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ES2611788T3 - Proteínas de Fc modificadas que comprenden residuos de aminoácidos no naturales específicos del sitio, conjugados de las mismas, métodos para su preparación y métodos para su uso - Google Patents

Proteínas de Fc modificadas que comprenden residuos de aminoácidos no naturales específicos del sitio, conjugados de las mismas, métodos para su preparación y métodos para su uso Download PDF

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ES2611788T3
ES2611788T3 ES13737046.6T ES13737046T ES2611788T3 ES 2611788 T3 ES2611788 T3 ES 2611788T3 ES 13737046 T ES13737046 T ES 13737046T ES 2611788 T3 ES2611788 T3 ES 2611788T3
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alkylene
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protein
group
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Christopher D. Thanos
Leslie Mcevoy
Gang Yin
Kalyani Penta
Ramesh Baliga
Sunil Bajad
Sonia Pollitt
Chris Murray
Alex STEINER
Avinash GILL
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Original Assignee
Sutro Biopharma Inc
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Abstract

Una proteína de Fc que comprende una cadena polipeptídica que tiene al menos 70% de identidad con la región Fc de la SEQ ID NO: 1 y un residuo de aminoácido no natural en el sitio H404 de acuerdo con el esquema de numeración de la UE, o una variante del mismo modificada después de la traducción.

Description

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Protefnas de Fc modificadas que comprenden residuos de aminoacidos no naturales especfficos del sitio, conjugados de las mismas, metodos para su preparacion y metodos para su uso
Campo tecnico
En la presente invencion se proporcionan protefnas de Fc modificadas que comprenden residuos de aminoacidos no naturales en posiciones especfficas de sitio, composiciones que comprenden las protefnas de Fc modificadas y conjugados de las mismas, metodos para su produccion y metodos para su uso.
Antecedentes
Los anticuerpos o inmunoglobulinas comprenden dos partes funcionalmente independientes, un dominio variable conocido como "Fab", que se une al antfgeno, y un dominio constante conocido como "Fc", que se enlaza a tales funciones efectoras como activacion del complemento y ataque por celulas fagocfticas. Un dominio Fc de inmunoglobulina tiene una semivida en suero larga, mientras que un dominio Fab es de corta vida. Vease, por ejemplo, Capon y colaboradores, 1989, Nature 337: 525-531.
Los dominios Fc de inmunoglobulina y sus fragmentos han encontrado un amplio uso como protefnas portadoras o conjugadas para una variedad de moleculas terapeuticas y de diagnostico. Cuando se construyen junto con, por ejemplo, una protefna o peptido terapeutico, un dominio Fc de inmunoglobulina puede proporcionar una semivida mas larga, o pueden incorporar funciones tales como la union al receptor de Fc, la union a la protefna A, la fijacion del complemento e incluso quizas la transferencia placentaria. Como portador o conjugado, un dominio o fragmento Fc puede ser superior a otros conjugados, por ejemplo, albumina y PEG: un dominio o fragmento Fc proporciona mas estabilidad, semivida mas larga e inmunogenicidad reducida a las moleculas unidas al mismo. Por ejemplo, la union de un farmaco a un dominio Fc puede aumentar la semivida en suero del farmaco y reducir el riesgo de inducir respuestas inmunitarias.
Se han utilizado diversos metodos para unir moleculas terapeuticas y/o de diagnostico a un dominio o fragmento Fc. Por ejemplo, los enfoques convencionales para la conjugacion qufmica con el dominio Fc de inmunoglobulina incluyen el acoplamiento al azar a aminas primarias naturales tal como lisina y el terminal amino o acidos carboxflicos tales como acido glutamico, acido aspartico y el extremo carboxilo. Alternativamente, el acoplamiento especffico del sitio semiselectivo se puede conseguir mediante conjugacion del terminal N en condiciones apropiadas, o carbohidratos sometidos a derivacion como se encuentran en protefnas de Fc aisladas de fuentes eucariotas, o mediante reduccion parcial y acoplamiento de residuos de cistefna nativos. (Por ejemplo, Kim y colaboradores, A pharmaceutical composition comprising an immunoglobulin Fc region as a carrier, WO 2005/047337). Aunque cada uno de estos enfoques se ha aplicado con exito, tfpicamente sufren de diversos grados de heterogeneidad conjugada, rendimientos relativamente bajos y a veces, perdidas significativas en la actividad funcional.
Ademas, se han hecho modificaciones a dominios y/o fragmentos Fc para optimizar su funcion como protefnas portadoras o conjugadas. Por ejemplo, se han logrado numerosas fusiones de protefnas y peptidos ya sea en el terminal amino o carboxi de un dominio Fc y/o fragmento del mismo. Tambien, una variedad de enzimas y moleculas informadoras sinteticas se han conjugado qufmicamente a las cadenas laterales de aminoacidos no terminales asf como a las unidades estructurales de carbohidrato sometidas a derivacion del dominio Fc. Ademas, se han conjugado polfmeros tales como polietilenglicol (PEG) con el dominio Fc con el fin de mejorar la semivida in vivo y reducir la inmunogenicidad.
Sin embargo, existen problemas asociados con conjugados a base de Fc existentes, incluyendo efectos adversos o menos optimos sobre la especificidad, eficacia, rendimiento, solubilidad y actividad de las moleculas terapeuticas o de diagnostico. Existe la necesidad de mejores protefnas portadoras basadas en Fc para mejorar adicionalmente las propiedades de las moleculas terapeuticas o de diagnostico conjugadas con las mismas; en particular, para aumentar adicionalmente su semivida en suero.
Sumario
En la presente memoria se proporcionan protefnas de Fc modificadas, modificadas en una o mas posiciones especfficas del sitio con uno o mas residuos de aminoacidos no naturales. Estas posiciones especfficas del sitio son optimas para la sustitucion de un residuo de aminoacido natural por un residuo de aminoacido no natural. En ciertas realizaciones, la sustitucion en estas posiciones especfficas del sitio produce protefnas de Fc que son uniformes en sustitucion, es decir, que se modifican sustancialmente en la posicion seleccionada. En ciertas realizaciones, una protefna de Fc modificada sustituida en una o mas de estas posiciones especfficas del sitio tiene un rendimiento de produccion ventajoso, una solubilidad ventajosa, una union ventajosa y/o una actividad ventajosa. Las propiedades de estas protefnas de Fc modificadas se describen en detalle en las secciones siguientes.
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En un aspecto, se proporciona aquf una protefna de Fc que comprende una cadena polipeptfdica que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con la region Fc de la SEQ ID NO: 1 y un residuo de aminoacido no natural. La protefna de Fc modificada puede ser un monomero o un dfmero. Dichos dfmeros pueden ser homodfmeros o heterodfmeros. La posicion en la cadena polipeptfdica que puede ser optimamente sustituida es cualquier posicion en la cadena polipeptfdica que puede proporcionar una sustitucion con rendimiento, uniformidad, solubilidad, union y/o actividad optimos. Las secciones a continuacion describen en detalle las posiciones que pueden ser optimamente sustituidas de dichas cadenas polipeptfdicas. Tambien se describen a continuacion protefnas de Fc utiles que contienen aminoacidos no naturales utiles.
En un aspecto adicional, se proporcionan aquf conjugados de las protefnas de Fc con una o mas moleculas de carga util. La molecula de carga util puede ser cualquier molecula que se considere util para conjugarse con una protefna de Fc modificada. En ciertas realizaciones, la molecula de carga util puede ser una molecula terapeutica o una molecula de diagnostico. La molecula de carga util puede estar unida a la protefna de Fc directamente a traves de un enlace covalente o indirectamente a traves de un enlazador. Ventajosamente, en ciertas realizaciones, los aminoacidos no naturales de las protefnas de Fc modificadas proporcionan sitios utiles para unirse al enlazador o a la molecula de carga util. Por consiguiente, se proporcionan aquf conjugados que comprenden una protefna de Fc modificada unida a una unidad estructural de carga util a traves de un aminoacido no natural en un sitio que puede ser sustituido en forma optima de la protefna de Fc.
En otro aspecto, se proporcionan aquf composiciones que comprenden dichas protefnas de Fc modificadas o conjugados de las mismas. Ventajosamente, dichas composiciones pueden tener una alta uniformidad debido a la uniformidad de la sustitucion de las protefnas de Fc modificadas proporcionadas en la presente memoria. En otra realizacion, la composicion comprende una protefna de Fc, en la que dicha composicion es sustancialmente pura. En otra realizacion, la composicion comprende una protefna de Fc, en la que dicha protefna de Fc es al menos 95% en masa de la masa proteica total de dicha composicion. En ciertas realizaciones, las composiciones comprenden una cantidad sustancial de la protefna de Fc modificada o su conjugado cuando se mide por el peso total de protefna o cuando se mide por el peso total de protefna de Fc o conjugado. En ciertas realizaciones, las composiciones comprenden al menos el 80% de la protefna de Fc modificada o su conjugado, al menos el 85% de la protefna o conjugado de Fc, al menos el 90% de la protefna de Fc modificada o su conjugado, o al menos el 95% de la protefna o conjugado de Fc en peso.
La divulgacion se refiere tambien a metodos para elaborar las protefnas de Fc modificadas. Las protefnas de Fc modificadas pueden elaborarse mediante cualquier tecnica evidente para los expertos en la tecnica para incorporar aminoacidos no naturales en posiciones especfficas del sitio de cadenas de protefna de Fc. En ciertas realizaciones, las protefnas de Fc modificadas se elaboran mediante sfntesis en fase solida, semi-sfntesis, traduccion in vivo, traduccion in vitro o traduccion libre de celulas.
La divulgacion tambien se refiere a metodos para elaborar los conjugados de la protefna de Fc modificada (tambien denominados conjugados de protefna de Fc). Los conjugados de protefna de Fc pueden elaborarse mediante cualquier tecnica evidente para los expertos en la tecnica para incorporar aminoacidos no naturales en posiciones especfficas del sitio de cadenas de protefna de Fc y para enlazar las protefnas de Fc con moleculas de carga util. En ciertas realizaciones, las protefnas de Fc modificadas se elaboran mediante sfntesis en fase solida, semi-sfntesis, traduccion in vivo, traduccion in vitro o traduccion libre de celulas.
La divulgacion se refiere tambien a metodos para usar los conjugados de protefna de Fc para terapia. Las protefnas de Fc modificadas dirigidas a un objetivo terapeutico pueden incorporar uno o mas aminoacidos no naturales especfficos del sitio de acuerdo con la descripcion de la presente invencion. Estos conjugados de protefna de Fc pueden usarse para tratar o prevenir una enfermedad o afeccion asociada con el objetivo terapeutico. Ventajosamente, se utiliza un aminoacido no natural especffico del sitio para enlazar la protefna de Fc con una carga util terapeutica para facilitar la eficacia. Se describen aquf ejemplos de conjugados de protefna de Fc, objetivos terapeuticos y enfermedades o afecciones.
La divulgacion tambien se refiere a metodos para usar los conjugados de protefna de Fc para deteccion. Los conjugados de protefna de Fc pueden incorporar uno o mas aminoacidos no naturales especfficos del sitio de acuerdo con la descripcion de la presente invencion. Estas protefnas de Fc modificadas se pueden usar con un marcador para senalar la union al objetivo de deteccion. Ventajosamente, se puede usar un aminoacido no natural especffico del sitio para enlazar la protefna de Fc modificada con un marcador para facilitar la deteccion. Se describen aquf ejemplos de conjugados de protefna de Fc, objetivos de deteccion y marcadores.
La divulgacion se refiere tambien a metodos para modificar la estabilidad de moleculas de carga util. Las protefnas de Fc pueden modificarse con un aminoacido no natural como se describe aquf para facilitar la union a una molecula de carga util, modificando asf la estabilidad de la molecula de carga util. Por ejemplo, una molecula de carga util puede estar unida a una protefna de Fc para incrementar la estabilidad in vivo de la molecula de carga util. Se describen aquf ejemplos de moleculas de carga util y unidades estructurales de enlazamiento.
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Breve descripcion de las figuras
La Fig. 1 proporciona la estructura de un ejemplo de reactivo citotoxico DBCO-MMAF.
La Fig. 2 proporciona un unico perfil de ensayo de cromatograffa de interaccion hidrofoba de un solo pico (HIC).
La Fig. 3 proporciona un perfil de ensayo HIC no bien resuelto (NWR).
La Fig. 4 proporciona un perfil de ensayo HIC bien resuelto (WR).
Las Figs. 5A y 5B representan ejemplos de trazas de dos variantes por HIC (HC T110 y HC S 112), que muestran picos correspondientes a IgG no conjugadas, parcialmente conjugadas y totalmente conjugadas.
Las Figs. 6A - 6E representan los datos comparativos de eficacia de supresion y de rendimiento soluble de anticuerpos que comprenden diferentes aminoacidos no naturales.
Las Figs. 7A y 7B representan los datos comparativos de eficiencia de supresion y de rendimiento soluble de anticuerpos que comprenden diferentes aminoacidos no naturales
La Fig. 8 representa la muerte celular de lfneas celulares positivas para CD-30 por ejemplos de conjugados de anticuerpo-farmaco brentuximab.
La Fig. 9 proporciona los resultados experimentales que demuestran que ejemplos de conjugados de anticuerpo- farmaco brentuximab no matan celulas que no expresan CD-30.
La Fig. 10 representa la union a lfneas celulares positivas para CD-30 por ejemplos de conjugados de anticuerpo- farmaco brentuximab (ADCETRIS®).
Las Figs. 11A, 11B, 11C y 11D proporcionan la estructura de ejemplos de reactivos citotoxicos DBCO-MMAF2, DBCO- DM4, DBCO-DM4 2 y DBCO-MMAE, respectivamente.
La Fig. 12 proporciona una representacion grafica de la farmacocinetica de un ejemplo de conjugado de anticuerpo- farmaco especffico del sitio scFv-Fc.
Las Figs. 13A y 13B muestran una representacion grafica de la eficacia in vivo de ejemplos de conjugados de anticuerpo-farmaco especfficos del sitio para retrasar el crecimiento del tumor y/o para hacer retroceder el tamano del tumor en un modelo animal.
Descripcion de ejemplos de formas de realizacion
En el presente documento se proporcionan protefnas de Fc modificadas que tienen aminoacidos no naturales en una o mas posiciones especfficas del sitio, composiciones que comprenden las protefnas de Fc modificadas y conjugados de las mismas, metodos para elaborar las protefnas de Fc modificadas y sus conjugados, y metodos para su uso.
Definiciones
Cuando se hace referencia a las protefnas de Fc modificadas o a sus conjugados proporcionados en el presente documento, los terminos utilizados tienen los siguientes significados a menos que se indique lo contrario. A menos que se defina de otro modo, todos los terminos tecnicos y cientfficos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que comunmente entiende un experto en la tecnica. En el caso de que haya una pluralidad de definiciones para un termino en este documento, aquellas en esta seccion prevalecen a menos que se indique lo contrario.
Tal como se usa en el presente documento, las formas singulares "un", "uno, una" y "el, la" incluyen la referencia al plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Asf, por ejemplo, la referencia a una "protefna de Fc" es una referencia a una o mas de tales protefnas de Fc, etc.
El termino "sustancialmente puro" con respecto a una composicion que comprende una protefna de Fc modificada se refiere a una composicion que incluye al menos 80, 85, 90 o 95% en peso o, en ciertas realizaciones, 95, 98, 99 o 100% en peso, por ejemplo en peso seco, de la protefna de Fc modificada con relacion a la porcion restante de la composicion. El porcentaje en peso puede ser relativo al peso total de protefna en la composicion o relativo al peso total de protefnas de Fc en la composicion. La pureza puede determinarse mediante tecnicas evidentes para los expertos en la tecnica, por ejemplo SDS-PAGE.
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El termino "aislado" se refiere a una protefna de Fc, una protefna de Fc modificada o un conjugado de la misma que esta sustancial o esencialmente libre de componentes que normalmente acompanan o interaccionan con el anticuerpo tal como se encuentra en su entorno natural o en su entorno de produccion, o ambos. Las preparaciones de anticuerpos aislados tienen menos de aproximadamente 30%, menos de aproximadamente 25%, menos de aproximadamente 20%, menos de aproximadamente 15%, menos de aproximadamente 10%, menos de aproximadamente 5%, menos de aproximadamente 4%, menos de aproximadamente 3%, menos de aproximadamente 2% o menos de aproximadamente 1% de protefna contaminante en peso, por ejemplo en peso seco.
El termino "anticuerpo" se refiere a cualquier macromolecula que sea reconocida como un anticuerpo por los expertos en la tecnica. Los anticuerpos comparten propiedades comunes que incluyen union y al menos una cadena polipeptfdica que es sustancialmente identica a una cadena polipeptfdica que puede ser codificada por cualquiera de los genes de inmunoglobulina reconocidos por los expertos en la tecnica. Los genes de la inmunoglobulina incluyen, pero no se limitan a, los genes de la region constante k, A, a, y (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4), 6, £ y p, asf como los genes de la region variable de inmunoglobulina. El termino incluye anticuerpos de longitud completa y fragmentos de anticuerpo reconocidos por los expertos en la tecnica, y variantes de los mismos. El termino incluye ademas anticuerpos glicosilados y no glicosilados.
El termino "fragmento de anticuerpo" se refiere a cualquier forma de un anticuerpo distinto de la forma de longitud completa. Los fragmentos de anticuerpo de la presente invencion incluyen anticuerpos que son componentes mas pequenos que existen dentro de anticuerpos de longitud completa, y anticuerpos que han sido modificados. Los fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, Fv, Fc, Fab y (Fab')2, Fv de cadena sencilla (scFv), diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, anticuerpos hfbridos bifuncionales, CDRi, CDR2, CDR3, combinaciones de CDR, regiones variables , regiones marco, regiones constantes y similares (Maynard y Georgiou, 2000, Annu Rev. Biomed, Eng. 2: 339 -76, Hudson, 1998, Curr. Opin. Biotechnol., 9: 395 - 402).
El termino "inmunoglobulina (Ig)" se refiere a una protefna que consiste en uno o mas polipeptidos sustancialmente codificados por uno de los genes de la inmunoglobulina, o una protefna sustancialmente identica a la misma en la secuencia de aminoacidos. Las inmunoglobulinas incluyen pero no se limitan a anticuerpos. Las inmunoglobulinas pueden tener una cantidad de formas estructurales, incluyendo, pero sin limitarse a, anticuerpos de longitud completa, fragmentos de anticuerpos y dominios individuales de inmunoglobulina incluyendo, pero sin limitarse a, Vh, Cy1, Cy2, Cy3, Vl y Cl.
El termino "dominio de inmunoglobulina (Ig)" se refiere a un dominio de protefna que consiste en un polipeptido sustancialmente codificado por un gen de inmunoglobulina. Los dominios de Ig incluyen pero no se limitan a Vh, Cy1, Cy2, Cy3, V L y CL.
El termino "region variable" de un anticuerpo se refiere a un polipeptido o polipeptidos compuestos del dominio Vh de inmunoglobulina, los dominios Vl de inmunoglobulina o los dominios Vh y Vl de inmunoglobulina. La region variable puede referirse a este o estos polipeptidos aisladamente, como un fragmento Fv, como un fragmento scFv, como esta region en el contexto de un fragmento de anticuerpo mas grande, o como esta region en el contexto de un anticuerpo de longitud completa o una alternativa, molecula de andamio no anticuerpo.
El termino "variable" se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren ampliamente en secuencia entre anticuerpos y son responsables por la especificidad de union de cada anticuerpo particular para su antfgeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente a traves de los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en tres segmentos denominados regiones determinadoras de complementariedad (CDR) tanto en los dominios variables de cadena ligera como de cadena pesada. Las porciones mas conservadas de los dominios variables se denominan regiones marco (FR). Los dominios variables de cadenas pesada y ligera nativas comprenden cada uno cuatro regiones FR, que adoptan en gran medida una configuracion de lamina p, conectadas por tres o cuatro CDR, que forman bucles que conectan y, en algunos casos, forman parte de la estructura de la lamina p. Las CDR en cada cadena se mantienen unidas en estrecha proximidad por las regiones FR y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formacion del sitio de union al antfgeno de los anticuerpos (vease Kabat y colaboradores, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ta Ed. Servicio de Salud Publica, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, Md. (1991)).
Los dominios constantes no estan tfpicamente involucrados directamente en la union de un anticuerpo a un antfgeno, sino que presentan diversas funciones efectoras. Dependiendo de la secuencia de aminoacidos de la region constante de sus cadenas pesadas, se pueden asignar anticuerpos o inmunoglobulinas a diferentes clases. Existen cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas pueden dividirse ademas en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4; IgA1 e IgA2. Las regiones constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan a, 6, £, y y p, respectivamente. De este modo, la protefna de Fc de cualquiera de las reivindicaciones precedentes en la que dicha cadena polipeptfdica es una cadena pesada de un tipo seleccionado del grupo que consiste en a, 6, £ y p. De las diversas clases de inmunoglobulinas humanas, solo se sabe que las IgG1, IgG2, IgG3 e IgM humanas activan el complemento.
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El termino "protefna de Fc" se refiere a cualquier macromolecula que serfa reconocida como una protefna de Fc por los expertos en la tecnica. Una protefna de Fc corresponde generalmente a la region Fc (region cristalizable del fragmento) de un anticuerpo, como es conocido por los expertos en la tecnica. Las protefnas de Fc comparten propiedades comunes incluyendo la union a uno o mas receptores Fc. Las protefnas de Fc correspondientes a anticuerpos IgG, IgG e IgD comprenden dominios correspondientes a los dominios Ch2 y Ch3 de estos anticuerpos. Las protefnas de Fc correspondientes a anticuerpos IgM e IgE comprenden dominios correspondientes a los dominios Ch2, Ch3 y Ch4 de estos anticuerpos. En ciertas realizaciones, las protefnas de Fc estan glicosiladas. En ciertas realizaciones, las protefnas de Fc son dfmeros. En ciertas realizaciones, las protefnas de Fc son homodfmeros. En ciertas realizaciones, las protefnas de Fc son heterodfmeros. En ciertas realizaciones, los dfmeros estan unidos mediante un enlace disulfuro. En ciertas realizaciones, los dfmeros estan unidos por un aminoacido o un puente peptfdico. En ciertas realizaciones, las protefnas de Fc no comprenden un dominio variable. En ciertas realizaciones, las protefnas de Fc no comprenden una cadena ligera. En ciertas realizaciones, las protefnas de Fc no comprenden un dominio variable o una cadena ligera.
El termino "conjugado" se refiere a cualquier unidad estructural que puede estar conectada a una protefna de Fc modificada. En algunas realizaciones, los terminos "conjugado" y "carga util" se usan indistintamente. Un conjugado puede ser una molecula pequena o una macromolecula. En algunas realizaciones, el conjugado es una molecula bioactiva que incluye, pero no se limita a, una protefna, un peptido, un activo nucleico o un hfbrido del mismo. En algunas realizaciones, un conjugado es un polfmero tal como polietilenglicol. En algunas realizaciones, un conjugado es un agente terapeutico, que incluye un farmaco comercialmente disponible. En algunas realizaciones, un conjugado es un marcador que puede reconocer y unirse a objetivos especfficos, tales como una carga util molecular que es perjudicial para las celulas objetivo o un marcador util para la deteccion o el diagnostico. En algunas realizaciones, el conjugado esta conectado a una protefna de Fc a traves de un enlazador. En algunas realizaciones, el conjugado esta directamente conectado a una protefna de Fc sin un enlazador. En una realizacion, el conjugado de protefna de Fc comprende una protefna de Fc ligada a uno o mas farmacos o polfmeros. En otra realizacion, el conjugado de protefna de Fc comprende una protefna de Fc ligada a una o mas unidades estructurales marcadoras. En otra realizacion, el conjugado de protefna de Fc comprende una protefna de Fc ligada a uno o mas dominios de union de cadena sencilla (scFv). En una realizacion adicional, la protefna de Fc esta unida a uno o mas unidades estructurales terapeuticas o unidades estructurales de marcacion a traves de uno o mas enlazadores.
El termino "secuencia de protefna variante" se refiere a una secuencia de protefna que tiene uno o mas residuos que difieren en la identidad de aminoacidos de otra secuencia de protefna similar. Dicha secuencia similar de protefna puede ser la secuencia de protefna de tipo natural, u otra variante de la secuencia de tipo silvestre. Las variantes incluyen protefnas que tienen una o mas inserciones, supresiones o sustituciones de aminoacidos. Las variantes tambien incluyen protefnas que tienen uno o mas aminoacidos modificados despues de la traduccion.
El termino "anticuerpo progenitor" se refiere a un anticuerpo conocido por los expertos en la tecnica que se modifica de acuerdo con la descripcion proporcionada en la presente memoria. La modificacion puede ser ffsica, es decir, el reemplazo o modificacion qufmica o bioqufmicamente de uno o mas aminoacidos del anticuerpo progenitor para producir un anticuerpo dentro del alcance de la presente descripcion. La modificacion tambien puede ser conceptual, es decir, usar la secuencia de una o mas cadenas polipeptfdicas del anticuerpo progenitor para disenar un anticuerpo que comprende uno o mas aminoacidos no naturales especfficos del sitio de acuerdo con la presente descripcion. Los anticuerpos progenitores pueden ser anticuerpos de origen natural o anticuerpos disenados o desarrollados en un laboratorio. Los anticuerpos progenitores tambien pueden ser anticuerpos artificiales o modificados geneticamente, por ejemplo, anticuerpos quimericos o humanizados.
El termino "variante modificada conservativamente" se refiere a una protefna de Fc que difiere de una protefna de Fc relacionada mediante sustituciones conservadoras en la secuencia de aminoacidos. Un experto reconocera que las sustituciones, supresiones o adiciones individuales a una secuencia de peptido, polipeptido o protefna que altera, anade o elimina un solo aminoacido o un pequeno porcentaje de aminoacidos en la secuencia codificada es una "variante modificada conservativamente" donde la alteracion da lugar a la sustitucion de un aminoacido por un aminoacido qufmicamente similar. Las tablas de sustitucion conservadora que proporcionan aminoacidos funcionalmente similares son bien conocidas en la tecnica. Tales variantes modificadas en forma conservadora son ademas y no excluyen variantes polimorficas, homologas entre especies y alelos de la invencion.
Los siguientes ocho grupos contienen cada uno aminoacidos que son sustituciones conservadoras entre sf:
1) Alanina (A), Glicina (G);
2) Acido aspartico (D), Acido glutamico (E);
3) Asparagina (N), Glutamina (Q);
4) Arginina (R), Lisina (K), Histidina (H);
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5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V);
6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W);
7) Serina (S), Treonina (T); y
8) Cistefna (C), Metionina (M)
(vease, por ejemplo, Creighton, Protefnas: Structures and Molecular Properties (WH Freeman & Co., 2a edicion (diciembre de 1993).
Los terminos "identica" o "identidad", en el contexto de dos o mas secuencias de polipeptidos, se refieren a dos o mas secuencias o subsecuencias que son las mismas. Las secuencias son "sustancialmente identicas" si tienen un porcentaje de residuos de aminoacidos o nucleotidos que son iguales (es decir, aproximadamente 60% de identidad, opcionalmente alrededor de 65%, aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, o aproximadamente 95% de identidad sobre una region especificada), cuando se comparan y alinean para correspondencia maxima sobre una ventana de comparacion, o region designada medida usando uno de los siguientes algoritmos de comparacion de secuencias o por alineacion manual e inspeccion visual. La identidad puede existir sobre una region que tiene al menos aproximadamente 50 aminoacidos o nucleotidos de longitud, o sobre una region que es de 75-100 aminoacidos o nucleotidos de longitud, o, cuando no se especifica, a lo largo de toda la secuencia o un polipeptido. En el caso de anticuerpos, la identidad se puede medir fuera de las CDR variables. La alineacion optima de las secuencias para la comparacion se puede llevar a cabo, incluyendo, pero sin limitarse a, mediante el algoritmo de homologfa local de Smith y Waterman (1970) Adv. Appl. Mates. 2: 482c, por el algoritmo de alineacion de homologfa de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443, mediante la busqueda del metodo de similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85: 2444, mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Paquete de Software de Genetica de Wisconsin, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wisconsin); o mediante alineacion manual e inspeccion visual (vease, por ejemplo, Ausubel y colaboradores, Current Protocols in Molecular Biology (suplemento de 1995)).
Ejemplos de algoritmos que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y similitud de secuencia incluyen los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul y colaboradores (1977) Nucl. Acids Res. 25: 3389 - 3402, y Altschul y colaboradores (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 - 410, respectivamente. El software para realizar el analisis BLAST esta disponible publicamente a traves del National Center for Biotechnology Information. Los parametros del algoritmo BLAST, W, T y X, determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineacion. El programa BLASTN (para secuencias de nucleotidos) utiliza por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4 y una comparacion de ambas cadenas. Para las secuencias de aminoacidos, el programa BLASTP utiliza por defecto una longitud de palabra de 3, y la expectativa (E) de 10, y la alineacion de matriz de puntuacion de BLOSUM62 (vease Henikoff y Henikoff (1989) Proc. Nat. Ac. Sci. USA 89: 10915) (B) de 50, expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4, y una comparacion de ambas cadenas. El algoritmo BLAST es normalmente realizado con el filtro de "baja complejidad" desactivado. En algunas realizaciones, el algoritmo BLAST se realiza tfpicamente con el filtro de "baja complejidad" activado.
El algoritmo BLAST tambien realiza un analisis estadfstico de la similitud entre dos secuencias (vease, por ejemplo, Karlin y Altschul (1993) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma mas pequena (P(N)), que proporciona una indicacion de la probabilidad de que una coincidencia entre dos nucleotidos o secuencias de aminoacidos se produzca por casualidad. Por ejemplo, un acido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma mas pequena en una comparacion del acido nucleico de prueba con el acido nucleico de referencia es menor que aproximadamente 0,2, mas preferiblemente menor que aproximadamente 0,01 y lo mas preferiblemente menor que aproximadamente 0,001.
El termino "aminoacido" se refiere a aminoacidos de origen natural y de origen no natural, asf como aminoacidos tales como prolina, analogos de aminoacidos y mimeticos de aminoacidos que funcionan de una manera similar a los aminoacidos naturales.
Los aminoacidos naturalmente codificados son los aminoacidos proteinogenicos conocidos por los expertos en la tecnica. Incluyen los 20 aminoacidos comunes (alanina, arginina, asparagina, acido aspartico, cistefna, glutamina, acido glutamico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina y valina ) y los menos comunes pirrolisina y selenocistefna. Los aminoacidos naturalmente codificados incluyen variantes postraduccionales de los 22 aminoacidos naturales tales como aminoacidos prenilados, aminoacidos isoprenilados, aminoacidos miristoilados, aminoacidos palmitoilados, aminoacidos glicosilados enlazados a N, aminoacidos glicosilados enlazados a O, aminoacidos fosforilados y aminoacidos acilados.
El termino "aminoacido no natural" se refiere a un aminoacido que no es un aminoacido proteinogenico, o una variante
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postraduccionalmente modificada del mismo. En particular, el termino se refiere a un aminoacido que no es uno de los 20 aminoacidos comunes o pirrolisina o selenocistefna, o variantes postraduccionalmente modificadas de los mismos.
Una "protefna del factor de liberacion funcional 1 (RF1)" se refiere a RF1 que retiene actividad igual o sustancialmente similar a la protefna del RF1 de tipo silvestre o no modificada. La actividad funcional de RF1 se puede probar, por ejemplo, midiendo la tasa de crecimiento de bacterias que expresan la protefna RF1 modificada, y comparando la tasa de crecimiento a bacterias que expresan RF1 de tipo silvestre o no modificada. La actividad funcional RF1 tambien se puede probar, por ejemplo, mediante la capacidad de la protefna del RF1 modificada para reducir la incorporacion ortogonal de ARNt de una nnAA en una posicion especificada en un ARNm que codifica una protefna objetivo, aumentando de este modo la cantidad de terminacion prematura de la cadena (es decir, aumentando la cantidad de protefna truncada).
Una "protefna atenuada del factor de liberacion 1 (RF1)" se refiere a una protefna modificada del RF1 que retiene una actividad reducida con respecto a la protefna del RF1 de tipo silvestre o no modificada. La actividad de RF1 se puede probar, por ejemplo, midiendo la tasa de crecimiento de bacterias que expresan la protefna modificada del RF1, y comparando la tasa de crecimiento con bacterias que expresan la protefna de tipo silvestre o no modificada del RF1. La actividad de RF1 tambien se puede probar, por ejemplo, mediante la capacidad de la protefna modificada del RF1 para reducir la incorporacion ortogonal de ARNt de una nnAA en una posicion especificada en un ARNm que codifica una protefna objetivo, aumentando de ese modo la cantidad de terminacion prematura de la cadena (es decir, el aumento de la cantidad de protefna truncada). En algunas realizaciones, la protefna atenuada del RF1 comprende modificaciones transcripcionales; por ejemplo, se puede reducir el nivel de expresion de la protefna del RF1 (tipo silvestre o modificada) para lograr la atenuacion. La reduccion tambien puede lograrse mediante el uso de tecnologfas de ARNi. En algunas realizaciones, la protefna atenuada del RF1 comprende modificaciones de la traduccion; por ejemplo, la cantidad de la protefna sintetizada del RF1 (tipo silvestre o modificada) puede reducirse para conseguir atenuacion, por ejemplo, aumentando la velocidad a la que la protefna es digerida por la proteasa mediante la insercion de una secuencia especffica de proteasa en la secuencia del RF1.
Protefnas de Fc
Se proporcionan protefnas de Fc modificadas que comprenden uno o mas residuos de aminoacidos no naturales en posiciones especfficas del sitio en la secuencia de aminoacidos de al menos una cadena polipeptfdica.
La protefna de Fc modificada puede compartir identidad de secuencia alta con cualquier protefna de Fc reconocida por los expertos en la tecnica, es decir, una protefna de Fc parental. En algunas realizaciones, una protefna de Fc parental es un fragmento Fc de una inmunoglobulina que puede aislarse de un sujeto. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos de la protefna de Fc es identica a la secuencia de aminoacidos de la protefna de Fc parental, distinta de los aminoacidos no naturales en la posicion especffica del sitio. En otras realizaciones, la protefna de Fc modificada proporcionada aquf puede tener una o mas inserciones, supresiones o mutaciones en relacion con la protefna de Fc parental ademas de uno o mas aminoacidos no naturales en las posiciones especfficas del sitio. En ciertas realizaciones, la protefna de Fc modificada proporcionada aquf puede tener una secuencia primaria unica, siempre que sea reconocida como una protefna de Fc por los expertos en la tecnica.
En ciertas realizaciones, la protefna de Fc que comprende uno o mas residuos de aminoacidos no naturales en posiciones especfficas del sitio tiene una identidad de secuencia alta con cualquier protefna de Fc parental descrita en la presente memoria o conocida por los expertos en la tecnica. En ciertas realizaciones, la protefna de Fc es sustancialmente identica a una protefna de Fc parental descrita en la presente memoria. En ciertas realizaciones, la protefna de Fc tiene aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, o aproximadamente 95% de identidad con una protefna de Fc parental. En ciertas realizaciones, la protefna de Fc comprende una cadena polipeptfdica que tiene al menos 80% o 90% de identidad con la region Fc de la SEQ ID NO: 1 y que tiene un residuo de aminoacido no natural en el sitio 407 del polipeptido representativo de cadena pesada de acuerdo con la SEQ ID NO: 1, o una variante postraduccionalmente modificada del mismo. En ciertas realizaciones, la protefna de Fc tiene mas de aproximadamente 75%, mas de aproximadamente 80%, mas de aproximadamente 85%, mas de aproximadamente 90%, o mas de aproximadamente 95% de identidad con una protefna de Fc parental. Las protefnas de Fc son sustancialmente identicas si al menos una cadena polipeptfdica de la protefna de Fc tiene identidad de secuencia con una cadena de protefna de Fc correspondiente de otra protefna de Fc. En ciertas realizaciones, la protefna de Fc que comprende uno o mas residuos de aminoacidos no naturales en posiciones especfficas del sitio tiene al menos una cadena polipeptfdica que tiene mas de aproximadamente 70%, mas de aproximadamente 75%, mas de aproximadamente 80%, mas de aproximadamente 85%, mas de aproximadamente 90%, o mas de aproximadamente 95% de identidad con cualquiera de las SEQ ID NO: 1 y 4-6 sobre al menos un dominio, al menos dos dominios o al menos tres dominios. En ciertas realizaciones, el porcentaje de identidad esta sobre al menos una cadena. En ciertas realizaciones, el porcentaje de identidad esta sobre al menos dos cadenas.
En algunas realizaciones y en forma similar a una protefna de Fc parental, la protefna de Fc modificada puede ser un monomero o un dfmero. En ciertas realizaciones, la protefna de Fc modificada es un dfmero que comprende polipeptidos que corresponden a uno o mas dominios constantes de un anticuerpo. En algunas realizaciones, las
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protefnas de Fc correspondientes a anticuerpos IgG, IgG e IgD comprenden dominios correspondientes a los dominios Ch2 y Ch3 de estos anticuerpos. En algunas realizaciones, las protefnas de Fc correspondientes a anticuerpos IgM e IgE comprenden dominios correspondientes a los dominios Ch2, Ch3 y Ch4 de estos anticuerpos. Cada cadena polipeptfdica puede estar unida a la otra cadena polipeptfdica por uno o mas enlaces disulfuro covalentes. Cada cadena polipeptfdica puede tener tambien uno o mas enlaces disulfuro dentro de la cadena. En ciertas realizaciones, las protefnas de Fc estan glicosiladas. En algunas realizaciones, la secuencia enlazadora incluye un unico aminoacido. En otras realizaciones, la secuencia enlazadora incluye un peptido. En algunas realizaciones, las secuencias peptfdicas enlazadoras pueden ser secuencias enlazadoras aleatorias que ofrecen flexibilidades estructurales. En algunas realizaciones, las secuencias peptfdicas enlazadoras pueden seleccionarse con base en las estructuras de las cadenas peptfdicas individuales, por ejemplo, buscando bibliotecas de estructuras de protefnas o de peptidos. En ciertas realizaciones, se selecciona una secuencia peptfdica enlazadora para unir mejor las estructuras de cadenas peptfdicas individuales del dfmero o multfmero. En algunas realizaciones, se pueden incorporar aminoacidos no naturales en la secuencia enlazadora. En algunas realizaciones, el enlazador puede incluir no aminoacidos tales como alcanos, lfpidos o moleculas de grasa.
Como es sabido por los expertos en la tecnica, las protefnas de Fc tfpicamente tienen afinidad de union por los receptores de Fc in vivo.
Las protefnas de Fc modificadas proporcionadas en la presente memoria pueden tener secuencias que son similares o identicas a las de cualquier forma de protefna de Fc conocida por los expertos en la tecnica. Pueden ser de longitud completa, o fragmentos. Los ejemplos de protefnas de Fc de longitud completa corresponden a los dominios Fc de IgA, IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 o IgM.
Las protefnas de Fc modificadas proporcionadas en el presente documento comprenden al menos un aminoacido no natural. El aminoacido no natural puede ser cualquier aminoacido no natural conocido por los expertos en la tecnica. Los ejemplos de aminoacidos no naturales se describen en las secciones siguientes.
Los aminoacidos no naturales se situan en posiciones seleccionadas en una cadena polipeptfdica de la protefna de Fc parental. Estos lugares se identificaron por proporcionar sitios optimos para la sustitucion con los aminoacidos no naturales. Cada sitio es capaz de portar un aminoacido no natural con estructura, funcion y/o metodos optimos para producir la protefna de Fc modificada.
En ciertas realizaciones, una posicion especffica del sitio para la sustitucion proporciona una protefna de Fc modificada que es mas estable en comparacion con una protefna de Fc sin el aminoacido no natural especffico del sitio. La estabilidad se puede medir por cualquier tecnica evidente para los expertos en la tecnica.
En ciertas realizaciones, una posicion especffica del sitio para sustitucion proporciona una protefna de Fc modificada que tiene propiedades funcionales optimas en comparacion con una protefna de Fc sin el aminoacido no natural especffico del sitio. Por ejemplo, la protefna de Fc modificada puede mostrar poca o ninguna perdida de afinidad de union para el receptor de Fc en comparacion con una protefna de Fc sin el aminoacido no natural especffico del sitio. En ciertas realizaciones, la protefna de Fc modificada puede mostrar una union mejorada en comparacion con una protefna de Fc sin el aminoacido no natural especffico del sitio.
En ciertas realizaciones, una posicion especffica del sitio para sustitucion proporciona una protefna de Fc modificada que se puede hacer ventajosamente. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, la protefna de Fc modificada muestra propiedades ventajosas en sus metodos de sfntesis en comparacion con una protefna de Fc sin el aminoacido no natural especffico del sitio, que se discute a continuacion. En ciertas realizaciones, la protefna de Fc modificada puede mostrar poca o ninguna perdida en el rendimiento en la produccion en comparacion con una protefna de Fc sin el aminoacido no natural especffico del sitio. En ciertas realizaciones, la protefna de Fc modificada puede mostrar un rendimiento mejorado en la produccion en comparacion con una protefna de Fc sin el aminoacido no natural especffico del sitio. En ciertas realizaciones, la protefna de Fc modificada puede mostrar poca o ninguna perdida de la supresion del ARNt, descrita mas adelante, en comparacion con una protefna de Fc sin el aminoacido no natural especffico del sitio. En ciertas realizaciones, la protefna de Fc modificada puede mostrar una supresion mejorada de ARNt, descrita a continuacion, en produccion en comparacion con una protefna de Fc sin el aminoacido no natural especffico del sitio.
En ciertas realizaciones, una posicion especffica del sitio para sustitucion proporciona una protefna de Fc modificada que tiene solubilidad ventajosa en comparacion con una protefna de Fc sin el aminoacido no natural especffico del sitio. En ciertas realizaciones, la protefna de Fc modificada puede mostrar poca o ninguna perdida en solubilidad en comparacion con una protefna de Fc sin el aminoacido no natural especffico del sitio. En ciertas realizaciones, la protefna de Fc modificada puede mostrar una solubilidad mejorada en comparacion con una protefna de Fc sin el aminoacido no natural especffico del sitio.
En ciertas realizaciones, una posicion especffica del sitio para sustitucion proporciona una protefna de Fc modificada que tiene una expresion ventajosa en comparacion con una protefna de Fc sin el aminoacido no natural especffico del
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sitio. En ciertas realizaciones, la protefna de Fc modificada puede mostrar poca o ninguna perdida de expresion en comparacion con una protefna de Fc sin el aminoacido no natural especffico del sitio. En ciertas realizaciones, la protefna de Fc modificada puede mostrar una expresion mejorada en comparacion con una protefna de Fc sin el aminoacido no natural especffico del sitio.
En ciertas realizaciones, una posicion especffica del sitio para sustitucion proporciona una protefna de Fc modificada que tiene un plegado ventajoso en comparacion con una protefna de Fc sin el aminoacido no natural especffico del sitio. En ciertas realizaciones, la protefna de Fc modificada puede mostrar poca o ninguna perdida de plegamiento apropiado en comparacion con una protefna de Fc sin el aminoacido no natural especffico del sitio. En ciertas realizaciones, la protefna de Fc modificada puede mostrar plegamiento mejorado en comparacion con una protefna de Fc sin el aminoacido no natural especffico del sitio.
En ciertas realizaciones, una posicion especffica del sitio para sustitucion proporciona una protefna de Fc modificada que es capaz de conjugacion ventajosa en comparacion con una protefna de Fc sin el aminoacido no natural especffico del sitio. Como se describe a continuacion, varios aminoacidos no naturales tienen cadenas laterales o grupos funcionales que facilitan la conjugacion de la protefna de Fc modificada a un segundo agente, ya sea directamente o a traves de un enlazador. En ciertas realizaciones, la protefna de Fc modificada puede mostrar una eficacia de conjugacion mejorada en comparacion con una protefna de Fc sin el mismo u otros aminoacidos no naturales en otras posiciones. En ciertas realizaciones, la protefna de Fc modificada puede mostrar un rendimiento de conjugacion mejorado en comparacion con una protefna de Fc sin el mismo u otros aminoacidos no naturales en otras posiciones. En ciertas realizaciones, la protefna de Fc modificada puede mostrar una especificidad de conjugacion mejorada en comparacion con una protefna de Fc sin el mismo u otros aminoacidos no naturales en otras posiciones.
Los uno o mas aminoacidos no naturales estan localizados en posiciones seleccionadas especfficas del sitio en al menos una cadena polipeptfdica de la protefna de Fc modificada. Si la protefna de Fc modificada es un dfmero o multfmero, al menos un aminoacido no natural puede estar en cualquiera de los polipeptidos del dfmero. Ademas, al menos un aminoacido no natural puede estar en cualquier dominio de un polipeptido de una protefna de Fc. Por supuesto, una protefna de Fc modificada puede comprender una pluralidad de aminoacidos no naturales en posiciones especfficas del sitio, en cualquier dominio y/o en cualquier polipeptido.
En ciertas realizaciones, las protefnas de Fc modificadas proporcionadas en la presente invencion comprenden un aminoacido no natural en una posicion especffica del sitio. En ciertas realizaciones, las protefnas de Fc modificadas proporcionadas en la presente invencion comprenden dos aminoacidos no naturales en posiciones especfficas del sitio. En ciertas realizaciones, las protefnas de Fc modificadas proporcionadas aquf comprenden tres aminoacidos no naturales en posiciones especfficas del sitio. En ciertas realizaciones, las protefnas de Fc modificadas proporcionadas en la presente invencion comprenden mas de tres aminoacidos no naturales en posiciones especfficas del sitio.
Las posiciones especfficas del sitio para la sustitucion se pueden describir de acuerdo con cualquier sistema de nomenclatura de protefnas de Fc conocido por los expertos en la tecnica. En el sistema de numeracion de Kabat, estas posiciones se encuentran en los residuos de la cadena pesada H238, H239, H241, H243, H246, H267, H268, H269, H2O2, H271, H272, H274, H275, H278, H280, H281 , H282, H283, H286, H289, H292, H293, H294, H295, H296, H297, H298, H299, H300, H301, H303, H305, H317, H320, H324, H326, H327, H329, H330, H332, H333 , H334, H335, H337,

H339, H340, H342, H344, H355, H356, H358, H353, H360, H375, H383, H384, H386, H389, H392, H398, H404, H420,
H421, H436 y H438. En otras palabras, se proporcionan protefnas de Fc modificadas que comprenden uno o mas aminoacidos no naturales en una o mas posiciones seleccionadas entre las unidades estructurales de Kabat H238, H239, H241, H243, H246, H262, H264, H265, H267, H268, H269, H2O2, H271, H272, H274, H275, H278, H280, H281,

H282, H283, H286, H289, H292, H293, H294, H295, H296, H297, H298, H299, H300, H301, H303, H305, H317, H320,

H324, H326, H327, H329, H330, H332, H333, H334, H335, H337, H339, H340, H342, H344, H355, H356, H358, H359,

H360, H375, H383, H384, H386, H389, H392, H398, H404, H420, H421, H436 y H438.
En ciertas realizaciones, se proporcionan en la presente memoria protefnas de Fc modificadas que comprenden uno o mas aminoacidos no naturales en una o mas posiciones seleccionadas entre los residuos de Kabat H239, H241, H246, H267, H268, H269, H270, H271, H272, H274 H2O, H2O, H2O, H2O, H2O, H2O, H2O2, H282, H289, H292, H293, H294, H295, H296, H297, H298, H299, H305, H317, H320, H324, H326, H327, H329 , H330, H332, H333, H334, H335,
H337, H339, H340, H342, H344, H355, H359, H375, H386, H389, H392, H398, H404, H420, H421 y H438.
En ciertas realizaciones, se proporcionan en la presente memoria protefnas de Fc modificadas que comprenden uno o mas aminoacidos no naturales en una o mas posiciones seleccionadas entre los residuos de Kabat H239, H293, H334, H355, H359 y H389.
En ciertas realizaciones, se proporcionan en la presente memoria protefnas de Fc modificadas que comprenden uno o mas aminoacidos no naturales en una o mas posiciones seleccionadas entre los residuos de Kabat H241, H246, H267, H268, H269, H270, H271, H272, H274, H275 H2O3, H2O2, H292, H2O2, H292, H292, H292, H294, H295, H296, H297,
H298, H299, H300, H301, H303, H305, H317, H320, H324, H326, H327, H329, H330, H332 , H333, H335, H337, H339,
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H342, H344, H355, H375, H386, H392, H398, H420, H421, H340, H404 y H438.
En ciertas realizaciones, proporcionadas en el presente documento, se incluyen protefnas de Fc modificadas que comprenden uno o mas aminoacidos no naturales en una o mas posiciones seleccionadas entre los residuos de Kabat H238, H243, H262, H264, H265, H278, H342, H356, H358, H360 , H383, H384, H404 y H436.
En ciertas realizaciones, se proporcionan aquf protefnas de Fc modificadas que comprenden uno o mas aminoacidos no naturales en una o mas posiciones seleccionadas de residuos de Kabat correspondientes a H292-H301, H303 y H305.
En el sistema de numeracion de Chothia, estas posiciones se encuentran en los residuos de la cadena pesada H238, H239, H241, H243, H246, H262, H264, H265, H267, H268, H269, H270, H271, H272, H274, H275, H278, H230, H281,

H282, H283, H286, H289, H292, H293, H294, H295, H296, H297, H298, H299, H300, H301, H303, H305, H317, H320,

H324, H326, H327, H329, H330, H332, H333, H334, H335, H337, H339, H340, H342, H344, H355, H356, H358, H359,
H360, H375, H383, H384, H386, H389, H392, H398, H404, H420, H421, H436, y H438. En otras palabras, se proporcionan en la presente memoria protefnas de Fc modificadas que comprenden uno o mas aminoacidos no naturales en una o mas posiciones seleccionadas entre los residuos de Chothia H238, H239, H241, H243, H246, H262,

H264, H265, H267, H268, H269, H2O2, H271, H272, H274, H275, H278, H280, H281, H282, H283, H286, H289, H292,

H293, H294, H295, H296, H297, H298, H299, H300, H301, H303, H305, H317, H320, H324, H326, H327, H329, H330,

H332, H333, H334, H335, H337, H339, H340, H342, H344, H355, H356, H358, H359, H360, H375, H383, H384, H386,
H389, H392, H398, H404, H420, H421, H436 y H438.
En ciertas realizaciones, proporcionadas en la presente memoria, se incluyen protefnas de Fc modificadas que comprenden uno o mas aminoacidos no naturales en una o mas posiciones seleccionadas entre los residuos de Chothia H239, H241, H246, H267, H268, H269, H270, H271, H272, H274 H2O, H2O, H2O, H2O, H2O, H2O, H2O, H2O, H2O2, H282, H289, H292, H293, H294, H295, H296, H297, H298, H299, H305, H317, H320, H324, H326, H327, H329 , H330, H332, H333, H334, H335, H337, H339, H340, H342, H344, H355, H359, H375, H386, H389, H392, H398, H404, H420, H421 y H438.
En ciertas realizaciones, se proporcionan aquf protefnas de Fc modificadas que comprenden uno o mas aminoacidos no naturales en una o mas posiciones seleccionadas entre los residuos de Chothia H239, H293, H334, H342, H355, H359 y H389.
En ciertas realizaciones, se proporcionan aquf protefnas de Fc modificadas que comprenden uno o mas aminoacidos no naturales en una o mas posiciones seleccionadas de residuos de Kabat correspondientes a H292-H301, H303 y H305.
En ciertas realizaciones, se proporcionan aquf protefnas de Fc modificadas que comprenden uno o mas aminoacidos no naturales en una o mas posiciones seleccionadas entre los residuos de Chothia H241, H246, H267, H268, H269, H270,
H271, H272, H274, H275 H2O3, H2O2, H292, H2O2, H292, H292, H292, H294, H295, H296, H297, H298, H299, H300,
H301, H303, H305, H317, H320, H324, H326, H327, H329, H330, H332 , H333, H335, H337, H339, H342, H344, H355,
H375, H386, H389, H392, H398, H404, H420, H421, H340 y H438.
En ciertas realizaciones, se proporcionan aquf protefnas de Fc modificadas que comprenden uno o mas aminoacidos no naturales en una o mas posiciones seleccionadas entre los residuos de Chothia H238, H243, H262, H264, H265, H278, H342, H356, H358, H360, H383, H384, H389, H404 y H436.
Las posiciones especfficas del sitio tambien pueden identificarse en relacion con las secuencias de aminoacidos de las cadenas polipeptfdicas de una protefna de Fc de referencia. Por ejemplo, la secuencia de aminoacidos de una cadena pesada de referencia se proporciona en la SEQ ID NO: 1. En el ejemplo de cadena pesada de referencia, las posiciones especfficas del sitio estan en los residuos 241, 242, 244, 246, 249, 265, 267, 268, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 277, 278, 281, 283,284, 285, 286, 289, 292, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 306, 308, 320, 323, 327, 329,
330, 332, 333, 335 337, 338, 340, 342, 343, 345, 347, 358, 359, 361, 362, 363, 378, 386, 387, 389, 392, 395, 401, 407,
423, 424, 439 y 441. En otras palabras, se proporcionan protefnas de Fc que comprenden uno o mas aminoacidos no naturales en una o mas posiciones seleccionadas entre las correspondientes a los residuos 241, 242, 244, 246, 249, 265, 267, 268, 270, 271, 273, 277, 278, 281, 283, 284, 285, 286, 289, 292, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303,
304, 306, 308, 320, 323, 327, 329, 330, 332, 333, 335, 336, 337, 338, 340, 342, 343, 345, 347, 358, 359, 361, 362, 363,
378, 386, 387, 389, 392, 395, 401, 407, 423, 424, 439 y 441 del polipeptido representativo de cadena pesada de acuerdo con la SEQ ID NO: 1.
En ciertas realizaciones, se proporcionan aquf protefnas de Fc modificadas que comprenden uno o mas aminoacidos no naturales en una o mas posiciones seleccionadas entre las correspondientes a los residuos 242, 244, 249, 270, 271,
272, 273, 274, 275,277, 278, 283, 284, 285, 286, 289, 292, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 306, 308,
320, 323, 327, 329, 330, 332, 333, 335, 336, 337, 338, 340, 342, 343, 345, 347, 358, 362, 378, 389, 392, 395, 401, 407,
423, 424 y 441 del polipeptido representativo de cadena pesada de acuerdo con la SEQ ID NO: 1.
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En ciertas realizaciones, se proporcionan aquf protefnas de Fc modificadas que comprenden uno o mas aminoacidos no naturales en una o mas posiciones seleccionadas entre las correspondientes a los residuos 242, 296, 337, 345, 358, 362 y 392 del polipeptido representativo de cadena pesada de acuerdo con la SEQ ID NO: 1.
En ciertas realizaciones, se proporcionan aquf protefnas modificadas Fc que comprenden uno o mas aminoacidos no naturales en una o mas posiciones seleccionadas entre las correspondientes a los residuos 244, 249, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 277,278, 283, 284, 285, 286, 289, 292, 295, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 306, 308, 320, 323, 327, 329, 330, 332, 333 , 335, 336, 338, 340, 342, 343, 345, 347, 358, 378, 389, 395, 401, 407, 423, 424 y 441 del polipeptido representativo de cadena pesada de acuerdo con la SEQ ID NO: 1.
En ciertas realizaciones, se proporcionan aquf protefnas de Fc modificadas que comprenden uno o mas aminoacidos no naturales en una o mas posiciones seleccionadas entre las correspondientes a los residuos 241, 246, 265, 267, 268, 281, 345, 359, 361 , 363, 386, 387, 407 y 439 del polipeptido representativo de cadena pesada de acuerdo con la SEQ ID NO: 1.
En ciertas realizaciones, se proporcionan aquf protefnas de Fc modificadas que comprenden uno o mas aminoacidos no naturales en una o mas posiciones seleccionadas entre las correspondientes a 242, 244, 270, 273, 274, 275, 285, 289,
295, 296, 299, 300, 301, 332, 333, 337, 338, 343, 345, 358, 362, 389, 407, 423, 424 y 441 del polipeptido representativo de cadena pesada de acuerdo con la SEQ ID NO: 1.
En ciertas realizaciones, se proporcionan aquf protefnas de Fc modificadas que comprenden uno o mas aminoacidos no naturales en una o mas posiciones seleccionadas entre las correspondientes a los residuos 292-301, 303 y 305 del polipeptido representativo de cadena pesada de acuerdo con la SEQ ID NO: 1.
En ciertas realizaciones, se proporcionan protefnas de Fc modificadas que comprenden uno o mas aminoacidos no naturales en una o mas posiciones seleccionadas entre las correspondientes a 222, 285, 292, 299, 333, 338, 364, 403,
407, 425, 443, 263, 270, 271, 275, 277, 295, 296, 300, 301, 306, 308, 335, 336, 337, 343, 344, 345, 346, 358, 365, 389,
395, 407, 427, 441, 445 y 446 del polipeptido representativo de cadena pesada de acuerdo con la SEQ ID NO: 1.
En ciertas realizaciones, se proporcionan aquf protefnas de Fc modificadas que comprenden uno o mas aminoacidos no naturales en una o mas posiciones seleccionadas entre las correspondientes a 222, 285, 299, 338, 364, 425, 443, 270,
275, 277, 295, 296, 300, 301, 306, 308, 337, 343, 344, 345, 346, 358, 365, 395, 407, 427, 441, 445 y 446 del polipeptido
representativo de cadena pesada de acuerdo con la SEQ ID NO: 1.
En ciertas realizaciones, se proporcionan aquf protefnas de Fc modificadas que comprenden uno o mas aminoacidos no naturales en una o mas posiciones seleccionadas entre las correspondientes a 222, 285, 299, 364, 425, 443, 270, 275,
296, 300, 301, 306, 308, 337, 343, 344, 345, 358, 365, 395, 407, 427, 441, 445 y 446 del polipeptido representativo de cadena pesada de acuerdo con la SEQ ID NO: 1.
En ciertas realizaciones, se proporcionan aquf protefnas de Fc modificadas que comprenden uno o mas aminoacidos no naturales en una o mas posiciones seleccionadas entre las correspondientes a 222, 285, 299, 425, 443, 270, 275, 296, 300, 301, 306, 308, 337, 343, 344, 345, 358, 395, 407, 427, 441, 445 y 446 del polipeptido representativo de cadena pesada de acuerdo con la SEQ ID NO: 1.
En ciertas realizaciones, se proporcionan aquf protefnas de Fc modificadas que comprenden uno o mas aminoacidos no naturales en una o mas posiciones seleccionadas entre las correspondientes a 222, 285, 299, 270, 296, 300, 301, 306, 308, 337, 343, 344, 395, 407 y 441 del polipeptido representativo de cadena pesada de acuerdo con la SEQ ID NO: 1.
En ciertas realizaciones, se proporcionan aquf protefnas de Fc modificadas que comprenden uno o mas aminoacidos no naturales en una o mas posiciones seleccionadas entre las correspondientes a 224, 225, 228, 230, 233, 234, 235 y 239 del polipeptido representativo de cadena pesada de acuerdo con la SEQ ID NO: 1.
En ciertas realizaciones, se proporcionan en la presente memoria protefnas de Fc modificadas que comprenden uno o mas aminoacidos no naturales en una o mas posiciones seleccionadas entre las correspondientes a 224, 225, 228, 230, 233, 234, 235 y 239 del polipeptido representativo de cadena pesada de acuerdo con la SEQ ID NO: 1.
En ciertas realizaciones, proporcionadas en la presente memoria, se incluyen protefnas de Fc modificadas que comprenden uno o mas aminoacidos no naturales en una o mas posiciones seleccionadas entre las correspondientes a 230, 233, 234, 235 y 239 del polipeptido representativo de cadena pesada de acuerdo con la SEQ ID NO: 1.
En ciertas realizaciones, se proporcionan aquf protefnas de Fc modificadas que comprenden uno o mas aminoacidos no naturales en una o mas posiciones seleccionadas entre las correspondientes a 224 y 225 del polipeptido representativo de cadena pesada de acuerdo con la SEQ ID NO: 1.
En ciertas realizaciones, la protefna de Fc modificada comprende una cadena polipeptfdica que se puede describir mediante la siguiente formula (I):
Xaa1-...-(Naap(i))n-...-Xaaq (I)
En la Formula (I), cada Xaa representa un aminoacido en la cadena polipeptfdica de cualquier identidad. En otras 5 palabras, cada Xaa puede ser cualquier aminoacido, tfpicamente cualquier aminoacido natural, o una variante del mismo. El exponente a la derecha de cada Xaa representa la posicion del aminoacido dentro de la secuencia primaria de la cadena polipeptfdica. Xaa1 representa el primer aminoacido o del extremo terminal N en la cadena polipeptfdica, y Xaaq representa el ultimo, o aminoacido del extremo terminal C en la cadena polipeptfdica. La variable q es un numero entero que es igual al numero total de aminoacidos en la cadena polipeptfdica. Cada Naa representa un aminoacido no 10 natural dentro de la cadena polipeptfdica. Los aminoacidos no naturales utiles se describen en las secciones siguientes. El numero entero n representa el numero de aminoacidos no naturales en la cadena polipeptfdica. En las realizaciones tfpicas, n es un entero mayor que 1. Cada entero p(i) es mayor que 1 e inferior a q, y la variable i es un numero entero que varfa de 1 a n. Cada entero p(i) representa una localizacion especffica del sitio en la secuencia de aminoacidos para el Naa correspondiente. Cada ubicacion especffica del sitio p(i) es optima para la sustitucion de un aminoacido 15 natural con un aminoacido no natural, tal como Naap(i), de acuerdo con las tecnicas descritas aquf.
El analisis de los datos del cribado de TAG tal como se presentan en los Ejemplos permitio la seleccion de sitios que son candidatos ideales para preparar conjugados de protefna de Fc con base en la muerte de celulas, niveles de expresion, relacion de farmaco a anticuerpo, accesibilidad al disolvente y (cuando se encuentre disponible) la estabilidad termica. Los sitios mas preferidos tienen menor accesibilidad al disolvente y mayor termoestabilidad que las 20 otras variantes ensayadas. Los sitios preferidos para la incorporacion de nnAA se enumeran en la Tabla I, a continuacion.
Tabla I: Sitios preferidos para la incorporacion de nnAA
Sitio de nnAA
Preferencia
HC-F404
El mas preferido
HC-F241
El mas preferido
HC-K222
Mas preferido
Por consiguiente, en ciertas realizaciones, proporcionadas en la presente invencion, se incluyen anticuerpos que 25 comprenden uno o mas aminoacidos no naturales en una o mas posiciones seleccionadas del grupo que consiste en residuos de cadena pesada o de cadena ligera HC-F404, HC-F241 y HC-K222 de acuerdo con el esquema de numeracion de Kabat o Chothia, o una variante postraduccionalmente modificada del mismo.
En ciertas realizaciones, se proporcionan aquf anticuerpos que comprenden uno o mas aminoacidos no naturales en
una o mas posiciones seleccionadas del grupo que consiste en residuos de cadena pesada o cadena ligera ----de
30 acuerdo con el esquema de numeracion de Kabat o Chothia, o una variante postraduccionalmente modificada de los mismos.
En ciertas realizaciones, se proporcionan aquf anticuerpos que comprenden uno o mas aminoacidos no naturales en
una o mas posiciones seleccionadas del grupo que consiste en residuos de cadena pesada o cadena ligera -----de
acuerdo con la numeracion de Kabat o Chothia, o una variante postraduccionalmente modificada de los mismos.
35 En algunas realizaciones, las protefnas de Fc modificadas proporcionadas en la presente memoria pueden modificarse adicionalmente de manera conservadora usando metodos conocidos en la tecnica. Las variantes modificadas en forma conservadora de una protefna de Fc incluyen una o mas inserciones, supresiones o sustituciones que no alteran la estructura y/o la funcion de la protefna de Fc cuando son evaluadas por un experto en la tecnica. En ciertas realizaciones, las variantes modificadas en forma conservadora incluyen 20 o menos inserciones, supresiones o 40 sustituciones de aminoacidos. En ciertas realizaciones, las variantes modificadas en forma conservadora incluyen 15 o menos inserciones, supresiones o sustituciones de aminoacidos. En ciertas realizaciones, las variantes modificadas en forma conservadora incluyen 10 o menos inserciones, supresiones o sustituciones de aminoacidos. En ciertas realizaciones, las variantes modificadas en forma conservadora incluyen 9 o menos inserciones, supresiones o sustituciones de aminoacidos. En ciertas realizaciones, las variantes modificadas en forma conservadora incluyen 8 o 45 menos inserciones, supresiones o sustituciones de aminoacidos. En ciertas realizaciones, las variantes modificadas en forma conservadora incluyen 7 o menos inserciones, supresiones o sustituciones de aminoacidos. En ciertas
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realizaciones, las variantes modificadas en forma conservadora incluyen 6 o menos inserciones, supresiones o sustituciones de aminoacidos. En ciertas realizaciones, las variantes modificadas en forma conservadora incluyen 5 o menos inserciones, supresiones o sustituciones de aminoacidos. En ciertas realizaciones, las variantes modificadas en forma conservadora incluyen 4 o menos inserciones, supresiones o sustituciones de aminoacidos. En ciertas realizaciones, las variantes modificadas en forma conservadora incluyen 3 o menos inserciones, supresiones o sustituciones de aminoacidos. En ciertas realizaciones, las variantes modificadas en forma conservadora incluyen 2 o menos inserciones, supresiones o sustituciones de aminoacidos. En ciertas realizaciones, las variantes modificadas en forma conservadora incluyen 1 insercion, delecion o sustitucion de aminoacidos. En realizaciones particulares, las sustituciones son conservadoras, sustituyendo un aminoacido dentro de la misma clase, como se ha descrito anteriormente.
En ciertas realizaciones, las protefnas de Fc modificadas pueden modificarse adicionalmente para modular la estructura, la estabilidad y/o la actividad. En tales realizaciones, las modificaciones pueden ser conservadoras o distintas de las conservadoras. Las modificaciones solo necesitan ser adecuadas para el medico que lleva a cabo los metodos y utilizando las composiciones descritas en la presente memoria. En ciertas realizaciones, las modificaciones disminuyen pero no eliminan la afinidad de union al antfgeno. En ciertas realizaciones, las modificaciones aumentan la afinidad de union al antfgeno. En ciertas realizaciones, las modificaciones mejoran la estructura o la estabilidad de la protefna de Fc. En ciertas realizaciones, las modificaciones reducen pero no eliminan la estructura o la estabilidad de la protefna de Fc. En ciertas realizaciones, las variantes modificadas incluyen 20 o menos inserciones, supresiones o sustituciones de aminoacidos. En ciertas realizaciones, las variantes modificadas incluyen 15 o menos inserciones, supresiones o sustituciones de aminoacidos. En ciertas realizaciones, las variantes modificadas incluyen 10 o menos inserciones, supresiones o sustituciones de aminoacidos. En ciertas realizaciones, las variantes modificadas incluyen 9 o menos inserciones, supresiones o sustituciones de aminoacidos. En ciertas realizaciones, las variantes modificadas incluyen 8 o menos inserciones, supresiones o sustituciones de aminoacidos. En ciertas realizaciones, las variantes modificadas incluyen 7 o menos inserciones, supresiones o sustituciones de aminoacidos. En ciertas realizaciones, las variantes modificadas incluyen 6 o menos inserciones, supresiones o sustituciones de aminoacidos. En ciertas realizaciones, las variantes modificadas incluyen 5 o menos inserciones, supresiones o sustituciones de aminoacidos. En ciertas realizaciones, las variantes modificadas incluyen 4 o menos inserciones, supresiones o sustituciones de aminoacidos. En ciertas realizaciones, las variantes modificadas incluyen 3 o menos inserciones, supresiones o sustituciones de aminoacidos. En ciertas realizaciones, las variantes modificadas incluyen 2 o menos inserciones, supresiones o sustituciones de aminoacidos. En ciertas realizaciones, las variantes modificadas incluyen 1 insercion, delecion o sustitucion de aminoacidos.
Tambien dentro del alcance de la invencion estan variantes postraduccionalmente modificadas de protefnas de Fc modificadas. Cualquiera de las protefnas de Fc modificadas proporcionadas en la presente memoria pueden ser modificadas despues de la traduccion de cualquier manera reconocida por los expertos en la tecnica. Las modificaciones tfpicas postraduccionales para las protefnas de Fc incluyen el enlace disulfuro entre cadenas, el enlace disulfuro dentro de la cadena, la glicosilacion y proteolisis enlazada a N. Tambien se proporcionan aquf otras protefnas de Fc postraduccionalmente modificadas que tienen modificaciones tales como fosforilacion, glicosilacion enlazada a O, metilacion, acetilacion, lipidacion, anclaje a GPI, miristoilacion y prenilacion. La modificacion postraduccional puede producirse durante la produccion, in vivo, in vitro o de otro modo. En ciertas realizaciones, la modificacion postraduccional puede ser una modificacion intencional por parte de un medico, por ejemplo, utilizando los metodos proporcionados en la presente memoria.
Tambien se incluyen dentro del alcance protefnas de Fc modificadas fusionadas a peptidos o polipeptidos adicionales. Ejemplos de fusiones incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, una protefna de Fc de metionilo en la que una metionina esta unida al extremo terminal N de la protefna de Fc resultante de la expresion recombinante, fusiones con el proposito de purificacion (incluyendo pero sin limitarse a, A poli-histidina o epftopos de afinidad), fusiones con el fin de unirse a otras moleculas biologicamente activas, fusiones con peptidos de union a la albumina de suero y fusiones con protefnas de suero tales como albumina de suero. Las protefnas de Fc modificadas pueden comprender secuencias de escision de proteasas, grupos reactivos, dominios de union a protefnas de Fc (incluyendo, pero sin limitarse a, FLAG o poli-His) u otras secuencias basadas en afinidad (incluyendo pero sin limitarse a, FLAG, poli-His, GST, etc.). Las protefnas de Fc modificadas tambien pueden comprender moleculas enlazadas (incluyendo, pero no limitadas a, biotina) que mejoran la deteccion (incluyendo, pero sin limitarse a, GFP), purificacion u otras caracterfsticas de la protefna de Fc modificada. En ciertas realizaciones, las protefnas de Fc modificadas comprenden una secuencia de afinidad del extremo terminal C que facilita la purificacion de protefnas de Fc de longitud completa. En ciertas realizaciones, dicha secuencia de afinidad del extremo terminal C es una secuencia poli-His, por ejemplo, una secuencia 6-His.
La protefna de Fc modificada puede tener cualquier forma de protefna de Fc reconocida por los expertos en la tecnica. La protefna de Fc puede comprender una unica cadena polipeptfdica. La protefna de Fc modificada tambien puede estar en forma de un multfmero que sera reconocida por los expertos en la tecnica incluyendo homodfmeros, heterodfmeros, homomultfmeros y heteromultfmeros. Estos multfmeros pueden estar enlazados o no enlazados. Los enlaces utiles incluyen enlaces disulfuro entre cadenas tfpicos para dominios Fc modificados. Los multfmeros tambien pueden estar enlazados por otros aminoacidos, incluyendo los aminoacidos no naturales introducidos de acuerdo con la presente descripcion. La protefna de Fc modificada puede estar basada en una inmunoglobulina progenitora tal como de
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cualquier clase o subclase incluyendo IgA, IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 e IgM. En algunas realizaciones, las cadenas peptidicas individuales de un dfmero o multfmero de protema de Fc modificada pueden unirse mediante una secuencia enlazadora para formar una unica cadena peptidica. En algunas realizaciones, la secuencia enlazadora incluye un unico aminoacido. En otras realizaciones, la secuencia enlazadora incluye un peptido. En algunas realizaciones, las secuencias peptidicas enlazadoras pueden ser secuencias enlazadoras aleatorias que ofrecen flexibilidades estructurales. En algunas realizaciones, las secuencias peptfdicas enlazadoras pueden seleccionarse con base en las estructuras de las cadenas peptidicas individuales, por ejemplo, buscando bibliotecas de estructuras de protemas o peptidos. Se selecciona una secuencia de peptido enlazador para unirse mejor a las estructuras de cadenas peptfdicas individuales del dfmero o multfmero. En algunas realizaciones, se pueden incorporar tambien aminoacidos no naturales en la secuencia enlazadora. En algunas realizaciones, el enlazador puede incluir no aminoacidos tales como alcanos, lfpidos o moleculas de grasa. En algunas realizaciones, una unica cadena peptfdica que porta la secuencia enlazadora puede sintetizarse usando metodos sinteticos. En algunas realizaciones, una secuencia de nucleotidos que codifica la unica cadena peptfdica puede expresarse en un sistema de expresion heterologo para producir el dfmero o multfmero deseado.
La protema de Fc modificada puede ademas estar glicosilada o no glicosilada. Por consiguiente, en ciertas realizaciones, la protema de Fc modificada esta glicosilada. En ciertas realizaciones, la protema de Fc modificada es no glicosilada. Las protemas de Fc no glicosiladas que comprenden un aminoacido no natural pueden ser elaboradas, por ejemplo, como se describe en los Ejemplos proporcionados en la presente memoria o mediante sistemas de expresion bacterianos conocidos por los expertos en la tecnica. Las protemas de Fc glicosiladas que comprenden un aminoacido no natural pueden prepararse, por ejemplo, como se describe por parte de Axup y colaboradores, 2012, Proc. Nat. Acad. Sci. EE.UU. 109 (40): 16101 - 16106.
Tambien se proporcionan aqrn protemas modificadas de Fc que estan conjugadas con una o mas unidades estructurales de conjugacion. La unidad estructural de conjugacion puede ser cualquier unidad estructural de conjugacion considerada util por un experto en la tecnica. Por ejemplo, la unidad estructural de conjugacion puede ser un polfmero, tal como polietilenglicol, que puede mejorar la estabilidad de la protema de Fc modificada in vitro o in vivo. La unidad estructural de conjugacion puede tener actividad terapeutica, produciendo de este modo un conjugado de protema de Fc-farmaco. La unidad estructural de conjugacion puede ser una carga util molecular que es perjudicial para las celulas objetivo. La unidad estructural de conjugacion puede ser un marcador util para deteccion o diagnostico. En ciertas realizaciones, la unidad estructural de conjugacion esta unida a la protema de Fc modificada a traves de un enlace covalente directo. En ciertas realizaciones, la unidad estructural de conjugacion esta unida a la protema de Fc modificada a traves de un enlazador. En realizaciones ventajosas, la unidad estructural de conjugacion o el enlazador se unen a traves de uno de los aminoacidos no naturales de la protema de Fc modificada. Los ejemplos de fragmentos de conjugacion y los enlazadores se discuten en las secciones siguientes.
Aminoacidos no naturales
El aminoacido no natural puede ser cualquier aminoacido no natural conocido por los expertos en la tecnica. En algunas realizaciones, el aminoacido no codificado naturalmente comprende un grupo funcional. El grupo funcional puede ser cualquier grupo funcional conocido por los expertos en la tecnica. En ciertas realizaciones, el grupo funcional es un marcador, un grupo polar, un grupo no polar o un grupo reactivo.
Los grupos reactivos son particularmente ventajosos para enlazar otros grupos funcionales con la protema de Fc en la posicion espedfica del sitio de la cadena de protema de Fc. En ciertas realizaciones, el grupo reactivo se selecciona del grupo que consiste en amino, carboxi, acetilo, hidrazino, hidrazido, semicarbazido, sulfanilo, azido y alquinilo. De este modo, en una realizacion, dicho residuo de aminoacido no natural comprende una unidad estructural seleccionada del grupo que consiste en amino, carboxi, acetilo, hidrazino, hidrazido, semicarbazido, sulfanilo, azido y alquinilo.
En ciertas realizaciones, el residuo de aminoacido no natural esta de acuerdo con cualquiera de las siguientes formulas:
imagen1
H O f H O or H O
en donde cada L es independientemente un enlazador divalente; y cada R es independientemente un grupo funcional.
Los expertos en la tecnica reconoceran que las protemas de Fc estan generalmente compuestas de L-aminoacidos. Sin embargo, con aminoacidos no naturales, las presentes composiciones proporcionan al medico la capacidad de usar aminoacidos no naturales L, Do racemicos en las posiciones espedficas del sitio. En ciertas realizaciones, los aminoacidos no naturales descritos en la presente memoria incluyen versiones D de los aminoacidos naturales y
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versiones racemicas de los aminoacidos naturales.
En las formulas anteriores, las lineas onduladas indican enlaces que se conectan al resto de las cadenas polipeptfdicas de las protefnas de Fc. Estos aminoacidos no naturales pueden incorporarse en las cadenas polipeptfdicas de la misma manera que los aminoacidos naturales se incorporan en las mismas cadenas polipeptfdicas. En ciertas realizaciones, los aminoacidos no naturales se incorporan en la cadena polipeptfdica a traves de enlaces amida como se indica en las formulas.
En las formulas anteriores R designa cualquier grupo funcional sin limitacion, siempre que el residuo de aminoacido no sea identico a un residuo de aminoacido natural. En ciertas realizaciones, R puede ser un grupo hidrofobo, un grupo hidrofilo, un grupo polar, un grupo acido, un grupo basico, un grupo quelante, un grupo reactivo, una unidad estructural terapeutica o una unidad estructural marcadora. En ciertas realizaciones, R es un grupo reactivo seleccionado del grupo que consiste en amino, carboxi, acetilo, hidrazino, hidrazido, semicarbazido, sulfanilo, azido y alquinilo. En otra realizacion, cada L es un enlazador divalente seleccionado del grupo que consiste en un enlace, alquileno, alquileno sustituido, heteroalquileno, heteroalquileno sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno y heteroarileno sustituido.
A 9 O A J 9 A 0 1
En ciertas realizaciones, R se selecciona del grupo que consiste en R NR R , R C(=O)R , R C(=O)OR , R N3, R1=C(=CH). En estas realizaciones, R1 se selecciona del grupo que consiste en un enlace, alquileno, heteroalquileno, arileno, heteroarileno. R2 y R3 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en hidrogeno, alquilo y heteroalquilo.
En algunas realizaciones, los aminoacidos no codificados naturalmente incluyen grupos funcionales de cadena lateral que reaccionan eficientemente y selectivamente con grupos funcionales no encontrados en los 20 aminoacidos comunes (incluyendo, pero sin limitarse a, grupos azido, cetona, aldehfdo y aminooxi) para formar conjugados estables. Por ejemplo, el polipeptido de union al antfgeno que incluye un aminoacido no codificado naturalmente que contiene un grupo funcional azido puede hacerse reaccionar con un polfmero (incluyendo pero no limitado a, poli(etilenglicol) o, alternativamente, un segundo polipeptido que contiene una unidad estructural alquino para formar un conjugado estable resultante de la reaccion selectiva de la azida y los grupos funcionales alquino para formar un producto de cicloadicion de Huisgen [3+2].
Ejemplos de aminoacidos no codificados naturalmente que pueden ser adecuados para uso en la presente invencion y que son utiles para reacciones con polfmeros solubles en agua incluyen, pero no se limitan a, aquellos con carbonilo, aminooxi, hidracina, hidrazida, semicarbazida, azida y alquino. En algunas realizaciones, los aminoacidos no codificados naturalmente comprenden una unidad estructural sacarido. Ejemplos de tales aminoacidos incluyen N-acetil- L-glucosaminil-L-serina, N-acetil-L-galactosaminil-L-serina, N-acetil-L-glucosaminil-L-treonina, N-acetil-L-glucosaminil-L- asparagina y O-manosaminil-L-serina. Ejemplos de tales aminoacidos tambien incluyen ejemplos en los que el enlace N u O de origen natural entre el aminoacido y el sacarido se reemplaza por un enlace covalente que no se encuentra comunmente en la naturaleza, incluyendo, pero sin limitarse a, un alqueno, una oxima, un tioeter, una amida y similares. Ejemplos de tales aminoacidos incluyen tambien sacaridos que no se encuentran comunmente en protefnas naturales tales como 2-desoxi-glucosa, 2-desoxigalactosa y similares.
Muchos de los aminoacidos no codificados naturalmente proporcionados en la presente invencion estan comercialmente disponibles, por ejemplo, a traves de Sigma-Aldrich (St. Louis, Mo., EE.UU.), Novabiochem (una division de EMD Biosciences, Darmstadt, Alemania), o Peptech (Burlington, Massachusetts, EE.UU.). Aquellos que no estan comercialmente disponibles son opcionalmente sintetizados como se ensena en la presente memoria o usando metodos estandar conocidos por los expertos en la tecnica. Para tecnicas de sfntesis organica, vease, por ejemplo, Organic Chemistry de Fessendon y Fessendon, (1982, Segunda Edicion, Willard Grant Press, Boston Massachusetts); Advanced Organic Chemistry de March (tercera edicion, 1985, Wiley and Sons, Nueva York); y Advanced Organic Chemistry por Carey y Sundberg (Tercera Edicion, Partes A y B, 1990, Plenum Press, Nueva York). Vease, asimismo, las publicaciones de las solicitudes de patente estadounidenses Nos. 2003/0082575 y 2003/0108885. Ademas de los aminoacidos no naturales que contienen cadenas laterales novedosas, los aminoacidos no naturales que pueden ser adecuados para su uso en la presente invencion tambien comprenden opcionalmente estructuras de cadena principal modificadas, incluyendo, pero sin limitarse a ellas, como se ilustra en las estructuras de Formula II y III:
R
Z^C-YH
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X
R R'
V
h2n co2h
en la que Z comprende tfpicamente OH, NH2, SH, NH-R', o S-R'; X y Y, que pueden ser iguales o diferentes, comprenden tfpicamente S u O, y R y R', que son opcionalmente iguales o diferentes, se seleccionan tfpicamente de la misma lista de constituyentes para el grupo R descrito anteriormente para los aminoacidos no naturales que tienen la
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Formula I asf como hidrogeno. Por ejemplo, los aminoacidos no naturales de la invencion comprenden opcionalmente sustituciones en el grupo amino o carboxilo como se ilustra por las Formulas II y III. Los aminoacidos no naturales de este tipo incluyen, pero no se limitan a, a-hidroxiacidos, a-tioacidos, a-aminotiocarboxilatos, incluyendo pero sin limitarse a, cadenas laterales que corresponden a los veinte aminoacidos naturales comunes o cadenas laterales no naturales. Ademas, las sustituciones en el carbono a incluyen opcionalmente, pero no se limitan a, aminoacidos L, D o a-a- disustituidos tales como D-glutamato, D-alanina, D-metil-O-tirosina, acido aminobutfrico, y similares. Otras alternativas estructurales incluyen aminoacidos cfclicos, tales como analogos de prolina, asf como analogos de prolina de anillo de 3, 4, 6, 7, 8 y 9 miembros, aminoacidos P e y tales como p-alanina sustituida y acido Y-amino butfrico.
Muchos aminoacidos no naturales se basan en aminoacidos naturales, tales como tirosina, glutamina, fenilalanina y similares, y son adecuados para uso en la presente invencion. Los analogos de tirosina incluyen, pero no se limitan a, tirosinas para-sustituidas, tirosinas orto-sustituidas y tirosinas meta-sustituidas, donde la tirosina sustituida comprende, incluyendo, pero sin limitarse a, un grupo ceto (incluyendo pero no limitado a un grupo acetilo), un grupo benzoilo, un grupo amino, una hidracina, una hidroxiamina, un grupo tiol, un grupo carboxi, un grupo isopropilo, un grupo metilo, un hidrocarburo de cadena recta de 6 a 20 atomos de carbono o ramificado, un hidrocarburo saturado o insaturado, un grupo O-metilo, un grupo polieter, un grupo nitro, un grupo alquinilo o similares. Ademas, tambien se contemplan anillos arilo sustituidos en forma multiple. Los analogos de glutamina que pueden ser adecuados para su uso en la presente invencion incluyen, pero no se limitan a, derivados de a-hidroxi, derivados sustituidos en y, derivados dclicos y derivados de glutamina sustituidos con amida. Ejemplos de analogos de fenilalanina que pueden ser adecuados para uso en la presente invencion incluyen, pero no se limitan a, fenilalaninas para-sustituidas, fenilalaninas orto-sustituidas y fenilalaninas meta-sustituidas, en donde el sustituyente comprende, incluyendo, pero no limitado a, un grupo metoxi, un grupo metilo, un grupo alilo, un aldehfdo, un azido, un yodo, un bromo, un grupo ceto (incluyendo, pero sin limitarse a, un grupo acetilo), un grupo benzoilo, un grupo alquinilo o similares. Ejemplos especfficos de aminoacidos no naturales que pueden ser adecuados para uso en la presente invencion incluyen, pero no se limitan a, una p-acetil-L-fenilalanina, una O-metil-L-tirosina, una L-3-(2-naftil)alanina, una 3-metilfenilalanina, una O-4-alil-L-tirosina, una 4-propil-L-tirosina, una tri-O-acetil-GlcNAcp-serina, una L-Dopa, una fenilalanina fluorada, una isopropil-L-fenilalanina, una p-azido-L- fenilalanina, una p-acil-L-fenilalanina, una p-benzoil-L-fenilalanina, una L-fosfoserina, una fosfonoserina, una fosfonotirosina, una p-yodo-fenilalanina, una p-bromofenilalanina, una p-amino-L-fenilalanina, una isopropil-L- fenilalanina y una p-propargiloxi-fenilalanina, y similares. Ejemplos de estructuras de una variedad de aminoacidos no naturales que pueden ser adecuados para su uso en la presente invencion se proporcionan, por ejemplo, en el documento WO 2002/085923 titulado "In vivo incorporation of unnatural amino acids". Vease tambien Kiick y colaboradores, (2002) Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation, PNAS 99: 19-24, para analogos de metionina adicionales.
Muchos de los aminoacidos no naturales adecuados para su uso en la presente invencion estan comercialmente disponibles, por ejemplo, a traves de Sigma (EE.UU.) o Aldrich (Milwaukee, Wisconsin, EE. UU.). Aquellos que no estan comercialmente disponibles son opcionalmente sintetizados como se ensena en la presente memoria o como se ensena en diversas publicaciones o usando metodos estandar conocidos por los expertos en la tecnica. Para tecnicas de sfntesis organica, vease, por ejemplo, Organic Chemistry de Fessendon y Fessendon, (1982, Segunda Edicion, Willard Grant Press, Boston Massachusetts); Advanced Organic Chemistry por March (tercera edicion, 1985, Wiley and Sons, Nueva York); y Advanced Organic Chemistry por Carey y Sundberg (Tercera Edicion, Partes A y B, 1990, Plenum Press, Nueva York). Publicaciones adicionales que describen la sfntesis de aminoacidos no naturales incluyen, por ejemplo, el documento WO 2002/085923 titulado "In vivo incorporation of Unnatural Amino Acids"; Matsoukas y colaboradores, (1995) J. Med. Chem., 38, 4660 - 4669; King, F. E. y Kidd, D. A. A. (1949) A New Synthesis of Glutamine and of Y-Dipeptides of Glutamic Acid from Phthylated Intermediates. J. Chem. Soc., 3315 - 3319; Friedman, O. M. & Chatterrji, R. (1959) Synthesis of Derivatives of Glutamine as Model Substrates for Anti-Tumor Agents. J. Am. Chem. Soc. 81, 3750 - 3752; Craig, J. C. y colaboradores (1988) Absolute Configuration of the Enantiomers of 7-Chloro-4 [[4- (diethylamino)-1-methylbutyl]amino]quinoline (Chloroquine). J. Org. Chem. 53, 1167-1170; Azoulay, M., Vilmont, M. & Frappier, F. (1991) Glutamine analogues as Potential Antimalarials, Eur. J. Med. Chem. 26, 201-5; Koskinen, A. M. P. & Rapoport, H. (1989) Synthesis of 4-Substituted Prolines as Conformationally Constrained Amino Acid Analogues. J. Org. Chem. 54, 1859-1866; Christie, B. D. & Rapoport, H. (1985) Synthesis of Optically Pure Pipecolates from L-Asparagine. Application to the Total Synthesis of (+)-Apovincamine through Amino Acid Decarbonylation and Iminium Ion Cyclization. J. Org. Chem. 1989:1859-1866; Barton y colaboradores, (1987) Synthesis of Novel a-Amino-Acids and Derivatives Using Radical Chemistry: Synthesis of L- and D-a-Amino-Adipic Acids, L-a-aminopimelic Acid and Appropriate Unsaturated Derivatives. Tetrahedron Lett. 43:4297-4308; y, Subasinghe y colaboradores, (1992) Quisqualic acid analogues: synthesis of beta-heterocyclic 2-aminopropanoic acid derivatives and their activity at a novel quisqualate-sensitized site. J. Med. Chem. 35:4602-7. Vease tambien, las solicitudes de patente tituladas "Protein Arrays", presentada el 22 de diciembre de 2003, Ser. No. 10/744.899 y la solicitud de patente estadounidense No. 60/435.821 presentada el 22 de diciembre de 2002.
Los aminoacidos con un grupo reactivo carbonilo permiten una variedad de reacciones para enlazar moleculas (incluyendo, pero sin limitarse a, PEG u otras moleculas solubles en agua) mediante reacciones de adicion nucleofflica o de condensacion aldolica entre otras.
Ejemplos de aminoacidos que contienen carbonilo pueden representarse como sigue:
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(CH2)nRiCOR2
R3HN'^COR4
en donde n es 0-10; Ri es un alquilo, arilo, alquilo sustituido o arilo sustituido; R2 es H, alquilo, arilo, alquilo sustituido y arilo sustituido; y R3 es H, un aminoacido, un polipeptido, o un grupo de modificacion del terminal amino, y R4 es H, un aminoacido, un polipeptido o un grupo de modificacion del terminal carboxilo. En algunas realizaciones, n es 1, Ri es fenilo y R2 es un alquilo simple (es decir, metilo, etilo, o propilo) y la unidad estructural cetona se coloca en la posicion para con relacion a la cadena lateral de alquilo. En algunas realizaciones, n es 1, Ri es fenilo y R2 es un alquilo simple (es decir, metilo, etilo, o propilo) y la unidad estructural cetona se posiciona en la posicion meta con relacion a la cadena lateral de alquilo.
En la presente invencion, un aminoacido codificado no naturalmente que porta grupos hidroxilo y amino adyacentes puede incorporarse al polipeptido como una funcion aldehfdo "enmascarada". Por ejemplo, la 5-hidroxilisina porta un grupo hidroxilo adyacente a la amina epsilon. Las condiciones de reaccion para generar el aldehfdo implican tfpicamente la adicion de un exceso molar de metaperiodato de sodio bajo condiciones suaves para evitar la oxidacion en otros sitios dentro del polipeptido. El pH de la reaccion de oxidacion es tfpicamente de aproximadamente 7,0. Una reaccion tfpica implica la adicion de aproximadamente un exceso molar de 1,5 de meta-peryodato de sodio a una solucion tamponada del polipeptido, seguido de incubacion durante aproximadamente 10 minutos en la oscuridad. Vease, por ejemplo, la patente estadounidense No. 6.423.685.
La funcion carbonilo puede hacerse reaccionar selectivamente con un reactivo que contiene hidracina, hidracida, hidroxilamina o semicarbazida en condiciones suaves en solucion acuosa para formar los correspondientes enlaces hidrazona, oxima o semicarbazona, respectivamente, que son estables bajo condiciones fisiologicas. Vease, por ejemplo, Jencks, W.P., J. Am. Chem. Soc. 81, 475 - 481 (1959); Shao, J. y Tam, J. P., J. Am. Chem. Soc. 117: 3893 - 3899 (1995). Ademas, la unica reactividad del grupo carbonilo permite la modificacion selectiva en presencia de las otras cadenas laterales de aminoacidos. Vease, por ejemplo, Cornish, V. W. y colaboradores, J. Am. Chem. Soc. 118: 8150-8151 (1996); Geoghegan, K. F. y Stroh, J. G., Bioconjug. Chem. 3: 138-146 (1992); Mahal, L. K., y colaboradores, Science 276: 1125-1128 (1997).
Los aminoacidos no codificados naturalmente que contienen un grupo nucleofflico, tal como una hidracina, hidrazida o semicarbazida, permiten la reaccion con una variedad de grupos electrofflicos para formar conjugados (incluyendo pero sin limitarse a, PEG u otros polfmeros solubles en agua) .
Los ejemplos de aminoacidos que contienen hidracina, hidrazida o semicarbazida pueden representarse como sigue:
(CH2)fJR1X-C(0)-NH-HN2
R2HN^COR3
en donde n es 0-10; R1 es un alquilo, arilo, alquilo sustituido o arilo sustituido o no esta presente; X, es O, N, o S o no esta presente; R2 es H, un aminoacido, un polipeptido, o un grupo de modificacion del terminal amino, y R3 es H, un aminoacido, un polipeptido, o un grupo de modificacion del terminal carboxilo.
En algunas realizaciones, n es 4, R1 no esta presente y X es N. En algunas realizaciones, n es 2, R1 no esta presente y X no esta presente. En algunas realizaciones, n es 1, R1 es fenilo, X es O y el atomo de oxfgeno se posiciona en posicion para frente al grupo alifatico en el anillo arilo.
Los aminoacidos que contienen hidrazida, hidracina y semicarbazida estan disponibles a partir de fuentes comerciales. Por ejemplo, L-glutamato-Y-hidrazida esta disponible a traves de Sigma Chemical (St. Louis, Mo.). Otros expertos en la tecnica pueden preparar otros aminoacidos no disponibles comercialmente. Vease, por ejemplo, la patente estadounidense No. 6.228.211.
Los polipeptidos que contienen aminoacidos no codificados naturalmente que portan funciones hidrazida, hidracina o semicarbazida pueden hacerse reaccionar de manera eficiente y selectiva con una diversidad de moleculas que contienen aldehfdos u otros grupos funcionales con reactividad qufmica similar. Vease, por ejemplo, Shao, J. y Tam, J., J. Am. Chem. Soc. 117: 3893-3899 (1995). La reactividad unica de los grupos funcionales hidrazida, hidracina y semicarbazida los hace significativamente mas reactivos hacia aldehfdos, cetonas y otros grupos electrofflicos en comparacion con los grupos nucleofflicos presentes en los 20 aminoacidos comunes (incluyendo, pero sin limitarse a, el grupo hidroxilo de serina o treonina o los grupos amino de la lisina y el extremo terminal N).
Los aminoacidos no codificados naturalmente que contienen un grupo aminooxi (tambien llamado hidroxilamina) permiten la reaccion con una variedad de grupos electrofflicos para formar conjugados (incluyendo, pero no limitados a, PEG u otros polfmeros solubles en agua). Al igual que las hidracinas, hidrazidas y semicarbazidas, la nucleofilicidad
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mejorada del grupo aminooxi permite que reaccione eficientemente y selectivamente con una variedad de moleculas que contienen aldehfdos u otros grupos funcionales con reactividad qmmica similar. Vease, por ejemplo, Shao, J. y Tam, J., J. Am. Chem. Soc. 117: 3893-3899 (1995); H. Hang y C. Bertozzi, Acc. Chem. Res. 34: 727-736 (2001). Mientras que el resultado de la reaccion con un grupo hidracina es la hidrazona correspondiente, sin embargo, generalmente resulta una oxima de la reaccion de un grupo aminooxi con un grupo que contiene carbonilo tal como una cetona.
Los ejemplos de aminoacidos que contienen grupos aminooxi pueden representarse como sigue:
(CH2)nR1 X—(CH2)„—Y O NH2 r2hn^cor3
en donde n es 0-10; R1 es un alquilo, arilo, alquilo sustituido o arilo sustituido o no esta presente; X es O, N, S o no esta presente; M es 0-10; Y=C(O) o no esta presente; R2 es H, un aminoacido, un polipeptido, o un grupo de modificacion del terminal amino, y R3 es H, un aminoacido, un polipeptido, o un grupo de modificacion del terminal carboxilo. En algunas realizaciones, n es 1, R1 es fenilo, X es O, m es 1, y Y esta presente. En algunas realizaciones, n es 2, R1 y X no estan presentes, m es 0 y Y no esta presente.
Los aminoacidos que contienen aminooxi pueden ser preparados a partir de precursores de aminoacidos facilmente disponibles (homoserina, serina y treonina). Vease, por ejemplo, M. Carrasco y R. Brown, J. Org. Chem. 68: 8853-8858 (2003). Ciertos aminoacidos que contienen aminooxi, tales como el acido L-2-amino-4-(aminooxi)butmco), han sido aislados a partir de fuentes naturales (Rosenthal, G. y colaboradores, Life Sci. 60: 1635-1641 (1997). Otros aminoacidos que contienen aminooxi pueden ser preparados por un experto en la tecnica.
La reactividad unica de grupos funcionales azida y alquino los hace extremadamente utiles para la modificacion selectiva de polipeptidos y otras moleculas biologicas. Las azidas organicas, particularmente las azidas alifaticas, y los alquinos son generalmente estables frente a las condiciones qmmicas reactivas comunes. En particular, tanto la azida como los grupos funcionales alquino son inertes frente a las cadenas laterales (es decir, los grupos R) de los 20 aminoacidos comunes que se encuentran en los polipeptidos naturales. Sin embargo, cuando se pone en estrecha proximidad, se revela la naturaleza de "resorte cargado" de los grupos azida y alquino y reaccionan selectiva y eficientemente mediante la reaccion de cicloadicion de Huisgen [3+2] para generar el correspondiente triazol. Vease, por ejemplo, Chin J., y colaboradores, Science 301: 964-7 (2003); Wang, Q., y colaboradores, J. Am. Chem. Soc. 125, 3192-3119 (2003); Chin, J. W. y colaboradores, J. Am. Chem. Chem. Soc. 124: 9026-9027 (2002).
Debido a que la reaccion de cicloadicion de Huisgen implica una reaccion de cicloadicion selectiva (vease, por ejemplo, Padwa, A., en COMPREHENSIVE ORGIC SYNTHESIS, Vol. 4, (ed. Trost, BM, 1991), paginas 1069-1109; Huisgen, R. en 1,3-DIPOLAR CYCLOADDITION CHEMISTRY (ed. Padwa, A., 1984), pags. 1-176) en lugar de una sustitucion nucleofflica, la incorporacion de aminoacidos no codificados naturalmente que contienen azida y cadenas laterales que contienen alquino permite que los polipeptidos resultantes se modifiquen selectivamente en la posicion del aminoacido no codificado naturalmente. La reaccion de cicloadicion que implica azida o anticuerpo que contiene alquino puede llevarse a cabo a temperatura ambiente en condiciones acuosas mediante la adicion de Cu (II) (incluyendo, pero sin limitarse a, en forma de una cantidad catalftica de CuSO4) en presencia de un agente reductor para reducir Cu (II) hasta Cu (I), in situ, en cantidad catalftica. Vease, por ejemplo, Wang, Q., y colaboradores, J. Am. Chem. Soc. 125, 3192-3119 (2003); Tornoe, C. W., y colaboradores, J. Org. Chem. 67: 3057-3064 (2002); Rostovtsev y colaboradores, Angew. Chem. Int. Ed. 41: 2596-2599 (2002). Ejemplos de agentes reductores incluyen, pero sin limitarse a, ascorbato, cobre metalico, quinina, hidroquinona, vitamina K, glutation, cistema, Fe2+, Co2+ y un potencial electrico aplicado.
En algunos casos, cuando se desea una reaccion de cicloadicion de Huisgen [3+2] entre una azida y un alquino, el polipeptido de union al antfgeno comprende un aminoacido no codificado naturalmente que comprende una unidad estructural alquino y el polfmero soluble en agua que va a ser unido al aminoacido comprende una unidad estructural azida. Alternativamente, tambien se puede realizar la reaccion inversa (es decir, con la unidad estructural azida en el aminoacido y la unidad estructural alquino presente en el polfmero soluble en agua).
El grupo funcional azida tambien puede hacerse reaccionar selectivamente con un polfmero soluble en agua que contiene un ester anlico e introducirle adecuadamente una funcion con la unidad estructural aril fosfina para generar un enlace amida. El grupo aril fosfina reduce la azida in situ y la amina resultante reacciona entonces eficientemente con un enlace ester proximal para generar la amida correspondiente. Vease, por ejemplo, E. Saxon y C. Bertozzi, Science 287, 2007-2010 (2000). El aminoacido que contiene azida puede ser o bien una azida de alquilo (incluyendo, pero sin limitarse a, el acido 2-amino-6-azido-1-hexanoico) o una aril azida (p-azido-fenilalanina).
Los ejemplos de polfmeros solubles en agua que contienen un ester anlico y una unidad estructural fosfina pueden representarse como sigue:
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en donde X puede ser O, N, S o no estar presente, Ph es fenilo, W es un polfmero soluble en agua y R puede ser H, alquilo, arilo, alquilo sustituido y grupos arilo sustituidos. Ejemplos de grupos R incluyen pero no se limitan a -CH2, - C(CH3)3, -OR', -NR'R'', -SR', -halogeno, -C(O)R', -CONR'R'', R'', R'' y R'''' cada uno independientemente se refiere a hidrogeno, heteroalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, incluyendo, pero no limitado a, arilo sustituido con 1-3 halogenos, grupos alquilo, alcoxi o tioalcoxi sustituidos o no sustituidos, o grupos arilalquilo. Cuando un compuesto de la invencion incluye mas de un grupo R, por ejemplo, cada uno de los grupos R se selecciona independientemente ya que son cada uno grupos R', R'', R'' y R''" cuando mas de uno de estos grupos esta presente. Cuando R' y R'' estan unidos al mismo atomo de nitrogeno, pueden combinarse con el atomo de nitrogeno para formar un anillo de 5, 6 o 7 miembros. Por ejemplo, se entendera que -NR'R" incluye, pero no se limita a, 1-pirrolidinilo y 4- morfolinilo. De la discusion anterior de sustituyentes, un experto en la tecnica entendera que el termino "alquilo" incluye grupos que incluyen atomos de carbono unidos a grupos distintos de grupos hidrogeno, tales como haloalquilo (incluyendo, pero sin limitarse a, -CF3 y -CH2CF3) y acilo (incluyendo, pero sin limitarse a, -C(O)CH3, -C(O)CF3, -C(O) CH2OCH3 y similares).
Tambien se puede hacer reaccionar selectivamente el grupo funcional azida con un polfmero soluble en agua que contiene un tioester y con la adicion apropiada de una funcion con una unidad estructural aril fosfina para generar un enlace amida. El grupo aril fosfina reduce la azida in situ y la amina resultante reacciona entonces eficientemente con el enlace tioester para generar la amida correspondiente. Ejemplos de polfmeros solubles en agua que contienen un tioester y una unidad estructural de fosfina pueden representarse como sigue:
S X
Ph2P(H2C)/ Y O
en donde n es 1-10; X puede ser O, N, S o no estar presente, Ph es fenilo y W es un polfmero soluble en agua.
Los ejemplos de aminoacidos que contienen alquino pueden representarse como sigue:
(CH2)nR1X(CH2)mCCH
R2HN^COR3
en donde n es 0-10; R1 es un alquilo, arilo, alquilo sustituido o arilo sustituido o no esta presente; X es O, N, S o no esta presente; M es 0-10, R2 es H, un aminoacido, un polipeptido, o un grupo de modificacion del terminal amino, y R3 es H, un aminoacido, un polipeptido o un grupo de modificacion del terminal carboxilo. En algunas realizaciones, n es 1, R1 es fenilo, X no esta presente, m es 0 y la unidad estructural acetileno esta situada en la posicion para con relacion a la cadena lateral alquilo. En algunas realizaciones, n es 1, R1 es fenilo, X es O, m es 1 y el grupo propargiloxi esta situado en la posicion para con relacion a la cadena lateral de alquilo (es decir, O-propargil-tirosina). En algunas realizaciones, n es 1, R1 y X no estan presentes y m es 0 (es decir, propargilglicina).
Los aminoacidos que contienen alquino estan disponibles comercialmente. Por ejemplo, la propargilglicina esta disponible comercialmente a traves de Peptech (Burlington, Massachusetts). Alternativamente, los aminoacidos que contienen alquino pueden prepararse de acuerdo con metodos estandar. Por ejemplo, la p-propargiloxifenilalanina puede sintetizarse, por ejemplo, como se describe en Deiters, A., y colaboradores, J. Am. Chem. Chem. Soc. 125: 11782-11783 (2003), y la 4-alquinil-L-fenilalanina pueden sintetizarse como se describe en Kayser, B. y colaboradores, Tetrahedron 53 (7): 2475-2484 (1997). Pueden prepararse otros aminoacidos que contienen alquino por parte de un experto en la tecnica.
Los ejemplos de aminoacidos que contienen azida pueden representarse como sigue:
(CH2),R1X(CH2)mN3
R2HN^COR3
en donde n es 0-10; R1 es un alquilo, arilo, alquilo sustituido, arilo sustituido o no esta presente; X es O, N, S o no esta presente; M es 0-10; R2 es H, un aminoacido, un polipeptido, o un grupo de modificacion del terminal amino, y R3 es H, un aminoacido, un polipeptido, o un grupo de modificacion del terminal carboxilo. En algunas realizaciones, n es 1, R1 es fenilo, X no esta presente, m es 0 y la unidad estructural azida esta situada en posicion para frente a la cadena lateral de alquilo. En algunas realizaciones, n es 0-4 y R1 y X no estan presentes, y m = 0. En algunas realizaciones, n es 1, R1
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es fenilo, X es O, m es 2 y la unidad estructural P-azidoetoxi esta situada en la posicion para con respecto a la cadena lateral de alquilo.
Los aminoacidos que contienen azidas estan disponibles a partir de fuentes comerciales. Por ejemplo, la 4- azidofenilalanina se puede obtener a traves de Chem-Impex International, Inc. (Wood Dale, I11). Para los aminoacidos que contienen azidas que no estan comercialmente disponibles, el grupo azida puede prepararse relativamente facilmente usando metodos estandar conocidos por los expertos en la tecnica, incluyendo, pero no limitandose a, el desplazamiento de un grupo saliente adecuado (incluyendo pero no limitado a, haluro, mesilato, tosilato) o a traves de la apertura de una lactona adecuadamente protegida. Vease, por ejemplo, Advanced Organic Chemistry de March (tercera Edicion, 1985, Wiley and Sons, Nueva York).
La reactividad unica de los grupos funcionales aminotiol beta-sustituidos los hace extremadamente utiles para la modificacion selectiva de polipeptidos y otras moleculas biologicas que contienen grupos aldehfdo mediante la formacion de la tiazolidina. Vease, por ejemplo, J. Shao y J. Tam, J. Am. Chem. Soc. 1995, 117 (14) 3893-3899. En algunas realizaciones, se pueden incorporar aminoacidos aminotiol beta-sustituidos en anticuerpos y luego hacerlos reaccionar con polfmeros solubles en agua que comprenden una funcion aldehfdo. En algunas realizaciones, un polfmero soluble en agua, conjugado de farmaco u otra carga util puede acoplarse a un polipeptido de anticuerpo que comprende un aminoacido aminotiol beta-sustituido mediante la formacion de la tiazolidina.
Ejemplos particulares de aminoacidos no naturales utiles incluyen, pero no se limitan a, p-acetil-L-fenilalanina, O-metil- L-tirosina, L-3-(2-naftil)alanina, 3-metilfenilalanina, O-4-alil-L-tirosina, 4-propil-L-tirosina, tri-O-acetil-GlcNAc b-serina, L- Dopa, fenilalanina fluorada, isopropil-L-fenilalanina, p-azido-L-fenilalanina p-acil-L-fenilalanina, p-benzoil-L-fenilalanina, L-fosfoserina, fosfonoserina, fosfonotirosina, p-yodo-fenilalanina, p-bromofenilalanina, p-amino-L-fenilalanina, isopropil- L-fenilalanina y p-propargiloxi-fenilalanina. Otros ejemplos utiles incluyen N-acetil-L-glucosaminil-L-serina, N-acetil-L- galactosaminil-L-serina, N-acetil-L-glucosaminil-L-treonina, N-acetil-L-glucosaminil-L-asparagina y O-manosaminil-L- serina.
En realizaciones particulares, los aminoacidos no naturales se seleccionan de p-acetil-fenilalanina, p-etinil-fenilalanina, p-propargiloxifenilalanina y p-azido-fenilalanina. Un aminoacido no natural particularmente util es la p-azido-fenilalanina. Este residuo de aminoacido es conocido por los expertos en la tecnica para facilitar las reacciones de cicloadicion de Huisgen [3+2] (llamadas reacciones qufmicas "clic") con, por ejemplo, compuestos que portan grupos alquinilo. Esta reaccion permite que un experto en la tecnica se conjugue facil y rapidamente al anticuerpo en la ubicacion especffica del sitio del aminoacido no natural.
En ciertas realizaciones, el primer grupo reactivo es una unidad estructural alquinilo (incluyendo pero no limitado a, en el aminoacido no natural p-propargiloxifenilalanina, en donde el grupo propargilo se denomina tambien a veces como una unidad estructural acetileno) y el segundo grupo reactivo es una unidad estructural azido, y se puede usar la qufmica [3+2] de cicloadicion. En ciertas realizaciones, el primer grupo reactivo es la unidad estructural azido (incluyendo pero no limitado a, en el aminoacido no natural p-azido-L-fenilalanina) y el segundo grupo reactivo es la unidad estructural alquinilo.
En las formulas anteriores, cada L representa un enlazador divalente. El enlazador divalente puede ser cualquier enlazador divalente conocido por los expertos en la tecnica. Generalmente, el enlazador divalente es capaz de formar enlaces covalentes con la unidad estructural funcional R y el carbono alfa del aminoacido no natural. Enlazadores divalentes utiles son, alquileno, alquileno sustituido, heteroalquileno, heteroalquileno sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno y heteroarileno sustituido. En ciertas realizaciones, L es alquileno de 1 a 10 atomos de carbono o heteroalquileno de 1 a 10 atomos de carbono.
Los aminoacidos no naturales utilizados en las composiciones descritas en la presente invencion tienen al menos una de las cuatro propiedades siguientes: (1) al menos un grupo funcional en la cadena lateral del aminoacido no natural tiene al menos una caracterfstica y/o actividad y/o reactividad ortogonal a la reactividad qufmica de los 20 aminoacidos comunes codificados geneticamente (es decir, alanina, arginina, asparagina, acido aspartico, cistefna, glutamina, acido glutamico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina y valina), o al menos ortogonales a la reactividad qufmica de los aminoacidos naturales presentes en el polipeptido que incluye el aminoacido no natural; (2) los aminoacidos no naturales introducidos son sustancialmente qufmicamente inertes hacia los 20 aminoacidos comunes codificados geneticamente; (3) el aminoacido no natural puede incorporarse de forma estable en un polipeptido, preferiblemente con la estabilidad acorde con los aminoacidos naturales o bajo condiciones fisiologicas tfpicas, y preferiblemente ademas dicha incorporacion puede ocurrir a traves de un sistema in vivo; y (4) el aminoacido no natural incluye un grupo funcional oxima o un grupo funcional que puede transformarse en un grupo oxima por reaccion con un reactivo, preferiblemente en condiciones que no destruyen las propiedades biologicas del polipeptido que incluye el aminoacido no natural (a menos que, por supuesto, tal destruccion de las propiedades biologicas sea el proposito de la modificacion/transformacion), o cuando la transformacion pueda ocurrir en condiciones acuosas a un pH entre aproximadamente 4 y aproximadamente 8, o cuando el sitio reactivo en el aminoacido no natural es un sitio electrofflico. Ejemplos ilustrativos y no limitantes de aminoacidos que satisfacen estas cuatro propiedades para los aminoacidos no naturales que se pueden usar con las composiciones descritas aquf se
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presentan en las Figs. 2, 3, 35 y 40-43. Se puede introducir cualquier cantidad de aminoacidos no naturales en el polipeptido. Los aminoacidos no naturales tambien pueden incluir oximas protegidas o enmascaradas o grupos protegidos o enmascarados que se pueden transformar en un grupo oxima despues de la desproteccion del grupo protegido o desenmascaramiento del grupo enmascarado.
Los aminoacidos no naturales tambien pueden incluir grupos carbonilo o dicarbonilo protegidos o enmascarados, que pueden transformarse en un grupo carbonilo o dicarbonilo despues de la desproteccion del grupo protegido o desenmascaramiento del grupo enmascarado y por lo tanto estan disponibles para reaccionar con hidroxilaminas u oximas para formar grupos oxima.
En otras realizaciones, los aminoacidos no naturales que pueden usarse en las composiciones descritas en la presente memoria incluyen, pero no se limitan a, aminoacidos que comprenden un agente entrelazador que puede ser activado por luz, aminoacidos marcados por centrifugacion, aminoacidos fluorescentes, aminoacidos que se unen a metal, aminoacidos que contienen metal, aminoacidos radiactivos, aminoacidos con nuevos grupos funcionales, aminoacidos que interaction de forma covalente o no covalente con otras moleculas, aminoacidos captados por luz y/o que pueden ser isomerizados por luz, aminoacidos que comprenden biotina o un analogo de biotina, aminoacidos glicosilados tales como una serina sustituida con azucar, otros aminoacidos modificados con carbohidratos, aminoacidos que contienen cetona, aminoacidos que contienen aldehfdo, aminoacidos que comprenden polietilenglicol u otros polieteres, aminoacidos sustituidos con atomos pesados, amino qufmicamente escindibles y/o escindibles por luz, aminoacidos con cadenas laterales alargadas en comparacion con aminoacidos naturales, incluyendo, pero no limitandose a, polieteres o hidrocarburos de cadena larga, incluyendo, pero sin limitarse a, mas de aproximadamente 5 o mas de aproximadamente 10 carbonos, aminoacidos que contienen azucar enlazada a carbono, aminoacidos redox activos, aminoacidos que contienen tioaminoacidos y aminoacidos que comprenden uno o mas unidades estructurales toxicas.
En algunas realizaciones, los aminoacidos no naturales comprenden una unidad estructural de sacarido. Ejemplos de tales aminoacidos incluyen N-acetil-L-glucosaminil-L-serina, N-acetil-L-galactosaminil-L-serina, N-acetil-L-glucosaminil- L-treonina, N-acetil-L-glucosaminil-L-asparagina y O-manosaminil-L-serina. Ejemplos de tales aminoacidos tambien incluyen ejemplos en los que el enlace N u O de origen natural entre el aminoacido y el sacarido se reemplaza por un enlace covalente que no se encuentra comunmente en la naturaleza, incluyendo pero sin limitarse a, un alqueno, una oxima, un tioeter, una amida y similares. Ejemplos de tales aminoacidos incluyen tambien sacaridos que no se encuentran comunmente en protefnas naturales tales como 2-desoxi-glucosa, 2-desoxigalactosa y similares.
Las unidades estructurales qufmicas incorporadas en anticuerpos mediante la incorporacion de aminoacidos no naturales ofrecen una variedad de ventajas y manipulaciones de polipeptidos. Por ejemplo, la reactividad unica de un grupo funcional carbonilo o dicarbonilo (incluyendo un grupo funcional cetona o aldehfdo) permite la modificacion selectiva de anticuerpos con cualquiera de un numero de reactivos que contienen hidracina o hidroxilamina in vivo e in vitro. Por ejemplo, un aminoacido no natural de atomo pesado puede ser util para poner en fase los datos de estructura de rayos X. La introduccion especffica del sitio de atomos pesados usando aminoacidos no naturales tambien proporciona selectividad y flexibilidad en la eleccion de posiciones para atomos pesados. Los aminoacidos fotorreactivos no naturales (incluyendo pero sin limitarse a, aminoacidos con benzofenona y arilazidas (incluyendo, pero sin limitarse a, las cadenas laterales de fenilazida), por ejemplo, permiten el fotoentrecruzamiento eficaz in vitro e in vitro de polipeptidos. Ejemplos de aminoacidos no naturales fotorreactivos incluyen, pero no se limitan a, p-azido-fenilalanina y p-benzoil-fenilalanina. Los anticuerpos con los aminoacidos no naturales fotorreactivos pueden entonces entrecruzarse a voluntad mediante la excitacion del control temporal del grupo fotorreactivo. En un ejemplo no limitativo, el grupo metilo de un amino no natural puede estar sustituido con un grupo marcado isotopicamente, incluyendo pero no limitado a, con un grupo metilo, como una sonda de estructura local y dinamica, incluyendo, pero sin limitarse a, con el uso de resonancia magnetica nuclear y espectroscopfa vibracional.
Los aminoacidos con un grupo reactivo electrofflico permiten una variedad de reacciones para enlazar moleculas a traves de diversas reacciones qufmicas, incluyendo, pero sin limitarse a, reacciones de adicion nucleofflicas. Dichos grupos reactivos electrofflicos incluyen un grupo carbonilo o dicarbonilo (incluyendo un grupo cetona o aldehfdo), un grupo similar a carbonilo o dicarbonilo (que tiene reactividad similar a un grupo carbonilo o dicarbonilo y es estructuralmente similar a un grupo carbonilo o dicarbonilo), un grupo carbonilo enmascarado o dicarbonilo enmascarado (que se puede convertir facilmente en un grupo carbonilo o dicarbonilo), o un grupo carbonilo protegido o dicarbonilo protegido (que tiene una reactividad similar a un grupo carbonilo o dicarbonilo tras la desproteccion). Tales aminoacidos incluyen aminoacidos que tienen la estructura de Formula (I):
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en donde: A es opcional, y cuando esta presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior,
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cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; B es opcional y cuando esta presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste en alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, -O-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S(O)k- donde k es 1, 2 o 3, -S(O)k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -NS(o)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C(S)- (alquileno o alquileno sustituido), -N(R')-, -NR'-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')CO-(alquileno o alquileno sustituido)- , -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')- , -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N- N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- y -C(R')2-n(r')-n(r')-, en donde cada R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido; J es
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R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; cada R" es independientemente H, alquilo, alquilo sustituido, o un grupo protector, o cuando mas de un grupo R" esta presente, dos R" forman opcionalmente un heterocicloalquilo; Ri es H, un grupo protector de amino, resina, aminoacido, polipeptido, o polinucleotido; y R2 es OH, un grupo protector de ester, resina, aminoacido, polipeptido, o polinucleotido; cada uno de R3 y R4 es independientemente H, halogeno, alquilo inferior o alquilo inferior sustituido, o R3 y R4 o dos grupos R3 opcionalmente forman un grupo cicloalquilo o heterocicloalquilo; o los grupos -A-B-J-R forman juntos un cicloalquilo o heterocicloalquilo bicfclico o tricfclico que comprende al menos un grupo carbonilo, incluyendo un grupo dicarbonilo, grupo carbonilo protegido, incluyendo un grupo dicarbonilo protegido, o grupo carbonilo enmascarado, incluyendo un grupo dicarbonilo enmascarado; o el grupo -J-R forma en conjunto un cicloalquilo o heterocicloalquilo monocfclico o bicfclico que comprende al menos un grupo carbonilo, incluyendo un grupo dicarbonilo, un grupo carbonilo protegido, incluyendo un grupo dicarbonilo protegido, o un grupo carbonilo enmascarado, incluyendo un grupo dicarbonilo enmascarado; con la condicion de que cuando A es fenileno y cada R3 es H, B esta presente; y que cuando A es -(CH2)4- y cada R3 es H, B no es -NHC(O)(CH2CH2)-; y que cuando A y B estan ausentes y cada R3 es H, R no es metilo. Tales aminoacidos no naturales pueden estar en forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipeptido, polfmero, polisacarido, o un polinucleotido de aminoacidos no naturales y opcionalmente modificado despues de la traduccion.
En ciertas realizaciones, los compuestos de Formula (I) son estables en solucion acuosa durante al menos 1 mes en condiciones ligeramente acidas. En ciertas realizaciones, los compuestos de Formula (I) son estables durante al menos 2 semanas en condiciones ligeramente acidas. En ciertas realizaciones, el compuesto de Formula (I) es estable durante al menos 5 dfas en condiciones ligeramente acidas. En ciertas realizaciones, tales condiciones acidas son de pH 2 a 8.
En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (I), B es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, -O-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(R')=NN(R')-, -N(R')CO-, -C(O)-, -C(R')=N-, -C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -CON(R')- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(alquileno o alquileno sustituido)-, -S(O)(alquileno o alquileno sustituido)- o -S(O)2 (alquileno o alquileno sustituido)-. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (I), B es -O(CH2)-, -CH=N-, -CH= N-NH-, -NHCH2-, -NHCO-, -C(O)C(O)-(CH2)-, -CONH-(CH2)-, -SCH2-, -S(=O)CH2-, o -S(O)2CH2-. En ciertas
realizaciones de compuestos de Formula (I), R es alquilo C1-6 o cicloalquilo. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (I) R es -CH3, -CH(CH3)2, o ciclopropilo. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (I), Ri es H, terc- butiloxicarbonilo (Boc), 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc), N-acetilo, tetrafluoroacetilo (TFA) o benciloxicarbonilo (Cbz). En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (I), Ri es una resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (I), R2 es OH, O-metilo, O-etilo, u O-t-butilo. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (I), R2 es una resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (I), R2 es un polinucleotido. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (I), R2 es acido ribonucleico (ARN). En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (I), R2 es ARNt. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (I), el ARNt reconoce especfficamente un codon selector. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (I), el codon selector se selecciona del grupo que consiste en un codon ambar, codon ocre, codon opalo, un codon unico, un codon raro, un codon no natural, un codon de cinco bases y un codon de cuatro bases.
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En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (I), R2 es un ARNt supresor. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (I),
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se selecciona del grupo que consiste en: (i) A es alquileno inferior sustituido, arileno C4, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; B es opcional y cuando esta presente es un enlazador divalente seleccionado del grupo que consiste en alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, -O-, -O-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S(O)-, - S(O)2, -NS(O)2, -OS(O)2, -C(O)-, -C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -N(R')-, -C(O)N(R')-, -CON(R')- (alquileno o alquileno sustituido)-, CSN(R')-, -N(R')CO-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')C(O)O-, -N(R')C(S)-, - S(O)N(R')-, -S(O)2N(R'), -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')-C(S)N(R')-, -N(R')S(O)N(R')-, -N(R')S(O)2N(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N- n(r')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- y -C(R')2-n(r')-n(r')-; (ii) A es opcional y cuando esta presente es alquileno inferior sustituido, arileno C4, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; B es un enlazador divalente seleccionado del grupo que consiste en alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, -O-, -O-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-, -C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -N(R')-, - C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -N(R')CO-(alquileno o alquileno sustituido)-,- N(R')C(O)O-, -N(R')C(S)-, -S(O)N(R'), -S(O)2N(R'), -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)N(R')-, - N(R')S(O)2N(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=NN=,-C(R')2-N=N-, y -C(R')2-N(R')-N(R')-; (iii) A es alquileno inferior; B es opcional, y cuando esta presente es un enlazador divalente seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, -O-, -O-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-, -C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, - N(R')-, -C(O)N(R')-, -CSN(R')-, -CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')C(O)O-, -N(R')C(S)-, -S(O)N(R'), - S(O)2N(R'),-N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)N(R')-, -N(R')S(O)2N(R')-, -N(R')-N=,-C(R')=N-N(R')-, - c(r')=N-N=, -C(R')2-N=N-, y -C(R')2-N(R')-N(R')-; y (iv) A es fenileno; B es un enlazador divalente seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, - O-, -O-( alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-, -C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -N(R')-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -N(R')CO-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')C(O)O-, -N(R')C(S)-, -S(O)N(R'), -S(O)2N(R'), -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, - N(R')S(O)N(R')-, -N(R')S(O)2N(R')-, -N(R')-N=, -C(R')'N-N(R')-, -C(R')=NN=, -C(R')2-N=N-, y -C(R>N(R')-N(R')-; J es
O 9 , S
w.vy vV
! \ OR1 SR'
W ,vV,
, , N+
Yn'0A - 0 \J^y ;
cada R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido; R1 es opcional, y cuando esta presente, es H, un grupo protector de amino, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido; y R2 es opcional, y cuando esta presente, es OH, un grupo protector de ester, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido; y cada R3 y R4 es independientemente H, halogeno, alquilo inferior o alquilo inferior sustituido; y R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido.
Ademas, se incluyen aminoacidos que tienen la estructura de Formula (II):
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en donde: A es opcional y cuando esta presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; B es opcional y cuando esta presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste en alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, -O-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S(O)k- donde k es 1, 2 o 3, -S(O)k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -NS(o)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C(S)- (alquileno sustituido), -N(R')-, -NR'-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')CO-(alquileno o alquileno sustituido)-, - N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')- , -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- y -C(R')2-N(R')-N(R')-, en donde cada R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo protector de amino, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido; y R2 es OH, un grupo protector de ester, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido. En ciertas realizaciones, cuando A es fenileno, B esta presente; y que cuando A es -(-CH2)4-, B no es - NHC(O)(CH2CH2)-; y que cuando A y B estan ausentes, R no es metilo. Tales aminoacidos no naturales pueden estar en forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipeptido de aminoacidos no naturales, polfmero, polisacarido, o un polinucleotido y opcionalmente modificado despues de la traduccion.
Ademas, se incluyen aminoacidos que tienen la estructura de Formula (III):
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en donde: B es un enlazador seleccionado del grupo que consiste en alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, -O- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S(O)k- donde k es 1, 2 o 3, -S(O)k(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR'-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')CO-(alquileno o alquileno sustituido)-, - N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- y -C(R>N(R')-N(R')-, donde cada R' es independientemente H , alquilo, o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; R1 es H, un grupo protector de amino, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido; y R2 es OH, un grupo protector de ester, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido; cada Ra se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, halogeno, alquilo, alquilo sustituido, -N(R')2, -C(O)kR' donde k es 1, 2 o 3, -C(O)N(R')2, -OR' y -S(O)kR', en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido. Tales aminoacidos no naturales pueden estar en forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipeptido de aminoacidos no naturales, polfmero, polisacarido, o un polinucleotido y opcionalmente modificado despues de la traduccion.
Ademas, se incluyen los siguientes aminoacidos:
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y
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Dichos aminoacidos no naturales pueden ser opcionalmente grupos amino protegidos, carboxilo protegidos y/o en forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipeptido de aminoacidos no naturales, polfmero, polisacarido o un polinucleotido y, opcionalmente, modificados despues de la traduccion.
Ademas, se incluyen los siguientes aminoacidos que tienen la estructura de Formula (IV):
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en donde -NS(O)2-, -OS(O)2-, opcional, y cuando esta presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste en alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, -O-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S-(alquileno o alquileno sustituido)-, - S(O)k- donde k es 1, 2 o 3, -S(O)k(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, - c(s)-, -C(S)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR'-(alquileno o alquileno sustituido)-, -c(o)N(R')-, -CON(R')- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')CO-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, - C(R')=N-, -C(R')=NN(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R>N=N-, y -C(R>N(R')-N(R')-, en donde cada R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo protector de amino, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido; y R2 es OH, un grupo protector de ester, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido; cada Ra se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, halogeno, alquilo, alquilo sustituido, -N(R')2, -C(O)kR' en donde k es 1, 2 o 3, -C(O)N(R')2, -OR' y -S(O)kR', en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; y n es 0 a 8. En ciertas realizaciones, cuando A es - (CH2)4, B no es -NHC(O)(CH2CH2)-. Tales aminoacidos no naturales pueden estar en forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipeptido de aminoacidos no naturales, polfmero, polisacarido, o un polinucleotido y opcionalmente modificados despues de la traduccion.
Ademas, se incluyen los siguientes aminoacidos:
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en donde dichos compuestos estan opcionalmente amino protegidos, opcionalmente carboxilo protegidos, opcionalmente amino protegidos y carboxilo protegidos, o pueden ser incorporados en un polipeptido de aminoacidos no naturales, polfmero, polisacarido o un polinucleotido y opcionalmente modificados despues de la traduccion.
Ademas, se incluyen los siguientes aminoacidos que tienen la estructura de Formula (VIII):
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en donde, A es opcional, y cuando esta presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; B es 15 opcional, y cuando esta presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste en alquileno inferior, alquileno
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inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, -O-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S(O)k- donde k es 1, 2 o 3, -S(O)k(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, - C(S)-(alquileno o alquileno sustituido), -N(R')-, -NR'-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')CO-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, - C(R')=NN(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N-, y -C(R')2-N(R')-N(R')-, en donde cada R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido; Ri es H, un grupo protector de amino, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido; y R2 es Oh, un grupo protector de ester, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido. Tales aminoacidos no naturales pueden estar en forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipeptido de aminoacidos no naturales, polfmero, polisacarido, o un polinucleotido y opcionalmente modificados despues de la traduccion.
Ademas, se incluyen los siguientes aminoacidos que tienen la estructura de Formula (IX):
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en donde: B es opcional, y cuando esta presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste en alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, -O-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S-(alquileno o alquileno sustituido)-, - S(O)k- donde k es 1, 2 o 3, -S(O)k(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno o alquileno sustituido), -N(R')-, -NR'-(alquileno o alquileno sustituido)-, - C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, - N(R')CO-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, - N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N-, y -C(R')2-N(R')-N(R')-, en donde cada R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido; R1 es H, un grupo protector de amino, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido; y R2 es Oh, un grupo protector de ester, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido; en donde cada Ra se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, halogeno, alquilo, alquilo sustituido, -N(R')2, -C(O)kR' donde k es 1, 2 o 3, -C(O)N(R')2, -OR' y -S(O)kR', en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido. Tales aminoacidos no naturales pueden estar en forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipeptido de aminoacidos no naturales, polfmero, polisacarido, o un polinucleotido y opcionalmente modificado despues de la traduccion.
Ademas, se incluyen los siguientes aminoacidos:
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en donde dichos compuestos estan opcionalmente amino protegidos, opcionalmente carboxilo protegidos, opcionalmente amino protegidos y carboxilo protegidos, o una sal de los mismos, o pueden ser incorporados en un polipeptido de aminoacidos no naturales, polfmero, polisacarido o un polinucleotido y opcionalmente modificados despues de la traduccion.
Ademas, se incluyen los siguientes aminoacidos que tienen la estructura de formula (X):
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en donde, B es opcional, y cuando esta presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste en alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, -O-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S-(alquileno o alquileno sustituido)-, - S(O)k- donde k es 1, 2 o 3, -S(O)k(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -Ns(o)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno o alquileno sustituido), -N(R')-, -NR'-(alquileno o alquileno sustituido)-, - C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CsN(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, - N(R')CO-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, - N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N-, y -C(R')2-N(R')-N(R')-, en donde cada R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido; Ri es H, un grupo protector de amino, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido; y R2 es Oh, un grupo protector de ester, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido; cada Ra se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, halogeno, alquilo, alquilo sustituido, -N(R')2, -C(O)kR' donde k es 1, 2 o 3, -C(O)N(R')2, -OR' y -S(o)kR', en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; y n es = a 8. Tales aminoacidos no naturales pueden estar en forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipeptido de aminoacidos no naturales, polfmero, polisacarido, o un polinucleotido y opcionalmente modificado despues de la traduccion.
Ademas, se incluyen los siguientes aminoacidos:
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en donde dichos compuestos estan opcionalmente amino protegidos, opcionalmente carboxilo protegidos, opcionalmente amino protegidos y carboxilo protegidos, o pueden ser incorporados en un polipeptido de aminoacidos no naturales, polfmero, polisacarido o un polinucleotido y opcionalmente modificados despues de la traduccion.
Ademas de las estructuras de monocarbonilo, los aminoacidos no naturales descritos en la presente memoria pueden incluir grupos tales como dicarbonilo, tipo dicarbonilo, dicarbonilo enmascarado y grupos dicarbonilo protegidos. Por ejemplo, se incluyen los siguientes aminoacidos que tienen la estructura de Formula (V):
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en donde, A es opcional y cuando esta presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; B es opcional y cuando esta presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste en alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, -O-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S(O)k- donde k es 1, 2 o 3, - S(O)k(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, - c(s)-(alquileno o alquileno sustituido), -N(R')-, -NR'-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')CO-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, - C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R>N=N-, y -C(R>N(R')-N(R')-, en donde cada R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo protector de amino, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido; y R2 es OH, un grupo protector de ester, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido. Tales aminoacidos no naturales pueden estar en forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipeptido de aminoacidos no naturales, polfmero, polisacarido, o un polinucleotido y opcionalmente modificado despues de la traduccion.
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en donde: B es opcional, y cuando esta presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste en alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, -O-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S-(alquileno o alquileno sustituido)-, - 5 S(O)k- donde k es 1, 2 o 3, -S(O)k(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -Ns(o)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(alquileno o
alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno o alquileno sustituido), -N(R')-, -NR'-(alquileno o alquileno sustituido)-, - C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, - N(R')CO-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, - N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N-, y -C(R')2-N(R')-N(R')-, en donde 10 cada R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo protector de amino, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido; y R2 es OH, un grupo protector de ester, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido; en donde cada Ra se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, halogeno, alquilo, alquilo sustituido, -N(R')2, -C(O)kR' donde k es 1, 2 o 3, -C(O)N(R')2, -OR' y -S(O)kR', en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido. Tales 15 aminoacidos no naturales pueden estar en forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipeptido de aminoacidos no naturales, polfmero, polisacarido, o un polinucleotido y opcionalmente modificado despues de la traduccion.
Ademas, se incluyen los siguientes aminoacidos:
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en donde dichos compuestos estan opcionalmente amino protegidos y carboxilo protegidos, o una sal de los mismos. Tales aminoacidos no naturales pueden estar en forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipeptido de aminoacidos no naturales, polfmero, polisacarido, o un polinucleotido y opcionalmente modificado despues de la 25 traduccion.
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en donde, B es opcional, y cuando esta presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste en alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, -O-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S-(alquileno o alquileno sustituido)-, - 5 S(O)k- donde k es 1, 2 o 3, -S(O)k(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -Ns(o)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(alquileno o
alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno o alquileno sustituido), -N(R')-, -NR'-(alquileno o alquileno sustituido)-, - C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, - N(R')CO-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, - N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N-, y -C(R')2-N(R')-N(R')-, en donde
10 cada R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo protector de amino, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido; y R2 es OH, un grupo protector de ester, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido; cada Ra se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, halogeno, alquilo, alquilo sustituido, -N(R')2, -C(O)kR' donde k es 1, 2 o 3, -C(O)N(R')2, -OR' y -S(O)kR', en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; y n es = a 8.
15 Tales aminoacidos no naturales pueden estar en forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipeptido de aminoacidos no naturales, polfmero, polisacarido, o un polinucleotido y opcionalmente modificado despues de la traduccion.
Ademas, se incluyen los siguientes aminoacidos:
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y
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en donde dichos compuestos estan opcionalmente amino protegidos y carboxilo protegidos, o una sal de los mismos, o pueden incorporarse en un polipeptido de aminoacidos no naturales 5 opcionalmente modificados despues de la traduccion.
Ademas, se incluyen los siguientes aminoacidos que tienen la estructura
O O
r2
en donde: A es opcional y cuando esta presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, 10 heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; R1 es H, un grupo protector de amino, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido; y R2 es OH, un grupo protector de ester, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido; X1 es C, S, o S(O); y L es alquileno, alquileno sustituido, N(R')(alquileno) o N(R')(alquileno sustituido), donde R' es H, 15 alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido. Tales aminoacidos no naturales pueden estar en forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipeptido de aminoacidos no naturales, polfmero, polisacarido, o un polinucleotido y opcionalmente modificado despues de la traduccion.
Ademas, se incluyen los siguientes aminoacidos que tienen la estructura de formula (XXX-A):
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20 en donde: A es opcional y cuando esta presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; R1 es H, un grupo protector de amino, resina, aminoacido, 25 polipeptido o polinucleotido; y R2 es OH, un grupo protector de ester, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido; L es alquileno, alquileno sustituido, N(R')(alquileno) o N(R')(alquileno sustituido), donde R' es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido. Tales aminoacidos no naturales pueden estar en forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipeptido de aminoacidos no naturales, polfmero, polisacarido, o un polinucleotido y opcionalmente modificado despues de la traduccion.
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, polfmero, polisacarido o un polinucleotido y de Formula (XXX):
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en donde: A es opcional y cuando esta presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo protector de amino, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido; y R2 es OH, un grupo protector de ester, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido; L es alquileno, alquileno sustituido, N(R')(alquileno) o N(R')(alquileno sustituido), donde R' es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido. Tales aminoacidos no naturales pueden estar en forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipeptido de aminoacidos no naturales, polfmero, polisacarido, o un polinucleotido y opcionalmente modificado despues de la traduccion.
Ademas, se incluyen los siguientes aminoacidos que tienen la estructura de Formula (XXXI):
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en donde: A es opcional y cuando esta presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo protector de amino, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido; y R2 es OH, un grupo protector de ester, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido; Xi es C, S, o S(O); y n es 0, 1, 2, 3, 4 o 5; y cada R8 y R9 en cada grupo CR8R9 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, alcoxi, alquilamina, halogeno, alquilo, arilo o cualquier R8 y R9 pueden formar juntos =O o un cicloalquilo, o cualquiera de los grupos R8 adyacentes pueden formar juntos un cicloalquilo. Tales aminoacidos no naturales pueden estar en forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipeptido de aminoacidos no naturales, polfmero, polisacarido, o un polinucleotido y opcionalmente modificado despues de la traduccion.
Ademas, se incluyen los siguientes aminoacidos que tienen la estructura de formula (XXXI-A):
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en donde: A es opcional y cuando esta presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo protector de amino, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido; y R2 es OH, un grupo protector de ester, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido; n es 0, 1, 2, 3, 4 o 5; y cada R8 y R9 en cada grupo CR8R9 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, alcoxi, alquilamina, halogeno, alquilo, arilo o cualquier R8 y R9 pueden formar juntos =O o un cicloalquilo, o cualquiera de los grupos R8 adyacentes pueden formar juntos un cicloalquilo. Tales aminoacidos no naturales pueden estar en forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipeptido de aminoacidos no naturales, polfmero, polisacarido, o un polinucleotido y opcionalmente modificado despues de la traduccion.
Ademas, se incluyen los siguientes aminoacidos que tienen la estructura de Formula (XXXI-B):
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en donde: A es opcional y cuando esta presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo protector de amino, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido; y R2 es OH, un grupo protector de ester, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido; n es 0, 1, 2, 3, 4 o 5; y cada R8 y R9 en cada grupo CR8R9 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, alcoxi, alquilamina, halogeno, alquilo, arilo o cualquier R8 y R9 pueden formar juntos =O o un cicloalquilo, o cualquiera de los grupos R8 adyacentes pueden formar juntos un cicloalquilo. Tales aminoacidos no naturales pueden estar en forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipeptido de aminoacidos no naturales, polfmero, polisacarido, o un polinucleotido y opcionalmente modificado despues de la traduccion.
Ademas, se incluyen los siguientes aminoacidos que tienen la estructura de Formula (XXXII):
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en donde: A es opcional y cuando esta presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo protector de amino, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido; y R2 es OH, un grupo protector de ester, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido; Xi es C, S, o S(O); y L es alquileno, alquileno sustituido, N(R')(alquileno) o N(R')(alquileno sustituido), donde R' es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido. Tales aminoacidos no naturales pueden estar en forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipeptido de aminoacidos no naturales, polfmero, polisacarido, o un polinucleotido y opcionalmente modificado despues de la traduccion.
Ademas, se incluyen los siguientes aminoacidos que tienen la estructura de Formula (XXXII-A):
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en donde: A es opcional y cuando esta presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo protector de amino, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido; y R2 es OH, un grupo protector de ester, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido; L es alquileno, alquileno sustituido, N(R')(alquileno) o N(R')(alquileno sustituido), donde R' es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido. Tales aminoacidos no naturales pueden estar en forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipeptido de aminoacidos no naturales, polfmero, polisacarido, o un polinucleotido y opcionalmente modificado despues de la traduccion.
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en donde: A es opcional y cuando esta presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo protector de amino, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido; y R2 es OH, un grupo protector de ester, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido; L es alquileno, alquileno sustituido, N(R')(alquileno) o N(R')(alquileno sustituido), donde R' es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido. Tales aminoacidos no naturales pueden estar en forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipeptido de aminoacidos no naturales, polfmero, polisacarido, o un polinucleotido y opcionalmente modificado despues de la traduccion.
Ademas, se incluyen aminoacidos que tienen la estructura de Formula (XXXX):
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en donde: A es opcional y cuando esta presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido;
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<b)
(ap k4
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en donde (a) indica union al grupo A y (b) indica union a grupos carbonilo respectivos, R3 y R4 se seleccionan independientemente entre H, halogeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido, o R3 y R4 o dos grupos R3 o dos grupos R4 opcionalmente forman un cicloalquilo o un heterocicloalquilo; R es H, halogeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; T3 es un enlace, C(R)(R), O o S, y R es H, halogeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo protector de amino, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido; y R2 es OH, un grupo protector de ester, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido. Tales aminoacidos no naturales pueden estar en forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipeptido de
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aminoacidos no naturales, polfmero, polisacarido, o un polinucleotido y opcionalmente modificado despues de la traduccion.
Ademas, se incluyen aminoacidos que tienen la estructura de Formula (XXXXI):
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en donde:
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en donde (a) indica union al grupo A y (b) indica union a grupos carbonilo respectivos, R3 y R4 se seleccionan independientemente entre H, halogeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido, o R3 y R4 o dos grupos R3 o dos grupos R4 opcionalmente forman un cicloalquilo o un heterocicloalquilo; R es H, halogeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; T3 es un enlace, C(R)(R), O o S, y R es H, halogeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; R1 es H, un grupo protector de amino, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido; y R2 es OH, un grupo protector de ester, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido; cada Ra se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, halogeno, alquilo, alquilo sustituido, -N(R')2, - C(O)kR' en donde k es 1, 2 o 3, -C(O)N(R')2, -OR' y -S(O)kR', en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido. Tales aminoacidos no naturales pueden estar en forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipeptido de aminoacidos no naturales, polfmero, polisacarido, o un polinucleotido y opcionalmente modificado despues de la traduccion.
Ademas, se incluyen aminoacidos que tienen la estructura de Formula (XXXXII):
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en donde: R es H, halogeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; y T3 son O o S. Tales aminoacidos no naturales pueden estar en forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipeptido de aminoacidos no naturales, polfmero, polisacarido o un polinucleotido y opcionalmente modificados despues de la traduccion.
Ademas, se incluyen aminoacidos que tienen la estructura de Formula (XXXXIII):
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en donde: R es H, halogeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido. Ademas, se incluyen los siguientes aminoacidos que tienen estructuras de Formula (XXXXIII):
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Tales aminoacidos no naturales pueden estar en forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipeptido de aminoacidos no naturales, polfmero, polisacarido, o un polinucleotido y opcionalmente modificado despues de la traduccion.
Los aminoacidos no naturales que contienen un grupo hidroxilamina (tambien llamado aminooxi) permiten la reaccion con una variedad de grupos electrofflicos para formar conjugados (incluyendo, pero sin limitarse a, PEG u otros polfmeros solubles en agua). Al igual que las hidracinas, hidrazidas y semicarbazidas, la nucleofilicidad mejorada del grupo aminooxilo permite reaccionar de manera eficiente y selectiva con una variedad de moleculas que contienen grupos carbonilo o dicarbonilo, incluyendo, pero sin limitarse a, cetonas, aldehfdos u otros grupos funcionales con reactividad qufmica similar. Vease, por ejemplo, Shao, J. y Tam, J., J. Am. Chem. Soc. 117: 3893-3899 (1995); H. Hang y C. Bertozzi, Acc. Chem. Res. 34 (9): 727-736 (2001). Mientras que el resultado de la reaccion con un grupo hidracina es la hidrazona correspondiente, sin embargo, una oxima resulta generalmente de la reaccion de un grupo aminooxi con un grupo que contiene carbonilo o dicarbonilo tal como, a modo de ejemplo, cetonas, aldehfdos u otros grupos funcionales con reactividad qufmica similar.
Por lo tanto, en ciertas realizaciones de la presente invencion se describen aminoacidos no naturales con cadenas laterales que comprenden un grupo hidroxilamina, un grupo similar a hidroxilamina (que tiene reactividad similar a un grupo hidroxilamina y es estructuralmente similar a un grupo hidroxilamina), una hidroxilamina enmascarada (que puede convertirse facilmente en un grupo hidroxilamina), o un grupo hidroxilamina protegido (que tiene reactividad similar a un grupo hidroxilamina tras la desproteccion). Tales aminoacidos incluyen aminoacidos que tienen la estructura de Formula (XIV):
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en donde: A es opcional y cuando esta presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; B es opcional y cuando esta presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste en alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, -O-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S(O)k- en donde k es 1, 2 o 3, - S(O)k(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -NS(O)2-, -OS(o)2-, -C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, - c(s)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR'-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')CO-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, - C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R>N=N-, y -C(R')2-N(R')-N(R')-, donde cada R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido; K es -NR6R7 o -N=CR6R7; Ri es H, un grupo protector de amino, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido; y R2 es OH, un grupo protector de ester, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido; cada uno de R3 y R4 es independientemente H, halogeno, alquilo inferior o alquilo inferior sustituido, o R3 y R4 o dos grupos R3 forman opcionalmente un cicloalquilo o un heterocicloalquilo; cada uno de R6 y R7 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, oxido de polialquileno, oxido de polialquileno sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo y aralquilo sustituido, -C(O)R", -C(O)2R", -C(O)N(R")2, en donde cada R" es independientemente hidrogeno, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo o aralquilo sustituido; o R6 o R7 es L-X, donde X es seleccionado del grupo que consiste en un marcador; un colorante; un polfmero; un polfmero soluble en agua; un derivado de polietilenglicol; un fotoentrecruzador; un compuesto citotoxico; un farmaco; un marcador de afinidad; un marcador de fotoafinidad; un compuesto reactivo; una resina; una segunda protefna o polipeptido o analogo de polipeptido; un anticuerpo o fragmento de anticuerpo; un quelante metalico; un cofactor; un acido graso; un carbohidrato; un polinucleotido; un ADN; un ARN; un polinucleotido antisentido; un sacarido, un dendrfmero soluble en agua, una ciclodextrina, un biomaterial; una nanopartfcula; un marcador de espfn; un fluoroforo, una unidad estructural que contiene metal; una unidad estructural radioactiva; un nuevo grupo funcional; un grupo que coopera covalentemente o no covalentemente con otras moleculas; una unidad estructural accionada por luz; una unidad estructural fotoisomerizable; biotina; un analogo de biotina; una unidad estructural que incorpora un atomo pesado; un grupo qufmicamente escindible; un grupo fotoescindible; una cadena lateral alargada; un azucar unido a carbono; un agente redox activo; un amino tioacido; una fraccion toxica; una unidad estructural marcada isotopicamente; una sonda bioffsica; un grupo fosforescente; un grupo quimioluminiscente; un grupo con densidad de electrones; un grupo magnetico; un grupo de intercalacion; un cromoforo; un agente de transferencia de energfa; un agente biologicamente activo; un marcador detectable; y cualquier combinacion de los mismos; y L es opcional, y cuando esta presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste en alquileno, alquileno sustituido, alquenileno, alquenileno sustituido, -O- , -O-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S(O)k- en donde k es 1, 2, o 3, - S(O)k(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-,-C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR'-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')CO-(alquileno o alquileno sustituido)-, - N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N-, y -C(R')2-N(R')-N(R')-, donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido. Tales aminoacidos no naturales pueden estar en forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipeptido de aminoacidos no naturales, polfmero, polisacarido, o un polinucleotido y opcionalmente modificado despues de la traduccion.
En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (XIV), A es fenileno o fenileno sustituido. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (XIV), B es -(alquileno o alquileno sustituido)-, -O-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)- o -C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (XIV), B es -O(CH2)2-, -S(CH2)2-, -NH(CH2)2-, -cO(CH2)2-, o- (CH2)n-, donde n es 1 a 4. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (XIV), Ri es H, terc-butiloxicarbonilo (Boc), 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc), N-acetilo, tetrafluoroacetilo (TFA) o benciloxicarbonilo (Cbz ). En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (XIV), Ri es una resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido. En ciertas realizaciones de compuestos de formula (XIV), en donde R2 es OH, O-metilo, O-etilo u O-t-butilo. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (XIV), R2 es una resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (XIV), R2 es un polinucleotido. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (XIV), R2 es acido ribonucleico (ARN). En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (XIV), R2 es ARNt. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (XIV), el ARNt reconoce especfficamente un codon seleccionado del grupo que consiste en un codon ambar, codon ocre, codon opalo, codon unico, codon raro, codon no natural, codon de cinco bases , y un codon de cuatro bases. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (XIV), R2 es un ARNt supresor. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (XIV), cada R6 y R7 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo, alquilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, oxido de polialquileno, oxido de polialquileno sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo y aralquilo sustituido. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (XIV), cada uno de R6 y R7 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, metilo, fenilo y - [(alquileno o alquileno sustituido)-O-(hidrogeno, alquilo o alquilo sustituido)]X, en donde x es de 1-50. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (XIV), K es -NR6R7.
En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (XIV), X es un agente biologicamente activo seleccionado del grupo que consiste en un peptido, protefna, enzima, anticuerpo, farmaco, colorante, lfpido, nucleosidos, oligonucleotido, celula, virus, liposoma, micropartfculas y micelas. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (XIV), X es un farmaco seleccionado del grupo que consiste en un antibiotico, fungicida, agente antiviral, agente antiinflamatorio, agente 5 antitumoral, agente cardiovascular, agente antiansiolftico, hormona , factor de crecimiento y agente esteroideo. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (XIV), X es una enzima seleccionada del grupo que consiste en peroxidasa de rabano picante, fosfatasa alcalina, p-galactosidasa y glucosa oxidasa. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (XIV), X es un marcador detectable seleccionado del grupo que consiste en una unidad estructural fluorescente, fosforescente, quimioluminiscente, quelante, densidad electronica denso, magnetica, 10 intercalante, radiactiva, cromofora y de transferencia de energfa.
En ciertas realizaciones, los compuestos de formula (XIV) son estables en solucion acuosa durante al menos 1 mes bajo condiciones ligeramente acidas. En ciertas realizaciones, los compuestos de formula (XIV) son estables durante al menos 2 semanas bajo condiciones ligeramente acidas. En ciertas realizaciones, los compuestos de Formula (XIV) son estables al menos durante 5 dfas en condiciones ligeramente acidas. En ciertas realizaciones, tales condiciones acidas 15 son de pH 2 a 8.
Tales aminoacidos incluyen aminoacidos que tienen la estructura de Formula (XV):
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en donde A es opcional, y cuando esta presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, 20 heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; B es opcional y cuando esta presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste en alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, -O-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S(O)k- en donde k es 1, 2, o 3, - 25 S(O)k(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-,-NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -
c(s)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR'-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')CO-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, - C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R>N=N-, y -C(R>N(R')-N(R')-, en donde cada R' es independientemente H, alquilo, 30 o alquilo sustituido; Ri es H, un grupo protector de amino, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido; y R2 es OH, un grupo protector de ester, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido; cada uno de R3 y R4 es independientemente H, halogeno, alquilo inferior o alquilo inferior sustituido, o R3 y R4 o dos grupos R3 forman opcionalmente un cicloalquilo o un heterocicloalquilo. Tales aminoacidos no naturales pueden estar en forma de una sal, o pueden estar incorporados en un polipeptido de aminoacidos no naturales, polfmero, polisacarido, o un polinucleotido 35 y opcionalmente modificado despues de la traduccion.
Un aminoacido representativo, no limitante, tiene la siguiente estructura:
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Tal aminoacido no natural puede estar en forma de una sal, o puede ser incorporado en un polipeptido de aminoacidos no naturales, polfmero, polisacarido, o un polinucleotido y opcionalmente modificados despues de la traduccion.
40 Los aminoacidos no naturales que contienen un grupo oxima permiten la reaccion con una variedad de reactivos que contienen ciertos grupos reactivos carbonilo o dicarbonilo (incluyendo, pero sin limitarse a cetonas, aldehfdos u otros grupos con reactividad similar) para formar nuevos aminoacidos no naturales que comprenden un nuevo grupo oxima. Tal reaccion de intercambio de oxima permite la introduccion adicional de una funcion de polipeptidos de aminoacidos no naturales. Ademas, los aminoacidos no naturales originales que contienen un grupo oxima pueden ser utiles por
45 derecho propio siempre y cuando el enlace oxima sea estable en las condiciones necesarias para incorporar el aminoacido en un polipeptido (por ejemplo, los metodos in vivo, in vitro y de sfntesis qufmica descritos en la presente memoria).
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Por lo tanto, en ciertas realizaciones se describen en el presente documento aminoacidos no naturales con cadenas laterales que comprenden un grupo oxima, un grupo similar a oxima (que tiene reactividad similar a un grupo oxima y es estructuralmente similar a un grupo oxima), un grupo oxima enmascarado (que puede ser facilmente convertido en un grupo oxima), o un grupo oxima protegido (que tiene reactividad similar a un grupo oxima despues de la desproteccion). Tales aminoacidos incluyen aminoacidos que tienen la estructura de Formula (XI):
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en donde: A es opcional y cuando esta presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; B es opcional y cuando esta presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste en alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, -O-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S(O)k- en donde k es 1, 2, o 3, - S(O)k(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, - c(s)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR'-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')CO-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-,-N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, - C(R')=NN(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N-, y -C(R')2-N(R')-N(R')-, en donde cada R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo protector de amino, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido; y R2 es OH, un grupo protector de ester, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido; cada uno de R3 y R4 es independientemente H, halogeno, alquilo inferior o alquilo inferior sustituido, o R3 y R4 o dos R3 forman opcionalmente un cicloalquilo o un heterocicloalquilo; R5 es H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, alquilalcoxi, alquilalcoxi sustituido, oxido de polialquileno, oxido de polialquileno sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo, aralquilo sustituido, -(alquileno o alquileno sustituido)-ON(R")2, - (alquileno o alquileno sustituido)-C(O)SR", -(alquileno o alquileno sustituido)-S-(arilo o arilo sustituido ), -C(O)R”, -C(O) 2R” o -C(O)N(R'')2, en donde cada R” es independientemente hidrogeno, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo o aralquilo sustituido; o R5 es L-X, en donde X es seleccionado del grupo que consiste en un marcador; un colorante; un polfmero; un polfmero soluble en agua; un derivado de polietilenglicol; un fotoentrecruzador; un compuesto citotoxico; un farmaco; un marcador de afinidad; un marcador de fotoafinidad; un compuesto reactivo; una resina; una segunda protefna o polipeptido o analogo de polipeptido; un anticuerpo o fragmento de anticuerpo; un quelante metalico; un cofactor; un acido graso; un carbohidrato; un polinucleotido; un ADN; un ARN; un polinucleotido antisentido; un sacarido, un dendrfmero soluble en agua, una ciclodextrina, un biomaterial; una nanopartfcula; un marcador de espfn; un fluoroforo, una unidad estructural que contiene metal; una unidad estructural radioactiva; un nuevo grupo funcional; un grupo que interactua covalente o no covalentemente con otras moleculas; una unidad estructural captada por luz; una unidad estructural fotoisomerizable; biotina; un analogo de biotina; una unidad estructural que incorpora un atomo pesado; un grupo qufmicamente escindible; un grupo fotoescindible; una cadena lateral alargada; un azucar enlazado a carbono; un agente redox activo; un amino tioacido; una unidad estructural toxica; una unidad estructural marcada isotopicamente; una sonda bioffsica; un grupo fosforescente; un grupo quimioluminiscente; un grupo electronicamente denso; un grupo magnetico; un grupo de intercalacion; un cromoforo; un agente de transferencia de energfa; un agente biologicamente activo; un marcador detectable; y cualquier combinacion de los mismos; y L es opcional, y cuando esta presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste en alquileno, alquileno sustituido, alquenileno, alquenileno sustituido, -O- , -O-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S(O)k- en donde k es 1, 2, o 3, - S(O)k(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR'-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')CO-(alquileno o alquileno sustituido)-, - N(R')C(O)O-, -(alquileno o alquileno sustituido)-ON=CR'-, -(alquileno o alquileno sustituido)-C(O)NR'-(alquileno o alquileno sustituido)-, -(alquileno o alquileno sustituido)-S(O)k-(alquileno o alquileno sustituido)-S-, -(alquileno o alquileno sustituido)-S-S-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-,-C(R')=N- N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N-, y -C(R')2-N(R')-N(R')-, en donde cada R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido; con la condicion de que cuando A y B estan ausentes, R no es metilo. Tales aminoacidos no naturales pueden estar en forma de una sal, o pueden ser incorporados en un polipeptido de aminoacidos no naturales, polfmero, polisacarido, o un polinucleotido y modificados opcionalmente despues de la traduccion.
En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (XI), B es -O-(alquileno o alquileno sustituido)-. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (XI), B es -O(CH2)-. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (XI), R es alquilo C1-4. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (XI), R es -CH3. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (XI), Ri es H, terc-butiloxicarbonilo (Boc), 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc), N-acetilo,
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tetrafluoroacetilo (TFA) o benciloxicarbonilo (Cbz). En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (XI), Ri es una resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (XI), R2 es OH, O- metilo, O-etilo, u O-t-butilo. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (XI), R2 es una resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (XI), R2 es un polinucleotido. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (XI), R2 es acido ribonucleico (ARN). En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (XI), R2 es ARNt. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (XI), el ARNt reconoce especfficamente un codon selector. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (XI), el codon selector se selecciona del grupo que consiste en un codon ambar, codon ocre, codon opalo, un codon unico, un codon raro, un codon no natural, un codon de cinco bases y un codon de cuatro bases. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (XI), R2 es un ARNt supresor. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (XI), R5 es alquilalcoxi, alquilalcoxi sustituido, oxido de polialquileno, oxido de polialquileno sustituido, o -C(O)2R". En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (XI), R5 es -[(alquileno o alquileno sustituido)-O-(hidrogeno, alquilo o alquilo sustituido)]X, en donde x es de 1 a 50. En ciertas realizaciones de compuestos de Formula (XI), R5 es -(CH2CH2)-O-CH3 o -COOH.
En ciertas realizaciones, los compuestos de formula (XI) son estables en solucion acuosa durante al menos 1 mes bajo condiciones ligeramente acidas. En ciertas realizaciones, los compuestos de Formula (XI) son estables durante al menos 2 semanas bajo condiciones ligeramente acidas. En ciertas realizaciones, los compuesto de formula (XI) son estables durante al menos 5 dfas bajo condiciones ligeramente acidas. En ciertas realizaciones, tales condiciones acidas son pH 2 a 8.
Los aminoacidos de Formula (XI) incluyen aminoacidos que tienen la estructura de Formula (XII):
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en donde, B es opcional, y cuando esta presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste en alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, -O-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S-(alquileno o alquileno sustituido)-, - S(O)k- en donde k es 1, 2, o 3, -S(O)k(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR'-(alquileno o alquileno sustituido)-, - C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-,-CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, - N(R')CO-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)k-N(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, - N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N-, y -C(R')2-N(R')-N(R')-, en donde cada R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo protector de amino, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido; y R2 es OH, un grupo protector de ester, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido; R5 es H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, alquilalcoxi, alquilalcoxi sustituido, oxido de polialquileno, oxido de polialquileno sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo, aralquilo sustituido, -(alquileno o alquileno sustituido)-ON(R")2, -(alquileno o alquileno sustituido)-C(O)SR", -(alquileno o alquileno sustituido)-S-(arilo o arilo sustituido), -C(O)R", -C(O)2R" o -C(O)N(R")2, en donde cada R" es independientemente hidrogeno, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo o aralquilo sustituido; o R5 es L-X, en donde X es seleccionado del grupo que consiste en un marcador; un colorante; un polfmero; un polfmero soluble en agua; un derivado de polietilenglicol; un fotoentrecruzador; un compuesto citotoxico; un farmaco; un marcador de afinidad; un marcador de fotoafinidad; un compuesto reactivo; una resina; una segunda protefna o polipeptido o analogo de polipeptido; un anticuerpo o fragmento de anticuerpo; un quelante metalico; un cofactor; un acido graso; un carbohidrato; un polinucleotido; un ADN; un ARN; un polinucleotido antisentido; un sacarido, un dendrfmero soluble en agua, una ciclodextrina, un biomaterial; una nanopartfcula; un marcador de espfn; un fluoroforo, una unidad estructural que contiene metal; una unidad estructural radioactiva; un nuevo grupo funcional; un grupo que interactua covalente o no covalentemente con otras moleculas; una unidad estructural captada por luz; una unidad estructural fotoisomerizable; biotina; un analogo de biotina; una unidad estructural que incorpora un atomo pesado; un grupo qufmicamente escindible; un grupo fotoescindible; una cadena lateral alargada; un azucar enlazado a carbono; un agente redox activo; un amino tioacido; una unidad estructural toxica; una unidad estructural marcada isotopicamente; una sonda bioffsica; un grupo fosforescente; un grupo quimioluminiscente; un grupo electronicamente denso; un grupo magnetico; un grupo de intercalacion; un cromoforo; un agente de transferencia de energfa; un agente biologicamente activo; un marcador detectable; y cualquier combinacion de los mismos; y L es opcional, y cuando esta presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste en alquileno, alquileno sustituido, alquenileno, alquenileno sustituido, -O-, -O- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S(O)k- en donde k es 1, 2, o 3, - S(O)k(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR'-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')CO-(alquileno o alquileno sustituido)-, -
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N(R')C(O)O-, -(alquileno o alquileno sustituido)-ON=CR'-, -(alquileno o alquileno sustituido)-C(O)NR'-(alquileno o alquileno sustituido)-, -(alquileno o alquileno sustituido)-S(O)k-(alquileno o alquileno sustituido)-S-, -(alquileno o alquileno sustituido)-S-S-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-,-C(R')=N- N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N-, y -C(R')2-N(R')-N(R')-, en donde cada R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido. Tales aminoacidos no naturales pueden estar en forma de una sal, o pueden ser incorporados en un polipeptido de aminoacidos no naturales, polfmero, polisacarido, o un polinucleotido y modificados opcionalmente despues de la traduccion.
Tales aminoacidos incluyen aminoacidos que tienen la estructura de Formula (XIII):
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en donde R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; Ri es H, un grupo protector de amino, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido; y R2 es OH, un grupo protector de ester, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido; R5 es H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, alquilalcoxi, alquilalcoxi sustituido, oxido de polialquileno, oxido de polialquileno sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo, aralquilo sustituido, -(alquileno o alquileno sustituido)-ON(R")2, -(alquileno o alquileno sustituido)-C(O)SR", -(alquileno o alquileno sustituido)-S-(arilo o arilo sustituido), -C(O)R”, -C(O)2R” o -C(O)N(R”)2, en donde cada R” es independientemente hidrogeno, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo o aralquilo sustituido; o R5 es L-X, en donde X es seleccionado del grupo que consiste en un marcador; un colorante; un polfmero; un polfmero soluble en agua; un derivado de polietilenglicol; un fotoentrecruzador; un compuesto citotoxico; un farmaco; un marcador de afinidad; un marcador de fotoafinidad; un compuesto reactivo; una resina; una segunda protefna o polipeptido o analogo de polipeptido; un anticuerpo o fragmento de anticuerpo; un quelante metalico; un cofactor; un acido graso; un carbohidrato; un polinucleotido; un ADN; un ARN; un polinucleotido antisentido; un sacarido, un dendrfmero soluble en agua, una ciclodextrina, un biomaterial; una nanopartfcula; un marcador de espfn; un fluoroforo, una unidad estructural que contiene metal; una unidad estructural radioactiva; un nuevo grupo funcional; un grupo que interactua covalente o no covalentemente con otras moleculas; una unidad estructural captada por luz; una unidad estructural fotoisomerizable; biotina; un analogo de biotina; una unidad estructural que incorpora un atomo pesado; un grupo qufmicamente escindible; un grupo fotoescindible; una cadena lateral alargada; un azucar enlazado a carbono; un agente redox activo; un amino tioacido; una unidad estructural toxica; una unidad estructural marcada isotopicamente; una sonda bioffsica; un grupo fosforescente; un grupo quimioluminiscente; un grupo electronicamente denso; un grupo magnetico; un grupo de intercalacion; un cromoforo; un agente de transferencia de energfa; un agente biologicamente activo; un marcador detectable; y cualquier combinacion de los mismos; y L es opcional, y cuando esta presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste en alquileno, alquileno sustituido, alquenileno, alquenileno sustituido, -O-, -O-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(O)k- en donde k es 1, 2, o 3, -S(O)k(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, - C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR'-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CsN(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')CO-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')C(O)O-, -(alquileno o alquileno sustituido)- ON=CR'-, -(alquileno o alquileno sustituido)-C(O)NR'-(alquileno o alquileno sustituido)-, -(alquileno o alquileno sustituido)-S(O)k-(alquileno o alquileno sustituido)-S-, -(alquileno o alquileno sustituido)-S-S-, -S(O)kN(R')-, - N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-,-C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N-, y -C(R')2-N(R')-N(R')-, en donde cada R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido. Tales aminoacidos no naturales pueden estar en forma de una sal, o pueden ser incorporados en un polipeptido de aminoacidos no naturales, polfmero, polisacarido, o un polinucleotido y opcionalmente modificados despues de la traduccion.
Otros ejemplos no limitativos de tales aminoacidos incluyen aminoacidos que tienen las siguientes estructuras:
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10
15
20
25
30
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40
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Tales aminoacidos no naturales pueden estar en forma de una sal, o se pueden incorporar en un polipeptido de aminoacidos no naturales, polfmero, polisacarido, o un polinucleotido y opcionalmente modificado despues de la traduccion.
Ademas, dichos aminoacidos incluyen aminoacidos que tienen la estructura de Formula (XIV):
imagen64
en donde: A es opcional y cuando esta presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; B es opcional y cuando esta presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste en alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, -O-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S(O)k- en donde k es 1, 2, o 3, - S(O)k(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, - c(s)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR'-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')CO-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-,-N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, - C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N-, y -C(R')2-N(R')-N(R')-, en donde cada R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido; k es -NR6R7 o -N=CRaRy; Ri es H, un grupo protector de amino, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido; y R2 es OH, un grupo protector de ester, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido; cada uno de R3 y R4 es independientemente H, halogeno, alquilo inferior o alquilo inferior sustituido, o R3 y R4 o dos grupos R3 forman opcionalmente un cicloalquilo o heterocicloalquilo; cada uno de R6 y R7 se selecciona independientemente del grupo que consiste de H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, oxido de polialquileno, oxido de polialquileno sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo, y aralquilo sustituido, -C(O)R”, -C(O)2R'' o -C(O)N(R'')2, en donde cada R'' es independientemente hidrogeno, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo o aralquilo sustituido; o R6 o R7 es L-X, en donde X es seleccionado del grupo que consiste en un marcador; un colorante; un polfmero; un polfmero soluble en agua; un derivado de polietilenglicol; un fotoentrecruzador; un compuesto citotoxico; un farmaco; un marcador de afinidad; un marcador de fotoafinidad; un compuesto reactivo; una resina; una segunda protefna o polipeptido o analogo de polipeptido; un anticuerpo o fragmento de anticuerpo; un quelante metalico; un cofactor; un acido graso; un carbohidrato; un polinucleotido; un ADN; un ARN; un polinucleotido antisentido; un sacarido, un dendrfmero soluble en agua, una ciclodextrina, un biomaterial; una nanopartfcula; un marcador de espfn; un fluoroforo, una unidad estructural que contiene metal; una unidad estructural radioactiva; un nuevo grupo funcional; un grupo que interactua covalente o no covalentemente con otras moleculas; una unidad estructural captada por luz; una unidad estructural fotoisomerizable; biotina; un analogo de biotina; una unidad estructural que incorpora un atomo pesado; un grupo qufmicamente escindible; un grupo fotoescindible; una cadena lateral alargada; un azucar enlazado a carbono; un agente redox activo; un amino tioacido; una unidad estructural toxica; una unidad estructural marcada isotopicamente; una sonda bioffsica; un grupo fosforescente; un grupo quimioluminiscente; un grupo electronicamente denso; un grupo magnetico; un grupo de intercalacion; un cromoforo; un agente de transferencia de energfa; un agente biologicamente activo; un marcador detectable; y cualquier combinacion de los mismos; y L es opcional, y cuando esta presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste en alquileno, alquileno sustituido, alquenileno, alquenileno sustituido, -O-, -O- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S(O)k- en donde k es 1, 2, o 3, - S(O)k(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR'-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')CO-(alquileno o alquileno sustituido)-, -
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N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-,-C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N-, y -C(R')2-N(R')-N(R')-, en donde cada R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido. Tales aminoacidos no naturales pueden estar en forma de una sal, o pueden ser incorporados en un polipeptido de aminoacidos no naturales, polfmero, polisacarido, o un polinucleotido y modificados opcionalmente despues de la traduccion.
Tales aminoacidos incluyen ademas aminoacidos que tienen la estructura de Formula (XVI):
imagen65
en donde: A es opcional y cuando esta presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; B es opcional y cuando esta presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste en alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, -O-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S(O)k- en donde k es 1, 2, o 3, - S(O)k(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, - c(S)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR'-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')CO-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-,-N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, - C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N-, y -C(R')2-N(R')-N(R')-, en donde cada R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido; R1 es H, un grupo protector de amino, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido; y R2 es OH, un grupo protector de ester, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido; cada uno de R3 y R4 es independientemente H, halogeno, alquilo inferior o alquilo inferior sustituido, o R3 y R4 o dos grupos R3 forman opcionalmente un cicloalquilo o heterocicloalquilo; cada uno de R6 y R7 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, oxido de polialquileno, oxido de polialquileno sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo, y aralquilo sustituido, -C(O)R”, -C(O)2R'' o -C(O)N(R'')2, en donde cada R'' es independientemente hidrogeno, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo o aralquilo sustituido; o R6 o R7 es L-X, en donde X es seleccionado del grupo que consiste en un marcador; un colorante; un polfmero; un polfmero soluble en agua; un derivado de polietilenglicol; un fotoentrecruzador; un compuesto citotoxico; un farmaco; un marcador de afinidad; un marcador de fotoafinidad; un compuesto reactivo; una resina; una segunda protefna o polipeptido o analogo de polipeptido; un anticuerpo o fragmento de anticuerpo; un quelante metalico; un cofactor; un acido graso; un carbohidrato; un polinucleotido; un ADN; un ARN; un polinucleotido antisentido; un sacarido, un dendrfmero soluble en agua, una ciclodextrina, un biomaterial; una nanopartfcula; un marcador de espfn; un fluoroforo, una unidad estructural que contiene metal; una unidad estructural radioactiva; un nuevo grupo funcional; un grupo que interactua covalente o no covalentemente con otras moleculas; una unidad estructural captada por luz; una unidad estructural fotoisomerizable; biotina; un analogo de biotina; una unidad estructural que incorpora un atomo pesado; un grupo qufmicamente escindible; un grupo fotoescindible; una cadena lateral alargada; un azucar enlazado a carbono; un agente redox activo; un amino tioacido; una unidad estructural toxica; una unidad estructural marcada isotopicamente; una sonda bioffsica; un grupo fosforescente; un grupo quimioluminiscente; un grupo electronicamente denso; un grupo magnetico; un grupo de intercalacion; un cromoforo; un agente de transferencia de energfa; un agente biologicamente activo; un marcador detectable; y cualquier combinacion de los mismos; y L es opcional, y cuando esta presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste en alquileno, alquileno sustituido, alquenileno, alquenileno sustituido, -O-, -O- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S(O)k- en donde k es 1, 2, o 3, - S(O)k(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR'-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')CO-(alquileno o alquileno sustituido)-, - N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-,-C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N-, y -C(R')2-N(R')-N(R')-, en donde cada R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido. Tales aminoacidos no naturales pueden estar en forma de una sal, o pueden ser incorporados en un polipeptido de aminoacidos no naturales, polfmero, polisacarido, o un polinucleotido y modificados opcionalmente despues de la traduccion.
Ademas, tales aminoacidos incluyen aminoacidos que tienen la estructura de Formula (XVII):
5
10
15
20
25
30
35
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en donde: B es opcional, y cuando esta presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste en alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, -O-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S-(alquileno o alquileno sustituido)-, - S(O)k- en donde k es 1, 2, o 3, -S(O)k(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR'-(alquileno o alquileno sustituido)-, - C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CsN(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, - N(R')CO-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-,-
N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N-, y -C(R')2-N(R')-N(R')-, en donde cada R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido; R1 es H, un grupo protector de amino, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido; y R2 es Oh, un grupo protector de ester, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido; cada uno de R6 y R7 se selecciona independientemente del grupo que consiste de H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, oxido de polialquileno, oxido de polialquileno sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo, y aralquilo sustituido, -C(O)R”, -C(O)2R'' o -C(O)N(R'')2, en donde cada R'' es independientemente hidrogeno, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo o aralquilo sustituido; o R6 o R7 es L-X, en donde X es seleccionado del grupo que consiste en un marcador; un colorante; un polfmero; un polfmero soluble en agua; un derivado de polietilenglicol; un fotoentrecruzador; un compuesto citotoxico; un farmaco; un marcador de afinidad; un marcador de fotoafinidad; un compuesto reactivo; una resina; una segunda protefna o polipeptido o analogo de polipeptido; un anticuerpo o fragmento de anticuerpo; un quelante metalico; un cofactor; un acido graso; un carbohidrato; un polinucleotido; un ADN; un ARN; un polinucleotido antisentido; un sacarido, un dendrfmero soluble en agua, una ciclodextrina, un biomaterial; una nanopartfcula; un marcador de espfn; un fluoroforo, una unidad estructural que contiene metal; una unidad estructural radioactiva; un nuevo grupo funcional; un grupo que interactua covalente o no covalentemente con otras moleculas; una unidad estructural captada por luz; una unidad estructural fotoisomerizable; biotina; un analogo de biotina; una unidad estructural que incorpora un atomo pesado; un grupo qufmicamente escindible; un grupo fotoescindible; una cadena lateral alargada; un azucar enlazado a carbono; un agente redox activo; un amino tioacido; una unidad estructural toxica; una unidad estructural marcada isotopicamente; una sonda bioffsica; un grupo fosforescente; un grupo quimioluminiscente; un grupo electronicamente denso; un grupo magnetico; un grupo de intercalacion; un cromoforo; un agente de transferencia de energfa; un agente biologicamente activo; un marcador detectable; y cualquier combinacion de los mismos; y L es opcional, y cuando esta presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste en alquileno, alquileno sustituido, alquenileno, alquenileno sustituido, -O-, -O-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(O)k- en donde k es 1, 2, o 3, -S(O)k(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, - C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR'-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')CO-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, - N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-,-C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N-, y -C(R')2-N(R')- N(R')-, en donde cada R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido.
Ejemplos no limitantes de tales aminoacidos incluyen aminoacidos que tienen las siguientes estructuras:
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5
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15
20
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Tales aminoacidos no naturales pueden estar en forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipeptido de aminoacidos no naturales, polfmero, polisacarido, o un polinucleotido y opcionalmente modificado despues de la traduccion.
Adicionalmente, tales aminoacidos incluyen aminoacidos que tienen la estructura de Formula (XVIII):
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en donde: B es opcional, y cuando esta presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste en alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, -O-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S-(alquileno o alquileno sustituido)-, - S(O)k- en donde k es 1, 2, o 3, -S(O)k(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR'-(alquileno o alquileno sustituido)-, - C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CsN(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, - N(R')CO-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-,-
N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N-, y -C(R')2-N(R')-N(R')-, en donde cada R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido; Ri es H, un grupo protector de amino, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido; y R2 es Oh, un grupo protector de ester, resina, aminoacido, polipeptido o polinucleotido; cada uno de R6 y R7 se selecciona independientemente del grupo que consiste de H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, oxido de polialquileno, oxido de polialquileno sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo, y aralquilo sustituido, -C(O)R”, -C(O)2R'' o -C(O)N(R'')2, en donde cada R'' es independientemente hidrogeno, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, alcarilo, alcarilo sustituido, aralquilo o aralquilo sustituido; o R6 o R7 es L-X, en donde X es seleccionado del grupo que consiste en un marcador; un colorante; un polfmero; un polfmero soluble en agua; un derivado de polietilenglicol; un fotoentrecruzador; un compuesto citotoxico; un farmaco; un marcador de afinidad; un marcador de fotoafinidad; un compuesto reactivo; una resina; una segunda protefna o polipeptido o analogo de polipeptido; un anticuerpo o fragmento de anticuerpo; un quelante metalico; un cofactor; un acido graso; un carbohidrato; un polinucleotido; un ADN; un ARN; un polinucleotido antisentido; un sacarido, un dendrfmero soluble en agua, una ciclodextrina, un biomaterial; una nanopartfcula; un marcador de espfn; un fluoroforo, una unidad estructural que contiene metal; una unidad estructural radioactiva; un
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nuevo grupo funcional; un grupo que interactua covalente o no covalentemente con otras moleculas; una unidad estructural captada por luz; una unidad estructural fotoisomerizable; biotina; un analogo de biotina; una unidad estructural que incorpora un atomo pesado; un grupo qufmicamente escindible; un grupo fotoescindible; una cadena lateral alargada; un azucar enlazado a carbono; un agente redox activo; un amino tioacido; una unidad estructural toxica; una unidad estructural marcada isotopicamente; una sonda bioffsica; un grupo fosforescente; un grupo quimioluminiscente; un grupo electronicamente denso; un grupo magnetico; un grupo de intercalacion; un cromoforo; un agente de transferencia de energfa; un agente biologicamente activo; un marcador detectable; y cualquier combinacion de los mismos; y L es opcional, y cuando esta presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste en alquileno, alquileno sustituido, alquenileno, alquenileno sustituido, -O-, -O-(alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(O)k- en donde k es 1, 2, o 3, -S(O)k(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, - C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR'-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CsN(R')-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')CO-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, - N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-,-C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N-, y -C(R')2-N(R')- N(R')-, en donde cada R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido; y cada Ra se selecciona independientemente del grupo que consiste de H, halogeno, alquilo, alquilo sustituido, -N(R')2, -C(O)kR' donde k es 1, 2 o 3, -C(O)N(R')2, -OR' y -S(O)kR'; en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido y n es de 0 a 8. Tales aminoacidos no naturales pueden estar en forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipeptido de aminoacidos no naturales, polfmero, polisacarido, o un polinucleotido y opcionalmente modificado despues de la traduccion.
Ejemplos no limitantes de tales aminoacidos incluyen aminoacidos que tienen las siguientes estructuras:
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Tales aminoacidos no naturales pueden estar en forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipeptido de aminoacidos no naturales, polfmero, polisacarido, o un polinucleotido y opcionalmente modificado despues de la traduccion.
En ciertas realizaciones, el aminoacido no natural puede ser de acuerdo con la formula XIX:
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Formula XIX;
o una sal del mismo, en donde: D es -Ar-W3- o -Wi-Yi-C(O)-Y2-W2-; Ar es
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cada uno de Wi, W2 y W3 es independientemente un enlace sencillo o alquileno inferior; cada Xi es independientemente -NH-, -O-, o -S-; cada Yi es independientemente un enlace sencillo, -NH-, o -O-; cada Y2 es independientemente un enlace sencillo, -NH-, -O-, o un pirrolidinileno enlazado a N o enlazado en C; y uno de Zi, Z2 y Z3 es -N- y los otros de
Zi, Z2 y Z3 son independientemente -CH-. En ciertas realizaciones, el aminoacido no natural es de acuerdo con la formula XlXa:
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Formula XlXa;
en donde D esta definido en el contexto de la formula XIX. En ciertas realizaciones, el aminoacido no natural es de acuerdo con la formula XIXb:
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Formula XIXb;
o una sal del mismo, en donde W4 es alquileno C1-C10. En una realizacion adicional, W4 es alquileno C1-C5. En una 10 realizacion, W4 es alquileno C1-C3. En una realizacion, W4 es alquileno Ci. En realizaciones particulares, el aminoacido
no natural se selecciona del grupo que consiste en:
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o una sal del mismo. Tales aminoacidos no naturales pueden estar en forma de una sal, o pueden incorporarse en un polipeptido de aminoacidos no naturales, polfmero, polisacarido, o un polinucleotido y opcionalmente modificado despues de la traduccion.
Enlaces y cargas utiles
En ciertas realizaciones, la protefna de Fc modificada comprende un aminoacido no natural que tiene un grupo reactivo, como se ha descrito anteriormente. Un experto en la tecnica puede usar el grupo reactivo para unir la protefna de Fc modificada a cualquier entidad molecular capaz de formar un enlace covalente con el aminoacido no natural, directa o indirectamente a traves de un enlazador. De acuerdo con ello, se proporcionan aquf conjugados de una protefna de Fc modificada (tambien denominada conjugado de protefna de Fc), como se describe en la presente memoria, unida a una o mas unidades estructurales de carga util a traves de uno o mas aminoacidos no naturales en posiciones especfficas del sitio. La carga util puede estar unida directa o indirectamente a la protefna de Fc modificada, por ejemplo, a traves de un enlazador.
Se pueden utilizar cualesquiera de los metodos conocidos para unir moleculas terapeuticas y/o diagnosticas a un dominio o fragmento Fc para unir una carga util o un conjugado a una protefna de Fc modificada proporcionada en la presente memoria. Por ejemplo, los enfoques convencionales para la conjugacion qufmica con el dominio Fc de inmunoglobulina incluyen el acoplamiento al azar a aminas primarias naturales tal como lisina y el terminal amino o acidos carboxflicos tales como acido glutamico, acido aspartico y el terminal carboxilo. Alternativamente, el acoplamiento semiselectivo especffico del sitio se puede conseguir mediante conjugacion del extremo terminal N bajo condiciones apropiadas, o carbohidratos sometidos a derivacion como se encuentran en protefnas de Fc aisladas a partir de fuentes eucariotas, o mediante reduccion parcial y acoplamiento de residuos de cistefna nativos (por ejemplo, Kim y colaboradores, A pharmaceutical composition comprising an immunoglobulin Fc region as a carrier, documento WO 2005/047337). Se puede encontrar informacion adicional, por ejemplo, en la patente estadounidense No. 8.008.453 de Gegg y colaboradores, titulada "Modified Fc molecules"; patente estadounidense No. 7.887.809 de Garen y colaboradores, titulada "Neovascular-targeted immunoconjugates;" patente estadounidense No. 8.124.094 de Kim y colaboradores, titulada "Immunoglobulin Fc fragment modified by nonpeptide polymer and pharmaceutical composition comprising the same"; Carter, 2011, Experimental Cell Research, 317(9): 1261-1269; Santi y colaboradores, 2012, PNAS 109(16): 6211-6216; y Reichert 2011, MAbs. 3(1): 76-99.
Los enlazadores utiles incluyen los descritos en la seccion anterior. En ciertas realizaciones, el enlazador es cualquier enlazador divalente o multivalente conocido por los expertos en la tecnica. Generalmente, el enlazador es capaz de formar enlaces covalentes con la unidad estructural funcional R y el carbono alfa del aminoacido no natural. Los enlazadores divalentes utiles incluyen un enlace, alquileno, alquileno sustituido, heteroalquileno, heteroalquileno sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno y heteroarileno sustituido. En ciertas realizaciones, el enlazador es alquileno C1-10 o heteroalquileno C1-10.
La carga util molecular puede ser cualquier entidad molecular que un experto en la tecnica pueda desear para conjugar con la protefna de Fc. En ciertas realizaciones, la carga util es una unidad estructural terapeutica. En tales realizaciones, el conjugado de protefna de Fc puede usarse para dirigir la unidad estructural terapeutica a su objetivo molecular. En ciertas realizaciones, la carga util es una fraccion marcadora. En tales realizaciones, el conjugado de protefna de Fc puede usarse para detectar la union de la protefna de Fc a su objetivo. En ciertas realizaciones, la carga util es una unidad estructural citotoxica. En tales realizaciones, el conjugado puede usarse para dirigir la unidad estructural citotoxica a una celula enferma, por ejemplo, una celula cancerosa, para iniciar la destruccion o eliminacion de la celula. Los conjugados que comprenden otras cargas utiles moleculares evidentes para los expertos en la tecnica estan dentro del alcance de los conjugados descritos en la presente memoria.
En ciertas realizaciones, un conjugado puede tener una carga util seleccionada del grupo que consiste en un marcador, un colorante, un polfmero, un polfmero soluble en agua, polietilenglicol, un derivado de polietilenglicol, un fotoentrecruzador, un compuesto citotoxico, un farmaco, un marcador de afinidad, un marcador de fotoafinidad, un compuesto reactivo, una resina, una segunda protefna o polipeptido o analogo de polipeptido, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, un quelante metalico, un cofactor, un acido graso, un carbohidrato, un polinucleotido, un ADN, un ARN, un polinucleotido antisentido, un peptido, un dendrfmero soluble en agua, una ciclodextrina, un acido ribonucleico inhibidor, un biomaterial, una nanopartfcula, un marcador de espfn, un fluoroforo, una unidad estructural que contiene metal, una unidad estructural radioactiva, un nuevo grupo funcional, un grupo que interactua covalente o no covalentemente con otras moleculas, una unidad estructural captada por luz, una unidad estructural fotoisomerizable, biotina, un analogo de biotina, una unidad estructural que incorpora un atomo pesado, un grupo qufmicamente
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escindible, un grupo fotoescindible, una cadena lateral alargada, un azucar enlazado a carbono, un agente redox activo, un amino tioacido, una unidad estructural toxica, una unidad estructural marcada isotopicamente, una sonda bioffsica, un grupo fosforescente, un grupo quimioluminiscente, un grupo electronicamente denso, un grupo magnetico, un grupo de intercalacion, un cromoforo, un agente de transferencia de energfa, un agente biologicamente activo, un marcador detectable, una molecula pequena o cualquier combinacion de los mismos.
Las cargas utiles de farmaco incluyen cualquier farmaco citotoxico, citostatico o inmunomodulador. Las clases utiles de agentes citotoxicos o inmunomoduladores incluyen, por ejemplo, agentes antitubulina, auristatinas, ligandos de la ranura menor de ADN, inhibidores de replicacion de ADN, agentes alquilantes (por ejemplo, complejos de platino tales como cisplatino, mono(platino), bis(platino) y complejos de platino trinucleares y carboplatino), antraciclinas, antibioticos, antifolatos, antimetabolitos, inhibidores de calmodulina, sensibilizadores de quimioterapia, duocarmicinas, etoposidos, pirimidinas fluoradas, ionoforos, lexitropsinas, maitansinoides, nitrosoureas, platinoles, compuestos formadores de poros, antimetabolitos de purina, puromicinas, sensibilizadores de radiacion, rapamicinas, esteroides, taxanos, inhibidores de topoisomerasa, alcaloides de vinca o similares.
Los agentes citotoxicos o inmunomoduladores individuales incluyen, por ejemplo, un androgeno, antramicina (AMC), asparaginasa, 5-azacitidina, azatioprina, bleomicina, busulfan, butionina sulfoximina, caliqueamicina, derivados de caliqueamicina, camptotecina, carboplatino, carmustina (BSNU), CC-1065, clorambucilo, cisplatino, colchicina, ciclofosfamida, citarabina, citidina arabinosido, citocalasina B, dacarbazina, dactinomicina (anteriormente actinomicina), daunorrubicina, decarbazina, DM1, DM4, docetaxel, doxorrubicina, etoposido, estrogeno, 5-fluordeoxiuridina, 5- fluorouracilo, gemcitabina, gramicidina D, hidroxiurea, idarrubicina, irinotecano, lomustina (CCNU), maitansina, mecloretamina, melfalan, 6-mercaptopurina, metotrexato, mitramicina, mitomicina C, mitoxantrona, nitroimidazol, paclitaxel, palytoxina, plicamicina, procarbizina, rizoxina, estreptozotocina, teniposido, 6-tioguanina, tioTEPA, topotecano, vinblastina, vincristina, vinorelbina, VP-16 y VM-26.
En algunas realizaciones, los agentes citotoxicos adecuados incluyen, por ejemplo, aglutinantes de ranuras menores de ADN (por ejemplo, enediinas y lexitropsinas, un compuesto CBI; vease tambien la patente estadounidense No. 6.130.237), duocarmicinas, taxanos (por ejemplo, paclitaxel y docetaxel), puromicinas, alcaloides de la vinca, CC-1065, SN-38, topotecano, morfolino-doxorrubicina, rizoxina, cianomorfolinodoxorubicina, echinomicina, combretastatina, netropsina, epotilona A y B, estramustina, criptoficinas, cemadotina, maitansinoides, discodermolida, eleuterobina y mitoxantrona.
En algunas realizaciones, la carga util es uno o mas peptidos terapeuticos. Cualquier peptido que exhibe un efecto terapeutico se puede incluir como carga util a una protefna de Fc modificada. Los peptidos terapeuticos pueden ser de cualquier longitud; por ejemplo, un peptido terapeutico puede tener dos o mas aminoacidos, tres o mas aminoacidos, cuatro o mas aminoacidos, cinco o mas aminoacidos, seis o mas aminoacidos, siete o mas aminoacidos, ocho o mas aminoacidos, nueve o mas aminoacidos, 10 o mas aminoacidos, 11 o mas aminoacidos, 12 o mas aminoacidos, 13 o mas aminoacidos, 14 o mas aminoacidos, 15 o mas aminoacidos, 16 o mas aminoacidos, 17 o mas aminoacidos, 18 o

mas aminoacidos, 20 o mas aminoacidos, 22 o mas aminoacidos, 24 o mas aminoacidos, 26 o mas aminoacidos, 28 o

mas aminoacidos, 30 o mas aminoacidos, 32 o mas aminoacidos, 34 o mas aminoacidos, 36 o mas aminoacidos, 38 o

mas aminoacidos, 40 o mas aminoacidos, 42 o mas aminoacidos, 44 o mas aminoacidos, 46 o mas aminoacidos, 48 o

mas aminoacidos, 50 o mas aminoacidos, 55 o mas aminoacidos, 60 o mas aminoacidos, 65 o mas aminoacidos, 70 o

mas aminoacidos, 75 o mas aminoacidos, 80 o mas aminoacidos, 85 o mas aminoacidos, 90 o mas aminoacidos, 95 o
mas aminoacidos, 100 o mas aminoacidos, 110 o mas aminoacidos, 120 o mas aminoacidos, 130 o mas aminoacidos, 140 o mas aminoacidos, 150 o mas aminoacidos, 160 o mas aminoacidos, 170 o mas aminoacidos, 180 o mas aminoacidos, 190 o mas aminoacidos, 200 o mas aminoacidos, 220 o mas aminoacidos, 250 o mas aminoacidos, 275 o mas aminoacidos, 300 o mas aminoacidos, 350 o mas aminoacidos, 400 o mas aminoacidos, 450 o mas aminoacidos, o 500 o mas aminoacidos.
En algunas realizaciones, el peptido terapeutico es un fragmento de una protefna conocida. Por ejemplo, el peptido terapeutico puede tener dos o mas aminoacidos, tres o mas aminoacidos, cuatro o mas aminoacidos, cinco o mas aminoacidos, seis o mas aminoacidos, siete o mas aminoacidos, ocho o mas aminoacidos, nueve o mas aminoacidos, 10 o mas aminoacidos, 11 o mas aminoacidos, 12 o mas aminoacidos, 13 o mas aminoacidos, 14 o mas aminoacidos,
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20 o mas aminoacidos, 22 o mas aminoacidos, 24 o mas aminoacidos, 26 o mas aminoacidos, 28 o mas aminoacidos,
30 o mas aminoacidos, 32 o mas aminoacidos, 34 o mas aminoacidos, 36 o mas aminoacidos, 38 o mas aminoacidos,
40 o mas aminoacidos, 42 o mas aminoacidos, 44 o mas aminoacidos, 46 o mas aminoacidos, 48 o mas aminoacidos,
50 o mas aminoacidos, 55 o mas aminoacidos, 60 o mas aminoacidos, 65 o mas aminoacidos, 70 o mas aminoacidos,
75 o mas aminoacidos, 80 o mas aminoacidos, 85 o mas aminoacidos, 90 o mas aminoacidos, 95 o mas aminoacidos,
100 o mas aminoacidos, 110 o mas aminoacidos, 120 o mas aminoacidos, 130 o mas aminoacidos, 140 o mas aminoacidos, 150 o mas aminoacidos, 160 o mas aminoacidos, 170 o mas aminoacidos, 180 o mas aminoacidos, 190 o mas aminoacidos, 200 o mas aminoacidos, 220 o mas aminoacidos, 250 o mas aminoacidos, 275 o mas aminoacidos, 300 o mas aminoacidos, 350 o mas aminoacidos, 400 o mas aminoacidos, 450 o mas aminoacidos, o 500 o mas aminoacidos a partir de un fragmento contiguo de una protefna conocida.
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En algunas realizaciones, la secuencia de un peptido terapeutico se basa en una identidad de secuencia compartida o similar con una protefna conocida. En algunas realizaciones, el peptido terapeutico tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60% o mas con la secuencia de aminoacidos de un fragmento contiguo de una protefna conocida.
En algunas realizaciones, el peptido terapeutico tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70% o mas con la secuencia de aminoacidos de un fragmento contiguo de una protefna conocida.
En algunas realizaciones, el 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, de una protefna conocida.
En algunas realizaciones, el 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, de una protefna conocida.
En algunas realizaciones, el 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, una protefna conocida.
En algunas realizaciones, el peptido terapeutico puede incluir cualquiera de los residuos de aminoacidos no naturales o modificados conocidos en la tecnica. En realizaciones ventajosas, el aminoacido no natural o modificado facilita el enlace a la protefna de Fc modificada directamente a traves de un enlace covalente o indirectamente a traves de un enlazador.
Ejemplos de aminoacidos no naturales y analogos de aminoacidos que se pueden usar en los peptidos terapeuticos incluyen, pero no se limitan a, acido 2-aminobutfrico, acido 2-aminoisobutfrico, 3-(1-naftil)alanina, 3-(2-naftil)alanina, 3- metilhistidina, 3-piridilalanina, 4-clorofenilalanina, 4-fluorofenilalanina, 4-hidroxiprolina, 5-hidroxilisina, aloisoleucina, citrulina, deshidroalanina, homoarginina, homocistefna, homoserina, hidroxiprolina, N-acetilserina, N-formilmetionina, N- metilglicina, N-metilisoleucina, norleucina, N-alfa-metilarginina, O-fosfoserina, ornitina, fenilglicina, acido pipecolfnico, acido piperazico, piroglutamina, sarcosina, valanina, p-alanina y p-ciclohexilalanina. Otros aminoacidos utiles incluyen los descritos aquf.
En ciertas realizaciones, los peptidos terapeuticos pueden ser una citoquina, un factor de crecimiento, un factor para regular la replicacion, transcripcion o traduccion, o un homologo o analogo de los mismos. En formas de realizacion particulares, los ejemplos de peptidos terapeuticos incluyen, pero no se limitan a, adrenomedulina (AM), argatroban, angiopoyetina (Ang), factor de motilidad autocrino, protefnas morfogeneticas oseas (BMP), factor neurotrofico derivado del cerebro (BDNF), factor neurotrofico ciliar (CNTF), elafin, factor de crecimiento epidermico (EGF), eritropoyetina (EPO), exendina 3, exendina 4, factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor neurotrofico derivado de la lfnea de celulas gliales (GDNF), gonadotropina, factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulador de colonias de granulocitos y macrofagos (GM-CSF), factor 9 de diferenciacion del crecimiento (GDF9), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de crecimiento derivado del hepatoma (HDGF), factor de crecimiento similar a la insulina (IGF), interferon (IFN), factor estimulante de la migracion, miostatina (GDF-8), factor de crecimiento de los nervios (NGF) y otras neurotrofinas, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), prolactina, trombopoyetina (TPO), somatotropina, factor alfa de crecimiento transformador (TGF-a), factor beta de crecimiento transformador (TGF- p), factor alfa de necrosis tumoral (TNF-a), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), un regulador de la via de senalizacion wnt de su homologo, el factor de crecimiento placentario (P1GF) , La somatotropina bovina fetal (FBS), inhibidor de la protefna de apoptosis enlazado a X (XIAP), o una interleucina tal como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL- 7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-10 viral, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, e IL-18.
Ejemplos de peptidos terapeuticos adicionales y metodos para su elaboracion se describen, por ejemplo, en la publicacion de patente estadounidense No. 2007/0003518 de Atkinson y colaboradores; la publicacion de patente estadounidense No. 2010/0285003 de Eggink y colaboradores; la publicacion de patente estadounidense No. 2004/0067888 de Tovey y colaboradores; la publicacion de patente estadounidense No. 20050267028 de M. Virji; y la publicacion de patente estadounidense No. 2011/0166063 de Bossard y colaboradores.
Los conjugados de peptidos terapeuticos y protefnas de Fc modificadas pueden prepararse usando cualquier metodo conocido en la tecnica y descrito en la presente memoria. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un peptido terapeutico puede unirse a cualquier aminoacido no natural de una protefna de Fc como se describe en la presente memoria. En algunas realizaciones, un peptido terapeutico que contiene un aminoacido no natural puede estar enlazado a una protefna de Fc modificada en un aminoacido no natural de la protefna de Fc como se describe en la presente memoria. Ademas, en algunas realizaciones, las protefnas de Fc modificadas pueden acoplarse a cualquier otro grupo reactivo,
peptido terapeutico tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 71%, 77%, 78%, 79% o 80% o mas con la secuencia de aminoacidos de un fragmento contiguo
peptido terapeutico tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 81%, 87%, 88%, 89% o 90% o mas con la secuencia de aminoacidos de un fragmento contiguo
peptido terapeutico tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 91%, 97%, 98%, o 99% o mas con la secuencia de aminoacidos de un fragmento contiguo de
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por ejemplo, un grupo amino, carboxi o tiol, de reactivos o enlazadores de acoplamiento estandar de un peptido terapeutico.
En algunas realizaciones, se incluye una unidad estructural de direccionamiento en un conjugado de protefna de Fc para guiar la carga util terapeutica o de diagnostico a un lugar deseado dentro de un sujeto. El termino "unidad estructural de direccionamiento" se utiliza en la presente memoria para referirse a una estructura molecular que ayuda a los conjugados de la invencion a localizarse en un area objetivo, por ejemplo, ayudar a entrar en una celula o unirse a un receptor. Preferiblemente, la unidad estructural de direccionamiento comprende una vitamina, anticuerpo, antfgeno, receptor, ADN, ARN, antfgeno sialilo X de Lewis, acido hialuronico, azucares, lectinas especfficas de celulas, esteroide o derivado de esteroide, peptido RGD, ligando para un receptor de superficie celular, componente del suero, o molecula combinatoria dirigida contra diversos receptores intracelulares o extracelulares. La unidad estructural de direccionamiento puede comprender tambien un lfpido o un fosfolfpido. Ejemplos de fosfolfpidos incluyen, sin limitacion, fosfatidilcolinas, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, fosfatidilglicerol y fosfatidiletanolamina. Estos lfpidos pueden estar en forma de micelas o liposomas y similares. La unidad estructural de direccionamiento puede comprender ademas un marcador detectable o alternativamente un marcador detectable puede servir como una unidad estructural de direccionamiento. Cuando el conjugado tiene un grupo de direccionamiento que comprende un marcador detectable, se puede determinar la cantidad y/o distribucion/localizacion del polfmero y/o la unidad estructural (por ejemplo, agente activo) al que se acopla el polfmero usando un detector adecuado. Dichas etiquetas incluyen, sin limitacion, agentes fluorescentes, quimioluminiscentes, unidades estructurales utilizadas en la marcacion con enzimas, agentes colorimetricos (por ejemplo, colorantes), iones metalicos, unidades estructurales radiactivas, partfculas de oro, puntos cuanticos y similares.
En algunas realizaciones, la carga util es un agente antitubulina. Ejemplos de agentes antitubulina incluyen, pero no se limitan a, taxanos (por ejemplo, Taxol® (paclitaxel), Taxotere® (docetaxel)), T67 (Tularik) y alcaloides de la vinca (por ejemplo, vincristina, vinblastina, vindesina y vinorelbina). Otros agentes antitubulina incluyen, por ejemplo, derivados de bacatina, analogos de taxano, epotilonas (por ejemplo, epotilona A y B), nocodazol, colchicina y colcimida, estramustina, criptoficinas, cemadotina, maitansinoides, combretastatinas, discodermolida y eleuterobina.
En ciertas realizaciones, el agente citotoxico es un maitansinoide, otro grupo de agentes antitubulina. Por ejemplo, en formas de realizacion especfficas, el maitansinoide puede ser maitansina o DM-1 (ImmunoGen, Inc., vease tambien Chari y colaboradores, 1992, Cancer Res. 52: 127-131).
En algunas realizaciones, la carga util es una auristatina, tal como la auristatina E o un derivado de la misma. Por ejemplo, el derivado de auristatina E puede ser un ester formado entre auristatina E y un cetoacido. Por ejemplo, la auristatina E puede hacerse reaccionar con acido para-acetil benzoico o acido benzoilvalerico para producir AEB y AEVB, respectivamente. Otros derivados de auristatina tfpicos incluyen AFP, MMAF y MMAE. La sfntesis y la estructura de los derivados de auristatina se describen en las publicaciones de las solicitudes de patente estadounidenses Nos. 2003-0083263, 2005-0238649 y 2005-0009751; la publicacion de internacional de patente No. WO 04/010957, la publicacion de internacional de patente No. WO 02/088172, y la patente estadounidense No. 6.323.315; 6.239.104; 6.034.065; 5.780.588; 5.665.860; 5.663.149; 5.635.483; 5.599.902; 5.554.725; 5.530.097; 5.521.284; 5.504.191; 5.410.024; 5.138.036; 5.076.973; 4.986.988; 4.978.744; 4.879.278; 4.816.444; y 4.486.414.
En algunas realizaciones, la carga util comprende un radioisotopo. En algunas realizaciones, la carga util no comprende un radioisotopo. En algunas realizaciones, la carga util es radiactiva. En algunas realizaciones, la carga util no es radiactiva. En algunas realizaciones, la carga util comprende un marcador o etiqueta, creado a base de fluorescencia (por ejemplo, protefna fluorescente verde o roja), resonancia, luminiscencia (por ejemplo, bioluminiscencia, quimioluminiscencia, electroquimioluminiscencia, cristaloluminiscencia, producida durante la cristalizacion, electroluminiscencia, catodoluminiscencia, mecanoluminiscencia, triboluminiscencia, fractoluminiscencia, piezoluminiscencia, fluorescencia, fosforescencia, radioluminiscencia, el resultado del bombardeo mediante radiacion ionizante, sonoluminiscencia, termoluminiscencia), quelacion, metal (por ejemplo, las partfculas de oro), los puntos cuanticos, las unidades estructurales usadas en la marcacion enzimatica, agentes colorimetricos (por ejemplo, colorantes), o cualquiera de las interacciones de union molecular especffica.
En algunas realizaciones, cuando se usan para propositos de diagnostico o etiquetado, la carga util puede ser una unidad estructural no biologica. En algunas realizaciones, la carga util puede ser una unidad estructural no biologica unida a una unidad estructural biologica tal como un peptido, una protefna, un acido nucleico o un hfbrido de los mismos.
En algunas realizaciones, la carga util es un antimetabolito. El antimetabolito puede ser, por ejemplo, un antagonista de la purina (por ejemplo, azatioprina o micofenolato de mofetilo), un inhibidor de la dihidrofolato reductasa (por ejemplo metotrexato), aciclovir, ganciclovir, zidovudina, vidarabina, ribavarina, azidotimidina, citidina arabinosido, amantadina, didesoxiuridina, yododesoxiuridina, poscarnet o trifluridina.
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En otras realizaciones, la carga util es tacrolimus, ciclosporina, FU506 o rapamicina. En otras realizaciones, la carga util es un farmaco tal como aldesleuquina, alemtuzumab, alitretinofna, alopurinol, altretamina, amifostina, anastrozol, trioxido de arsenico, bexaroteno, calusterona, capecitabina, celecoxib, cladribina, darbepoetina alfa, denileuquina diftitox, dexrazoxano, propionato de dromostanolona, epirubicina, epoetina alfa, estramustina, exemestano, filgrastim, floxuridina, fludarabina, fulvestrant, gemcitabina, gemtuzumab ozogamicina (MYLOTARG), goserelina, idarubicina, ifosfamida, mesilato de imatinib, interferon alfa-2a, irinotecano, letrozol, leucovorina, levamisol, mecloretamina o mostaza de nitrogeno, megestrol, mesna, metotrexato, metoxaleno, mitomicina C, mitotano, fenpropionato de nandrolona, oprelvequina, oxaliplatino, pamidronato, pegademasa, pegaspargasa, pegfilgrastim, pentostatina, pipobromano, plicamicina, porffmero de sodio, procarbazina, quinacrina, rasburicasa, rituximab, sargramostim, estreptozocina, tamoxifeno, temozolomida, teniposido, testolactona, tioguanina, toremifeno, tositumomab, trastuzumab (HERCEPTINA), tretinoina, mostaza de uracilo, valrubicina, vinblastina, vincristina, vinorelbina o zoledronato.
En algunas realizaciones, la carga util es un agente inmunomodulador. El agente inmunomodulador puede ser, por ejemplo, ganciclovir, etanercept, tacrolimus, ciclosporina, rapamicina, ciclofosfamida, azatioprina, micofenolato de mofetilo o metotrexato. Alternativamente, el agente inmunomodulador puede ser, por ejemplo, un glucocorticoide (por ejemplo, cortisol o aldosterona) o un analogo de glucocorticoide (por ejemplo, prednisona o dexametasona).
En algunas realizaciones, el agente inmunomodulador es un agente antiinflamatorio, tal como derivados arilcarboxflicos, derivados que contienen pirazol, derivados de oxicam y derivados de acido nicotfnico. Las clases de agentes antiinflamatorios incluyen, por ejemplo, inhibidores de ciclooxigenasa, inhibidores de 5-lipoxigenasa y antagonistas de receptores de leucotrieno.
Los inhibidores adecuados de ciclooxigenasa incluyen acido meclofenamico, acido mefenamico, carprofeno, diclofenaco, diflunisal, fenbufeno, fenoprofeno, indometacina, ketoprofeno, nabumetona, sulindac, tenoxicam y tolmetina.
Los inhibidores de lipoxigenasa adecuados incluyen inhibidores redox (por ejemplo, derivados de catecol butano, acido nordihidroguaiaretico (NDGA), masoprocol, fenidona, lanopaleno, indazolinonas, nafazatrom, benzofuranol, alquilhidroxilamina), e inhibidores no redox (por ejemplo, hidroxitiazoles, metoxialquiltiazoles, benzopiranos y derivados de los mismos, metoxitetrahidropirano, acidos boswellicos y derivados acetilados de acidos boswellicos y acidos quinolinmetoxifenilaceticos sustituidos con radicales cicloalquilo), y precursores de inhibidores redox.
Otros inhibidores adecuados de lipoxigenasa incluyen antioxidantes (por ejemplo, fenoles, galato de propilo, flavonoides y/o sustratos naturales que contienen flavonoides, derivados hidroxilados de las flavonas, flavonol, dihidroquercetina, luteolina, galangina, orobol, derivados de chalcona, 4,2',4'-trihidroxialcona, orto-aminofenoles, N-hidroxiureas, benzofuranoles, ebselen y especies que aumentan la actividad de las selenoenzimas reductoras), agentes quelantes de hierro (por ejemplo, acidos hidroxamicos y derivados de los mismos, N-hidroxiureas, 2-bencil-1-naftol, catecoles, hidroxilaminas, carnosol trolox C, catecol, naftol, sulfasalazina, zileuton, acido 5-hidroxiantranilico y acidos 4-(omega- arilalquil)fenilalcanoicos), compuestos que contienen imidazol (por ejemplo, ketoconazol e itraconazol), fenotiazinas, y derivados de benzopirano.
Incluso otros inhibidores de lipoxigenasa adecuados incluyen inhibidores de eicosanoides (por ejemplo, acidos octadecatetraenoico, eicosatetraenoico, docosapentaenoico, eicosahexaenoico y docosahexaenoico y sus esteres, PGE1 (prostaglandina E1), PGA2 (prostaglandina A2), viprostol, 15-monohidroxieicosatetraenoico, 15-monohidroxi- eicosatrienoico y 15-monohidroxieicosapentaenoico, y leucotrienos B5, C5 y D5), compuestos que interfieren con los flujos de calcio, fenotiazinas, difenilbutilaminas, verapamilo, fucosido, curcumina, acido clorogenico, acido cafeico, acido 5,8,11,14-eicosatetraenoico (ETYA), hidroxifenilretinamida, lanopaleno, esculina, dietilcarbamazina, fenantrolina, baicalefna, proxicromilo, tioeteres, sulfuro de dialilo y sulfuro de di-(1-propenilo).
Los antagonistas del receptor de leucotrieno incluyen calcitriol, ontazolast, Bayer Bay-x-1005, Ciba-Geigy CGS-25019C, ebselen, Leo Dinamarca ETH-615, Lilly LY-293111, Ono ONO-4057, Terumo TMK-688, Boehringer lngelheim Bl-RM- 270, Lilly LY 213024, Lilly LY 264086, Lilly LY 292728, ONO LB457, Pfizer 105696, Perdue Frederick PF 10042, Rhone- Poulenc Rorer RP 66153, SmithKline Beecham SB-201146, SmithKline Beecham SB-201993, SmithKline Beecham SB- 209247, Searle SC-53228, Sumitamo SM 15178, American Home Products WAY 121006, Bayer Bay-o-8276, Warner- Lambert Cl-987, Warner-Lambert Cl-987BPC-15LY 223982, Lilly LY 233569, Lilly LY-255283, MacroNex MNX-160, Merck y Co. MK-591, Merck y Co. MK-886, Ono ONO-LB-448, Purdue Frederick PF-5901, Rhone-Poulenc Rorer RG14893, Rhone-Poulenc Rorer RP 66364, Rhone-Poulenc Rorer RP 69698, Shionoogi S-2474, Searle SC-41930, Searle SC-50505, Searle SC-51146, Searle SC-52798, SmithKline Beecham SK&F-104493, Leo Dinamarca SR-2566, Tanabe T-757 y Teijin TEl - 1338.
Otras cargas utiles de farmacos incluyen compuestos qufmicos utiles en el tratamiento del cancer. Ejemplos de agentes quimioterapeuticos incluyen Erlotinib (TARCEVA®, Genentech/OSl Pharm.), Bortezomib (VELCADE®, Millennium Pharm.), Fulvestrant (FASLODEX®, AstraZeneca), Sutent (SU11248, Pfizer), Letrozol (FEMARA®, Novartis), mesilato de imatinib (GLEEVEC®, Novartis), PTK787/ZK 222584 (Novartis), Oxaliplatino (Eloxatin®, Sanofi), 5-FU (5-
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fluorouracilo), Leucovorina, Rapamicina (Sirolimus, RAPAMUNE®, Wyeth), Lapatinib, GSK572016, Glaxo Smith Kline), Lonafarnib (SCH 66336), Sorafenib (BAY43-9006, Bayer Labs) y Gefitinib (IRESSA®, AstraZeneca), AG1478, AG1571 (SU 5271, Sugen), agentes alquilantes tales como tiotepa y CYTOXAN ® ciclofosfamida; sulfonatos de alquilo tales como busulfan, improsulfan y piposulfan; aziridinas tales como benzodepa, carboquona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilmelaminas que incluyen altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilmelamina; acetogeninas (especialmente bullatacina y bullatacinona); una camptotecina (incluyendo el analogo sintetico topotecano); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluyendo sus analogos sinteticos adozelesina, carzelesina y bizelesina); criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluyendo los analogos sinteticos, KW-2189 y CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictiina; espongistatina; mostazas de nitrogeno tales como clorambucilo, clomafazina, clorofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de oxido de mecloretamina, melfalan, novembicina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimustina; antibioticos tales como los antibioticos de enedina (por ejemplo, calicheamicina, especialmente calicheamicina gammall y calicheamicina omegall (Angew Chem. Int. Ed. Engl. (1994) 33: 183-186), dinemicina, incluyendo la dinemicina A; bisfosfonatos tales como clodronato; una esperamicina; asf como cromoforo de neocarcinostatina y cromoforos relacionados de antibioticos de la cromoprotefna enedina), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carubicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L- noreleucina, ADRIAMYCIN® (doxorubicina), morfolino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino- doxorubicina y desoxidoxorrubicina), epirubicina, esorrubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, acido micofenolico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, porfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); analogos de acido folico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; analogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamniprina, tioguanina; analogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; androgenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-suprarrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecimiento de acido folico tal como acido frolfnico; aceglatona; glucosido de aldofosfamida; acido aminolevulfnico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatrexato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elformitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglucido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidainina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona; acido podofilfnico; 2-etilhidrazida; procarbazina; complejo polisacarido PSK® (JHS Natural Products, Eugene, Oregon); razoxano; rizoxina; sizofurano; espirogermanio; acido tenuazonico; triaziquona; 2,2',2''-triclorotrimetilamina, tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; mannomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitocina, arabinosido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa, por ejemplo, TAXOL® (paclitaxel; Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ), ABRAXANE® (libre de cremoforo), formulaciones de nanopartfculas modificadas con albumina de paclitaxel (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, I11), y TAXOTERE® (docetaxel, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Francia), clorambucilo, GEMZAR® (gemcitabina), 6- tioguanina, mercaptopurina, metotrexato, analogos de platino tales como cisplatino y carboplatino, vinblastina, etoposido (VP-16); Ifosfamida, mitoxantrona, vincristina, NAVELBINE® (vinorelbina), novantrona, teniposido, edatrexato, daunomicina, aminopterina, capecitabina (XELODA®), ibandronato, CPT-11, inhibidor de topoisomerasa RFS 2000, difluorometilornitina (DMFO), retinoides tales como acido retinoico; y sales, acidos y derivados farmaceuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.
Otras cargas utiles incluyen: (i) agentes antihormonales que actuan para regular o inhibir la accion hormonal sobre tumores tales como antiestrogenos y moduladores selectivos de receptores de estrogenos (SERM), incluyendo, por ejemplo, tamoxifeno (incluyendo NOLVADEX®; citrato de tamoxifeno), raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona y FARESTON® (citrato de toremifina); (ii) inhibidores de la aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, que regula la produccion de estrogenos en las glandulas suprarrenales, como por ejemplo 4(5)-imidazoles, aminoglutetimida, MEGASE® (acetato de megestrol), AROMASIN® (exemestano, Pfizer), formestanie, fadrozol, RIVISOR® (vorozol), FEMARA® (letrozol, Novartis) y ARIMIDEX® (anastrozol, AstraZeneca); (iii) antiandrogenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida y goserelina; al igual que la troxacitabina (un analogo de 1,3-dioxolano nucleosido citosina); (iv) inhibidores de protefna quinasa; (v) inhibidores de la quinasa lipfdica; (vi) oligonucleotidos antisentido, particularmente aquellos que inhiben la expresion de genes en rutas de senalizacion implicadas en proliferacion celular aberrante, tales como, por ejemplo, PKC-alfa, Ralf y H-Ras; (vii) ribozimas tales como inhibidores de la expresion de VEGF (por ejemplo, ANGIOZYME®) e inhibidores de la expresion de HER2; (viii) vacunas tales como vacunas de terapia genica, por ejemplo, ALLOVECTIN®, LEUVECTIN® y VAXID®; PROLEUKIN® rIL-2; un inhibidor de topoisomerasa 1 tal como LURTOTECAN®; ABARELIX® rmRH; (ix) agentes antiangiogenicos tales como bevacizumab (AVASTIN®, Genentech); y (x) sales, acidos y derivados farmaceuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. Otros agentes antiangiogenicos incluyen inhibidores de la MMP-2 (metaloproteinasa 2 de matriz), inhibidores de la MMP-9 (metaloproteinasa 9 de matriz), inhibidores de la COX-II (ciclooxigenasa II) e inhibidores de la tirosina quinasa del receptor de VEGF. Ejemplos de tales inhibidores de metaloproteinasas de matriz utiles que se pueden usar en combinacion con los presentes compuestos/composiciones se describen en los documentos WO 96/33172, WO 96/27583, EP 818442, EP 1004578, WO 98/07697, WO 98/03516, WO 98/34918, WO 98/34915, WO
98/33768, WO 98/30566, EP 606.046, EP 931.788, WO 90/05719, WO 99/52910, WO 99/52889, WO 99/29667, WO
99/07675, EP 945864, la patente estadounidense No. 5.863.949, la patente estadounidense No. 5.861.510 y el
documento EP 780.386. Ejemplos de inhibidores de la tirosina quinasa del receptor de VEGF incluyen 4-(4-bromo-2-
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fluoroanilino)-6-metoxi-7-(1-metilpiperidin-4-ilmetoxi)quinazolina (ZD6474, Ejemplo 2 en el documento WO 01/32651), 4- (4-fluoro-2-metilindol-5-iloxi)-6-metoxi-7-(3-pirrolidin-1-ilpropoxi)-quinazolina (AZD2171, Ejemplo 240 en el documento WO 00/47212), vatalanib (PTK787 , WO 98/35985) y SU11248 (sunitinib, WO 01/60814), y compuestos tales como los descritos en las publicaciones PCT Nos. WO 97/22596, WO 97/30035, WO 97/32856 y WO 98/13354).
En ciertas realizaciones, la carga util es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. En ciertas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de carga util puede ser codificado por cualquiera de los genes de inmunoglobulina reconocidos por los expertos en la tecnica. Los genes de la inmunoglobulina incluyen, pero no se limitan a, los genes de la region constante k, A, a, y (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4), 6, £ y p, asf como los genes de la region variable de la inmunoglobulina. El termino incluye anticuerpos de longitud completa y fragmentos de anticuerpo reconocidos por los expertos en la tecnica, y variantes de los mismos. Ejemplos de fragmentos incluyen pero no se limitan a Fv, Fc, Fab y (Fab')2, Fv de cadena sencilla (scFv), diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, anticuerpos hfbridos bifuncionales, CDR1, CDR2, CDR3, combinaciones de CDR, regiones variables, regiones marco, regiones constantes y similares.
En ciertas realizaciones, la carga util puede ser uno o mas polfmeros solubles en agua. Una amplia variedad de polfmeros macromoleculares y otras moleculas pueden estar enlazadas a polipeptidos de union a antfgenos de la presente invencion para modular las propiedades biologicas del anticuerpo, y/o proporcionar nuevas propiedades biologicas al anticuerpo. Estos polfmeros macromoleculares pueden estar enlazados al anticuerpo a traves de un aminoacido naturalmente codificado, a traves de un aminoacido no codificado naturalmente, o cualquier sustituyente funcional de un aminoacido natural o no natural, o cualquier sustituyente o grupo funcional anadido a un aminoacido natural o no natural. El peso molecular del polfmero puede ser de un amplio intervalo, incluyendo pero no limitado a, entre aproximadamente 100 Da y aproximadamente 100.000 Da o mas.
El polfmero seleccionado puede ser soluble en agua de modo que la protefna a la que esta unido no precipite en un medio acuoso, tal como un entorno fisiologico. El polfmero puede ser ramificado o no ramificado. Preferiblemente, para el uso terapeutico de la preparacion del producto final, el polfmero sera farmaceuticamente aceptable.
La proporcion de moleculas de polietilenglicol respecto a las moleculas de anticuerpo variara, al igual que sus concentraciones en la mezcla de reaccion. En general, la relacion optima (en terminos de eficacia de la reaccion en el sentido de que existe un exceso mfnimo de protefna o polfmero sin reaccionar) puede determinarse por el peso molecular del polietilenglicol seleccionado y por el numero de grupos reactivos disponibles. En cuanto al peso molecular, tfpicamente, cuanto mayor sea el peso molecular del polfmero, menor sera el numero de moleculas de polfmero que se pueden unir a la protefna. De forma similar, la ramificacion del polfmero debe tenerse en cuenta al optimizar estos parametros. Generalmente, cuanto mas alto sea el peso molecular (o mas ramificaciones) mayor sera la relacion polfmero : protefna.
El polfmero soluble en agua puede ser cualquier forma estructural incluyendo, pero sin limitarse a, lineal, bifurcada o ramificada. Tfpicamente, el polfmero soluble en agua es un poli(alquilenglicol), tal como poli(etilenglicol) (PEG), pero tambien pueden emplearse otros polfmeros solubles en agua. A modo de ejemplo, PEG se utiliza para describir ciertas realizaciones de esta invencion.
El PEG es un polfmero soluble en agua bien conocido que esta disponible comercialmente o se puede preparar por polimerizacion de apertura de anillo de etilenglicol de acuerdo con metodos bien conocidos en la tecnica (Sandler y Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, New York, Vol. 3, paginas 138-161). El termino "PEG" se utiliza ampliamente para abarcar cualquier molecula de polietilenglicol, sin tener en cuenta el tamano o la modificacion en un extremo del PEG, y se puede representar como unido al anticuerpo por la formula: XO-(CH2CH2O)=n-CH2CH2-Y donde n es de 2 a 10.000 y X es H o una modificacion terminal, incluyendo pero no limitado a, un alquilo C1 - 4.
En algunos casos, un PEG usado en la invencion termina en un extremo con hidroxi o metoxi, es decir, X es H o CH3 ("metoxi PEG"). Alternativamente, el PEG puede terminar con un grupo reactivo, formando de este modo un polfmero bifuncional. Los grupos reactivos tfpicos pueden incluir aquellos grupos reactivos que se usan comunmente para reaccionar con los grupos funcionales encontrados en los 20 aminoacidos comunes (incluyendo pero sin limitarse a, grupos maleimida, carbonatos activados (incluyendo pero no limitado a ester de p-nitrofenilo), esteres activados (incluyendo pero sin limitarse a, N-hidroxisuccinimida, ester de p-nitrofenilo) y aldehfdos) asf como grupos funcionales que son inertes a los 20 aminoacidos comunes pero que reaccionan especfficamente con grupos funcionales complementarios presentes en aminoacidos no codificado naturalmente (incluyendo pero sin limitarse a, grupos azida, grupos alquino). Se observa que el otro extremo del PEG, que se muestra en la formula anterior por Y, se unira directa o indirectamente a un polipeptido de union al antfgeno a traves de un aminoacido natural o no codificado naturalmente. Por ejemplo, Y puede ser un enlace amida, carbamato o urea a un grupo amina (incluyendo, pero sin limitarse a, la amina epsilon de lisina o el extremo terminal N) del polipeptido. Alternativamente, Y puede ser un enlace maleimida con un grupo tiol (incluyendo, pero no limitado a, el grupo tiol de cistefna). Alternativamente, Y puede ser un enlace con un residuo que no es comunmente accesible a traves de los 20 aminoacidos comunes. Por ejemplo, un grupo azida en el PEG puede hacerse reaccionar con un grupo alquino en el anticuerpo para formar un producto de cicloadicion de Huisgen [3+2]. Alternativamente, un grupo alquino en el PEG puede hacerse reaccionar con un grupo azida presente en un aminoacido no codificado naturalmente para formar un producto similar. En algunas realizaciones, se puede hacer
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reaccionar un nucleofilo fuerte (incluyendo, pero no limitado a, hidracina, hidrazida, hidroxilamina, semicarbazida) con un grupo aldehfdo o cetona presente en un aminoacido no codificado naturalmente para formar una hidrazona, oxima o semicarbazona, segun el caso, que en algunos casos puede reducirse adicionalmente por tratamiento con un agente reductor apropiado. Alternativamente, el nucleofilo fuerte puede incorporarse al anticuerpo a traves de un aminoacido no codificado naturalmente y usarse para reaccionar preferentemente con un grupo cetona o aldehfdo presente en el polfmero soluble en agua.
Cualquier masa molecular para un PEG se puede usar tal como se desea practicamente, incluyendo pero no limitado a, de aproximadamente 100 Dalton (Da) a 100.000 Da o mas segun se desee (incluyendo pero no limitado a, a veces 0,150 kDa o 10-40 kDa). Pueden usarse tambien PEG de cadena ramificada, incluyendo pero sin limitarse a, moleculas de PEG con cada cadena que tiene un PM que varfa de 1-100 kDa (incluyendo pero no limitado a, 1-50 kDa o 5-20 kDa). Se describe una amplia gama de moleculas de PEG, incluyendo, pero sin limitarse a ellas, en el catalogo de Shearwater Polymers, Inc., el catalogo Nektar Therapeutics.
Generalmente, al menos un extremo terminal de la molecula de PEG esta disponible para reaccion con el aminoacido no codificado naturalmente. Por ejemplo, pueden usarse derivados de PEG que contienen unidades estructurales alquino y azida para reaccion con cadenas laterales de aminoacidos para unir PEG con aminoacidos no codificados naturalmente como se describe en la presente memoria. Si el aminoacido no codificado naturalmente comprende una azida, entonces el PEG contendra tfpicamente ya sea una unidad estructural alquino para efectuar la formacion del producto de cicloadicion [3+2] o una especie PEG activada (es decir, ester, carbonato) que contiene un grupo fosfina para efectuar la formacion del enlace amida. Alternativamente, si el aminoacido no codificado naturalmente comprende un alquino, entonces el PEG contendra tfpicamente una unidad estructural azida para efectuar la formacion del producto de cicloadicion de Huisgen [3+2]. Si el aminoacido no codificado naturalmente comprende un grupo carbonilo, el PEG comprendera tfpicamente un nucleofilo potente (incluyendo pero sin limitarse a, una funcion hidrazida, hidracina, hidroxilamina o semicarbazida) con el fin de efectuar la formacion de los enlaces correspondientes hidrazona, oxima, y semicarbazona, respectivamente. En otras alternativas, se puede usar un inverso de la orientacion de los grupos reactivos descritos anteriormente, es decir, se puede hacer reaccionar una unidad estructural azida en el aminoacido no codificado naturalmente con un derivado de PEG que contiene un alquino.
En algunas realizaciones, la variante de la protefna de Fc con un derivado de PEG contiene una funcion qufmica que es reactiva con la funcion qufmica presente en la cadena lateral del aminoacido no codificado naturalmente.
En ciertas realizaciones, la carga util es un polfmero que contiene azida o acetileno que comprende una cadena principal polimerica soluble en agua que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 800 Da a aproximadamente 100.000 Da. La cadena principal polimerica del polfmero soluble en agua puede ser poli(etilenglicol). Sin embargo, debe entenderse que tambien son adecuados una amplia variedad de polfmeros solubles en agua que incluyen, pero no se limitan a poli(etilen)glicol y otros polfmeros relacionados, incluyendo poli(dextrano) y poli (propilenglicol), para uso en la practica de esta invencion y que el uso del termino PEG o poli(etilenglicol) pretende abarcar e incluir todas estas moleculas. El termino PEG incluye, pero sin limitacion, poli(etilenglicol) en cualquiera de sus formas, incluyendo PEG bifuncional, PEG multiarmado, PEG sometido a derivacion, PEG bifurcado, PEG ramificado, PEG pendiente (es decir, PEG o polfmeros relacionados que tienen uno o mas grupos funcionales que penden de la cadena principal del polfmero), o PEG con enlaces degradables en el mismo.
La cadena principal del polfmero puede ser lineal o ramificada. Las cadenas principales polimericas ramificadas son generalmente conocidas en la tecnica. Tfpicamente, un polfmero ramificado tiene una unidad estructural nuclear de ramificacion central y una pluralidad de cadenas polimericas lineales unidas al nucleo de la ramificacion central. El PEG se usa comunmente en formas ramificadas que se pueden preparar por adicion de oxido de etileno a diversos polioles, tales como glicerol, oligomeros de glicerol, pentaeritritol y sorbitol. La unidad estructural de ramificacion central tambien puede derivarse de varios aminoacidos, tales como lisina. El poli(etilenglicol) ramificado puede representarse en forma general como R(-PEG-OH)m en la que R se deriva de una unidad estructural nuclear, tal como glicerol, oligomeros de glicerol, o pentaeritritol, y m representa el numero de brazos. Las moleculas de PEG de multiples brazos, tales como las descritas en las patentes estadounidenses Nos. 5.932.462; 5.643.575; 5.229.490; 4.289.872; la solicitud de patente estadounidense No. 2003/0143596; los documentos WO 96/21469 y WO 93/21259, tambien pueden usarse como la cedan principal del polfmero.
El PEG ramificado puede estar tambien en forma de un PEG bifurcado representado por PEG(-YCHZ2)n, donde Y es un grupo de enlazamiento y Z es un grupo terminal activado unido a CH por una cadena de atomos de longitud definida.
Incluso otra forma ramificada, el PEG colgante, tiene grupos reactivos, tales como carboxilo, a lo largo de la cadena principal de PEG en vez de al extremo de la cadena de PEG.
Ademas de estas formas de PEG, el polfmero tambien se puede preparar con enlaces debiles o degradables en la cadena principal. Por ejemplo, el PEG puede prepararse con enlaces ester en la cadena principal del polfmero que estan sujetos a hidrolisis. Como se muestra a continuacion, esta hidrolisis da lugar a la escision del polfmero en
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fragmentos de menor peso molecular: -PEG-CO2-PEG- + H2O ^ PEG-CO2H + HO-PEG-. Los expertos en la tecnica entienden que el termino poli(etilenglicol) o PEG representa o incluye todas las formas conocidas en la tecnica incluyendo, pero sin limitarse a las descritas en la presente memoria.
Muchos otros polfmeros son tambien adecuados para uso en la presente invencion. En algunas realizaciones, las cadenas principales polimericas que son solubles en agua, con de 2 hasta aproximadamente 300 terminales, son particularmente utiles en la invencion. Ejemplos de polfmeros adecuados incluyen, pero no se limitan a, otros poli (alquilen glicoles), tales como poli(propilenglicol) ("PPG"), copolfmeros de los mismos (incluyendo pero sin limitarse a copolfmeros de etilenglicol y propilenglicol), terpolfmeros de los mismos, mezclas de los mismos y similares. Aunque el peso molecular de cada cadena de la cadena principal del polfmero puede variar, esta tfpicamente en el intervalo de aproximadamente 800 Da hasta aproximadamente 100.000 Da, a menudo de aproximadamente 6.000 Da hasta aproximadamente 80.000 Da.
Los expertos en la tecnica reconoceran que la lista anterior para cadenas principales sustancialmente solubles en agua no es de ninguna manera exhaustiva y es meramente ilustrativa, y que todos los materiales polimericos que tienen las cualidades descritas anteriormente se contemplan como adecuados para su uso en la presente invencion.
En algunas realizaciones de la presente invencion los derivados polimericos son "multifuncionales", lo que significa que la cadena principal del polfmero tiene al menos dos terminales, y posiblemente hasta 300 terminales, con adicion de grupos funcionales o activados con un grupo funcional. Los derivados polimericos multifuncionales incluyen, pero no se limitan a, polfmeros lineales que tienen dos terminales, estando cada extremo terminal enlazado a un grupo funcional que puede ser igual o diferente.
En una realizacion, el derivado de polfmero tiene la estructura: X-A-POLY-B-N=N=N en donde: N=N=N es una unidad estructural azida; B es una unidad estructural de enlazamiento, que puede estar presente o ausente; POLY es un polfmero no antigenico soluble en agua; A es una unidad estructural de enlazamiento, que puede estar presente o ausente y que puede ser la mismo que B o diferente; y X un segundo grupo funcional. Ejemplos de una unidad estructural de enlace para A y B incluyen, pero no se limitan a, un grupo alquilo con adicion de multiples grupos funcionales que contiene hasta 18 y mas preferiblemente entre 1-10 atomos de carbono. Un heteroatomo tal como nitrogeno, oxfgeno o azufre se puede incluir con la cadena de alquilo. La cadena alquilo tambien puede estar ramificada en un heteroatomo. Otros ejemplos de una unidad estructural de enlazamiento para A y B incluyen, pero no se limitan a, un grupo arilo con adicion de multiples grupos funcionales, que contiene hasta 10 y mas preferiblemente 5-6 atomos de carbono. El grupo arilo puede estar sustituido con otros atomos de carbono, atomos de nitrogeno, oxfgeno o azufre. Otros ejemplos de grupos de enlazamiento adecuados incluyen los grupos de enlazamiento descritos en las patentes estadounidenses Nos. 5.932.462; 5.643.575; y la publicacion de la solicitud de patente estadounidense No. 2003/0143596. Los expertos en la tecnica reconoceran que la lista anterior para unidades estructurales de enlazamiento no es exhaustiva y es meramente ilustrativa y que todos las unidades estructurales de enlazamiento que tienen las cualidades descritas anteriormente se consideran adecuadas para su uso en la presente invencion.
Ejemplos de grupos funcionales adecuados para uso como X incluyen, pero no se limitan a, hidroxilo, hidroxilo protegido, alcoxilo, ester activo, tal como esteres de N-hidroxisuccinimidilo y esteres de 1-benzotriazolilo, carbonato activo, tal como carbonatos de N-hidroxisuccinimidilo y carbonatos de 1-benzotriazolilo, acetal, aldehfdo, hidratos de aldehfdo, alquenilo, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona activa, amina, aminooxi, amina protegida, hidrazida, hidrazida protegida, tiol protegido, acido carboxflico, acido carboxflico protegido, isocianato, isotiocianato, maleimida, vinilsulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, yodoacetamida, epoxido, glioxales, dionas, mesilatos, tosilatos, tresilato, alqueno, cetona y azida. Como es entendido por los expertos en la tecnica, la unidad estructural X seleccionada debe ser compatible con el grupo azida de modo que no se produzca reaccion con el grupo azida. Los derivados polimericos que contienen azida pueden ser homobifuncionales, lo que significa que el segundo grupo funcional (es decir, X) es tambien una unidad estructural azida, o heterobifuncional, lo que significa que el segundo grupo funcional es un grupo funcional diferente.
El termino "protegido" se refiere a la presencia de un grupo o unidad estructural de proteccion que evita la reaccion del grupo funcional qufmicamente reactivo bajo ciertas condiciones de reaccion. El grupo protector variara dependiendo del tipo de grupo qufmicamente reactivo que este protegido. Por ejemplo, si el grupo qufmicamente reactivo es una amina o una hidrazida, el grupo protector se puede seleccionar del grupo de terc-butiloxicarbonilo (t-Boc) y 9- fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc). Si el grupo qufmicamente reactivo es un tiol, el grupo protector puede ser orto-piridil- disulfuro. Si el grupo qufmicamente reactivo es un acido carboxflico, tal como acido butanoico o propionico, o un grupo hidroxilo, el grupo protector puede ser bencilo o un grupo alquilo tal como metilo, etilo o terc-butilo. Otros grupos protectores conocidos en la tecnica tambien se pueden usar en la presente invencion.
Ejemplos especfficos de grupos funcionales terminales en la bibliograffa incluyen, pero no se limitan a, carbonato de N- succinimidilo (vease, por ejemplo, las patentes estadounidenses Nos. 5.281.698, 5.468.478), amina (vease, por ejemplo, Buckmann y colaboradores, Makromol. Chem. 182: 1379 (1981), Zaplipsky y colaboradores, Eur. Polym. J. 19: 1177 (1983)), hidrazida (vease, por ejemplo, Andresz y colaboradores, Makromol, Chem. 179: 301 (1978)), propionato
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de succinimidilo y butanoato de succinimidilo (vease, por ejemplo, Olson y colaboradores en Poly(ethylene glycol) Chemistry & Biological Applications, paginas 170-181, Harris y Zaplipsky Eds., ACS, Washington, DC, 1997; vease tambien la patente estadounidense No. 5.672.662), succinato de succinimidilo (vease, por ejemplo, Abuchowski y colaboradores, Cancer Biochem, Biophys 7: 175 (1984) y Joppich y colaboradores, Macrolol. Chem 180: 1381 (1979), ester de succinimidilo (vease, por ejemplo, la patente estadounidense No. 5.650.234), glicidil eter (vease, por ejemplo, Pitha y colaboradores, Eur. J. Biochem. 94: 11 (1979), Elling y colaboradores, Biotech , Appl. Biochem. 13: 354 (1991), oxicarbonilimidazol (vease, por ejemplo, Beauchamp y colaboradores, Anal. Biochem. 131: 25 (1983), Tondelli y colaboradores, J. Controlled Release 1: 251 (1985)), carbonato de p-nitrofenilo (vease, por ejemplo, Veronese y colaboradores, Appl. Biochem. Biotech., 11: 141 (1985) y Sartore y colaboradores, Appl. Biochem. Biotech (vease, por ejemplo, Harris y colaboradores, J. Polym. Sci., Ed. 22: 341 (1984), patente estadounidense No. 5.824.784, patente estadounidense No. 5.824.784, (vease, por ejemplo, Goodson y colaboradores, Bio/Technology 8: 343 (1990), Romani y colaboradores, en Chemistry of Peptides and Proteins 2: 29 (1984)), y Kogan, Synthetic Comm. 22: 2417 (1992)), disulfuro de orto-piridilo (vease, por ejemplo, Woghiren, y colaboradores, Bioconj., Chem. 4: 314 (1993)), acrilol (vease, por ejemplo, Sawhney y colaboradores, Macromolecules 26: 581 1993)), vinilsulfona (vease, por ejemplo, la patente estadounidense No. 5.900.461).
En ciertas realizaciones de la presente invencion, los derivados polimericos de la invencion comprenden una cadena principal polimerica que tiene la estructura: X-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-N=N=N en donde: X es un grupo funcional tal como se describe mas arriba; y n es de aproximadamente 20 a aproximadamente 4000. En otra realizacion, los derivados polimericos de la invencion comprenden una cadena principal polimerica que tiene la estructura: X- CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-O-(CH2)m-W-N=N=N en donde: W es una unidad estructural enlazadora alifatica o aromatica que comprende entre 1-10 atomos de carbono; N es de aproximadamente 20 a aproximadamente 4000; X es un grupo funcional como se ha descrito anteriormente; y m esta entre 1 y 10.
Los derivados de PEG que contienen azidas de la invencion pueden prepararse mediante una diversidad de metodos conocidos en la tecnica y/o descritos en la presente memoria. En un metodo, mostrado a continuacion, se hace reaccionar una cadena principal polimerica soluble en agua que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 800 Da a aproximadamente 100.000 Da, teniendo la estructura polimerica un primer terminal unido a un primer grupo funcional y un segundo terminal unido a un grupo saliente adecuado, con un anion azida (que puede estar apareado con cualquiera de una cantidad de contraiones adecuados, incluyendo sodio, potasio, terc-butilamonio, etc.). El grupo saliente sufre un desplazamiento nucleofflico y se reemplaza por la unidad estructural azida, proporcionando el polfmero deseado de PEG que contiene azida como se muestra a continuacion: X-PEG-L+N3' ^ X-PEG-N3.
Como se muestra, una cadena principal polimerica adecuada para uso en la presente invencion tiene la formula X-PEG- L, en la que PEG es poli(etilenglicol) y X es un grupo funcional que no reacciona con grupos azida y L es un grupo saliente adecuado. Ejemplos de grupos funcionales adecuados incluyen, pero no se limitan a, hidroxilo, hidroxilo protegido, acetal, alquenilo, amina, aminooxi, amina protegida, hidrazida protegida, tiol protegido, acido carboxflico, acido carboxflico protegido, maleimida, ditiopiridina y vinilpiridina y cetona. Ejemplos de grupos salientes adecuados incluyen, pero no se limitan a, cloruro, bromuro, yoduro, mesilato, tresilato y tosilato.
En otro metodo para la preparacion de los derivados de polfmero que contienen azida de la presente invencion, se pone en contacto un agente de union que porta una funcion azida con una cadena principal polimerica soluble en agua que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 800 Da a aproximadamente 100.000 Da, en donde el agente de enlazamiento porta una funcion qufmica que reaccionara selectivamente con una funcion qufmica sobre el polfmero de PEG, para formar un producto derivado del polfmero que contiene azida en donde la azida se separa de la cadena principal del polfmero por un grupo de enlazamiento.
Un ejemplo de un esquema de reaccion se muestra a continuacion: X-PEG-M+N-enlazador-N=N=N-PG-X-PEG- enlazador-N=N=N en donde: PEG es poli(etilenglicol) y X es un grupo de recubrimiento tal como alcoxi o un grupo funcional como se ha descrito anteriormente; y M es un grupo funcional que no es reactivo con la funcion azida pero que reaccionara de manera eficiente y selectiva con el grupo funcional N.
Ejemplos de grupos funcionales adecuados incluyen, pero no se limitan a, M que es un acido carboxflico, carbonato o ester activo si N es una amina; siendo M una cetona si N es una unidad estructural hidrazida o aminooxi; siendo M un grupo saliente si N es un nucleofilo.
La purificacion del producto en bruto puede realizarse por metodos conocidos que incluyen, pero no se limitan a, la precipitacion del producto seguida por cromatograffa, si es necesario.
Un ejemplo mas especffico se muestra a continuacion en el caso de la diamina de PEG, en la que una de las aminas esta protegida por una unidad estructural de grupo protector tal como tert-butil-Boc y la diamina de PEG monoprotegida resultante reacciona con una unidad estructural de enlazamiento que tiene la funcion azida: BocHN-PEG-NH2+HO2C- (CH2)3-N=N=N.
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En este caso, el grupo amina puede acoplarse al grupo de acido carboxflico usando una variedad de agentes activadores tales como cloruro de tionilo o reactivos de carbodiimida y N-hidroxisuccinimida o N-hidroxibenzotriazol para crear un enlace amida entre el derivado de PEG de monoamina y la unidad estructural enlazadora que porta azida. Despues de la formacion satisfactoria del enlace amida, el derivado resultante que contiene azida protegido con N-terc- butil-Boc puede usarse directamente para modificar moleculas bioactivas o puede elaborarse adicionalmente para instalar otros grupos funcionales utiles. Por ejemplo, el grupo N-t-Boc puede hidrolizarse por tratamiento con acido fuerte para generar una omega-amino-PEG-azida. La amina resultante se puede usar como mango sintetico para instalar otra funcion util tal como grupos maleimida, disulfuros activados, esteres activados y asf sucesivamente para la creacion de valiosos reactivos heterobifuncionales.
Los derivados heterobifuncionales son particularmente utiles cuando se desea unir moleculas diferentes a cada extremo terminal del polfmero. Por ejemplo, el PEG omega-N-amino-N-azido permitirfa la union de una molecula que tiene un grupo electrofflico activado, tal como un aldehfdo, cetona, ester activado, carbonato activado y asf sucesivamente, a un extremo terminal del PEG y una molecula que tiene un grupo acetileno al otro extremo del PEG.
En otra realizacion de la invencion, el derivado de polfmero tiene la estructura: X-A-POLY-B-C=C-R en donde: R puede ser H o un grupo alquilo, alqueno, alquiloxi o arilo o arilo sustituido; B es una unidad estructural de enlazamiento, que puede estar presente o ausente; POLY es un polfmero no antigenico soluble en agua; A es una unidad estructural de enlazamiento, que puede estar presente o ausente y que puede ser el mismo que B o diferente; y X un segundo grupo funcional.
Ejemplos de una unidad estructural de enlazamiento para A y B incluyen, pero no se limitan a, un grupo alquilo con adicion de multiples funciones que contiene hasta 18 y mas preferiblemente entre 1-10 atomos de carbono. Un heteroatomo tal como nitrogeno, oxfgeno o azufre puede ser incluido con la cadena de alquilo. La cadena de alquilo tambien puede estar ramificada en un heteroatomo. Otros ejemplos de una unidad estructural de enlazamiento para A y B incluyen, pero no se limitan a, un grupo arilo con adicion de multiples funciones, que contiene hasta l0 y mas preferiblemente 5-6 atomos de carbono. El grupo arilo puede estar sustituido con uno o mas atomos de carbono, nitrogeno, oxfgeno o atomos de azufre. Otros ejemplos de grupos de enlazamiento adecuados incluyen los grupos de enlazamiento descritos en las patentes estadounidenses Nos. 5.932.462 y 5.643.575 y la publicacion de la solicitud de patente estadounidense No. 2003/0143596. Los expertos en la tecnica reconoceran que la lista anterior para unidades estructurales de enlazamiento no es en modo alguno exhaustiva y se pretende que sea meramente ilustrativa y que se considere que una gran variedad de grupos de enlazamiento que tienen las cualidades descritas anteriormente son utiles en el presente invencion.
Ejemplos de grupos funcionales adecuados para su uso como X incluyen hidroxilo, hidroxilo protegido, alcoxilo, ester activo, tal como esteres de N-hidroxisuccinimidilo y esteres de 1-benzotriazolilo, carbonato activo, tal como carbonatos de N-hidroxisuccinimidilo y carbonatos de 1-benzotriazolilo, acetona, aldehfdo, hidratos de aldehfdo, alquenilo, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona activa, amina, aminooxi, amina protegida, hidrazida, hidrazida protegida, tiol protegido, acido carboxflico, acido carboxflico protegido, isocianato, isotiocianato, maleimida, vinilsulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, yodoacetamida, epoxido, glioxales, dionas, mesilatos, tosilatos y tresilato, alqueno, cetona y acetileno. Como se comprendera, la unidad estructural X seleccionada debe ser compatible con el grupo acetileno de modo que no se produzca reaccion con el grupo acetileno. Los derivados polimericos que contienen acetileno pueden ser homobifuncionales, lo que significa que el segundo grupo funcional (es decir, X) es tambien una unidad estructural acetileno, o heterobifuncional, lo que significa que el segundo grupo funcional es un grupo funcional diferente.
En otra realizacion de la presente invencion, los derivados polimericos comprenden una cadena principal polimerica que tiene la estructura: X-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-O-(CH2)mC=CH en donde: X es un grupo funcional tal como se describe mas arriba; n es de aproximadamente 20 a aproximadamente 4000; y m esta entre 1 y 10. A continuacion se muestran ejemplos especfficos de cada uno de los polfmeros de PEG heterobifuncionales.
Los derivados de PEG que contienen acetileno de la invencion se pueden preparar usando metodos conocidos por los expertos en la tecnica y/o descritos en la presente memoria. En un metodo, se hace reaccionar una cadena principal polimerica soluble en agua que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 800 Da a aproximadamente 100.000 Da, la cadena principal polimerica que tiene un primer extremo terminal unido a un primer grupo funcional y un segundo extremo terminal unido a un grupo nucleofilo adecuado, con un compuesto que porta tanto una funcion acetileno como un grupo saliente que es adecuado para la reaccion con el grupo nucleofflico en el PEG. Cuando el polfmero de PEG que porta la unidad estructural nucleofflica y la molecula que porta el grupo saliente se combinan, el grupo saliente sufre un desplazamiento nucleofflico y es sustituido por la unidad estructural nucleofflica, proporcionando el polfmero deseado que contiene acetileno: X-PEG-Nu+LAC ^ X-PEG-Nu-AC=CR'.
Como se muestra, una cadena principal polimerica preferida para uso en la reaccion tiene la formula X-PEG-Nu, en donde PEG es poli(etilenglicol), Nu es una unidad estructural nucleofflica y X es un grupo funcional que no reacciona con Nu, L o la funcion acetileno.
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Ejemplos de Nu incluyen, pero no se limitan a, grupos amina, alcoxi, ariloxi, sulfhidrilo, imino, carboxilato, hidrazida, aminoxi que reaccionarfan principalmente a traves de un mecanismo del tipo SN2. Ejemplos adicionales de grupos Nu incluyen aquellos grupos funcionales que reaccionarfan principalmente a traves de una reaccion de adicion nucleofflica. Ejemplos de grupos L incluyen cloruro, bromuro, yoduro, mesilato, tresilato y tosilato y otros grupos que se espera que experimenten desplazamiento nucleofflico, asf como cetonas, aldehfdos, tioesteres, olefinas, grupos carbonilo insaturados alfa-beta, carbonatos y otros grupos electrofflicos que se espera experimenten adicion por nucleofilos.
En otra realizacion de la presente invencion, A es un enlazador alifatico de entre 1-10 atomos de carbono o un anillo arilo sustituido de entre 6-14 atomos de carbono. X es un grupo funcional que no reacciona con grupos azida y L es un grupo saliente adecuado.
En otro metodo para la preparacion de los derivados polimericos que contienen acetileno de la invencion, un polfmero de PEG que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 800 Da a aproximadamente 100.000 Da, que porta ya sea un grupo funcional protegido o un agente de recubrimiento en un extremo terminal y se pone en contacto un grupo saliente adecuado en el otro extremo terminal con un anion de acetileno.
Los polfmeros solubles en agua pueden estar enlazados a las protefnas de Fc de la invencion. Los polfmeros solubles en agua pueden estar enlazados a traves de un aminoacido no codificado naturalmente incorporado en las protefnas de Fc o cualquier grupo funcional o sustituyente de un aminoacido no codificado naturalmente o naturalmente codificado, o cualquier grupo funcional o sustituyente anadido a un aminoacido no codificado naturalmente o naturalmente codificado. Alternativamente, los polfmeros solubles en agua estan enlazados a un polipeptido de union al antfgeno que incorpora un aminoacido no codificado naturalmente a traves de un aminoacido natural (incluyendo, pero no limitado a, cistefna, lisina o el grupo amina del residuo del extremo terminal N). En algunos casos, las protefnas de Fc de la invencion comprenden 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 aminoacidos no naturales, en donde uno o mas aminoacidos no codificados naturalmente, estan unidos a polfmeros solubles en agua (incluyendo, pero sin limitarse a, PEG y/o oligosacaridos). En algunos casos, las protefnas de Fc de la invencion comprenden ademas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o mas aminoacidos codificados naturalmente enlazados a polfmeros solubles en agua. En algunos casos, la protefna de Fc de la invencion comprende uno o mas aminoacidos no codificados naturalmente enlazados a polfmeros solubles en agua y uno o mas aminoacidos naturales que estan enlazados a polfmeros solubles en agua. En algunas realizaciones, los polfmeros solubles en agua utilizados en la presente invencion mejoran la semivida en suero de las protefnas de Fc con relacion a la forma no conjugada.
El numero de polfmeros solubles en agua enlazados a un polipeptido de union al antfgeno (es decir, el grado de PEGilacion o glicosilacion) de la presente invencion puede ajustarse para proporcionar una caracterfstica farmacologica, farmacocinetica o farmacodinamica alterada (incluyendo, pero no limitada a, aumentada o disminuida), tal como la semivida in vivo. En algunas realizaciones, la semivida de la protefna de Fc se incrementa al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 por ciento, 2 veces, 5 veces, 10 veces, 50 veces, o al menos aproximadamente 100 veces sobre un polipeptido no modificado.
En una realizacion de la presente invencion, se modifica un polipeptido de union al antfgeno que comprende un aminoacido no codificado naturalmente que contiene carbonilo con un derivado de PEG que contiene una unidad estructural terminal de hidracina, hidroxilamina, hidrazida o semicarbazida que esta unida directamente a la cadena principal de PEG.
En algunas realizaciones, el derivado de PEG de hidroxilamina terminal tendra la estructura: RO-(CH2CH2O)n-O- (CH2)mO-NH2 donde R es un alquilo simple (metilo, etilo, propilo, etc.), m es 2 -10 y n es 100-1.000 (es decir, el peso molecular promedio esta entre 5-40 kDa).
En algunas realizaciones, el derivado de PEG que contiene hidracina o hidrazida tendra la estructura: RO-(CH2CH2O)n- O-(CH2)mX-NH-NH2 donde R es un alquilo simple (metilo, etilo, propilo, etc.), m es 2-10 y n es 100-1.000 y X es opcionalmente un grupo carbonilo (C=O) que puede estar presente o ausente.
En algunas realizaciones, el derivado de PEG que contiene semicarbazida tendra la estructura: RO-(CH2CH2O)n-O- (CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2 donde R es un alquilo simple (metilo, etilo, Propilo, etc.), m es 2-10 y n es 100-1.000.
En otra realizacion de la invencion, un polipeptido de union al antfgeno que comprende un aminoacido que contiene carbonilo se modifica con un derivado de pEg que contiene una unidad estructural terminal de hidroxilamina, hidrazida, hidracina o semicarbazida que esta enlazada a la cadena principal de PEG por medio de un enlace amida.
En algunas realizaciones, los derivados de PEG de hidroxilamina terminal tienen la estructura: RO-(CH2CH2O)n-O- (CH2)2-NH-C(O)(CH2)mO-NH2 donde R es un alquilo simple (metilo, etilo, propilo, etc.), m es 2-10 y n es 100-1.000 (es decir, el peso molecular promedio esta entre 5-40 kDa).
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En algunas realizaciones, los derivados de PEG que contienen hidracina o hidrazida tienen la estructura: RO- (CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)mX-NH-NH2 donde R es un grupo alquilo simple (metilo, etilo, propilo, etc.), m es 210, n es 100-1.000 y X es opcionalmente un grupo carbonilo (C=O) que puede estar presente o ausente.
En algunas realizaciones, los derivados de PEG que contienen semicarbazida tienen la estructura: RO-(CH2CH2O)n-O- (CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2 donde R es un alquilo simple (metilo, etilo, propilo, etc.), m es 2-10 y n es 1001.000.
En otra realizacion de la invencion, una protefna de Fc que comprende un aminoacido que contiene carbonilo se modifica con un derivado de PEG ramificado que contiene una unidad estructural terminal de hidracina, hidroxilamina, hidrazida o semicarbazida, con cada cadena del PEG ramificado que tiene un PM en el intervalo de 10-40 kDa y, mas preferiblemente, de 5-20 kDa.
En otra realizacion de la invencion, una protefna de Fc que comprende un aminoacido no codificado naturalmente se modifica con un derivado de PEG que tiene una estructura ramificada. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el derivado PEG de hidracina o hidrazida terminal tendra la siguiente estructura: [RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH- C(O)]2CH(CH2)mX-NH-NH2 donde R es un alquilo simple (metilo, etilo, propilo, etc.), m es 2-10 y n es 100-1.000, y X es opcionalmente un grupo carbonilo (C=O) que puede estar presente o ausente.
En algunas realizaciones, los derivados de PEG que contienen un grupo semicarbazida tendran la estructura: [RO- (CH2CH2O)n-O-(CH2)2-C(O)-NH-CH2-CH2]2CH-X-(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2 donde R es un alquilo simple (metilo, etilo, propilo, etc.), X es opcionalmente NH, O, S, C(O) o no esta presente, m es 2-10 y n es 100-1.000.
En algunas realizaciones, los derivados de PEG que contienen un grupo hidroxilamina tendran la estructura: [RO- (CH2CH2O)n-O-(CH2)2-C(O)-NH-CH2-CH2]2CH-X-(CH2)m-O-NH2 donde R es un alquilo simple (metilo, etilo, propilo, etc.), X es opcionalmente NH, O, S, C(O) o no esta presente, m es 2-10 y n es 100-1.000.
El grado y los sitios en los que el polfmero o los polfmeros solubles en agua estan unidos a las protefnas de Fc pueden modular la union de las protefnas de Fc a un antfgeno o receptor.
Los metodos y la qufmica para la activacion de polfmeros asf como para la conjugacion de peptidos se describen en la literatura y son conocidos en la tecnica. Los metodos comunmente utilizados para la activacion de polfmeros incluyen, pero no se limitan a, la activacion de grupos funcionales con bromuro de cianogeno, peryodato, glutaraldehfdo, diepoxidos, epiclorohidrina, divinil sulfona, carbodiimida, haluros de sulfonilo, triclorotriazina, etc., (vease, R.F. Taylor, (1991), PROTEIN IMMOBILISATION. FUNDAMENTAL AND APPLICATIONS, Marcel Dekker, N.Y.; S. S. Wong, (1992), CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSSLINKING, CRC Press, Boca Raton; G. T. Hermanson y colaboradores, (1993), IMMOBILIZED AFFINITY LIGAND TECHNIQUES, Academic Press, N.Y.; Dunn, R. L., y colaboradores, Eds. POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D.C. 1991).
Se dispone de varias revisiones y monograffas sobre la adicion d grupos funcionales y conjugacion de PEG. Vease, por ejemplo, Harris, Macronol. Chem. Phys. C25: 325-373 (1985); Scouten, Methods in Enzymology 135: 30-65 (1987); Wong y colaboradores, Enzyme Microb. Technol. 14: 866-874 (1992); Delgado y colaboradores, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249-304 (1992); Zalipsky, Bioconjugate Chem. 6: 150-165 (1995).
Los metodos para la activacion de polfmeros tambien pueden encontrarse en los documentos WO 94/17039, patente estadounidense No. 5.324.844, WO 94/18247, WO 94/04193, patente estadounidense No. 5.219.564, patente estadounidense No. 5.122.614, WO 90/13540, patente estadounidense No. 5.281.698, y WO 93/15189, y para la conjugacion entre polfmeros activados y enzimas que incluyen, pero no se limitan a, el factor de coagulacion VIII (WO 94/15625), hemoglobina (WO 94/09027), molecula portadora de oxfgeno (patente estadounidense No. 4.412.989), ribonucleasa y superoxido dismutasa (Veronese y colaboradores, App. Biochem. Biotech., 11: 141-45 (1985)).
La PEGilacion (es decir, la adicion de cualquier polfmero soluble en agua) de polipeptidos de union al antfgeno que contienen un aminoacido no codificado naturalmente, tal como p-azido-L-fenilalanina, se lleva a cabo por cualquier metodo conveniente. Por ejemplo, la protefna de Fc se PEGila con un derivado de mPEG terminado en alquino. En pocas palabras, se anade, con agitacion, un exceso de mPEG(5000)-O-CH2-C=CH solido a una solucion acuosa de protefna de Fc que contiene p-azido-L-Phe a temperatura ambiente. Tfpicamente, la solucion acuosa se tampona con un regulador que tiene un valor de pKa cerca del pH al cual se va a llevar a cabo la reaccion (generalmente alrededor de pH 4-10). Ejemplos de reguladores adecuados para PEGilacion a pH 7,5, por ejemplo, incluyen, pero no se limitan a, HEPES, fosfato, borato, TRIS-HCl, EPPS y tEs. El pH se controla continuamente y se ajusta si es necesario. La reaccion se deja tfpicamente continuar durante entre aproximadamente 1-48 horas.
Los productos de reaccion se someten posteriormente a cromatograffa de interaccion hidrofoba para separar las variantes de protefna de Fc PEGilada de mPEG(5000)-O-CH2-C=CH libre y cualquier complejo de alto peso molecular
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de la protefna de Fc PEGilada que pueda formarse cuando el PEG no bloqueado se activa en ambos extremos de la molecula, entrecruzando asf las moleculas de la variante de la protefna de Fc. Las condiciones durante la cromatograffa de interaccion hidrofoba son tales que el mPEG(5000)-O-CH2-C=CH libre fluye a traves de la columna, mientras que cualquier complejo de la variante de la protefna de Fc PEGilada entrecruzada eluye despues de las formas deseadas, que contienen una molecula de la variante de protefna de Fc conjugada con uno o mas grupos PEG. Las condiciones adecuadas varfan dependiendo de los tamanos relativos de los complejos entrecruzados frente a los conjugados deseados y son facilmente determinadas por los expertos en la tecnica. El eluyente que contiene los conjugados deseados se concentra por ultrafiltracion y se desaliniza por diafiltracion.
Si es necesario, las protefnas de Fc PEGiladas obtenidas a partir de la cromatograffa hidrofoba pueden purificarse adicionalmente mediante uno o mas procedimientos conocidos por los expertos en la tecnica incluyendo, pero sin limitacion, cromatograffa de afinidad; cromatograffa de intercambio anionico o cationico (usando, incluyendo pero sin limitarse a, DEAE SEPHAROSE); cromatograffa sobre sflice; HPLC de fase inversa; filtracion en gel (usando, incluyendo pero no limitado a, SEPHADEX G-75); cromatograffa de interaccion hidrofoba; cromatograffa de exclusion por tamano, cromatograffa de quelato metalico; ultrafiltracion/diafiltracion; precipitacion con etanol; precipitacion con sulfato de amonio; cromatoenfoque; cromatograffa de desplazamiento; procedimientos electroforeticos (incluyendo, pero sin limitarse a, el enfoque isoelectrico preparativo), solubilidad diferencial (incluyendo, pero sin limitarse a, precipitacion con sulfato de amonio), o extraccion. El peso molecular aparente se puede estimar por GPC por comparacion con estandares de protefna globular (PROTEIN PURIFICATION METHODS, A PRACTICAL APPROACH (Harris & Angal, Eds.) IRL Press 1989, 293-306). La pureza del conjugado protefna de Fc-PEG puede evaluarse por degradacion proteolftica (incluyendo, pero sin limitarse a, escision por tripsina) seguido por analisis de espectrometrfa de masas. Pepinsky B., y colaboradores, J. Pharmcol. & Exp. Ther. 297 (3): 1059-66 (200l).
Un polfmero soluble en agua enlazado a un aminoacido de una protefna de Fc de la invencion puede formar adicionalmente un derivado o ser sustituido sin limitacion.
En otra realizacion de la invencion, un polipeptido de union al antfgeno se modifica con un derivado de PEG que contiene una unidad estructural azida que reaccionara con una unidad estructural alquino presente en la cadena lateral del aminoacido no codificado naturalmente. En general, los derivados de PEG tendran un peso molecular promedio que varfa de 1-100 kDa y, en algunas realizaciones, de 10-40 kDa.
En algunas realizaciones, el derivado de PEG del terminal azida tendra la estructura: RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-N3 donde R es un alquilo simple (metilo, etilo, propilo, etc.), m es 2-10 y n es 100-1.000 (es decir, el peso molecular promedio esta entre 5-40 kDa).
En otra realizacion, el derivado de PEG del terminal azida tendra la estructura: RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-NH-C(O)- (CH2V-N3, donde R es un alquilo simple (metilo, etilo, propilo, etc.), m es 2-10, p es 2-10 y n es 100-1.000 (es decir, el peso molecular promedio esta entre 5-40 kDa).
En otra realizacion de la invencion, una protefna de Fc que comprende un aminoacido que contiene alquino se modifica con un derivado de PEG ramificado que contiene una unidad estructural azida terminal, teniendo cada cadena del PEG ramificado un PM que varfa de 10-40 kDa y, mas preferiblemente, de 5-20 kDa. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el derivado de PEG del terminal azida tendra la siguiente estructura: [RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C (O)]2CH(CH2)m-X- (CH2P-N3 donde R es un alquilo simple (metilo, etilo, propilo, etc.), m es 2-10, p es 2-10 y n es 100-1.000 y X es opcionalmente un O, N, S o grupo carbonilo (C=O), en cada caso que puede estar presente o ausente.
En otra realizacion de la invencion, un polipeptido de union al antfgeno se modifica con un derivado de PEG que contiene una unidad estructural alquino que reaccionara con una unidad estructural azida presente en la cadena lateral del aminoacido no codificado naturalmente.
En algunas realizaciones, el derivado de PEG del terminal alquino tendra la siguiente estructura: RO-(CH2CH2O)n-O- (CH2)m-C=CH en donde R es un alquilo simple (metilo, etilo, propilo, etc.), m es 2-10 y n es 100-1.000 (es decir, el peso molecular promedio esta entre 5-40 kDa).
En otra realizacion de la invencion, una protefna de Fc que comprende un aminoacido no codificado naturalmente que contiene alquino se modifica con un derivado de PEG que contiene una unidad estructural de azida terminal o alquino terminal que esta enlazada a la cadena principal de PEG por medio de un enlace Amida.
En algunas realizaciones, el derivado de PEG del terminal alquino tendra la siguiente estructura: RO-(CH2CH2O)n-O- (CH2)m-NH-C(O)-(CH2)p-C=CH en donde R es un alquilo simple (metilo, etilo, propilo, etc.), m es 2-10, p es 2-10 y n es 100-1.000.
En otra realizacion de la invencion, un polipeptido de union al antfgeno que comprende un aminoacido que contiene azida se modifica con un derivado de PEG ramificado que contiene una unidad estructural de alquino terminal, teniendo
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cada cadena del PEG ramificado un PM que varfa de 10- 40 kDa y, mas preferentemente, de 5-20 kDa. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el derivado de PEG del terminal alquino tendra la siguiente estructura: [RO-(CH2CH2O)n-O- (CH2)2-NH-C(O)]2-CH(CH2)m-X-(CH2)p-C=CH en donde R es un alquilo simple (metilo, etilo, propilo, etc.), m es 2-10, p es 2-10 y n es 100-1.000, y X es opcionalmente un O, N, S o grupo carbonilo (C=O), o no esta presente.
En otra realizacion de la invencion, una protefna de Fc se modifica con un derivado de PEG que contiene un grupo funcional activado (que incluye, pero no se limita a ester, carbonato) que comprende ademas un grupo aril fosfino que reaccionara con una unidad estructural azida presente en la cadena lateral del aminoacido no codificado naturalmente. En general, los derivados de PEG tendran un peso molecular promedio que varfa de 1-100 kDa y, en algunas realizaciones, de 10-40 kDa.
Otras ejemplos de moleculas de PEG que pueden enlazarse a las protefnas de Fc, asf como metodos de PEGilacion
incluyen aquellos descritos en
2002/0052009 2003/0114647 2002/0082345 2001/0044526 5.219.564 6.610.281 5.808.096 5.747.646
2003/0162949
2003/0105275
2002/0072573
2001/0027217;
por ejemplo, las publicaciones de patentes estadounidenses Nos 2004/0013637; 2003/0228274; 2003/0220447
2003/0105224; 2003/0023023; 2002/0156047
2002/0052430; 2002/0040076; 2002/0037949
2001/0021763; patentes estadounidenses Nos
5.629.384
6.515.100
5,612,460
5.834.594
5.736.625
6.461.603
5.324.844
5.849.860;
4.902.502
6.436.386
5,252,714
5.980.948;
5.281.698
6.214.966
6,420,339
6,004,573;
5.122.614
5.990.237
6,201,072
6.129.912;
5.473.034
5.900.461
6,451,346
Documentos
2003/0158333 2002/0099133 2002/0002250 6.646.110 5.516.673 5.739.208 6.306.821
5.824.778
5.382.657
5.672.662
5.559.213
2004/0001838 2003/0143596 2002/0086939 2001/0056171 5.476.653 6.552.167 5.446.090 5,612,460
WO 97/32607, EP 229.108, EP
402.378, WO 92/16555, WO 94/04193, WO 94/14758, WO 94/17039, WO 94/18247, WO 94/28024, WO 95/00162, WO 95/11924 , Los documentos WO 95/3390, WO 95/33490, WO 96/00080, WO 97/18832, WO 98/41562, WO 98/48837, WO 99/32134, WO 99/32139, WO 99/32140, WO 96/40791, WO 98/32466, WO 95/06058, EP 439 508, WO 97/03106, WO 96/21469, WO 95/13312, EP 921 131, WO 98/05363, EP 809 996, WO 96/41813, WO 96/07670, EP 605 963, EP 510 356, EP 400 472, EP 183 503 y EP 154 316. Cualquiera de las moleculas de PEG descritas en la presente memoria se pueden usar en cualquier forma, incluyendo, pero sin limitarse a, una cadena sencilla, una cadena ramificada, una cadena de multiples brazos, funcional simple, bifuncional, multifuncional o cualquier combinacion de las mismas.
En ciertas realizaciones, las protefnas de Fc pueden estar enlazadas a las cargas utiles con uno o mas enlazadores capaces de reaccionar con el aminoacido no natural. Uno o mas enlazadores pueden ser cualquiera de los enlazadores evidentes para los expertos en la tecnica. El termino "enlazador" se usa en la presente memoria para referirse a grupos o enlaces que normalmente se forman como resultado de una reaccion qufmica y tfpicamente son enlaces covalentes. Los enlaces hidrolfticamente estables significan que los enlaces son sustancialmente estables en agua y no reaccionan con agua a valores de pH utiles, incluyendo pero no limitandose a, en condiciones fisiologicas durante un perfodo de tiempo prolongado, tal vez incluso indefinidamente. Los enlaces hidrolfticamente inestables o degradables significan que los enlaces son degradables en agua o en soluciones acuosas, incluyendo, por ejemplo, sangre. Enlaces inestables o degradables significa que el enlace puede ser degradado por una o mas enzimas. Como se entiende en la tecnica, el PEG y los polfmeros relacionados pueden incluir enlaces degradables en la cadena principal del polfmero o en el grupo enlazador entre la cadena principal del polfmero y uno o mas de los grupos funcionales terminales de la molecula del polfmero. Por ejemplo, los enlaces ester formados por la reaccion de acidos carboxflicos de PEG o acidos carboxflicos de PEG activado con grupos alcohol sobre un agente biologicamente activo generalmente se hidrolizan bajo condiciones fisiologicas para liberar el agente. Otros enlaces hidrolfticamente degradables incluyen, pero no se limitan a, enlaces carbonato; enlaces Imina como resultado de la reaccion de una amina y un aldehfdo; enlaces ester fosfato formados por reaccion de un alcohol con un grupo fosfato; enlaces hidrazona que son el producto de reaccion de una hidrazida y un aldehfdo; enlaces acetal que son el producto de reaccion de un aldehfdo y un alcohol; enlaces orto-ester que son el producto de reaccion de un formiato y un alcohol; enlaces peptfdicos formados por un grupo amina, incluyendo pero sin limitarse a, en un extremo de un polfmero tal como PEG, y un grupo carboxilo de un peptido; y enlaces oligonucleotidos formados por un grupo fosforamidita, incluyendo, pero sin limitarse a, al extremo de un polfmero, y un grupo hidroxilo 5' de un oligonucleotido. Los enlazadores ramificados pueden usarse en las protefnas de Fc de la invencion. Los expertos en la tecnica conocen una cantidad enlazadores escindibles diferentes. Veanse las patentes estadounidenses Nos. 4.618.492; 4.542.225 y 4.625.014. Los mecanismos para la liberacion de un agente de estos grupos enlazadores incluyen, por ejemplo, irradiacion de un enlace sensible a la luz e hidrolisis catalizada por acido. La patente estadounidense No. 4.671.958, por ejemplo, incluye una descripcion de inmunoconjugados que comprenden enlazadores que son escindidos en el sitio objetivo in vivo mediante enzimas proteolfticas del sistema de complemento del paciente. La longitud del enlazador puede ser predeterminada o seleccionada dependiendo de una relacion espacial deseada entre la protefna de Fc y la molecula enlazada a ella. Teniendo en cuenta el gran numero de metodos que se han descrito para unir una variedad de compuestos de radiodiagnostico, compuestos radioterapeuticos, farmacos, toxinas y otros agentes a protefnas de Fc, un experto en la tecnica sera capaz de determinar un metodo adecuado para unir un agente dado a una protefna de Fc.
Se puede usar cualquier enlazador heterofuncional u homobifuncional para enlazar los conjugados. El enlazador puede tener una amplia gama de peso molecular o longitud molecular. Pueden usarse enlazadores de peso molecular mas grandes o mas pequenos para proporcionar una relacion espacial o conformacion deseada entre la protefna de Fc y la entidad enlazada. Pueden usarse tambien enlazadores que tienen una longitud molecular mas larga o mas corta para
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proporcionar un espacio o flexibilidad deseados entre la protefna de Fc y la entidad enlazada. De manera similar, un enlazador que tiene una forma o conformacion particular puede ser utilizado para impartir una forma o conformacion particular a la protefna de Fc o la entidad enlazada, ya sea antes o despues de que la protefna de Fc alcance su objetivo. Los grupos funcionales presentes en cada extremo del enlazador pueden seleccionarse para modular la liberacion de una protefna de Fc o una carga util en las condiciones deseadas. Esta optimizacion de la relacion espacial entre la protefna de Fc y la entidad enlazada puede proporcionar nuevas propiedades moduladas o deseadas a la molecula.
En algunas realizaciones, la invencion proporciona ligandos bifuncionales solubles en agua que tienen una estructura en forma de pesa que incluye: a) una azida, un alquino, una hidracina, una hidrazida, una hidroxilamina o una unidad estructural que contiene carbonilo en al menos un primer extremo de una cadena principal polimerica; y b) al menos un segundo grupo funcional en un segundo extremo de la cadena principal del polfmero. El segundo grupo funcional puede ser igual o diferente que el primer grupo funcional. El segundo grupo funcional, en algunas realizaciones, no es reactivo con el primer grupo funcional. La invencion proporciona, en algunas realizaciones, compuestos solubles en agua que comprenden al menos un brazo de una estructura molecular ramificada. Por ejemplo, la estructura molecular ramificada puede ser dendrftica.
Composiciones de la protefna de Fc
Las protefnas de Fc y los conjugados descritos en la presente invencion se pueden formular en composiciones usando metodos disponibles en la tecnica y aquellos divulgados en la presente memoria. Cualquiera de los compuestos descritos en la presente invencion puede ser proporcionados en la composicion farmaceutica apropiada y pueden se administrados por una via adecuada de administracion.
En ciertas realizaciones, la protefna de Fc o las composiciones conjugadas de Fc proporcionadas en el presente documento comprenden ademas un portador farmaceuticamente aceptable. El portador puede ser un diluyente, excipiente o vehfculo con el que se administra la composicion farmaceutica. Tales portadores farmaceuticos pueden ser lfquidos esteriles, tales como agua y aceites, incluyendo aquellos originados en petroleo, de origen animal, vegetal o sintetico, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sesamo y similares. Tambien se pueden emplear soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol como portadores lfquidos, particularmente para soluciones inyectables. Los excipientes farmaceuticos adecuados incluyen almidon, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sflice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada seca, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. La composicion, si se desea, puede contener tambien cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes reguladores de pH. Estas composiciones pueden adoptar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, pastillas, capsulas, polvos, formulaciones de liberacion sostenida y similares. La formulacion oral puede incluir portadores estandar tales como grados farmaceuticos de manitol, lactosa, almidon, estearato de magnesio, sacarina sodica, celulosa, carbonato de magnesio, etc. Ejemplos de portadores farmaceuticos adecuados se describen en: EW Martin, 1990, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.
En algunas realizaciones, la composicion farmaceutica se proporciona en una forma adecuada para la administracion a un sujeto humano. En algunas realizaciones, la composicion farmaceutica contendra una cantidad profilactica o terapeuticamente eficaz de la protefna de Fc junto con una cantidad adecuada de portador de modo que proporcione la forma para la administracion apropiada al paciente. La formulacion debe adecuarse al modo de administracion.
En algunas realizaciones, la composicion farmaceutica se proporciona en una forma adecuada para administracion intravenosa. Tfpicamente, las composiciones adecuadas para administracion intravenosa son soluciones en regulador acuoso isotonico esteril. Cuando sea necesario, la composicion puede incluir tambien un agente solubilizante y un anestesico local tal como lignocafna para aliviar el dolor en el sitio de la inyeccion. Tales composiciones, sin embargo, pueden administrarse por una via distinta a la administracion intravenosa.
En realizaciones particulares, la composicion farmaceutica es adecuada para administracion subcutanea. En realizaciones particulares, la composicion farmaceutica es adecuada para administracion intramuscular.
Los componentes de la composicion farmaceutica pueden suministrarse ya sea por separado o mezcladas en forma de dosificacion unitaria, por ejemplo, en forma de polvo liofilizado seco o concentrado libre de agua. Cuando la composicion se va a administrar por infusion, se puede dispensar con una botella de infusion que contiene agua esteril de calidad farmaceutica o solucion salina. Cuando la composicion se administra por inyeccion, puede proporcionarse una cantidad suficiente de agua esteril para inyeccion o solucion salina, de modo que los ingredientes se puedan mezclar antes de la administracion.
En algunas realizaciones, la composicion farmaceutica se suministra como un polvo liofilizado esterilizado en seco que es capaz de ser reconstituido a la concentracion apropiada para administracion a un sujeto. En algunas realizaciones, las protefnas de Fc se suministran como un concentrado libre de agua. En algunas realizaciones, la protefna de Fc se
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suministra como un polvo esteril liofilizado seco a una dosis unitaria de al menos 0,5 mg, al menos 1 mg, al menos 2 mg, al menos 3 mg, al menos 5 mg, al menos 10 mg, al menos 15 mg, al menos 25 mg, al menos 30 mg, al menos 35 mg, al menos 45 mg, al menos 50 mg, al menos 60 mg o al menos 75 mg.
En otra realizacion, la composicion farmaceutica se suministra en forma lfquida. En algunas realizaciones, la composicion farmaceutica se proporciona en forma lfquida y esta sustancialmente libre de surfactantes y/o sales inorganicas. En algunas realizaciones, la protefna de Fc se suministra en forma lfquida a una dosis unitaria de al menos 0,1 mg/mL, al menos 0,5 mg/mL, al menos 1 mg/mL, al menos 2,5 mg/mL, al menos 3 mg/mL, al menos 5 mg/mL, al menos 8 mg/mL, al menos 10 mg/mL, al menos 15 mg/mL, al menos 25 mg/mL, al menos 30 mg/mL o al menos 60 mg/mL.
En algunas realizaciones, la composicion farmaceutica se formula en forma de sal. Las sales farmaceuticamente aceptables incluyen aquellas formadas con aniones tales como los derivados de acidos clorhfdrico, fosforico, acetico, oxalico, tartarico, etc., y aquellos formados con cationes tales como los derivados de sodio, potasio, amonio, calcio, hidroxidos ferricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procafna, etc.
En el uso terapeutico, el medico determinara la posologfa mas apropiada de acuerdo con un tratamiento preventivo o curativo y de acuerdo con la edad, el peso, el estadio de la infeccion y otros factores especfficos del sujeto a tratar. En ciertas realizaciones, las dosis son de aproximadamente 1 a aproximadamente 1000 mg al dfa para un adulto, o de aproximadamente 5 a aproximadamente 250 mg por dfa o de aproximadamente 10 a 50 mg por dfa para un adulto. En ciertas realizaciones, las dosis son de aproximadamente 5 a aproximadamente 400 mg por dfa o de 25 a 200 mg por dfa por adulto. En ciertas realizaciones, tambien se contemplan tasas de dosis de aproximadamente 50 a aproximadamente 500 mg por dfa.
Esta descripcion se refiere a metodos de uso para terapia o profilaxis
La descripcion se refiere a ciertas protefnas de Fc o conjugados de protefna de Fc proporcionados en el presente documento, que pueden usarse para el tratamiento o la prevencion de cualquier enfermedad o afeccion que se considere adecuada para el especialista en la tecnica. Generalmente, un metodo de tratamiento o prevencion abarca la administracion de una cantidad terapeuticamente o profilacticamente eficaz de la protefna de Fc o composicion conjugada a un sujeto que lo necesite para tratar o prevenir la enfermedad o condicion.
Una cantidad terapeuticamente eficaz de la protefna de Fc o composicion conjugada es una cantidad que es eficaz para reducir la gravedad, la duracion y/o los sfntomas de una enfermedad o condicion particular. La cantidad de la protefna o composicion de Fc que sera terapeuticamente eficaz en la prevencion, manejo, tratamiento y/o mejorfa de una enfermedad particular puede determinarse mediante tecnicas clfnicas estandar. La cantidad precisa de la protefna de Fc o la composicion a administrar dependen, en parte, de la via de administracion, de la gravedad de la enfermedad o afeccion en particular y deben decidirse de acuerdo con el juicio del medico y las circunstancias de cada sujeto.
De este modo, una cantidad eficaz de la protefna o conjugado de Fc esta entre aproximadamente 0,025 mg/kg y aproximadamente 1000 mg/kg de peso corporal de un sujeto humano. La protefna de Fc se administra a un sujeto humano en una cantidad de aproximadamente 1000 mg/kg de peso corporal o menos, aproximadamente 950 mg/kg de peso corporal o menos, aproximadamente 900 mg/kg de peso corporal o menos, aproximadamente 850 mg/kg de peso corporal o menos, aproximadamente 800 mg/kg de peso corporal o menos, aproximadamente 750 mg/kg de peso
corporal o menos, aproximadamente 700 mg/kg de peso corporal o menos, aproximadamente 650 mg/kg de peso
corporal o menos, aproximadamente 600 mg/kg de peso corporal o menos, aproximadamente 550 mg/kg de peso
corporal o menos, aproximadamente 500 mg/kg de peso corporal o menos, aproximadamente 450 mg/kg de peso
corporal o menos, aproximadamente 400 mg/kg de peso corporal o menos, aproximadamente 350 mg/kg de peso
corporal o menos, aproximadamente 300 mg/kg de peso corporal o menos, aproximadamente 250 mg/kg de peso
corporal o menos, aproximadamente 200 mg/kg de peso corporal o menos, aproximadamente 150 mg/kg de peso
corporal o menos, aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal o menos, aproximadamente 95 mg/kg de peso corporal o menos, aproximadamente 90 mg/kg de peso corporal o menos, aproximadamente 85 mg/kg de peso corporal o menos, aproximadamente 80 mg/kg de peso corporal o menos, aproximadamente 75 mg/kg de peso corporal o menos, aproximadamente 70 mg/kg de peso corporal o menos, o aproximadamente 65 mg/kg de peso corporal o menos.
Una cantidad eficaz de protefna de Fc o conjugado esta entre aproximadamente 0,025 mg/kg y aproximadamente 60 mg/kg de peso corporal de un sujeto humano. La cantidad eficaz de una protefna de Fc de la composicion farmaceutica proporcionada aquf es de aproximadamente 0,025 mg/kg o menos, aproximadamente 0,05 mg/kg o menos, aproximadamente 0,10 mg/kg o menos, aproximadamente 0,20 mg/kg o menos, aproximadamente 0,40 mg/kg o menos, aproximadamente 0,80 mg/kg o menos, aproximadamente 1,0 mg/kg o menos, aproximadamente 1,5 mg/kg o menos, aproximadamente 3 mg/kg o menos, aproximadamente 5 mg/kg o menos, aproximadamente 10 mg/kg o menos, aproximadamente 15 mg/kg o menos, aproximadamente 20 mg/kg o menos, aproximadamente 25 mg/kg o menos,
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aproximadamente 30 mg/kg o menos, aproximadamente 35 mg/kg o menos, aproximadamente 40 mg/kg o menos, aproximadamente 45 mg/kg o menos, aproximadamente 50 mg/kg o aproximadamente 60 mg/kg o menos.
La composicion farmaceutica se puede administrar utilizando cualquier metodo conocido por los expertos en la tecnica. Por ejemplo, la composicion farmaceutica puede administrarse por via intramuscular, intradermica, intraperitoneal, intravenosa, subcutanea o cualquier combinacion de las mismas. La composicion farmaceutica se administra por via subcutanea. La composicion se administra por via intravenosa. La composicion se administra por via intramuscular.
La descripcion se refiere a metodos de uso para deteccion o diagnostico
Las protefnas de Fc o conjugados de protefna de Fc se pueden usar para la deteccion de cualquier objetivo o para el diagnostico de cualquier enfermedad o afeccion considerada adecuada para el experto en la materia. Los metodos abarcan la deteccion de la union de una protefna de Fc a un antfgeno objetivo en la ubicacion apropiada, por ejemplo, el cuerpo, tejido o celula apropiados. En los metodos, la formacion de un complejo entre la protefna de Fc y el antfgeno se puede detectar por cualquier metodo conocido por los expertos en la tecnica. Los ejemplos incluyen ensayos que usan reactivos secundarios para la deteccion, ensayos de ELISA e inmunoprecipitacion y aglutinacion. Una descripcion detallada de estos ensayos se proporciona, por ejemplo, en Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York 1988, 555-612, WO96/13590 de Maertens y Stuyver, Zrein y colaboradores, 1998) y WO96/29605.
Para el diagnostico in situ, se puede administrar la protefna o el conjugado de Fc a un sujeto por metodos conocidos en la tecnica tales como, por ejemplo, inyeccion intravenosa, intranasal, intraperitoneal, intracerebral, intraarterial de tal manera que pueda ocurrir una union especffica entre una protefna de Fc de acuerdo con la invencion con una region epitopica sobre la protefna amiloide. El complejo protefna de Fc/antfgeno puede ser detectado convenientemente a traves de un marcador unido a la protefna de Fc o cualquier otro metodo de deteccion conocido en la tecnica.
Ademas se proporcionan aquf kits para la deteccion o diagnostico. Los ejemplos de kits comprenden una o mas protefnas o conjugados de Fc proporcionados aquf junto con uno o mas reactivos utiles para detectar un complejo entre las una o mas protefnas de Fc y sus antfgenos objetivo.
La descripcion se refiere a la preparacion de protefnas de Fc
Las protefnas de Fc se pueden preparar por cualquier tecnica evidente para los expertos en la tecnica sin limitacion. Las tecnicas utiles para la preparacion incluyen sfntesis in vivo, por ejemplo con ARNt modificado y ARNt sintetasa, sfntesis libre de celulas, por ejemplo con ARNt modificado y ARNt sintetasa, sfntesis de polipeptidos en fase solida y sfntesis de polipeptidos en fase lfquida. Se describen ejemplos de tecnicas en esta seccion y en los ejemplos mas adelante.
En ciertos metodos, la protefna de Fc se traduce y/o transcribe a partir de uno o mas polinucleotidos que codifican las cadenas polipeptfdicas de la protefna de Fc. De acuerdo con ello, se proporcionan aquf polinucleotidos capaces de codificar las protefnas de Fc que tienen uno o mas aminoacidos no naturales en posiciones especfficas del sitio en una o mas cadenas polipeptfdicas. En ciertas realizaciones, los polinucleotidos comprenden un codon no asociado normalmente con un aminoacido en la posicion del polinucleotido correspondiente a la posicion del polipeptido especffico del sitio para el aminoacido no natural. Ejemplos de tales codones incluyen codones de terminacion, codones de 4 pb, codones de 5 pb, y similares. La mezcla de reaccion comprende tfpicamente una ARNt sintetasa capaz de producir ARNt que complementa (suprime) los codones correspondientes. Estos ARNt supresores estan enlazados a los aminoacidos no naturales para facilitar su incorporacion al polipeptido en el sitio del codon supresor.
Las protefnas de Fc se pueden preparar mediante tecnicas conocidas por los expertos en la tecnica para expresar tales polinucleotidos para incorporar aminoacidos no naturales en posiciones especfficas del sitio de una cadena polipeptfdica. Tales tecnicas se describen, por ejemplo, en las patentes estadounidenses Nos. 7.045.337 y 7.083.970, en las solicitudes de patente estadounidenses publicadas Nos. 2008/0317670, 2009/0093405, 2010/0093082, 2010/0098630, 2008/0085277 y en las publicaciones internacionales de patentes Nos. WO 2004/016778 A1 y WO 2008/066583 A2.
Una protefna de Fc se puede preparar en una mezcla de reaccion libre de celulas que comprende al menos un ARNt ortogonal aminoacilado con un aminoacido no natural, en donde el ARNt ortogonal empareja las bases con un codon que normalmente no esta asociado con un aminoacido, por ejemplo, un codon de terminacion; un codon de 4 pb, etc. La mezcla de reaccion tambien comprende una ARNt sintetasa capaz de aminoacilar el ARNt ortogonal con un aminoacido no natural. Normalmente, la ARNt sintetasa ortogonal, que es susceptible de degradacion por las proteasas presentes en extractos de celulas bacterianas, se sintetiza exogenamente y se anade a la mezcla de reaccion antes del inicio de la sfntesis de polipeptidos. El ARNt ortogonal puede sintetizarse en las celulas bacterianas a partir de las cuales se obtiene el extracto celular, puede sintetizarse de nuevo durante la reaccion de sfntesis del polipeptido o puede anadirse exogenamente a la mezcla de reaccion.
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Los componentes que afectan la insercion de aminoacidos no naturales y la insercion o plegado de protefnas se anaden opcionalmente a la mezcla de reaccion. Tales componentes incluyen concentraciones elevadas de factores de traduccion para minimizar el efecto del factor de liberacion 1 y 2 y para optimizar adicionalmente las concentraciones de componentes ortogonales. Las chaperonas de protefnas (Sistema Dsb de oxidorreductasas e isomerasas, GroES, GroEL, DNAJ, DNAK, Skp, etc.) pueden anadirse exogenamente a la mezcla de reaccion o se pueden sobreexpresar en las celulas fuente utilizadas para preparar el extracto celular. Las reacciones pueden utilizar un reactor a gran escala, escala pequena, o pueden multiplexarse para realizar una pluralidad de sfntesis simultaneas. Las reacciones continuas utilizaran un mecanismo de alimentacion para introducir un flujo de reactivos y pueden aislar el producto final como parte del proceso. Los sistemas por lotes tambien son de interes, donde se pueden introducir reactivos adicionales para prolongar el periodo de tiempo para la sfntesis activa. Un reactor puede funcionar en cualquier modo tal como por lotes, lotes extendidos, semidiscontinua, semicontinua, alimentado por lotes y continua, y que se seleccionara de acuerdo con pel proposito de aplicacion. Las reacciones pueden ser de cualquier volumen, ya sea a escala pequena, usualmente al menos aproximadamente 1 pL y no mas de aproximadamente 15 pL, o en una reaccion escalada, donde el volumen de reaccion es al menos aproximadamente 15 pL, usualmente al menos aproximadamente 50 pl, mas habitualmente al menos aproximadamente 100 pl, y puede ser de 500 pl, 1000 pl o mayor. En principio, las reacciones pueden realizarse a cualquier escala siempre que se suministre suficiente oxfgeno (u otro aceptor de electrones) cuando sea necesario.
Los metodos utiles para sfntesis en donde al menos se introduce un aminoacido no natural en la cadena del polipeptido durante el alargamiento incluyen, pero no se limitan a: (I) adicion de sintetasa ortogonal purificada exogena, aminoacido no natural y ARNt ortogonal a la reaccion libre de celulas (II) adicion de sintetasa ortogonal purificada exogena y aminoacido no natural a la mezcla de reaccion, pero con ARNt ortogonal transcrito durante la reaccion libre de celulas, (III) adicion de sintetasa ortogonal purificada exogena y aminoacido no natural a la mezcla de reaccion , pero con ARNt ortogonal sintetizado por el organismo fuente del extracto celular. En ciertas realizaciones, los componentes ortogonales son dirigidos por promotores regulables, de tal manera que se pueden controlar los niveles de sfntesis aunque se pueden utilizar otras mediciones tales como el control del nivel de las plantillas de ADN relevantes mediante adicion o digestion especffica.
Se utiliza un sistema de expresion libre de celulas bacterianas para producir variantes de protefnas o peptidos con aminoacidos no nativos (nnAA). El uso de extractos libres de celulas bacterianas para la sfntesis de protefnas in vitro ofrece varias ventajas sobre los metodos convencionales de expresion de la protefna in vivo. Los sistemas libres de celulas pueden dirigir la mayorfa, si no la totalidad, de los recursos metabolicos de la celula hacia la produccion exclusiva de una protefna. Ademas, la carencia de una pared celular y componentes de membrana in vitro es ventajosa ya que permite el control del ambiente de la sfntesis. Sin embargo, la eficacia de los extractos libres de celulas puede disminuirse por las protefnas bacterianas que inhiben la sfntesis de protefnas, ya sea directa o indirectamente. De este modo, la inactivacion de protefnas indeseables que disminuyen la eficacia de la sfntesis proteica deberfa aumentar el rendimiento de protefnas deseables en extractos libres de celulas. Por ejemplo, la inactivacion de protefnas que disminuyen la eficacia de la sfntesis de protefnas deberfa incrementar el rendimiento de polipeptidos que tienen aminoacidos no nativos incorporados en un residuo de aminoacido definido. La introduccion de nnAA en polipeptidos es util para aumentar la diversidad biologica y la funcion de las protefnas. Un enfoque para producir polipeptidos que tienen un nnAA incorporado en un residuo de aminoacido definido es usar un nnAA, CUA ortogonal aminoacilado que contiene ARNt para la introduccion del nnAA en el polipeptido naciente en un codon ambar (terminacion) durante la traduccion de la protefna. Sin embargo, la incorporacion de nnAA en el codon ambar puede ser inhibida por el complejo de terminacion bacteriano nativo, que normalmente reconoce el codon de terminacion y termina la traduccion. El factor de liberacion 1 (RF1) es una protefna compleja de terminacion que facilita la terminacion de la traduccion mediante el reconocimiento del codon ambar en una secuencia de ARNm. El reconocimiento de RF1 del codon de terminacion ambar puede promover productos de truncamiento prematuros en el sitio de incorporacion de aminoacidos no nativos y, de este modo, disminuir el rendimiento de protefna. Por lo tanto, la atenuacion de la actividad de RF1 puede aumentar la incorporacion de nnAA en las protefnas recombinantes.
Se ha demostrado previamente que la incorporacion de nnAA puede aumentarse mediante la atenuacion de la actividad de RF1 de 3 formas: 1) neutralizacion de la inactivacion del anticuerpo de RF1, 2) desactivacion genomica de RF1 (en una cadena reforzada por RF2), y 3) remocion especffica del sitio de RF1 usando una cadena modificada para expresar RF1 que contiene un marcador de protefna para su remocion por cromatograffa de afinidad (Dominio de union de quitina y Etiqueta His). Otro metodo para inactivar RF1 comprende la introduccion de sitios de escision proteolfticos en la secuencia de aminoacidos RF1. Los sitios de escision no son accesibles a la proteasa durante el crecimiento de celulas bacterianas, pero son escindidos por la proteasa cuando las celulas bacterianas son lisadas para producir extracto libre de celulas. Por lo tanto, el rendimiento de polipeptidos de longitud completa que tienen un nnAA incorporado en un codon ambar se incrementa en los extractos de celulas bacterianas que expresan tales variantes modificadas de RF1.
Con el fin de producir protefnas de Fc que comprenden un aminoacido no natural, se necesita una plantilla de acido nucleico. Las plantillas para la sfntesis de protefnas libres de celulas pueden ser o bien ARNm o ADN. La plantilla puede comprender secuencias para cualquier anticuerpo particular de interes, y puede codificar un anticuerpo de longitud completa o un fragmento de cualquier longitud del mismo. Los acidos nucleicos que sirven como plantillas para la sfntesis de protefnas se derivan opcionalmente de una fuente natural o pueden ser sinteticos o recombinantes. Por ejemplo, los ADN pueden ser ADN recombinantes, por ejemplo, plasmidos, virus o similares.
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Una vez que se produce una plantilla de acido nucleico de una protefna de Fc, se utiliza la plantilla para sintetizar el anticuerpo en un sistema de traduccion libre de celulas. Por ejemplo, la plantilla puede anadirse a un lisado celular en condiciones suficientes para traducir la plantilla en protefna. El lisado celular puede ser de celulas bacterianas o celulas eucariotas. La protefna de Fc expresada puede entonces purificarse usando metodos conocidos en la tecnica, como se describe a continuacion.
Se puede usar un sistema de traduccion (por ejemplo, un sistema de sfntesis de protefnas in vitro) para producir la protefna de Fc con uno o mas nnAA incorporados en el mismo. Un ejemplo de sistema de traduccion comprende un extracto libre de celulas, lisado celular o sistema de traduccion reconstituido, junto con la plantilla de acido nucleico para la sfntesis del polipeptido o protefna deseada que tiene aminoacidos no nativos en posiciones preseleccionadas (definidas). La mezcla de reaccion comprendera ademas monomeros para la macromolecula que se va a sintetizar, por ejemplo, aminoacidos, nucleotidos, etc., y tales cofactores, enzimas y otros reactivos que son necesarios para la sfntesis, por ejemplo, ribosomas, ARNt, polimerasas, factores de transcripcion, etc. Ademas de los componentes anteriores tales como un extracto libre de celulas, una plantilla de acido nucleico y aminoacidos, los materiales especfficamente requeridos para la sfntesis de protefnas pueden anadirse a la reaccion. Los materiales incluyen sales, acido folfnico, AMP cfclico, inhibidores de enzimas de degradacion de protefnas o de acidos nucleicos, inhibidores o reguladores de la sfntesis de protefnas, ajustadores de potenciales de oxidacion/reduccion, surfactantes no desnaturalizantes, componentes reguladores, espermina, espermidina, putrescina, etc. Se conocen en la tecnica diversos sistemas de reaccion de sfntesis libres de celulas. Vease, por ejemplo, Kim, D.M. y Swartz, J.R. Biotechnol. Bioeng. 66: 180 - 8 (1999); Kim, D.M. y Swartz, J.R. Biotechnol. Prog. 16: 385 - 90 (2000); Kim, D.M. y Swartz, J.R. Biotechnol. Bioeng. 74: 309 - 16 (2001); Swartz y colaboradores, Methods MoL Biol. 267: 169-82 (2004); Kim, D.M. y Swartz, J.R. Biotechnol. Bioeng. 85: 122 - 29 (2004); Jewett, M.C. Y Swartz, J.R., Biotechnol. Bioeng. 86: 19-26 (2004); yin, G. y Swartz, J.R., Biotechnol. Bioeng. 86: 188- 95 (2004); Jewett, M.C. Y Swartz, J.R., Biotechnol. Bioeng. , 87: 465 - 72 (2004); Voloshin, A.M. y Swartz, J.R., Biotechnol. Bioeng. 91: 516- 21 (2005). Las condiciones adicionales para la sfntesis libre de celulas de los polipeptidos deseados se describen en el documento WO2010/081110.
Se utiliza una plantilla de ADN para conducir la sfntesis de protefna in vitro, y se anade ARN polimerasa a la mezcla de reaccion para proporcionar una transcripcion mejorada de la plantilla de aDn. Las ARN polimerasas adecuadas para uso en la presente invencion incluyen cualquier ARN polimerasa que funcione en las bacterias de las que se deriva el extracto bacteriano. En otras realizaciones, se utiliza una plantilla de ARN para conducir la sfntesis de protefna in vitro, y se pueden mezclar los componentes de la mezcla de reaccion en cualquier orden conveniente, pero se mezclan preferiblemente en un orden en el que se anade de ultimo la plantilla de ARN, minimizando asf la degradacion potencial de la plantilla de ARN por las nucleasas.
En algunas realizaciones, se utiliza un sistema de traduccion libre de celulas para producir el anticuerpo con uno o mas nnAA incorporados en el mismo. La sfntesis de protefnas libre de celulas explota la potencia catalftica de la maquinaria celular. La obtencion de rendimientos maximos de protefna in vitro requiere un suministro adecuado de sustrato, por ejemplo, trifosfatos de nucleosido y aminoacidos, un ambiente homeostatico, estabilidad del catalizador y la remocion o evitar la presencia de subproductos inhibidores. La optimizacion de reacciones de sfntesis in vitro se beneficia de la recreacion del estado in vivo de un organismo que crece rapidamente. En algunas realizaciones de la invencion, la sfntesis libre de celulas se realiza por lo tanto en una reaccion en la que se activa la fosforilacion oxidativa. Detalles adicionales se describen en la patente estadounidense No. 7.338.789.
La sfntesis de protefnas libre de celulas, in vitro, ofrece varias ventajas sobre los metodos convencionales de expresion de protefna in vivo. Los sistemas libres de celulas pueden dirigir la mayorfa, si no la totalidad, de los recursos metabolicos de la celula hacia la produccion exclusiva de una protefna. Ademas, la falta de una pared celular y componentes de la membrana in vitro es ventajosa ya que permite el control del ambiente para la sfntesis. Por ejemplo, se pueden cambiar los niveles de ARNt para reflejar el uso de codones de los genes que estan siendo expresados. El potencial redox, el pH o la fuerza ionica tambien pueden alterarse con mayor flexibilidad que con la sfntesis de protefna in vivo, ya que no existen preocupaciones acerca del crecimiento o viabilidad de las celulas. Ademas, se puede lograr facilmente la recuperacion directa de los productos de protefna adecuadamente plegada, y purificada adecuadamente. La productividad de los sistemas libres de celulas ha mejorado en dos ordenes de magnitud en los ultimos anos, de aproximadamente 5 pg/mL-h hasta aproximadamente 500 pg/mL-h.
La ARNt sintetasa se sintetiza exogenamente y se anade a la mezcla de reaccion libre de celulas. En ciertas realizaciones, la mezcla de reaccion se prepara a partir de celulas bacterianas en las que se ha inactivado ompT o esta naturalmente inactivo. Se cree que ompT degrada componentes de la mezcla de reaccion incluyendo la ARNt sintetasa.
Ademas de los componentes anteriores tales como extracto libre de celulas, plantilla genetica y aminoacidos, los materiales especfficamente requeridos para la sfntesis de protefnas pueden anadirse a la reaccion. Estos materiales incluyen sales, acido folfnico, AMP cfclico, inhibidores de enzimas de degradacion de protefnas o de acidos nucleicos, inhibidores o reguladores de la sfntesis de protefnas, ajustadores de potenciales de oxidacion/reduccion, surfactantes no desnaturalizantes, componentes reguladores, espermina, espermidina, putrescina, etc.
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Las sales incluyen preferiblemente sales de potasio, magnesio y amonio (por ejemplo de acido acetico o acido glutamico). Una o mas de tales sales pueden tener un aminoacido alternativo como contraanion. Existe una interdependencia entre las especies ionicas para la concentracion optima. Estas especies ionicas se optimizan tfpicamente con respecto a la produccion de protefnas. Cuando se cambia la concentracion de un componente particular del medio de reaccion, aquella del otro componente puede cambiarse en consecuencia. Por ejemplo, las concentraciones de varios componentes tales como nucleotidos y compuestos de fuentes energeticas pueden ser simultaneamente ajustadas de acuerdo con el cambio en aquellas de otros componentes. Ademas, los niveles de concentracion de los componentes en el reactor se pueden variar con el tiempo. El ajustador del potencial de oxidacion/reduccion puede ser ditiotreitol, acido ascorbico, glutation y/o sus formas oxidadas.
La reaccion puede proceder en un modo de dialisis, en un modo discontinuo de diafiltracion, en un modo alimentado por lotes de un modo de operacion semicontinuo. Se puede suministrar una solucion de alimentacion al reactor a traves de una membrana o a traves de una unidad de inyeccion. La protefna de Fc sintetizada puede acumularse en el reactor seguido por aislamiento o purificacion despues de completarse la operacion del sistema. Las vesfculas que contienen la protefna de Fc pueden tambien ser aisladas en forma continua, por ejemplo por adsorcion de afinidad a partir de la mezcla de reaccion, ya sea in situ o en un circuito de circulacion a medida que el fluido de reaccion es bombeado mas alla de la matriz de adsorcion.
Durante la sfntesis de protefnas en el reactor, los medios de aislamiento de protefnas para aislar selectivamente la protefna deseada pueden incluir una unidad empacada con partfculas recubiertas con moleculas de protefna de Fc u otras moleculas para adsorber la protefna sintetizada deseada. Preferiblemente, los medios de aislamiento de protefnas comprenden dos columnas para uso alternativo.
La protefna de Fc resultante puede purificarse o aislarse mediante tecnicas estandar. Se proporcionan ejemplos de tecnicas en los ejemplos mas adelante.
Metodos de ensayo
Las protefnas de Fc se pueden ensayar por su actividad esperada, o por una nueva actividad, de acuerdo con cualquier ensayo evidente para los expertos en la tecnica. Se puede ensayar la actividad de la protefna de Fc resultante en un ensayo funcional, por ejemplo, mediante la union al receptor de Fc, o mediante la cuantificacion de la cantidad de protefna presente en un ensayo no funcional, por ejemplo, Inmunotincion, ELISA, cuantificacion sobre un gel tenido con Coomassie o plata, etc., y determinar la relacion de la protefna biologicamente activa con respecto a la protefna total.
La cantidad de protefna producida en una reaccion de traduccion se puede medir de diversas maneras. Un metodo se basa en la disponibilidad de un ensayo que mide la actividad de la protefna particular que esta siendo traducida. Un ejemplo de un ensayo para medir la actividad de la protefna es un sistema de ensayo con luciferasa o un sistema de ensayo con acetil transferasa y cloranfenicol. Estos ensayos miden la cantidad de protefna funcionalmente activa producida a partir de la reaccion de traduccion. Los ensayos de actividad no mediran la protefna de longitud completa que es inactiva debido al plegamiento inadecuado de la protefna o falta de otras modificaciones postraduccionales necesarias para la actividad de la protefna.
Otro metodo para medir la cantidad de protefna producida en reacciones de transcripcion y traduccion acopladas in vitro es llevar a cabo las reacciones usando una cantidad conocida de aminoacidos marcados radioactivamente tales como 35S-metionina, 3H-leucina o 14C-leucina y posteriormente medir la cantidad de aminoacido marcado en forma radioactiva incorporado en la protefna recien traducida. Los ensayos de incorporacion mediran la cantidad de aminoacidos marcados en forma radiactiva en todas las protefnas producidas en una reaccion de traduccion in vitro que incluye productos de protefna truncados. La protefna marcada en forma radiactiva puede ser separada ademas en un gel de protefna y, mediante autorradiograffa, se confirma que el producto sea del tamano apropiado y que los productos de la protefna secundaria no hayan sido producidos.
Ejemplos
Tal como se utiliza en la presente invencion, los sfmbolos y convenciones utilizados en estos procedimientos, esquemas y ejemplos, independientemente de si una abreviatura particular esta definida especfficamente, son consistentes con los usados en la literatura cientffica contemporanea, por ejemplo, el Journal of Biological Chemistry.
Para todos los ejemplos siguientes, pueden utilizarse metodos estandar de tratamiento y purificacion conocidos por los expertos en la tecnica. A menos que se indique lo contrario, todas las temperaturas se expresan en °C (grados centfgrados). Todos los metodos se llevan a cabo a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario. Los siguientes ejemplos ilustran ejemplos de moleculas que contienen Fc que contienen aminoacidos no naturales que estan en el contexto de secuencias de anticuerpos de longitud completa. Se cree que las secuencias de cadena pesada del extremo N terminal y secuencias de cadena ligera no afectan significativamente la idoneidad de los sitios particulares para la incorporacion de un aminoacido no natural y/o conjugacion con ese aminoacido no natural. Por lo
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tanto, los sitios que tienen propiedades deseables en el contexto de un anticuerpo de longitud completa tambien tienen propiedades deseables en el contexto de una protefna de Fc.
Ejemplo 1
Sfntesis de ejemplos de anticuerpos que contienen aminoacidos no naturales y conjugacion con un ejemplo de un agente citotoxico
El siguiente ejemplo describe ejemplos de anticuerpos que contienen aminoacidos no naturales en posiciones definidas junto con metodos para su construccion y expresion. Los anticuerpos se evaluaron en cuanto a expresion, eficacia de supresion, eficacia de conjugacion con un agente de destruccion de celulas, union celular y muerte celular, como se expone a continuacion. En este ejemplo, los ejemplos de anticuerpos se basan en el anticuerpo progenitor trastuzumab (patente estadounidense No. 6.165.464 y el documento 2006/0018899 A1, Carter y colaboradores, 1992, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 10: 4285-4289).
En primer lugar, se elaboraron constructos mediante la incorporacion de un codon ambar TAG en una posicion definida en la cadena pesada de trastuzumab. Se llevo a cabo la mutagenesis dirigida al sitio utilizando un plasmido pYD que contiene la region codificante de trastuzumab con un marcador (His)6 del extremo terminal C (SD02005) como plantilla de ADN y oligonucleotidos sinteticos (Eurofins MWS Operon, Huntsville, AL) que contiene mutaciones de interes tanto en direcciones sentido como antisentido. Se anadieron oligonucleotidos de cada mutacion a la plantilla de ADN y polimerasa PHUSION® (New England Biolabs; Ipswich, MA) hasta un volumen final de 20 pL. La concentracion final de cada componente fue de 0,16 pM de cada oligonucleotido, 0,5 ng/pL de ADN plantilla, 0,02 U/pL de polimerasa PHUSION® en regulador de HF que contenfa MgCh 1,5 mM y dNTP 200 pM. Se incubo la mezcla a 98°C durante 5min, 18 ciclos de PCR (98 C durante 30s, 55°C durante 1 min, 72°C durante 4 min), 10 min a 72°C y se almaceno a 4°C. Se anadio Dpnl (New England Biolabs, Ipswich, MA) a la mezcla hasta una concentracion final de 0,6 U/pL y se incubo a 37°C durante 1 hora para digerir el aDn progenitor.
Se transformaron luego 5 pL de cada mezcla en 50 pL de celulas de E. coli qufmicamente competentes con una placa TOP10 MultiShotMR de 96 pozos de acuerdo con el procedimiento del fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA). Las celulas transformadas se recuperaron en 200 pL de SOC (Invitrogen, Carlsbad, CA) a 37°C durante 1 hora y se colocaron en agar Luria-Bertani (LB) suplementado con 50 pg/mL de kanamicina (Teknova, Hollister, CA). Despues de 24 horas a 37°C, las colonias se recogieron en 200 pL de Lb con glicerol al 7,5% y 50 pg/mL de kanamicina, y se cultivaron a 37°C durante 24 h. Se usaron 20 pL de cultivo para amplificacion circular continua (RCA) y se secuenciaron mediante extension con cebadores utilizando cebadores T7 (SEQ ID NO.: 2, 5'TAATACGACTcAcTATAGG3') y T7 terminador (SEQ ID NO.: 3, 5'GCTAGTTATTGCTCAGCG3'). Se analizo la secuencia usando el software SEQuENcHER® (Gene Codes Corp., Ann Arbor, MI), y se recogieron los clones que contenfan mutaciones y se dispusieron en placas de 96 pozos. Se desarrollaron cultivos de las variantes seleccionadas durante la noche y se utilizaron para preparar ADN de plasmido utilizando el protocolo estandar de minipreparacion de 96 pozos de acuerdo con el fabricante (Qiagen, Germantown, MD). La concentracion de ADN de los minipreparados se midio usando absorbancia a 260 nm (y 280 nm).
Las variantes se expresaron luego en una reaccion de sfntesis de protefna libre de celulas como se describe a continuacion en Zawada y colaboradores, 2011, Biotechnol. Bioeng.108 (7) 1570-1578 con las modificaciones descritas a continuacion. Tambien se elaboro trastuzumab no sustituido como un control. Se trataron los extractos libres de celulas con yodoacetamida 50 pM durante 30 min a TA (20°C) y se anadieron a una premezcla que contenfa todos los demas componentes excepto el ADN de cadena pesada de las variantes de interes. Las reacciones libres de celulas se iniciaron mediante la adicion de ADN de plasmido de variantes de ADN de cadena pesada y se incubaron a 30°C durante 12 horas en un agitador a 450 rpm en placas profundas de 96 pozos. La reaccion se incubo adicionalmente a 4°C durante 5 h. La concentracion final en la reaccion de sfntesis de protefnas fue de 30% de extracto celular, para- azido fenilalanina 1 mM (pAzF) (RSP Amino Acids), 0,125 mg/mL de ARNt supresor de ambar de M jannaschii, 0,37 mg/mL de aminoacil-ARNt sintetasa especffico de pAzF de M jannaschii (FRS), GSSG 2 mM, 0,29 mg/mL de PDI (Mclab), 100 pg/mL de DsbC de E. coli, glutamato de magnesio 8 mM, glutamato de amonio 10 mM, glutamato de potasio 130 mM, piruvato de sodio 35 mM, AMP 1,2 mM, 0,86 mM de cada uno de GMP, UMP y CMP, aminoacidos 2 mM (excepto 0,5 mM para tirosina y fenilalanina), oxalato de sodio 4 mM, putrescina 1 mM, espermidina 1,5 mM, fosfato de potasio 15 mM, T7 RNAP 100 nM, 2 pg/mL de ADN de cadena ligera de trastuzumab, 8 pg/mL de ADN de cadena pesada de trastuzumab-(His)6. Cada variante de trastuzumab fue producida a escala de 1 mL en placas de 96 pozos profundos por duplicado. Se utilizaron un total de tres placas para expresar las variantes, se comparo cada una con la expresion de un trastuzumab no sustituido para normalizar la expresion a traves de las placas. Debe observarse que todas las variantes de trastuzumab asf producidas eran no glicosiladas.
Para controlar la sfntesis de protefnas, se removio una porcion de cada reaccion de sfntesis de protefna libre de celulas y se anadio 1-[U-14C]-leucina al 3,33% (v/v) (300 mCi/mmol, GE Life Sciences, Piscataway, NJ). Se determino la supresion del codon ambar en diferentes sitios de la cadena pesada mediante autorradiograffa con [14C] de geles reductores SDS-PAGE. Se corrieron variantes de cadena pesada de trastuzumab de longitud completa y de cadena pesada de trastuzumab suprimidas a 50 kD en SDS-PaGe. No se corrieron variantes de trastuzumab suprimidas (truncadas) con un peso molecular menor. La supresion de ambar en la cadena pesada se determina mediante:
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intensidad de banda de la variante TAG de cadena pesda suprimida
supresion =----------------------------------------------------------------------------------------
intensidad de banda de cadena pesada de tipo silvestre
Se determino la intensidad de banda mediante ImageQuant (Amersham Biosciences Corp., Piscataway, NJ). Debe observarse que este ensayo en gel con 14C no puede usarse para evaluar las supresiones de las variantes de TAG de la cadena pesada desde la posicion de 425 (numeracion del fndice UE) hasta el extremo terminal C ya que las variantes truncadas no pueden distinguirse del producto de longitud completa.
Despues de la sfntesis, se diluyo cada reaccion de 1 mL con 1 mL de PBS a pH 7,4. Se centrifugo la mezcla a 5000 x g a 4°C durante 15 min. Se capturo el sobrenadante con Phytip de IMAC que contenfa 40 pL de resina (PhyNexus, Inc., San Jose, CA) pipeteando hacia arriba y hacia abajo 4 veces lentamente a una velocidad de flujo de 4,2 pL/min. Se lavo la resina con 925 pL de regulador de union a ImAc (Tris 50 mM pH 8,0, NaCl 300 mM, imidazol 10 mM) pipeteando hacia arriba y hacia abajo dos veces a una velocidad de flujo de 8,3 pL/min. Este proceso se repitio una vez con 925 pL adicionales de regulador de union a IMAC. Se eluyo la protefna enlazada con 250 pL de regulador de elucion IMAC (Tris 50 mM pH 8,0, NaCl 300 mM, Imidazol 500 mM) pipeteando hacia arriba y hacia abajo 4 veces a una velocidad de flujo de 4,2 pL/min. Ya que la etiqueta (His)a del constructo esta en el extremo terminal C, este procedimiento permite el aislamiento de la protefna de longitud completa. Para cuantificar las variantes despues de la purificacion, se mezclaron las muestras purificadas con IMAC con regulador de carga de gel 2x (Bio-Rad # 161-0737) resuelto mediante un gel Stain-FreeMR al 4-15% (Bio-Rad CriterionMRTGX # 567-8085). Las muestras no se calentaron antes de cargarlas en los pozos del gel. Se visualizaron y cuantificaron las bandas de protefnas mediante el sistema Gel Doc EZ de Bio-Rad utilizando el software Image Lab (v3). Se determinaron las intensidades de banda de las muestras con base en los estandares de masa de HERCEPTIN® cargados en el mismo gel.
A continuacion, se conjugaron las variantes de trastuzumab con un ejemplo de un agente citotoxico, MMAF, usando un reactivo de ciclooctilo restringido. En resumen, se disolvio DBCO-MMAF (estructura mostrada en la Figura 1, ACME Bioscience, Palo Alto, CA) en DMSO hasta una concentracion final de 5 mM. Se diluyo el compuesto con PBS hasta 1 mM y luego se anadio a las variantes de trastuzumab-(His)a en regulador de elucion IMAC hasta una concentracion final de farmaco de 100 pM. Se incubo la mezcla a TA (20°C) durante 17 horas. Se detuvo la reaccion mediante la adicion de azida de sodio hasta una concentracion final de 100 mM y se intercambio el regulador usando placas Zeba (Thermo Scientific, Waltham, MA) equilibrada en PBS 1X. Se paso luego el filtrado a traves de una placa Q de MUSTANG® (Pall Corp., Port Washington, NY) para remover la endotoxina.
Ejemplo 2
Caracterizacion de ejemplos de conjugados de anticuerpo-farmaco
Se realizo cromatograffa de interaccion hidrofoba (HIC) para cuantificar las muestras y determinar las relaciones farmaco-anticuerpo de los conjugados de farmaco de la variante de trastuzumab de la siguiente manera. Se diluyeron las muestras y estandares 1: 2 en sulfato de amonio 3M (EMD Chemical), fosfato de sodio 50 mM pH 7,0 (Mallinckrodt) preparadas en agua MilliQ. Se equipo un sistema HPLC de bomba binaria Agilent 1100 con una columna TSK-gel butil- NPR® (4,6 mm x 3,5 cm) de Tosoh Bioscience LLC con una temperatura de compartimiento de columna de 30°C. La fase movil A fue sulfato de amonio 1,5 M, fosfato de sodio 50 mM, pH 7,0. La fase movil B fue fosfato de sodio 50 mM, pH 7,0 en agua: alcohol isopropflico en proporcion 80:20 (Honeywell). Se suministro la fase movil a una velocidad de flujo de 1,0 mL/minuto. Se realizo la separacion con un gradiente lineal de 15% de fase movil B a 100% de fase movil B en 10 minutos. Los datos UV se adquirieron tanto a 210 como a 280 nm. Las areas de los picos se cuantificaron usando el software de Chemstation (Agilent) y la relacion de farmaco- anticuerpo (DAR) se calculo a partir del porcentaje del area de total del pico.
Para evaluar la union de las variantes de trastuzumab conjugadas, se realizo un ensayo de union a las celulas que expresan HER2 de la siguiente manera. La union de las variantes conjugadas purificadas a HER2 en celulas SKBR3, que sobreexpresan al producto del gen HER2/c-erb-2, con mas de 1,5 millones de copias de receptor por celula (ATCC # HTB-30, Manassas, VA) se comparo con Herceptin® grado clfnico, trastuzumab no glicosilado producido por la sfntesis de protefnas libre de celulas, o IgG1 en suero humano como control negativo (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Se cultivaron celulas SKBR3 en DMEM: F-12 de Ham (50:50), alto contenido de glucosa (Cellgro-Mediatech, Manassas, VA) suplementado con suero fetal bovino inactivado por calor al 10% (Hyclone; Thermo Scientific, Waltham, MA) MM glutamax (Invitrogen, Carlsbad, CA) y penicilina/estreptomicina 1x (Cellgro-Mediatech, Manassas, VA). Se lavaron dos veces las celulas adherentes con solucion salina equilibrada de Hanks (HBSS) libre de calcio y magnesio, se recolectaron con HYQ®TASEMR (Hyclone, Thermo Scientific, Waltham, MA). Se incubaron un total de 200.000 celulas por muestra en un volumen total de 10 pL con diluciones seriadas ya sea de una variante conjugada de trastuzumab, HERCEPTIN® grado clfnico o trastuzumab no glicosilado elaborado en 10 pL de regulador FACS (regulador DPBS suplementado con albumina de suero bovino al 1%). Se incubaron las celulas mas el anticuerpo o ADC durante 60 minutos sobre hielo. Se utilizaron como controles las celulas no tenidas, IgG1 humana (control de isotipo) y anticuerpo secundario (anti IgG humana de cabra). Se lavaron las celulas dos veces con regulador FACS enfriado sobre hielo y se incubaron ya sea con 5 pg/mL de anticuerpo secundario anti IgG humano de cabra marcado con Alexa 647 (Invitrogen,
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Carlsbad, CA) sobre hielo durante 1 hora. Se lavaron todas las muestras usando regulador FACS y se analizaron usando un sistema BD FACS Calibur (BD Biosciences, San Jose, CA).
Se ajustaron las intensidades medias de fluorescencia usando un analisis de regresion no lineal con una ecuacion de union especffica del sitio usando GraphPad Prism (Software, GraphPad version 5.00, San Diego, CA). Los datos se expresaron como MFI relativo contra la concentracion de anticuerpo o variante de anticuerpo en pg/mL.
A continuacion, se midieron los efectos del trastuzumab conjugado sobre la muerte celular con un ensayo de proliferacion celular de la siguiente manera. Se obtuvieron celulas SKBR3 y MDA-MB-468 de la ATCC y se mantuvieron en DMEM: F-12 de Ham (50:50), alto contenido de glucosa (Cellgro-Mediatech, Manassas, VA) suplementada con suero fetal bovino inactivado por calor al 10% (Hyclone; Thermo Scientific, Waltham, MA), glutamax 2 mM (Invitrogen, Carlsbad, CA) y penicilina/estreptomicina 1x (Cellgro-Mediatech, Manassas, VA). Se lavaron dos veces las celulas adherentes con solucion salina equilibrada de Hanks (HBSS) libre de calcio y magnesio, se recogieron con HYQ®TASEmr (Hyclone, Thermo Scientific, Waltham, MA). Se sembraron un total de 103 celulas en un volumen 40 pL en una placa de poliestireno blanco de fondo plano de 96 pozos de superficie media. Se permitio que las celulas se adhirieran durante la noche a 37°C en una incubadora de CO2. Se formularon las variantes de ADC a una concentracion 2x en medio DMEM/F12 y se filtraron a traves de placas filtrantes de 96 pozos MultiScreenHTS (Millipore, Billerica, MA). Las variantes de trastuzumab conjugadas esterilizadas a traves de filtro, HERCEPTIN, o trastuzumab no glicosilado fueron anadidas en pozos de tratamiento y se cultivaron las placas a 37°C en una incubadora de CO2 durante 120 horas. Para la medicion de la viabilidad celular, se anadieron 80 pL del reactivo Cell Titer-Glo® (Promega Corp., Madison, WI) en cada pozo y se procesaron las placas de acuerdo a las instrucciones del producto. Se midio la luminiscencia relativa en un lector de placas ENVISION® (Perkin-Elmer, Waltham, MA). Las lecturas relativas de luminiscencia se convirtieron en % de viabilidad usando celulas no tratadas como controles. Se ajustaron los datos con un analisis de regresion no lineal, usando log (inhibidor) contra la pendiente de la variable de respuesta, ecuacion de ajuste de 4 parametros usando GraphPad Prism (Software, GraphPad version 5.00, San Diego, CA). Los datos se expresaron como viabilidad celular relativa, % del contenido de ATP contra la dosis de ADC en pg/mL.
Los resultados positivos de estos experimentos de caracterizacion se presentan en las Tablas 1, 2 y 3 (placas 1, 2 y 3, respectivamente). En las Tablas, se muestran las siguientes propiedades de las variantes: el orden de clasificacion y la concentracion de la protefna elaborada, la eficacia de expresion del producto de longitud completa comparado con el tipo silvestre (eficacia de supresion), la capacidad para unir las celulas que expresan a HER2, la relacion farmaco- anticuerpo (expresada como el numero de agentes citotoxicos por anticuerpo), un comentario con respecto al perfil de HIC, y la IC50 observada a partir del ensayo de muerte celular descrito anteriormente. En los comentarios con respecto al ensayo HIC, el pico unico corresponde a un perfil que se resolvio bien como un solo pico (un ejemplo de tal perfil se muestra en la Figura 2), NWR corresponde a un perfil pobremente resuelto (un ejemplo de tal perfil se muestra en la Figura 3), y WR corresponde a un perfil de HIC bien resuelto (un ejemplo de tal perfil se muestra en la Figura 4). Varias de las variantes que exhibieron un perfil de un solo pico tambien exhibieron una gran capacidad de matar, lo que indica que la variante estaba en realidad conjugada con el farmaco, pero no pudo resolverse en la columna de HIC.
En general, las variantes preferidas exhiben una IC50 de aproximadamente 20 ng/mL o inferior, aun mas preferiblemente inferior a aproximadamente 10 ng/mL, e incluso mas preferiblemente inferior a aproximadamente 5 ng/mL. Preferiblemente, las variantes estan en el 50% superior de expresion, e incluso mas preferiblemente, estan en el 25% superior de expresion. Las variantes que tienen una DAR de al menos aproximadamente 1,0 son tambien preferidas. Las variantes preferidas incluyen aquellas con un aminoacido no natural que reemplaza las posiciones P238, S239, F241, F243, K246, E356, M358, K360, V262, V264, D265, S267, H268, E269, D270, P271, E272, K274, F275, Y278,
D280, G281, V282, E283, N286, T289, R292, E293, E294, Q295, Y296, N297, S298, T299, Y300, R301, V303, V305,
K317, K320, S324, K326, A327, P329 A330, I332, E333, K334, T335, S337, A339, Q342, R344, R355, T359, L398, S375, S383, N384, Q386, N389, K392, F404, G420, K340, Q438, N421 y Y436, en donde la letra denota un aminoacido especffico y el numero indica la posicion del aminoacido particular. Incluso mas preferidas eran las variantes que incluyen aquellas con aminoacidos no naturales que reemplazan las posiciones S239, F241, K246, S267, H268, E269, D270, P271, E272, K274, F275, D280, G281, V282, E283, N286, T289, R322, E293, E294, Q295, Y296, N297, S298,
T299, Y300, R301, V303, V305, K317, K320, S324, K326, A327, P329, A330, I332, E333, K334, T335, S337, A339,
Q342, R344, R355, T359, L398, S375, Q386, N389, K392, F404, G420, K340, Q438 y N421. Aun mas preferidas eran las variantes que incluyen aquellas con un aminoacido no natural que reemplaza las posiciones S239, F241, S267, E269, D270, P271, E272, V282, N286, R292, E293, Y296, S298, P329, A330, K334, T335, K340, Q342, R355, T359, Q386, N389, F404, G420, N421 y Q438. Las variantes con un aminoacido no natural que reemplaza las posiciones S239, E293, K334, Q342, R355, T359 y N389 fueron identificadas como particularmente preferidas.
Tambien se observo que la expresion, eficacia de supresion, eficacia de conjugacion, union a la celula y muerte celular no eran predecibles con base en la estructura cristalina publicada de Fc. Por ejemplo, no se predecirfa que E293 y K334 aceptan la sustitucion con un derivado de fenilalanina aromatico con base en sus posiciones dentro de la estructura de Fc, incluso ambas se expresan bien y son potentes asesinos, con valores de IC50 de 2,7 y 3,0 ng/mL, respectivamente. Por el contrario, se predijo que S131 era una posicion excelente para conjugacion con base en su disponibilidad sobre la superficie de la cadena pesada, incluso los derivados con sustituciones en esta posicion fueron conjugadores pobres
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(DAR de 0,65) y asesinos pobres (IC50 de 27,1 ng/mL). Por lo tanto, se concluyo que se requerfa experimentacion para identificar sitios optimos para la expresion, supresion, conjugacion y muerte celular.
Tambien debe observarse que los sitios cercanos al sitio de glicosilacion enlazado a N de trastuzumab, N297, resultaron ser adecuados para la conjugacion. En particular, se encontro que los sitios desde R292 hasta R301, V303 y V305 exhiben propiedades deseables de muerte celular y/o conjugacion. Fue posible evaluar estos sitios debido a la forma no glicosilada de las variantes de trastuzumab producidas en la reaccion de sfntesis de protefna libre de celulas como se describio anteriormente.
Ejemplo 3
Fidelidad de la incorporacion de un aminoacido no natural en un ejemplo de conjugado anticuerpo-farmaco
Este Ejemplo describe una evaluacion de la fidelidad de incorporacion de un aminoacido no natural en un conjugado y un ejemplo de un conjugado anticuerpo-farmaco. Trastuzumab sustituido con p-azido-fenilalanina sustituido en S136 conjugado con DBCO-MMAF fue digerido con tripsina y analizado en un sistema LC-MS Agilent 6520 Accurate Mass Q- TOF equipado con una fuente de nano-electroaspersion ChipCube. Los peptidos que contenfan aminoacidos potencialmente mal incorporados y sus contrapartes de tipo silvestre fueron buscados utilizando cromatogramas de iones extrafdos de los datos de LC-MS con ± 10 ppm del m/z teorico para los estados de carga z = 1-4 del peptido. Si la m/z del pico encontrado estaba dentro de ± 10 ppm del m/z teorico y del estado de carga correcto, se considero que eran coincidencias potenciales hasta la verificacion por MS/MS. En ausencia de senal de una mala incorporacion, se asumio que la senal era igual o menor que el ruido en el espectro de masas. La tasa de fidelidad minima se calculo como una relacion de ruido a senal. La senal se midio como el promedio de todos los iones monoisotopicos a traves del perfil de elucion del peptido para el estado de carga mas abundante y el ruido se estimo en el mismo espectro en una region adyacente a la que exhibia una cantidad minima de senal. Donde se encontro un peptido observado que contenfa un evento de incorporacion erronea, se uso su senal promediada en lugar de la medicion de ruido.
En el mapa de peptidos del conjugado anticuerpo-farmaco analizado, se detecto el peptido con nnAA + farmaco conjugado en los estados de carga 2 y 3 con un error de menos de 4 ppm. En la posicion 136, no estaba presente una incorporacion de tirosina y se determino que la eficacia de incorporacion para pAzPhe fue del 98,3%. No se detecto ninguna incorporacion erronea de tirosina en las posiciones de Phe a traves de la secuencia de IgG detectada. Se midio que la eficiencia global de incorporacion de Phe fue como mfnimo de 99,7%.
Tabla 1
Variante
IMAC gel pg/mL "C orden de rango de expresion CFPS 14C pg/mL Eficacia de supresion Union a la celula DAR Perfil de HIC IC50 Muerte de celulas SKB3 (ng/mL)
S136
151 77 35% + 1,54 WR 7,9
S239
161 2 126 57% + ND Un solo pico 5,2
A118
156 7 105 48% + 1,51 WR 6,5
K246
162 18 75 34% + ND Un solo pico 6,6
S119
191 6 109 50% + 1,41 7,4
S132
307 1 158 72% + 1,58 WR 8
A162
145 17 77 35% + 1,38 NWR 8
V005
186 3 124 56% + 0,99 NWR 11,5
S191
183 4 114 52% + 0,68 WR 13,9
Variante
IMAC gel |jg/mL 14C orden de rango de expresion CFPS 14C jg/mL Eficacia de supresion Union a la celula DAR Perfil de HIC 1C50 Muerte de celulas SKB3 (ng/mL)
S074
177 9 96 44% + 0,78 NWR 9,9
T135
151 8 96 44% + 1,03 NWR 10,1
A084
150 5 114 52% + 1,28 WR 9
G194
145 11 89 40% + 1,1 WR 10,8
T139
138 24 55 25% + 1 WR 9,6
A172
130 21 64 29% + 1,3 NWR 12,5
S134
124 16 80 36% + 1,37 WR 8,9
G137
112 15 83 38% + 1,23 WR 9,3
A023
110 19 70 32% + 1,33 NWR 9,8
S165
103 20 68 31% + 1,04 NWR 9,5
F241
99 13 87 39% + ND Un solo pico 8,4
S160
96 14 86 39% + 1,34 WR 10
P238
93 22 60 27% + 0,47 NWR 12,9
T155
89 10 95 43% + 1,19 WR 10,5
V264
88 32 29 13% + ND Un solo pico 10,5
S176
74 31 38 17% + 0,82 NWR 12,4
G138
72 29 43 20% + 1,16 WR 11,2
G065
68 30 40 18% + ND NWR 9,6
G042
68 26 49 22% + 1,12 NWR 13,8
F243
67 22 60 27% + 0,12 NWR 10,4
V262
47 36 18 8% cambiada a ta ND NWR 8,2
D265
56 38 13 6% + ND Un solo pico 9
L174
52 28 43 20% + 1,07 NWR 12,8
S219
26 27 45 20% + 1,18 NWR 13,6
S131
76 25 49 22% 0,65 27,1
G161
43 33 26 12% 0,97 NWR 87,7
T164
17 35 22 10% 0,68 NWR 17,5
T195
26 39 14 6% 1,1 NWR
S177
23 34 24 11% + 0,68 NWR 13,6
Tabla 2
Variante
IMAC gel |jg/ml_ orden de rango de expresion CFPS 14C jg/mL Eficacia de supresion Union DAR Perfil de HIC IC50 Muerte de celulas SKB3 (ng/mL)
E293
147,6 9 50,7 19% + 1,5 WR 2,7
K334
135,7 3 72,5 28% + 0,12 Un solo pico 3
E269
91,2 24 25,3 10% + 1,21 WR 1,4
S298
76,9 34 10,6 4% + 1,17 NWR 1,9
R292
160,9 7 54,8 21% + ND Un solo pico con hombro 2,4
E272
111,2 19 32,2 12% + 1,05 WR 3
V282
117,4 15 39,7 15% + 0,62 NWR 3,1
Y296
142,7 14 39,9 15% + ND Un solo pico 3,5
D270
122,6 12 43,8 17% + ND Un solo pico 3,9
N286
89,8 20 31,1 12% + 0,71 NWR 4
E333
96,1 8 52,6 20% + 0,55 NWR 5
S324
88,5 5 59,7 23% + 0,3 NWR 5,8
H268
140,2 4 67,6 26% + 0,46 NWR 7,9
T289
128,2 11 44 17% + 0,26 NWR 8,2
Variante
IMAC gel |jg/ml_ 14C orden de rango de expresion CFPS 14C jg/mL Eficacia de supresion Union DAR Perfil de HIC IC50 Muerte de celulas SKB3 (ng/mL)
F275
97,3 13 42,4 16% + 0,24 NWR 9
I332
98,1 6 54,9 21% + 0,88 NWR 10
T335
123,7 2 82,4 32% + 0,33 NWR 11,2
P329
61,4 16 36,9 14% + 1,05 NWR 3,6
P271
78,2 18 32,3 12% + 1,05 WR 4,4
A330
63,6 10 44,7 17% + 1,51 NWR 4,5
Y300
124,0 27 17,4 7% + 0,13 NWR 4,8
S267
22,1 29 12,4 5% + 1,57 NWR 5,1
A327
38,0 22 26,3 10% + 0,69 NWR 5,2
G281
31,0 32 11,5 4% + 0,27 NWR 5,2
V305
42,8 35 10,2 4% + 0,06 NWR 5,5
N297
34,0 37 7,8 3% + 0,09 NWR 6,5
Q295
35,6 28 14,2 5% + ND Un solo pico 6,8
R301
41,8 39 6 2% + ND Un solo pico 7,8
E294
27,9 30 12 5% + 0,65 NWR 8,3
E283
32,1 31 11,7 4% + 0,24 NWR 8,7
D280
18,0 36 10,1 4% + ND Un solo NWR 8,8
K326
35,0 25 24,1 9% + 0,54 NWR 9
K317
38,0 33 11,4 4% + 0,22 NWR 9,5
K274
36,3 26 19,3 7% + 0,45 WR 10,2
T299
20,4 40 4,5 2% + ND NWR 10,3
V303
93,6 21 29 11% + 0,01 NWR 11,1
K320
13,5 38 7,1 3% + 0,93 NWR 11,9
Y278
181,6 1 94 36% + ND WR 22,5
Variante
IMAC gel |jg/mL 14C orden de rango de expresion CFPS 14C jg/mL Eficacia de supresion Union DAR Perfil de HIC IC50 Muerte de celulas SKB3 (ng/mL)
R355
86 7 36 21% + 1,14 WR 13,8
T359
84 4 39 23% + 1,13 WR 7,5
N389
63 6 37 22% + 1,54 WR 9,7
S337
56 5 39 23% + ND No resuelto 6,9
A339
94 2 45 26% + ND No resuelto 7,7
L398
49 11 24 14% + ND Un solo pico 9,4
Q438
56 36 ND ND + 1,46 WR 10
N421
27 15 18 11% + 1,35 WR 10,5
S375
68 8 27 16% + ND Un solo pico 12,3
R344
52 14 20 12% + 1,13 WR 16,7
G420
19 18 15 9% + 1,34 WR 9,4
K340
20 20 12 7% + 1,49 Senal baja 12,9
Q386
9 19 13 8% + 1,49 NWR 16,9
K392
11 34 2 1% + 1 NWR 18
S383
39 13 23 13% + 0,72 WR 21,3
M358
25 16 16 10% + 0,93 21,6
E356
44 10 25 14% + 0,66 WR 27
K360
55 12 23 14% + 0,42 WR 31,2
Y436
22 35 ND ND + 0,6 Senal baja 32,6
N384
127 1 69 40% + 0,25 WR 34,9
Q342
6,5 30 4,5 3% + 1,59 Senal baja 35,1
5
10
15
20
25
Evaluacion de la estabilidad termica de ejemplos de conjugados anticuerpo-farmaco
Este ejemplo describe experimentos disenados para medir la estabilidad termica (Tm) de trastuzumab no glicosilado y variantes de trastuzumab. El ensayo de cambio termico se llevo a cabo mezclando la protefna a ensayar (Sutroceptina y variantes) con un colorante sensible al medio ambiente (SYPRO Orange, Life Technologies Cat. # S-6650) en una solucion regulada (PBS) y controlando la fluorescencia de la mezcla en tiempo real a medida que se somete a una desnaturalizacion termica controlada. La concentracion final de la protefna en la mezcla de ensayo estaba comprendida entre 100 y 250 pg/mL, y el colorante se diluyo 1:1000 a partir del patron original (el colorante patron es 5000x en DMSO). Despues de dispensar alfcuotas de 5 pL de la mezcla de protefna-colorante en una microplaca de 384 pozos (Bio-Rad Cat. # MSP-3852), se sello la placa con una pelfcula de sellamiento opticamente transparente (Bio-Rad Cat. # MSB-1001) y se la coloco en un termociclador de tiempo real de 384 pozos (Bio-Rad CFX384 Real Time System). Se calento la mezcla de protefna-colorante de 25°C a 95°C, en incrementos de 0,1°C por ciclo (~1,5°C por minuto), permitiendo 3 segundos de equilibrio a cada temperatura antes de tomar una medida de fluorescencia. Al final del experimento, se determino la temperatura de fusion (Tm) usando el software gestor CFX de Bio-Rad. Para las muestras de protefnas con perfiles complejos de transicion termica, se calcula la temperatura de fusion (Tm) a partir del grafico de la derivada negativa de primer orden de la intensidad de fluorescencia (eje Y) contra a la temperatura (eje X), o ajustando los datos con el modelo sigmoidal de Boltzmann. La diferencia en la temperatura de fusion de las variantes de IgG en comparacion con la protefna de tipo silvestre es una medida del cambio termico para la protefna que se esta ensayando.
Los resultados de este ensayo para ciertas variantes se muestran en la Tabla 4. En general, las deflexiones en Tm significativamente menores que el trastuzumab no sustituido, particularmente en Tm1, indican una perdida indeseable de estabilidad y/o una propension a agregarse. Por lo tanto, se prefieren las variantes de trastuzumab que exhiben un Tm1 y/o Tm2 dentro de aproximadamente 5°C del trastuzumab no sustituido. Se prefieren aun mas las variantes que exhiben una Tm1 y/o Tm2 dentro de aproximadamente 3°C del trastuzumab no sustituido. Todavfa mas preferidas son aquellas variantes que exhiben una Tm1 y/o Tm2 dentro de aproximadamente 2°C del trastuzumab no sustituido. Aun mas preferidas son aquellas variantes que exhiben una Tm1 y/o Tm2 dentro de aproximadamente 1°C del trastuzumab no sustituido. La Tm1 y la Tm2 se pueden medir en las formas no conjugadas o conjugadas.
Tabla 4
Anticuerpo o conjugado anticuerpo-farmaco
Variante de trastuzumab Tm1 (°C) Tm2 (°C)
Anticuerpo
Trastuzumab no glicosilado 63,5 +/- 0,6 76,5 +/- 0,1
Anticuerpo
T359 64,0 +/- 0,4 76,8 +/- 0,0
Anticuerpo
E293 59,7 +/- 0,7 76,1 +/- 0,1
Anticuerpo
K334 49,5 +/- 0,8 76,5 +/- 0,1
Anticuerpo
R355 63,6 +/- 0,4 76,8 +/- 0,1
Anticuerpo
N389 62,8 +/- 0,1 76,8 +/- 0,0
Conjugado anticuerpo-farmaco
T359 63,9 +/- 0,6 76,7 +/- 0,1
Conjugado anticuerpo-farmaco
E293 59,2 +/- 0,0 76,0 +/- 0,3
Conjugado anticuerpo-farmaco
K334 59,0 +/- 0,2 76,3 +/- 0,2
Conjugado anticuerpo-farmaco
R355 63,7 +/- 0,4 76,6 +/- 0,1
Conjugado anticuerpo-farmaco
N389 61,9 +/- 0,5 76,4 +/- 0,1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Preparacion y conjugacion de ejemplos de conjugados de Fc
Este ejemplo describe la preparacion de ejemplos de conjugados de Fc que estan conjugados con un colorante fluorescente. Como se muestra en el ejemplo, ciertos residuos ensayados que se conjugan bien con el colorante tambien se conjugan bien con un agente citotoxico en el contexto de Fc presente en un anticuerpo no glicosilado de longitud completa. Por lo tanto, se cree que los residuos que son buenos sitios para la conjugacion en un anticuerpo de longitud completa son tambien buenos sitios para la conjugacion con Fc.
Para elaborar los conjugados de Fc, se llevo a cabo la mutagenesis dirigida al sitio utilizando un plasmido pYD que contenfa la region codificante de la porcion de Fc del trastuzumab no glicosilado con his en el extremo terminal C como plantilla de ADN y oligonucleotidos sinteticos que contenfan mutaciones de interes tanto en direcciones sentido como antisentido. Se anadieron oligonucleotidos de cada mutacion a la plantilla de ADN y la polimerasa PHUSION® (Thermo, Cat. # F531s) hasta un volumen final de 20 pL. La concentracion final de cada componente fue de 0,16 pM de cada oligonucleotido, 0,5 ng/pL de ADN plantilla, 0,02 U/pL de polimerasa PHUSION® en regulador HF (Thermo) que contenfa MgCl2 1,5 mM y dNTP 200 pM. Se incubo la mezcla a 98°C durante 5 min, 18 ciclos de PCR (98°C 30 s, 55° C 1 min, 72°C 4 min), 10 m a 72°C y se almaceno a 4°C. Se anadio Dpnl (NEB) a la mezcla hasta una concentracion final de 0,6 U/pL y se incubo a 37°C durante 1 h. Se transformaron 5 pL de cada mezcla en 50 pL de celulas de E. coli qufmicamente competentes de acuerdo con el procedimiento de los fabricantes (Invitrogen, placa de 96 pozos MultiShotMR TOP10). Se recuperaron las celulas transformadas en 200 pL de SOC (Invitrogen) a 37°C durante 1 hora y se sembraron en placa sobre agar Luria-Bertani (LB) suplementado con 50 pg/mL de kanamicina (Teknova). Despues de permanecer a 37°C durante 24 h, se recogieron las colonias usando Qpix2 (Genetix) en 200 pL de LB con glicerol al 7,5% y 50 pg/mL de kanamicina y se cultivaron a 37°C durante 24 horas, se usaron 20 pL del cultivo para amplificacion circular continua y se secuencio mediante extension del cebador usando cebadores T7 (SEQ ID NO.: 2, 5' TAATACGACTCACTATAGG 3') y T7 terminador (SEQ ID NO.: 3, 5' GCTAGTTATTGCTCAGCG 3') (Sequetech). La secuencia fue analizada por Sequencher (Gene Codes), y los clones que contenfan mutaciones se dispusieron en placas de 96 pozos.
La expresion de las protefnas de Fc se realizo utilizando un sistema de sfntesis de protefnas libre de celulas como se describe en Zawada y colaboradores, 2011, Biotechnol. Bioeng. 108 (7) 1570-1578 con las modificaciones descritas a continuacion. Se trataron los extractos libres de celulas con yodoacetamida 50 pM durante 30 min a TA (20°C) y se anadieron a una premezcla que contenfa todos los demas componentes excepto el ADN. Las reacciones libres de celulas se iniciaron mediante la adicion de ADN de plasmido de variantes de interes y se incubaron a 30°C durante 5 h a 850 rpm en placas de 96 pozos. La reaccion se incubo adicionalmente a 4°C durante 11 h. La concentracion final de cada componente fue 30% de extracto celular, pAzF-ARNt 20 pM, GSSG 2 mM, 100 pg/mL de DsbC de E. coli, glutamato de magnesio 8 mM, glutamato de amonio 10 mM, glutamato de potasio 130 mM, piruvato de sodio 35 mM, AMP 1,2 mM, 0,86 mM de cada uno de GMP, UMP y CMP, aminoacidos 2 mM (excepto 0,5 mM para tirosina), oxalato de sodio 4 mM, putrescina 1 mM, espermidina 1,5 mM, fosfato potasico 15 mM, RNAP T7 100 nM, 10 pg/mL de ADN de cada variante de Fc.
Las muestras se purificaron a continuacion mediante Phytip de IMAC y mediante Phytip de Protefna A. Para muestras preparadas por Phytip de IMAC, se produjo cada variante de Fc en una escala de 30 pL en una placa de 96 pozos. Cada reaccion de CFPS se diluyo con 30 pL de PBS (Gibco, pH 7,4). Se centrifugo la mezcla a 5000 x g a 4°C durante 15 min. Se capturo el sobrenadante con Phytip de IMAC que contenfa 5 pL de resina (PhyNexus) pipeteando arriba y abajo 4 veces lentamente con una velocidad de flujo de 250 pL/min. Se lavo la resina con 200 pL de regulador de union de IMAC (Tris 50 mM pH 8,0, NaCl 300 mM, imidazol 10 mM) pipeteando dos veces arriba y abajo a un velocidad de flujo de 500 pL/min. Este proceso se repitio una vez con 200 pL adicionales de regulador de union de IMAC. La protefna unida se eluyo con 125 pL de regulador de elucion de IMAC (Tris 50 mM pH 8,0, NaCl 300 mM, Imidazol 500 mM) pipeteando 4 veces hacia arriba y hacia abajo a un velocidad de flujo de 250 pL/min.
Para las muestras purificadas mediante Phytip de Protefna A, se produjo cada variante de Fc a escala de 30 pL en una placa de 96 pozos. Cada reaccion de CFPS se diluyo con 30 pL de PBS (Gibco, pH 7,4). Se centrifugo la mezcla a 5000 x g a 4°C durante 15 min. Se capturo el sobrenadante con Phytip de Protefna A que contenfa 5 pL de resina (PhyNexus) pipeteando hacia arriba y hacia abajo 4 veces con un velocidad de flujo de 250 pL/min. Se lavo la resina con 200 pL de PBS pipeteando hacia arriba y hacia abajo dos veces a una velocidad de flujo de 500 pL/min. Se lavo la resina luego con 200 pL de NaCl 150 mM. Se eluyeron las protefnas unidas con 125 pL de glicina a pH 3,0 (100 mM) pipeteando hacia arriba y hacia abajo 4 veces a un velocidad de flujo de 250 pL/min. La protefna eluida se neutralizo inmediatamente con 50 pL de Tris 1M pH 8,0. El regulador de elucion neutralizado contenfa Glicina 71 mM y Tris 285 mM con un pH de aproximadamente 7,8.
La conjugacion con un ejemplo de colorante fluorescente se realizo de la siguiente manera. Se disolvio DIBO-TAMRA (Invitrogen C-10410) (estructura mostrada como Figura 5) en DMSO anhidro hasta una concentracion final de 5 mM. Se diluyo el compuesto 10x con PBST (PBS con Tween 20 al 0,2%) hasta 500 pM ya continuacion se anadio a las variantes de Fc-his en regulador de elucion IMAC hasta la concentracion final de farmaco de 50 pM. Se incubo la
mezcla a 30°C, 250 rpm, durante 16 h en un Thermomixer (Thermo). Se anadio azida de sodio a las muestras hasta una concentracion final de 100 mM.
Para determinar las cantidades de expresion de FC, se analizaron las muestras purificadas por Phytip de afinidad para determinar la union de protefna A usando las puntas de Protein A ForteBio (18-50l 0). Cada muestra se diluyo de 2 a 10 5 veces en regulador cinetico basado en PBS (ForteBio 18-5032). Se incubaron las muestras con puntas de Protefna A de ForteBio durante 300 s y disociaron durante 600 s en regulador cinetico. Se midio la proporcion y se comparo con una curva estandar generada usando Fc-his purificado (0,4 a 25 pg/mL) para determinar la concentracion. Los niveles de expresion se normalizaron a la expresion de la variante S375pAzF.
Para determinar la cantidad de conjugacion, se mezclaron muestras purificadas por Phytip de IMAC o Protefna A con un 10 volumen igual de 2x regulador de muestra de Laemmli y se fraccionaron mediante gel al 4-12% (BioRad). Se visualizo la intensidad de fluorescencia de la protefna conjugada TAMRA por GelDoc EZ (BioRad, filtro de excitacion UV (280-400 nM)). La intensidad de fluorescencia relativa de cada banda de gel se cuantifico y normalizo a aquella del producto conjugado de la variante de Fc S375pAzF producida en la misma placa usando ADN del plasmido correspondiente (SD2009).
15 De las protefnas de Fc ensayadas, se expresaron particularmente bien y conjugaron las sustituciones en las posiciones correspondientes a S239 y Y296. En consecuencia, las sustituciones en estas posiciones son particularmente preferidas para conjugados de Fc.
Ejemplo 6
Evaluacion de la expresion de HC-F404 en un extracto atenuado de RF-1
20 Para evaluar inicialmente los efectos del uso de una capa de E. coli atenuada con RF-1 en la incorporacion de un aminoacido no natural, se expresaron 12 variantes que se expresaron pobremente en la cepa positiva para RF-1 y se escalaron en la cepa atenuada con RF-1. Una de tales variantes, HC-F404, exhibio propiedades excepcionalmente deseables, como se discute a continuacion.
El extracto libre de celulas utilizado para esta reaccion de sfntesis de protefnas libres de celulas se preparo a partir de 25 una cepa de E. coli atenuada con rF-1 sensible a OmpT que tambien se habfa modificado geneticamente para producir un ARNt que codifica CUA ortogonal para la insercion de un aminoacido no natural en un codon de terminacion ambar. Despues de la adicion de la plantilla de ADN que codifica para HC-F404 y WT LC, se incubo la reaccion libre de celulas a 30°C durante 12 horas en un agitador a 650 rpm a una escala de 1 mL X 6 (para un total de 9 mL) en una placa Flower (m2p-labs # MTP-48-B). Se purifico luego la protefna sobre la protefna A y resina de adherencia Capto usando 30 Protein Maker (Emerald Bio).
La conjugacion con farmaco (DBCO-MMAF) y la preparacion de conjugados de anticuerpo-farmaco (ADC) para analisis adicionales se realizo como se describio anteriormente.
El analisis con ThermoFluor de las variantes se llevo a cabo como se describio anteriormente.
La variante de HC F404 generada tanto durante el Escaneo de TAG como en la escala intermedia mostro una buena 35 capacidad de destruccion celular (Escaneo de TAG I: IC50 = 0,018 nM, escalado intermedio: IC50 = 0,023 nM), pero la estimacion de DAR con base en su perfil de HIC resulto problematico, debido a la baja resolucion de los picos, posiblemente debido a la inaccesibilidad del farmaco a la columna analftica durante el analisis de HIC. Sin embargo, el analisis de MS mostro que tenia un DAR de 1,74. Ademas, el analisis por ThermoFluor demostro que la version ADC de HC-F404 tenia una Tm1 mejorada (mayor estabilidad termica) (aumento de 2,2°C) en comparacion con el anticuerpo 40 solamente.
Tabla 5: Propiedades de la variante HC-F404
Caden a
Variante Concentracion final de ADC purificada (pg/mL) DAR Perfil de MS IC50 de muerte de celulas SKBR3 (ng/mL)
HC
F404 541 1,74 WR* 3.5
* - Este resultado de DAR se basa en el analisis de LC-MS. La variante conjugada produjo un pico no bien resuelto (NWR) en el ensayo de HIC, y se determino DAR usando LC-MS
5
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15
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25
30
Tabla 6: Resultados del ThermoFluor para la variante HC-F404
Unicamente anticuerpo Conjugado anticuerpo-farmaco
Cadena
Variante de Trastuzumab Tm1 (°C) Tm2 (°C) Tm1 (°C) Tm2 (°C)
HC
F404 61,2 +/- 0,2 76,6 +/- 0,1 63,5 +/- 0,4 76,5 +/- 0,1
Ejemplo 7
Caracterizacion de ejemplos de conjugados anticuerpo-farmaco: analisis del factor de liberacion Escaneo de TAG I: Metodos y listado de variantes seleccionadas
El extracto libre de celulas utilizado para reacciones de sfntesis de protefnas libres de celulas se preparo a partir de una cepa de E. coli atenuada con RF-1 sensible a OmpT que tambien habfa sido modificada geneticamente para expresar un ARNt que codifica CUA ortogonal para la insercion de un aminoacido no natural en un codon de terminacion ambar. Despues de la adicion de plantilla de ADN, se incubaron las reacciones libres de celulas a 30°C durante 12 h en un agitador a 650 rpm en placas Flower (m2p-labs # MTP-48-B). Para la sfntesis de variantes de cadena ligera (variantes que tenfan incorporacion de nnAA en la cadena ligera), se utilizo una relacion de ADN de 4 pg/mL de ADN de cadena ligera a 8 pg/mL de ADN de cadena pesada. Cada variante de trastuzumab se produjo en una escala de 1 mL en placas Flower de 48 pozos en forma individual. Se utilizaron un total de 6 placas para expresar las variantes.
El sobrenadante se capturo con Phytip de IMAC que contenfa 40 pL de resina pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces lentamente a una velocidad de flujo de 4,2 pL/min. Se eluyo la protefna unida con 125 pL de regulador de elucion de IMAC (Tris 50 mM, pH 8,0, NaCl 300 mM, imidazol 500 mM). Despues de la purificacion, se cuantificaron las variantes purificadas por IMAC en un sistema Caliper GXII mediante comparacion con los estandares de masa de HERCEPTIN® corridos en el mismo Protein Express LabChip (Caliper LifeSciences # 760499). Las muestras se prepararon para el analisis como se especifica en el kit de reactivos Protein Express (Caliper LifeSciences # 760328) con la excepcion de que las muestras (mezcladas en regulador de muestra) se calentaron a 65°C durante 10 minutos antes del analisis en el sistema Caliper.
La conjugacion con farmaco (DBCO-MMAF) y la preparacion de conjugados anticuerpo-farmaco (ADC) para analisis adicionales se realizo como se describio anteriormente.
Los resultados positivos de estos experimentos de caracterizacion se presentan en la Tabla 7. En la Tabla se muestran las siguientes propiedades de las variantes: concentracion final del conjugado anticuerpo-farmaco elaborado, capacidad para unirse a celulas que expresan HER2, relacion farmaco-anticuerpo (DAR, expresada como el numero de agentes citotoxicos por anticuerpo), un comentario con respecto al perfil de HIC, y la IC50 observada a partir del ensayo de muerte celular descrito anteriormente. En los comentarios relativos al ensayo de HIC, SP corresponde a un perfil que se resolvio bien como un solo pico, NWR corresponde a un perfil pobremente resuelto y WR corresponde a un perfil de HIC bien resuelto. Varias de las variantes que exhibfan un perfil de un solo pico tambien exhibfan una muerte potente, lo que indica que la variante se conjugo realmente con el farmaco, pero no pudo resolverse en la columna de HIC.
Tabla 7: Variantes seleccionadas para el Escaneo de Tag I
Variantes
Cadena ADC final purificado (pg/mL) DAR Perfil de HIC IC50 (ng/mL) de muerte de celulas SKBR3
V282
HC 52 1,0 NWR 1,6
T289
HC 46 0,3 WR 2,1
Y296
HC 32 1,5 WR 7,2
A330
HC 80 ND SP 2,4
T335
HC 43 0,7 NWR 2,3
N361
HC 42 1,0 WR 5,9
S400
HC 51 0,5 WR 7,1
F404
HC 20 ND NWR 4,3
V422
HC 100 1,3 WR 4,0
S440
HC 74 1,2 WR 6,1
T260
HC 37 0,1 NWR 4,4
S267
HC 94 1,7 WR 7,2
H268
HC 45 0,4 NWR 7,5
E272
HC 50 1,2 WR 3,0
K274
HC 64 0,8 WR 2,8
R292
HC 101 ND SP 9,0
E293
HC 133 1,7 WR 9,0
N297
HC 45 1,7 WR 4,7
S298
HC 60 1,5 WR 5,4
V303
HC 75 1,5 WR 12,7
V305
HC 66 1,5 WR 7,0
I332
HC 47 ND NWR 2,6
E333
HC 47 ND NWR 2,6
K334
HC 83 1,8 WR 6,9
K340
HC 76 1,5 WR 4,4
G341
HC 29 1,5 WR 3,8
Q342
HC 60 1,3 WR 4,8
P343
HC 51 0,8 WR 6,6
R355
HC 54 1,4 WR 4,6
Q362
HC 89 1,1 WR 6,3
Q386
HC 124 ND NWR 4,0
K392
HC 40 1,6 WR 3,4
S424
HC 24 1,3 WR 4,9
Q438
HC 33 1,5 WR 5,2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
S442
HC 57 1,4 WR 4,3
L443
HC 39 1,4 WR 3,0
Las variantes preferidas incluyen aquellas con un aminoacido no natural que reemplaza estas posiciones de la cadena pesada (HC): V282, T289, Y296, A330, T335, N361, S400, F404, V422, S440, T260, S267, H268 , E272, K274, R292,
E293, N297, S298, V303, V305, I332, E333, K334, K340, G341, Q342, P343, R355, Q362, Q386, K392, F404, S424,
Q438, S442 y L443.
Tambien se prefieren variantes que tienen una DAR de al menos aproximadamente 0,7. Las variantes preferidas incluyen aquellas con un aminoacido no natural que reemplaza estas posiciones de la cadena pesada (HC): V282, Y296, T335, N361, V422, S440, S267, E272, K274, E293, N297, S298, V303, V305, K334, K340, G341, Q342, P343, R355, Q362, K392, F404, S424, Q438, S442 y L443.
Tambien se prefieren variantes que tienen una DAR de al menos aproximadamente 1,0. Aun mas preferidas fueron las variantes que incluyen aquellas con un aminoacido no natural que reemplazan estas posiciones de la cadena pesada: V282, Y296, N361, V422, S440, S267, E272, E293, N297, S298, V303, V305, K334, K340, G341, Q342, R355, Q362, K392, F404, S424, Q438, S442 y L443.
Tambien se prefieren variantes que tienen una DAR de al menos aproximadamente 1,2. Aun mas preferidas fueron las variantes que incluyen aquellas con un aminoacido no natural que reemplaza estas posiciones de la cadena pesada:
V282, Y296, V422, S440, S267, E272, E293, N297, S298, V303, V305, K334, K340, G341, Q342, R355, K392, F404,
S424, Q438, S442 y L443.
Tambien se prefieren variantes que tienen una DAR de al menos aproximadamente 1,5. Aun mas preferidas fueron las variantes que incluyen aquellas con un aminoacido no natural que reemplaza estas posiciones de la cadena pesada: V282, Y296, S267, E293, N297, S298, V303, V305, K334, K340, G341, K392, F404 y Q438.
Ejemplo 8
Caracterizacion de ejemplos de conjugados anticuerpo-farmaco: analisis adicional del factor de liberacion Escaneo de TAG II Metodos y listado de variantes seleccionadas
El extracto libre de celulas utilizado para reacciones de sfntesis de protefnas libres de celulas se preparo a partir de una cepa de E. coli atenuada con RF-1 sensible a OmpT que tambien habfa sido modificada geneticamente para producir un ARNt que codifica CUA ortogonal para la insercion de un aminoacido no natural (p-azido-fenilalanina) en un codon de terminacion ambar. Despues de la adicion de plantilla de ADN, se incubaron las reacciones libres de celulas a 30°C durante 12 h en un agitador a 650 rpm en placas Flower (m2p-labs # MTP-48-B). Para la sfntesis de variantes de cadena ligera (variantes que tenfan incorporacion de nnAA en la cadena ligera), se utilizo una relacion de ADN de 4 pg/mL de ADN de cadena ligera a 8 pg/mL de ADN de cadena pesada. Cada variante de trastuzumab se produjo en una escala de 1 mL en placas Flower de 48 pozos en forma individual. Se utilizaron un total de 6 placas para expresar las variantes.
El sobrenadante se capturo con Phytip de IMAC que contenfa 40 pL de resina pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces lentamente a una velocidad de flujo de 4,2 pL/min. Se eluyo la protefna unida con 125 pL de regulador de elucion de IMAC (Tris 50 mM, pH 8,0, NaCl 300 mM, imidazol 500 mM). Despues de la purificacion, se cuantificaron las variantes purificadas por IMAC en un sistema Caliper GXII mediante comparacion con los estandares de masa de HERCEPTIN® corridos en el mismo Protein Express LabChip (Caliper LifeSciences # 760499). Las muestras se prepararon para el analisis como se especifica en el kit de reactivos Protein Express (Caliper LifeSciences # 760328) con la excepcion de que las muestras (mezcladas en regulador de muestra) se calentaron a 65°C durante 10 minutos antes del analisis en el sistema Caliper.
La conjugacion con farmaco (DBCO-MMAF) y la preparacion de conjugados anticuerpo-farmaco (ADC) para analisis adicionales se realizo como se describio anteriormente.
Los resultados positivos de estos experimentos de caracterizacion se presentan en la Tabla 8. En la Tabla se muestran las siguientes propiedades de las variantes: concentracion final del conjugado anticuerpo-farmaco elaborado, la eficacia de expresion del producto de longitud completa comparada con el tipo silvestre (eficacia de supresion), capacidad para unirse a celulas que expresan HER2, relacion farmaco-anticuerpo (DAR, expresada como el numero de agentes citotoxicos por anticuerpo), un comentario con respecto al perfil de HIC, y la IC50 observada a partir del ensayo de
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muerte celular descrito anteriormente. En los comentarios relativos al ensayo de HIC, SP corresponde a un perfil que se resolvio bien como un solo pico, NWR corresponde a un perfil pobremente resuelto y WR corresponde a un perfil de HIC bien resuelto. Varias de las variantes que exhibfan un perfil de un solo pico tambien exhibfan una muerte potente, lo que indica que la variante se conjugo realmente con el farmaco, pero no pudo resolverse en la columna de HlC.
En total, las variantes de trastuzumab que tienen un aminoacido no natural en 269 sitios que se seleccionaron para actividades como las descritas. La Tabla 8 presenta las 71 variantes que tenfan DAR, perfiles de expresion, eficacias de supresion y/o valores de IC50 deseables. Ninguna de estas propiedades podfan ser predichas antes del ensayo, y muchas veces los valores para cada propiedad individual variaron impredeciblemente dentro de una muestra. Por ejemplo, se esperarfa generalmente que las variantes con DAR alta exhibirfan valores de IC50 inferiores a aquellos de DAR baja. No obstante, la variante I51, por ejemplo, mostro una DAR relativamente baja de 0,6 pero mostro una IC50 de 1 ng/mL.
Tabla 8. Variantes de Escaneo de Tag II
Variantes
Cadena MMAF (Post MQ) (pg/mL) DAR Perfil de HIC SKBR3, IC50, ng/mL Supresion % de ts por 14C
D221
HC 178 1,4 WR 9,6 75
K222
HC 194 1,5 WR 8,4 87
T225
HC 156 1,4 WR 8,3 81
P227
HC 96 1,5 NWR 6,2 68
P230
HC 157 1,5 NWR 6,0 122
Variantes
Cadena MMAF (Post MQ) (Pg/mL) DAR Perfil de HIC SKBR3, IC50, ng/mL Supresion % de ts por 14C
A231
HC 147 1,6 NWR 5,5 97
P232
HC 107 1,5 NWR 5,5 86
G236
HC 74 1,6 WR 4,5 70
Las variantes preferidas incluyen aquellas con un aminoacido no natural que reemplaza estas posiciones de la cadena pesada (HC): D221, K222, T225, P227, P230, A231, P232 y G236.
Tambien se prefieren variantes que tienen una DAR de al menos aproximadamente 0,7. Las variantes preferidas incluyen aquellas con un aminoacido no natural que reemplaza estas posiciones de la cadena pesada (HC): D221, K222, T225, P227, P230, A231, P232 y G236.
Tambien se prefieren variantes que tienen una DAR de al menos aproximadamente 1,0. Aun mas preferidas fueron las variantes que incluyen aquellas con un aminoacido no natural que reemplazaba estas posiciones de la cadena pesada: D221, K222, T225, P227, P230, A231, P232 y G236.
Tambien se prefieren variantes que tienen una DAR de al menos aproximadamente 1,2. Aun mas preferidas fueron las variantes que incluyen aquellas con un aminoacido no natural que reemplazaba estas posiciones de la cadena pesada: D221, K222, T225, P227, P230, A231, P232 y G236.
Tambien se prefieren variantes que tienen una DAR de al menos aproximadamente 1,5. Aun mas preferidas fueron las variantes que incluyen aquellas con un aminoacido no natural que reemplazaba estas posiciones de la cadena pesada: K222, P227, P230, A231, P232 y G236.
Ejemplo 9
Caracterizacion de ejemplos de conjugados anticuerpo-farmaco: analisis de escalabilidad Escalado de variantes selectas del Escaneo de TAG II
Con base en DAR y los datos de destruccion de celulas, se selecciono un subconjunto de variantes de trastuzumab con 5 caracterfsticas deseables para la expresion libre de celulas a pequena escala con el fin de generar material para una caracterizacion adicional. Las variantes de cadena pesada seleccionadas para produccion a pequena escala fueron: D221 y K222.
La mezcla de reaccion libre de celulas en la que se sintetizaron las variantes comprendfa una mezcla 80%:20% de extractos libres de celulas preparados a partir de una cepa de E. coli atenuada con RF-1 sensible a OmpT y una cepa 10 de E. coli atenuada con rF-1 sensible a OmpT que fue modificada geneticamente para expresar un ARNt que codifica CUA ortogonal, respectivamente. Todas las variantes se escalaron hasta 9 mL en placas Flower (1,5 mL X 6 repeticiones) y se purificaron usando Protein Maker (Emerald Bio).
La conjugacion con farmaco (DBCO-MMAF) y la preparacion de conjugados anticuerpo-farmaco (ADC) para analisis adicional se realizo como se describio anteriormente.
15 Los resultados positivos de estos experimentos de caracterizacion se presentan en la Tabla 9. En la Tabla se muestran las siguientes propiedades de las variantes: concentracion final del conjugado anticuerpo-farmaco elaborado, la eficacia de la expresion del producto de longitud completa comparada con el tipo silvestre (eficacia de supresion), capacidad de unir celulas que expresan HER2, relacion farmaco-anticuerpo (DAR, expresada como el numero de agentes citotoxicos por anticuerpo), un comentario con respecto al perfil HIC y la IC50 observada a partir del ensayo de muerte celular 20 descrito previamente. En los comentarios relativos al ensayo de HIC, SP corresponde a un perfil que se resolvio bien como un solo pico, NWR corresponde a un perfil pobremente resuelto y WR corresponde a un perfil de HIC bien resuelto.
Tabla 9: Un subconjunto de variantes preferidas de Fc
Variantes
Cadena Concentracion de ADC final purificado (pg/mL) DAR Perfil de HIC IC50 (ng/mL) de muerte de celulas SKBR3
HC
D221 284 1,16 WR 3,5
HC
K222 308 1,21 WR 3,0
25 Ejemplo 10
Caracterizacion de ejemplos de conjugados anticuerpo-farmaco: analisis por ThermoFluor
Se llevo a cabo el analisis por ThermoFluor de las variantes como se describio anteriormente. Los resultados del ThermoFluor se encuentran en la Tabla 10.
Tabla 10: Datos de ThermoFluor para variantes de produccion a escala pequena
Unicamente anticuerpo Conjugado anticuerpo-farmaco
Cadena
Variante de trastuzumab Tm1 (°C) Tm2 (°C) Tm1 (°C) Tm2 (°C)
Trastuzumab no glicosilado 61,4 +/- 0,6 76,2 +/- 0,1 N/A N/A
HC
D221 59,1 +/- 0 76,7 +/- 0,1 59 +/- 0,1 76,7 +/- 0,1
HC
K222 59,1 +/- 0,1 76,7 +/- 0,1 59 +/- 0,1 76,5 +/- 0,1
Las variantes sometidas a analisis por ThermoFluor incluyen aquellas con un aminoacido no natural que reemplaza estas posiciones de la cadena pesada: D221 y K222.
Ejemplo 11
Caracterizacion de ejemplos de conjugados anticuerpo-farmaco: analisis cineticos 5 Cinetica de conjugacion de variantes seleccionadas
Las tasas de conjugacion se determinaron para cinco variantes que mostraron una amplia gama de relacion de conjugado farmaco con respecto a anticuerpo. Las reacciones se iniciaron por mezcla de variantes con farmaco (DBCO- MMAF) en PBS (pH 7,4) a 20°C por duplicado durante 15 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h y 16 h. Las concentraciones finales de anticuerpo en un intervalo de mezcla de 0,2 a 2 pM. La concentracion final de farmaco para toda la reaccion 10 es de 100 pM. Al final del penodo de incubacion, se anadio Na-azida a la mezcla hasta una concentracion final de 10 mM. La mezcla final se purifico mediante placas Zeba y MustangQ como se describio anteriormente. La concentracion de IgG se determino por Caliper usando Herceptin como estandar de masa. La fraccion de variantes completamente conjugadas se determino mediante HIC como se describio anteriormente.
Tabla 11.Semividas y DAR de variantes
HC-S112 HC-T110 HC-T77 HC-Y79 HC-F126
T1/2
6,2 h 10,5 h ~ 40 h ~ 270 h ND
DAR
1,7 1,6 1,1 0,4 0
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Las figuras 5A y 5B proporcionan las trazas por HIC de dos variantes (HC T110 y HC S112). Las trazas mostraron tres picos (P0, P1 y P2) correspondientes a picos con IgG no conjugada, IgG conjugada individualmente e IgG totalmente conjugada, respectivamente.
Las Figuras 6A a 6E muestran que la conjugacion de variantes de para-azido fenilalanina (pAzF) es especffica del sitio. 20 Los porcentajes del total de anticuerpos conjugados individual y totalmente se separaron mediante HIC.
Ejemplo 12
Caracterizacion de ejemplos de conjugados anticuerpo-farmaco: analisis de comparacion de la supresion
Comparacion de la supresion por para-azido fenilalanina (pAzF) y para-azido metil fenilalanina (pAzMeF)
Se expresaron once variantes con una gama de eficacias de supresion en una reaccion de sfntesis de protefnas sin 25 celulas como se describe en Zawada y colaboradores, 2011, Biotechnol. Bioeng. 108 (7): 1570-1578 con las modificaciones descritas a continuacion. Tambien se utilizo trastuzumab no sustituido como un control. Se trataron extractos libres de celulas que contenfan ARNt y RF1 sensible a OmpT (mezcla 80/20 de cepas 16/23) con yodoacetamida 50 pM durante 30 min a TA (20°C) y se anadieron a una premezcla que contenfa todos los otros componentes excepto GSSG, aminoacidos no naturales, ARNt sintetasas, T7 RNAP, DsbC, PDI y ADN plantilla. A 30 continuacion se anadieron a la mezcla todos los reactivos restantes excepto el ADN. Se iniciaron las reacciones libres de celulas mediante la adicion de ADN de plasmido de variantes seleccionadas y se incubaron a 30°C durante 12 horas en un agitador a 450 rpm en placas de 96 pozos. La reaccion se incubo adicionalmente a 4°C durante 5 h. La concentracion final en la reaccion de sfntesis de protefnas fue de 30% de extracto celular, para-azido fenilalanina (pAzF) 1 mM (RSP Amino Acids) con 0,37 mg/m de aminoacil-ARNt sintetasa (FRS) especffico de pAzF de M jannaschii, o 35 para-azido metil fenilalanina (pAzMeF) 1 mM con 0,37 mg/mL de aminoacil-ARNt sintetasa especffica de p-ciano- fenilalanina (Young y colaboradores, 2011, Biochem 50: 1894-1900), GSSG 2 mM, 0,29 mg/mL de PDI (Mclab), 100 pg/mL de DsbC de E. coli, glutamato de magnesio 8 mM, glutamato de amonio 10 mM, glutamato de potasio 130 mM, piruvato de sodio 35 mM, AMP 1,2 mM, 0,86 mM de cada uno de GMP, UMP y CMP, aminoacidos 2 mM (excepto 0,5 mM para tirosina y fenilalanina), oxalato de sodio 4 mM, putrescina 1 mM, espermidina 1,5 mM, fosfato de potasio 15 40 mM, T7 RNAP 100 nM, 2 pg/mL de ADN de cadena ligera de trastuzumab, 8 pg/mL de ADN de cadena pesada de trastuzumab-(His)6. Cada variante de trastuzumab se produjo en una escala de 100 pL en placas de 96 pozos por duplicado con 14C para cada variante. Debe observarse que todas las variantes de trastuzumab asf producidas eran no glicosiladas.
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Para controlar la sfntesis de protefnas, se agrego a las reacciones 1-[U-14C]-leucina al 3% (v/v) (300 mCi/mmol, GE Life Sciences, Piscataway, NJ). La supresion del codon ambar en diferentes sitios de la cadena pesada y la cadena ligera se determino mediante [14C]-autorradiograffa de geles SDS-PAGE reductores. La cadena pesada de trastuzumab de longitud completa y las variantes de cadena pesada de trastuzumab suprimidas corrieron a 50 kD en SDS-PAGE. La cadena ligera de trastuzumab de longitud completa y las variantes de cadena ligera de trastuzumab suprimidas corrieron a 30 kD en SDS-PAGE. Las variantes de trastuzumab no suprimidas (truncadas) corrieron con un peso molecular mas bajo. La supresion de ambar en la cadena pesada o ligera se determina por:
.. intensidad de banda de la variante TAG de cadena Desada o liaera suorimida
supresion =--------------------------------------------------------------------------------------------------------
intensidad de banda de cadena pesada o ligera de tipo silvestre
La intensidad de la banda se determino por ImageQuant (Amersham Biosciences Corp., Piscataway, NJ). En la Figura 6A, se compara la eficacia de supresion de las variantes pAzF y pAzMeF. La eficacia de la supresion se calcula como una intensidad de banda variante de HC sobre la intensidad de banda de HC de tipo silvestre o una intensidad de banda de LC variante sobre intensidad de banda de LC de tipo silvestre. En la Figura 6B, se comparan el rendimiento de IgG soluble de las variantes pAzF y pAzMeF. La cantidad de IgG se calcula de acuerdo con la formula: recuentos solubles/recuentos completos * intensidad de la banda de IgG / intensidad total de carril * 2 * 74008.02Da/47 Leucinas.
Ejemplo 13 Transferencia de sitios de incorporacion de aminoacidos no naturales a otro anticuerpo
Para evaluar si los sitios para la incorporacion de aminoacidos no naturales pueden transferirse entre dos secuencias de IgG distintas con DAR predecibles, se evaluo un segundo anticuerpo que contenfa un aminoacido no natural en sitios representativos. Para este experimento, se eligio brentuximab como el segundo anticuerpo (vease la SEQ ID NO: 3 y la sEq ID NO: 4). Se escogieron varios sitios del estudio de mutagenesis de trastuzumab que mostraba diversas DAR. En la cadena pesada, los sitios correspondieron a K121, Y180, K133, S157, F126 y P127 (numeracion de la UE). En la cadena ligera, los sitios correspondfan a R142, N152, Q147, E161, K149 y Q155 (numeracion de la UE). El codon de terminacion de TAG se inserto en la secuencia de brentuximab usando mutagenesis dirigida al sitio con base en el cambio rapido estandar y la identidad de cada variante se confirmo mediante secuenciacion de ADN. Se preparo Mini Prep de ADN utilizando un kit de Qiagen, para su uso como una plantilla para impulsar la reaccion de sfntesis de protefnas libres de celulas.
Las variantes se sintetizaron en una mezcla de reaccion que contenfa una protefna del RF-1 sensible a OmpT y un ARNt que codifica CUA ortogonal expresado in vivo. Todas las variantes se escalaron hasta 9 mL en placas Flower (1,5 mL X 6 repeticiones) y se purificaron usando Protein Maker (Emerald Bio).
La conjugacion con farmaco (DBCO-MMAF) y la preparacion de conjugados de anticuerpo-farmaco (ADC) para el analisis adicional se realizo como se describio anteriormente. Se identificaron las DAR mediante el metodo de perfilado de HIC descrito anteriormente.
Los resultados del experimento sugieren que los sitios se pueden transferir en forma general de manera predecible entre dos IgG distintas.
Tabla 12A: Un subconjunto de variantes de HC preferidas
DAR
Variantes
trastuzumab brentuximab
HC-K1211AG
1,6 1,4
HC-Y180IAG
1,6 0,5
HC-K133iag
0,7 0,8
HC-S157iag
0,9 1,1
HC-F126iag
- -
HC-P127iag
- -
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DAR
Variantes
trastuzumab brentuximab
LC-R142iag
1,2 1,3
LC-N152iag
1,2 1,3
LC-Q147iag
0,8 1
LC-E161 iag
0,8 NA
LC-K149iag
0,1 0,1
LC-Q155iag
0,1 0,1
Para caracterizar adicionalmente los conjugados de brentuximab, se seleccionaron variantes que contenfan mutaciones ambar en las posiciones de cadena pesada K121 o F404 o en la posicion de cadena ligera N152 para escalado y caracterizacion adicional. Como control, se expreso tambien el trastuzumab que contenfa una mutacion ambar en F404, se inserto el codon TAG expresado mediante mutagenesis de PCR superpuesta en los nucleotidos correspondientes a las posiciones K121 y F404 en la cadena pesada y N152 en la cadena ligera y se clono por separado en el vector de expresion pYD317.
La mezcla de reaccion libre de celulas en la que se sintetizaron las variantes de brentuximab y trastuzumab comprendfa una mezcla de extractos libres de celulas elaborada a partir de una cepa E. coli atenuada con RF-1 sensible a OmpT y una cepa E. coli atenuada con RF-1 sensible a OmpT que fue modificada geneticamente para producir un ARNt codificante de CUA ortogonal para la insercion de un aminoacido no natural en un codon de terminacion ambar. Las variantes se expresaron en una reaccion de sfntesis de protefnas libre de celulas tal como se describe en Zawada y colaboradores, 2011, Biotechnol. Bioeng. 108 (7) 1570-1578 con las modificaciones descritas a continuacion. Se trataron los extractos libres de celulas con yodoacetamida 50 pM durante 30 min a TA (20°C) y se anadieron a una premezcla que contenfa todos los demas componentes excepto el ADN que codifica las variantes de interes. La concentracion final en la reaccion de sfntesis de protefna fue 30% de extracto celular, para-azido metil fenilalanina (pAzMeF) 1 mM (RSP Amino Acids), 0,37 mg/mL de aminoacil-ARNt sintetasa especffica de pAzMeF (FRS) de M jannaschii, GSSG 2 mM, 0,29 mg/mL de PDI (Mclab), 30 pg/mL de DsbC de E. coli, glutamato de magnesio 8 mM, glutamato de amonio 10 mM, glutamato de potasio 130 mM, piruvato de sodio 35 mM, AMP 1,2 mM, 0,86 mM cada uno de GMP, UMP y CMP, aminoacidos 2 mM (excepto 0,5 mM para tirosina y fenilalanina), oxalato de sodio 4 mM, putrescina 1 mM, espermidina 1,5 mM, fosfato de potasio 15 mM, RNAP T7 100 nM. Se analizaron las relaciones de plasmido de HC a LC para encontrar la condicion optima: 3:1, 2:1, 1:1 y 1:2. La concentracion total de plasmido se mantuvo constante a 10 pg/mL. Despues de la adicion de plantilla de ADN, las reacciones libres de celulas se incubaron a 30°C durante 12 h en placas de Petri y seguido por analisis de ensayo con 14C. El rendimiento maximo se alcanzo con una relacion de 1:1. Se llevaron a cabo reacciones libres de celulas de 10 mL bajo esta condicion.
Para purificar las variantes, se diluyeron primero en proporcion 1:0,5 10 mL de extractos crudos libres de celulas para cada variante con regulador de equilibrado (fosfato de sodio 50 mM, pH 7) y se centrifugo a 11.000 x g durante 30 minutos. A continuacion, se paso el sobrenadante a traves de un filtro de jeringa de 0,45 micras antes de cargarse con un tiempo de residencia de 2 minutos en un MabSelect Sure HiTrap (GE Lifesciences) de 1 mL previamente equilibrado para capturar las variantes de IgG. Se lavo luego la columna con 7,5 CV (volumen de columna) del regulador de lavado 1 (fosfato de sodio 100 mM y arginina 800 mM, pH 7) y seguido por 7,5 CV del regulador de lavado 2 (fosfato de sodio 50 mM y Triton X-100 al 0,5% (v/v), pH 7,3). Despues de lavar con 7,5 CV de regulador de equilibrado, se eluyo cada variante con regulador de elucion 4 Cv (citrato de sodio 100 mM y arginina 300 mM, pH 3). Se ajusto el combinado de elucion a pH 7 mediante la adicion de un 30% (v/v) de Tris 1 M, pH 9.
Se intercambio el regulador de la combinacion de elucion recogida en PBS a traves de dialisis durante una noche en unidades de 10kD Slide-A-Lyzer (Pierce). El material dializado se concentro despues usando una unidad filtrante para centrffuga Amicon Ultra-15 (Millipore) a una concentracion de 5-10 mg/mL.
Se conjugaron las variantes purificadas de la siguiente manera. Se disolvio DBCO-MMAF 2 (ACME Bioscience, Palo Alto, cA) en DMSO hasta una concentracion final de 5 mM. Se diluyo el compuesto con PBS hasta una concentracion de 1 mM y a continuacion se anadio a las variantes purificadas de trastuzumab en regulador de elucion de IMAC para conseguir una concentracion final de farmaco de 100 pM. Se incubo la mezcla a TA (20°C) durante 17 horas. Se detuvo
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la reaccion anadiendo azida de sodio hasta una concentracion final de 100 mM y se intercambio el regulador usando placas Zeba (Thermo Scientific, Waltham, MA) equilibradas en 1X PBS.
Se determino la DAR para las variantes no glicosiladas mediante LC-MS de la siguiente forma. ADC mediante LCMS
Las muestras se corrieron en un sistema de UPLC Aquity de Waters unido a Xevo QTOF. Se separaron las protefnas en una columna de PLRP-S de Agilent (2,3x50 mm, 5 pm, 4000 A) a 80°C. Fases moviles: A: agua : acido formico al 0,1%; B: 20:80 isopropanol: acetonitrilo, acido formico al 0,1%. Se desalinizaron las muestras en columna durante 0,4 minutos con 10% de B, seguido de un gradiente escalonado desde 30% de B hasta 40% de B durante 7 minutos, 40% de B a 60% de B durante 3 minutos. Los datos se obtuvieron a lo largo de toda la elucion de LC utilizando un voltaje de cono de 35 V. Los espectros se analizaron utilizando el software MassLynx. Los valores de DAR se calcularon como un promedio ponderado y se muestran en la Tabla 13
Tabla 13: Valores de DAR para ADC Adcetris
Variante
Farmaco DAR
Brentuximab no glicosilado IgG HC-F404
DBCO-MMAF 2 1,87
Brentuximab no glicosilado IgG HC-K121
DBCO-MMAF 2 1,79
Brentuximab no glicosilado IgG LC-N152
DBCO-MMAF 2 1,74
Trastuzumab no glicosilado IgG HC-F404
DBCO-MMAF 2 1,97
A continuacion, se midieron las actividades de union celular y de muerte celular de las variantes de la siguiente forma. Se obtuvieron las lfneas celulares Karpas 299 y L540 de la coleccion alemana de microorganismos y de cultivos celulares (DSMZ) y se obtuvieron las lfneas celulares SKBR3 y Raji de la American Type Culture Collection (ATCC). Se cultivaron las celulas en medio RPMI 1650 (Cellgro-Mediatech, Manassas, VA) que contenfa 20% de suero fetal bovino inactivado por calor (Hyclone, Thermo Scientific, Waltham, MA), glutamax 2 mM (Invitrogen, Carlsbad, CA) y penicilina/estreptomicina 1x (Cellgro - Mediatech, Manassas, VA). Se cultivaron las celulas SKBR3 adherentes en medio DMEM/Nutriente F-12 Ham (50:50) de alto contenido en glucosa (Cellgro-Mediatech, Manassas, VA) suplementado con suero fetal bovino inactivado por calor al 10%, glutamax 2 mM y penicilina/estreptomicina 1x. Todas las celulas se cultivaron y se mantuvieron a 37°C en una incubadora de CO2 al 5%. Se pasaron las celulas SKBR3 mediante lavado con solucion salina equilibrada de fosfato (PBS) libre de calcio/magnesio y se recolectaron con HyQTase (Hyclone, Thermo Scientific, Waltham, MA).
Se midieron las actividades de muerte celular de las variantes de Trastuzumab y Brentuximab (Adcetris) utilizando el ensayo de proliferacion celular CellTiter-Glo®. Brevemente, se sembraron en placa 104 celulas en suspension o 3x103 celulas SKBR3 en 40 pL por pozo en una placa tratada con TC blanca de media area de 96 pozos y se incubaron a 37°C durante 2 horas antes de anadir los anticuerpos. Los anticuerpos se formularon en los medios respectivos de cultivo de celulas y se esterilizaron por filtracion con filtros de tubo de centrffuga Costar Spin-X® de acetato de celulosa 0,45 pm (Corning, Tewksbury, MA). Se anadieron 40 pL de anticuerpo no conjugado, anticuerpo conjugado con AB4285 o farmaco libre de AB4285 a las celulas y se cultivaron durante 3 o 5 dfas para las celulas en suspension y las celulas SKBR3, respectivamente. Se midio la viabilidad celular mediante la adicion de 80 pL del reactivo Cell Titer-Glo® (Promega Corp., Madison, WI) a cada pozo y se proceso siguiendo las instrucciones del producto. Se midio la luminiscencia se midio con el lector de placas ENVISION® (Perkin-Elmer, Waltham, MA). Se convirtieron las lecturas de luminiscencia relativas en % de viabilidad usando celulas no tratadas como controles y se grafico contra la concentracion de anticuerpos. Se calculo IC50 a partir de la ecuacion de regresion no lineal, log (inhibidor) contra la pendiente de la variable de respuesta (4 parametros) utilizando el software estadfstico Prism (Software GraphPad, San Diego, CA). Los resultados se muestran en las Figuras 8 y 9 y la Tabla 14.
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ADC
Sitio Lfnea celular
Karpas
L540 SKBR3
IC50
IC50
IC50
(nM)
(nM)
(nM)
Brentuximab no glicosilado DBCO-MMAF 2
HC F404 0,078 0,22
Brentuximab no glicosilado DBCO-MMAF 2
HC K121 0,040 0,12
Brentuximab no glicosilado DBCO-MMAF 2
LC N152 0,037 0,12
Trastuzumab no glicosilado DBCO-MMAF 2
HC F404 0,043
DBCO-MMAF 2 libre de farmaco
243 646 378
Se midieron las afinidades de union a celulas de las variantes de trastuzumab y de brentuximab usando el ensayo basado en FACS. En pocas palabras, se sembraron en placa 2 x 105 celulas Karpas 299 o L540 en 25 pL de regulador de union, que consiste en PBS que contenfa albumina de suero bovino (BSA) al 0,5% (Invitrogen, Carlsbad, CA) y azida de sodio al 0,09% (Sigma, St. Louis, MO) en una placa de polipropileno de fondo en U de 96 pozos (Greiner Bio-One, Monroe, NC). Los anticuerpos se formularon en regulador de union y se prepararon diluciones en serie de 2 veces en una placa separada de 96 pozos. Se anadio un volumen igual de anticuerpos diluidos a las celulas y se incubaron a 4°C durante 1 hora. Las celulas se lavaron dos veces con 200 pL de regulador de union para eliminar los anticuerpos no unidos. Para la deteccion de anticuerpos secundarios, se prepararon 5 pg/mL anti IgG humano de cabra conjugada con Alexa-488 (Invitrogen, Carlsbad, CA) en regulador de union y se anadieron 50 pL a las celulas y se incubaron a 4°C durante 1 hora. Se lavaron las celulas dos veces, se resuspendieron en 200 pL de regulador de union y se analizaron utilizando un citometro de flujo BD FACScan® (Cytek, Fremont, CA) equipado con un micromuestreador automatico de 96 pozos (Cytek, Fremont, CA). Se adquirieron los datos y se analizaron usando FlowJo (Tree Star, Ashland, OR). Se expresaron las lecturas de intensidad media de fluorescencia como % de union mediante normalizacion de los valores maximos promedio de MFI y se graficaron los datos contra la concentracion de anticuerpos. Se calcularon las afinidades de union a partir de la ecuacion de union de saturacion de regresion no lineal, union total en el sitio utilizando el software Prism. Los resultados se muestran en la Figura 10 y en la Tabla 15.
TABLA 15 Union de celulas de variantes de Brentuximab
ADC
Sitio Lfnea celular
Karpas
L540
Kd (nM)
Kd (nM)
Brentuximab no glicosilado DBCO-MMAF 2
HC F404 0,46 0,81
Brentuximab no glicosilado DBCO-MMAF 2
HC K121 0,52 1,3
Brentuximab no glicosilado DBCO-MMAF 2
LC N152 0,50 1,0
Ejemplo 14: Conjugados anticuerpo-farmaco en andamiajes alternativos: formatos de scFv
Para demostrar la viabilidad de usar scFv como andamiaje alternativo para ADC, se clono el ADN que codifica scFv (VL_VH) de trastuzumab con un codon ambar en el vector de expresion pYD317. Se inserto el codon TAG por mutagenesis de PCR superpuesta en los nucleotidos correspondientes al aminoacido serina en la posicion (-1).
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Para expresar el scFv, se descongelaron los extractos libres de celulas a temperature ambiente y se incubaron con yodoacetamida 50 pM durante 30 min. Las reacciones libres de celulas se realizaron a 30°C durante hasta 10 horas que contenfan 30% (v/v) de extracto tratado con yodoacetamida con glutamato de magnesio 8 mM, glutamato de amonio 10 mM, glutamato de potasio 130 mM, piruvato de sodio 35 mM, AMP 1,2 mM, 0,86 mM cada uno de GMP, UMP y CMP, aminoacidos 2 mM para todos los 18 aminoacidos excepto tirosina y fenilalanina que se anadieron a 0,5 mM, oxalato de sodio 4 mM, putrescina 1 mM, espermidina 1,5 mM, fosfato de potasio 15 mM, T7 RNAP 100 nM, DsbC de E. coli 1,3 pM, glutationa oxidada (GSSG) 2 mM, 10 pg/mL de scFv plasmido, ARNt de m. j. producido in vivo 15 pM, ARN sintetasa 5 pM y p-azido fenilalanina 1 mM (pN3F). El scFv de tipo silvestre se expreso como control.
Se purificaron scFv(-1)pN3F y scFv de tipo silvestre mediante Protefna L seguido de SEC. Se incubo scFv(-1) 5 pM con 50 pM del reactivo DBCO-MMAF mostrado en la Figura 1 durante 16 horas a temperatura ambiente. El exceso de farmaco libre se elimino mediante una columna de desalinizacion Zeba.
Se realizo a continuacion la cromatograffa de interaccion hidrofoba para cuantificar las muestras y para determinar las relaciones farmaco-anticuerpo de la siguiente manera. Las muestras y los patrones se diluyeron 1:1 en sulfato de amonio 3 M (EMD Chemical), fosfato de sodio 50 mM pH 7,0 (Mallinckrodt) preparado en agua MilliQ. Se equipo un sistema de HPLC Dionex con una columna TSK-gel Butil-NPR® de Tosoh Bioscience LLC (4,6 mm x 3,5 cm) con una temperatura del compartimento de columna de 30°C. La fase movil A era sulfato de amonio 1,5 M, fosfato de sodio 50 mM, pH 7,0. La fase movil B era fosfato de sodio 50 mM, pH 7,0 en agua : alcohol isopropflico en proporcion 80:20 (Honeywell). La fase movil se suministro a una velocidad de flujo de 1,0 mL/minuto. La separacion se realizo con un gradiente lineal de 15% de fase movil B a 100% de fase movil B en 10 minutos. Los datos UV se adquirieron a 214 nm. Las areas de los picos se cuantificaron usando el software de Chromeleon (Thermo) para calcular la relacion de farmaco-anticuerpo (DAR).
Para evaluar la union de las variantes de andamiaje alternativas conjugadas, se realizo un ensayo de union a celulas que expresan HER2 de la siguiente manera. La union de las variantes conjugadas purificadas a HER2 en celulas SKBR3, que sobreexpresan el producto del gen HER2/c-erb-2, con mas de 1,5 millones de copias del receptor por celula (ATCC # HTB-30, Manassas, VA) se comparo con Herceptin® de grado clfnico, trastuzumab no glicosilado producido por sfntesis de protefnas libres de celulas, o IgG1 en suero humano como control negativo (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Se cultivaron celulas SKBR3 en DMEM:F-12 de Ham (50:50), alto contenido de glucosa (Cellgro-Mediatech, Manassas, VA) suplementada con suero fetal bovino inactivado por calor al 10% (Hyclone; Thermo Scientific, Waltham, MA), glutamax 2 mM (Invitrogen, Carlsbad, CA) y Penicilina/estreptomicina 1x (Cellgro-Mediatech, Manassas, VA). Las celulas adherentes se lavaron dos veces con solucion salina equilibrada de Hanks (HBSS) libre de calcio y magnesio, se recolectaron con HYQ®TASEMR (Hyclone, Thermo Scientific, Waltham, MA). Se incubaron un total de 200.000 celulas por muestra en un volumen total de 10 pL con diluciones en serie ya sea de variantes de andamiaje alternativas conjugadas, HERCEPTIN® de grado clfnico o trastuzumab no glicosilado en 10 pL de regulador FACS (regulador DPBS suplementado con 1% de albumina de suero bovino). Las celulas mas anticuerpo o ADC se incubaron durante 60 minutos sobre hielo. Se utilizaron como control celulas no tenidas, IgG1 humana (control de isotipo) y anticuerpo secundario (anti-IgG humana de cabra). Para detectar la union a HERCEPTIN® o a trastuzumab no glicosilada, se lavaron las celulas dos veces con regulador FACS enfriado con hielo y se incubaron con 5 pg/mL de anticuerpo secundario anti-IgG humana de cabra marcado con Alexa 647 (Invitrogen, Carlsbad, CA) sobre hielo durante 1 hora. Se detecto la union a celulas alternativas de andamiaje incubando celulas en hielo durante 1 h con 5 pg /mL de Protefna L (Pierce) marcada con Alexa 647 o con anti-Fc humano de cabra marcado con Alexa 647 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Todas las muestras se lavaron usando regulador FACS y se analizaron usando un sistema BD FACS Calibur (BD Biosciences, San Jose, CA).
Las intensidades medias de fluorescencia se ajustaron usando analisis de regresion no lineal con una ecuacion de union especffica del sitio usando GraphPad Prism (software GraphPad version 5.00, San Diego, CA). Los datos se expresaron como MFI relativa frente a la concentracion de anticuerpo o variante de anticuerpo en nM.
A continuacion, se midieron los efectos de las variantes de andamiaje alternativas conjugadas sobre la muerte celular con un ensayo de proliferacion celular de la siguiente manera. Se obtuvieron celulas SKBR3 de ATCC y se mantuvieron en DMEM:F-12 de Ham (50:50), alto contenido de glucosa (Cellgro-Mediatech, Manassas, VA) suplementada con suero bovino fetal inactivado por calor al 10% (Hyclone, Thermo Scientific, Waltham, MA), glutamax 2 mM (Invitrogen, Carlsbad, CA) y Penicilina/estreptomicina 1x (Cellgro-Mediatech, Manassas, VA). Las celulas adherentes se lavaron dos veces con solucion salina equilibrada de Hanks (HBSS) libre de calcio y magnesio, se recogieron con HYQ®TASEmr (Hyclone, Thermo Scientific, Waltham, MA). Se sembraron un total de 103 celulas en un volumen de 40 pL en una placa de poliestireno blanco de fondo plano de 96 pozos de superficie media. Se dejo que las celulas se adhirieran durante la noche a 37°C en una incubadora de CO2. Se formularon las variantes de ADC a una concentracion de 2x en medio DMEM/F12 y se filtraron a traves de placas filtrantes de 96 pozos MultiScreen hts (Millipore, Billerica, MA). Se anadieron variantes de andamiaje alternativas conjugadas esterilizadas con filtro, HERCEPTIN®, o trastuzumab no glicosilado en pozos de tratamiento y se cultivaron las placas a 37°C en una incubadora de CO2 durante 120 horas. Para la medicion de la viabilidad celular, se anadieron 80 pL de reactivo Cell Titer-Glo® (Promega Corp., Madison, WI) en cada pozo y se procesaron las placas de acuerdo con las instrucciones del producto. Se midio la luminiscencia relativa en un lector de placas ENVISION® (Perkin-Elmer, Waltham, MA). Las lecturas relativas de
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luminiscencia se convirtieron en % de viabilidad usando celulas no tratadas como controles. Los datos se ajustaron con un analisis de regresion no lineal, utilizando el log(inhibidor) frente a la respuesta -de pendiente variable, ecuacion de ajuste de 4 parametros utilizando GraphPad Prism (software GraphPad version 5.00, San Diego, CA). Los datos se expresaron como viabilidad celular relativa, contenido de ATP en % frente a la dosis de ADC en nM.
Los resultados del analisis HIC, la union a la celula y los experimentos de muerte celular se presentan en la Tabla 16.
Tabla 16: Union de celulas scFv, muerte de celulas y DAR
Union a celulas SKBR3 Muerte de celulas SKBR3
Andamiaje
IC50, nM Kd, nM DAR por el ensayo HIC
Trastuzumab no glicosilado
5 NA NA
scFv(-1) TS
15 NA NA
scFv(-1) conjugado
14 0.48 0.77
Ejemplo 15: Conjugados anticuerpo-farmaco en andamiajes alternativos: formatos scFv-Fc
Para demostrar la viabilidad de usar scFv Fc como andamiaje alternativo para ADC, se clono el ADN que codifica scFv Fc (VL_VH_Fc) de trastuzumab con ambar, en el vector de expresion pYD317. Se inserto el codon TAG mediante mutagenesis de PCR superpuesta en los nucleotidos correspondientes al aminoacido serina en la posicion (-1), Fc R355, Fc N389 y Fc F404 (numeracion del fndice de la UE).
Las condiciones de reaccion CFPS fueron las mismas que las descritas en el Ejemplo 14, excepto que se anadio PDI de levadura 5 pM. El scFv Fc de tipo silvestre se expreso como control.
Para conjugar scFv-Fc no glicosilado, se purificaron primero las protefnas por Protefna A seguido por SEC. Se incubo pN3F 5 pM que contiene scFv-Fc con DBCO-MMAF 50 pM durante 16 horas a temperatura ambiente. Se removio el exceso de farmaco libre mediante una columna de desalinizacion Zeba.
Adicionalmente, se incorporo p-azido metil fenilalanina a scFv Fc en los sitios de R355, N389 y F404, respectivamente. Las condiciones de reaccion eran las mismas que las descritas en el Ejemplo 14, excepto que se utilizaron pCiano FRS de m. j. 1 pM y p-azido metil fenilalanina 1 mM para reemplazar el par de FRS de m. j. y p-azido fenilalanina. Se conjugo luego la protefna purificada por protefna A con el reactivo DBCO-MMAF 2 (DBCO-MMAF 2). La estructura de DBCO- MMAF 2 se muestra en la Figura 11.
A continuacion, se realizo una LC-MS para cuantificar las muestras y para determinar las relaciones farmaco-anticuerpo de la siguiente manera. Se analizaron las muestras por cromatograffa lfquida (CHIP-Cube nanoLC, Agilent) acoplado a un espectrometro de masas qTOF (Agilent 6520). Las protefnas se separaron en HPLC-Chip de fase reversa (PLRP-S, 4000A, 5 p; columna de enriquecimiento: 25 mm; columna de separacion: 150 mm x 75 pm) con acido formico al 0,1% en agua (disolvente A) y acido formico al 0,1% en acetonitrilo + alcohol isopropflico (80:20 v/v, disolvente B). Los datos se procesaron usando el software cualitativo MassHunter (Agilent). Los datos se muestran en la Tabla 17.
Tabla 17: DAR y union a celulas y muerte de celulas de variantes de scFv-Fc
Union a celulas SKBR3 Muerte de celulas SKBR3 DAR por LCMS
Andamiaje
Kd, nM IC50, nM DAR
HERCEPTIN®
12 NA NA
Trastuzumab no glicosilado
8,1 NA NA
Her scFv-Fc
6,0 NA NA
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scFv-Fc (-1) pNaF DBCO-MMAF
6,8 0,011 1,86
scFv-Fc (R355) pNaF DBCO-MMAF
6,9 0,015 1,77
scFv-Fc (N389) pNaF DBCO-MMAF
5,4 0,010 1,53
scFv-Fc (N389) pNaC^F DBCO-MMAF 2
3,0 0,052 1,97
scFv-Fc (R355) pNaC^F DBCO-MMAF 2
5,0 0,055 1,97
scFv-Fc (F404) vH-vL pNaC^F DBCO-MMAF 2
0,05 1,99
scFv-Fc (F404) vL-vLH pNaC^F DBCO-MMAF 2
0,068 1,97
La estabilidad in vivo de los conjugados ADC enlazadores de farmaco se midio dosificando 2 mg/kg de conjugados scFv-Fc DBCO-MMAF2 respectivos en ratones Xid desnudos Beige. Se recogio el plasma por sangrados terminales a los 30 minutos, d3, d7, d14 y d21 de n = 2 animales para cada punto de tiempo. Se capturaron los ADC ScFv-FC totales en circulacion por Biotina-anti-IgG humana de cabra (Fab)2, especfficos del fragmento Fcy. Se degrado el complejo con estreptavidina Mag Sefarosa. Se lavo el complejo capturado para remover la union no especffica y se eluyo con acido formico al 1%. Se analizo el eluato neutralizado mediante LCMS intacta. Los resultados indican que scFv-Fc (N389) pNaCFhF DBCO-MMAF2 y scFv-Fc (R355) pNaCF^F DBCO-MMAF2 son estables hasta 28 dfas.
A continuacion, se analizaron las propiedades farmacocineticas de los ADC ScFv-Fc en ratones XID desnudos beige. Los animales se dosificaron por via intravenosa hasta un nivel de dosis de aproximadamente 2,0 mg/kg de scFv-Fc R355 y scFv-Fc N389. Las concentraciones en plasma, muestreadas hasta los 28 dfas, se determinaron mediante inmunoensayo y los parametros farmacocineticos se calcularon utilizando un enfoque no compartimentado con WinNonlin version 5.2 (Pharsight, CA). Los resultados se muestran en la Figura 12.
Para evaluar la eficacia in vivo de los ADC scFc-Fc, se inocularon celulas tumorales de mama humana KPL-4 en las almohadillas de grasa mamaria de ratones beige SCID (Charles River Laboratories). Se inyectaron un total de 3 millones de celulas por raton, suspendidas en Matrigel libre de rojo fenol al 50% (Becton Dickinson Bioscience) mezcladas con medio de cultivo. Una vez que se alcanzo el tamano del tumor, todos los animales se asignaron aleatoriamente a grupos de tratamiento, de tal manera que el volumen tumoral medio para cada grupo fuese de 100-150
mm3.
Se administro trastuzumab (30 mg/kg) en forma i.p. (una sola inyeccion el dfa 0 del tratamiento), seguido por (15 mg/kg) por semana durante 3 semanas. Se administraron una variante 2nnAA de trastuzumab no glicosilado scFv-Fc N389 DBCO-MMAF 2 15 mg/kg (872ug MMAF/m2, DAR 1.901), una variante 2nnAA de trastuzumab no glicosilado HC-S136 (15 mg/kg) (no conjugado), vehfculo (PBS) y farmaco libre (0,54 mg/kg) por via i.v. (una sola inyeccion en el dfa de tratamiento 0). Los resultados de este experimento se presentan en la Figura 13a.
En otro experimento, se administraron scFv-Fc F404vL-vH DBCO-MMAF2 (15 mg/kg), scFv-Fc F404vH-vL DBCO- MMAF2 (15 mg/kg), Trastuzumab-CF HC F404 DBCO- MMAF 2 (15 mg/kg), trastuzumab-CF (15 mg/kg) y vehfculo por via i.v. mediante una unica Inyeccion en el dfa 0. Los resultados de este experimento se presentan en la Figura 13b.
Para ambos experimentos, todos los grupos de tratamiento consistieron en 10 animales por grupo, y se controlo el tamano del tumor dos veces por semana usando la medicion del calibre. Los ratones se alojaron en jaulas estandar microisladoras para roedores. Los controles ambientales para los habitaculos de los animales se programaron para mantener una temperatura de 70°F, una humedad relativa del 40% a 60%, y un ciclo de luz de aproximadamente 14 h de luz/10 h de oscuridad.
Los resultados de este experimento demuestran que los ADC conjugados en las posiciones N389 y F404 fueron eficaces en un animal para hacer retroceder de forma duradera al tamano del tumor. De particular importancia, los conjugados F404 scFv-Fc lograron una regresion por debajo de la lfnea base, lo que demuestra la eficacia particular de este andamiaje en un modelo de tumor solido.
Ejemplo 16: Ejemplos de ADC especfficos para CD74 y Her2 y con un ejemplo adicional de combinaciones de enlazador-ojiva
Este ejemplo proporciona ejemplos de conjugados anticuerpo-farmaco preparados con un anticuerpo especffico para CD74 y que contiene diferentes ejemplos de combinaciones de enlazador-ojiva como se describe en la presente
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memoria. Este ejemplo proporciona ademas ejemplos de conjugados anticuerpo-farmaco preparados a partir de trastuzumab conjugado con ciertas combinaciones de enlazador-ojiva.
La secuencia proteica de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo anti-CD74 usado en este ejemplo se proporciona como la SEQ ID NO: 5 y 6, respectivamente. La secuencia de cadena pesada incluye un marcador 6-His del extremo terminal C para ayudar con la purificacion. Se introdujeron codones ambar en las posiciones que codifican HC K212, HC S136, HC F241, HC F404, LcS7 o LC N152 usando los metodos descritos en el Ejemplo 13. Se expresaron y purificaron los anticuerpos anti-CD74 que contenfan p-metilazido-Phe usando los metodos descritos en el Ejemplo 13. Las variantes de trastuzumab que contienen p-metilazido-Phe en las posiciones HC S136 o HC F404 tambien se expresaron y purificaron como se describe en el Ejemplo 13.
A continuacion, se conjugaron las variantes anti-CD74 o de trastuzumab con DBCO-MMAF2 (Figura 11A), DBCO-DM4 (Figura 11B), DBCO-DM4 2 (Figura 11C) o DBCO-MMAE (Figura 11D). El metodo utilizado para realizar las reacciones de conjugacion entre las variantes de anticuerpo y las combinaciones de enlazador-ojiva fue como se describe en el Ejemplo 13.
Las relaciones de farmaco-anticuerpo (DAR) de los ADC se determinaron luego mediante LC-MS de acuerdo con el metodo descrito en el Ejemplo 13. Debe observarse que el metodo LC-MS para las muestras anti-CD74 no se habfa optimizado para este anticuerpo; los resultados del analisis contenfan picos que se superponfan con especies no conjugadas, disminuyendo artificialmente la DAR de estas muestras. La DAR de las variantes de ADC preparadas en este ejemplo mostro por lo tanto un buen acuerdo con las ADC que contenfan un nnAA en los sitios correspondientes discutidos en los Ejemplos 1-15. Los resultados del analisis de DAR se presentan en la Tabla 18, a continuacion.
A continuacion, se usaron las variantes de ADC en experimentos de destruccion de celulas para determinar sus valores de IC50. Las variantes de Trastuzumab se analizaron como se describe en el Ejemplo 13. Los efectos de las variantes conjugadas anti-CD74 sobre la muerte celular se midieron mediante un ensayo de proliferacion celular. Las celulas SU- DhL-6 y NCI-H929 se obtuvieron a traves de ATCC y se mantuvieron en medio RPMI-1640 (Cellgro-Mediatech, Manassas, VA) suplementado con suero fetal bovino inactivado por calor al 20% (Hyclone, Thermo Scientific, Waltham, MA), glutamax 2 mM (Invitrogen, Carlsbad, CA) y Penicilina/estreptomicina 1x (Cellgro-Mediatech, Manassas, VA). Se recogieron las celulas SU-DHL-6 y NCI-H929 y se suspendieron nuevamente en medio de cultivo hasta una concentracion final de 0,5 x 106 celulas/mL. Se sembraron un total de 20 x 103 celulas en un volumen de 40 pL en cada pozo de una placa de poliestireno blanco de fondo plano de 96 pozos de superficie media. Las variantes de ADC se formularon en una concentracion de 2x en medio RPMI-1640 completo y se filtraron a traves de placas filtrantes de 96 pozos MultiScreenHTS (Millipore, Billerica, MA). Se anadieron ADC esterilizados por filtracion en pozos de tratamiento y se cultivaron las placas a 37°C en una incubadora de CO2 durante 72 horas. Para la medicion de la viabilidad celular, se anadieron 80 pL de reactivo Cell Titer-Glo® (Promega Corp. Madison, WI) en cada pozo y se procesaron las placas de acuerdo con las instrucciones del producto. Se midio la luminiscencia relativa en un lector de placas ENVISION® (Perkin-Elmer, Waltham, MA). Las lecturas relativas de luminiscencia se convirtieron en % de viabilidad usando celulas no tratadas como controles. Los datos se ajustaron con un analisis de regresion no lineal, utilizando el log(inhibidor) frente a la respuesta -pendiente variable, ecuacion de ajuste de 4 parametros utilizando GraphPad Prism (software GraphPad version 5.00, San Diego, CA). Los datos se expresaron como viabilidad celular relativa, % del contenido de ATP frente a la dosis de ADC en nM. Los resultados de los ensayos de muerte celular se presentan en la Tabla 18.
Tabla 18: Valores de DAR e IC50 para los ejemplos de ADC anti-CD74 y Anti-HER2
Anticuerpo
Conjugado de farmaco Sitio DAR IC50
Anticuerpo anti-CD74
DBCO-MMAF 2 HC K121 1,601 0,122
Anticuerpo anti-CD74
DBCO-MMAF 2 HC S136 1,601 0,100
Anticuerpo anti-CD74
DBCO-MMAF 2 HC F241 1,58 0,078
Anticuerpo anti-CD74
DBCO-MMAF 2 HC F404 1,631 0,137
Anticuerpo anti-CD74
DBCO-MMAF 2 LC S7 1,543 0,120
Anticuerpo anti-CD74
DBCO-MMAF 2 LC N152 1,457 0,130
Anticuerpo anti-CD74
DBCO-DM4 HC K121 1,572 0,191
Anticuerpo anti-CD74
DBCO-DM4 HC S136 1,61 0,271

Claims (17)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    1. Una protefna de Fc que comprende una cadena polipeptfdica que tiene al menos 70% de identidad con la region Fc de la sEq ID NO: 1 y un residuo de aminoacido no natural en el sitio H404 de acuerdo con el esquema de numeracion de la UE, o una variante del mismo modificada despues de la traduccion.
  2. 2. La protefna de Fc de la reivindicacion 1 que no comprende un dominio variable o una cadena ligera.
  3. 3. La protefna de Fc de la reivindicacion 1 que comprende una cadena polipeptfdica que tiene al menos un 80% o 90% de identidad con la region Fc de la SEQ ID NO: 1 y que tiene un residuo de aminoacido no natural en el sitio 407 del polipeptido representativo de cadena pesada de acuerdo con la SEQ ID NO: 1, o una variante de la misma modificada despues de la traduccion.
  4. 4. La protefna de Fc de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha cadena polipeptfdica es una cadena pesada de un tipo seleccionado del grupo que consiste en a, 6, £ y p.
  5. 5. La protefna de Fc de cualquiera de las reivindicaciones anteriores que corresponde a una clase o subclase seleccionada del grupo que consiste en IgA, IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG, IgG1, IgG2, IgG3 e IgM.
  6. 6. La protefna de Fc de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho residuo de aminoacido no natural comprende una unidad estructural seleccionada del grupo que consiste en amino, carboxi, acetilo, hidrazino, hidrazido, semicarbazido, sulfanilo, azido y alquinilo.
  7. 7. La protefna de Fc de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde cada residuo de aminoacido no natural es de acuerdo con la formula
    imagen1
    en donde cada L es independientemente un enlazador divalente; y cada R es independientemente un grupo funcional.
  8. 8. La protefna de Fc de la reivindicacion 7, en donde R es un grupo reactivo, una unidad estructural terapeutica o una unidad estructural marcadora.
  9. 9. La protefna de Fc de la reivindicacion 7, en donde cada R es un grupo reactivo seleccionado del grupo que consiste en amino, carboxi, acetilo, hidrazino, hidrazido, semicarbazido, sulfanilo, azido y alquinilo.
  10. 10. La protefna de Fc de la reivindicacion 7, en donde cada L es un enlazador divalente seleccionado entre el grupo que consiste en un enlace, alquileno, alquileno sustituido, heteroalquileno, heteroalquileno sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno y heteroarileno sustituido.
  11. 11. Un conjugado de protefna de Fc que comprende la protefna de Fc de cualquiera de las reivindicaciones anteriores enlazada a una o mas unidades estructurales terapeuticas o unidades estructurales marcadoras.
  12. 12. El conjugado de protefna de Fc de la reivindicacion 11 que comprende dicha protefna de Fc enlazada a uno o mas farmacos o polfmeros.
  13. 13. El conjugado de protefna de Fc de la reivindicacion 11 que comprende dicha protefna de Fc enlazada a una o mas unidades estructurales marcadoras.
  14. 14. El conjugado de protefna de Fc de la reivindicacion 11 que comprende dicha protefna de Fc enlazada a uno o mas dominios de union de cadena sencilla (scFv).
  15. 15. El conjugado de protefna de Fc de cualquiera de las reivindicaciones 11-14, en donde dicha protefna de Fc esta enlazada a dichas una o mas unidades estructurales terapeuticas o unidades estructurales marcadoras a traves de uno o mas enlazadores.
  16. 16. Una composicion que comprende la protefna de Fc de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha composicion es sustancialmente pura.
  17. 17. Una composicion que comprende la protefna de Fc de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha protefna de Fc es al menos 95% en masa de la masa total de protefna de dicha composicion.
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