205, 1979; Biochem. Biophys. Acta 737: 305–341, 1983). I-Afadin wurde im Bereich der Zwischenscheiben mit Vinculin co-lokalisiert gefunden (6(d1)–(d3)). Während jedoch Vinculin auch in regelmäßigen Abständen entlang der Längsseite von Herzmuskelzellen zu finden ist, wurde I-Afadin in diesem Bereich nicht gefunden. Weiterhin war nach Doppelfärbung von kultivierten EL-Zellen, die E-Cadherin exprimierten (Nature 329: 341–343, 1987), mit Antikörpern gegen ZO-1 die Lokalisierung von I-Afadin ähnlich der von ZO-1 (7(a) und (b)). Da es von ZO-1 bekannt ist, dass es in Fibroblasten im Bereich von Cadherin-basierten punktförmigen Zell-Zell-Kontakten konzentriert ist (J. Cell Biol. 115: 1149–1462, 1991; J. Cell Biol. 121: 491–502, 1993), wurde angenommen, dass I-Afadin auch an Cadherin-basierten Zell-Zell-AJs lokalisiert ist.
Um die genaue Lokalisation von I-Afadin zu bestimmen, wurden außerdem Gefrierschnitte des Dünndarms mit dem monoklonalen Antikörper gegen ZO-1 und dem Antikörper gegen I-Afadin doppelt gefärbt. Zusätzlich wurden Gallenkanälchen mit dem monoklonalen Antikörper gegen Desmoplakin und im Antikörper gegen I-Afadin doppelt gefärbt. ZO-1 ist ein bekannter Marker für „Tight Junctions" im resorptiven Darmepithel (J. Cell Biol. 103: 755–766, 1986; J. Cell Biol. 121: 491–502, 1993), und Desmoplakin ist ein Macker für Desmosomen (J. Cell Biol. 63: 515–523, 1974; Eur. J. Cell Biol. 32: 117–130, 1983; J. Mol. Biol. 163: 647–671, 1983; EMBO J. 6: 885–889, 1987). Die Ergebnisse zeigten, dass I-Afadin in den resorptiven Dünndarmepithelien etwas mehr auf der basalen Seite zu finden ist als ZO-1 (8(a1)–(a3)). Im Gallengang fiel die Lokalisation von I-Afadin nicht mit der Desmoplakin zusammen (8(b1)–(b3)).
Diese Ergebnisse zeigen, dass I-Afadin eher an Zell-Zell-AJs lokalisiert ist als an „Tight Junctions" oder Desmosomen. Weiterhin wurde in der Immuno-Elektronenmikroskopie beob achtet, dass I-Afadin in den Zell-Zell-AJs resorptiver Dünndarmepithelien lokalisiert ist (9(a) und (b)).
Demgemäß wurde nachgewiesen, dass das erfindungsgemäße I-Afadin ein neuartiges Protein ist, das das Aktin-Zytoskelett und Zell-Zell-AJs verbindet.
Wie oben im Einzelnen dargelegt, beschreibt die vorliegende Erfindung ein neuartiges Aktinfilament-bindendes Protein, I-Afadin, das an Cadherin-basierten Zell-Zell-Adhärenzjunktionen lokalisiert ist, und das genetische Material, um I-Afadin industriell zu nutzen.
Sequenzprotokoll

Claims

Actin-bindendes Protein I-Afadin mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1.
Nukleinsäuremolekül, das eine das in Anspruch 1 definierte Protein kodierende Nukleotidsequenz umfasst.
Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 2, wobei das Nukleinsäuremolekül cDNA ist.
Klonierungs- oder Expressionsvektor, der ein in Anspruch 2 oder 3 definiertes Nukleinsäuremolekül enthält.
Wirtszelle, die mit einem in Anspruch 2 oder 3 definierten Nukleinsäuremolekül transformiert ist oder ein in Anspruch 3 definiertes Nukleinsäuremolekül enthält.
Verfahren zur Herstellung eines in Anspruch 1 definierten Proteins, wobei man eine Wirtszelle, die ein das Protein kodierendes Nukleinsäuremolekül enthält, unter Bedingungen kultiviert, wodurch das Protein exprimiert wird, und das auf diese Weise produzierte Protein gewinnt.
In Anspruch 1 definiertes synthetisches Protein, das von einer in Anspruch 5 definierten Wirtszelle exprimiert ist.