CZ301689B6 - Derivát chinazolinu a farmaceutický prostredek, který ho obsahuje - Google Patents

Abstract

Rešení se týká derivátu chinazolinu, 4-(4-brom-2-fluoranilino)-6-methoxy-7-(1-methylpiperid-4-ylmethoxy)chinazolinu, a jeho solí, a farmaceutických prostredku obsahujících tento derivát nebo jeho farmaceuticky prijatelné soli jako aktivní složky. Tento derivát a jeho farmaceuticky prijatelné soli inhibují úcinky VEGF, mají protinádorový úcinek a snižují antiangiogenní a/nebo vaskulární permeabilitu.

Description

Derivát chinazolinu a farmaceutický prostředek, který ho obsahuje

Oblast techniky

Předložený vynález se týká derivátu chinazolinu, farmaceutických prostředků, které ho obsahují jako aktivní složku, a jeho použití při výrobě léčivých prostředků určených k tvorbě antiangiogenních a/nebo vaskulámí permeabilitu snižujících účinků u teplokrevných zvířat, např. lidí.

Dosavadní stav techniky

Normální angiogeneze hraje důležitou roli při různých procesech zahrnujících vývoj embrya, léčení zranění a několika komponent Ženských reprodukčních funkcí. Nežádoucí nebo patologic15 ká angiogeneze bývá spojena s onemocněním zahrnujícím diabetickou retinopatii, psoriázu, rakovinu, revmatoidní artritidu, aterom, Kaposiho sarkom a nezhoubný nádor z krevních cév (Fan et al, 1995, Trends Pharmacol Sci. 16: 57-66: Folkman, 1995, Nátuře Medicine 1:27-31). Předpokládá se, že alterace vaskulámí permeability hraje roli při normálních i patologických fyziologických procesech (Cullinan-Bove etal, 1993, Endocrinology 133: 829—837; Senger etal, 1993, Cancer and Metastasis Reviews, 12: 303-324). Bylo identifikováno několik polypeptidů, které jsou in vitro promotory endotheliálního buněčného růstu, a zahrnují kyselé a bazické fibroblastové růstové, faktory (aFGF & bFGF) a vaskulámí endoteliální růstový faktor (VEGF). V důsledku omezené exprese jejich receptorů, je aktivita růstové faktoru VEGF na rozdíl od FGF relativně specifická ve vztahu k endotheliálním buňkám. Poslední důkazy indikují, že

VEGF je důležitým stimulátorem normální i patologické angiogeneze (Jakeman etal, 1993, Endocrinology, 133: 848-859; Kolch etal, 1995, Breast Cancer Research and Treatment, 36: 139-155) a vaskulámí permeability (Connolly etal, 1989, J Biol Chem, 264: 20 017-20 024). Antagonismus účinku VEGF tvorbou komplexů VEGF protilátkou může vést k inhibici nádorového růstu (Kim et al, 1993, Nátuře 362: 841-844).

Receptorové tyrosinkinázy (receptor tyrosin kinases (RTK)) jsou důležité při přenosu biochemických signálů přes plazmatickou membránu buněk. Tyto transmembránové molekuly se charakteristicky sestávají z extracelulámí oblasti vázající ligand připojené přes segment v plazmatické membráně až do intracelulámí oblasti tyrosinkinázy. Vazba ligandu na receptor vede ke stimulaci aktivity tyrosinkinázy spojené s receptorem, která má za následek fosforylaci tyrosinových zbytků na receptorových i dalších intracelulámích molekulách. Změny ve fosforylaci tyrosinu iniciují signální kaskádu mající za následek různé buněčné odpovědi. Dosud bylo identifikováno devatenáct rozdílných podrodin RTK definovaných homologií v sekvenci aminokyselin. Jedna z těchto podrodin je složena z ťms-podobné receptorové tyrosinkinázy, Fit nebo Fit 1, receptorové kinázy obsahující inzertovanou doménu (KDR) (také označovaná jako Flk-1) a další fmspodobná receptorová tyrosinkináza, Flt-4. Bylo zjištěno, že dvě z příbuzných RTK, Fit a KDR, vážou VEGF s vysokou afinitou (De Vnes etal, 1992, Science 255: 989-991; Terman etal, 1992, Biochem. Biophys. Res. Comm. 1992, 187: 1 579-1 586). Vazba VEGF na tyto receptory exprimované v heterologních buňkách bývá spojena se změnami ve stavu fosforylace tyrosinu buněčných proteinů a průchodu vápníku.

Deriváty chinazolinu, které jsou inhibitory VEGF receptorových tyrosinkináz, jsou popsány v mezinárodní přihlášce vynálezu WO 97/30035 a WO 98/13354, v nichž jsou popsány sloučeniny, které jsou aktivní vůči VEGF receptorovým tyrosinkinázám, a zároveň jsou určitým způso50 bem aktivní 1 vůči EGF receptorovým tyrosinkinázám.

Sloučeniny podle předloženého vynálezu spadají do obecného rozsáhlého popisu v patentových přihláškách WO 97/30035 a WO 98/13354. Byly objeveny sloučeniny podle předloženého vynálezu, které mají velmi dobrou inhibiční aktivitu proti-VEGF receptorovým tyrosinkinázám. Slou55 Čeniny podle předloženého vynálezu byly testovány a vykazovaly in vivo aktivitu proti nádoro- 1 CZ 301689 B6 vým xenoimplantátům u myší. Při čtrnáctidenním testování sloučenin podle předloženého vynálezu se u myší ukázal prospěšný farmako logický profil.

Sloučeniny podle předloženého vynálezu inhibují účinky VEGF, což jsou důležité vlastnosti při ošetření onemocnění spojených s angiogenezi a/nebo zvýšenou diabetes, vaskulámí permeabilitou, např. rakovina, psoriáza, revmatoidní artritida, Kaposiho sarkom, nezhoubný nádor z krevních cév, akutní a chronická nefropatie, aterom, arteriální restenóza, autoimunitní choroba, akutní zánět, excesivní tvorba jizev a adheze, endometrióza, dysfunkční děložní krvácení a nemoci očí s proliferaci retinální cévy.

io

Sloučeniny podle předloženého vynálezu mají dobrou aktivitu proti VEGF receptorové tyrosinkináze a zároveň mají také aktivitu proti EGF receptorové kináze. Dále mají některé sloučeniny podle předloženého vynálezu výrazně vyšší účinnost proti VEGF receptorové tyrosinkináze než proti EGF (epidermální růstový faktor) receptorové tyrosinkináze nebo FGF RI receptorové tyro15 sinkináze. I když bychom nechtěli být svázáni teoretickými úvahami, mohou být takové sloučeniny například výhodné při ošetření nádorů, které jsou spojeny s VEGF, zejména ty nádory, které jsou závislé na VEGF z hlediska jejich růstu. Dále se předpokládá, že tyto sloučeniny mohou být výhodné při ošetření nádorových stavů spojených s VEGF i EGF, a zejména tam, kde pacient trpí onemocněním s výskytem nádorů, jenž jsou závislé na VEGF i EGF z hlediska jejich růstu.

Podstata vynálezu

V rámci jednoho aspektu poskytuje předložený vynález derivát chinazolinu vybraný ze:

4-(4-brom-2-fluoranilÍnoH>-methoxy-7-( 1-methylpiperid-4-ylmethoxy)chinazolinu a jeho solí.

V předloženém vynálezu může sloučenina podle vynálezu nebo její sůl tautomerizovat a vzorce uvedené v předloženém vynálezu mohou reprezentovat pouze jednu z možných tautomemích forem. Předložený vynález zahrnuje kteroukoliv tautomemí formu, která inhibuje aktivitu VEGF receptorové tyrosinkinázy, a neměla by být omezena jakoukoliv tautomemí formou používanou v uvedených vzorcích.

Sloučenina podle vynálezu a její soli mohou existovat v solvatovaných, jakož i v nesolvatova35 ných formách, např. hydratovaných formách. Předložený vynález zahrnuje všechny tyto solvatované formy, které inhibují aktivitu VEGF receptorové tyrosinkinázy.

Sloučeniny podle vynálezu mohou být podávány ve formě proléčiva, které se rozloží v lidském nebo zvířecím těle za vzniku sloučeniny podle vynálezu. Příklady proléčiv zahrnují in vivo hyd40 rolyzovatelné estery sloučeniny podle vynálezu.

Z dosavadního stavu techniky jsou známy různé formy proléčiv. Pro příklady takových léčiv viz:

a) Design of Prodrugs, edited by H. Bundgaard, (Elsevier, 1985) and Methods in Enzymology, Vol. 42 p. 309-396, edited by K. Widder, et al, (Academie Press, 1985);

b) A Textbook of Drug Design and Development, edited by Krogsgaard-Larsen and H. Bundgaard, Chapter 5 „Design and Application of Prodrugs“, by H. Bundgaard p, 113-191 (1991);

c) H. Bundgaard, Advanced Drug Delivery Reviews, 8, 1-38 (1992);

d) H. Bundgaard, etaí, Journal of Pharmaceutical Sciences, 77, 285 (1988); a

e) N. Kakeya, et aí, Chem Pharm Bull, 32 692 (1984).

Předložený vynález se týká výše definované sloučeniny podle vynálezu, jakož i jejích solí. Soli, které lze použít ve farmaceutických prostředcích, jsou farmaceuticky přijatelné soli, nicméně při _ 7 _ výrobě sloučeniny podle vynálezu a jejích farmaceuticky přijatelných solí mohou být užitečné také další soli. Farmaceuticky přijatelné soli podle předloženého vynálezu mohou např. zahrnovat adiční soli výše definované sloučeniny podle vynálezu, která je dostatečně bazická k vytvoření takových solí, s kyselinou. Tyto adiční soli s kyselinami zahrnují např. soli s anorganickými nebo organickými kyselinami poskytujícími farmaceuticky přijatelné anionty, např. s halogenovodíky (zejména chlorovodíková nebo bromovodíková kyselina, přičemž výhodná je chlorovodíková kyselina) nebo se sírovou, fosforečnou, trifluoroctovou, citrónovou nebo maleinovou kyselinou. Navíc tam, kde je sloučenina podle vynálezu dostatečně kyselá, mohou být vyrobeny farmaceuticky přijatelné soli s anorganickou nebo organickou bází, která poskytne farmaceuticky přijalo telný kation. Tyto soli s anorganickými nebo organickými bázemi zahrnují např. soli s alkalickými kovy, např. sodné nebo draselné soli, soli s kovy alkalickými zemin, např. vápenaté nebo hořečnaté soli, amonné soli nebo např. soli s methylaminem, dímethylaminem, trimethylaminem, piperidinem, morfolinem nebo tris-(2-hydroxyethyl)aminem.

Sloučenina podle vynálezu nebo její sůl (výše definované) mohou být připraveny jakýmkoliv standardním způsobem, který může být aplikovatelný při přípravě chemicky příbuzných sloučenin. Tyto způsoby jsou uvedeny např. v evropských patentových přihláškách 0 520 722, 0 566 226, 0 602 851 a 0 635 498 a mezinárodních patentových přihláškách WO 97/22596, WO 97/30035, WO 97/32856 a WO 98/13354. Tyto způsoby jsou popsány v další části tohoto vynálezu. Potřebné výchozí látky mohou být získány standardními způsoby. Příprava takových výchozích látek je popsána v přiložených a nikterak omezujících příkladech. Nebojsou potřebné výchozí látky analogickými způsoby připraveny.

Sloučeniny podle vynálezu se mohou vyrobit např. následujícími způsoby (a) až (d) a (i) až (iv).

Syntéza sloučenin podle vynálezu (a) Sloučenina podle vynálezu a její soli mohou být připraveny reakcí sloučeniny obecného vzorce III,

(m) (kde substituent R² je methylpiperid^f-ylmethylová skupina, X^! je skupina -O- a L¹ je substituovatelná část), se sloučeninou obecného vzorce IV

NH, (IV) (kde index m je 2 a substituent R¹ je atom fluoru v poloze 2 a atom bromu v poloze 4), čímž se získá sloučenina podle vynálezu a její soli. Standardní substituovatelná část L je např. halogen,

-3CZ 301689 B6 alkoxyskupina (výhodně alkoxyskupina mající 1 až 4 atomy uhlíku), ary loxy skupina nebo sulfonyloxy skupina, např chlor, brom, methoxyskupina, fenoxyskupina, methansulfonyloxyskupina nebo toluen-4-sulfonyloxy skupina.

Průběh reakce je výhodně proveden v přítomnosti buď kyseliny anebo báze. Kyselinou mohou být např. bezvodé anorganické kyseliny, např. chlorovodíková kyselina. Bází mohou být např. organické aminové báze, např. pyridin, 2,6-lutidin, kollidin, 4-dimethylaminopyridin, triethylamin, morfolin, N-methylmorfolin nebo diazabicyklo[5.4.0]undec-7-en, nebo např. hydroxidy nebo uhličitany alkalických kovů nebo kovů alkalických zemin, např. uhličitan sodný, uhličitan io draselný, uhličitan vápenatý, hydroxid sodný nebo hydroxid draselný. Nebo báze mohou být např. hydridy alkalického kovu, např. hydrid sodný, nebo amidy alkalických kovů nebo kovů alkalických zemin, např. amid sodný nebo bis (trimethylsilyl)amid sodný. Reakce je výhodně provedena v přítomnosti inertního rozpouštědla nebo ředicího roztoku, např. alkanol nebo ester, např. methanol, ethanol, 2-propanol nebo ethylacetát, halogenovaného rozpouštědla, např.

methylenchlorid, chloroform nebo tetrachlormethan, ether, např. tetrahydrofuran nebo 1,4-dioxan, aromatického uhlovodíkového rozpouštědla, např. toluenu, nebo dipolámího aprotického rozpouštědla, např. A^V-dimethylformamid, W-dimethylacetamid, V-methylpyrrolidin-2-on nebo dimethylsulfoxid. Reakce je výhodně provedena za teploty v rozmezí např. 10 až 150 °C, výhodně v rozmezí 20 až 80 °C.

Sloučenina podle předloženého vynálezu může být tímto způsobem získána ve formě volné báze nebo může být získána ve formě soli s kyselinou obecného vzorce H-L¹, kde L¹ má výše uvedený význam. Pokud je třeba získat ze soli volnou bázi, může být sůl podrobena reakci s bází výše uvedeným, standardním způsobem.

(b) Sloučenina podle vynálezu a její soli mohou být připraveny reakcí, výhodně v přítomnosti výše definované báze, sloučeniny obecného vzorce V

(V) (kde index m, X¹ a R¹ jsou definovány výše) se sloučeninou obecného vzorce VI

R-L¹ ( VI) (kde substituent R² a L¹ jsou definovány výše); L¹ je substituovatelná část např. halogen nebo sulfonyloxy skupina, např. brom nebo methansulfonyloxyskupina. Výhodně I? skupina O-⁺P (Y)3 (kde Y je buty 1 nebo fenyl) a v takových případech je sloučenina obecného vzorce VI výhodně připravena in šitu. Reakce je výhodně provedena v přítomnosti báze (definována výše ve způsobu (a)) a výhodně v přítomnosti inertního rozpouštědla nebo ředicího rozpouštědla (defi40 nováno výše v bodě (a)), výhodně při teplotě v rozmezí 10 až 150 °C, výhodně při 50 °C.

(c) Sloučenina podle vynálezu a její soli mohou být připraveny reakcí sloučeniny obecného vzorce VII

-4JUIUU/ DU

(VD) se sloučeninou obecného vzorce VIII 5

R²-X‘-H (VIII) (kde L¹, R¹, R², m a X¹ jsou všechny definovány výše). Reakce může být provedena v přítomnosti báze (definována výše ve způsobu (a)) a výhodně v přítomnosti inertního rozpouš10 tědla nebo ředicího roztoku (definovaného výše ve způsobu (a)), výhodně při teplotě v rozmezí 10 až 150 °C, standardně při 100 °C.

(d) Sloučenina podle vynálezu a její soli mohou být připraveny odchráněním sloučeniny obecného vzorce IX

(K), kde substituent R¹, index m a X¹ jsou všechny definovány výše, a substituent R⁴ reprezentuje chráněný substituent R², kde substituent R² je definován výše, ale dodatečně může mít jednu nebo více chránících skupin P². Výběr chránících skupin P² je proveden standardním způsobem, např. podle „Protective Groups in Organic Synthesis“ T.W. Greene and R.G.M. Wuts, 2^nd Ed. Wiley 1991. Výhodně je P² chránící skupina, např. karbamát (alkoxykarbonyl) (např. /erc-butoxykarbonyl, tercamyloxykarbonyl, cyklobutoxykarbonyl, propoxykarbonyl, methoxykarbonyl, ethoxykarbonyl, izopropoxykarbonyl, allyloxykarbonyl nebo benzyloxykarbonyl). Výhodněji je

P² tercbutoxykarbonyl. Reakce je výhodně provedena v přítomností kyseliny. Kyselinou je např. anorganická kyselina, např. chlorovodíková nebo bromovodíková kyselina, nebo organická kyselina, např. trifluoroctová kyselina, trifluormethansulfonová kyselina. Reakce může být provedena v přítomnosti inertního rozpouštědla, např. methylenchloridu, chloroformu, a v přítomnosti stop vody. Reakce je výhodně provedena za teploty v rozmezí 10 až 100 °C, výhodně v rozmezí 20 až

80 °C.

Syntéza meziproduktů (i) Sloučeniny obecného vzorce III ajejich soli, ve kterých L¹ je halogen, mohou být např. při35 praveny halogenací sloučeniny obecného vzorce X

-5CZ 301689 B6

(kde substituent R² a X¹ jsou definovány výše).

Výhodně halogenační činidla zahrnují halogenidy anorganických kyselin, např. thionylchlorid, chlorid fosforitý, oxychlorid fosforečný a chlorid fosforečný. Halogenační reakce je výhodně provedena v přítomnosti inertního rozpouštědla nebo ředicího roztoku, např. halogenované rozpouštědlo, např. methylenchlorid, chloroform nebo tetrachlormethan, nebo aromatická uhlovodíková rozpouštědla, např. benzen nebo toluen. Reakce je výhodně provedena za teploty v rozmezí např. 10 až 150 °C, výhodně v rozmezí 40 až 100 °C.

Sloučeniny obecného vzorce X ajejich soli mohou být připraveny reakcí sloučeniny obecného vzorce XI

(kde L¹ je definována výše) se sloučeninou obecného vzorce (VIII), kteráje rovněž definována výše. Reakce je výhodně provedena v přítomnosti báze (definována výše ve způsobu (a)) a výhodně v přítomnosti inertního rozpouštědla, např. 10 až 150 °C, výhodně asi 100 °C.

Sloučeniny obecného vzorce X ajejich soli mohou být připraveny cyklizací sloučeniny obecného vzorce XII

(ΧΠ) (kde substituent R² a X¹ jsou definovány výše a A¹ je hydroxyskupina, alkoxyskupina (výhodně alkoxyskupina mající 1 až 4 atomy uhlíky) nebo aminoskupina), čímž se získá sloučenina obecného vzorce X nebo její sůl. Cyklizace může být ovlivňována reakcí sloučeniny obecného vzorce XII, kde A¹ je hydroxyskupina nebo alkoxyskupina, s formamidem nebo jeho ekvivalen30 tem za účelem provedení cyklizace za vzniku sloučeniny obecného vzorce X nebo její soli, např. chlorid [3-(dimethylamino)~2-azaprop-2-enyliden]dimethylamonný. Cyklizace je výhodně provedena v přítomnosti formamidu jako rozpouštědla nebo v přítomnosti inertního rozpouštědla nebo ředicího roztoku, např. etherového rozpouštědla, např. 1,4-dioxan. Cyklizace je výhodně také provedena za teploty, výhodně v rozmezí 80 až 200 °C. Sloučeniny obecného vzorce X mohou být také připraveny cyklizací sloučeniny obecného vzorce XII, kde A¹ je aminoskupina, s kyselinou mravenčí nebo jejím ekvivalentem použitelným k cyklizací, a tím ke vzniku slouče-6VZj JU1UO7 DU niny obecného vzorce X nebo její soli. Ekvivalenty mravenčí kyseliny použitelné k cyklizaci zahrnují např. tri-C|.₄alkoxymethan, např. triethoxymethan a trimethoxymethan. Cyklizace je výhodně provedena v přítomnosti katalytického množství bezvodé kyseliny, např. kyseliny sírové např, p-toluensulfonové kyseliny, a přítomností rozpouštědla, inertního rozpouštědla nebo ředí5 čího např. halogenovaného rozpouštědla, např. methylenchloridu, chloroformu nebo tetrachlormethanu, etherové rozpouštědla, např. diethyletheru nebo tetrahydrofuranu, nebo aromatického uhlovodíkového rozpouštědla, např. toluenu. Cyklizace je výhodně provedena za teploty v rozmezí 10 až 100 °C, výhodně v rozmezí 20 až 50 °C.

ío Sloučeniny obecného vzorce XII ajejich soli mohou být připraveny redukcí nitroskupiny ve sloučenině obecného vzorce XIII

o' (ΧΠΙ) (kde substituent R², X¹ a A¹ jsou definovány výše) za vzniku výše definované sloučeniny obecného vzorce XII. Redukce nitro skupiny může být výhodně provedena jakýmkoliv standardním způsobem. Dále může redukce být prováděna např. hydrogenací roztoku nitrosloučeniny v přítomnosti výše definovaného inertního rozpouštědla nebo ředicího roztoku za přítomnosti kovu účinného ke katalýze hydrogenačních reakcí, např. palladium nebo platina. Další redukční činidlo je např. aktivovaný kov, např. aktivované železo (připravené např. promýváním železného prášku zředěným roztokem kyseliny, např. chlorovodíkové kyseliny). Tudíž může být redukce např. provedena zahříváním nitrosloučeniny a aktivovaného kovu v přítomnosti rozpouštědla nebo ředicího roztoku, např. směsi vody a alkoholu, např. methanol nebo ethanol, za teploty v rozmezí např. 50 až 150 °C, výhodně asi 70 °C.

Sloučeniny obecného vzorce XIII ajejich soli mohou být připraveny reakcí sloučeniny obecného vzorce XIV

(kde L¹ a A¹ jsou definovány výše) s výše definovanou sloučeninou obecného vzorce VIII za vzniku sloučeniny obecného vzorce XIII. Reakce sloučenin obecných vzorců XIV a VIII je výhodně proveden za podmínek uvedených u způsobu (c) výše.

Sloučeniny obecného vzorce XIII ajejich soli mohou být např. také připraveny reakcí sloučeniny obecného vzorce XV

-7CZ 301689 B6

(XV) (kde X¹ a A¹ je definováno výše) s výše definovanou sloučeninou obecného vzorce VI za vzniku výše definované sloučeniny obecného vzorce XIII. Reakce sloučenin obecných vzorců XV a VI jsou výhodné provedeny za podmínek uvedených u způsobu (b) výše.

Sloučeniny obecného vzorce III a jejich soli mohou být také připraveny napr. reakcí sloučeniny obecného vzorce XVI

(kde X¹ je definováno výše a L² reprezentuje substituovatelnou chránící skupinu) s výše definovanou sloučeninou obecného vzorce VI za vzniku sloučeniny obecného vzorce III, ve které L¹ je reprezentováno vzorcem L².

Výhodně je používána sloučenina obecného vzorce XVI ve které L² reprezentuje fenoxyskupinu, jenž může podle potřeby mít až 5 substituentů, výhodně až 2 substituenty, vybrané ze skupiny zahrnující halogen, nitroskupinu a kyanoskupinu. Reakce může být výhodně provedena za podmínek uvedených u způsobu (b) výše.

Výše definované sloučeniny obecného vzorce XVI a jejich soli mohou být např. připraveny odchráněním sloučeniny obecného vzorce XVII

(kde substituent X¹ a L² jsou definovány výše a reprezentuje fenolickou hydroxy-chránicí skupinu). Výběr fenolické hydroxy-chránicí skupiny P¹ je proveden standardním způsobem, např. podle protective Groups in Organic Synthesis“ T.W. Greene and R.G.M. Wuts, 2^nd Ed. Wiley 1991, včetně etherů (např. methylu, methoxymethylu, allylu a benzylu a benzylu substituovaného až dvěma substituenty vybranými ze skupiny zahrnující alkoxyskupinu mající 1 až 4 atomy uhlíku a nitroskupinu), silyletherů (např. t-butyldifenylsilyl a t-butyldimethylsilyl), esterů (např. acetát a benzoát) a karbonátů (např. methyl a benzyl a benzyl substituovaný až dvěma substituenty vybranými ze skupiny zahrnující alkoxyskupinu mající 1 až 4 atomy uhlíku a nitroskupinu). Odchránění může být provedeno standardními technikami, např. tam, kde P¹ reprezen35 tuje benzylovou skupinu, je odchránění provedeno hydrogenolýzou nebo reakcí s trifluoroctovou kyselinou.

Odstranění této fenolické hydroxy-chránicí skupiny může být provedeno jakýmkoliv standardním způsobem, včetně těch reakčních podmínek uvedených ve standardní literatuře, např. výše

-8V_,Zj JV1UO7 DU citovaná literatura. Reakční podmínky jsou výhodně takové, aby u hydroxyderivátu neprobíhaly nežádoucí vedlejší reakce ve výchozích látkách nebo produktech. Například pokud chránící skupinou P¹ je acetát, může být transformace výhodně provedena reakcí derivátu chinazolinu s bází výše definovaným způsobem a zahrnující amoniak ajeho mono a dialkylované deriváty, výhodně v přítomnosti protického rozpouštědla nebo spolurozpouštědla, např. vody či alkoholu, např. methanol nebo ethanol. Tato reakce může být provedena v přítomnosti dalšího výše definovaného inertního rozpouštědla nebo ředicího roztoku a za teploty v rozmezí 0 až 50 °C, výhodně asi 20 °C.

io Sloučeninu obecného vzorce III lze, pokud je třeba, konvertovat na další sloučeninu obecného vzorce III, ve které je Část L¹ jiná. To znamená, že např. sloučenina obecného vzorce III, ve které L¹ je jiná skupina než halogen, např. případně substituovaná fenoxyskupina, může být konvertována na sloučeninu obecného vzorce III, ve které L¹ je halogen, hydrolýzou sloučeniny obecného vzorce III (ve které L¹ je jiná skupina než halogen) za vzniku výše definované slouče15 niny obecného vzorce X a zavedením halogenidu do takto získané sloučeniny obecného vzorce X podle výše definovaného způsobu, Čímž vznikne sloučenina obecného vzorce III, ve které L¹ reprezentuje halogen.

(ii) Výše definované sloučeniny obecného vzorce V ajejich soli mohou být připraveny odchrá20 něním sloučeniny obecného vzorce XVIII

(xvm) (kde R¹, P^l, X¹ a index m jsou definovány výše) např. způsobem podle bodu (i) výše.

Sloučeniny obecného vzorce XVIII ajejich soli mohou být připraveny reakcí výše definovaných sloučenin obecných vzorců XVII a IV za podmínek uvedených u bodu (a) výše za vzniku sloučeniny obecného vzorce XVIII nebo její soli.

(iii) Výše definované sloučeniny obecného vzorce VII ajejich soli mohou být připraveny reakcí sloučeniny obecného vzorce XIX

(XIX) (kde L¹ je definováno výše a I? v poloze 4 a 7 může být stejné nebo rozdílné) s výše definovanou sloučeninou obecného vzorce IV, přičemž reakce může být provedena podle způsobu z bodu (a) výše.

-9CZ 301689 B6 (iv) Sloučenina obecného vzorce IX může být připravena reakcí výše definované sloučeniny obecného vzorce V se sloučeninou obecného vzorce XX

R⁴-L' (XX) kde substituent R⁴ a L¹ jsou definovány výše, za podmínek uvedených v bodu (b) výše, čímž vznikne sloučenina obecného vzorce IX nebo její sůl. Reakce je výhodně prováděna v přítomnosti báze (podle výše definovaného způsobu (a)) a výhodně v přítomnosti inertního rozpouštědla io nebo ředicího roztoku (definováno výše v bodě (a)), výhodně při teplotě v rozmezí 10 až 150 °C, výhodněji 20 až 50 °C).

Pokud je třeba připravit farmaceuticky přijatelnou sůl sloučeniny podle vynálezu, lze ji připravit standardním způsobem, tzn. reakcí uvedené sloučeniny s např. kyselinou, přičemž kyselina má i? farmaceuticky přijatelný anion, nebo může být farmaceuticky přijatelná sůl sloučeniny podle vynálezu připravena standardním způsobem, tzn, reakcí dané sloučeniny s bází.

Charakterizace sloučenin, které významně inhibují aktivitu tyrosinkinázy související s receptory

VEGF, např. Fit a/nebo KDR, a které inhibují angiogenezi a/nebo zvýšenou vaskulámí permea20 bilitu, je žádoucí a spadá do záměru předloženého vynálezu. Tyto vlastnosti mohou být stanoveny např. jedním nebo více níže uvedenými způsoby:

(a) In vitro test inhibice receptorové tyrosinkinázy

Tento test determinuje schopnost testované sloučeniny inhibovat aktivitu tyrosinkinázy. DNA kódující VEGF nebo EGF receptorové cytoplazmatické domény může být získána totální genovou expresí (Edwards M, International Biotechnology Lab 5 (3), 19-25, 1987) nebo klonováním. Tato DNA pak může být exprimována ve vhodném expresívním systému kvůli získání polypeptidu s aktivitou tyrosinkinázy. Bylo zjištěno, že např. VEGF a EGF receptorové cytoplazmatické domény, které byly získány expresí rekombinantního proteinu v insektních buňkách, vykazují vlastní tyrosinkinázovou aktivitu. V případě VEGF receptorové Fit (Genbank accession number X51602) byl izolován 1,7kb DNA fragment kódující většinu z cytoplazmatické oblasti, začínající methioninem 783 a zahrnující terminační kodon, popsaný Shibuyaem etal. (Oncogene, 1990, 5: 519-524), z cDNA a klonován do bakulovirového transsubstítučního (transplacement) vektoru (např. pAcYMl (viz Baculovirus Expressíon System: A Laboratory Guide, L.A. King and R.D. Possee, Chapman and Halí, 1992) nebo pAc360 nebo pBlueBacHis (dostupný u Invitrogen Corporation)). Tento rekombinantní konstrukt byl kotransfektován do insektních buněk (např. Spodoptera frugiperda 21 (Sf21)) svirou DNA (např. Pharmingen BaculoGold) k připravení rekombinantního bakuloviru. (Detaily tohoto způsobu pro sestavení rekombinantních DNA molekul a přípravy a použití rekombinantního bakuloviru lze nalézt v klasické literatuře, např. Sambrook etal., 1989, Molecular cloning-A Laboratory Manual, 2^nd edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press and 0'Reilly etal, 1992, Baculovirus Expressíon Vectors-A Laboratory Manual, W.H. Freeman and Co. New York). U dalších tyrosinkináz použitých v testech mohou být cytoplazmatické fragmenty začínající methioninem 806 (KDR, Genbank accession number L04947) a methioninem 668 (EGF receptor, Genbank accession number X00588) klonovány a exprimovány podobným způsobem.

Při expresi aktivity cFIt tyrosinkinázy byly buňky Sf21 infikovány cFIt rekombinantním virem s čistým plakem o multiplicítě infekce 3 a po 48 hodinách sbírány. Tyto sebrané buňky byly promývány ledově studeným fyziologickým roztokem tlumeným fosfátem (PBS) (10 mM fosforečnan sodný pH 7,4, 138 mM chloridu sodného, 2,7 mM chloridu draselného), pak resuspendovány v ledově studeném roztoku HNTG/PMSF (20 mM Hepes pH 7,5, 150 mM chloridu sodného, 10 obj.% glycerolu, 1 obj. % Tritonu X100, 1,5 mM chloridu hořečnatého, lmM ethylenglykol- bis (p-aminoethylether)-WV',V -tetraoctové kyseliny (EGTA), I mM PMSF (fenyl55 methy I sul fony lfluorid); PMSF byl před použitím upravován čerstvě připraveným 100 mM rozto- 10CA JV1UO7 DU kem v methanolu) při použití 1 ml HNTG/PMSF na 10 milionů buněk. Suspenze byla centrifugována po dobu 10 minut pri 13 000 ot. za min. při teplotě 4 °C, supematant (enzymová kultura) byl odstraněn a skladován v alikvótních podílech za teploty -70 °C. Každá nová dávka enzymové kultury byla pri testu titrována zředěním s enzymovým ředicím roztokem (100 mM HEPES pH 7,4, 0,2 mM orthovanadátu sodného, 0,1 obj. % Tritonu XI00, 0,2 mM dithiothreitolu). Při typickém dávkování byla enzymová kultura zředěna 1 ku 2000 enzymovým ředicím roztokem a pro každý test bylo používáno 50 μΐ zředěného enzymu.

Zásobní roztok substrátu byl připraven z nepravidelného kopolymeru obsahujícího tyrosin, např. to Póly (Glu, Ala, Tyr) 6:3:1 (Sigma P3899) a byl skladován jako 1 mg/ml zásobní roztok v PBS při teplotě -20 °C a pro potažení destiček byl zředěn 1 ku 500 pomocí PBS.

Jeden den před testem bylo 100 μΐ zředěného roztoku substrátu dávkováno do všech jamek testovacích destiček (imunodestičky Nunc Maxisorp o 96 jamkách), jenž byly poté uzavřeny a pone15 chány pres noc při teplotě 4 °C.

V den testu byl roztok substrátu pročištěn a jamky testovacích destiček byly promývány PBST (lx) (PBS obsahující 0,05 obj. % Tweenu 20) a 50 mM Hepes pH 7,4 (lx).

Testované sloučeniny byly zředěny 10% dimethy lsulfoxidem (DMSO) a 25 μΙ zředěné sloučeniny bylo naneseno do jamek v promytých testovacích destičkách. „Úplné“ kontrolní jamky obsahovaly místo sloučeniny 10% DMSO. Do všech testovacích jamek kromě „slepých“ kontrolních jamek, které obsahovaly chlorid manganatý bez ATP, bylo přidáno 25 μΐ 40 mM chloridu manganatého obsahujícího 8μΜ adenosin-5'-trifosfátu (ATP). Ke spuštění reakcí bylo do každé jamky přidáno 50 μΐ čerstvě zředěného enzymu a destičky byly inkubovány při pokojové teplotě po dobu 20 minut. Tekutý podíl pak byl odstraněn a jamky byly promývány PBST (2x), Do každé jamky bylo přidáno 100 μΐ myšího IgG anti-fosfotyrosinové protilátky (Upstate Biotechnology lne. Produkt 05-321) zředěné 1 ku 6000 pomocí PBST obsahujícího 0,5 obj. % bovinního sérumalbuminu (BSA) a destičky byly inkubovány po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě, poté byl tekutý podíl odstraněn a jamky byly promývány pomocí PBST (2x). Do každé jamky bylo přidáno 100 μΐ křenové peroxidázy (HRP)-vázané ovčí antimyší Ig protilátky (Amersham produkt NXA 931) zředěné l ku 500 pomocí PBST obsahujícího 0,5 obj. % (BSA) a destičky byly inkubovány po dobu 1 hodiny pri pokojové teplotě, poté byl tekutý podíl odstraněn a jamky byly promývány pomocí PBST (2x). Do každé jamky bylo přidáno 100 μΐ roztoku 2,2'-azino-bis (335 ethylbenzthiazolin-6-sulfonové kyseliny) (ABTS) čerstvě připravené pomocí jedné 50 mg ABTS tablety (Boehringer 1204 521) v 50 ml čerstvě připraveného 50 mM fosfát-citrátového pufru pH5,0 + 0,03 % perboritanu sodného (připraveného s 1 kapslí fosfát-citrátového pufru s perboritanem sodným (PCSB) (Sigma P4922) na 100 ml destilované vody). Destičky pak byly inkubovány po dobu 20 až 60 minut při pokojové teplotě, dokud hodnota optické hustoty „úpl40 ných“ kontrolních jamek změřená při 405 nm na spektrofotometru byla přibližně 1,0. „Slepé“ (bez ATP) a „úplné“ (bez sloučeniny) kontrolní hodnoty byly používány ke stanovení zřeďovacího poměru testované sloučeniny, která poskytla 50% inhibici enzymové aktivity, (b) ín vitro testy proliferace HUVEC

Tento test determinuje schopnost testované sloučeniny inhibovat proliferaci lidských umbilikálních žilních endotheliálních buněk (HUVEC) stimulovaných růstovým faktorem,

HUVEC buňky byly izolovány v MCDB 131 (Gibco BRL) + 7,5 obj. % fetálního telecího séra (FCS) a naneseny na destičku (do pasáže 2 až 8) v MCDB 131+2 obj. % FCS + 3 pg/ml heparinu + 1 pg/ml hydrokortisonu v koncentraci 1 000 buněk na jamku (96 jamek na jedné destičce). Po minimálně 4 hodinách byl do jamek dávkován příslušný růstový faktor (tzn. VEGF 3 ng/ml, EGF 3 ng/ml nebo b-FGF 0,3 ng/ml) a sloučenina. Kultury byly inkubovány po dobu 4 dnů při teplotě 37 °C s 7,5% oxidem uhličitým. Čtvrtý den byly kultury vystaveny 37 kBq (1 pCi) na jamku tritiovaného thymidinu (Amersham produkt TRA 61) a inkubovány po dobu 4 hodin.

- 11 CZ 301689 B6

Buňky byly sbírány pomocí sběrače (Tomtek) pro destičky o 96 jamkách a následně byla testována inkorporace tritia pomocí měřiče beta záření. K měření inhibice buněčné proliferace stimulované růstovým faktorem pomocí sloučenin byla používána inkorporace radioaktivity do buněk.

(c) In vivo model pevného nádoru

V tomto testu se měří schopnost sloučenin inhibovat růst pevného nádoru.

Nádorový xenoimplantát CaLu-6 byl zaveden do boku samičí athymické švýcarské nu/nu myši io subkutánní injekcí lxlO⁶ CaLu-6 buněk na myš νΙΟΟμΙ 50 obj. % roztoku Matrigel v kultivačním médiu bez séra.Deset dnů po buněčném implantátu byly myši rozděleny do skupin o 8 až 10 kusech takovým způsobem, aby se získaly srovnatelné skupiny s průměrným objemem nádoru. Nádory byly měřeny pomocí posuvného měřítka s noniem a objemy byly spočteny následovně.

(lχ w)x _v'0^x w)x(^4-6), | j_e nejdelší průměr a w je průměr kolmý k nejdelšímu průměru.

Testované sloučeniny byly podávány perorálně jednou denně po dobu minimálně 21 dnů a kontrolní zvířata dostala zředěný roztok sloučeniny. Nádory byly měřeny dvakrát týdně. Míra inhibice růstu byla spočtena srovnáním středního objemu nádoru kontrolní skupiny oproti ošetřované skupině a statistická signifikance stanovená Studentským t-testem a/nebo Mann-Whitney pořa20 dovým sumárním testem. Inhibiční účinek sloučenin byl statistický významný, pokud p < 0,05.

Toxikologický profil sloučenin podle předloženého vynálezu mohl být stanoven např. při 14denní studii účinku na potkanech, která je uvedena níže.

(d) 14-denní studie toxických účinků na potkanech

V tomto testu se měří aktivita sloučenin při zvyšující se zóně hypertrofie ve femorálních epifyzeálních růstových destičkách distální stehenní kosti a proximální holenní kosti a umožňuje vyšetření histopatologických změn v dalších tkáních.

Angiogeneze je hlavním příhodou při endochondrální osifikaci během elongace dlouhé kosti a předpokládá se, že vaskulámí invaze růstové destičky závisí na produkci VEGF hypertrofhími chondrocyty. Expanse zóny hypertrofního chondrocytu a inhibice angiogeneze byla demonstrována po ošetření agens, která specificky oddělují VEGF, např. (i) rozpustný VEGF receptorový chimérický protein (Fit-(1—3)—IgG) u myší (Gerber, H-P., Vu, T.H., Ryan, A.M., Kowalski, J., Werb, Z. a Ferrara, N. VEGF couples hypertrophic cartilage remodelling, ossiffcation and angiogenesis during endochondral bone formation, Nátuře Med., 5: 623-628, 1999) a (ii) rekombinantní polidštěná anti-VEGF monokíonální IgGl protilátka u cynomologní opice (Ryan, A.M., Eppler, D.B., Hagler, K.E., Bruner, R.H., Thomford, P.J., Halí, R.L. Shopp, G.M.

and O'Neill, C.A. Preclinical Safety Evaluation of rhuMAbVEGF, an antiangiogenic humanised monoclonal antibody, Tox. Path., 27: 78 - 86, 1999).

Proto by měl inhibitor aktivity VEGF tyrosinkinázy také inhibovat vaskulámí invazi reeeptorové chrupavky a zvyšovat zónu hypertrofie ve femorálních epifyzeálních růstových destičkách distál45 ní stehenní kosti a proximální holenní kosti.

Sloučeniny byly nejprve formovány suspenzí v 1 obj. % roztoku monooleátu polyoxyethylen (20)-sorbitanu v deionizované vodě mletím při teplotě 4 °C přes noc (alespoň 15 hodin). Sloučeniny byly těsně před dávkováním znovu suspendovány mícháním. Mladým potkanů Alderley

Park (vyšlechtěným z Wistar, 135 až 150 g, staré 4 až 8 týdnů, 5 až 6 na skupinu) byla podávána jednou denně pomocí perorální výživy žaludeční sondou po dobu následujících 14 dnů sloučenina (v 0,25 ml/100 g tělesné váhy) nebo nosič. V 15 den byla zvířata humánním způsobem usmrcena vzrůstající koncentrací oxidu uhličitého a po smrti byly odebrány vzorky tkání. Byly odebrány tkáně, které zahrnovaly femorotibiální spoje, a zpracovány standardními histologickými

-12CL JU1OO7 DO technikami za účelem připravení parafínových řezů. Histologické řezy byly odbarveny hematoxylinem a eosinem a zkoumány světelnou mikroskopií za účelem provedení histopatologie.

Oblasti femorálních epifýzeálních růstových destiček distální kosti stehenní a proximální kosti holenní byly měřeny v řezech kosti stehenní a holenní pomocí morfometrické zobrazovací analý5 zy. Zvýšení zóny hypertrofie bylo stanoveno srovnáním průměrné oblasti epifýzeálních růstových destiček kontrolní skupiny oproti ošetřované skupině a statistická signifikance byla stanovena pomocí jednostranného Studentův t-testu. Inhibiční účinek sloučenin byl statistický významný, pokud p<0,05.

io Sloučeniny podle vynálezu mají při 14-denním toxikologickém testu na potkanech prospěšný toxikologický profil na rozdíl od dalších sloučenin spadajících do rozsahu mezinárodní přihlášky vynálezu číslo WO 98/13354.

Sloučeniny podle vynálezu mají při 14-denním toxiko logickém testu na potkanech prospěšný toxikologický profil na rozdíl od dalších sloučenin spadajících do rozsahu mezinárodní přihlášky vynálezu Číslo WO 97/30035.

Při podání potkanům, kteří mají statisticky významné přírůstky oblasti femorální epifyzeální růstové destičky distální kosti stehenní a/nebo proximální kosti holenní, výhodně dávky menší než nebo rovné 150 mg/kg, výhodněji dávky menší než nebo rovné 100 mg/kg, zejména dávky menší než nebo rovné 50 mg/kg, neprodukovaly sloučeniny podle vynálezu při prováděných testech (d) nepřijatelné histopatologické změny v dalších tkáních.

Například sloučenina 4-(4-brom-2-fluoranilino}-6-methoxy-7-(l-tnethylpiperid-4-ylmetho25 xy) chinazolin, (příklad 2), testovaná podle výše uvedených bodů (a), (b), (c) a (d) měla následující výsledky:

(a) Fit - IC₅₀ při 1,6 μΜ KDR-1C_5O při 0,04 μΜ

EGFR - IC50 při 0,5 μΜ (b) VEGF - IC₅o při 0,06 μΜ EGF-IC₅₀ při 0,17 μΜ Basal - IC₅₀ při >3 μΜ (c) 78% inhibice nádorového růstu při 50 mg/kg; p < 0,001 (Mann-Whitney pořadovým sumárním testem);

(d) 75% zvýšení hypertrofie epifyzeální růstové destičky při 100 mg/kg denně u samic potkanů; p < 0,001 (jednostranný Studentský t-test).

V rámci dalšího aspektu poskytuje předložený vynález farmaceutický prostředek, který obsahuje výše definovanou sloučeninu podle vynálezu nebo její farmaceuticky přijatelnou sůl společně s farmaceuticky přijatelným excipientem nebo nosičem.

Prostředek může být ve formě vhodné pro perorální podání (např, tablety, pastilky, tvrdé nebo měkké kapsle, vodné nebo olejovité suspenze, emulze, dispergovatelné prášky nebo granule, sirupy nebo léčebné nápoje), nebo ve formě vhodné pro podání inhalací (např. jemně rozetřený prášek nebo tekutý aerosol), nebo ve formě vhodné pro podání insuflací (např. jemně rozetřený prášek), nebo ve formě vhodné pro parenterální injekce (např. sterilní roztok, suspenze nebo emulze pro intravenózní, subkutánní, intramuskulární, intravaskulámí nebo infuzní dávkování), nebo ve formě vhodné pro místní podání (např. krémy, masti, gely nebo vodné nebo olejovité roztoky nebo suspenze), nebo ve formě vhodné pro rektální podání (např. čípky). Obecně mohou

-13CZ 301689 B6 být výše uvedené prostředky připraveny standardním způsobem za použití standardních excipientů.

Prostředky podle předloženého vynálezu mají výhodně jednotkovou dávkovači formu. Sloučeni5 na bude běžně podávána teplokrevným zvířatům v rozmezí jednotkové dávky 5 až 5 000 mg na m² těla zvířete, tzn. přibližně 0,1 až 100 mg/kg. Předpokládá se, že jednotková dávka se bude pohybovat v rozmezí např. 1 až 100 mg/kg, výhodně 1 až 50 mg/kg, které stačí k poskytnutí terapeuticky účinné dávky. Jednotková dávkovači forma, např. tableta nebo kapsle, bude obvykle obsahovat např. 1 až 250 mg aktivní složky.

io

Bylo zjištěno, že sloučeniny podle předloženého vynálezu inhibují aktivitu VEGF receptorové tyrosinkinázy a mají proto antiangiogenní účinky a/nebo schopnost snižovat vaskulámí permeabiiitu.

Podle dalšího aspektu poskytuje předložený vynález použití sloučeniny podle vynálezu nebo její farmaceuticky přijatelné soli při výrobě léčiva pro použití při tvorbě antiangiogenního a/nebo vaskulámí permeabilitu snižujícího účinku u teplokrevného zvířete, jako je člověk.

Podle dalšího aspektu poskytuje předložený vynález použití sloučeniny podle vynálezu nebo její farmaceuticky přijatelné soli pri výrobě léčiva pro použití pri tvorbě protinádorového účinku u teplokrevného zvířete, jako je Člověk.

Podle dalšího aspektu poskytuje předložený vynález použití sloučeniny podle vynálezu nebo její farmaceuticky přijatelné soli při výrobě léčiva k inhibicí účinků vaskulámího endotelového růs25 tového faktoru u teplokrevného zvířete, jako je člověk.

Jak je uvedeno výše, tak velikost potřebné dávky pro dosažení terapeutického nebo profy taktického ošetření příslušných nemocí bude různá v závislosti na ošetřovaném subjektu, způsobu podání a síle ošetřované nemoci. Výhodně se bude denní dávka pohybovat v rozmezí 1 až

50 mg/kg. Nicméně denní dávka bude různá v závislosti na ošetřovaném subjektu, způsobu podání a síle ošetřované nemoci. Proto může být optimální dávka stanovena praktickým lékařem, který příslušného pacienta ošetřuje.

Antiangiogenní a/nebo vaskulámí permeabilitu snižující ošetření definované výše může být apli35 kováno jako základní terapie nebo může zahrnovat kromě sloučeniny podle předloženého vynálezu jednu nebo více dalších látek a/nebo ošetření, Toto společné ošetření může být dosaženo současným, postupným nebo separátním způsobem podání jednotlivých komponent ošetření. Z hlediska lékařské onkologie je normální praxí používat kombinace různých forem ošetření k léčení každého nového pacienta s rakovinou. V lékařské onkologii mohou být další kompo40 nenty (a) tohoto společného ošetření kromě výše definovaného snížení antiangiogenního a/nebo vaskulámí permeability snižujícího ošetření následující: chirurgie, radioterapie nebo chemoterapie, Daná chemoterapie může zahrnovat pět hlavních kategorií terapeutického agens:

(i) další antiangiogenní agens, které působí odlišnými mechanismy než výše definované agens (např. linomid, inhibitory funkce integrinu ανβ3, angiostatin, endostatin, razoxin, thalidomid) a zahrnující vaskulámí cílené agens (např. combrestatinfosfát) a agens poškozující cévy popsané v mezinárodní přihlášce vynálezu WO 99/02166, přičemž dokument je zde uveden jako odkaz (např. Λ'-acetylcolchinol-O-fosfát));

(ii) cytostatika, např. antioestrogeny (např. tamoxifen, toremifen, raloxifen, droloxifen, iodoxyfen), progestogeny (např. megestrolacetát), inhibitory aromatas (např. anastrozol, letrazol, vorazol, exemestan), antiprogestogeny, antiandrogeny (např. flutamid, nilutamid, bicalutamid, cyproterontacetát), agonisté a antagonisté LHRH (např. goserelinacetát, luprolid, abarelix), inhibitory testosteron-5a-dihydroreduktas (např. finasterid), antiinvazní agens (např. inhibitory metaloproteinas jako marimastat a inhibitory receptorové funkce plasminogenaktivátoru urokiná- 14zy) a inhibitory fimkce růstového faktoru (např. růstové faktory zahrnují např. růstový faktor odvozený od destičky a hepatocytový růstový faktor, např, inhibitory zahrnují růstový faktor protilátek, růstový faktor receptorů protilátek, inhibitory tyrosinkinázy a serin/threoninkinázy);

(iii) modifikátory biologické odpovědi (např. interferon);

(iv) protilátky (např. edrecolomab); a (v) antiproliferaČní/antineoplastická léčiva a jejich kombinace používané v lékařské onkologii, např. antimetabolity (např. antifoláty jako methotrexát, fluoropyrimidiny jako 5-fluorouraciI, analoga purinu a adenosinu, cytosin-arabinosid); protinádorová antibiotika (např. anthracykliny jako doxorubicin, daunomycin, epirubicin a idarubicin, mitomycin-C, dactinomycin, mithramycin); deriváty platiny (např. cisplatina, karboplatina); alkylační činidla (např. nitrogen-mustard, nelphalan, chlorambucil, busuplhan, cyklofosfamíd, ifosfamid, nitrosomočoviny, thiotepa); anti15 mitotíka (např. vínkové alkaloidy jako vinkristin a taxoidy jako taxol, taxoter); enzymy (např, asparaginasa); inhibitory thymidylát-synthasy (např. raítitrexed); inhibitory topoizomeras (např. epipodofylotoxiny jako etoposid a teniposid, amsacrin, topotecan, irinotecan).

Například toto společné ošetření může být dosaženo simultánním, sekvenčním nebo separátním způsobem podání výše uvedené sloučeniny podle vynálezu nebo její soli, zejména její hydrochloridové solí, a vaskulámího cíleného agens popsané v WO 99/02166, napr. V-acetylcolchinol-O-fosfát (příklad 1 z WO 99/02166),

Jak je uvedeno výše, jsou sloučeniny podle předloženého vynálezu zajímavé z hlediska svých účinků, které mají antiangiogenní a/nebo vaskulámí permeabilitu snižující účinek. Předpokládá se, že tyto sloučeniny podle předloženého vynálezu budou použitelné na široké rozmezí nemocí zahrnujících rakovinu, diabetes, psoriázu, revmatoidní artritidu, Kaposiho sarkom, nezhoubný nádor z krevních cév, akutní a chronickou nefropatii, aterom, arteriální restenózu, autoimunní chorobu, akutní zánět, nepřiměřenou tvorbu jizev a adhezi, endometriózu, dysfunkční uterinní krvácení a oční onemocnění sproliferací retinálních cév. Zejména se předpokládá, že tyto sloučeniny podle předloženého vynálezu budou příznivě zpomalovat růst primárních a rekurentních pevných nádorů např. tlustého střeva, prsou, prostaty, plic a kůže. Zejména se předpokládá, že tyto sloučeniny podle předloženého vynálezu budou inhibovat růst těch primárních a rekurentních pevných nádorů, které souvisejí s VEGF, a to zejména ty nádory, které jsou výrazně závislé na VEGF z hlediska svého růstu a rozvoje, včetně např. určitých nádorů tlustého střeva, prsou, prostaty, plic a kůže.

V dalším aspektu se předpokládá, že předložený vynález poskytuje sloučeniny podle vynálezu, které inhibuj í růst těchto primárních a rekurentních pevných nádorů, které souvisejí s VEGF i

EGF, a zejména těch nádorů, které jsou výrazně závislé na VEGF i EGF z hlediska svého růstu a rozvoje.

Kromě svého použití v terapeutickém ošetření, jsou sloučenina podle vynálezu a její farmaceuticky přijatelné soli použitelné jako farmakologické nástroje při vývoji a standardizaci in vitro a in vivo testovacích systémů na laboratorních zvířatech, např. koček, psů, králíků, opic, potkanů a myší, jako součást výzkumu nových terapeutických agens.

Termín „ether“ používané kdekoliv v předloženém vynálezu označuje diethylether.

Předložený vynález bude dále ilustrován, bez jakýchkoliv omezení, následujícími příklady, ve kterých, pokud není uvedeno jinak:

(i) odpařování bylo prováděno na rotační odparce za vakua a zpracování bylo prováděno po odstranění zbylých pevných látky, např. sušidly a filtrací.

- 15CZ 301689 B6 (ii) odpařování bylo prováděno za pokojové teploty, tzn. v rozmezí 18 až 25 °C a za atmosféry inertního plynu, např. argon.

(iii) sloupcová chromatografíe („flash“ způsobem) a střednětlaká kapalinová chromatografíe (MPLC) byla prováděna se silikagelem značky Merck Kieselgel silica (Art. 9385) nebo Merck

Lichroprep RP-18 (Art. 9303) silikagel s reverzní fází za koupený u E. Merck, Darmstadt, Germany;

(iv) výtěžky jsou uvedeny pro ilustraci a nemají nikterak ukazovat maximální výtěžnost; io (v) teploty tání nejsou korigovány a byly stanoveny na automatickém přístroji Mettler SP62 nebo Koffler s topnou deskou.

(vi) struktury konečných produktů byly potvrzeny nukleární magnetickou rezonancí (NMR) (vět15 šinou vodíkovou) a hmotnostní spektrometrií; chemický posun u vodíkových spekter (NMR) byl měřen na stupnici delta a multiplicita píku byla označena následovně: s, singlet; d, dublet; t, triplet; m, multiplet; br, široký; q, kvartet; NMR spektra byla měřena na 400 MHz přístroji při teplotě 24 °C.

(vii) meziprodukty byly obecně plně popsány a čistota byla stanovena pomocí tenko vrstvě chromatografie (TLC), vysokoúčinné kapalinové chromatografíe (HPLC), infračervené spektroskopie (IR) nebo NMR;

(viii) a byly používány následující zkratky:

DMF - XA-dimethylformamid

DMSO - dimethylsulfoxid THF - tetrahydrofuran TFA - trifluoroctová kyselina NMP - 1-methy 1-2-pyrrolidinon

BP - Britský lékopis

Ph. Eur - Evropský lékopis

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

TFA (3 ml) bylo přidáno do suspenze 4-(4-brom-2-fluoranilino)-7-(l - (/erc butoxykarbonvl)40 piperidin-4-ylmethoxy)-6-methoxychinazolinu (673 mg, 1,2 mmol) v methylenchloridu (10 ml). Po 1 hodinovém míchání při pokojové teplotě byly odstraněny za vakua těkavé látky. Zbytek byl triturován směsí vody a etheru. Organická vrstva byla separována, vodná vrstva byla znovu promývána etherem, vodná vrstva byla upravena na pH=10 2N vodným roztokem hydroxidu sodného. Vodná vrstva byla extrahována methylenchloridem, organická vrstva byla sušena (MgSO₄) a rozpouštědlo bylo odstraněno za vakua. Pevná látka byla triturována směsí etheru a petroletheru (1/1), filtrována, promývána etherem a sušena za vakua, čímž byl získán 4(4-brom-2-fIuoranilino)-6-methoxy-7-(píperidin-4-ylmethoxy)chinazolÍn (390 mg, 70,5%). MS-ESL46M63 [MH]⁺ 'HNMRspektrum: (DMSOd₆) 1,13-1,3 (m,2H), 1,75 (d, 2H), 1,87-2,0(m, IH), 2,5 (d, 2H), 3,0 so (d, 2H), 3,96 (s, 3H), 3,98 (d, 2H), 7,2 (s, IH), 7,5 (dd, IH), 7,55 (t, IH), 7,68 (dd, IH), 7,80 (s,

IH), 8,36(s, IH), 9,55 (brs, IH)

Elementární analýza: naměřená C 54,5 H 4,9 N 12,1

- 16jwiwo7 υυ

C₂,H₂₂N₄O₂BrF vypočtená C 54,7 H 4,8 N 12,1%

Výchozí látka byla připravena následujícím způsobem:

Roztok 7-benzyloxy-4-chlor-6-methoxychinazolinhydrochloridu (8,35 g, 27,8 mmol), (připravený např. podle způsobu z WO 97/22596, příklad 1) a 4-brom-2-fluoranilinu (5,65 g, 29,7 mmol) v 2-propanolu (200 ml) byly zahřívány při refluxu po dobu 4 hodin. Výsledný precipitát byl spojen filtrací, promýván 2-propanolem, pak etherem a sušen za vakua, čímž byl získán 7-benzyloxy-4-(4-brom-2-fluoranílino)-6-methoxychinazolin-hydrochlorid (9,46 g, 78%).

io Ή NMR spektrum: (DMSOdé; CD₃COOD) 4,0 (s, 3H); 5,37 (s, 2H); 7,35-7,5 (m, 4H); 7,527,62 (m, 4H); 7,8 (d, IH); 8,14 (9s, IH); 8,79 (s, IH)

MS-ESI: 456 [MH]⁺

Elementární analýza: naměřená C 54,0 H 3,7 N 8,7 C₂₂Hi₇N₃O₂BrF-0,9HCl vypočtená C 54,2 H 3,7 N 8,6%

Roztok 7-benzyloxy-4-(4-brúm-2-fluoranilino}“ó-methoxychinazolin-hydrochlorÍdu (9,4 g, 19,1 mmol) v TFA (90 ml) byl zahříván při refluxu po dobu 50 minut. Směs se nechala ochladit a byla nalita do ledu. Výsledný precipitát byl spojen filtrací a rozpuštěn v methanolu (70 ml). Roztok byl upraven na pH=9-l0 konc. vodným roztokem amoniaku. Směs byla zahuštěna na poloviční objem odpařením. Výsledný precipitát byl spojen filtrací, promýván vodou a etherem a sušen za vakua, čímž byl získán 4-(4-brom-2-fluoranilino}-7-hydroxy-6-methoxychinazolin (5,66 g, 82%).

'H NMR spektrum: (DMStM; CD₃COOD) 3,95 (s, 3H); 7,09 (s, IH); 7,48 (s, IH); 7,54 (t, IH); 7,64 (d, IH); 7,79 (s, 1H); 8,31 (s, IH)

MS - ESI: 366 [MH]⁺

Elementární analýza: naměřená C 49,5 H 3,1 N 11,3 C₁₃Hi,N₃O₂BrF vypočtená C 49,5 H 3,0 N 11,5%

Za stálé teploty v rozmezí 0-5 °C byl po kapkách přidáván roztok di-ferc-butyldikarbonátu (41,7 g, 0,19 mol) v ethylacetátu (75 ml) do roztoku ethyl-4-piperidinkarboxylátu (30 g,

0,19 mol) v ethylacetátu (150 ml) ochlazeném na teplotu 5 °C. Po 48 hodinovém míchání při pokojové teplotě byla směs nalita do vody (300 ml). Organická vrstva byla separována, promývána postupně vodou (200 ml), 0,lN vodným roztokem chlorovodíkové kyseliny (200 ml), nasyceným hydrogenuhliěitanem sodným (200 ml) a solankou (200 ml), sušena (Mg$O₄) a odpařová35 na, čímž byl získán ethyl-4-( l-(/erc-butoxykarbonyl)piperidin)karboxylát (48 g, 98%).

*H NMR spektrum: (CDC1₃) 1,25 (t, 3H); 1,45 (s, 9H); 1,55-1,70 (m, 2H); 1,8-2,0 (d, 2H); 2,352,5 (m, IH); 2,7-2,95 (t, 2H); 3,9-4,1 (br s, 2H); 4,15 (q, 2H)

Roztok 1M hydridohlinitanu lithného v THF (133 ml, 0,133 mol) byl přidán po částech do rozto40 ku ethylů—(l~(/erc-butoxy karbony l)piperidin)karboxylátu (48 g, 0,19 mol) v suchém THF (180ml) chlazeném na teplotu 0 °C. Po 2 hodinovém míchání při teplotě 0 °C byla přidána voda (30 ml), poté 2N hydroxid sodný (10 ml). Precipitát byl odstraněn filtrací pres křemičitou hlinku a promýván ethylacetátem. Filtrát byl promýván vodou, solankou, sušen (MgSO₄) a odpařován, čímž byl získán l-(terc-butoxykarbonyl)-4-hydroxymethylpiperidin (36,3 g, 89%).

MS (El): 215 [MH]⁺ *H NMR spektrum: (CDC1₃) 1,05-1,2 (m, 2H); 1,35-1,55 (m, 10H); 1,6-1,8 (m, 2H); 2,6-2,8 (t, 2H); 3,4-3,6 (t, 2H); 4,0-4,2 (br s, 2H)

1,4-Diazabicyklo[2.2.2]oktan (42,4 g, 0,378 mol) byl přidán do roztoku I-(ím>butoxy50 karbonyI)-4-hydroxymethylpiperidinu (52,5 g, 0,244 mol) v terc-butylmethyletheru (525 ml).

Po 15 minutovém míchání při pokojové teplotě byla směs ochlazena na teplotu 5 °C a po částech v průběhu 2 hodin byl přidáván roztok toluensulfonylchloridu (62,8 g, 0,33 mmol) v terč- 17CZ 301689 B6 butylmethyletheru (525 ml), přičemž teplota byla udržována pri 0 ^ŮC. Po 1 hodinovém míchání pri pokojové teplotě byl přidán petrolether (1 1) a preeipitát byl odstraněn filtrací. Filtrát byl odpařován, čímž byla získána pevná látka, která byla rozpuštěna v etheru a promývána postupně

0,5N vodnou kyselinou chlorovodíkovou (2 x 500 ml), vodou, nasyceným hydrogenuhličitanem sodným a solankou, sušena (MgSO₄) a odpařována, čímž byl získán 1- (Zerc-butoxykarbonyl)-4(4-methylfenylsulfonyloxymethyl)piperidin (76,7 g, 85%).

MS (ESI): 392 [MNa]⁺ 'HNMRspektrum: (CDCI₃) 1,0-1,2 (m, 2H); 1,45 (s, 9H); 1,65 (d, 2H); 1,75-1,9 (m, 2H); 2,45 (s, 3H); 2,55-2,75 (m, 2H); 3,85 (d, 1H); 4,<M,2 (br s, 2H); 7,35 (d, 2H); 7,8 (d, 2H)

Uhličitan draselný (414 mg, 3 mmol) byl přidán do suspenze 4-(4-brom-2-fluoranilino)-7-hydroxy-6-methoxychinazolinu (546 mg, 1,5 mmol) v DMF (5 ml). Po 10 minutovém míchání při pokojové teplotě byl přidán l-(řerc-butoxykarbonyl)-4-(4-methylfenylsulfonyloxymethyl)piperidin (636 mg, 1,72 mmol) a směs byla zahřívána při teplotě 95 °C po dobu 2 hodin. Po ochlazení byla směs nalita do studené vody (20 ml). Preeipitát byl spojen filtrací, promýván vodou a sušen za vakua, čímž byl získán 4-(4-brom-2-fluoranilino>-7-(l-(zerc-butoxykarbonyl)piperid-4-ylmethoxy)~6-niethoxychinazolin (665 mg, 79%).

MS-ESI: 561-563 [MH]⁺

Ή NMR spektrum: (DMSOd₆) 1,15-1,3 (m, 2H), 1,46 (s, 9H), 1,8 (d, 2H), 2,0-2,1 (m, IH),

2,65-2,9 (m, 2H), 3,95 (s, 3H), 4,02 (br s, 2H), 4,05 (d, 2H), 7,2 (s, IH), 7,48 (d, IH), 7,55 (t,

IH), 7,65 (d, IH), 7,8 (s, IH), 8,35 (s, IH}, 9,55 (brs, IH)

Příklad 2a

Roztok 37% vodného formaldehydu (50 μΙ, 0,6 mmol), poté kyanoborohydridu sodného (23 mg, 0,36 mmol) byl přidán do roztoku 4-{4-brom-2-fluoranilino)-6-methoxy-7-(piperid^4-ylmethoxy) chinazolinu (139 mg, 0,3 mmol), (připraveného podle způsobu z příkladu 1), ve směsi THF a methanolu (1,4 ml/1,4 ml). Po 1 hodinovém míchání pri pokojové teplotě byla přidána voda a těkavé látky byly odstraněny za vakua. Zbytek byl triturován vodou, filtrován, promýván vodou a sušen za vakua. Pevná látka byla čištěna chromatografií na neutrální alumině v systému methylenchlorid, poté směsí methylenchloridu a ethylacetátu (1/1), poté směsí methylenchloridu, ethylacetátu a methanolu (50/45/5). Frakce obsahující očekávaný produkt byly odpařovány za vakua a výsledná bílá pevná látka byla rozpuštěna ve směsi methylenchloridu a methanolu (3 mi/3 ml) a byl přidán 3N chlorovodík v etheru (0,5 ml). Těkavé látky byly odstraněny za vakua, pevná látka byla triturována etherem, filtrována, promývána etherem a sušena za vakua, čímž byl získán 4-(4-brom-2-íluoranilino)-6-methoxy-7-(l-methylpiperid-4-ylmethoxy)chinazolin-hydrochlorid (120 mg, 69%).

MS -ESI: 475-477 [MHf

NMR spektrum protonované formy 4-(4-brom-2-fluoranilino)-6-methoxy-7-(l - methylpiperid-4-ylmethoxy)chinazolinhydrochloridu vykazovalo přítomnost dvou forem A a B v poměru A:B přibližně 9:1.

'H NMR spektrum: (DMSOd,; CFjCOOD) 1,55-1,7 (m, forma A 2H); 1,85-2,0 (m, forma B 15 4H); 2,03 (d, forma A 2H); 2,08-2,14 (br s, forma A IH); 2,31-2,38 (br s, forma B IH); 2,79 (s, forma A 3H); 2,82 (s, forma B 3H); 3,03 (t, forma A 2H); 3,21 (br s, forma B 2H); 3,30 (br, forma B 2H); 3,52 (d, forma A 2H); 4,02 (s, 3H); 4,12 (d, forma A 2H); 4,30 (d, forma B 2H); 7,41 (s, IH); 7,5-7,65 (m, 2H); 7, 81 (d, 1H); 8,20 (s, 1H); 8, 88 (s, 1H)

Elementární analýza: naměřená C 46,0 H 5,2 N 9,6 C₂2H24N₄O2BrF 0,3·Η₂Ο vypočtená C 45,8 H 4,8 N 9,7%

- 18V-Zj UV1UO7 DU

Příklad 2b

37% Vodný formaldehyd (3,5 ml, 42 mmol) byl přidán do roztoku 4-(4-brom-2-f]uoranilino)7-(l-{rerc-butoxykarbonyl)piperid-4~ylmethoxy) -ó-methoxychinazolinu (3,49 g, 6,22 mmol), (připraveného podle způsobu pro výchozí látku z příkladu 1), v mravenčí kyselině (35 ml). Po zahřátí pri teplotě 95 °C po dobu 4 hodin byly těkavé látky odstraněny za vakua. Zbytek byl suspendován ve vodě a směs byla upravena na pH=10,5 pomalým přidáním roztoku 2N hydroxidu sodného. Suspenze byla extrahována ethylacetátem, organická vrstva byla promývána solankou, sušena MgSO₄ a odpařována, čímž byl získán 4-(4-brom-2-fluoranilino)-6-methoxy-7-(lio methy lpiperidin-4-ylmethoxy)chinazolin (2,61 g, 88%).

MS - ESI: 475-477 [MH]⁺ ’H NMR spektrum: (DMSOd^ 1,3-1,45 (m, 2H), 1,8 (d, 2H), 1,7-1,9 (m, IH), 1,95 (t, 2H), 2,2 (s, 3H), 2,85 (d, 2H), 3,96 (s, 3H), 4,05 (d, 2H), 7,19 (s, IH), 7,5 (d, IH), 7,55 (t, IH), 7,67 (d, IH), 7,81 (s, IH), 8,37 (s, IH), 9,54 (s, IH) is Elementární analýza: naměřená C 55,4 H 5,1 N 11,6 C₂₂H₂₄N₄O₂BrF vypočtená C 55,6 H 5,1 N 11,8%

Příklad 2c

Suspenze 4-chlor-6-methoxy-7-(l-methylpiperid-4-yl-methoxy)chinazolínu (200 mg, 0,62 mmol) a 4-brom-2-fluoranilinu (142 mg, 0,74 mmol) v izopropanolu (3 ml) obsahujícím 6N chlorovodík v izopropanolu (110 μΐ, 0,68 ml) byla zahřívána pri refluxu po dobu 1,5 hodiny. Po ochlazení byl precipitát spojen filtrací, promýván izopropanolem, poté etherem a sušen za vakua, čímž byl získán 4-(4-brom-2-fluoranilino)-6-methoxy-7-(l-methylpiperid-4-ylmethoxy)chinazolin-hydrochlorid (304 mg, 90%).

Elementární analýza: naměřená C 47,9 H 4,9 N 10,0 C₂₂H₂₄N₄O₂BrF 0,5H₂O vypočtená C 48,2 H 5,0 N 10,1 0,08 izopropanol

NMR spektrum protonované formy 4-(4-brom-2-fluoranilino)-6-methoxy-7-(l~methylpiperid-4_ylmethoxy)chinazolin-hydrochloridu vykazovalo přítomnost dvou forem A a B v poměru A:B přibližně 9:1.

’H NMR spektrum: (DMSOd$) 1,6-1,78 (m, forma A 2H); 1,81-1,93 (br s, forma B 4H); 1,942,07 (d, forma A 2H); 2,08-2,23 (br s, forma A IH); 2,29-2,37 (br s, forma B IH); 2,73 (d, forma A 3H); 2,77 (d, forma B 3H); 2,93-3,10 (q, forma A 2H); 3,21 (br s, forma B 2H); 3,27 (br s, forma B 2H); 3,42-3,48 (d, forma A 2H); 4,04 (s, 3H); 4,10 (d, forma A 2H); 4,29 (d, forma B 2H); 7,49 (s, IH); 7,53-7,61 (m, 2H); 7,78 (d, IH); 8,47 (s, IH); 8,81 (s, IH); 10,48 (br s, forma A IH); 10,79 (br s, forma B IH); 11,90 (br s, IH)

Při dalším měření NMR byl do roztoku DMSO 4-(4-brom-2-fluoranilino)-6-methoxy-7-(lmethyípiperid-4-yImethoxy)chinazolin-hydrochloridu popsaného výše k uvolnění volné báze v NMR kyvetě přidán uhličitan draselný. Pote bylo NMR spektrum změřeno znovu a vykazovalo přítomnost pouze jedné formy:

’H NMR spektrum: (DMSOd₆; pevný uhličitan draselný) 1,3-1,45 (m, 2H); 1,75 (d, 2H); 1,7-1,9 (m, IH); 1,89 (t, 2H); 2,18 (s, 3H); 2,8 (d, 2H); 3,98 (s, 3H); 4,0 (d, 2H); 7,2 (s, IH); 7,48 (d,

IH); 7,55 (t, IH); 7,68 (d, IH); 7,8 (s, IH); 8,35 (s, IH); 9,75 (s, IH)

Vzorek 4-(4-brom-2-fluoranilino)-ó-methoxy-7-( 1-methyÍpiperid-A-ylmethoxy)chinazolinu (volná báze) byl připraven z 4-(4-brom-2-fluoranilino)-6-methoxy-7-( 1-methylpiperid-4-yl· methoxy)chínazolin-hydrochloridu, (připraveného podle výše uvedeného způsobu), následovně;

4-(4-Brom-2-fluorani 1 ino)-6-methoxy-7-( 1 -methy lpiperid-4-y Imethoxychinazol in-hydrochlorid (50 mg) byl suspendován v methylenchloridu (2 ml) a promýván nasyceným hydro-19CZ 301689 B6 genuhličitanem sodným. Methylenchloridový roztok byl sušen (MgSO₄) a těkavé látky byly odstraněny odpařením, čímž byl získán 4-(4-brom-2-fluoranilino)-6-methoxy-7-(l-methylpiperid-4-y Imethoxy )chinazolin (volná báze). Tímto způsobem vytvořená volná báze vykazovala při NMR přítomnost pouze jedné formy:

’H NMR spektrum: (DMSOd₆) 1,3-1,45 (m, 2H); 1,76 (d, 2H); 1,7-1,9 (m, IH); 1,9 (t, 2H); 2,19 (s, 3H); 2,8 (d, 2H); 3,95 (s, 3H); 4,02 (d, 2H); 7,2 (s, IH); 7,48 (d, IH); 7,55 (t, IH); 7,68 (dd, IH); 7,8 (s, IH); 8,38 (s, 1H); 9,55 (br s, IH)

Při dalším měření NMR byla do DMSO roztoku 4-{4~brom-2-fluoranilino)-6-methoxy-7-(lio methylpiperid-4-ylmethoxy)chinazolinu (volná báze) popsaného výše přidána CF₃COOD a

NMR spektrum bylo znovu změřeno. Tímto způsobem získané spektrum protonované formy trifluoroctové soli 4-(4-brom-2-fluoranilino)-6-methoxy-7-( l-methylpiperid-4-ylmethoxy)chinazolinu vykazovalo přítomnost dvou forem A a B v poměru A:B přibližně 9:1.

‘HNMR spektrum: (DMSOd₆; CF,COOD) 1,5-1,7 (m, forma A 2H); 1,93 (br s, forma B 4H);

2,0-2,1 (d, forma A 2H); 2,17 (br s, forma A 1H); 2,35 (br s, forma Β 1H); 2,71 (s, forma A 3H);

2,73 (s, forma B 3H); 2,97-3,09 (t, forma A 2H); 3,23 (br s, forma B 2H); 3,34 (br s, forma B 2H); 3,47-3, 7 (d, forma A 2H); 4,02 (s, 3H); 4,15 (d, forma A 2H); 4,30 (d, forma B 2H); 7,2 (s, IH); 7,3-7,5 (m, 2H); 7,6 (d, IH); 7,9 (s, IH); 8,7 (s, IH)

Výchozí látka byla připravena následujícím způsobem: l-(/erc-Butoxykarbony 1)-4-(4-methylfenylsulfonyloxymethyl)piperidin (40 g, 0,11 mol), (připravený způsobem pro výchozí látku z příkladu 1), bylo přidáno do suspenze ethyl-4-hydroxy-3-methoxybenzoátu (19,6 g, 0,1 mol) a uhličitanu draselného (28 g, 0,2 mol) v suchém DMF (200 ml). Po 2,5 hodinovém míchání při teplotě 95 °C byla směs ochlazena na pokojovou teplotu a rozdělena mezi vodu a směs ethyl25 acetátu a etheru. Organická vrstva byla promývána vodou, solankou, sušena (MgSO₄) a odpařována. Výsledný olej byl krystalizován z petroletherů a suspenze byla ponechána přes noc při teplotě 5 °C. Pevná látka byla spojena filtrací, promývána petroletherem a sušena za vakua, čímž byl získán ethy 1-4-(1 -(/erc-butoxykarbonyl)piperidin-4-ylmethoxy-3-methoxybenzoát (35 g, 89%).

Teplota tání: 81 až 83 °C MS (ESI): 416 [MNaf 'HNMRspektrum: (CDC1₃) 1,2-1,35 (m, 2H); 1,4 (t, 3H); 1,48 (s, 9H); 1,8-1,9 (d, 2H); 2,02,15 (m, 2H); 2,75 (t, 2H); 3,9 (d, 2H); 3,95 (s, 3H); 4,05^1,25 (br s, 2H); 4,35 (q, 2H); 6,85 (d, IH); 7,55 (s, IH); 7,65 (d, IH)

Elementární analýza: naměřená C 63,4 H 8,0 N 3,5 C_2íH₃iNO₆-0,3H₂O vypočtená C 63,2 H 8,0 N 3,5%

Formaldehyd (12M, 37% ve vodě, 35 ml, 420 mmol) byl přidán do roztoku ethy 1-4-(1 -(terčbutoxy karbony l)p i per id—4-yImethoxy)-3-methoxybenzoátu (35 g, 89 mmol) v mravenčí kyseli40 ně (35 ml). Po 3 hodinovém míchání při teplotě 95 °C byly těkavé látky odstraněny odpařením. Zbytek byl rozpuštěn v methylenchloridu a byl přidán 3M chlorovodík v etheru (40 ml, 120 mmol). Po zředění etherem byla směs triturována, dokud nebyla vytvořena pevná látka, která byla spojena filtrací, promývána etherem a sušena za vakua přes noc při teplotě 50 °C, čímž byl získán ethyl-3-methoxy-4-(l-methy lpiperid-4-ylmethoxy)benzoát (30,6 g, kvant.).

MS (ESI): 308 [MH]⁺

Ή NMR spektrum: (DMSOd₆) 1,29 (t, 3H); 1,5-1,7 (m, 2H); 1,95 (d, 2H); 2,0-2,15 (br s, IH); 2,72 (s, 3H); 2,9-3,1 (m, 2H); 3,35-3,5 (br s, 2H); 3,85 (s, 3H); 3,9-4,05 (br s, 2H); 4,3 (q, 2H); 7,1 (d, IH); 7,48 (s, IH); 7,6 (d, IH)

Roztok ethyl-3-methoxy-4-(l -methylpiperid-4-yl-methoxy)benzoátu (30,6 g,89 mmol) v methylenchloridu (75 ml) byl ochlazen na teplotu 0 až 5 °C. Bylo přidáno TFA (37,5 ml), poté byla po kapkách v průběhu 15 minut přidávána 24N kyselina dusičná (7,42 ml, 178 mmol)

-20V2L· uuxuo? υυ v methylenchloridu (15 ml). Po přidání se roztok nechal ohřát a byl míchán při pokojové teplotě po dobu 2 hodin. Těkavé látky byly odstraněny za vakua a zbytek byl rozpuštěn v methylenchloridu (50 ml). Roztok byl ochlazen na teplotu 0 až 5 °C a byl přidán ether. Precipitát byl spojen filtrací, sušen za vakua při teplotě 50 °C. Pevná látka byla rozpuštěna v methylenchloridu (500 ml) a byl přidán 3M chlorovodík v etheru (30 ml), poté ether (500 ml). Pevná látka byla spojena filtrací a sušena za vakua pri teplotě 50 °C, čímž byl získán ethyl-3-methoxy^4-(lmethylpiperid-4-ylmethoxy)-6-nitrobenzoát (28,4 g, 82%).

MS (ESI): 353 [MH]⁺ ’H NMR spektrum: (DMSOde) 1,3 (t, 3H); 1,45-1,65 (m, 2H); 1,75-2,1 (m, 3H); 2,75 (s, 3H); io 2,9-3,05 (m, 2H); 3,4-3,5 (d, 2H); 3,95 (s, 3H); 4,05 (d, 2H); 4,3 (q, 2H); 7,32 (s, IH); 7,66 (s,

IH)

Suspenze ethyl-3-methoxy-4-(l-methylpiperi<M-ylmethoxy)-6-nitrobenzoát (3,89 g, 10 mmol) v methanolu (80 ml) obsahujícím 10% platinu na aktivním uhlí (50% vlhkost) (389 mg) byla hydrogenována pri tlaku 182 385 Pa (1,8 atm.), dokud neskončila absorpce vodíku. Směs byla zředěna směsí ethylacetátu a vody (1/1) a organická vrstva byla separována. Vodná vrstva byla dále extrahována směsí ethylacetátu a etheru a organické vrstvy byly spojeny, promývány vodou, solankou, sušeny (MgSO₄), filtrovány a odpařovány. Výsledná pevná látka byla triturována ve směsi etheru petroletheru, filtrována, promývána petroletherem a sušena za vakua pri teplotě 60 °C, čímž byl získán ethyl-6-amino-3-inethoxy-4-(l-methylpiperid-4ylmethoxy)benzoát (2,58 g, 80%).

Teplota tání: Ulažll2^ůC MS (ESI): 323 [MH]⁺ ‘HNMRspektrum: (CDCh) 1,35 (t, 3H); 1,4-1,5 (m, 2H); 1,85 (m, 3H); 1,95 (t, 2H); 2,29 (s,

3H); 2,9 (d, 2H); 3,8 (s, 3H); 3,85 (d, 2H); 4,3 (q, 2H); 5,55 (br s, 2H); 6,13 (s, IH); 7,33 (s, IH)

Elementární analýza: naměřená C 62,8 H 8,5 N 8,3 Ci₇H₂₆N₂O4 0,2H₂O vypočtená C 62,6 H 8,2 N 8,6%

Roztok ethy l-6-am ino-3-m ethoxy-^H 1-methy lpiperid-4-ylmethoxy)benzoátu (16,1 g,

50 mmol) v 2-methoxyethanolu (160 ml) obsahující formámidin-acetát (5,2 g, 50 mmol) byl zahříván pri teplotě 115 °C po dobu 2 hodin. Pak byl po částech v průběhu 4 hodin přidáván formamidin-acetát (10,4 g, 100 mmol). Po ochlazení byly těkavé látky odstraněny za vakua, pevná látka byla rozpuštěna v ethanolu (100 ml) a methylenchloridu (50 ml). Precipitát byl odstraněn filtrací a filtrát byl koncentrován na konečný objem 100 ml. Suspenze byla ochlazena na teplotu 5 °C a pevná látka byla spojena filtrací, promývána studeným ethanolem, poté etherem a sušena za vakua pres noc při teplotě 60 °C, čímž byl získán 6-methoxy-7-(l-methylpiperid-4ylmethoxy)-3,4-dihydrochinazolirt^-on (12,7g, 70%).

MS (ESI): 304 [MHf ‘HNMRspektrum: (DMSOd$) 1,25-1,4 (m, 2H); 1,75 (d, 2H); 1,9 (t, IH); 1,9 (s, 3H); 2,16 (s,

2H); 2,8 (d, 2H); 3,9 (s, 3H); 4,0 (d, 2H); 7,11 (s, 1H); 7,44 (s, 1H); 7,97 (s, 1H)

Roztok 6-methoxy-7-(l-methylpiperid^kyímethoxy)-3,4-dihydrochÍnazolin-4-onu (2,8 g, 9,24 mmol) v thionylchloridu (28 ml) obsahujícím DMF (280 μΐ) byl zahříván při refluxu 85 °C po dobu 1 hodiny. Po ochlazení byly těkavé látky odstraněny odpařením. Precipitát byl triturován etherem, filtrován, promýván etherem a sušen za vakua. Pevná látka byla rozpuštěna v methylenchloridu a byl přidán nasycený roztok hydrogenuhličitanu sodného. Organická vrstva byla separována, promývána vodou, solankou, sušena (MgSO₄) a odpařována, čímž byl získán 4chlor-6-methoxy-7-(l-methylpiperid-4-ylmethoxy)chinazolin (2,9 g, 98%).

MS (ESI): 322 [MH]⁺ so 'HNMRspektrum: (DMSOd«) 1.3-1,5 (m. 2H); 1,75-1,9 (m, 3H); 2,0 (t, IH); 2,25 (s, 3H); 2,85 (d, 2H); 4,02 (s, 3H); 4,12 (d, 2H); 7,41 (s, IH); 7,46(s, IH); 8,9(s, IH)

-21CZ 301689 B6

Nebo 6-methoxy-7-(]-methy lpiperíd-4-ylmethoxy )-3,4-dihydrochinazolín~4-on může být připraven následovně:

Hydrid sodný (1,44 g z 60% suspenze v minerálním oleji, 36 mmol) byl po částech v průběhu

20 minut přidán do roztoku 7-benzyloxy-6-methoxy-3,4-dihydrochinazolÍn-4-onu (8,46 g, mmol), (připravený např. podle způsobu z WO 97/22596, příklad 1), v DMF (70ml) a směs byla míchána po dobu 1,5 hodin. Po částech byl přidáván chlormethylpivalát (5,65 g, 37,5 mmol) a směs byla míchána po dobu 2 hodin při pokojové teplotě, zředěna ethylacetátem (lOOml) a nalita do ledu s vodou (400 ml) a 2N kyseliny chlorovodíkové (4 ml). Organická vrstva byla io separována a vodná vrstva byla extrahována ethylacetátem. Spojené extrakty byly promývány solankou, sušeny (MgSO₄) a rozpouštědlo bylo odstraněno odpařením. Zbytek byl triturován směsí etheru a petroletheru. Pevná látka byla spojena filtrací a sušena za vakua, Čímž byl získán

7-benzyloxy-ó-methoxy-3-((pÍvaloyloxy)methyl)-3,4-dihydrochinazolin-4-on (10 g, 84%).

'H NMR spektrum: (DMSOd,) 1,11 (s, 9H); 3,89 (s, 3H); 5,3 (s, 2H); 5,9 (s, 2H); 7,27 (s, IH); is 7,35 (m, 1H); 7,47 (t, 2H); 7,49 (d, 2H); 7,51 (s, 1H); 8,34 (s, 1H)

Směs 7-benzyloxy-6-methoxy-3-((pÍvaloyloxy)methyl)-3,4-dihydrochinazolin^l·-onu (7 g, 17,7 mmol) a 10% palladium na aktivním uhlí (700 mg) vethylacetátu (250 ml), DMF (50 ml), methanolu (50 ml) a octové kyselině (0,7 ml) byla míchána pod atm. vodíku po dobu 40 minut.

Katalyzátor byl odstraněn filtrací a rozpouštědlo z filtrátu odpařením. Zbytek byl triturován etherem, spojen filtrací a sušen za vakua, čímž byl získán 7-hydroxy-6-methoxy-3-((pivaloyloxy)methyl)-3,4-dihydrochinazolin-4-on (4,36 g, 80%).

'HNMRspektrum: (DMSOd₆) 1,1 (s, 9H); 3,89 (s, 3H); 5,89 (s, 2H); 7,0 (s, IH); 7,48 (s, IH); 8,5(s,lH).

Trifenylfosfin (1,7 g, 6,5 mmol) byl přidán pod atm. dusíku do suspenze 7-hydroxy-~6-methoxy3-(pÍvaloyloxy)methyl-3,4-dihydrochinazolin-4—onu (1,53 g, 5 mmol) v methylenchloridu (20 ml), poté byl přidán l-{/erc-butoxykarbonyiy4-(hydroxymethyl)piperidin (1,29 g, 6 mmol), (připravený podle způsobu pro výchozí látku z příkladu 1), a roztok diethylazodikarboxylátu (1,13 g, 6,5 mmol) v methylenchloridu (5 ml). Po 30 minutovém míchání při pokojové teplotě byla reakční směs nanesena na sloupec silikagelu a eluována systémem ethylacetát/petrolether (1/1, poté 6/5,6/4 a 7/3). Odpařením frakcí obsahujících očekávaný produkt byl získán olej, který po trituraci pentanem krystalizoval. Pevná látka byla spojena filtrací a sušena za vakua, čímž byl získán 7 -(l-ftórc-butoxy karbony l)p iper id—4—yl methoxy )-6-methoxy-3-((p i val oy loxy )methyl}35 3,4-dihydrochinazolin-4-on (232 g, 92%),

MS-ESI: 526 [MNa]⁺ 'HNMRspektrum: (CDC1₃) 1,20 (s, 9H), 1,2-1,35 (m, 2H), 1,43 (s, 9H), 1,87 (d, 2H), 2,05-2,2 (m, IH), 2,75 (t, 2H), 3,96 (d, 2H), 3,97 (s, 3H), 4,1-4,25 (br s, 2H), 5,95 (s, 2H), 7,07 (s, IH), 7,63 (s, IH), 8,17 (s, IH)

Elementární analýza: naměřená C 61,8 H 7,5 N 8,3 C₂₆H₃₇N₃O₇ vypočtená C 62,0 H 7,4 N 8,3%

Roztok 7-( 1 -(/É7r-butoxykarbonyl)piperid-4-ylmethoxy>-6-tnethoxy-3-((pivaloyloxy)methyl)-3,4-dihydrochinazolin-^T-onu (2,32 g, 4,6 mmol) v methylenchloridu (23 ml) obsa45 hujícím TFA (5 ml) byl míchán při pokojové teplotě po dobu 1 hodiny a těkavé látky byly odstraněny za vakua. Zbytek byl rozdělen mezi vrstvu ethylacetátu a hydrogenuhličitanů sodného. Organické rozpouštědlo bylo odstraněno za vakua a zbytek byl filtrován, precipitát byl promýván vodou a sušen za vakua, pevná látka byla azeotropicky destilována 5 toluenem a sušena za vakua, čímž byl získán 6-methoxy-7-(piperid-4-ylmethoxy)-3-((pivaloyloxy)methyl)-3,4-di50 hydrochinazolin-4-on (1,7g, 92%).

MS-ESI: 404 [MH]⁺

22CZ. JU11KJ7 UV 'HNMRspektrum: (DMSOík CF₃COOD) 1,15 (s, 9H), 1,45-1,6 (m, 2H), 1,95 (d, 2H), 2,12,25 (m, IH), 2,95 (t, 2H), 3,35 (d, 2H), 3,95 (s, 3H), 4,1 (d, 2H), 5,95 (s, 2H), 7,23 (s, IH), 7,54 (s, IH), 8,45 (s, IH)

37% Vodný roztok formaldehydu (501 μΐ, 6 mmol), poté kyanoborohydrid sodný (228 mg,

3,6 mmol) byl po částech přidáván do roztoku 6-methoxy-7-(piperÍd-4-ylmethoxy)-3((pivaloyloxy)methyl)~3,4-dihydrochinazolin-4-onu (1,21 g, 3 mmol) ve směsi THF a methanolu (lOml/lOml). Po 30 minutovém míchání při pokojové teplotě byla organická rozpouštědla odstraněna za vakua a zbytek byl rozdělen mezi vrstvu methylenchloridu a vody. Organická io vrstva byla separována, promývána vodou a solankou, sušena (MgSO^ a těkavé látky byly odstraněny odpařením. Zbytek byl triturován etherem a výsledná pevná látka byla spojena filtrací, promývána etherem a sušena za vakua, čímž byl získán 6-methoxy-7-(l-methy lpiperid-4yImethoxy)-3-((pivaloyloxy)methyl)-3,4-dihydrochinazolin-4-on (1,02 g, 82%).

MS-ESI: 418 [MHf *H NMR spektrum: (CDCI₃) 1,19 (s, 9H), 1,4-1,55 (m, 2H), 1,9 (d, 2H), 2,0 (t, 2H), 1,85-2,1 (m, IH), 2,3 (s, 3H), 2,92 (d, 2H), 3,96 (5, 3H), 3,99 (d, 2H), 5,94 (s, 2H), 7,08 (s, IH), 7,63 (s, 1H), 8,17 (s, IH)

Nasycený roztok amoniaku v methanolu (14 ml) byl přidán do roztoku 6-methoxy-7-(l“methyl20 piperid-4-yImethoxy)-3-((pivaloyloxy)methyl)-3,4-dihydrochinazoIin-4-onu (1,38 g,

3,3 mmol) v methanolu (5 ml). Po 20 hodinovém míchání při pokojové teplotě byla suspenze zředěna methylenchloridem (10 ml) a roztok byl filtrován, filtrát byl odpařován za vakua a zbytek byl triturován etherem, spojen filtrací, promýván etherem a sušen za vakua, čímž byl získán 6-methoxy-7-(Imethylpiperid-4-ylmethoxy)-3,4-dÍhydrochinazolin-4-on (914 mg, 83%).

MS - ESI: 304 [MH]⁺ 'H NMR spektrum: (DMSOdé) 1,3-1,45 (m, 2H), 1,75 (d, 2H), 1,7-1,85 (m, IH), 1,9 (t, 2H), 2,2 (s, 3H), 2,8 (d, 2H), 3,9 (s, 3H), 4,0 (d, 2H), 7,13 (s, IH), 7,45 (s, IH), 7,99 (s, IH)

Příklad 3

Dále jsou názorně uvedeny reprezentativní farmaceutické dávkovači formy obsahující sloučeninu podle vynálezu nebo její farmaceuticky přijatelnou sůl (dále Sloučenina) pro terapeutické nebo profylaktické použití u lidských subjektů:

Tableta I	mg/tableta
Sloučenina	100
Laktóza Ph.Eur	182,75
Kroskarmelóza sodná	12,0
Pasta z kukuřičného škrobu (5 obj.% pasty)	2,25
Stearát hořečnatý	3,0
Tableta II	mg/tableta
Sloučenina	50
Laktóza Ph. Eur	223,75
Kroskarmelóza sodná	6,0
Kukuřičný škrob	15,0
Polyvinylpyrrolidon (5 obj. % pasty)	2,25
Stearát hořečnatý 3,0
Tableta III	mg/tableta
Sloučenina	1,0
Laktóza Ph. Eur	93,25

Kroskarmelóza sodná 4,0

Pasta z kukuřičného škrobu (5 obj. % pasty) 0,75 Stearát hořečnatý 1,0 (d) Kapsle mg/kapsle

Sloučenina 10

Laktóza Ph. Eur 488,5

Stearát horečnatý 1,5 io (e) Injekce I (50 mg/ml)

Sloučenina 5,0 obj.%

1M roztok hydroxidu sodného 15 obj.%

0,lM HCl (k upravení pH na 7,6)

Polyethylenglykol 400 4,5 obj.%

Voda na doplnění injekce do 100% (f) Injekce II (10 mg/ml)

Sloučenina 1,0 obj.%

Fosforečnan sodný BP 3,6 obj.%

0,lM roztok hydroxidu sodného 15 obj.%

Voda na doplnění injekce do 100% (g) Injekce III

Sloučenina

Fosforečnan sodný BP Kyselina citrónová Polyethylenglykol 400 Voda na doplnění injekce do 100%

Poznámka (1 mg/ml, pufrovaná na pH 6) 0,1 obj.%

2,26 obj.% 0,38 obj.%

3,5 obj.%

Výše uvedené formulace mohou být připraveny standardními technikami používanými ve farmaceutickém oboru. Tablety (a) - (c) mohou být entericky potaženy standardními prostředky, např. potáhnuty acetát-ftalátem celulózy.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (6)

1. Derivát chinazolinu vybraný ze:

4-(4-brom-2-fluoranilino)-6-methoxy-7-(l-methylpiperid-4-ylmethoxy)chinazolÍnu ajeho solí.

2. Derivát chinazolinu podle nároku 1 ve formě farmaceuticky přijatelné soli.

3. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že zahrnuje jako aktivní složku sloučeninu podle nároku 1 nebo její farmaceuticky přijatelnou sůl podle nároku 2 společně

50 s farmaceuticky přijatelným excipientem nebo nosičem.

4. Použití sloučeniny podle nároku 1 nebo její farmaceuticky přijatelné soli podle nároku 2 při výrobě léčiva pro použití pri tvorbě antiangiogenního a/nebo vaskulámí permeabilitu snižujícího účinku u teplokrevného zvířete, jako je člověk.

-24CZ OU1005 BO

5. Použití sloučeniny podle nároku 1 nebo její farmaceuticky přijatelné soli podle nároku 2 při výrobě léčiva pro použití při tvorbě protinádorového účinku u teplokrevného zvířete Jako je člověk.

6. Použití sloučeniny podle nároku 1 nebo její farmaceuticky přijatelné soli podle nároku 2 pri výrobě léčiva k inhibici účinků vaskulámího endotelového růstového faktoru u teplokrevného zvířete Jako je člověk.