DE69535467T2

DE69535467T2 - Faktor aus pigmentiertem Epithel (PEDF): Charakterisierung, genomische Organisation und Sequenz des PEDF-Gens

Info

Publication number: DE69535467T2
Application number: DE69535467T
Authority: DE
Inventors: Gerald J. Bethesda CHADER; Sofia Patricia Bethesda BECERRA; Joan P. Bethesda SCHWARTZ; Takayuki Rockville TANIWAKI
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1994-06-07
Filing date: 1995-06-06
Publication date: 2008-01-03
Anticipated expiration: 2015-06-07
Also published as: JP2009153517A; US6319687B1; EP0765169A1; CA2704083C; EP0765169B1; CA2190365A1; DE69536028D1; ATE451118T1; JPH10504705A; DE69535467D1; AU710141B2; CA2190365C; JP5108797B2; EP1864678A1; CA2704083A1; ATE359810T1; AU2768195A; JP2006149405A; WO1995033480A1; US7179621B1

Description

Fachgebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neurotrophes, neuronotrophes und gliastatisches Protein. Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung die biologischen Eigenschaften eines Proteins, das als Pigmentepithel-abstammender Faktor („pigment epithelium-derived factor", PEDF) bekannt ist, und rekombinante Formen des Proteins. Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung eine verkürzte Version von PEDF, die als rPEDF bezeichnet wird. Zusätzlich zu PEDF und rPEDF und funktionell äquivalenten Proteinen betrifft die vorliegende Erfindung Nucleinsäuren, die rPEDF und Fragmente davon codieren, Vektoren, die solche Nucleinsäuren umfassen, Wirtszellen, in welche solche Vektoren eingeführt wurden, und die Verwendung dieser Wirtszellen zum Herstellen solcher Proteine
Stand der Technik
Der Pigmentepithel-abstammende Faktor, der auch als Pigmentepithel-Differenzierungs-Faktor bekannt ist, wurde im konditionierten Medium von gezüchteten fetalen menschlichen retinalen Pigmentepithelzellen als ein extrazelluläres neurotrophes Mittel identifiziert, das in der Lage ist, bei gezüchteten menschlichen Retinoblastomzellen den Auswuchs von Neuriten zu induzieren (Tombran-Tink et al., (1989), Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 30 (8), 1700–1707). Die Struktur, von der PEDF abstammt, nämlich das retinale Pigmentepithel (RPE), ist möglicherweise für die normale Entwicklung und Funktion der neuralen Retina entscheidend. Eine Vielzahl von Molekülen, einschließlich Wachstumsfaktoren, wird von den RPE-Zellen synthetisiert und ausgeschieden. Da das RPE sich früher als die neurale Retina entwickelt und angrenzend daran liegt und da es als ein Teil der Blut-Retina-Schranke dient (Fine et al., (1979), The Retina, Ocular Histology: A Text and Atlas, New York, Harper & Row, 61–70), wurde das RPE mit Gefäß-, Entzündungs-, degenerativen und dystrophischen Krankheiten des Auges in Verbindung gebracht (Elner et al., (1990), Am. J. Pathol. 136: 745–750). Zwischen dem RPE und der Retina werden zusätzlich zu Wachstumsfaktoren auch Nährstoffe und Stoffwechselprodukte ausgetauscht. Z.B. versorgt das RPE die Retina mit den bekannten Wachstumsfaktoren PDGF, FGF, TGF-α und TGF-β (Campochiaro et al., (1988), Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 29: 305–311; Plouet (1988), Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 29: 106–114; Fassio et al., (1988), Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 29: 242–250; Connor et al., (1988), Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 29: 307–313). Die Wahrscheinlichkeit ist sehr groß, dass diese und andere unbekannte Faktoren, die durch das RPE geliefert werden, die Organisation, Differenzierung und normale Funktion der Retina beeinflussen. WO 93/24529 betrifft u.a. die neurotrophe Behandlung verletzter Nerven, insbesondere führt die Behandlung mit PEDNF zu einer Förderung des Auswuchses von Neuriten und der Regeneration von Nerven.
Um die Effekte mutmaßlicher Differenzierungsfaktoren, die durch RPE ausgeschieden werden, zu untersuchen und zu bestimmen, wurden gezüchtete Zellen mit Retinaextrakten und konditioniertem Medium, das aus Kulturen von menschlichen fetalen RPE-Zellen erhalten wurde, in Kontakt gebracht. Z.B. offenbart das US-Patent Nr. 4 996 159 (Glaser) einen aus RPE-Zellen gewonnenen Gefäßneubildungs-Inhibitor, der ein Molekulargewicht von etwa 57 000 ± 3 000 aufweist. Ähnlich offenbaren die US-Patente Nr. 1 700 691 (Stuart), 4 477 435 (Courtois et al.) und 4 670 257 (Guedon geb. Saglier et al.) Retinaextrakte und die Verwendung dieser Extrakte für die zelluläre Regeneration und Behandlung von Augenkrankheiten. Weiterhin beschreiben die US-Patente Nr. 4 770 877 (Jacobson) und 4 534 967 (Jacobson et al.) Zellproliferations-Inhibitoren, die aus dem hinteren Teil der Glaskörperflüssigkeit des Rindes gereinigt wurden.
Erst kürzlich wurde PEDF aus menschlichem RPE als ein 50-kDa-Protein isoliert (Tombran-Tink et al., (1989), Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 29: 414; Tombran-Tink et al., (1989), Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 30: 1700–1707; Tombran-Tink et al., (1991), Exp. Eye Res. 53: 411–414). Genauer gesagt wurde gezeigt, dass PEDF die Differenzierung der menschlichen Retinomblastomzellen Y79 induziert, die ein neoplastisches Gegenstück zu den normalen Retinoblasten sind (Chader (1987), Cell Different. 20: 209–216). Die durch PEDF induzierten Differenzierungs-Änderungen schließen die Erweiterung eines komplexen Netzwerkes von Neuriten und die Expression von neuronalen Markern wie Neuron-spezifischer Enolase und Neurofilament-Proteinen ein. Dies ist der Grund, warum vermutet wird, dass die Synthese und Sekretion von PEDF-Protein durch das RPE einen Einfluss auf die Entwicklung und Differenzierung der neuralen Retina hat. Außerdem wird der PEDF nur in undifferenzierten menschlichen Retinazellen wie in den Retinoblastomzellen Y79 stark exprimiert, fehlt jedoch in ihren differenzierten Gegenstücken entweder ganz oder ist in ihnen herunterreguliert. Kürzlich wurde berichtet, dass PEDF-mRNA in ruhenden menschlichen fetalen W1-Fibroblastenzellen sehr stark exprimiert wird, in ihren alternden Gegenstücken jedoch nicht exprimiert wird (Pignolo et al., 1993).
Für eine weitere Untersuchung von PEDF und die Aufklärung seines möglichen therapeutischen Nutzens in der Behandlung von Entzündungs-, Gefäß-, degenerativen und dystrophischen Krankheiten der Retina und des Zentralnervensystems (ZNS) ist es erforderlich, dass man große Mengen von PEDF gewinnen kann. Leider wird eine weitere Untersuchung von PEDF aufgrund der geringen Mengen von PEDF im fetalen menschlichen Auge und außerdem aufgrund der seltenen Verfügbarkeit des Gewebes, aus dem er stammt, insbesondere hinsichtlich der Restriktionen bei der Verwendung fetalen Gewebes in der Forschung und in therapeutischen Anwendungen, bestenfalls schwierig gemacht. Deshalb bleibt ein Bedarf für große Mengen von PEDF und äquivalenten Proteinen. Demgemäß würde die Gewinnung von Nucleinsäuren, welche den PEDF und äquivalente Proteine codieren, und die Fähigkeit, PEDF und äquivalente Proteine in großen Mengen zu produzieren, einen entscheidenden Einfluss auf die weitere Untersuchung von PEDF, seiner Struktur, seiner biochemischen Aktivität und seiner zellulären Funktion, und außerdem auf die Entdeckung und die Gestaltung therapeutischer Anwendungen für PEDF haben.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein in vitro-Verfahren zur Verlängerung des Überlebens von neuronalen Zellen, umfassend:
das Behandeln einer Zellpopulation, umfassend Neuronen, mit Pigmentepithelabstammendem Faktor (PEDF) oder einem aktiven Fragment davon, welches neuronotrophe Aktivität hat.
Die neuronalen Zellen liegen in einer Gewebezellkultur vor oder umfassen eine Komponente eines Gewebes, die in ein Individuum verpflanzt wird. Die Zellen können fetale Gehirnzellen, Neuronen in einer Primärkultur oder Photorezeptor-Neuronen sein.
In einer spezifischen Ausführungsform umfasst das Verfahren der Erfindung:

a) das Einführen einer Nucleinsäure, die PEDF oder ein aktives Fragment davon, welches neuronotrophe Aktivität hat, codiert, in eine Wirtszelle; und
b) das Exprimieren der Nucleinsäure und dadurch das Bereitstellen des PEDF oder des aktiven Fragment davon, welches neuronotrophe Aktivität hat.

Die Wirtszelle kann eine Nervenzelle, eine Astrogliazelle, ein Photorezeptor-Neuron oder eine retinale Pigmentepithelzelle sein.
Außerdem betrifft die Erfindung die Verwendung von PEDF oder eines aktiven Fragments davon, welches neuronotrophe Aktivität hat, einer Nucleinsäure, welche PEDF oder ein aktives Fragment davon, welches neuronotrophe Aktivität hat, codiert, und/oder einem Vektor, umfassend ein Nucleinsäuremolekül, welches PEDF oder ein aktives Fragment davon, welches neuronotrophe Aktivität hat, codiert, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Verlängerung des Überlebens von neuronalen Zellen.
Das in der vorliegenden Erfindung verwendete Nucleinsäuremolekül ist ein Nucleinsäuremolekül, umfassend eine Nucleinsäure, ausgewählt aus:

(a) einer Nucleinsäuresequenz, wie in SEQ ID NO: 1 dargestellt; und
(b) einer Nucleinsäuresequenz, welche ein Polypeptid codiert, welches die Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO: 2 oder 3 dargestellt, hat.

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Nucleinsäuren, welche PEDF und funktionelle Fragmente davon codieren, Vektoren, welche solche Nucleinsäuren umfassen, Wirtszellen, in welche solche Vektoren eingeführt wurden, und ein rekombinantes Verfahren zum Herstellen von PEDF und äquivalenten Proteinen. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist das Erhalten der genomischen DNA-Sequenzen, die PEDF codieren, das Identifizieren der Intron-Exon-Übergänge, das Lokalisieren auf einem Chromosom im menschlichen Genom und das Bereitstellen der regulatorischen Regionen des Gens, welche die genomische Sequenz flankieren. Die vorliegende Erfindung betrifft eine solche genomische PEDF-DNA.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung struktureller Merkmale von PEDF sowie seiner sowohl strukturellen als auch funktionellen Ähnlichkeiten mit der Serpin-Familie von Serinprotease-Inhibitoren.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von PEDF und äquivalenten Proteinen, die gemäß einem solchen rekombinanten Verfahren hergestellt wurden, wobei der auf diese Weise produzierte PEDF und die auf diese Weise produzierten äquivalenten Proteine frei von den Risiken sind, die mit der Isolierung von PEDF aus den in der Natur vorkommenden Quellen-Organismen assoziiert sind.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Nucleinsäuren für eine verkürzte Version von PEDF, die als rPEDF bezeichnet wird, und äquivalente Proteine, Vektoren, die solche Nucleinsäuren umfassen, Wirtszellen, in die solche Vektoren eingeführt wurden, und eines rekombinanten Verfahrens zum Herstellen von rPEDF und äquivalenten Proteinen. Außerdem ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung von rPEDF und äquivalenten Proteinen, die gemäß einem solchen rekombinanten Verfahren hergestellt werden.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines PEDF-Proteins, welches neuronotrophe Aktivität hat. Die neuronotrophe Aktivität äußert sich in einem verlängerten Überleben von neuronalen Zellen. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung von Verfahren zum Behandeln von neuronalen Zellen, so dass das Überleben von Neuronen gefördert/verlängert wird, umfassend das Behandeln solcher Zellpopulationen mit einer wirksamen Menge von PEDF oder eines aktiven Fragments davon.
Außerdem werden hier Antikörper beschrieben, die spezifisch PEDF erkennen, entweder monoclonale oder polyclonale Antikörper, die gegen natives Protein, gegen das rekombinante Protein oder gegen ein immunreaktives Fragment davon hervorgerufen wurden. Außerdem werden hier Verfahren zum Nachweisen von PEDF durch Immuntest unter Verwendung eines solchen Antikörperpräparats zum Bestimmen von Alters- und/oder anderen degenerativen Krankheiten beschrieben. Weiterhin wird ein Verfahren zur Verwendung von PEDF-Antikörpern zum spezifischen Hemmen von PEDF-Aktivität beschrieben.
Diese und andere Aufgaben und Vorteile der vorliegenden Erfindung sowie zusätzliche erfindungsgemäße Merkmale werden aus der hier bereitgestellten Beschreibung der Erfindung ersichtlich sein.
Beschreibung der Figuren
1: Struktur des menschlichen PEDF-Gens: Restriktionskarte und Organisation des menschlichen PEDF-Gens. Die Exons 1 bis 8 sind durch schwarze Kästchen bezeichnet und mit 1 bis 8 numeriert. Introns und flankierende DNA sind durch die waagrechte Linie dargestellt und mit A bis G bezeichnet. Positionen mehrerer genomischer Clone sind über und unter dem schematisch dargestellten Gen angegeben. Erkennungsstellen für die Restriktionsendonuclease NotI („N"), BamHI („B") und EcoRI („E") sind durch senkrechte Pfeile angegeben.
2: Southern-Analyse von menschlicher genomischer DNA (A) und P147 (B), gespalten mit den Endonucleasen BamHI, EcoRI, HindIII und PstI: Southern-Membranen aus Pulsfeldelektrophorese-Gelprofilen wurden mit radioaktiv markierter PEDF-cDNA sondiert. Das Hybridisierungsmuster von P147-DNA stimmt mit der gesamten menschlichen genomischen DNA überein. Größenmarker sind angegeben.
3: 5'-Flankierende Region des PEDF-Gens: Das erste Exon (Großbuchstaben) und die ersten 1050 bp der 5'-flankierenden Region sind dargestellt. Zwei Alu-Wiederholungssequenzen sind unterstrichen. Mögliche Bindungsstellen für HNF-1, PEA3, Octomer (Oct), c/EBP sind unterstrichen und markiert. Die mutmaßlichen AP-1-Stellen sind in fetten Buchstaben dargestellt, und TREp/RAR sind doppelt unterstrichen. Die unterstrichene (gestrichelt) Sequenz in Exon 1 wurde durch 5'-RACE bestimmt.
4: Northern-Blot-Analyse von PEDF-mRNA: Genexpressions-Analyse des menschlichen PEDF-Transkripts in verschiedenen menschlichen erwachsenen und fetalen Geweben. Die Gewebe, aus denen die RNA erhalten wurde, sind über den entsprechenden Bahnen angegeben. Die Membranen enthalten für jede Probe 2 μg Poly(A)-RNA und wurden mit radioaktiv markierter cDNA für menschlichen PEDF sondiert. Ein einzelnes 1,5-kb-Transkript ist sowohl in erwachsenen als auch in fetalen Geweben zu sehen, wobei die größte Intensität der Hybridisierung in Leber, Hoden, Skelettmuskel und Ovar vorlag, während das Signal für Gehirn, Pankreas und Thymus signifikant schwächer war als dasjenige für andere Gewebe. Kein signifikantes Signal wurde für erwachsene Niere und Milz nachgewiesen. Ein signifikanter Unterschied in PEDF-mRNA-Spiegeln zeigte sich zwischen erwachsener und fetaler Niere.
5: Evolutionärer Zusammenhang des menschlichen PEDF-Gens: Jede Bahn repräsentiert für jede Art insgesamt 8 μg genomische DNA, gespalten mit EcoRI. Die Southern-Blot-Analyse wird mit einer PEDF-Sonde gezeigt. Hybridisierungssignale für Huhn (A), Säuger (B) und Primaten (C) sind dargestellt. Ein großes Fragment von etwa 23 kb ist bei allen Primaten und zahlreichen Sängerarten zu sehen. Außerdem werden in den verschiedenen untersuchten Sängerarten mehrere Polymorphismen nachgewiesen.
6A und 6B: Zusammenhang zwischen plattierter Zelldichte und optischer Dichte, gemessen durch den MTS-Test: Unterschiedliche Konzentrationen von Cerebellum-Körnerzellen vom Tag 8 nach der Geburt wurden in eine Platte mit 96 Vertiefungen gegeben und in serumenthaltendem Medium (6A) oder in chemisch definiertem Medium (6B) gezüchtet. Die optische Dichte wurde an den in vitro-Tagen (DIV) 1, 4 oder 7 gemessen. Quadrat, DIV 1; gefüllter Kreis, DIV 4; leerer Kreis, DIV 7. Die Daten sind als Funktion der Zelldichte aufgetragen (n = 6).
7: Zeitverlauf für eine PEDF-Stimulation des Überlebens von Zellen in chemisch-definiertem Medium: Cerebellum-Körnerzellen vom Tag 8 nach der Geburt wurden in einer Platte mit 96 Vertiefungen gezüchtet. PEDF wurde am DIV 0 zugegeben, und danach wurde die optische Dichte am DIV 1, 4, 7 oder 10 gemessen. Gefüllter Balken, Kontrolle; kreuzschraffierter Balken, PEDF-behandelt (50 ng/ml); gestreifter Balken, PEDF-behandelt (500 ng/ml). Die Daten sind als optische Dichte pro Vertiefung angegeben (Mittelwerte ± SEM („standard error of median", Standardabweichung des Mittelwerts"), n = 6). Die statistische Analyse erfolgte durch die zweiseitige ANOVA mit post-hoc-Scheefe-Test. ** P < 0,0001 gegenüber der Kontrolle.
8: Dosis-Antwort-Kurve für PEDF in chemisch definiertem Medium: Verschiedene Konzentrationen von PEDF wurden am DIV 0 zugegeben und der MTS-Test am DIV 7 durchgeführt. Die Daten sind als Verhältnis zur Kontrolle angegeben (Mittelwert ± SEM, n = 6). Die statistische Analyse erfolgte durch einen einseitigen-post-hoc Scheffe-ANOVA-F-Test. ** P < 0,0001 gegenüber der Kontrolle.
9: MTS-Test von Cerebellum-Körnerzellen vom Tag 5 nach der Geburt am DIV 1 und DIV 2: Cerebellum-Körnerzellen vom Tag 5 nach der Geburt wurden in einer Platte mit 96 Vertiefungen gezüchtet, wobei ein Serum-enthaltendes Medium ohne Ara-C (A) oder ein chemisch definiertes Medium ohne F12 (B) verwendet wurde. Der MTS-Test wurde am DIV 1 und 2 durchgeführt. Gefüllter Balken, Kontrolle; gestreifter Balken, PEDF-behandelt (500 ng/ml). Die Daten sind als optische Dichte pro Vertiefung angegeben (Mittelwerte ± SEM, n = 6). Die statistische Analyse wurde durch einen zweiseitigen-post-hoc Scheffe-ANOVA-F-Test durchgeführt. ** p < 0,0005 gegenüber der Kontrolle.
10: BrdU-Einbau in Cerebellum-Körnerzellen vom Tag 5 nach der Geburt: Cerebellum-Körnerzellen vom Tag 5 nach der Geburt wurden in einer Platte mit 96 Vertiefungen gezüchtet, wobei ein serumenthaltendes Medium (SCM) ohne Ara-C oder ein chemisch definiertes Medium (CDM) ohne F12 verwendet wurde. PEDF wurde am DIV 0 zugegeben, BrdU wurde am DIV 1 zugegeben, und die Zellen wurde am DIV 2 fixiert. Gefüllter Balken, Kontrolle; gestreifter Balken, PEDF-behandelt (500 ng/ml). Die Zahl von markierten Nucleinsäuren ist als Prozentsatz der gesamten Zellpopulation angegeben (Mittelwert ± SEM). Für jeden Wert wurden mindestens 3000 Zellen gezählt.
11: Zusammenhang zwischen Zelldichte und Neurofilament-Gehalt, gemessen durch ELISA. Unterschiedliche Konzentrationen von Cerebellum-Körnerzellen vom Tag 8 nach der Geburt wurden in Platten mit 96 Vertiefungen gegeben und gezüchtet. Die optische Dichte wurde am DIV 7 gemessen. Die Daten sind als Funktion der Zelldichte aufgetragen.
12: Neurofilament-ELISA-Test in Cerebellum-Körnerzellen vom Tag 8 nach der Geburt. Die Zellen wurden in einer Platte mit 96 Vertiefungen mit oder ohne PEDF gezüchtet, wobei ein serumenthaltendes Medium (SCM) oder ein chemisch definiertes Medium (CDM) verwendet wurde. Nach Fixieren der Zellen am DIV 7 wurde ein Neurofilament-ELISA durchgeführt und die Daten sind als Verhältnis zur Kontrolle angegeben (Mittelwert ± SEM, n = 6 bis 10). Gefüllter Balken, Kontrolle; gestreifter Balken, PEDF-behandelt (500 ng/ml). Die statistische Analyse erfolgte durch einen zweiseitigen-post-hoc Scheffe-ANOVA-F-Test. * p < 0,05 gegenüber der Kontrolle.
13: Zusammenfassung von neuronotrophen Effekten von PEDF während zehn Tage in Kultur.
14: Effekte der verkürzten Peptide BP und BX auf die Lebensfähigkeit von CGC.
15: Wirkung von PEDF auf Astroglia aus Cerebellum.
16: Wirkung von PEDF auf Cerebellum-Mikroglia.
17: Reinigung von PEDF-immunreaktivem Protein aus Rinder-IPM: Waschflüssigkeiten von Rinder-IPM wurden A) einer TSK-3000-Größenausschluss-Chromatographie und anschließend B) einer Mono-S-Chromatographie unterworfen. Western-Blot-Einschübe zeigen die Fraktionen, die PEDF enthalten.
18: Enzymatische Deglycosylierung von PEDF, wie durch Western-Blot-Verfahren gezeigt: Die Behandlung von PEDF ist am Anfang jeder Zeile angegeben. Die Zahlen geben die Positionen von Mol.-Gew.-Standards an.
19: Antikörper gegen rPEDF erkennt spezifisch nativen PEDF mit hohem Titer: A) Western-Blot, der die Wirksamkeit des Antikörpers bis zu mindestens einer Verdünnung von 1:50 000 zeigt und der deutlich macht, dass die Zugabe eines Überschusses an rPEDF die Sichtbarmachung der Bande vollständig blockiert. B) Die Slot-Blot-Analyse zeigt die Fähigkeit, ≤ 1 ng des nativen Rinder-PEDF-Proteins nachzuweisen.
20: Negative Wirkung eines PEDF-Antikörpers auf die Verlängerung von Neuriten in Y-79-Zellen. Obere Reihe: Kontrollkulturen mit Rinderserumalbumin (RSA). Mittlere Reihe: Antikörper-Wirkung auf die Neuriten-Induktion durch natives Rinder-PEDF-Protein. Untere Reihe: Antikörper-Wirkung auf die Neuriten-Induktion durch Interphotorezeptor-Matrix (IPM).
21: Phasenkontrastmikroskopische Analyse des Auswuchses von Neuriten in Gegenwart oder in Abwesenheit von PEDF.
22: Phasenkontrastmikroskopische Analyse des Auswuchses von Neuriten in Gegenwart von rekombinantem PEDF und nativem isoliertem PEDF.
23: Schematisches Diagramm von C-terminalen Deletionen von rPEDF.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Protein, das neue, wichtige und nicht naheliegende Eigenschaften besitzt. Der Pigmentepithel-abstammende Faktor (PEDF) ist ein Protein mit neurotrophen, neuronotrophen und gliastatischen Eigenschaften. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die DNA-Sequenzen, welche das PEDF-Gen codieren, die genomische DNA, welche das PEDF-Gen enthält, und Fragmente des PEDF-Gens, welche Proteinfragmente von PEDF, die eine biologischen Aktivität haben, codieren.
Eine „neurotrophe" Aktivität ist hier als die Fähigkeit definiert, die Differenzierung einer neuronalen Zellpopulation zu induzieren. Z.B. wird die Fähigkeit von PEDF, die Differenzierung in gezüchteten Retinoblastomzellen zu induzieren, als neurotrophe Aktivität angesehen.
Eine „neuronotrophe" Aktivität ist hier als die Fähigkeit definiert, das Überleben von neuronalen Zellpopulationen zu verlängern. Z.B. ist die Fähigkeit von PEDF, auf neuronale Zellen als ein Neuronen-Überlebensfaktor zu wirken, eine neuronotrophe Aktivität.
Eine „gliastatische" Aktivität ist hier als die Fähigkeit definiert, das Wachstum und die Proliferation von Gliazellen zu hemmen. Z.B. ist die Fähigkeit von PEDF, das Wachstum und/oder die Proliferation von Gliazellen zu verhindern, eine gliastatische Aktivität.
Aufgrund der in der vorliegenden Erfindung aufgeklärten Protein-Aminosäuresequenz wurde gefunden, dass PEDF eine große Sequenzhomologie mit der Serpin-Genfamilie, deren Mitglieder Serinprotease-Inhibitoren sind, aufweist. Zahlreiche Mitglieder dieser Familie weisen eine strikt konservierte Domäne am Carboxylende auf, die als das reaktive Zentrum des Proteins dient. Deshalb wird angenommen, dass diese Proteine von einem gemeinsamen Vorläuferurgen abstammen. Jedoch unterscheidet sich die Entwicklungs-Regulation unter den Mitgliedern der Serpin-Genfamilie stark, wobei zahlreiche Vertreter von der klassischen Protease-Hemmaktivität abgewichen sind (Bock, (1990), Plenum Press, New York, Bock, S.C., Protein Eng. 4: 107–108; Stein et al., (1989), Biochem. J. 262: 103–107). Obwohl der PEDF eine Sequenzhomologie mit den Serpinen aufweist, zeigt die Analyse der cDNA-Sequenz, dass ihm die konservierte Domäne fehlt und dass er somit möglicherweise nicht die Funktion eines klassischen Protease-Inhibitors hat.
Durch genomische Sequenzierung und Analyse von PEDF wurden Sequenzen von Introns und Exons und außerdem etwa 4 kb einer 5'-Stromaufwärts-Sequenz bereitgestellt. Die vorliegende Erfindung zeigt die Lokalisierung des Gens für PEDF an 17p13.1, wobei sowohl in situ-Hybridisierung als auch Analysen von Körperzellhybrid-Panels verwendet wurden (Tombran-Tink et al., (1994), Genomics 19: 266–272). Diese Stelle ist sehr nah zu dem p53-Tumorsuppressor-Gen und außerdem zu der chromosomalen Lokalisierung einer Reihe hereditärer Krebserkrankungen, die nicht mit Mutationen im p53-Genprodukt in Zusammenhang stehen. Somit wird PEDF zu einem herausragenden Gen-Kandidaten für diese Krebserkrankungen.
Die vollständige genomische PEDF-Sequenz wird durch SEQ ID NO: 43 dargestellt. Das PEDF-Gen umfasst etwa 16 kb und enthält acht Exons, von denen alle konventionelle Consensus-Spleißstellen aufweisen. Die 5'-flankierende Region des PEDF-Gens enthält zwei Alu-Wiederholungselemente, die etwa zwei Drittel der ersten 1050 bp der mutmaßlichen Promotorsequenz abdecken. Außerdem gibt es mehrere Sequenzmotive, die möglicherweise durch Mitglieder verschiedener Familien von Transkriptionsfaktoren erkannt werden. Das Vorliegen von zwei möglichen Bindungsstellen für die ubiquitäre Octamer-Familie von Transkriptionsfaktoren könnte als Erklärung dienen, warum der PEDF in den meisten getesteten Geweben vorhanden ist. Das Vorliegen von anderen spezifischeren Elementen legt jedoch nahe, dass PEDF unter einer genauen Kontrolle steht, und bestätigt eine frühere Arbeit, die seine Effekte auf so verschiedene Prozesse wie neuronale Differenzierung und Fibroblasten-Alterung einschließt.
Die genomische PEDF-Sequenz oder Fragmente davon können als Sonde zum Nachweisen des Gens in einer Zelle eingesetzt werden. Außerdem kann eine solche Sonde in einem Kit zum Identifizieren eines Zelltyps, welcher das Gen enthält, verwendet werden. Durch die Verwendung einer DNA-Sonde, welche von der genomischen PEDF-Sequenz hergeleitet ist, können Mutationen, Deletionen oder andere Änderungen in der Genorganisation nachgewiesen werden.
Gewebeverteilung
Zwar wird der PEDF durch RPE-Zellen besonders stark exprimiert, er ist jedoch in den meisten Geweben, Zelltypen, Tumoren usw. durch Northern- und Western-Blot-Analysen nachweisbar. Z.B. lässt er sich in Glaskörperflüssigkeit und in wässrigen Körperflüssigkeiten ohne weiteres nachweisen. Außerdem wurde die wichtige Frage der subzellulären Lokalisierung von PEDF untersucht. Obwohl es scheint, dass der Großteil des PEDF ausgeschieden wird, haben wir einen PEDF-Antikörper eingesetzt und damit gezüchtete Affen-RPE-Zellen sondiert, und dabei haben wir gefunden, dass der PEDF mit dem Kern und außerdem mit sehr spezifischen Strukturen des Cytoskeletts im Cytoplasma assoziiert ist. Wichtig ist, dass dies mit dem Alter der Zellen und dem spezifischen untersuchten Zellzyklus-Status variiert. Z.B. scheint sich das Protein an den Spitzen der Pseudopodi von Primaten-RPE-Zellen zu konzentrieren, die während der anfänglichen Stadien der Anlagerung mit dem Substratum interagieren. Später jedoch verschwindet diese Färbung, und das Protein erscheint in Assoziation mit spezifischen Strukturen des Cytoskeletts und mit dem Kern vor. Es scheint also, dass PEDF sowohl im Kern als auch im Cytoplasma eine wichtige intrazelluläre Rolle spielt.
Beteiligung am Zellzyklus
Die vorliegende Erfindung zeigt, dass in sich teilenden, undifferenzierten Y-79-Zellen eine Expression vorliegt, dass dagegen in ihren ruhenden differenzierten Gegenstücken eine geringe oder keine Expression vorhanden ist (Tombran-Tink et al., (1994), Genomics 19: 266–272). Pignolo et al., (1993), J. Biol. Chem. 268: 2949–295) haben gezeigt, dass die Synthese von PEDF in den WI-38-Fibroblastenzellen auf das G₀-Stadium des Zellzyklus in jungen Zellen beschränkt ist. Außerdem fehlt PEDF-Boten-RNA in alten alternden Zellen.
Produktion von rekombinantem PEDF
Die Segmentierung des PEDF-Polypeptids ist eine Voraussetzung für Studien über Struktur und Funktion. Für diesen Zweck stellen Expressionsvektoren, die Fragmente von PEDF-codierenden Sequenzen enthalten, einen exzellenten Ausgangspunkt für das Synthetisieren und Isolieren unterschiedlicher Regionen des PEDF-Polypeptids bereit. Die Expression menschlicher fetaler PEDF-Sequenzen wurde mit E. coli-Expressionvektoren und der menschlichen fetalen PEDF-cDNA erreicht. Wir haben gezeigt, dass das rekombinante PEDF-Produkt (rPEDF) ein biologisch aktiver neurotropher Faktor ist und in Ausbeuten in der Größenordnung von 1,3 mg/g feuchten E. coli-Zellen erhalten wird. Außerdem können verkürzte Peptide aus geeigneten molekularbiologischen Konstrukten hergestellt und in E. coli exprimiert werden. Unter Verwendung dieser Produkte haben wir bewiesen, dass zwei getrennte Regionen auf der PEDF-Primärstruktur unterschieden werden können: 1) Ein „aktives Zentrum", das dem Molekül eine neurotrophe Aktivität verleiht, liegt innerhalb der Aminosäurereste 44 bis 121 in der Nähe des N-Terminus des Proteins, und 2) eine Region in der Nähe des C-Terminus mit Homologie zu einer exponierten Schleife von Serpin, d.h. dem „klassischen" aktiven Zentrum von Serpin. Diese Ergebnisse legen nahe, dass 1) die native Gesamt-Konformation von PEDF nicht für den Auswuchs von Neuriten erforderlich ist, und dass 2) eine Hemmung von Serinproteasen nicht die biologische Aktivität von PEDF erklären kann. Nun haben wir eine Reihe von verkürzten rPEDF-Konstrukten, welche die Proteinsequenz überspannen, vorliegen und können das spezifische neurotrophe „aktive Zentrum" in der Nähe des N-Terminus genau festlegen.
Charakterisierung mit einem hochspezifischen polyclonalen Antikörper
Gereinigter rekombinanter menschlicher PEDF wurde verwendet, um einen polyclonalen Antikörper („anti-rPEDF") zu entwickeln, der die PEDF-vermittelte neurotrophe Aktivität spezifisch blockiert. Weiterhin blockiert der anti-rPEDF vollständig die IPM-induzierte neurotrophe Aktivität.
Neuronotrophe Eigenschaften von PEDF
Zusätzlich zu der Demonstration, dass nativer PEDF und rPEDF in den Y-79- und Weri-Tumorzellsystemen neurotrophisch sind, wurde in der vorliegenden Erfindung ermittelt, ob der PEDF in Primärkulturen eine Wirkung auf normale Neuronen hat. Für diesen Zweck wurden Untersuchungen durchgeführt, bei denen Kulturen von normalen Cerebellum-Körnerzellen (CGCs) verwendet wurden, die aus der Ratte am Tag 8 nach der Geburt hergestellt worden waren. Die mit rPEDF behandelten Zellen reagierten nicht so auf die Behandlung, dass sie eine stärker ausgeprägte neuronale Morphologie zeigten. Jedoch hatte PEDF eine starke Wirkung auf das Überleben von Körnerzellen. Da diese Zellen keine tumorösen oder transformierten Zellen sind, haben sie in Kultur eine endliches Leben, wobei sie, abhängig vom Kulturmedium, nach etwa 21 Tagen absterben. Die mit PEDF behandelte Kultur enthielt dagegen nach zehn Tagen in Kultur in serumfreiem Medium im Vergleich zu einer unbehandelten Kultur bis zu zehnmal mehr Zellen (4). Diese Ergebnisse wurden bestimmt: 1) durch direkte mikroskopische Untersuchung und Zählen der Zellen; und 2) durch die Verwendung eines MTS-Tests (Tetrazolium/Formazan-Test), der die Anzahl lebender Zellen bestimmt (vgl. Beispiel 11). Somit hat PEDF eine dramatische Wirkung auf das Überleben von ZNS-Neuronen und sollte zu der kurzen Liste von neu entdeckten „neuronotrophen" Proteinen zugefügt werden.
In der allgemeinen Gewebekultur-Forschung:
Zwei Probleme, die im Allgemeinen für jedes Gewebekulturexperiment unter Verwendung von Neuronen und Glia ein Erschwernis darstellen, bestehen darin, dass die Neuronen dazu neigen, rasch abzusterben, und dass Glia dazu neigt, die Kulturschale zu überwachsen. PEDF oder seine Peptide können in beiden Fällen helfen. Somit könnte eine kommerzielle Verwendung von PEDF darin bestehen, ihn als einen allgemeinen Kulturmedium-Zusatz für ZNS-Zellen, die gezüchtet werden sollen, einzusetzen.
In Untersuchungen zur ZNS-Transplantation:
Man geht davon aus, dass bestimmte krankhafte Zustände durch eine Transplantation von Neuronen geheilt werden könnten. Z.B. könnte bei der Parkinson-Krankheit eine Transplantation von spezifischen fetalen Gehirnzellen in den Patienten die mit der Krankheit zusammenhängenden Probleme abschwächen oder heilen. Eines der Hauptprobleme, mit denen man sich befassen muss, würde darin bestehen, das Leben der transplantierten Zellen zu verlängern und sie im differenzierten Zustand zu halten, so dass sie z.B. die richtigen Substanzen ausscheiden, usw.. Eine Vorbehandlung der Zellen mit PEDF könnte in beiden Fällen helfen. Genauso kann man, wenn man entweder Neuronen oder Astroglia vor der Implantation mit dem PEDF-Gen transfiziert, auf diese Weise eine langfristige Quelle von PEDF an der Transplantationsstelle bereitstellen.
Mit großem Einsatz wird daran gearbeitet, mit einer Transplantation von neuralen Retina- und Photorezeptor-Zellen zur Heilung der Blindheit beizutragen. Die Versuche waren bisher sowohl aufgrund der Nicht-Differenzierung als auch aufgrund des Absterbens der Transplantate nicht erfolgreich. Wieder könnte PEDF in beiden Fällen helfen. Insbesondere Photorezeptor-Neuronen, die transplantiert werden sollen, können mit PEDF vorbehandelt werden, oder das Gen kann vor der Operation in die Zellen transfiziert werden. Alternativ kann PEDF mit hohen Spiegeln in benachbarte retinale Pigmentepithelzellen (RPE-Zellen) transfiziert werden, so dass diese dann als supranormale Quelle des Proteins dienen können. Verschiedene Forscher haben nun gezeigt, dass gezüchtete RPE-Zellen nach einer Transplantation in den Interphotorezeptor-Raum von Testtieren sehr gut überleben. Somit ist eine Transfektion menschlicher RPE-Zellen in vitro mit dem PEDF-Gen und die anschließende Verwendung dieser Zellen für eine Retina-Transplantation machbar.
Bei neurodegenerativen Krankheiten:
Zahlreiche neurodegenerative Krankheiten und andere-Verletzungen des ZNS (Gehirn und Retina) sind durch das Absterben von Neuronen und eine zu starke Population durch Glia (Gliose) gekennzeichnet. PEDF kann bei diesen Zuständen wirksam eingesetzt werden, um das Leben und das Funktionieren der primären Neuronen zu verlängern und das Ausbreiten von Glia abzuwenden. PEDF kann z.B. wirksam die als Antwort auf eine ZNS-Läsion auftretende Mikroglia-Aktivierung blockieren und außerdem das Leben von Neuronen verlängern/schonen.
Es lässt sich voraussagen, dass PEDF in der Retina die Müller-Gliazellen hemmt. Da die Müller-Zellen der Astroglia ähnlich sind, würde PEDF bei Zuständen wie Netzhautablösung, Diabetes, Retinitis pigmentosa usw., ähnlich wirksam die Gliose blockieren und außerdem das Leben der Retinaneuronen schonen.
Bei Glia-Krebserkrankungen:
Der Großteil der wichtigsten Formen von Krebserkrankungen, die das ZNS betreffen, umfasst Gliaelemente, deshalb kann PEDF, der ein gliastatischer Faktor ist, in Kombinationen mit anderen Therapieformen eingesetzt werden. Z.B. kann durch PEDF in Kombination mit einer Operation die Ausbreitung oder das Wiederauftreten der Krankheit wirksam gehemmt werden.
Genetische Analyse
Die vorliegende Erfindung betrifft die Bestimmung der Organisation des menschlichen PEDF-Gens und seines Promotors und die Analyse seiner evolutionären Verwandtschaft und seiner Expression in einer Vielzahl von menschlichen fetalen und erwachsenen Geweben.
Die vorliegende Erfindung stellt u.a. eine Nucleinsäure, welche PEDF codiert, bereit. Insbesondere wird eine wie in SEQ ID NO: 1 angegebene cDNA-Sequenz bereitgestellt. Diese cDNA-Sequenz codiert PEDF, der die wie in SEQ ID NO: 2 angegebene Aminosäuresequenz besitzt. Weitere genomische Sequenzen werden in 1 kartiert und in SEQ ID NO: 43 bereitgestellt. Zusätzliche Fragmente der genomischen PEDF-Sequenz werden in SEQ ID NO: 9 bis SEQ ID NO: 12 bereitgestellt. Die Lage von Intron-Exon-Übergängen ist in Tabelle 1 und in SEQ ID NO: 25 bis SEQ ID NO: 40 und SEQ ID NO: 43 angegeben.
Der Begriff „Nucleinsäure" bezieht sich auf ein Polymer von Desoxyribonucleinsäure (DNA) oder Ribonucleinsäure (RNA), das von einer beliebigen Quelle stammen kann, das einzel- oder doppelsträngig sein kann und das gegebenenfalls synthetische, nichtnatürliche oder veränderte Nucleotide, die in DNA- oder RNA-Polymere eingebaut werden können, enthalten kann. Die Nucleinsäure der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise ein DNA-Segment.
Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung verkürzte Versionen von PEDF bereit. Der größte Vertreter hiervon wird als rPEDF bezeichnet und umfasst die Aminosäuresequenz Met-Asn-Arg-Ile, fusioniert an Asp⁴⁴ ... Pro⁴¹⁸ von PEDF, dessen Aminoterminus deletiert wurde. Das Protein rPEDF umfasst die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 3. Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Nucleinsäure bereit, welche ein Protein codiert, das die Aminosäuresequenz von rPEDF, d.h. die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 3, umfasst.
Für den Fachmann wird selbstverständlich sein, dass mehr als eine Nucleinsäure ein bestimmtes Protein codieren können, und zwar aufgrund der Degeneration des genetischen Codes und der Erlaubnis von Ausnahmen von der klassischen Basenpaarung in der dritten Position des Codons, wie durch die sogenannten „Wobble-Regeln" angegeben wird. Demgemäß ist es so gemeint, dass die vorliegende Erfindung alle Nucleinsäuren umfasst, welche die Aminosäuresequenzen von SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 3 und außerdem äquivalente Proteine codieren. Der Begriff „äquivalente Nucleinsäuren" soll alle diese Nucleinsäuren umfassen.
Außerdem wird es für den Fachmann selbstverständlich sein, dass Aminosäuresequenzen verändert werden können, ohne dass die Funktion eines bestimmten Proteins ungünstig beeinflusst wird. Tatsächlich kann es sein, dass einige Änderungen in der Aminosäuresequenz zu einem Protein mit verbesserten Eigenschaften führen. Das Vorgehen zur Bestimmung, welche Aminosäuren verändert werden können, ohne die Funktion eines Proteins ungünstig zu beeinflussen, ist auf dem Fachgebiet geläufig. Außerdem können Proteine, die mehr oder weniger Aminosäuren einschließen, zu Proteinen führen, die funktionell äquivalent sind. Demgemäß ist es so gemeint, dass die vorliegende Erfindung alle Aminosäuresequenzen umfasst, die zu einem PEDF-Protein oder zu funktionellen Proteinfragmenten davon führen.
Einige Beispiele von möglichen äquivalenten Nucleinsäuren und äquivalenten Proteinen schließen ein: Nucleinsäuren mit Substitutionen, Additionen oder Deletionen, welche die Synthese des rPEDF-Proteins und äquivalenter Proteinfragmente davon steuern; Nucleinsäuren mit unterschiedlichen regulatorischen Sequenzen, welche die Produktion von rPEDF-Proteinen steuern; Varianten von rPEDF, welche unterschiedliche Aminosäuren und/oder eine Anzahl von Aminosäuren, die nicht vier ist, besitzen, die an das aminoterminale Ende des Proteins fusioniert sind; und PEDF und rPEDF und funktionelle Proteinfragmente davon mit Aminosäure-Substitutionen, -Additionen, -Deletionen, -Modifikationen und/oder posttranslationalen Modifikationen wie Glycosylierungen, welche die Aktivität nicht ungünstig beeinflussen. Da die neurotrophe Aktivität auf einen bestimmten Teil des PEDF-Proteins bezogen wurde, liegen Fragmente, die diese Reste enthalten, eindeutig im Umfang der vorliegenden Erfindung.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem einen Vektor bereit, der eine Nucleinsäure von SEQ ID NO: 1, eine Nucleinsäure, die ein Protein, umfassend die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2, oder ein äquivalentes Protein codiert, eine Nucleinsäure, die ein Protein, umfassend die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 3, oder konservativ modifizierte Proteinvarianten codiert, und konservativ modifizierte Nucleinsäurevarianten davon umfasst.
Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung den Vektor πFS17, der die Nucleinsäure von SEQ ID NO: 1 umfasst, und den Vektor pEV-BH, der eine Nucleinsäure umfasst, die ein Protein, umfassend die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 3, codiert, bereit. Für den Fachmann wird es selbstverständlich sein, dass die beschriebenen cDNA-Insertionen auch in alternativen Vektoren vorliegen können. Z.B. können Insertionen in Vektoren unterschiedlicher Natur wie Phagen, Viruscapsiden, Plasmiden, Cosmiden, Phagemiden, YACs vorliegen oder sogar an der Außenseite eines Phagen oder Viruscapsids angeheftet sein. Die Vektoren können sich in Wirtsbereich, Stabilität, Replikation und Aufrechterhaltung unterscheiden. Außerdem können sich die Vektoren in der Art der Kontrolle, die über die clonierten Insertionen ausgeübt wird, unterscheiden. Z.B. können Vektoren clonierte Insertionen unter die Kontrolle eines unterschiedlichen Promotors, Enhancers oder Ribosomenbindungsstelle stellen oder auch als Teil eines Transposons oder eines mobilen genetischen Elements organisieren.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem eine Wirtszelle bereit, in welche ein Vektor eingeführt wurde, der eine Nucleinsäure von SEQ ID NO: 1, eine Nucleinsäure, die ein Protein, umfassend die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2, oder ein äquivalentes Protein codiert, eine Nucleinsäure, die ein Protein, umfassend die Aminosäure von SEQ ID NO: 3, oder ein äquivalentes Protein codiert, oder eine äquivalente Nucleinsäure davon umfasst. Insbesondere kann die Wirtszelle den Vektor πFS17, der die Nucleinsäure von SEQ ID NO: 1 umfasst, oder den Vektor pEV-BH, der eine Nucleinsäure umfasst, die ein Protein, umfassend die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 3, codiert, aufweisen.
Die Vektoren der vorliegenden Erfindung können in eine geeignete Wirtszelle, die eine eukaryontische oder eine prokaryontische Zelle sein kann, eingeführt werden. Diese Wirtszellen können sich in ihren bevorzugten Wachstumsbedingungen, ihren Nährstoffbedürfnissen und ihrer Empfindlichkeit gegenüber Stoffen aus der Umwelt unterscheiden. Zum Einführen der Vektoren in die Wirtszellen können beliebige geeignete Verfahren eingesetzt werden. Im Fall von prokaryontischen Zellen kann der Vektor z.B. durch Elektroporation, Transformation, Transduktion, Konjugation oder Mobilisation eingeführt werden. Bei eukaryontischen Zellen können Vektoren z.B. durch die Verwendung von Elektroporation, Transfektion, Infektion, DNA-beschichteten Mikroprojektilen oder Protoplastenfusion eingeführt werden.
Die Form der eingeführten Nucleinsäure kann mit dem Verfahren variieren, das zum Einführen des Vektors in eine Wirtszelle verwendet wird. Z.B. kann die Nucleinsäure geschlossen ringförmig, mit einem Nick oder linearisiert sein, abhängig davon, ob der Vektor als ein autonom replizierendes Element aufrechterhalten, als Provirus oder Prophage eingebaut, transient transfiziert, transient infiziert, wie bei einem replikationsunfähigen Virus oder Phagen, oder durch Einzel- oder Doppel-Crossover-Rekombinationsereignisse stabil eingeführt werden soll.
Außerdem stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen von PEDF, rPEDF und äquivalenten Proteine bereit, wobei das Verfahren das Exprimieren des Proteins in einer Wirtszelle umfasst. Z.B. kann eine Wirtszelle, in welche ein Vektor eingeführt wurde, der eine Nucleinsäure von SEQ ID NO: 1, eine Nucleinsäure, die ein Protein, umfassend die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2, oder ein äquivalentes Protein codiert, eine Nucleinsäure, die ein Protein, umfassend die Aminosäure von SEQ ID NO: 3, oder ein äquivalentes Protein codiert, oder eine äquivalente Nucleinsäure davon umfasst, unter geeigneten Bedingungen gezüchtet werden, so dass sie das gewünschte Protein produziert. Insbesondere kann eine Wirtszelle, in die der Vektor πFS17, der die Nucleinsäure von SEQ ID NO: 1 umfasst, oder der Vektor pEV-BH, der eine Nucleinsäure umfasst, die ein Protein, umfassend die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 3, codiert, eingeführt wurde, unter geeigneten Bedingungen gezüchtet werden, so dass sie die Proteine produziert, welche die Aminosäuresequenzen von SEQ ID NO: 2 bzw. SEQ ID NO: 3 umfassen.
Die vorliegende Erfindung stellt auch einen rekombinant produzierten PEDF und funktionelle Proteinfragmente davon bereit, die gemäß dem vorstehend erwähnten, vorliegenden erfindungsgemäßen Verfahren der Züchtung einer geeigneten Wirtszelle zur Produktion des gewünschten Proteins hergestellt wurden. Die Produktion eines Proteins wie PEDF durch rekombinante Verfahren macht es möglich, große Mengen des Proteins in einem hochgereinigten Zustand zu erhalten, frei von jeglichen Krankheitserregern, die in Verbindung mit dem Protein vorliegen könnten, das aus einem in der Natur vorkommenden Quellen-Organismus isoliert oder gereinigt wurde, und außerdem wird dadurch vermieden, dass z.B. fetales Gewebe als Quelle für ein solches Protein verwendet werden muss.
Rekombinanter PEDF und funktionelle Proteinfragmente davon können als Wirkstoffe an Zellen verabreicht werden, wobei eine Vielzahl von Verfahren eingesetzt werden kann, einschließlich z.B. der Einführung von Nucleinsäuren wie DNA oder RNA, die das Protein codieren und die demgemäß innerhalb der Wirtszelle transkribiert und/oder translatiert werden können, der Zugabe von exogenem Protein und anderer geeigneter Verfahren der Verabreichung, die dem Fachmann bekannt sind. In welcher Form der Wirkstoff auch verabreicht wird, er kann entweder alleine oder in Kombination mit anderen Wirkstoffen unter Verwendung pharmazeutischer Zusammensetzungen und Formulierungen des Wirkstoffs, die für das Verabreichungsverfahren geeignet sind, eingesetzt werden. Pharmazeutisch verträgliche Excipienten, d.h. Vehikel, Adjuvantien, Träger oder Verdünnungsmittel, sind dem Fachmann bekannt und sind ohne weiteres verfügbar. Die Auswahl des Excipienten wird zum Teil durch die jeweilige Verbindung und außerdem durch das jeweilige Verfahren, das zum Verabreichen der Verbindung verwendet wird, bestimmt. Demgemäß gibt es eine große Vielfalt von geeigneten Formulierungen, die in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung hergestellt werden können. Jedoch sind pharmazeutisch verträgliche Excipienten bevorzugt, die die neurotrophen, neuronotrophen und gliastatischen Aktivitäten des rekombinanten Proteins nicht verändern.
Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der vorliegenden Erfindung und sollen in keiner Weise ihren Umfang einschränken.
Beispiel 1
In diesem Beispiel werden die Trypsinspaltung von PEDF und die Aminosäuresequenzierung der resultierenden Fragmente beschrieben.
PEDF wurde aus dem Medium einer Primärkultur von menschlichen fetalen RPE-Zellen durch Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) gereinigt. Anschließend wurde der HPLC-gereinigte PEDF reduziert und alkyliert. Danach wurde er getrocknet und in 50 μl CRA-Puffer (8 M Harnstoff, 0,4 M Ammoniumcarbonat, pH 8,0) wieder gelöst und sodann mit 5 μl 45 mM Dithiothreit (DTT) (Calbiochem, San Diego, KA) versetzt. Nach 15-minütigem Erhitzen auf 50°C wurde die Lösung abgekühlt und mit 5 μl 100 mM Jodessigsäure (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO) versetzt. Nach 15 Minuten wurde die Lösung auf eine Konzentration von 2 M Harnstoff verdünnt und einer Trypsinspaltung (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) bei 37°C für 22 Stunden unter Verwendung eines Enzym:Substrat-Verhältnisses von 1:25 (Gew./Gew.) unterworfen. Die tryptischen Peptide wurden aufgetrennt, indem eine engporige Umkehrphasen-HPLC auf einer Hewlett-Packard 1090-HPLC, ausgestattet mit einem 1040 Diodenarray-Nachweisgerät, unter Verwendung einer Vydac C18-Säule, 2,1 mm × 150 mm, durchgeführt wurde. Ein Gradient von 5 % B bei 0 Minuten, 33 % B bei 63 Minuten, 60 % B bei 95 Minuten und 80 % B bei 105 Minuten wurde mit einer Fließrate von 150 μl/Minute eingesetzt. In diesem Gradienten war der Puffer A 0,06 % Trifluoressigsäure/H₂O, und der Puffer B war 0,055 % Trifluoressigsäure/Acetonitril. Die chromatographischen Daten wurden bei 210 und 277 nm erhalten und die UV-Spektren von jedem Peak von 209 bis 321 nm bestimmt. Die Proben für die aminoterminale Sequenzanalyse wurden auf ein Polybren-Glasfaserfilter, das zuvor Zyklen durchlaufen hatte, aufgetragen und einem automatischen Edman-Abbau (Harvard Microchemical Facility, Boston, MA) auf einem ABI Modell 477A-Gasphasen-Proteinsequenziergerät (Programm NORMAL 1) unterworfen. Die resultierenden Phenylthiohydantoin-Aminosäure-Fraktionen wurden manuell identifiziert, wobei eine Online-ABI Modell 120A-HPLC und ein Shimadzu CR4A-Integrator verwendet wurden.
Die Trypsinspaltung des gereinigten PEDF und die Aminosäureanalyse der resultierenden Fragmente ergab nichtüberlappende Peptidsequenzen, einschließlich der Sequenzen
Beispiel 2
In diesem Beispiel werden die Konstruktion von Oligonucleotiden, basierend auf den Peptidsequenzen von Beispiel 1, die Verwendung der Oligonucleotide für die Isolierung von PEDF-cDNA und die Sequenzierung von PEDF-cDNA beschrieben.
Basierend auf den Peptidsequenzen JT-3 und JT-8 von Beispiel 1 und den Daten der Codon Verwendung wurden die Oligonucleotide
oFS5665 (SEQ ID NO: 4): 5'-AGYAAYTTYTAYGAYCTSTA-3' und
oFS5667 (SEQ ID NO: 5): 5'-CTYTCYTCRTCSAGRTARAA-3'
auf einem ABI 392 DNA/RNA-Synthesizer konstruiert und in einer Polymerasekettenreaktion (PCR) als Primer eingesetzt.
Eine menschliche fetale Augen-Charon BS-cDNA-Bank (erhalten von Dr. A. Swaroop vom Kellog Eye Institute) wurde einmal amplifiziert (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, (1989)) und durch PCR durchgemustert (Friedman et al., Screening of λgt11 Libraries, in: PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al., Hrsg., Academic Press, NY, (1990), S. 253–260), wobei ein Techne-Thermozykler und Standardreagenzien (GeneAMP, Perkin-Elmer Cetus) verwendet wurden, mit der Ausnahme, dass MgSO₄ bei 3 mM eingesetzt wurde. Ein PCR-Amplifikationsfragment von etwa 350 bp wurde auf einem 3 % NuSieve 3:1-Gel (FMC Biochemicals, Rockland, ME) unter Verwendung von NA-45-DEAE-Cellulosepapier (Schleicher und Schuell) isoliert (Sambrook et al., vorstehend). Das Fragment wurde mit α-³²P-dCTP (Amersham Corp., Arlington Heights, IL) durch Zufallspriming (Random Priming-Kit, Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) markiert und zum Durchmustern von 200 000 Plaque-bildenden Einheiten (PBE) der menschlichen fetalen Augen-Bank verwendet.
Acht positive Clone wurden isoliert (Sambrook et al., vorstehend), und die DNA der positiven Clone wurde gemäß den Qiagen Maxi-Herstellungsprotokollen (Qiagen, Inc., Chatsworth, KA) gereinigt. Die Insertionen der positiven Clone wurden mit NotI (BRL, Gaithersburg, MD) ausgeschnitten, mit T4-DNA-Ligase (New England Biolabs, Beverly, MA) zirkularisiert, in die kompetenten Escherichia coli-Zellen „Epicurian Sure" (Stratagene, Inc., La Jolla, KA) transformiert und auf Luria-Brühe(LB-) Platten, enthaltend Ampicillin und 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactosid (X-Gal) plattiert.
Weiße Kolonien wurden aufgrund der Tatsache ausgewählt, dass solche Kolonien eine Insertion besitzen sollten, und sodann wurde die Plasmid-DNA aus Einzelkolonie-Kulturen durch das Qiagen-Plasmid-Miniprep-Protokoll isoliert. Die gereinigten Plasmide wurden mit EcoRI und HindIII (BRL) gespalten. Diese Restriktionsstellen waren während der Konstruktion der Bank durch die Ligierung von Linkern an die 5'- und 3'-Enden der Insertion angefügt worden, somit wird durch eine EcoRI-HindIII-Spaltung die in den isolierten Plasmiden vorliegende Insertion ausgeschnitten. Diese Fragmente wurden einer Elektrophorese auf einem 0,7 % Agarose-Gel unterworfen, um die Größe der Insertion zu bestimmen. Das Plasmid, welches die größte Insertion enthielt, nämlich πFS17, wurde für die Kartierung und die anschließende Sequenzierung unter Verwendung des Sequenase 2.0-Sequenzierungskits (United States Biochemical Corp., Cleveland, OH) ausgewählt, um die Identität des Clons zu bestätigen. Die Sequenzanalyse wurde unter Verwendung des MacVector-Softwarepakets (International Biotechnologies, Inc.) und der GenBank^® Sequence Data Bank (Intelligenetics, Mountain View, KA) durchgeführt.
Die Sequenzanalyse von πFS17 zeigte eine Basensequenz, umfassend SEQ ID NO: 1, mit einem langen offenen Leseraster (ORF), codierend die 418 Aminosäuren von SEQ ID NO: 2, ein typisches ATG-Startcodon und ein Polyadenylierungssignal (in SEQ ID NO: 1 nicht dargestellt). Die codierende Sequenz des Clons richtet sich exakt mit allen früher bestimmten PEDF-Peptidsequenzen aus. Die hergeleitete Aminosäuresequenz enthält auch eine Strecke von hydrophoben Aminosäuren, die als ein Signalpeptid dienen könnten. Ein Vergleich der codierenden Sequenz und der Peptidsequenz mit der Genbank^® Data Bank zeigt, dass PEDF ein einmaliges Protein mit einer signifikanten Homologie zu der Serpin- (Serinprotease-Inhibitor-) Genfamilie ist, die das menschliche [α]-1-Antitrypsin einschließt. Obwohl einige Mitglieder dieser Genfamilie eine neurotrophe Aktivität zeigen (Monard et al., (1983), Prog. Brain Res. 58: 359–364; Monard, (1988), TINS 11: 541–544), fehlt dem PEDF eine Homologie zu der vorgeschlagenen Consensussequenz für die reaktive Domäne von Serpin.
Beispiel 3
In diesem Beispiel wird die Konstruktion eines Expressionsvektors für die Produktion von rekombinantem PEDF beschrieben.
Ein Expressionsvektor wurde unter Verwendung des Plasmids πFS17, das die vollständige cDNA für den menschlichen PEDF, wie in Beispiel 2 beschrieben, enthält, konstruiert. Die PEDF-codierende Sequenz wurde unter die Kontrolle eines Bakteriophagen-Lambda-P_L-Promotors gestellt, der im Plasmid pEV-vrf2 vorliegt (Crowl et al., (1985), Gene 38: 31–38), wodurch der Vektor pEV-BH erhalten wurde. Dies wurde erreicht, indem ein BamHI-HindIII-Fragment von πFS17, umfassend einen Teil der PEDF-codierenden Region (nämlich Nucleotid 245 bis 1490 von SEQ ID NO: 1), hergestellt, das Plasmid pEV-vrf2 mit EcoRI-HindIII gespalten, beide Fragmente anhand einer Auffüllreaktion an den BamHI- und EcoRI-Enden mit DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) mit glatten Enden versehen und die resultierenden, mit glatten Enden/kompatiblen Enden versehenen Fragmente miteinander ligiert wurden. Der resultierende Vektor pEV-BH brachte zwischen die Shine-Dalgarno(SD-) Sequenz und die PEDF-codierende Region einen Abstand von acht Nucleotiden ein. Das Konstrukt spezifiziert Met-Asn-Arg-Ile-Asp⁴⁴ - - - Pro⁴¹⁸, so dass ein Protein von 379 Aminosäuren, bekannt als rPEDF, wie in SEQ ID NO: 3 angegeben, codiert wird. Die Aminosäuren am Aminoterminus des rPEDF-Proteins liegen im nativen PEDF nicht vor und kommen durch die Fusion von Nucleinsäuren während der Konstruktion von pEV-BH zustande.
Um die Produktion des rekombinanten PEDF-Proteins durch pEV-BH zu verifizieren, wurde das Plasmid in dem E. coli-Stamm RRI (Maniatis et al., (1982), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) vermehrt, der das kompatible Plasmid mit niedriger Kopienzahl, pRK248clts, trägt, das ein Gen für die Codierung eines temperatursensitiven λclAt2-Repressors enthält (Bernard et al., (1979), Methods in Enzymology 68: 482–492). Die Proteininduktion erfolgte, wie in Becerra et al., (1991), Biochem. 30: 11707–11719, beschrieben, mit den folgenden Modifikationen. Bakterienzellen, die pEV-BH enthielten, wurden in LG-Medium, das 50 μg/ml Ampicillin enthielt, bei 32°C bis zur frühen logarithmischen Phase gezüchtet, so dass OD_600nm = 0,2. Die Temperatur der Kultur wurde rasch auf 42°C erhöht, indem der Kolben in einem 65°C-Wasserbad inkubiert wurde, und anschließend wurden die Bakterien zwei bis drei Stunden bei 42°C in einem Luftstrominkubator bei 340 UpM gezüchtet. Aliquots wurden für die Bestimmung der Absorption bei 600 nm entnommen.
Naszierende Proteine, die nach der Proteininduktion synthetisiert wurden, wurden radiomarkiert. Nachdem die Temperatur der Kultur 42°C erreicht hatte, wurden 150 μCi L-[³⁵S]Methionin (1040 Ci/mMol, Amersham Corp., Arlington Heights, IL) pro ml Kultur zugegeben und die Inkubation wurde bei 42°C zehn Minuten und 30 Minuten fortgesetzt. Die Zellen wurden abzentrifugiert und mit TEN-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA und 100 mM NaCl) gewaschen. ³⁵S-markierte Peptide aus den Gesamtbakterienextrakten wurden auf SDS-12 %-PAGE aufgetrennt und anschließend durch Fluorographie analysiert. Eine Bande, die einem Polypeptid von 42 820 M_r entsprach, wurde zehn und 30 Minuten nach der Induktion nachgewiesen. Die Größe, die für das durch pEV-BH exprimierte rekombinante Protein erhalten wurde, stimmte mit der erwarteten Größe für die in pEV-BH subclonierte codierende Sequenz überein. In ähnlicher Weise können kleinere Fragmente (BP = 28 000 M_r; BX = 24 000 M_r; BA = 9 000 M_r) synthetisiert und gereinigt werden. Das Peptid BP schließt die PEDF-Aminosäuren 44 bis 269 ein, das Peptid BX schließt die PEDF-Aminosäuren 44 bis 227 ein, und das Peptid BA schließt die PEDF-Aminosäuren 44 bis 121 ein.
Beispiel 4
In diesem Beispiel wird die Konstruktion von Expressionsvektoren beschrieben, welche die vollständige PEDF-cDNA enthalten.
In ähnlicher Weise, wie in Beispiel 3 für die Konstruktion von pEV-BH beschrieben, wurde das PEDF-ORF von Plasmid πFS17 unter die Kontrolle des Bakteriophagen-Lambda-P_L-Promotors gestellt, der in den Plasmiden pRC23 und pEV-vrf1 vorliegt (Crowl et al., (1985), Gene 38: 31–38). Dies wurde erreicht, indem das SfaNI-HindIII-Fragment von πFS17, umfassend einen Teil der PEDF-cDNA (nämlich Nucleotid 107 bis 1490 von SEQ ID NO: 1), hergestellt, die Plasmide mit EcoRI-HindIII gespalten, die Fragmente anhand einer Auffüllreaktion an den SfaNI- und EcoRI-Enden mit DNA-Polymerase-I (Klenow-Fragment) mit glatten Enden versehen und die resultierenden mit glatten Enden/kompatiblen Enden versehenen Fragmente miteinander ligiert wurden. Die resultierenden Vektoren pRC-SH und pEV-SH bringen zwischen die SD-Sequenz und die PEDF-codierende Region einen Abstand von 14 bzw. acht Nucleotiden ein. Das Konstrukt pRC-SH umfasst das vollständige PEDF-OFR und spezifiziert ein PEDF-Protein von 418 Aminosäuren mit seinem natürlich vorkommenden Aminoterminus, wie in SEQ ID NO: 2 dargestellt. Das Konstrukt pEV-SH umfasst das vollständige PEDF-ORF und spezifiziert ein aminoterminales PEDF-Fusionsprotein von 425 Aminosäuren, wobei Met-Asn-Glu-Leu-Gly-Pro-Arg (SEQ ID NO: 8) vor der PEDF-Sequenz von SEQ ID NO: 2 steht. Diese zusätzlichen Aminosäuren am Aminoterminus liegen im nativen PEDF nicht vor, und die Codons in pEV-SH, die diese zusätzlichen Aminosäuren spezifizieren, kommen durch die Fusion von Nucleinsäuren während der Konstruktion von pEV-SH zustande.
Um die Produktion der durch die zwei Vektoren spezifizierten rekombinanten Proteine zu verifizieren, wurden die Vektoren in den E. coli-Stamm RRI [pRK248clts] eingeführt und die Proteininduktion wurde durchgeführt und anhand einer metabolischen Markierung mit ³⁵S-Methionin während der Induktion überwacht, genauso wie in Beispiel 3 beschrieben. Die induzierte Expression der durch pRC-SH und pEV-SH spezifizierten Proteine hatte eine negative Wirkung auf das Wachstum der Bakterienzellen. Im Vergleich zu Bakterienkulturen, welche die elterlichen Plasmide enthielten, wuchsen und teilten sich die Kulturen, die pRC-SH und pEV-SH enthielten, langsamer. Dieser negative Effekt auf das Bakterienwachstum korrelierte mit der Entfernung zwischen dem Initiationscodon und SD, dies legt nahe, dass eine kürzere Entfernung zu einer effizienteren Translation des rekombinanten Proteins führt. In den Medien oder Zelllysaten von Bakterienkulturen, die pRC-SH und pEV-SH enthielten, wurde kein 46 000-M Polypeptid-Kandidat für PEDF nachgewiesen. Jedoch wurde ein 35 000-M Protein in Extrakten von Kulturen, die pRC-SH und pEV-SH enthielten, festgestellt, nicht jedoch in Extrakten von Kulturen, welche die elterlichen Plasmide enthielten. Dies könnte darauf hinweisen, dass das aminoterminale Ende von PEDF Protease-sensitiv ist und dass der rekombinante vollständige PEDF in diesem bestimmten Wirt metabolisiert wird. Alternativ könnte die Tatsache, dass keine rekombinanten PEDF-Proteine der erwarteten Größe festgestellt wurden, einen experimentellen Artefakt darstellen, der durch die Verwendung von alternativen Expressionsvektoren, Wirten, induzierbaren Promotoren, Subclonierungsstellen, Verfahren zur Isolierung und zum Nachweis des rekombinanten Proteins oder Mitteln zur Proteininduktion behoben werden könnte.
Beispiel 5
In diesem Beispiel wird ein Verfahren zum Produzieren großer Mengen von rekombinant erzeugtem PEDF beschrieben.
Insgesamt 1 g E. coli-Zellen, die rPEDF enthielten, wurde in 50 ml 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 20 % Saccharose und 1 mM EDTA resuspendiert. Die Zellen wurden zehn Minuten auf Eis gehalten, bei 4000 × g abzentrifugiert und in 50 ml eiskaltem Wasser für zehn Minuten resuspendiert. Die lysierten äußeren Zellwände wurden durch Zentrifugation bei 8000 × g von den Sphäroplasten abgetrennt.
Die sedimentierten Sphäroplasten wurden in 10 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), die 5 mM EDTA, 1 μg/ml Pepstatin und 20 μg/ml Aprotinin enthielt, resuspendiert. Die Suspension wurde mit einem Beschallungsgerät (Ultrasonics, Inc., Modell W-225) sondenbeschallt, um die Zellmembranen zu lysieren. Drei Bursts von 30-Sekunden-Pulsen mit einer Pause von 30 Sekunden wurden durchgeführt, während die Probe in einem Eiswasserbad eingetaucht war. Sodann wurden RNase TI (1300 Einheiten, BRL) und DNase 1 (500 μg, BRL) zu der beschallten Zeltsuspension zugegeben und die Suspension wurde zehn Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Diese Suspension wurde durch Zugabe von 40 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), die 5 mM EDTA, 1 μg/ml Pepstatin und 20 μg/ml Aprotinin enthielt, verdünnt und die rohen Einschlusskörper 30 Minuten bei 13 000 × g abzentrifugiert. Das partikuläre Material, das aus Einschlusskörpern bestand, wurde in 40 ml PBS, die 25 % Saccharose, 5 mM EDTA und 1 % Triton X-100 enthielt, resuspendiert, zehn Minuten auf Eis inkubiert und zehn Minuten bei 24 000 × g zentrifugiert. Der Waschschritt wurde dreimal wiederholt. Schließlich wurden die Einschlusskörper in 10 ml Denaturierungspuffer, der 50 mM Tris-Cl, pH 8,0, 5 M Guanidin-Cl und 5 mM EDTA enthielt, resuspendiert. Die Suspension wurde kurz für fünf Sekunden in einem Eiswasserbad sondenbeschallt. Die resultierende Suspension wurde eine weitere Stunde auf Eis inkubiert. Nach 30 Minuten Zentrifugation bei 12 000 × g wurde der Überstand zu 100 ml Renaturierungspuffer, der 50 mM Tris-Cl, pH 8,0, 20 % Glycerin, 1 mM DTT, 1 μg/ml Pepstatin und 20 μg/ml Aprotinin enthielt, zugegeben und das Ganze bei 4°C über Nacht vorsichtig gerührt, um das Protein zu renaturieren. Die löslichen und unlöslichen Fraktionen wurden durch 30-minütige Zentrifugation bei 13 000 × g getrennt.
Die lösliche Fraktion wurde weiter gereinigt, indem sie unter Verwendung eines Centricon 30-Mikrokonzentrators (Amicon Div., W. R. Grace & Co., Beverly, MA) auf 1 ml eingeengt und gegen Puffer A (50 mM Natriumphosphat, 1 mM DTT, 20 % Glycerin, 1 mM EDTA, 1 μg/ml Pepstatin und 1 mM Benzamidin) drei Stunden bei 4°C dialysiert wurde. Der dialysierte Extrakt wurde zehn Minuten bei 14 000 UpM in einer Eppendorf-Zentrifuge (Modell 5415C) zentrifugiert. Die Überstandfraktion wurde auf eine S-Sepharose Fast-Flow-Säule (Pharmacia, New Market, NJ) aufgetragen (1 ml Bettvolumen), die mit Puffer A voräquilibriert war. Die Säule wurde mit zwei Säulenvolumina von Puffer A gewaschen. Schließlich wurde der rekombinante rPEDF mit einem Stufengradienten von 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500 und 1000 mM NaCl in Puffer A eluiert. Fraktionen von 1 ml wurden durch Schwerkraftfluß gesammelt und gegen Puffer A dialysiert. Die Fraktion 300, die den rekombinanten rPEDF enthielt, wurde bei –20°C gelagert. Die Ausbeute in Fraktion 300 betrug 50 μg pro g der bepackten Zellen, dies stellt 25 % des Gesamtproteins dar.
Der größte Teil des rPEDF wurde aus der unlöslichen Fraktion gewonnen, indem die Fraktion in 10 ml 6 M Guanidium-Cl in Puffer B (50 mM Tris-Cl, pH 8,0, 1 mM DTT, 2 mM EDTA) gelöst wurde. Die Lösung wurde fünf Minuten bei 10 000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde auf eine Superose-12-Säule (Pharmacia, New Market, NJ) aufgetragen, die in Tandemanordnung mit einer zweiten Superose-12-Säule verbunden war (jede Säule: 2,6 cm × 95 cm), voräquilibriert mit einem Puffer, der 4 M Guanidinium-Cl in Puffer B enthielt. Die Fließrate betrug 3 ml/Minute. Die Fraktionen aus der Superose-12-Säule, die rekombinanten rPEDF enthielten, wurden vereinigt und gegen Puffer C (4 M Harnstoff, 50 mM Natriumphosphat, pH 6,5, 1 mM Benzamidin, 1 μg/ml Pepstatin, 4 mM EDTA) dialysiert. Die dialysierte Fraktion wurde durch ein 0,22-μm-Filter (Miller-GV, Millipore Corp., Redford, MA) geschickt. Die filtrierte Lösung wurde auf eine Mono-S-Säule (Pharmacia, New Market, NJ) (1 cm × 10 cm, D × H) aufgetragen, die mit Puffer C voräquilibriert war. Die Säule wurde mit Puffer C gewaschen, und der rekombinante rPEDF wurde mit einem Gradienten von 0 mM bis 500 mM NaCl in Puffer C bei 0,5 ml/Min. eluiert. Zwei-ml-Fraktionen wurden gesammelt und die Peakfraktionen des rekombinanten rPEDF vereinigt. Die Ausbeute in den vereinigten Fraktionen betrug 0,5 mg rekombinanter PEDF pro g der gepackten Zellen.
Vergleichsbeispiel 6
In diesem Beispiel wird die Verwendung von gereinigtem rekombinantem PEDF als Differenzierungsmittel beschrieben.
Y79-Zellen (ATCC, HTB18) wurden in minimalem essentiellem Eagle-Medium mit Earl-Salzen (MEM), angereichert mit 15 % fetalem Rinderserum und Antibiotika (10 000 E/ml Penicillin und 10 mg/ml Streptomycin) bei 37°C in einem Inkubator mit erhöhter Luftfeuchtigkeit unter 5 % CO₂ gezüchtet. Die Zellen wurden nach Erhalt von der ATCC über zwei Passagen vermehrt und danach im gleichen Medium, enthaltend 10 % DMSO, eingefroren. Für jedes Differenzierungsexperiment wurden einige wenige der eingefrorenen Aliquots verwendet. Alle Experimente wurden in doppelter Ausführung durchgeführt.
Nachdem die Zellen aufgetaut waren, wurden sie ohne weitere Passagen so lange in dem serumenthaltenden Medium gehalten, bis die geeignete Zahl von Zellen verfügbar war. Die Zellen wurden abzentrifugiert und zweimal in PBS gewaschen, in PBS resuspendiert und gezählt. Dann wurden 2,5 × 10⁵ Zellen in jede Vertiefung einer Platte mit sechs Vertiefungen (Nunc, Inc., Roskilde, Dänemark) zusammen mit 2 ml serumfreiem Medium (MEM, angereichert mit 1 mM Natriumpyruvat, 10 mM HEPES, 1X nicht-essentiellen Aminosäuren, 1 mM L-Glutamin, 0,1 % ITS-Mix (5 μg/ml Insulin, 5 μg/ml Transferrin, 5 ng/ml Selen, Collaborative Research, Bedord, MA) und Antibiotika, wie vorstehend beschrieben, plattiert.
Differenzierungs-Effektoren und Kontrollpuffer wurden 12 bis 16 Stunden nach der Plattierung zugegeben und die Kulturen sieben Tage inkubiert und ungestört stehen gelassen. Am achten Tag wurden die Zellen auf Poly-D-Lysin-beschichtete Platten mit sechs Vertiefungen (Collaborative Research, Redford, MA) überführt und das alte Medium nach Anlagerung der Zellen an das Substrat durch 2 ml frisches, serumfreies Medium ersetzt. Die Kulturen wurden bis zu elf Tage unter diesen Bedingungen gehalten. Kulturen nach der Anlagerung wurden täglich anhand eines Olympus-CK2-Phasenkontrastmikroskops auf morphologische Hinweise auf eine Differenzierung untersucht, und außerdem wurde der Neuriten-Auswuchs quantitativ bestimmt.
Im Vergleich zu unbehandelten Zellen zeigten nur Y79-Kulturen, die dem rekombinanten rPEDF ausgesetzt worden waren, signifikante Hinweise auf eine neuronale Differenzierung. Ein gewisser Neuriten-Auswuchs (unter 5 %) war in Kontrollkulturen nachweisbar, die mit dem gleichen Puffer behandelt wurden, der zum Solubilisieren von rPEDF verwendet wurde, und kein Hinweis auf eine Differenzierung wurde in Kulturen gefunden, die in gleicher Weise ohne Zusatz von rPEDF oder Puffer behandelt wurden (22A, „Kontrolle"). Die Phasenkontrastmikroskopie von rPEDF-behandelten Kulturen zeigte, dass zwischen 50 und 65 % der Zellaggregate am Tag 3 nach der Anlagerung an Poly-D-Lysin Neuriten-Verlängerungen aufwiesen (22B, „PEDF"). Diese Neuriten-Verlängerungen am Tag 3 lagen als kurze Fortsätze aus birnenförmigen Zellen an den Rändern der Zellaggregate vor. Die Zahl von sich differenzierenden Aggregaten, die Zahl von sich differenzierenden Zellen pro Aggregat und die Länge der Neuritenartigen Fortsätze nahm mit der Zeit nach der Anlagerung zu. Am Tag 5 nach der Anlagerung zeigten etwa 75 bis 85 % der Aggregate Zeichen von Differenzierung, wobei sich die Neurite aus den meisten ihrer peripheren Zellen heraus verlängerten. Die mit rPEDF behandelten Kulturen erreichten am Tag 7 nach der Anlagerung das maximale Ausmaß an Differenzierung, wenn 85 bis 95 % der Zellen aggregieren. Zu diesem Zeitpunkt wurden zwei Typen von neuronalen Fortsätzen festgestellt, d.h. einzelne Neurite, die zwei- bis dreimal länger waren als diejenigen, die am Tag 3 festgestellt wurden, die sich aus den peripheren Zellen von isolierten Aggregaten heraus erstreckten, und viel längere und dünnere Fortsätze, die ein verzweigtes Netzwerk zwischen Nachbarzellaggregaten bildeten. Bei einer noch längeren Inkubation, d.h. von mehr als zehn Tagen nach der Anlagerung, kam es zu einer deutlichen Abnahme im Anteil der Netzwerkverbindungen und zu keinem weiteren Wachstum der einzelnen Neurite, obwohl die Lebensfähigkeit der Zellaggregate nicht ernstlich beeinträchtigt war und in verschiedenen Experimenten bei etwa 75 bis 80 % erhalten blieb. Keine Unterschiede wurden zwischen gereinigtem nativem PEDF und rekombinantem PEDF (rPEDF) festgestellt, wie in 23 zu sehen ist.
Die PEDF- und rPEDF-cDNA-Clone stellen nicht nur Mittel für die Produktion von großen Mengen der PEDF- und rPEDF-Proteine bereit, sondern dienen auch als Quellen für Sonden, die für die Untersuchung der Expression und Regulation des PEDF-Gens eingesetzt werden können. Außerdem können diese Sequenzen in der Antisense-Technik zum Anhalten der Translation eingesetzt werden, um die Translation des endogenen PEDF zu hemmen.
Die rekombinant produzierten PEDF- und rPEDF-Proteine und äquivalente Proteine können als wirksame neurotrophe Mittel in vitro und in vivo eingesetzt werden. Zusätzliche biochemische Aktivitäten dieser Proteine als neurotrophe Mittel können durch herkömmliche in vitro-Tests bestimmt werden, hierdurch kann dann die Entwicklung anderer therapeutischer Anwendungen für diese Proteine in der Behandlung von Entzündungs-, Gefäß-, degenerativen und dystrophischen Krankheiten der Retina möglich gemacht werden. In Anbetracht der Tatsache, dass diese Proteine solche wirksamen neurotrophen Mittel sind, kann man sich vorstellen, dass diese Proteine modifiziert werden könnten, so dass sie dann in der Behandlung von anderen Geweben als der Retina, die auch auf neurotrophe Faktoren ansprechen, einen therapeutischen Nutzen zeigen. Diese Proteine könnten sogar noch allgemeiner als „Differenzierungs"-Faktoren für nicht-neurale Gewebe und bestimmte Arten von Krebs Verwendung finden.
Vergleichsbeispiel 7
Neben dem rekombinanten PEDF mit dem Mol.-Gew. von 3 000 wurden noch kleinere rekombinante Konstrukte synthetisiert, um zu bestimmen, ob sie eine neurotrophe Aktivität besitzen. Kleinere Peptide könnten gegenüber dem vollständigen Konstrukt eine Reihe von Vorteilen bieten, wie größere Löslichkeit, bessere Membranpenetration, schwächere Antigenität, einfachere Herstellung usw..

23 zeigt nur drei der Konstrukte, die getestet wurden. BP, BX und BA haben Mol.-Gew. von 28 000, 24 000 bzw. 9 000 und stellen C-terminale Deletionsmutanten dar. Alle zeigen eine neurotrophe Aktivität, die ähnlich ist wie die in den 21 und 22 dargestellte Aktivität. Die neue Entdeckung hierin besteht darin, dass sogar das Peptid mit dem Mol.-Gew. von 9 000 (nur etwa 20 % des gesamten Mol.-Gew. des nativen Proteins) eine deutliche neurotrophe Aktivität zeigt. Außerdem repräsentiert das aktive neurotrophe Peptid Sequenzen am N-Terminus, und nicht am C-Terminus, der dafür bekannt ist, dass er das aktive Zentrum von Serpin enthält. Somit sind die Ergebnisse, dass das aktive Zentrum am N-Terminus liegt und dass die Aktivität durch ein solch kleines Molekül hervorgebracht werden kann, sehr erstaunlich und hätten aufgrund früherer Ergebnisse nicht vorausgesagt werden können. Tabelle 1 Exon- und Intron-Organisation des menschlichen PEDF-Gens

Exon- Nr.	Exongröße (bp)	5'-Spleiß-Donor	SEQ. ID. NO.	Introngröße (kb)
		Promotor ...aaggagta
1	128	TATCCACAG/gtaaagtag...	25	4806bp
2	92	CCGGAGGAG/gtcagtagg...	26	2862bp
3	199	TCTCGCTGG/gtgagtgct...	27	980 bp
4	156	TTGAGAAGA/gtgagtcgc...	28	688 bp
5	204	ACTTCAAGG/gtgagcgcg...	29	2982bp
6	143	AGCTGCAAG/gtctgtggg...	30	1342bp
7	211	AGGAGATGA/gtatgtctg...	31	444 bp
8	377	TTTATCCCT/aacttctgt...	32

3'-Spleiß-Akzeptor	SEQ. ID. VD.	Intron-Nr.
GCTGTAATC	33	1
...ttcttgcag/GCCCCAGGA	34	2
...tcctgccag/GGCTCCCCA	35	3
...ctctggcag/GAGCGGACG	36	4
...tcttctcag/AGCTGCGCA	37	5
...tctttccag/GGCAGTGGG	38	6
...ttgtctcag/ATTGCCCAG	39	7
...tctctacag/AGCTGCAAT	40	8

Tabelle 1: Die Exons sind in der oberen Hälfte dargestellt, und die Introns sind in der unteren Hälfte angegeben. 5'-Donor-GT und 3'-Akzeptor-AG sind unterstrichen. Exon- und Introngrößen sind in bp bzw. kb angegeben.
Beispiel 8
Clonierung und Sequenzierung des menschlichen PEDF-Gens
Material: Restriktionsenzyme, SuperScript^® RT und Kanamycin wurden von GIBCO-BRL (Gaithersburg, MD) bezogen. Dynabeads^®-Oligo(dT)₂₅ wurden von Dynal Inc. (Lake Success, NY) geliefert. Retrotherm^TM-RT wurde von Epicentre Technologies (Madison, WI) erhalten. RNAsin^® wurde von Promega (Madison, WI) bezogen. Taq-Polymerase wurde von Perkin-Elmer (Norwalk, CT) oder Stratagene (La Jolla, KA) bezogen. Der Plasmidvektor pBlueScript^®, der für die Subclonierung verwendet wurde, wurde von Stratagene (La Jolla, KA) bezogen. Gesamt-RNA aus neuraler Retina und retinalem Pigmentepithel wurde aus menschlichem Gewebe, das von dem National Disease Research Interchange (NDRI, Philadelphia, PA) erhalten wurde, wie früher beschrieben gereinigt (Chomczynki und Sacchi, 1987). [³²P]-α-dATP und [³²P]-γ-ATP (3000 Ci/mMol), die für die Markierung und (bzw.) Sequenzierung verwendet wurden, wurden von Amersham (Arlington Hts, IL) bezogen. „Superbroth" (12 g/l Bacto-Trypton, 24 g/l Hefeextrakt, 12,5 g/l K₂HPO₄, 3,8 g/l HK₂PO₄ und 5 ml/l Glycerin), denaturierende Lösung (0,2 N NaOH, 1,5 M NaCl), neutralisierende Lösung (1 M Tris-Cl, pH 7,0, 1,5 M NaCl), 20X SSC (3,0 M NaCl, 0,3 mM Natriumcitrat), 10X TBE (1 M Tris-Borat, 2 mM EDTA, pH 8,3) und 50X TAE (2 M Tris-Acetat, 50 mM EDTA, pH 8,0) wurden von Quality Biologicals (Gaithersburg, MD) bezogen. 20X SSPE (3 M NaCl, 0,2 M NaH₂PO₄, 20 mM EDTA, pH 7,4) wurde von Digene Diagnostics, Inc. (Silver Spring, MD) bezogen. Ampicillin wurde von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) bezogen, gelöst in Wasser und fitersterilisiert.
Polymerasekettenreaktion (PCR): Ein 2X PCR-Gemisch wurde hergestellt, das 1,6 μMol/ml GeneAmp^®-dNTPs (jeweils 400 μM), 2X GeneAmp^®-PCR-Puffer und 50 U/ml Taq-Polymerase enthielt. Diese Reagenzien wurden von Perkin-Elmer (Norwalk, CT) bezogen. Im Allgemeinen wurden die Matrize und die Oligonucleotide (100 ng von jedem Oligo) in einem 25-μl-Volumen gemischt, und sodann wurden 25 μl des 2X Gemisches zugegeben, worauf 50 μl Mineralöl folgten. Die Matrize wurde anfangs zwei Minuten bei 95°C denaturiert, dann folgen 30 Sekunden Anelierung (Temperatur zwischen 55 und 65°C, abhängig von den Primern) und eine Verlängerung bei 72°C für 1 bis 5 min, abhängig von der Länge des amplifizierten Produkts.
cDNA-Synthese an Dynabeads^®-Oligo(dT)₂₅: Die cDNA wurde an Dynabeads, wie früher beschrieben (Rodriguez und Chader, 1992), synthetisiert. Die Dynabeads (0,5 mg) wurden mit 100 μl 10 mM Tris-Cl, pH 7,0, 1 mM EDTA, 1 M KCl gewaschen. Die Gesamt-RNA, 30 μl (30 μg; ~1 μl), in Wasser wurde mit 30 μl des vorstehenden Puffers gemischt und sodann wurden die äquilibrierten Dynabeads (0,5 mg) zwei Minuten auf 55°C erhitzt. Die Poly(A)⁺-RNA ließ man 15 Minuten bei Raumtemperatur an die Perlen anelieren, und die überschüssige RNA wurde durch Binden der Perlen an den MPC-E-Magnet-Seperator (Dynal Inc.) entfernt. Anschließend wurden die Perlen mit der anelierten Poly(A)⁺-mRNA in 2,5 μl Puffer A (200 mM Tris-Cl, pH 8,3, 1,0 M KCl), 2,5 μl Puffer B (30 mM MgCl₂, 15 mM MnCl), 20 μl 10 mM dNTPs (jeweils 2,5 mM), 1 μl RNAsin, 2 μl SuperScript RT, 5 μl Retrotherm RT (1 Einheit/μl) und 16 μl H₂O suspendiert, so dass ein Endvolumen von 50 μl erreicht wurde. Das Reaktionsgemisch wurde zehn min bei 40°C und dann eine Stunde bei 65°C inkubiert. Die Perlen wurden erneut an den MPC-E-Magnet-Separator gebunden und das überschüssige RT-Reaktionsgemisch wurde entfernt. Danach wurden die Perlen einmal mit 100 μl 0,2 N NaOH, einmal mit 10X SSPE und zweimal in 1X TE gewaschen. Die cDNA-enthaltenden Perlen wurden in einem Endvolumen von 100 μl 1X TE suspendiert.
5'-Schnell-Amplifikation von cDNA-Enden („5' Rapid Amplification of cDNA Ends") (RACE): Die 5'-RACE wurde unter Verwendung eines modifizierten Verfahrens durchgeführt, das auf dem von Clontech bezogenen 5' AmpliFINDER RACE-Kit (Rodriguez et al., 1994) basierte. Zuerst wurde die cDNA an Dynabeads^®-Oligo(dT)₂₅, wie vorstehend beschrieben, synthetisiert (Rodriguez und Chader, 1992). Der AmpIiFINDER-Anker-Primer (Clontech) wurde an die äußersten 3'-Enden der Dynabead-immobilisierten retinalen Pigmentepithel-cDNA ligiert, wobei die gleichen Bedingungen wie für lösliche cDNA, wie im 5'-AmpliFINDER RACE-Kit beschrieben, verwendet wurden. Der AmpIiFINDER-Anker-Primer wurde in Kombination mit einem PEDF-spezifischen Primer #2744 verwendet, um das 5'-Primer-Ende durch PCR zu amplifizieren. Die Amplifikation erfolgte, wie vorstehend beschrieben, mit 2 μl Anker-ligierter menschlicher retinaler Pigmentepithel-Dynabeads-cDNA, die als Matrize verwendet wurde. Die Amplifikation wurde 30 Zyklen lang durchgeführt.
Sequenz von Oliqonucleotiden: Oligonucleotid-Primer wurden in einem DNA-Synthesegerät, Modell 392, von Applied Biosystems Inc. (Foster City, KA) synthetisiert. Die Oligonucleotide wurden von Schutzgruppen befreit und ohne weitere Reinigung verwendet.
Durchmusterung von genomischen Banken: Die menschliche genomische Cosmid-Bank (Clontech) wurde auf LG-Platten, die 150 mg/ml Ampicillin und 20 mg/ml Kanamycin enthielten, bei einer Dichte von 10 000 Kolonien pro Platte plattiert. Die Kolonien wurden unter Verwendung von Nitrocellulose-Filtern abgehoben und die Filter sodann, wie in Sambrook et al. (1989) beschrieben, behandelt und hybridisiert. Die Bank wurde mit einem [³²P]-markierten PCR-Produkt sondiert, das aus der Amplifikation eines PEDF-cDNA-Clons (Steele et al., 1993) unter Verwendung der Primer T7/T3 erhalten wurde. Dies führte zur Isolierung des Cosmids p10A. Eine λDASH^TMII-Bank (Stratagene) wurde durch Lark Sequencing Technologies Inc. (Houston, TX) unter Verwendung der Insertion aus dem vorstehend erwähnten PEDF-cDNA-Clon durchgemustert. Dies führte zur Isolierung des 7 kb NotI-Not-Fragments (JT6A). Ein P-1-Clon, p147, der das gesamte PEDF-Gen und flankierende Regionen enthielt, wurde unter Verwendung der Oligos 1590/1591 durch Genome Systems (St. Louis, MO) isoliert.
Clonierung von PCR-Produkten: Vier Sätze von Primern, 603:604, 605:606, 2238:354 und 2213:2744, die aus den inneren codierenden Regionen der sequenzierten PEDF-cDNA entworfen worden waren, wurden, wie vorstehend beschrieben, zur Verwendung als Primer in Polymerasekettenreaktion- (PCR-)
Experimenten synthetisiert. Die Primersequenzen sind wie folgt:
Die Amplifikationen, Subclonierung und Sequenzierung der PCR-Produkte, die mit den Primern 603:604 und 605:606 erzeugt wurden, wurden durch Lark Sequencing Technololgies Inc. unter Verwendung menschlicher genomischer DNA als Matrize durchgeführt. Das aus 603:604 erzeugte Produkt ist –2 kb groß (jt8A) und erstreckt sich von Exon 3 bis zu Exon 5. Das unter Verwendung von 605:606 erzeugte Produkt ist –3,3 kb groß (jt9) und erstreckt sich von Exon 5 bis zu Exon 6. Der Primersatz 2213–2744 wurde eingesetzt, um ein ~2,5-kb-Produkt (jt15; auch als JT115 bezeichnet) aus dem P1-Clon p147 zu amplifizieren. Dieses Produkt wurde anschließend für die Subclonierung und Sequenzierung an Lark Sequencing Technologies Inc. geschickt. Die 2238:354-Primer wurden eingesetzt, um von Exon 6 bis zu Exon 7 über Intron E zu amplifizieren. Dieses Produkt wurde nicht subcloniert, es wurde jedoch von uns direkt und vollständig sequenziert.
DNA-Sequenzierung: Der P-1-Clon (p147), Subclone dieses Clons und PCR-Produkte dieses Clons wurden sequenziert. Der Großteil der Sequenzierung wurde von Lark Sequencing Technologies Inc. unter Verwendung herkömmlicher Sequenziertechniken durchgeführt. Alle wichtigen Bereiche (z.B. Intron-Exon-Grenzen) und Übergänge zwischen Clonen wurden in unserem Labor sequenziert. DNA aus den PCR-Produkten wurde unter Verwendung des Wizard^TM PCR Preps DNA-Reinigungskit, bezogen von Promega Corp. (Madison, WI), für die Sequenzierung zubereitet. Der P-1-Clon und Plasmid-Subclone wurden unter Verwendung des Midi-Plasmid-Reinigungskit von Qiagen Inc. (Chatsworth, CA) gereinigt. Die gereinigten PCR-Produkte und Plasmide wurden unter Verwendung des PRISM^TM DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, ein Unternehmensbereich von Perkin-Elmer Corp., Foster City, KA) nach dem Protokoll des Herstellers sequenziert. Typischerweise wurden pro Sequenzierreaktion 0,5 pMol Matrize und 3 pMol Primer eingesetzt. Die Produkte der Sequenzierreaktion wurden unter Verwendung von Select-D G-50-Säulen (5 Prime-3 Prime; Boulder, CO) gereinigt und getrocknet. Danach wurde jede Probe in 5 μl Formamid, 1 μl 50 mM EDTA, gelöst, erhitzt und in einem Automated Fluorescent Sequencer, Modell 370A, (ABI, Foster City, KA) analysiert. Alle Spleißstellen-Übergänge, Intron F und Übergänge zwischen den Clonen wurden sequenziert.
Southern-Blot: Ein Blot mit EcoRI-gespaltener genomischer DNA (8 μg) aus einer Vielzahl von Arten wurde von BIOS Laboratories, New Haven, CT, bezogen. Der Blot wurde mit der PEDF-cDNA unter Verwendung von Standardtechniken sondiert (Sambrook et al., 1989).
5'-RACE von PEDF: Die 5'-RACE wurde, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt, indem das Anker-Oligo an die vorher an Dynabeads synthetisierte menschliche retinale Pigmentepithel-cDNA ligiert wurde. Das 5'-Ende wurde unter Verwendung des Anker-Primers (AmpliFINDER-Kit) und des PEDF-spezifischen Primers 2744 amplifiziert. Die Amplifikation wurde 30 Zyklen durchgeführt. Eine Hauptbande wurde bei ~230 bp festgestellt. Die PCR-Produkte wurden in pGEM-T (Promega Corp., Madison, WI) cloniert und sequenziert. Beim längsten dieser Clone wurde gefunden, dass er sich 20 bp über das 5'-Ende von PEDF hinaus erstreckte.
Isolierung des PEDF-Gens: Das PEDF-Gen wurde in einem P-1-Clon (p147) durch Genome Systems (St. Louis, MO) unter Verwendung der Primer 1590 und 1591 isoliert (1590: 5'-GGA CGC TGG ATT AGA AGG CAG CAA A-3' (SEQ ID NO: 23); und 1591: 5'-CCA CAC CCA GCC TAG TCC C-3' (SEQ ID NO: 24)). Um zu bestimmen, ob dieser Clon das gesamte PEDF-Gen enthielt, wurden sowohl p147 als auch menschliche genomische DNA mit BamHI, EcoHI, HindiII und PstI gespalten und anschließend durch Agarose-Gel-Elektrophorese in einer Pulsfeld-Apparatur aufgetrennt. Das Agarose-Gel wurde geblottet und mit dem PEDF-cDNA-Clon sondiert (Steele et al., (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 1526–1530). Der Vergleich der Bandenmuster zwischen dem P-1-Clon und der genomischen DNA zeigt, dass das gesamte PEDF-Gen in diesem Clon enthalten ist. Weiterhin zeigt dieses Ergebnis auch, dass es nur ein Gen für PEDF gibt.
Sequenz des PEDF-Gens: Eine Karte mit Skala des Gens ist in 1 angegeben. Das PEDF-Gen wurde in seiner Gesamtheit sequenziert (SEQ ID NO: 43). Die Clone jt1, jt14, jt6A und verwandte PCR-Produkte (jt15, jt8A und jt9) (1) wurden durch Lark Sequencing Technologies Inc. sequenziert. Der Rest des Gens wurde sequenziert, indem verschiedene Teile des Gens unter Verwendung des Clous p147 als Matrize amplifiziert wurden. Alle Exons, Intron-Exon-Übergänge und das gesamte Intron F wurden in unserem Labor, wie vorstehend beschrieben, aus den aus dem P-1-Clon, p147, erzeugten PCR-Produkten in beiden Richtungen sequenziert. Auch die NotI-Stelle stromabwärts von Exon 1 wurde bestätigt, indem über sie hinweg amplifiziert und das Produkt sequenziert wurde. Das Gen erstreckt sich etwa über 16 kb mit acht Exons. Alle Intron-Exon-Übergänge gehorchen der AG/GT-Regel. Die Intron-Exon-Übergänge und die flankierenden Sequenzen sind in Tabelle I dargestellt.
jt1: Ein 7,1-kb-Cosmid-Clon, isoliert aus einer menschlichen genomischen Cosmid-Bank (Clontech), enthaltend Exon 7, Exon 8 und die 3'-flankierende Region des PEDF-Gens. Das 5'-Ende dieses Clons, ein Bereich von etwa 2,1 kb, ist nicht Teil von PEDF. Dies wurde offensichtlich durch eine Umlagerung des Cosmids verursacht. Dieser Clon wurde vollständig durch Lark Sequencing Technologies Inc. sequenziert.
jt6A: Dies ist ein 7,2-kb-NotI-Fragment, das durch Lark Sequencing Technologies Inc. aus einer menschlichen genomischen λDASHII-Bank (Statagene) isoliert wurde. Dieser Clon enthielt > 6 kb der 5'-flankierenden Region, Exon 1 und 424 bp von Intron A des PEDF-Gens. Dieser Clon wurde durch Lark Sequencing Technologies Inc. vollständig sequenziert.
jt8A: Dieses clonierte PCR-Produkt JT8A wurde aus genomischer DNA unter Verwendung der Primer 603:604 erzeugt. Dieser Clon erstreckt sich von Exon 3 zu zu Exon 5, einschließlich Exon 4 und der Introns C und D. Er wurde durch Lark Sequencing Technologies Inc. amplifiziert, cloniert und vollständig sequenziert.
jt9: Dieses clonierte PCR-Produkt JT8A wurde aus genomischer DNA unter Verwendung der Primer 605:606 erzeugt. Es enthält das gesamte Intron E und Teile von Exon 5 und Exon 6. Es wurde durch Lark Sequencing Technologies Inc. amplifiziert, cloniert und vollständig sequenziert.
jt15: Dieser Clon wurde aus einem PCR-Produkt erhalten, das unter Verwendung des Primerpaars 2213:2744 aus p147 amplifiziert wurde. Der Clon erstreckt sich von Exon 2 bis zu Exon 3 über Intron B hinweg. Das PCR-Produkt wurde für die Subclonierung und Sequenzierung an Lark Sequencing Technologies Inc. übergeben.
P1-Clon p147: Dieser Clon wurde durch Genome Systems Inc. unter Verwendung der Oligonucleotide 1590:1591 isoliert. Dieser Clon wurde eingesetzt, um die Sequenz von Intron F (2238:354) und den Subclon jt14 zu erhalten. Außerdem wurde er verwendet, um die Intron-Exon-Grenzen zu bestätigen, die anfangs aus den vorstehend erwähnten Clonen erhalten wurden. Alle Exon- und Intron-Grenzen wurden unter Verwendung von Intron-spezifischen Oligos amplifiziert (unter Verwendung von p147 als Matrize) und die Produkte sequenziert. Alle Sequenzen von Spleißübergängen und außerdem die Größen von Introns und Exons wurden bestätigt.
jt14: Dies ist ein Subclon von p147, der den Großteil von Intron A, Exon 2 und einen Teil von intron B enthält. Dieser Clon wurde durch uns isoliert und für die Sequenzierung an Lark Sequencing Technologies Inc. gesendet.
Somit wurden aus der Sequenzanalyse aller vorstehend erwähnten Clone und PCR-Produkte die Struktur und die Größe von Exons und Introns des menschlichen PEDF-Gens bestimmt. Die 5'-Spleiß-Donor- und 3'-Spleiß-Akzeptor-Stellen in allen Übergängen stimmen mit dem GT/AG-Consensus überein.
Beispiel 9
Analyse des PEDF-Promotors
Wir führten eine theoretische Analyse der 5'-flankierenden Region von PEDF durch (3), um ein gewisses Verständnis hinsichtlich möglicher Transkriptionselemente, welche den PEDF regulieren könnten, zu erhalten und Richtlinien für zukünftige Experimente über die Expression von PEDF zu erhalten. Der 5'-flankierenden Region des PEDF-Gens fehlt das klassische TATAAA-Signal oder die TATA-Box. Jedoch enthält sie mehrere interessante Merkmale und Elemente, die durch wichtige Transkriptionsfaktoren erkannt werden. Es gibt zwei Alu-Wiederholungselemente von -164 bis -591 und von -822 bis -1050. Außerhalb der Alu-Regionen liegen zwei mögliche Stellen für die ubiquitäre Octamer-Familie von Transkriptionsfaktoren (Oct) an -29 (ATCCAAAT) und wieder an -113 (GTGCAAAT), die sich durch eine Base von der Consensussequenz ATGCAAAT unterscheiden (Parslow et al., (1984), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 2650–2654; Falkner et al., (1984), Nature 310: 71–74; Sturm et al., (1988), Genes & Devel. 2: 1582–1599; Faisst und Mayer, (1992), Nuc. Acids Res. 20: 3–26). Ein weiteres Element von möglichem Interesse liegt bei -62. Dieses Element, GTAAAGTTAAC, das der HNF-1- (Hepatocyten-Kernfaktor-Bindungs-Consensussequenz GTAATNATTAAC gleicht (Frain, M., et al., (1989), Cell 59: 145–147). Dies ist ein „homeodomainenthaltender Transkriptionsfaktor, der zahlreiche hauptsächlich hepatische Gene transaktiviert (Kuo et al., (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 9838–9842), jedoch auch mit der endodermalen Differenzierung in Verbindung gebracht wurde (Baumhueter et al., (1990), Genes Dev. 4: 371–379). Die Sequenz TCAGGTGATGCACCTGC an -202 ist der künstlichen Palindrom-Sequenz (TREp) TCAGGTCATGACCTGA sehr ähnlich, die durch AP-1 erkannt wird und möglicherweise durch Retinsäure transaktiviert wird (Umescono et al., (1988), Nature 336: 262–265; Linney (1992), Curr. Topics in Dev. Biol. 27: 309–350). Die Sequenzen TGAGTGCA an -22 und TGATGCA an -207 (innerhalb von TREp) sind der AP-1-Consensussequenz TGACTCA ähnlich (Schüle et al., (1990), Cell 61: 497–504). Die Sequenz AGGTGATGCACCT an -204, enthalten innerhalb der Sequenz TREp, ist auch dem entwicklungsgemäß regulierten RAR-Mofif (Retinsäure-Rezeptor) ähnlich, dessen Consensussequenz AGGTCATGACCT ist (Faisst und Meyer, (1992), Nuc. Acids Res. 20: 3–26). Das PEA3-Element (Polyomavirus-Enhancer-Aktivator 3) AGGAAG/A (Martin et al., (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5839–5843; Faisst und Meyer (1992), Nuc. Acids Res. 20: 3–26) liegt in Tandemanordnung an -122 und -129 und dann wieder an -141 vor. PEA3 ist ein Mitglied der ETS-Familie von Transkriptionsfaktoren (Macleod et al., (1992), TIBS 17:251–256), und seine Aktivität scheint durch nicht-nukleäre Onkogene reguliert zu werden (Wasylyk et al., (1989), EMBO J. 8: 3371–3378). Eines der interessantesten Elemente liegt mit der Sequenz GTGGTTATG an -654. Dieses Element befindet sich innerhalb der Consensussequenz GTGGT/AT/AT/AG, die durch die C/EBP- (CAAT-Enhancer-Bindungsprotein-) Familie von Transkriptionsfaktoren erkannt wird (Faisst und Meyer, (1992), Nuc. Acids Res. 20: 3–26). Dieser Faktor scheint an der terminalen Differenzierung beteiligt zu sein, die zu einem erwachsenen Phänotyp führt (Vellanoweth et al., (1994), Laboratory Investigation 70: 784–799). Drei mögliche CACCC-Boxen liegen vor, eine an -845 und zwei in der umgekehrten Orientierung an -826 und -905. Diese liegen alle innerhalb der Alu-Wiederholung. Eine mögliche Sp1-Stelle (CCCGGC) befindet sich an -153 vor der Alu-Wiederholung, und eine Consensus-Sp1-Stelle GGCGGG liegt an -1030 innerhalb der Alu-Wiederholung vor.
Beispiel 10
Expression von PEDF-mRNA in gezüchteten Zellen
Analyse der Genexpression:
mRNA-Northern-Blots mehrerer menschlicher Gewebe (Clonetech) mit 2 μg Poly(A)-RNA pro Bahn wurden mit einem radioaktiv markierten PCR-amplifizierten 667-bp-PEDF-Produkt hybridisiert (Tombran-Tink et al., (1994), Genomics 19: 266–272). Die Blots wurden 15 min bei 68°C in QuickHyb-Schnellhybridisierungslösung (Stratagene, La Jolla, KA) vorhybridisiert und dann eine Stunde bei 68°C in der gleichen Lösung, enthaltend 5 × 10⁶ ZpM („cpm" für Zählimpulse pro Minute) DNA/ml, hybridisiert. Die hybridisierten Blots wurden zweimal mit 100 ml 2X SSC, 0,1 % SDS, 15 min bei Raumtemperatur und einmal mit 200 ml 0,1X SSC, 0,1 % SDS. 30 min bei 68°C gewaschen. Die Blots wurden unter Verwendung eines Kodak-XAR-5-Films und von DuPont-Verstärkerschirmen zwei Std. bei –70°C autoradiographiert.
Genexpression:
Um zu bestimmen, ob eine Expression der PEDF-Boten-RNA in anderen menschlichen Geweben als in gezüchteten menschlichen fetalen RPE-Zellen vorkommt, analysierten wir RNA-Blots von verschiedenen menschlichen erwachsenen und fetalen Geweben, die für jedes untersuchte Gewebe gleiche Mengen von Poly(A)-RNA enthielten. Die Ergebnisse sind in 4 dargestellt. Die PEDF-Sonde identifizierte in 14 der 16 analysierten erwachsenen Gewebe ein einzelnes 1,5-kb-Primer-Transkript unterschiedlicher Hybridisierungsintensität. Kein Signal wird in erwachsenen Nieren oder peripheren Blut-Leukocyten nachgewiesen. Nur ein schwaches Signal kann in erwachsenem/r Gehirn, Pankreas, Milz und Thymus festgestellt werden. Das größte Ausmaß an Hybridisierung für PEDF-Boten-RNA ist in menschlicher/m erwachsener/m Leber, Skelettmuskel, Hoden und Ovar zu sehen. Erstaunlicherweise wird in der Gesamt-Gehirn-RNA nur ein sehr schwaches Signal festgestellt. In dem untersuchten fetalen Gewebe ist ein sehr starkes PEDF-Signal in Lebergewebe zu sehen, und interessanterweise zeigt sich ein Signal von signifikanter Intensität in der fetalen Niere, wobei im Vergleich dazu in Proben von erwachsenen Nieren keine PEDF-Hybridisierung gefunden wurde.
Im Gegensatz zu dem einzelnen 1,5-kb-Transkript, das in den erwachsenen Geweben festgestellt wurde, wird ein zusätzliches Nebentranskript von weniger als 500 bp variabel und mit geringerer Intensität in fetalem Herz, Lunge und Niere markiert. Dies beruht möglicherweise auf einer teilweisen Spaltung des Boten oder auf einem alternativen Spleiß-Phänomen. PEDF wird auch nur in Affen-RPE-Zellen früher Passagen (1. bis 5. Passage) exprimiert und nicht in Zellen später Passagen (10. Passage). Diese Daten machen die Relevanz von PEDF für das Altern deutlich.
Beispiel 11
Vergleichsanalyse von PEDF in einer Vielzahl phylogenetisch verwandter Arten
Analyse der evolutionären Konservierung
8 μg der genomischen DNA aus Lymphocyten einer Vielzahl von Arten, einschließlich mehrerer Säuger- und Primatenarten (BIOS Laboratories, New Haven, CT), wurden mit EcoRI gespalten und in 1 % Agarose-Gelen aufgetrennt. Die Gele wurden trans-geblottet und die Membranen, welche die gespaltene DNA enthielten, unter Verwendung des gleichen Verfahrens und der gleichen Bedingungen wie bei der Northern-Analyse hybridisiert.
Evolutionäre Konservierung
Die evolutionäre Konservierung von PEDF wurde bei mehreren phylogenetisch verwandten Arten untersucht. Die Ergebnisse sind in 5 dargestellt. Unter Verwendung dieser Hybridisierungsbedingungen mit hoher Stringenz wird ein großes EcoRI-Restriktionsfragment von etwa 23 kb in Vögeln, Säugern und Primaten festgestellt. Keine Hybridisierungssignale wurden in niedrigeren Arten nachgewiesen (5A), dies beruht möglicherweise auf einer schwachen Homologie der verwendeten menschlichen PEDF-Sonde. Das EcoRI-Fragment sowohl für Huhn als auch Maus ist etwas kleiner als das für Menschen. In einigen der untersuchten Säugerarten kommt ein interessantes Restriktionsmuster zustande (5B). Mehrere kleinere Restriktionsfragmente sind zu sehen, deren Größe im Bereich zwischen 6 kb und 2 kb liegt. Die größeren Fragmente liegen in der Größe im Bereich zwischen 9 kb und 23 kb und sind in allen untersuchten Primatenarten zu sehen, wobei ein zusätzliches, stark hybridisierendes, polymorphes Fragment bei etwa 9 kb vorliegt.
Beispiel 12
Neuronotrophe Effekte von Pigmentepithel-abstammendem Faktor auf Cerebellum-Körnerzellen in Kultur
Zellkultur
Cerebellum-Körnerzellen (CGC) wurden aus fünf oder acht Tage alten Sprague-Dawley-Rattenjungen, wie von Novelli et al. (1988, Brain Res. 451: 205–212) beschrieben, hergestellt. Kurz gesagt wurde gewebefreie Hirnhaut in einem Puffer, der 124 mM NaCl, 1 mM NaH₂PO₄, 1,2 mM MgSO₄, 3 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA), 27 μM Phenolrot und 25 mM HEPES (pH 7,4) enthielt, zerkleinert und drei min bei 550 × g zentrifugiert. Das Gewebepellet von 10 bis 20 Tieren wurde in 30 ml des gleichen Puffers, der 250 μg/ml Trypsin enthielt, resuspendiert und trypsiniert (15 min, 37°C); dann wurden weitere 15 ml Puffer, der 26 μg/ml DNase I, 166 μg/ml Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor und 0,5 mM zusätzliches MgSO₄ enthielt, zugegeben und das Gewebe erneut, wie vorstehend beschrieben, zentrifugiert. Das Pellet wurde in 1 ml Puffer, der mit 80 μg/ml DNase, 0,52 mg/ml Trypsin-Inhibitor und 1,6 mM zusätzlichem MgSO₄ ergänzt war, resuspendiert und 60-mal mit einer Pasteurpipette digeriert. Die Suspension wurde mit 2 ml Puffer, der 0,1 mM CaCl₂ und 1,3 mM zusätzliches MgSO₄ enthielt, verdünnt, sodann ließ man das nicht-dissozierte Material sich fünf Minuten absetzen. Der Überstand wurde in ein anderes Röhrchen überführt, die Zellen wurden durch eine kurze Zentrifuation gewonnen und in einem Serum-enthaltenden Medium (Eagle-Basalmedium mit 25 mM KCl, 2 mM Glutamin, 100 μg/ml Gentamicin und 10 % Hitze-inaktiviertes fetales Kälberserum) oder in einem chemisch definierten Medium (DMEM:F 12 (1:1) mit 5 μg/ml Insulin, 30 nM Selen, 100 μg/ml Transferrin, 1000 nM Putrescin, 20 nM Progesteron, 50 E/ml Penicillin, 50 μg/ml Streptomycin und 2 mM Glutamin) (Bottenstein, 1985, Cell Culture in Neuroscience, J. E. Bottenstein und G. Sato, Hrsg., New York Plenum Publishing Corp., S. 3–43) resuspendiert. Die Zellen wurden sodann in Poly-L-Lysin-beschichtete Platten mit 96 Vertiefungen (für MTS-Test und Neurofilament-ELISA-Test) oder in Kammerobjektträgern mit acht Vertiefungen (für Immuncytochemie und BrdU-Markierung) zu 2,5 × 10⁵ Zellen/cm² plattiert und bei 37°C in einer Atmosphäre, die aus 5 % CO₂ in Luft bestand, gezüchtet. Nach einem Tag in Kultur wurde Cytosinarabinosid (Ara-C) nur zu den Zellen in dem serumergänzten Medium zugegeben (Endkonzentration 50 μM).
MTS-Test
Cerebellum-Körnerzellen in Platten mit 96 Vertiefungen wurden in einem CO₂-Inkubator vier Stunden mit MTS (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-5-(3- carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, inneres Salz) und PMS (Phenazinmethosulfat) (Endkonzentration: 333 μg/ml MTS und 25 μM PMS) (Promega Corp.), inkubiert. In Gegenwart von PMS wird MTS durch ein Dehydrogenase-Enzym, das in metabolisch aktiven Zellen vorliegt, zu einem wasserlöslichen Formazan umgewandelt (Cory et al., (1991), Cancer Comm. 3: 207–212). Die Menge des Formazanprodukts wurde durch Spektrophotometrie bei 490 nm bestimmt.
Immuncytochemie
Nach sieben Tagen in vitro (DIV) wurden die Zellen dreimal in Calcium- und Magnesium-freier Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und dann zehn min mit 2 % Paraformaldehyd fixiert, worauf zehn min bei –20°C in 95 % Ethanol/5 % Essigsäure folgten. Die Inkubation mit primären Antikörpern gegen NSE (Neuron-spezifische Enolase), GABA, Calbindin oder saures Gliafaserprotein („Glial Fibrillary Acidic Protein") (GFAP) erfolgte 60 min bei T. Die Antikörper wurden bei 1:1000 bis 1:5000 in Gegenwart von 2% normalem Ziegenserum und 0,2 % BSA angewendet. Die Antikörper wurden unter Verwendung des ABC-Systems (Vector Laboratories) und Diaminobenzidin sichtbar gemacht. Für jedes Experiment wurden mindestens 20 Felder aus zwei bis drei Vertiefungen gezählt. Sodann wurde die durchschnittliche Zeltzahl pro Feld berechnet und hieraus dann das Verhältnis der Anzahl der Zellen, die mit den anderen Antikörpern gefärbt wurden, bezogen auf die NSE-positiven Zellen in Kontrollkulturen bestimmt.
Markierung mit Bromdesoxyuridin (BrdU)
Die BrdU-Markierung erfolgte durch das Verfahren von Gao et al. (1991, Neuron 6: 705–715) mit der folgenden Modifikation. Die Zellen wurden in Kammerobjektträgern mit acht Vertiefungen plattiert und rPEDF sofort zugegeben. Nach 24 Stunden wurde BrdU (1:100; Amersham-Zellproliferations-Kit) zu dem Kulturmedium für 24 Stunden zugefügt, danach wurden die Zellen in 2 % Paraformaldehyd fixiert (zehn min), mit 95 % Ethanol/5 % Essigsäure behandelt (zehn min) und mit einem monoclonalen anti-BrdU-Antikörper inkubiert (1:20, zwei Std.). Danach wurden die Kulturen 60 min mit einem Meerrettich-Peroxidasekonjugierten sekundären Ziegen-anti-Maus-Antikörper inkubiert. Nach Diaminobenzidin-Peroxidase wurden die Zellen in Gel Mount fixiert. Der Mitose-Index wurde durch Zählen des prozentualen Anteils markierter Zellen mit einem Mikroskop bestimmt. Für jeden Wert wurde eine Zufallsprobe von 3000 Zellen gezählt.
Neurofilament-ELISA-Test
Der Neurofilament-ELISA wurde gemäß dem Verfahren von Doherty et al. (1984, J. Neurochem. 42: 1116–1122) mit einer geringen Modifikation durchgeführt. Die in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen gezüchteten Kulturen wurden mit 4 Paraformaldehyd in PBS zwei Std. bei 4°C fixiert. Die fixierten Zellen wurden durch eine 15-min-Behandlung mit 0,1 % Triton-X-100 in PBS permeablisiert, worauf eine Inkubation von 60 min mit PBS, enthaltend 10 % Ziegenserum, zur Blockierung der unspezifischen Bindung folgte. Danach wurden die Kulturen mit einem monoclonalen anti-Neurofilament-Antikörper über Nacht bei 4°C inkubiert (RMO-42 bei 1:100; der nur Neurite in den Kulturen von Cerebellum-Körnerzellen färbt). Nach zweimaligem Waschen mit PBS, enthaltend 10 % Ziegenserum, wurden die Zellen eine Std. mit einem sekundären Antikörper (Meerrettich-Peroxidase-konjugierter Ziegen-anti-Maus bei 1:1000) inkubiert. Nach einem darauffolgenden Waschen mit PBS und Wasser wurden die Kulturen 30 min mit 0,2 % O-Phenylendiamin und 0,02 % H₂O₂ in 50 mM Citratpuffer (pH 5,0) inkubiert. Die Umsetzung wurde durch Zugabe eines gleichen Volumens von 4,5 M H₂SO₄ gestoppt. Die Produktbildung wurde quantitativ bestimmt, indem die optische Dichte (CD) eines Aliquots des Reaktionsprodukts bei 490 nm unter Verwendung eines Mikroplatten-Lesegeräts abgelesen wurde.
Um den MTS-Test als ein Messverfahren für lebende Zellen zu validieren und den Bereich der Zellzahl zu bestimmen, in welchem die Ergebnisse linear vorliegen würden, wurden die in 6 dargestellten Experimente durchgeführt. In Serumenthaltendem Medium (SCM) (6A) war die optische Dichte (OD) in einem Bereich von 1 bis 9 × 10⁵ Zellen/cm² zur plattierten Zellzahl proportional. Im Gegensatz dazu deckte bei den Zellen, die in dem chemisch definierten Medium (CDM) gezüchtet wurden (6B), der lineare Bereich 1 bis 5 × 10⁵ Zellen/cm² ab. Für alle anschließenden Experimente wurden die Zellen bei 2,5 × 10⁵ Zellen/cm² plattiert, dies stellt für beide Typen von Kulturmedium die Mitte des linearen Bereichs dar.
7 zeigt, dass PEDF am DIV4 eine signifikanten Zunahme der Zellzahl bewirkte, wobei am DIV7 und am DIV10 ein stärkerer Unterschied vorlag. Jedoch waren die zwei- bis dreifachen Zunahmen die Folge davon, dass in den Kontrollkulturen die Zellzahlen stark zurückgingen. Die Dosis-Antwort-Kurve in chemisch-definiertem Medium (8) zeigte, dass bei 20 ng/ml eine statistisch signifikante Wirkung vorliegt. Eine Erhöhung der Konzentration von PEDF auf mehr als 50 ng/ml ergab im CDM keine weiteren Anstiege.
Um zu bestimmen, ob der Anstieg der CD (MTS-Test) als Antwort auf PEDF einen Anstieg der überlebenden Zellen oder einen Anstieg der Proliferation darstellt, wurde eine BrdU-Markierungsstudie unter Verwendung von Kulturen aus Tieren am Tag 5 nach der Geburt (P5) (ein Zeitpunkt, an dem sich die Cerebellum-Körnerzellen im Tier noch teilen) durchgeführt. 9 zeigt die Wirkung von PEDF auf P5-CGC-Kulturen am DIV1 und am DIV2. Bei Verwendung des MTS-Tests zeigte PEDF am DIV1 keine Wirkung, löste jedoch am DIV2 in serumenthaltendem Medium oder in chemisch definiertem Medium einen kleinen Anstieg der CD aus. Deshalb wurde BrdU am Tag 1 zugegeben und die Zellen wurden am Tag 2 fixiert. Der BrdU- Markierungsindex betrug unter Kontrollbedingungen in SCM 5 % und in CDM 3 %, und PEDF erhöhte den BrdU-Markierungsindex in keinem der beiden Kulturmedien (10). Das Fehlen einer Stimulation des BrdU-Markierungsindex durch PEDF legt nahe, dass ein gesteigertes Überleben, und nicht eine gesteigerte Zellteilung, für den erhöhten OD-Wert verantwortlich ist, der durch den MTS-Test nach Exposition gegenüber PEDF gemessen wird.

Anhand der Immuncytochemie wurden die Zellen identifiziert, die in Kulturen vor und nach der Behandlung mit PEDF vorlagen. P8-Kulturen, die sieben Tage mit und ohne PEDF (500 ng/ml) gezüchtet worden waren, wurden mit vier verschiedenen Antikörpern gefärbt: mit einem polyclonalen Kaninchen-Antikörper gegen Neuronspezifische Enolase (NSE), der alle Cerebellum-Neuronen erkennt (Schmechel et al., (1978), Science 199: 313–315); mit einem polyclonalen Antikörper gegen GABA, die in allen Cerebellum-Neuronen mit Ausnahme von Cerebellum-Körnerzellen synthetisiert wird (Gruol und Crimi, (1988), Dev. Brain Res. 41: 135–146); mit einem Antikörper gegen Calbindin, das ein Neuron-spezifisches Protein ist, und mit einem gegen GFAP, welches ein intermediäres Filamentprotein ist, das nur in Astrocyten vorliegt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst. PEDF erhöht signifikant die Zahl von NSE-positiven Zellen, sowohl in SCM (Anstieg von 30 %) als auch in CDM (Anstieg von 60 %). Ein kleiner, nicht statistisch signifikanter Anstieg lag bei der Zahl von GABA-positiven Neuronen und Purkinje-Zellen (Calbindin-positiv) vor. Somit ist PEDF nur für Körnerneuronen neurotroph. Außerdem setzt PEDF die Zahl von GFAP-positiven Astrocyten, die in den Kulturen vorliegen, signifikant herab (Abnahme von 30 % in SCM und Abnahme von 40 % in CDM). Diese „gliastatische" Eigenschaft von PEDF wird in Beispiel 14 noch weiter diskutiert. Tabelle 2 Die Immuncytochemie zeigt, dass PEDF die Zahl von NSE-positiven Zellen (Neuronen) erhöhte, jedoch GFAP-positive Zellen (Glia) verminderte

Antigen	Behandlung	SCM	CDM
NSE	Kontrolle PEDF PEDF	100,0 ± 6,2 127,0 ± 5,9*	100,0 ± 4,5 157,2 ± 7,4*
GABA	Kontrolle PEDF	2,8 ± 0,2 3,2 ± 0,2	1,4 ± 0,2 1,8 ± 0,2
Calbindin	Kontrolle PEDF	0,06 ± 0,01 0,07 ± 0,02	0,07 ± 0,02 0,12 ± 0,02
GFAP	Kontrolle PEDF	0,86 ± 0,07 0,60 ± 0,03*	0,99 ± 0,07 0,60 ± 0,06*

Cerebellum-Körnerzellen vom Tag 8 nach der Geburt wurden in Kammerobjektträgern mit acht Vertiefungen gezüchtet. PEDF (500 ng/ml) wurde am DIVO zugegeben, die Zellen wurden am DIV7 fixiert, und die Immuncytochemie wurde unter Verwendung von Antikörpern gegen NSE, GABA, Calbindin und GFAP durchgeführt. Für jedes Experiment wurden mindestens 20 Felder aus zwei bis drei Vertiefungen gezählt. Die Daten sind als Prozentsatz von Kontrollen von NSE-positiven Zellen angegeben. Jeder Experimentwert stellt eine mittlere Zeltzahl ± SEM dar.

* P > 0,005, verglichen mit jeder anderen Kontrolle unter Verwendung eines nicht-gepaarten Tests.

Um die Effekte von PEDF auf den Auswuchs von Neuriten zu untersuchen, wurde ein Neurofilament-ELISA-Test eingesetzt. Die Immuncytochemie hatte gezeigt, dass der monoclonale Antikörper RMO-42 nur die Neuriten von Cerebellum-Körnerzellen in Kultur färbte, deshalb wurde dieser Antikörper als ein direktes Maß für das Neurofilament verwendet, das nur in Fortsätzen und nicht im Zellkörper vorliegt (11). PEDF erhöhte sowohl in SCM als auch in CDM den Neurofilament-Gehalt leicht, jedoch war der Anstieg direkt proportional zum Anstieg der Zellzahl (12).
In 13 sind die Ergebnisse aus diesem Beispiel zusammengefasst. Nach zehn Tagen in Kultur sterben die meisten unbehandelten CGCs ab (Kontrolle), dagegen bleiben 60 % oder mehr der PEDF-behandelten Zellen lebensfähig. Somit ist PEDF ein wirksamer Überlebensfaktor für Gehirnneuronen.
Beispiel 13
Neuronotrophe Eigenschaften der rPEDF-Peptide BP und BX
In den vorstehenden Abschnitten über die „neuronotrophe" Aktivität von PEDF wird die Tatsache beschrieben, dass wir relativ große Mengen eines rekombinanten PEDF (rPEDF) produzieren können, der eine starke neurotrophe Aktivität zeigt. Unter Verwendung einer geeigneten molekularbiologischen Rekombinationstechnologie können wir auch kleinere Fragmente des PEDF-Moleküls produzieren, die dann auf neurotrophe oder neuronotrophe Aktivität getestet werden können. 14 zeigt die Effekte von zwei dieser verkürzten Formen von PEDF auf die Lebensfähigkeit von CGC. BX und BP sind ein 24- bzw. ein 28-kDa-Fragment aus dem aminoterminalen Teil des PEDF-Moleküls. Beide Fragmente wirken in 1x- oder 10x-Konzentrationen als Neuron-Überlebensfaktoren, die signifikant das Überleben der CGCs fördern. In diesem Experiment wurde das Peptid einmal zu Beginn des Experiments verabreicht und die Zellzahl sieben Tage später bestimmt. Wir kommen zu dem Ergebnis, dass neben dem vollständigen PEDF-Molekül auch kleinere rekombinante Peptide in der Nähe des N-Terminus des Moleküls „neuronotroph" sind.
Vergleichsbeispiel 14
Gliastatische Eigenschaften von PEDF
Neben den Neuronen liegt in den Primärkulturen von Cerebellum-Körnerzellen der Ratte noch eine kleine Zahl von unterschiedlichen Typen von Glia vor. Glia sind die „Stütz"-Elemente im ZNS für Neuronen, welche das architektonische Gerüst und das metabolische Versorgungssystem bilden, auf welches die Neuronen angewiesen sind. Außerdem spielt Glia in der Klinik eine Rolle, da Tumoren des Gehirns meist durch Glia gebildet werden und die Gliose in verschiedenen neurodegenerativen Krankheiten ein Problem darstellt. In unserem System stellten wir erstmals eine Wirkung von PEDF auf Glia fest, als wir die gezüchtete gemischte Population von Zellen mit Antikörpern, die für Neuronen spezifisch waren, und mit anderen Antikörpern, die für verschiedene Typen von Glia spezifisch waren, immuncytochemisch färbten. Für diesen Zweck verwendeten wir die Standardmarker Neuron-spezifische Enolase (NSE) und andere, um das Vorliegen von Neuronen zu zeigen, saures Gliafaserprotein (GFAP), um das Vorliegen von Astroglia zu zeigen, und OX-42, um Mikroglia anzufärben. In diesem Experiment (Tabelle 2) fanden wir den erwarteten Anstieg der NSE-Färbung bei der PEDF-Behandlung, da wir damals schon wussten, dass die Neuronen länger lebten, jedoch fanden wir eine unerwartete Abnahme der GFAP-Färbung. Dies wies auf die Möglichkeit hin, dass in den PEDF-behandelten Kulturen weniger Astrocyten vorlagen.
Aufgrund der unterschiedlichen Morphologie von Astroglia und Mikroglia in den Kulturschalen und aufgrund ihrer selektiven Färbung auf GFAP oder OX-42 ist es möglich, ihre Anzahl unter dem Mikroskop unter verschiedenen Testbedingungen jeweils einzeln zu zählen. Dies wurde nun durchgeführt, wie in den 15 und 16 dargestellt ist. 15 zeigt die Effekte von PEDF auf die Anzahl von Astroglia in Kulturen, die aus Rattengehirn nach zwei Wochen (2W) oder nach zwölf Wochen (12W) in Kultur erhalten wurden. Die angegebenen Zeiten sind: 48 Stunden, 96 Stunden oder sieben Tage nach der Behandlung mit PEDF. Es ist deutlich, dass die PEDF-Behandlung unter allen getesteten Bedingungen zu einer dramatischen Abnahme der Zahl von Astroglia führt. 16 zeigt eine parallele Analyse von Mikroglia in den gleichen Kulturen. Die Verabreichung von PEDF für 48 Stunden oder sieben Tage führte zu niedrigeren Zahlen von Zellen, egal ob sie zwei Wochen (2W) oder 12 Wochen (12W) gezüchtet worden waren. Somit vermindert PEDF langfristig Gliaelemente wesentlich, während er für Neuronen als ein Überlebensfaktor wirkt.
Vergleichsbeispiel 15
Charakterisierung von nativem Rinder-PEDF
Da der spezifische Antikörper das Vorliegen von PEDF in der erwachsenen IPM anzeigte, verwendeten wir Rinder-IPM-Waschflüssigkeiten als Quelle für die Reinigung des nativen PEDF. Zwar exprimieren RPE- und Retinazellen PEDF- mRNA, jedoch konnten in diesen Zellextrakten mit anti-BH auf Western-Transfers keine PEDF-Banden nachgewiesen werden, dies legt nahe, dass PEDF rasch in die IPM freigesetzt wird. Nun schätzen wir, dass PEDF in der Rinder-IPM zu weniger als 1 % des gesamten löslichen Proteins vorliegt (d.h. etwa 2 bis 5 ng pro Rinderauge). Bei physiologischen Temperaturen bleibt das PEDF-Protein in der IPM längere Zeitspannen stabil und bildet keine nicht-reduzierten Komplexe, die gegenüber SDS resistent sind. Somit wird seine Verwendungsmöglichkeit in Kulturexperimenten und bei der Transplantation in vivo aufgrund seiner stabilen Natur deutlich gesteigert.
Eine Reinigung bis zur offensichtlichen Homogenität wird durch ein einfaches zweistufiges Verfahren erreicht (17). Die Komponenten der IPM wurden durch eine Größenausschluss-Säulenchromatographie (TSK-3000) fraktioniert. Die PEDF-immunreaktiven Fraktionen wurden vereinigt, auf eine Kationenaustauscher-Säule (Mono-S) aufgetragen und die Immunreaktivität wurde mit einem linearen NaCl-Gradienten eluiert. Das Reinigungsprotokoll ist in Material und Methoden genau beschrieben. Die Elutionsprofile jeder Chromatographie sind dargestellt in: A, TSK-3000-Größenausschluss-Säulenchromatographie, und B, Mono-S Säulenchromatographie. Die Absorption bei 280 nm ist dargestellt durch ____, und die NaCl-Konzentration durch - - -, die PEDF-Immunreaktivität wurde mit dem Antiserum Ab-rPEDF verfolgt. Die Einschübe entsprechen der Western-Blot-Analyse der angegebenen Fraktionen. Die Immunreaktion wurde mit einer Verdünnung von 1:10 000 von Ab-rPEDF durchgeführt und es erfolgte eine Färbung mit 4-Chlor-1-naphthol. Die Molekülgrößen-Standards für die TSK-3000-Chromatographie waren: BSA, Rinderserumalbumin (66 000); und CA, Rinder-Carboanhydrase (29 000).
Beginnend mit einer Waschflüssigkeit löslicher IPM-Komponenten umfasst der erste Schritt die Entfernung des am stärksten verbreiteten Proteins, IRBP, durch Größenausschlusschromatographie. PEDF eluiert als monomeres Polypeptid bei einer Größe von etwa 50 kDa. Da wir schon bestimmt haben, dass der isoelektrische Punkt von PEDF bei 7,2 bis 7,8 liegt, haben wir im zweiten Schritt unserer Prozedur zur gleichzeitigen Reinigung und Anreicherung des Proteins eine S-Sepharose-Säulenchromatographie bei pH 6,0 verwendet. Das gereinigte Protein wird bei etwa 2 μg Protein pro erwachsenem Rinderauge gewonnen, dies stellt eine Ausbeute von etwa 40 % dar. Der native PEDF verhält sich bei der SDS-PAGE wie ein monomeres Glycoprotein mit einem offensichtlichen Molekulargewicht von 49 500 ± 1 000.
Das gereinigte Protein ist gegenüber Glycosidase F empfindlich, dies zeigt, dass es sich hier um N-gekoppelte Oligosaccharide handelt, die bis zu 3 000 M_r des nativen Proteins ausmachen (18). Um Asparagin-gekoppelte Oligosaccharide zu entfernen, wurde das gereinigte PEDF-Protein mit Endoglycosidase H und N-Glycosidase F behandelt. Die Enzymreaktionen wurden, wie in Material und Methoden beschrieben, durchgeführt, wobei insgesamt 200 ng des PEDF-Proteins in Gegenwart oder in Abwesenheit von β-Mercaptoethanol verwendet wurden. Die Reaktionsgemische wurden auf ein SDS-12,5-%-Polyacrylamid-Gel aufgetragen. Fotos von Western-Transfers der Endoglycosidase H- (linke Abbildung) und N-Glycosidase F-Reaktionen (rechte Abbildung) sind dargestellt. Die Immunblots wurden mit Antiserum Ab-rPEDF, verdünnt 1:10 000, behandelt. Oben ist angegeben, was bei jeder Umsetzung zugegeben wurde. Die Zahlen an der rechten Seite jedes Fotos geben die Wanderung der biotinylierten SDS-PAGE-Standards an: Rinderserumalbumin (66 200), Ovalbumin (45 000) und Rinder-Carboanhydrase (31 000). Wir haben gezeigt, dass gereinigter Rinder-PEDF an Y-79-Zellen und Weri-Retinoblastomzellen den Auswuchs von Neuriten fördert und dass diese Aktivität durch anti-rPEDF blockiert wird (vgl. nachstehend).
Die vorliegende Erfindung stellt die Werkzeuge bereit, mit denen die Wirkung von authentischem PEDF auf die Expression neuronaler und glialer Marker in den CGC-Kulturen und Y-79-Tumorzellen, einschließlich NSE, GFAP, Neurofilament(NF-200) Protein, bestimmt werden kann.
Vergleichsbeispiel 16
Pigmentepithel-abstammender Faktor: Charakterisierung unter Verwendung eines hochspezifischen polyclonalen Antikörpers
Wir haben den in E. coli produzierten, gereinigten, rekombinanten menschlichen PEDF verwendet, um polyclonale Antikörper gegen PEDF zu entwickeln. Anti-rPEDF erkannte spezifisch ein einziges Polypeptid auf dem Western-Transfer der IPM-Waschflüssigkeit von erwachsenen Rinderaugen (19). Polyclonales Antiserum gegen menschlichen rekombinanten PEDF erkennt spezifisch rPEDF. Western-Transfer und Slot-Blot des menschlichen rPEDF wurden mit polyclonalem Kaninchen-Antiserum gegen rPEDF, Ab-rPEDF, behandelt. Hier sind Fotos der Immunfärbung mit 4-Chlornaphthol dargestellt. A: Western-Transfers von 0,5 μg rPEDF wurden verwendet, um steigende Verdünnungen von Antiserum zu testen. Das rPEDF-Protein wurde vor dem Transfer durch SDS-12,5-%-PAGE aufgetrennt. Oben an jeder Bahn sind die Verdünnungen angegeben. Verdünntes Antiserum, das mit rPEDF bei 5 μg/ml vorinkubiert wurde, bevor es für den Immunnachweis verwendet wurde, ist als 1:10 000 + rPEDF bezeichnet. Die links angegebenen Zahlen geben das Molekulargewicht von biotinylierten SDS-PAGE-Standards an. B: Steigende Mengen von rPEDF in 1 % BSA/PBS wurden auf eine Nitrocellulose-Membran mit einem Verteiler aufgetragen. Die Membranen wurden mit dem Antiserum anti-rPEDF und Kaninchen-Präimmunserum, verdünnt 1:10 000, behandelt. Die Zahlen an der rechten Seite geben die Mengen des rPEDF-Proteins an, die auf die Membran geblottet wurden. Oben in der Abbildung sind die Seren angegeben, die in jedem Papier verwendet wurden.
Anti-BH erkennt spezifisch den menschlichen PEDF auf Western-Transfers bei so niedrigen Verdünnungen wie 1:50 000; dabei ist wichtig, dass es nicht Serum-α₁-Antitrypsin erkennt. Der Antikörper erkennt eine einzige Hauptbande auf Western-Transfers von konditioniertem Medium jugendlicher Affen-RPE-Zellen in Kultur und außerdem von IPM aus erwachsenen Rinderaugen. Anti-rPEDF blockierte die IPM-fördernde neurotrophe Aktivität (20). Menschliche Retinoblastomzellen Y-79, die in Serumenthaltendem Medium exponentiell wuchsen, wurden zweimal mit PBS gewaschen und in serumfreiem MEM, angereichert mit Insulin, Transferrin und Selen (ITS-Gemisch, Collaborative Research Products), plattiert (2,5 × 10⁵ Zellen pro ml). Danach wurden Effektoren zu den Kulturen zugegeben. Nach sieben Tagen bei 37°C in 5 % CO₂ wurden die Zellen an Poly-D-Lysin-beschichtete Platten mit frischem serumfreiem Medium angelagert. Der Differenzierungszustand der Kulturen wurde in unterschiedlichen Abständen nach der Anlagerung überwacht. Die charakteristische Morphologie von Kulturen am Tag 9 nach der Anlagerung ist dargestellt. Die Zugabe von Effektoren erfolgte jeweils, wie in der Abbildung angegeben, mit den folgenden Endkonzentrationen: 125 μg/ml BSA, 1 % IPM und 100 ng/ml gereinigter Rinder-PEDF. Um die den Neuriten-Auswuchs induzierende Aktivität zu blockieren, wurde jeder Effektor mit einem Überschuss des Antiserums anti-rPEDF (1 μl) in 1 % BSA/PBS bei 4°C mindestens sechs Stunden vorinkubiert. Alle Fotos sind in 50-facher Vergrößerung dargestellt.
Der anti-rPEDF blockierte auch die durch den gereinigten PEDF geförderte Neuriten-Auswuchs-Aktivität. Unser Daten zeigen, dass PEDF der einzige neurotrophe Faktor in der IPM ist. Diese Ergebnisse legen außerdem nahe, dass der anti-rPEDF sich dafür eignen wird, das neurotrophe aktive Zentrum von PEDF und außerdem die physiologische Rolle von PEDF in der IPM und auch in anderen Geweben (z.B. im Gehirn) zu erforschen. Weiterhin zeigen diese Ergebnisse, dass PEDF eine echte Komponente der IPM ist und möglicherweise die einzige neurotrophe Komponente in der extrazellulären Matrix darstellt. Außerdem liegt das Protein in einem großen Spektrum von Geweben und extrazellulären Räumen vor. Der blockierende Antikörper eignet sich für Studien, mit denen die physiologischen Funktionen des PEDF erforscht werden können.
Vergleichsbeispiel 17
Pigmentepithel-abstammender Faktor: Ein Serpin mit neurotropher Aktivität
Die Aminosäuresequenz, die von einer fetalen menschlichen PEDF-cDNA hergeleitet ist, zeigt eine gemeinsame Identität seiner Primärstruktur (–30 %) mit der Serinprotease-Inhibitor- (Serpin-) Familie, wobei 90 % der Reste, die für die strukturelle Integrität von Serpinen essentiell sind, beibehalten sind. Jedoch hemmt rekombinanter PEDF nicht die Serinproteasen Trypsin, Chymotrypsin, Elastase oder Kathepsin G. Ein natürliches Ziel für PEDF wurde bisher noch nicht identifiziert. Wir haben Proteine aus der Interphotorezeptor-Matrix (IPM), dem Raum zwischen dem retinalen Pigmentepithel und der Retina, durch Immunnachweis auf Western-Blots mit gegen PEDF hervorgebrachten Antikörpern und durch Zymographie in Gelen, die Casein als proteolytische Substanz enthielten, analysiert. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Rinder-IPM ein stabiles, glycosyliertes PEDF-Polypeptid (50 000 M_r) in einer Menge von etwa 2 bis 5 μg pro Auge enthält. Eine begrenzte Proteolyse von Rinder-PEDF erzeugte mit Trypsin, Subtilisin, Chymotrypsin und Elastase ein Polypeptid von 46 000 M_r, dies legt eine globuläre Struktur mit einer Gelenk-Region nahe, die für eine proteolytische Spaltung empfindlich ist. Andererseits zeigte die SDS-PAGE-Zymographie eine schwache Protease-Aktivität in der IPM, die als eine Doppelbande von etwa 80 000 ± 5 000 M_r wanderte. Die caseinolytischen Aktivitäten wurden mit 1 μg/ml Aprotinin und 10 mM PMSF, die zum Gelgemisch zugegeben wurden, zu 100 % gehemmt, wurden jedoch durch E64 oder EDTA nicht beeinflusst. Wichtig ist, dass das IPM-Protein nicht mit einem Antikörper gegen Plasminogen, einer Serinprotease von etwa 80 000 M_r, reagierte. Wenn das rPEDF-Protein zu 1 μg/ml zugegeben wurde, verminderte sich das Signal für diese caseinolytischen Aktivitäten und außerdem für eine andere Serinprotease-Aktivität unbekannten Ursprungs um etwa 50 %. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass die IPM einen natürlichen extrazellulären Ort für eine neue Serinprotease und den Serpin-PEDF darstellt, die beide mit ≤ 1 % des Gesamtproteins vorliegen.
Die vorliegende Erfindung offenbart die allgemeinen strukturellen Merkmale von PEDF, und man beginnt dadurch zu verstehen, wie diese mit der Funktion des Proteins in Zusammenhang stehen. PEDF besitzt die strukturellen Merkmale und allgemeinen Tertiäreigenschaften, die früher den Serpinen zugeschrieben wurden, nicht jedoch die anti-Protease-Aktivität davon. PEDF ist ein neurotrophes Protein und scheint die einzige Komponente der IPM zu sein, welche an Retinoblastomzellen den Neuriten-Auswuchs fördert. Jedoch ist das reaktive Zentrum für die Serinprotease-Hemmung, das in der Nähe des Carboxyterminus von klassischen Serpinen gefunden wurde, für die neurotrophe biologische Aktivität des PEDF nicht erforderlich. Genau gesagt reicht eine Polypeptidkette, welche eine Domäne aus dem aminoterminalen Teil des Moleküls enthält (BA), für die neurotrophe und Neuron-Überlebens-Aktivität aus. Durch die vorliegende Erfindung wird weiterhin die Bestimmung möglich gemacht, ob die CGC-Neuronen normalerweise durch Apoptose absterben und ob PEDF ein Apoptose-Inhibitor ist. Mit anderen Worten macht es die vorliegende Erfindung möglich, dass man bestimmen kann, durch welchen Mechanismus PEDF Neuronen „rettet" und das Wachstum oder die Proliferation von Glia „hemmt".
Die vorliegende Erfindung kann eingesetzt werden, um das spezifische neurotrophe „aktive Zentrum" zu bestimmen. Weiterhin versetzt uns die Verwendung der verkürzten rPEDF-Peptide in die Lage, die Elemente zu definieren, die für eine neuronotrophe und vielleicht gliastatische Aktivität von PEDF erforderlich sind. Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung erforderliche Werkzeuge bereit, mit denen die Wechselwirkungen von PEDF untersucht werden können, welche das Signal für die Differenzierung des Retinoblastoms stimulieren. Kürzliche Experimente zeigen, dass ¹²⁵I-BH nur dann an Retinoblastomzellen in kompetitiver Art und Weise bindet, wenn es in Medium zugegeben wird, das früher durch Retinoblastomzellen „konditioniert" worden war. Dies legt nahe, dass für die Bindung ein oder mehrere, durch die Zellen produzierte Cofaktoren erforderlich sein könnten. Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin die Werkzeuge bereit, die erforderlich sind, um einen mutmaßlichen Zelloberflächen-Rezeptor für PEDF oder für einen PEDF-Komplex aus unseren CGC- und Retinoblastom-Testsystemen zu identifizieren und zu charakterisieren.
Rekombinante mutierte Proteine, proteolytische Produkte und synthetische Peptide haben sich zu einem Instrument für die Domän-Kartierung von funktionellen Zentren von Proteinen entwickelt. Außerdem ermöglichen die rekombinanten Proteine der vorliegenden Erfindung die Kartierung von neurotrophen und neuronotrophen „aktiven Zentren" auf dem PEDF-Molekül sowie die Bestimmung des zellulären Transduktionsmechanismus, durch welchen dieses interessante Protein seine dramatischen biologischen Effekte ausübt.
Diese Erfindung wurde zwar anhand bevorzugter Ausführungsformen beschrieben, für den Fachmann wird es jedoch offensichtlich sein, dass Variationen in den bevorzugten Nucleinsäuren, welche PEDF, rPEDF und äquivalente Proteine (BP, BX, BA) codieren, und in ihren Aminosäuresequenzen, in den Vektoren, die irgendwelche solche Nucleinsäuren nutzen, in den Rekombinationsverfahren, mit denen solche Proteine hergestellt werden, und in den Verfahren, in denen solche Proteine eingesetzt werden, durchgeführt werden können und dass es so gemeint ist, dass die Erfindung auch anders, als hier spezifisch beschrieben, ausgeführt werden kann.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

In vitro-Verfahren zur Verlängerung des Überlebens von neuronalen Zellen, umfassend: das Behandeln einer Zellpopulation, umfassend Neuronen mit Pigmentepithelabstammendem Faktor (PEDF) oder einem aktiven Fragment davon, welches neuronotrophe Aktivität hat.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die neuronalen Zellen in einer Gewebezellkultur sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die neuronalen Zellen eine Komponente eines Gewebes umfassen, die in ein Individuum verpflanzbar ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zellen fötale Hirnzellen sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zellen Neuronen in einer Primärkultur sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zellen Photorezeptorneuronen sind.
Verfahren nach Anspruch 1, umfassend: (a) das Herstellen einer Zellkultur; und (b) das Behandeln der Zellkultur mit PEDF oder einem aktiven Fragment davon, welches neuronotrophe Aktivität hat.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 7, wobei das Behandeln umfasst: (a) das Einführen einer Nucleinsäure, die PEDF oder ein aktives Fragment davon codiert, welches neuronotrophe Aktivität hat, in eine Wirstzelle; und (b) das Exprimieren der Nucleinsäure und dadurch das Bereitstellen des PEDF oder des aktiven Fragments davon, welches neuronotrophe Aktivität hat.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Wirtszelle eine neuronale Zelle, eine astrogliale Zelle, ein Photorezeptomeuron oder eine retinale Pigmentepithelzelle ist.
Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei die Nucleinsäure ein Nucleinsäuremolekül ist, umfassend eine Nucleinsäure ausgewählt aus: (a) einer Nucleinsäuresequenz wie in SEQ ID NO: 1 gezeigt; und (b) einer Nucleinsäuresequenz, welche ein Polypeptid codiert, welches die Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 2 oder 3 gezeigt, hat.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Nucleinsäuremolekül Teil eines Vektors ist.
Verwendung von PEDF oder eines aktiven Fragments davon, welches neuronotrophe Aktivität hat, eines Nucleinsäuremoleküls, welches PEDF codiert, oder eines aktiven Fragments davon, welches neuronotrophe Aktivität hat, und/oder eines Vektors, umfassend ein Nucleinsäuremolekül, welches PEDF codiert, oder ein aktives Fragment davon, welches neuronotrophe Aktivität hat, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Verlängerung des Überlebens von neuronalen Zellen.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei das Nucleinsäuremolekül ein Nucleinsäuremolekül ist, umfassend eine Nucleinsäure ausgewählt aus: (a) einer Nucleinsäuresequenz wie in SEQ ID NO: 1 gezeigt; und (b) einer Nucleinsäuresequenz, welche ein Polypeptid codiert, welches die Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 2 oder 3 gezeigt, hat.