CZ2003629A3 - Rostlina pšenice 33391 tolerantní ke glyfosátu a kompozice a způsoby její detekce - Google Patents
Rostlina pšenice 33391 tolerantní ke glyfosátu a kompozice a způsoby její detekce Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2003629A3 CZ2003629A3 CZ2003629A CZ2003629A CZ2003629A3 CZ 2003629 A3 CZ2003629 A3 CZ 2003629A3 CZ 2003629 A CZ2003629 A CZ 2003629A CZ 2003629 A CZ2003629 A CZ 2003629A CZ 2003629 A3 CZ2003629 A3 CZ 2003629A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- wheat
- dna
- glyphosate
- seq
- plant
- Prior art date
Links
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 94
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 title claims abstract description 82
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 title claims abstract description 82
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 77
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title abstract description 15
- 241000209140 Triticum Species 0.000 claims abstract description 187
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 143
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 claims description 121
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 67
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 52
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 33
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 28
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 claims description 27
- 108010020183 3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase Proteins 0.000 claims description 26
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 25
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 23
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 23
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 claims description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 21
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 claims description 19
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 17
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 17
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 17
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 17
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 10
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 claims description 8
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims description 8
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 claims description 7
- 108010031100 chloroplast transit peptides Proteins 0.000 claims description 6
- 101100507655 Canis lupus familiaris HSPA1 gene Proteins 0.000 claims description 5
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 5
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims description 5
- 101710197633 Actin-1 Proteins 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 claims description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims 5
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 claims 2
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 claims 2
- 241000209094 Oryza Species 0.000 claims 2
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 claims 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 claims 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 claims 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 abstract description 16
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 46
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 38
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 30
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 21
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 19
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 18
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 15
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 15
- 239000000047 product Substances 0.000 description 14
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 9
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 9
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 9
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 9
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 9
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 6
- 238000012250 transgenic expression Methods 0.000 description 6
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 5
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 5
- 101150037081 aroA gene Proteins 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 5
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 4
- 241001167018 Aroa Species 0.000 description 4
- 101100491986 Emericella nidulans (strain FGSC A4 / ATCC 38163 / CBS 112.46 / NRRL 194 / M139) aromA gene Proteins 0.000 description 4
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 4
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 3
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 3
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 3
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 108091092878 Microsatellite Proteins 0.000 description 2
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 244000082988 Secale cereale Species 0.000 description 2
- 235000007238 Secale cereale Nutrition 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 108700029229 Transcriptional Regulatory Elements Proteins 0.000 description 2
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 2
- 240000000359 Triticum dicoccon Species 0.000 description 2
- 235000001468 Triticum dicoccon Nutrition 0.000 description 2
- 235000007264 Triticum durum Nutrition 0.000 description 2
- 240000003834 Triticum spelta Species 0.000 description 2
- 235000004240 Triticum spelta Nutrition 0.000 description 2
- 241000209143 Triticum turgidum subsp. durum Species 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000007244 Zea mays Nutrition 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- IRLPACMLTUPBCL-FCIPNVEPSA-N adenosine-5'-phosphosulfate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@@H](CO[P@](O)(=O)OS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@H]1O IRLPACMLTUPBCL-FCIPNVEPSA-N 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 2
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- -1 glyphosate anion Chemical class 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 2
- 238000009401 outcrossing Methods 0.000 description 2
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000005382 thermal cycling Methods 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- QUTYKIXIUDQOLK-PRJMDXOYSA-N 5-O-(1-carboxyvinyl)-3-phosphoshikimic acid Chemical compound O[C@H]1[C@H](OC(=C)C(O)=O)CC(C(O)=O)=C[C@H]1OP(O)(O)=O QUTYKIXIUDQOLK-PRJMDXOYSA-N 0.000 description 1
- 102000000452 Acetyl-CoA carboxylase Human genes 0.000 description 1
- 108010016219 Acetyl-CoA carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 102000007347 Apyrase Human genes 0.000 description 1
- 108010007730 Apyrase Proteins 0.000 description 1
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 1
- 108010018763 Biotin carboxylase Proteins 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 244000148064 Enicostema verticillatum Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 108010034791 Heterochromatin Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-N Metaphosphoric acid Chemical compound OP(=O)=O UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 238000012181 QIAquick gel extraction kit Methods 0.000 description 1
- 101100173636 Rattus norvegicus Fhl2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 102000004523 Sulfate Adenylyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010022348 Sulfate adenylyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000010352 biotechnological method Methods 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000009402 cross-breeding Methods 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 244000037666 field crops Species 0.000 description 1
- 238000002875 fluorescence polarization Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 210000004458 heterochromatin Anatomy 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 108010087904 neutravidin Proteins 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 235000020030 perry Nutrition 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000012175 pyrosequencing Methods 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 241000228158 x Triticosecale Species 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
- C12N9/1092—3-Phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase (2.5.1.19), i.e. 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
- C12N15/8275—Glyphosate
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y205/00—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5)
- C12Y205/01—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5) transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5.1)
- C12Y205/01019—3-Phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase (2.5.1.19), i.e. 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Rostlina pšenice 33391 tolerantní ke glyfosátu a kompozice a způsoby její detekce
Oblast techniky (
Vynález se týká oblasti rostlinné molekulární biologie, přesněji se týká DNA konstruktu pro prokazatelně lepší toleranci rostliny pšenice vůči glyfosátu. Vynález se přesněji týká rostliny pšenice 33391 tolerantní ke glyfosátu a jejího rodu a testů detekce přítomnosti DNA rostliny pšenice 33391 ve vzorku a testovacích kompozic.
Dosavadní stav vynálezu
Pšenice je důležitá plodina a v mnoha oblastech světa je primárním zdrojem potravin. Na pšenici byly aplikovány biotechnologické metody za účelem vylepšení agronomických vlastností a kvality produktu. Jednou z takových agronomických vlastností je tolerance vůči herbicidům, zejména tolerance vůči glyfosátovému herbicidu. Tato vlastnost pšenice je způsobena expresí transgenu v rostlinách pšenice (Zhou et al., Plant Cell Rep. 15:159-163, 1995). Exprese cizích genů v rostlinách je, jak známo, ovlivněna pozicí začlenění těchto genů do chromozomu, pravděpodobně díky chromatinové struktuře (tzv. heterochromatin) nebo těsné blízkosti transkripčně regulačních elementů (tzv. enhancery) od místa integrace (Weising et al., Ann. Rev. Genet 22:421-477, 1988). Z těchto důvodů je často nezbytné sledovat velké množství případů z důvodu identifikace případu charakterizovaného optimální expresí žádaného zaváděného genu. Například bylo pozorováno u rostlin a dalších organismů, že se může vyskytnout široká variabilita v hladinách exprese zaváděného genu v rámci případů. Rozdíly mohou být v prostorovém nebo časovém charakteru exprese, například rozdíly v relativní expresi transgenu v různých rostlinných tkáních, které nemusí odpovídat charakteru očekávanému na základě transkripčně regulačních elementů přítomných v zaváděném genovém konstruktu. Z těchto důvodů je běžné produkovat stovky až tisíce různých případů a sledovat tyto případy za zisku jednoho případu, který má požadované expresní hladiny transgenu, a charakter exprese pro komerční použití. Případ, který má požadované hladiny a charakter exprese transgenu je použitelný pro vnesení transgenu do dalších genetických pozadí sexuálním „outcrossingem“ s použitím konvenčních šlechtitelských metod. Potomci takových kříženců udržují charakter exprese transgenu původního transfomnanta. Tato strategie je používána za účelem zajištění spolehlivé genové exprese v množství variet, které jsou dobře adaptovány pro lokální růstové podmínky.
Bylo by výhodné umět detekovat přítomnost případu zejména při určování, zda potomek sexuálního křížení obsahuje požadovaný transgen. Navíc způsob detekce specifických případů by byl užitečný například pro vyhovění předpisům vyžadujícím schválení pro trh a označení potravin odvozených z rekombinantních rostlin. Přítomnost transgenu je možné detekovat jakoukoliv obecně známou metodou detekce nukleových kyselin, jako je polymerázová řetězcová reakce (PCR, polymeraze chain reaction) nebo DNA hybridizace s využitím prob nukleových kyselin. Tyto detekční metody se obecně zaměřují na často používané genetické elementy jako jsou promotory, terminátory, značkové geny atd. Ve výsledku tyto metody nemusí být užitečné pro rozlišení mezi různými případy a to zejména těmi, které byly vyprodukovány s využitím stejného DNA konstruktu bez toho, aniž by byla • · • · · ·
známa sekvence chromozomální DNA přilehlá k vložené DNA („přiléhající DNA“). Je například diskutován PCR test specifický pro případy (Windels et al., Med. Fac. Landbouww, Univ. Gent 64/5b:459 - 462, 1999), kdy byl pomocí PCR identifikován případ sóji 40-3-2 tolerantní ke glyfosátu s využitím setu primerů překlenuj ících spoj mezi inzertem vložené DNA, přesněji jeden primer zahrnoval sekvenci insertu a druhý primer obsahoval sekvenci vložené DNA.
Podstata vynálezu
Vynález poskytuje rostliny pšenice 33391 (Triticum aestivum) s vylepšenou tolerancí vůči glyfosátu, DNA rostlinných expresních konstruktů rostliny pšenice 33391 a dále detekce oblasti inzerce transgenu do genomu u pšenice 33391 a jejích potomků.
Podle jednoho provedení vynálezu je poskytnut DNA konstrukt, který, pokud je exprimován v rostlinných buňkách pšenice, tak tyto rostliny vykazují lepší toleranci vůči glufosátovému herbicidu. Vynález poskytuje způsob produkce a selekce rostlin pšenice tolerantních vůči glyfosátu obsahujících DNA konstrukt pMON30139. DNA konstrukt pMON30139 obsahuje dvě transgenní expresní kazety. První expresní kazeta obsahuje promotor actin 1 (P-Os.Act1) z rýže (Oryzae sativa) a intron (IOs.Actl) funkčně napojený na EPSPS chloroplastovou tranzitní peptidovou sekvenci (TS-At.EPSPS) zArabidopsis funkčně napojenou na gen (AGRTU.aroA:CP4) kódující glyfosát rezistentní 5-enolpyruvylšikimát-3-fosfátsyntázu (EPSPS) izolovaný z Agrobacterium tumefaciens (AGRTU) sp. kmen CP4 funkčně napojený na transkripční inhibitor nopalin syntázy (T-AGRTU.nos). Druhá transgenní expresní kazeta se sestává z 35Spromotoru (P-CaMV.35S:en) mozaikového viru květáku (CaMV) obsahujícího tandemový duplikát oblasti enhanceru funkčně napojený na Hsp70 intron (l-Zm.Hsp70) z rostliny Zea mays, funkčně napojený na sekvenci nukleových kyselin kódující EPSPS chloroplastovou tranzitní peptidovou sekvenci zArabidopsis thaliana, funkčně napojený na gen kódující glyfosát rezistentní 5-enol-pyruvylšikimát-3-fosfát syntázu izolovanou z Agrobacterium tumefaciens (AGRTU) sp. kmen CP4, funkčně napojený na transkripční inhibitor nopalin syntázy. Tyto expresní kazety jsou v tandemu a jsou přemostěny oblastí DNA, která obsahuje DNA sekvence Agrobacterium tumefacies (RB a LB) jako komponenty způsobu, který je použit v rámci způsobu zprostředkované organismem Agrobacterium pro vložení expresních kazet do genomu pšenice.
Podle dalšího provedení vynálezu, je poskytnuto osivo pšenice 33391 obsahující tyto molekuly DNA, jak je uloženo v Americké sbírce typů kultur (American type culture collection, ATCC), záznam č. PTA-2347. Toto provedení podle vynálezu se tedy týká osiva pšenice 33391, rostlin pšenice 33391, částí rostlin pšenice 33391, které obsahují pyl a vajíčka, a způsobů produkce pšeničných rostlin s lepší tolerancí vůči glyfosátu křížením rostlin pšenice 33391 se stejnou rostlinou pšenice nebo jiného druhu.
Podle dalšího provedení vynálezu jsou poskytnuty kompozice a způsoby detekce přítomnosti oblasti inzerce transgenu do genomu u rostlin pšenice 33391 a osiva. Podle jednoho z provedení vynálezu jsou DNA molekuly vytvořeny tak, aby obsahovaly alespoň jednu sekvenci oblasti inzerce transgenu do genomu pšenice 33391, kde sekvence je vybrána ze skupiny obsahující SEQ ID č.5 a
SEQ ID č.6 a jejich komplementární sekvence, kde sekvence oblasti inzerce zahrnuje spojení mezi • · • · · · • · · • · · · * · · ·· · · ···· · heterologní DNA vloženou do genomu pšenice a DNA genomu pšenice navazující na místo inzerce, a charakterizuje případ.
Zahrnuty jsou DNA sekvence, které obsahují dostatečnou délku polynudeotidové sekvence transgenního inzertu a dostatečnou délku polynudeotidové sekvence pšeničného genomu pšenice 33391 ze sekvence SEQ ID č.5, které jsou použitelné jako příměrové sekvence pro vznik amplikonu charakteristického pro pšenici 33391. Zahrnuty jsou DNA sekvence, které obsahují dostatečnou délku polynudeotidové sekvence transgenního inzertu a dostatečnou délku polynudeotidové sekvence pšeničného genomu pšenice 33391 ze sekvence SEQ ID č.6, které jsou použitelné jako primerové sekvence pro vznik amplikonu charakteristického pro pšenici 33391.
Podle jiného provedení vynálezu jsou vytvořeny molekuly DNA, které jsou charakteristické pro pšenici 33391. Toto provedení vynálezu je určeno pro pšenid 33391 obsahující alespoň jednu novou molekulu DNA. DNA molekuly obsahující primerové sekvence jsou vytvořeny tak, že poskytují alespoň jeden nový DNA amplikon pšenice 33391 obsahující sekvence SEQ ID č.7 a SEQ ID č.8 a sekvence k nim komplementární. Tyto DNA amplikony jsou charakteristické pro pšenici 33391. Amplifikace nukleových kyselin genomové DNA pšenice 33391 dá vzniku amplikonu obsahujícího tyto charakteristické DNA sekvence. Vynález poskytuje izolované DNA molekuly, které obsahují dostatečnou délku sekvence transgenního inzertu a dostatečnou délku genomové sekvence pšenice 33391, které fungují jako sekvence primerů pro produkd amplikonu charakteristického pro pšenid 33391.
Podle dalšího provedení vynálezu je poskytnut způsob detekce přítomnosti DNA odpovídající pšenici 33391 ve vzorku. Způsob podle vynálezu zahrnují a) kontakt vzorku obsahujícího DNA se setem primerů, které, když jsou použity pn amplifikační reakd nukleových kyselin společně s genomovou DNA pšenice 33391, dávají vzniknout amplikonu charakteristického pro pšenid 33391; b) provedení amplifikační reakce nukleových kyselin při které vzniká amplikon; a c) detekci amplikonu.
Podle jiného provedení vynálezu je poskytnut kit pro detekci pšenice 33391. Kit obsahuje alespoň jednu polynukleotídovou DNA sekvenci o dostatečné délce komplementární k SEQ ID č. 5 nebo SEQ ID č.6, kde DNA sekvence jsou použitelné jako primery nebo proby, které hybridizují s izolovanou DNA z pšenice 33391 nebo jejích potomků.
Podle dalšího provedení vynálezu je poskytnut způsob produkce rostliny pšenice s lepší tolerancí vůči glyfosátu, který zahrnuje kroky: a) sexuální křížení prvního rodiče pšeničné linie obsahující konstrukt pMON30139, který zajišťuje lepší tolerand vůči aplikaci glyfosátu, a druhého rodiče pšeničné linie, který nevykazuje toleranci vůči glyfosátu, za vzniku velkého množství dceřiných rostlin; a b) výběr dceřiné rostliny, která je tolerantní vůči aplikad glyfosátu. Způsob podle vynálezu je užitečný pro vnesení vlastnosti tolerance vůči glyfosátu do různých genetických pozadí. Tyto způsoby mohou případně zahrnovat další krok zpětného křížení dceřiné rostliny do druhého rodiče pšeničné linie za vzniku rostliny pšenice tolerantní vůči aplikaci glyfosátu.
Výše uvedené a další provedení vynálezu budou zřejmější z následujícího detailního popisu a doprovodných obrázků.
Stávající přihláška vynálezu nárokuje výhodu U.S.Provisional Aplication No. 60/236 653, uplatněno 09/29/00 a U.S.Provisional Application No. 60/236 653?, uplatněno 09/29/00. Pro lepší • · definici vynálezu a jako instrukce pro odborníky v dané oblasti při uvádění do praxe jsou uvedeny následující definice a způsoby. Bez toho, aby to bylo dále rozváděno, použité termíny jsou srozumitelné a konvenčně používané odborníky v dané oblasti. Definice běžných termínů molekulární biologie mohou být také nalezeny v práci Rieger et al., Glossaty of Genetics: Classical and Molecular, 5. vydání, Springer-Verlag: New York, 1991; a Lewin, Genes V, Oxford University Press: New York, 1994. Je použita názvosloví DNA baží, jak je uvedeno v 37CFR § 1.822.
Jak je použito zde, termín „pšenice“ znamená Tríticum aestivum (včetně jarních, zimních a fakultativních variant pšenice), jakékoliv další druhy pšenice, které mohou být kříženy s Tríticum aestivum, včetně, ale ne pouze, tvrdá pšenice [Tríticum durum), pšenice špaldy [Tríticum spelta) a pšenice „emmer [Tríticum dicoccum). Zahrnuty jsou také rostliny, které jsou produkovány konvenčními technikami s využitím Tríticum aestivum jako rodiče při sexuálním křížení s druhy nespadajícími do Tríticum (jako je žito [Secale cereale]), včetně, ale ne pouze druh „triticale“.
Jak je použito zde, termín „obsahuje“ znamená .zahrnuje, ale nevyčerpává možnosti“.
„Glyfosát“ znamená N-fosfonometylglycin a jeho soli. Glyfosát je aktivní složka herbicidu Roundup® (Monsanto Co, St. Louis, MO). Ošetření „glyfosátovým herbicidem“ znamená ošetření přípravkem Roundup®, Roundup Ultra®, nebo jakoukoliv další formulací obsahující glyfosát. Pro účely vynálezu termín „glyfosát“ zahrnuje jakoukoliv herbicidně aktivní formu N-fosfonometylglycinu (včetně jeho jakýchkoliv solí) a další formy, které dávají vzniknout glyfosátového aniontu v rostlině. Ošetření „glyfosátem“ znamená ošetření přípravkem Roundup® nebo Roundup Ultra®, pokud není uvedeno jinak. Pro transformaci rostlin a regenerace v tkáňové kultuře je použit glyfosát nebo soli glyfosátu. Pro testy na celých rostlinách je použita formulace Roundup® nebo Roundup Ultra®. Další formulace s herbicidní aktivitou, které obsahují N-fosfonometylglycin nebo jakékoliv jeho soli, jsou zde uvedeny jako glyfosátový herbicid.
Transgenní „případ“ vzniká transformací rostlinných buněk heterologní DNA, tzn. konstruktu tvořeného nukleovou kyselinou, který obsahuje požadovaný transgen, regenerací populace rostlin vznikající na základě inzerce transgenu do genomu rostliny a selekcí zejména rostlin charakterizovaných inzercí do specifických genomových oblastí. Termín „případ“ označuje originálního transformanta a potomky transformanta, který obsahuje heterologní DNA. Termín „případ“ označuje také potomky vznikající sexuálním „outcross“ mezi transformantem a jinou variantou, která obsahuje heterologní DNA. Dokonce po opakovaném zpětném křížení rekurentního rodiče, vložená DNA a přiléhající sousední DNA z transformovaného rodiče je přítomna u potomků křížení ve stejném místě chromozomu. Termín „případ“ také označuje DNA z originálního transformanta a jeho potomků obsahující DNA inzert a genomové přiléhající sousední sekvence bezprostředně sousedící s DNA inzertem, u kterého se očekává, že bude přenesen potomkům, kteří obdrží DNA inzert včetně požadovaného transgenu jako výsledek sexuálního křížení rodičovské linie jež obsahuje DNA inzert (např. originální transformant a potomek vznikající vegetativním rozmnožováním (selfing) a rodičovské linie, která neobsahuje DNA inzert. Termín „případ“ ve vynálezu zahrnuje osivo pšenice 33391, jak je uloženo v ATCC, záznam č. PTA-2347 a rostliny pšenice, které vyrostli z osiva pšenice 33391 a jejich potomky. Rostlina pšenice, která je tolerantní k dostatečnému množství glyfosátového herbicidu pro řízení růstu plevele bez ovlivnění rostlin pšenice, může být namnožena sexuálním křížením prvního • · • · • · · · • · * · • · · · »»· ··
• · · · ·· ·· ··· ·· ·· rodiče rostliny pšenice, kterou představuje rostlina pšenice obsahující expresní kazety pMON30139 zajišťující lepší toleranci vůči aplikaci glyfosátového herbicidu a druhého rodiče rostliny pšenice, která postrádá toleranci vůči glyfosátovému herbicidu, za vzniku množství prvních potomků rostlin, poté selekcí prvních rostlinných potomků, které jsou tolerantní vůči aplikaci glyfosátu, vegetativním rozmnožováním (selfing) prvních rostlinných potomků za vzniku množství druhých rostlinných potomků a selekcí tolerantních rostlin vůči glyfosátu mezi druhým potomstvem. Tyto kroky mohou dále zahrnovat zpětné křížení rostliny prvního potomka tolerantního vůči aplikaci glyfosátového herbicidu nebo rostliny druhého potomstva tolerantního vůči aplikaci glyfosátového herbicidu s druhým rodičem rostliny pšenice nebo třetím rodičem rostliny pšenice za vzniku rostlin pšenice, které tolerují aplikaci glyfosátového herbicidu. Rostliny pšenice zahrnující osivo pšenice 33391 nebo jejich potomky, přičemž mohou být pěstovány na poli a ošetřovány dostatečným množstvím glyfosátového herbicidu pro řízení růstu plevele bez významného ovlivnění úrody pšenice. Dostatečné množství glyfosátového herbicidu je asi 59 μΙ na m2 (8 uncí na akr) nebo více, 119μΙ na m2 (16 uncí na akr) nebo více, 237 μΙ na m2 (32 uncí na akr) nebo více nebo 474 μΙ na m2 (64 uncí na akr) nebo více. Jakékoliv formulace obsahující glyfosátový herbicid mohou být použity pro řízení růstu plevele ve sklizni pšenice obsahující rostliny pšenice 33391 nebo jejich potomky.
Je také zřejmé, že dvě různé transgenní rostliny mohou být také kříženy za vzniku potomků, kteří obsahují dva nezávislé, oddělené exogenní geny. Vegetativní rozmnožování (selfing) vhodného potomka může vést ke vzniku rostlin, které jsou homozygotní pro oba přidané exogenní geny kódující požadovaný polypeptid. Stejně jako vegetativní rozmnožování je uvažováno také zpětné křížení s rodičovskou rostlinou a „out-crossing“ s netransgenní rostlinou. Popisy dalších šlechtitelských metod, které jsou běžně používány pro různé vlastnosti a plodiny, mohou být nalezeny v jedné z následujících prací: Fehr, in Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronoy, Madison Wl (1987) zde začleněna jako reference na celek; Poehlman, J. M. (1987); reeding Field Crops, 3. vydání. Van Nostrand Reinhold, NY, Knott, D. R. (1987); zde začleněna jako reference na celek The Application of Breeding Procedures to Wheat, strany 419-427 a také v práci E.G Heyne (ed.) In „Wheat and Wheat Improvement“, Madison, Wl. zde začleněna jako reference na celek. Šlechtění s využitím zpětného křížení je používáno pro transfer genů pro jednoduše děděné, vysoce děditelné vlastnosti do požadovaného homozygotního kultivaru nebo imbrední linie, kterou je rekurentní rodič. Zdroj vlastnosti, která má být přenesena, se nazývá donorový rodič. U výsledné rostliny se předpokládá, že bude vykazovat atributy rekurentního rodiče (například kultivaru) a požadovanou vlastnost přenesenou z donorového rodiče. Po počátečním křížení jsou vybráni potomci, kteří vykazují fenotyp donorového rodiče, a opakovaně zpětně kříženi s rekurentním rodičem. U výsledného rodiče se očekává, že bude mít atributy rekurentního rodiče (například kultivar) a požadovanou vlastnost přenesenou z donorového rodiče.
DNA molekuly podle vynálezu mohou být použity jako molekulární markéry u metody MAB (markér assisted breeding). DNA molekuly podle vynálezu mohou být použity v metodách jako jsou
AFLP (amplified fragment length polymorphismus), RFLP (restriction fragment length polymorphismus), SNP a SSR (simple sequence repeats), které slouží k identifikaci genetické vazby agronomicky užitečných vlastností, a které jsou popsány v pracech: Walton, Seed World 22-29 (červenec, 1993) zde začleněna tímto odkazem; Burow and Blake, Molecular Dissection of Complex Traits, 13-29, Eds. Paterson, CRC Press, New York (1988) zde začleněna tímto odkazem. Znak lepší tolerance vůči glyfosátu u rostliny pšenice 33391 může být u potomků křížení s rostlinou pšenice 33391 a jakoukoliv jinou variantou zjišťován pomocí metody MAB. DNA molekuly jsou markéry pro tento znak a v případě metody MAB je velice dobře známo, že může být použita pro zjišťování glyfosátové tolerance u pšenice, kde rostlina pšenice 33391 byla rodič nebo předek.
Termín „proba“ označuje izolovanou nukleovou kyselinu, ke které je připojena konvenčně detekovatelná nebo reportérová molekula, například radioizotop, ligand, chemiluminiscenční činidlo nebo enzym. Proba je komplementární k řetězci cílové nukleové kyseliny, v případě vynálezu k řetězci genomové DNA případu pšenice 33391 (ať už z rostliny pšenice nebo vzorku, který obsahuje DNA případu). Proby podle vynálezu nezahrnují pouze deoxyribonukleové nebo ribonukleové kyseliny, ale také polyamidy a další materiály tvořící proby tak, že se váží specificky k cílové DNA sekvenci a mohou být využity k detekci dané cílové DNA sekvence.
Termín „primery“ označuje izolované nukleové kyseliny, které jsou hybridizovány s kompiementámím řetězcem cílové DNA za vzniku hybridu mezi primerem a cílovým řetězcem DNA, poté prodlužovány podél cílového řetězce DNA pomocí polymerázy, například DNA polymerázy. Pár nebo set primerů může být použit pro amplifikaci sekvence nukleových kyselin například metodou PCR (polymerázová řetězcová reakce) nebo dalšími konvenčními metodami pro amplifikaci nukleových kyselin.
Proby a primery obvykle obsahují 8 nebo více polynukleotidů, 18 nebo více polynukleotidů, 24 nebo více polynukleotidů, 30 polynukleotidů nebo více. Polynukleotidy vhodné jako proby a primery mají dostatečnou délku, aby hybridizovaly specificky s cílovou sekvencí za stringentních (přesně daných) podmínek pro hybridizaci. Proby a primery podle vynálezu vykazují úplnou sekvenční podobnost s cílovou sekvencí, ačkoliv mohou být konvenčními metodami navrženy proby lišící se od cílové sekvence a přesto si udržují schopnost hybridizovat s cílovou sekvencí.
Metody přípravy a použití prob a primerů jsou popsány například v knize Molecular Cloning: A Laboratory manual, 2. vydání, svazek 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 (dále, „Sambrook et al., 1989“) zde začleněna tímto odkazem; Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley-lnterscience, New York, 1992 (s periodickými dodatky, dále .Ausubel et al., 1992) zde začleněna tímto odkazem; alnnis et al., PCR Protocols: A Guide to methods and Applications, Academie Press: San Diego, 1990 zde začleněna tímto odkazem. Pár PCR primerů může být odvozen od známé sekvence například použitím počítačových programů zamýšlených pro toto použití jako je například Primer (verze 0.5, © 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA) zde začleněn tímto odkazem.
Primery a proby na bázi DNA sousedící s inzertem a na sekvencích inzertů popsaných ve vynálezu mohou být použity k potvrzení (a pokud je nezbytné k opravě) popsaných sekvencí konvenčními metodami, například reklonováním a sekvenováním těchto sekvencí.
Primery a proby podle vynálezu ve formě nukleových kyselin hybridizují za stringentních podmínek s cílovou DNA sekvencí. K identifikaci přítomnosti DNA transgenního případu ve vzorku může být použita jakákoliv konvenční metoda pro hybridizaci a amplifikaci nukleových kyselin.
• · · · • ·
Termín „stringentní podmínky“ je funkčně definován vzhledem k hybridizaci proby ve formě nukleové kyseliny s cílovou nukleovou kyselinou (například se specifickou sekvencí požadované nukleové kyseliny) podle specifického hybridizačního postupu popsaného v knize Sambrook et al., 1989, v kapitolách 9.52 - 9.55. Viz také Sambrook et al., 1989 kapitoly 9.47 - 9.52, 9.56 - 9.58 zde začleněn tímto odkazem; Kanehisa, (Nucl. Acids Res. 12:203 - 213, 1984, zde začleněn tímto odkazem; a Wetmur and Davidson, (J. Mol. Biol. 31:349 - 370, 1988, zde začleněn tímto odkazem). Tudíž nukleotidové sekvence podle vynálezu mohou být využity pro svoji schopnost selektivní tvorby duplexních molekul s komplementárními relaxovanými DNA fragmenty. V závislosti na zamýšlené aplikaci je možné požadovat aplikaci různých hybridizačních podmínek hybridizace, aby bylo dosaženo různých stupňů selektivity proby vůči cílové sekvenci. Pro aplikace vyžadující vysokou selektivitu jsou obvykle vyžadovány relativně stringentní podmínky pro tvorbu hybridů, například budou zvoleny podmínky s nízkým obsahem soli a/nebo vysokou teplotou, jako je například koncentrace soli v rozmezí asi 0,02M až asi 0,15 M pň teplotách v rozmezí asi 50 °C až asi 70 °C. Stringentní podmínky jsou určeny například také promýváním hybridizačního filtru alespoň dvakrát vysoce stringentním pufrem (0,2 x SSC, 0,1% SDS, 65°C). Vhodné stringentní podmínky, které usnadňují hybridizaci DNA, například 6 x SSC (chlorid sodný / citrát sodný) při teplotě 45 °C s následným promýváním 2 x SSC při teplotě 50 °C, jsou odborníkům v oblasti známé a mohou být nalezeny v knize Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1 6.3.6. Například koncentrace soli v promývacím kroku se může pohybovat v rozmezí nízké stringence asi 2 x SSC při teplotě 50 °C až vysoké stringence asi 0,2 x SSC při teplotě 50 °C. Navíc může být měněna teplota v kroku promývání z podmínek nízké stringentnosti při pokojové teplotě asi 22 °C až k podmínkám vysoké stringentnosti při teplotě asi 65 °C. Jak teplota, tak koncentrace soli se mohou měnit nebo může být buď teplota, nebo koncentrace soli držena konstantní, zatímco druhý faktor se mění. Tyto selektivní podmínky dovolují vzniknout pouze malému množství, pokud nějakému, nesprávně spojených „mismatch“ hybridizaci mezi probou a templátem cílového řetězce. Detekce DNA sekvencí pomocí hybridizace je odborníkům v oblasti dobře známa a postupy v patentech U.S. Pat. No. 4 965 188 a 5 176 995 jsou příklady metod hybridizačních analýz.
Vzhledem k amplifikací cílových sekvencí nukleových kyselin (například pomocí PCR) s využitím specifického amplifikačního páru primerů, „stringentní podmínky“ jsou podmínky, které umožňují hybridizaci příměrového páru pouze k cílovým sekvencím nukleových kyselin, ke kterým by se primer s odpovídající neupravenou „wild - type“ sekvencí (nebo k ní komplementární) měl s výhodou vázat za vzniku unikátního amplifikačního produktu, amplikonu.
Termín „specifický pro (cílovou sekvenci“ znamená, že proba nebo primer hybridizuje za stringentních hybridizačních podmínek pouze s cílovou sekvencí ve vzorku obsahujícím cílovou sekvenci.
Zde použitý termín „amplifikovaná DNA“ nebo „amplikon“ označuje produkt amplifikace nukleových kyselin cílové sekvence nukleových kyselin, která je částí templátu tvořeného nukleovou kyselinou. Například pro určení, jestli rostlina pšenice vyprodukovaná na základě sexuálního křížení obsahuje transgenní případ, může být genomová DNA rostliny pšenice podrobena amplifikací nukleových kyselin s využitím příměrového páru, který zahrnuje primer odvozený od sekvence ·· · · · · ···· • ♦ · t · · « ·· • · · · ···· · · •··· ·· · · ··· ·· genomu rostliny přilehlé k místu inzerce vložené heterologní DNA a druhý primer odvozený od vložené heterologní DNA, za vzniku amplikonu, který je charakteristický pro přítomnost případu. Amplikon má délku a sekvenci, která je charakteristická pro případ. Nebo také může být pár primerů odvozen od sekvencí sousedících s inzertem na obou stranách vložené DNA, vznikne tak amplikon, který zahrnuje celý inzert.
Amplifikace nukleových kyselin může být dosaženo jakoukoliv z různých v oblasti známých metod amplifikace nukleových kyselin, včetně polymerázóvé řetězcové reakce - PCR. Je známo množství amplifikačních metod a jsou popsány v patentech U.S.Pat. No. 4 683 195 a 4 683 202 a v práci PCR protocols: A guide to Methods and Applications, ed. Innis et. al., Academie Press, San Diego, 1990. Pro využití vynálezu může být použita jakákoliv ze známých metod pro amplifikaci nukleových kyselin. Sekvence heterologní DNA inzertu nebo sousedící sekvence u případu pšenice 33391, vATCC záznam č. PTA-2347 může být ověřena (a pokud je nezbytné také opravena) amplifikaci těchto sekvencí z případu použitím primerů odvozených ze sekvencí poskytnutých vynálezem a následnými standardními metodami DNA sekvenování PCR amplikonu nebo klonované DNA molekuly.
Amplikon vyprodukovaný těmito metodami může být detekován množstvím metod. Běžná a známá metoda pro detekci DNA amplikonů je agarózová elektroforéza s detekcí pomocí etidium bromidu. Další metoda je metoda „Genetic Bit Analysis“ (Nikiforov, et al. Nucelic Acid Res. 22:4167 4175, 1994), kde je navržen DNA oligonukleotid, který zahrnuje DNA sekvenci jak k inzertu přilehlé oblasti, tak vloženého inzertu. Oligonukleotid je imobilizován v jamkách mikrotitrační destičky. Následuje PCR oblasti zájmu (s využitím jednoho primerů v oblasti vložené sekvence a druhého v oblasti s inzertem sousedící genomové DNA sekvence), jednořetězcový PCR produkt může být hybridizován k imobilizovanému oligonukleotidu a slouží jako templát pro reakci o jeden nukleotid prodlužující daný oligonukleotid DNA polymerázou a značeného nukleotidu ddNTP specifického pro další očekávanou bázi. Odečítání může být založeno na fluorescenci nebo dalších standardních postupů ELISA. Signál znamená přítomnost sekvence inzert/přilehlá DNA jako výsledek úspěšné amplifikace, hybridizace a reakce prodlužující oligonukleotid o jednu bázi.
Další metodou je technika pyrosekvenace (Pyrosequencing technique) popsaná autorem Winge (Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000). V této metodě je oligonukleotid navržen tak, že zahrnuje přechod mezi vloženou DNA a přilehlou genomovou DNA. Oligonukleotid je hybridizován k jednořetězcovému PCR produktu z požadované oblasti (jeden primer v oblasti vložené sekvence a druhý v oblasti sousedící genomové DNA sekvence) a inkubován v přítomnosti DNA polymerázy, ATP, sulfurylázy, luciferázy, apyrázy, adenosin 5‘ fosfosulfátu (APS) a luciferinu. Molekuly dNTP se přidávají individuálně a jejich inkorporace způsobuje vznik světelného signálu, který je měřen. Světelný signál označuje přítomnost sekvence inzert/přilehlá DNA jako výsledek úspěšné amplifikace, hybridizace a reakce prodlužující oligonukleotid o jednu nebo více baží.
Fluorescenční polarizace, metoda popsaná autory Chen et al., (Genome Res. 9:492 - 498,
1999), je metoda, která může být použita pro detekci vzniku amplikonu podle vynálezu. V této metodě je oligonukleotid navržen tak, že zahrnuje přechod mezi vloženou DNA a přilehlou genomovou DNA.
Oligonukleotid je hybridizován k jednořetězcovému PCR produktu z požadované oblasti (jeden primer • · ·
• · · e v oblasti vložené sekvence a druhý v oblasti sousedící genomové DNA sekvence) a inkubován v přítomnosti DNA polymerázy a fluorescenčně značených molekul ddNTP. Reakce prodlužující oligonukleotid o jednu bázi vkládá značený ddNTP. Vkládání baží může být stanovena jako změna polarizace pomocí fluorometru. Změny v polarizaci indikují přítomnost sekvence inzert/pňlehlá DNA jako výsledek úspěšné amplifikace, hybridizace a reakce prodlužující oligonukleotid o jednu bázi.
Jako metoda detekce a kvantifikace přítomnosti DNA sekvence je popsána metoda Taqman® (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) a je podrobně popsána v manuálu dodávaném výrobcem. Pouze stručně, oligonukleotidová FRET proba je navržena tak, že zahrnuje přechod mezi vloženou DNA a přilehlou genomovou DNA. FRET proba a PCR primery (jeden primer v oblasti vložené sekvence a druhý v oblasti sousedící genomové DNA sekvence) jsou podrobeny teplotnímu cyklování v přítomnosti termostabilní polymerázy a dNTP. Hybridizace FRET proby způsobuje odštěpení a uvolnění fluorescenční sondy z těla sondy zhášejícího fluorescenci FRET proby. Fluorescenční signál indikuje přítomnost sekvence inzert/přilehlá DNA jako výsledek úspěšné amplifikace a hybridizace.
Pro detekci sekvence byla popsána metoda „Molecular Beacons“ v práci Tyangi, et al., (Nátuře Biotech. 14:303-308, 1996). Pouze stručně, oligonukleotidová FRET proba je navržena tak, že zahrnuje přechod mezi vloženou DNA a přilehlou genomovou DNA. Unikátní struktura FRET proby způsobuje, že její sekundární struktura udržuje v těsné blízkosti fluorescenční oblast a oblast zhášející fluorescenci. FRET proba a PCR primery (jeden primer v oblasti vložené sekvence a druhý v oblasti sousedící genomové DNA sekvence) jsou podrobeny teplotnímu cyklování v přítomnosti termostabilní polymerázy a dNTP. Po úspěšné PCR amplifikace, hybridizace FRET proby s cílovou sekvencí způsobuje změnu sekundární struktury FRET proby a tím oddálení fluorescenční oblasti a oblasti fluorescenci zhášející a vzniká tak fluorescenční signál. Fluorescenční signál indikuje přítomnost sekvence inzert/přilehlá DNA jako výsledek úspěšné amplifikace a hybridizace.
Stručný popis obrázků
Obr. 1 Plazmidová mapa pMON30167
Obr. 2 Plazmidová mapa pMON42411
Obr. 3 Plazmidová mapa pMON30139
Příklady provedení vynálezu
Pro demonstraci příkladů určitých výhodných provedení podle vynálezu jsou uvedeny následující příklady. Pro odborníky v oblasti by mohlo být přínosem, že techniky popsané v příkladech popisujících reprezentativní přístupy vynálezců, dobře fungují při uplatnění vynálezu a tak mohou být považovány, že tvoří příklady výhodných způsobů pro jejich uplatnění. Nicméně odborníci v oblasti z hlediska prezentovaných popisů si jsou vědomi, že v popsaných specifických provedeních, která jsou uvedena, může být učiněno množství změn se získáním stejného nebo podobného výsledku bez vybočení z ducha a oblasti vynálezu.
·♦ ««
Příklad 1
Transgenní rostliny pšenice byly vytvořeny Agrobacřerium-zprostředkovanou transformací pšeničných embryí metodou popsanou v práci Cheng et al. (Plant Physiol. 115:971 - 980, 197) s využitím binárních vektorů vynálezu a modifikovaných podmínek pro glyfosátovou selekci podle práce Zhou et al., (Plant Cell Rep. 15:159 -13, 1995). Odborníkům v oblasti transformace pšenice jsou známé další metody, jako je „genová pistole“ (gene gun) nebo „částicové ostřelování“ ( particle bombardment), které mohou být použity pro vložení expresních kazet vynálezu do genomu pšeničných buněk. T-DNA konstruktu pMON30139 (Obr. 3) obsahuje dvě expresní kazety , které dohromady zapříčiňují vysokou míru tolerance vůči glyfosátovým herbicidům. První transgenní expresní kazeta obsahuje DNA sekvence promotoru a intronu actin 1 z rýže (P-Os.Act1 a l-Os.Actl, U.S.Patent 5 641 876, zde začleněn tímto odkazem) funkčně napojenou na DNA sekvenci kódující EPSPS chloroplastovou tranzitní peptidovou sekvenci zArabidopsis thaliana (TS-At.EPSPS:CTP2, Klee et al.., Mol. Gen. Genet. 210:47 -442, 1987, zde začleněno tímto odkazem), funkčně napojenou na DNA sekvenci kódující glyfosát rezistentní 5-enol-pyruvylšikimát-3-fosfát syntázu (EPSPS) izolovanou z Agrobacterium tumefaciens sp. kmen CP4 (gen AGRTU.aroA, U.S.Patent 5 633 435, zde začleněn tímto odkazem), funkčně napojenou na DNA sekvenci transkripčního terminátoru nopalin syntázy (T-AGRTU.nos, Fraley et al., Proč. Natí. Acad. Sci. USA 80:4803 - 4807, 1983, zde začleněno tímto odkazem). Druhá transgenní expresní kazeta obsahuje DNA sekvenci z 35S promotoru mozaikového viru květáku obsahujícího tandemový duplikát oblasti enhanceru (P-CaMV.35S:en, Kay et al., Science 236:1299-1302, 1987; U.S.Patent 5 164 316, zde začleněn tímto odkazem) funkčně napojenou na DNA sekvenci Hsp70 intronu z rostliny Zea mays (l-Zm.Hsp70, U.S.Patent 5 424 412, zde začleněn tímto odkazem), funkčně napojenou na DNA sekvenci kódující EPSPS chloroplastovou tranzitní peptidovou sekvenci z Arabidopsis thaliana (TS-At.EPSPS:CTP2, Klee et al.., Mol. Gen. Genet. 210:47 -442, 1987) funkčně napojenou na DNA sekvenci kódující glyfosát rezistentní 5-enol-pyruvylshikimát-3-fosfát syntázu (EPSPS) izolovanou z Agrobacterium tumefaciens sp. kmen CP4 (AGRTU.aroA, U.S.Patent 5 633 435) funkčně napojenou na DNA sekvenci transkripčního terminátoru nopalin syntázy (T-AGRTU.nos, Fraley et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 80:4803-4807, 1983).
pMON30167 (Obr. 1) je samostatná expresní kazeta identická s první transgenní expresní kazetou konstruktu pMON30139 popsanou výše. pMON42411 (Obr. 2) je samostatná expresní kazeta identická s druhou transgenní expresní kazetou konstruktu pMON30139 popsanou výše.
Po inkubaci pšeničných buněk s buňkami Agrobacterium obsahujícími konstrukty pMON42411, pMON30167 a pMON30139, byly vůči glyfosátu tolerantní transgenní pšeničné kalusy selektovány na médiu, které obsahovalo 2 mM glyfosát, po dobu jednoho týdne, dále přeneseny do diferenciačního média s 0,1 mM glyfosátem na dobu dvou týdnů a nakonec přeneseny do regeneračního média o obsahu glyfosátu 0,02 mM a 0,1 μΜ koncentrací aromatických aminokyselin.
Transformací buněk konstrukty pMON42411, pMON30167 a pMON30139 bylo získáno 284 případů. Rostliny s konstrukty pMON30167 a pMON30139 byly postříkány jednou glyfosátovým herbicidem (Roundup Ultra ™) v množství 474 μί na m2 (64 uncí na akr) za účelem vybrat linie s vegetativní a reprodukční tolerancí vůči glyfosátovému herbicidu (tabulka 1). Rostliny s konstruktem pMON42411 byly postříkány dvakrát glyfosátovým herbicidem. Selekce transformovaných pšeničných rostlin s konstrukty pMON42411 a pMON30167 obsahujícími jednu expresní kazetu poskytla malé procento rostlin pšenice s jak vegetativní tak reprodukční tolerancí (1,4% a 3,2% respektive). Pouze 3 ze 134 rostlin obsahujících tyto konstrukty vykazovaly přijatelnou hladinu tolerance vůči glyfosátovému herbicidu. Naproti tomu mezi transformovanými rostlinami pšenice obsahující konstrukt pMON30139 s dvojící expresních kazet bylo vysoké procento rostlin (16%) sjak vegetativní tak reprodukční tolerancí (24/150).
Případ pšenice 33391 (dále označován jako rostlina pšenice 33391 nebo pšenice 33391 se zahrnutím všech částí rostliny a osiva této rostliny) byl vybrán ze 150 transgenních případů, které vznikly na základě transformace konstruktem pMON30139. Z této populace bylo vybráno 24 případů, které vykazovaly lepší vegetativní a reprodukční toleranci vůči glyfosátu. Těchto 24 případů bylo dále testováno z hlediska agronomických vlastností a z hlediska přítomnosti jednoho intaktního inzertu. Z této populace případů byla vybrána pšenice 33391. Skleníkové a polní testování pšenice 33391 a potomků odvozených od pšenice 33391 naznačilo, že transgenní inzerce zajišťuje toleranci vůči glyfosátu, která převyšuje komerční specifikace plné vegetativní a reprodukční tolerance na 84 mg/m2 (340 g na akr, 840 g glyfosátu na hektar; 32 oz Roundup Ultra na akr) glyfosátu s dvounásobnou hranicí spolehlivosti, pokud je glyfosát aplikován ve stádiu 3-5 listů.
Tabulka č.1 Srovnání účinnosti přítomnosti jedné a dvou expresních kazet pro zajištění tolerance vůči glyfosátu u pšenice
| pMON# | počet testovaných případů | počet případů s vegetativní tolerancí | Počet případů s vegetativní tolerancí a reprodukční toleranci |
| 42411 | 71 | 26 | 1 (1,4%) |
| 30167 | 63 | 4 | 2 (3,5%) |
| 30139 | 150 | 104 | 24 (16%) |
Příklad 2
Izolace odpovídajících sekvencí přiléhajících k inzertu z pšeničného genomu je možno provádět množstvím metod známých v oboru (například s použitím ligovaných adaptérů a „dvoukolové“ (nested) PCR, jak je popsáno v kitu Genome Walker™ (CloneTech Laboratories, lne., Palo Alto, CA)). Genomová DNA pšenice 33391 byla izolována purifikační metodou CTAB (Rogers et al., Plant Mol Biol 5:69-76,1985). Reagencie jsou komerčně dostupné (viz například Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). DNA knihovny genomu pro amplifikaci byly připraveny podle přiloženého manuálu (Genome Walker™, CloneTech Laboratories, lne., Palo Alto, CA). Genomová DNA byla v oddělených reakcích štěpena přes noc při teplotě 37°C následujícími restrikčními endonukleázami produkujícími tupé konce (blunt-end endonucleases): Dral, EcoRV, Pvull, Seal a Stul (CloneTech Laboratories, lne., Palo Alto, CA). Reakční směsi byly extrahovány extrakční směsí fenol:chloroform, DNA byla precipitována ···· ·· ·· ··· ·« ·· přídavkem etanoiu do vodné fáze, centrifugována za vytvoření peletu a resuspendována v pufru TrisEDTA (10 mM Tris-HCI, pH 8.0, 1 mM EDTA). Purifikované fragmenty genomové DNA s tupými konci byly ligovány k adaptorům Genome Walker™ podle přiloženého manuálu. Po ligaci adaptorů ke fragmentům genomové DNA byla každá reakce ukončena zahříváním na teplotu 70 eC po dobu 5 min a poté 10 krát naředěna v pufru Tris-EDTA. Jeden mikrolitr ligačních produktů byl poté amplifikován v reakci o objemu 50 μΙ podle výrobcem doporučeného postupu s použitím adaptér-specifických oligonukleotidů (dodaných výrobcem) a oligonukleotidů specifických vůči transgenů pšenice 33391, jako je SEQ ID č.1, která přisedá blízko 5‘ konce P-Os.Act1. PCR směs obsahovala 1 μΙ odpovídající ligované DNA knihovny, 1μΙ 10μΜ adaptorového Genome Walker™ primerů AP1 dodávaného výrobcem (5‘GTATATCGACTCACTATAGGGC3‘, SEQ ID č. 11), 1μΙ 10μΜ oligonukleotidů specifického vůči transgenů pšenice 33391 (SEQ Id č.1), 1 μΙ 10 mM deoxyribonukleotidů, 5 μΙ 10x koncentrovaného PCR pufru obsahujícího MgCI2, 0,5 μΙ (2,5 jednotek) Taq DNA polymerázy (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN) a byla doplněna vodou do objemu 50 μΙ. PCR reakce byly prováděny v termocykleru s využitím řízení teploty výpočtem a za následujících podmínek cyklů: 1 cyklus při 94°C 1 minutu; 7 cyklů (94 °C 2 sekundy, 70 °C 3 minuty); 37 cyklů (94 °C 2 sekundy, 65 °C 3 minuty); 1 cyklus 65 °C 10 minut. Jeden mikrolitr každé reakční směsi byl poté amplifikován v druhé amplifikaci s využitím „nested“ adaptér-specifických oligonukleotidů (dodaných výrobcem) a „nested“ oligonukleotidů specifických vůči transgenů, jako je SEQ Id č.2, která přisedá na P-Os.Act1 nad (upstream) primerem použitým v první reakci (ve smyslu směru přepisu DNA řetězce). PCR směs pro druhou PCR obsahovalal μΙ odpovídajících primárních PCR produktů, 1μΙ 10μΜ adaptorového Genome Walker™ primerů AP2 dodávaného výrobcem (5‘ACTATAGGGCACGCGTGGT3‘, SEQ ID č. 12), 1μΙ 10μΜ oligonukleotidů specifického vůči transgenů pšenice 33391 (SEQ Id č.2), 1μΙ 10 mM deoxyribonukleotidů, 5 μΙ 10xkoncentrovaného PCR pufru obsahujícího MgCI2, 0,5 μΙ (2,5 jednotek) Taq DNA polymerázy (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN) a byla doplněna vodou do objemu 50 μΙ. PCR reakce byly opět prováděny v termocykleru s využitím řízení teploty výpočtem a za následujících podmínek cyklů: 1 cyklus při 94 °C 1 minutu; 7 cyklů (94 °C 2 sekundy, 70 °C 3 minuty); 31 cyklů (94 °C 2 sekundy, 65 °C 3 minuty); 1 cyklus 65 °C 10 minut. PCR produkty představující 5‘ oblast, která zahrnuje spojení mezi transgenním inzertem pšenice 33391 a přilehlou sousední genomovou sekvencí, byly následně purifikovány pomocí agarózové elektroforézy s následnou izolací DNA z agarózového gelu s využitím kitu QIAquick Gel Extraction Kit (kat. č. 28704, Qiagen lne., Valencia, CA) a poté přímo klonovány do vektoru pGEM-T Easy (kat. č. A1360, Promega, Madison, Wl). Identita klonovaného PCR produktu byla potvrzena DNA sekvenční analýzou (ABI Prism™ 377, PE Biosystems, Foster City, CA a software pro analýzu sekvence DNASTAR, DNASTAR lne., Madison, Wl).
Podobně byla amplifikována ke transgenů pšenice 33391 na 3‘ konci přilehlá sousední genomová sekvence a klonována s využitím „nested“ genově specifických primerů SEQ ID č.3 a SEQ ID č.4, které přisedají k transkripčnímu terminátoru T-nos. Při inzerci transgenů do genomu u pšenice 33391 jsou přítomny dva transkripční terminátory T-nos, jeden uvnitř konstruktu a druhý na 3‘ konci konstruktu v sousedství sekvence genomu pšenice. PCR produkty této reakce byly sekvenovány a srovnáním se známou sekvencí konstruktu pMON30139 byly od sebe odlišeny produkt zahrnující • · spojení mezi transgenním inzertem a přilehlou sousední genomovou sekvencí a produkt interního Tnos.
Pro pšenici 33391 byla zjištěna k inzertu přilehlá sousedící sekvence genomu pšenice na obou stranách inzertu sekvenováním amplifikačních produktů získaných pomocí systému Genome Walker™ a přiřazena ke známé sekvenci transgenu. Na 5' konci místa inzerce transgenu byla určena sekvence segmentu 399 párů baží (bp) v okolí místa inzerce. Tento segment se sestává z 257 bp genomové sekvence pšenice (nukleotidové baze 1-257 za SEQ ID č.5), 93 bp nosné sekvence vektoru (nukleotidové baze 258-350 ze SEQ ID č.5) a 49 bp 5* konce promotoru Act1 z rýže (nukleotidové baze 251-399 ze sekvence SEQ ID č.5). Podobně byla charakterizována sekvence segmentu 431 bp na 3‘ konci místa inzerce transgenu (SEQ ID č.6). Ta začíná 32 bp ze sekvence transkripčního terminátoru T-nos (nukleotidové baze 1-32 ze sekvence SEQ ID č.6), pokračuje 68 bp nosné sekvence vektoru (nukleotidové vaze 33-100) a končí 331 bp sekvence genomu pšenice přiléhající k inzerčnímu místu transgenu (nukleotidové baze 101-431 ze sekvence SEQ ID č.6). Byla provedena identifikace pšenice 33391 s využitím PCR amplifikace oblasti inzerce transgen/genom pomocí jednoho primerů ze sekvence transgenu a druhého primerů z oblasti pšeničné genomové DNA přilehlé ke transgenu. PCR amplifikací DNA, že amplikon 5‘ oblasti inzerce transgenu do genomu je specifický pro pšenici 33391. Tato identifikace byla ukázána pro PCR amplikon s využitím primerů 5 (SEQ ID č.7) a primerů 6 (SEQ ID č.8). Další příměrové sekvence mohou být navrženy na základě DNA sekvence SEQ ID č.5, s jejich použitím vzniknou amplikony s odlišnou délkou DNA než pň použití primerů 5 a primerů 6, ale stále charakteristické pro pšenici 33391 a její potomky. Zde záleží na zkušenostech a umění molekulárních biologů rostlin, jak vybrat DNA sekvence primerů ze SEQ ID č.5 a najít stringentní podmínky pro vznik ampiikonu. Podobně odborníci v oblasti mohou vybrat DNA sekvence primerů ze SEQ ID č.6, které budou generovat amplikony charakteristické pro pšenici 33391. Do oblasti vynálezu spadá, že DNA sekvence primerů odvozené na základě sekvencí SEQ ID č.5 a SEQ ID č.6 mohou být použity pro izolaci do genomu přidané DNA molekuly z rostlin pšenice 33391, jejího osiva a rostlinných částí metodami zde popsanými nebo metodami známými v oblasti molekulární biologie rostlin. Tyto do pšeničného genomu přidané DNA molekuly mohou být izolovány metodou, která využívá jakoukoliv část s dostatečnou délkou DNA sekvence popsané SEQ ID č.5 a SEQ ID č.6 aby byla použitelná jako primer nebo proba. Tyto do pšeničného genomu přidané DNA molekuly mohou být využity jako molekulární markéry charakteristické pro pšenici 33391.
DNA sekvence, které zahrnují oblast spojení genomové DNA pšenice 33391 a inzertu pMON30139 , a jsou obsaženy v SEQ ID č.5 a SEQ ID č.6, mohou být použity jako proby pro hybridizační reakci za účelem identifikace DNA pšenice 33391. Například DNA molekula použitelná jako proba navržená na základě sekvence SEQ ID č.5 může zahrnovat nukleotidovou sekvenci 245270 nebo sekvenci k ní komplementární; DNA molekula použitelná jako proba navržená na základě sekvence SEQ ID č.6 může zahrnovat nukleotidovou sekvenci 87-113 nebo sekvenci kní komplementární. Odborníci v oblasti mohou vybrat kratší nebo delší nukleotidové sekvence než uvedené sekvence tak, že překrývají oblast spojení a jsou využitelné jako specifické DNA proby nebo primery pro pšenici 33391 za vysoce stringentních podmínek.
Jako kontrola pro podmínky PCR reakce (tabulka 2) a kontrola kvality extrahované genomové DNA pšenice 33391 slouží amplikon generovaný pň použití primeru 7 (SEQ ID č.9) a primeru 8 (SEQ ID č.10), který reprezentuje DNA fragment o délce asi 400 bp z pšeničného genu acetyl CoA karboxylázy (Acc), endogenního genu pšeničného genomu v jedné kopii. Kontroly pro tyto analýzy by měly zahrnovat pozitivní kontrolu z pšenice 33391, negativní kontrolu z pšenice, která není pšenice 33391, a negativní kontrolu, která jako templát neobsahuje DNA pšenice, jak je ukázáno v tabulce 2. Pro testování na přítomnost amplikonů charakteristických pro pšenici 33391 může být použit termocykler Stratagene Robocycler, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700 nebo Eppendorf Mastercycler Gradient thermocycler, jak je ukázáno v tabulce 3, nebo metody přístroje známé v dané oblasti.
Tabulka č.2 PCR procedura a PCR reakční směs pro potvrzení přítomnosti 5‘ oblasti spojení transgenů a genomové DNA u pšenice 33391
| Krok | Reagencie | Množství | Poznámka |
| 1 | voda bez nukleázy | doplnit do objemu 20 μΙ | - |
| 2 | 10x konc. reakční pufr (s MgCI2) | 2,0 μΙ | konečná koncentrace pufru je 1x, u MgCI21,5 mM |
| 3 | 10 mM roztok dATP, dCTP, dGTP adTTP | 0,4 μΙ | konečná koncentrace pro každý dNTPje 200 μΜ |
| 4 | primer 5 (SEQ ID č.7) (rekonstituován v 1xTE pufru nebo vodě bez nukleázy na koncentraci 10 μΜ) | 0,4 μΙ | konečná koncentrace je 0,2 μΜ |
| 5 | primer 6 (SEQ ID č.8) (rekonstituován v 1xTE pufru nebo vodě bez nukleázy na koncentraci 10 μΜ) | 0,4 μΙ | konečná koncentrace je 0,2 μΜ |
| 6 | primer 7 (SEQ ID č.9) (rekonstituován v 1xTE pufru nebo vodě bez bez nukleázy na koncentraci 10 μΜ) | 0,2 μΙ | konečná koncentrace je 0,1 μΜ |
| 7 | primer 8 (SEQ ID č.10) (rekonstituován v 1xTE pufru nebo vodě bez nukleázy na koncentraci 10 μΜ) | 0,2 μΙ | konečná koncentrace je 0,1 μΜ |
| 8 | RNáza bez DNázové aktivity (500ng/pl) | 0,1 μΙ | 50 ng na reakci |
| 9 | REDTaq DNA polymeráza (1 jednotka na mikrolitr) | 1,0 μΙ | 1 jednotka na reakci doporučeno změnit pipetu před dalším krokem |
| 10 | Extrahovaná DNA (templát) • analyzované vzorky • jednotlivé listy • směs více listů (max. 50 listů v jedné směsi) • negativní kontrola • negativní kontrola • positivní kontrola | • 10-200 ng genomové DNA • 200 ng genomové DNA • 50 ng pšeničné genomové DNA (ne pšenice 33391) • žádný DNA templát • 50 ng genomové DNA pšenice 33391 |
• · • · »··· »· · · » · ··· ··» «· ·
Tabulka č.3 Navržené parametry PCR reakce pro různé termocyklery
PCR směs je nutno jemné promíchat a pokud je potřeba (ne u termocyklerů se zahřívaným víčkem) přidat 1 až 2 kapky minerálního oleje na hladinu každé reakce. Dále je možno provést PCR s následujícími parametry cyklů u Stratagene Robocycler, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700 nebo Eppendorf Mastercycler Gradient thermocycler.
Poznámka: MJ Engine nebo Eppendorf Mastercycler Gradient thermocycler by měly být spuštěny v módu počítání teploty. U termocyklerů Perkin-Elmer 9700 je nutno nastavit rychlost nástupu teploty na maximum.
| Počet cyklů | Nastavení: Stratagene Robocycler |
| 1 | 94 °C 3 minuty |
| 38 | 94 °C 1 minuta 63 °C 1 minuta 72 °C 90 sekund |
| 1 | 72 °C 10 minut |
| Počet cyklů | Nastavení: MJ Engine nebo Perkin-Elmer 9700 |
| 1 | 94 °C 3 minuty |
| 38 | 94 °C 10 sekund 63 °C 30 sekund 72 °C 1 minuta |
| 1 | 72 eC 10 minut |
| Počet cyklů | Nastavení: Eppendorf Mastercycler Gradient |
| 1 | 94 °C 3 minuty |
| 38 | 94 °C 15 sekund 63 °C 15 sekund 72 °C 1 minuta |
| 1 | 72 °C 10 minut |
Příklad 3
Exprese proteinu EPSPS glyfosátové rezistence (CP4 EPSPS) z genu aroA:CP4 může být detekována imunologickými metodami (Rogen et al., Food Control 10:407-414, 1999, zde začleněno tímto odkazem) v extraktech rostlinných tkání. Jsou vyvíjeny imunologické metodiky jako je western blot, stripové testy a testy ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) ke specifické detekci exprese proteinu z genu aroA:CP4, který je obsažen v expresním vektoru transformovaném do rostlin. Reagencie, které zahrnují polyklonální a monoklonální protilátky specifické pro CP4 EPSPS, jsou komerčně dostupné u firmy Strategie Diagnostics (Nwark, DE). CP4 EPSPS může být detekován v proteinových extraktech rostlin pšenice 33391, rostlinných částí a osiva imunologickými metodami včetně ELISA.
U ELISA testu je 100 ng monoklonální protilátky anti-CP4 EPSPS na jamku mikrotitrační destičky naředěné ve 100 μΙ 50 mM uhličitanového pufru pH 9,6 ponecháno adsorbovat přes noc při teplotě 4 °C. Jamka je promyta pufrem PBS-T (PBS (phosphate buffered šalině) pH 7,4 s 0,05% • · · ·
Tween-20). Tkáň je zhomogenizována v PBS pomocí třecí misky a paličky nebo jiného vhodného zařízení. Homogenát je přidán do jamek mikrotitrační destičky a inkubován po dobu 2 hodin při teplotě 37 “C. Jamka je třikrát promyta PBS-T. Podle jednoho způsobu je sekundární protilátka, purifikovaná králičí anti-CP4 EPSPS, naředěna na dostatečnou koncentraci, aby byla zajištěna dostatečná hladina k zajištění specifické vazby na protein CP4 EPSPS, a inkubována v jamce při teplotě 37 °C po dobu jedné hodiny. Podle druhého způsobu je použita jako sekundární protilátka kozí protilátka anti-CP4 EPSPS. Do jamky je přidána monoklonální protilátka (1: 40000 naředěna v PBS) proti králičím nebo proti kozím imunoglobulinům IgG (Sigma Corp, St Louis MO) a inkubována pn 37 °C 30 minut. Jamka je třikrát promyta PBS-T. Dále je v jamce po dobu 15 min pň teplotě 37 °C inkubována křenová peroxidáza konjugovaná savidinem (NeutrAvidin Horseradish Peroxidase) naředěná 1:10000 stabilizačním roztokem StabilZyme HRP-stabilizer (SurModics, Eden Prairie, MN). Jamka je třikrát promyta PBS-T. Do jamky je nakonec na 10 minut přidán substrát TMB (Kirkegaard and Perry, Gaithersburg, MD), poté je reakce ukončena 3 M fosforečnou kyselinou. Jamky jsou odečítány pomocí čtečky mikrodestiček „mikroplate readeru“ při vlnové délce 450 nm a referenční vlnové délce 650 nm. Tato metoda je příklad ELISA testu vhodného pro detekci CP4 EPSPS a není uvažována jako jediná ELISA metoda, která může být použita pro detekci CP4 EPSPS, odborníci v oblasti ELISA metod mohou navrhnout varianty metody pro specifický detekční test dostatečně citlivý pro detekci CP4 EPSPS v extraktech rostlinných tkání.
Pomocí ELISA metody je u pšenice 33391 vyrostlé na poli detekována průměrná hladina proteinu CP4 EPSPS 58,2 ± 8,4 pg/g v rozmezí 45,5 až 72,4 pg/g, vztaženo na hmotnost čerstvé tkáně (fwt, fresh weight tissue), zatímco u netransgenních rostlin sklizených z pole není detekovatelná hladina proteinu CP4 EPSPS, hladina nepřesahuje detekční limit testu ELISA 0,9pg/g fwt. Tkáň zrní pšenice 33391 obsahuje průměrně 12,6 ± 2,5 pg/g v rozmezí 9,5 až 17,6 pg/g fwt proteinu CP4 EPSPS, u netransgenní kontroly není detekovatelná hladina proteinu CP4 EPSPS, hladina nepřesahuje detekční limit testu ELISA 0,9pg/g fwt. ELISA, nebo další imunologické metody, může být použita jako diagnostický test pro detekci proteinu CP4 EPSP pšenice 33391, protože pšenice 33391 a její potomci je jediná pšenice tolerantní vůči glyfosátu registrovaná agenturou USDA (United States Department of Agriculture), která exprimuje protein CP4 EPSPS.
Pšenice 33391, Monsanto Company, zde popsané a uvedené v přiložených nárocích, byla uložena v Americké sbírce typů kultur (American Type Culture Collection, ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110 dle Budapešťské smlouvy. Registrační ATCC číslo je PTA-2347. Depozit bude uchováván v depozitáři po dobu 30-ti let nebo 5 let po posledním požadavku nebo po dobu účinnosti patentu, kteréhokoliv, který trvá delší dobu, a může být během této doby přemístěn, pokud to bude nezbytné.
Odborníkům v oblasti by mělo být z ilustrací a popsaných principů vynálezu zřejmé, že vynález může být modifikován v uspořádání a detailech bez odchýleni se od principu. Předmětem nároků jsou všechny modifikace, které spadají do oblasti a duchu připojených nároků.
Všechny publikace a publikované patentové dokumenty zde citované, jsou zde začleněny těmito odkazy se stejným obsahem jako kdyby každá individuální publikace nebo přihláška vynálezu byla specificky a individuálně označena, že je uvedena jako odkaz.
Claims (21)
- PATETOVÉ NÁROKY p 1/ —G>vytyty''Způsob zlepšení tolerance vůči glyfosátu u rostliny pšenice, vyznačující se tím, že zahrnuje:(1) vytvoření DNA konstruktu obsahujícího první a druhou expresní kazetu, kde první expresní kazeta obsahuje funkčně spojené (i) promotor rýžového actinu 1; (ii) intron rýžového actinu 1; (iii) DNA molekulu kódující chloroplastový transitní peptid; (iv) DNA molekulu kódující protein EPSPS zajišťující toleranci vůči glyfosátu; a (v) DNA molekulu s funkcí transkripčního terminátoru, a druhá expresní kazeta obsahuje funkčně spojené (a) promotor CaMV 35S; (b) intron Hsp70; (c) DNA molekulu kódující chloroplastový transitní peptid; (d) DNA molekulu kódující protein EPSPS zajišťující toleranci vůči glyfosátu; a (e) DNA molekulu s funkcí transkripčního terminátoru; a (2) transformaci pšeničných buněk DNA konstruktem; a (3) regeneraci pšeničných buněk v rostlinu pšenice; a (4) vystavení těchto rostlin pšenice ošetření účinnou dávkou glyfosátu; a (5) selekci fertilních rostlin pšenice, které vykazují vegetativní a reprodukční toleranci vůči glyfosátu.
- 2. Fertilní rostliny pšenice tolerantní vůči glyfosátu získané způsobem podle nároku 1.
- 3. Potomci osiva rostliny pšenice tolerantní vůči glyfosátu podle nároku 2.
- 4. DNA molekula izolovaná z fertilní rostliny pšenice tolerantní vůči glyfosátu podle nároku 2 obsahující nukleotidovou sekvenci identifikovanou jako SEQ ID č.5.
- 5. DNA molekula izolovaná z fertilní rostliny pšenice tolerantní vůči glyfosátu podle nároku 2 obsahující nukleotidovou sekvenci identifikovanou jako SEQ ID č.6.
- 6. Dvojice DNA molekul obsahující první a druhou DNA molekulu, kde první DNA molekula je dostatečně dlouhý souvislý řetězec nukleotidů pšeničného genomu ze SEQ ID č.5 nebo ze sekvence k ní komplementární tak, aby mohl být použit jako primer, a druhá DNA molekula je dostatečně dlouhý souvislý řetězec nukleotidů inzertu ze SEQ ID č.5 nebo ze sekvence k ní komplementární tak, aby mohl být použit jako primer, a použitím dvojice DNA molekul při amplifikaci DNA vzniká amplikon charakteristický pro DNA extrahovanou z rostliny pšenice 33391 tolerantní vůči glyfosátu nebo jejích potomků.
- 7. Dvojice DNA molekul obsahující první a druhou DNA molekulu, kde první DNA molekula je dostatečně dlouhý souvislý řetězec nukleotidů pšeničného genomu ze SEQ ID č.6 nebo ze sekvence k ní komplementární tak, aby mohl být použit jako primer, a druhá DNA molekula je dostatečně dlouhý souvislý řetězec nukleotidů inzertu ze SEQ ID č.6 nebo ze sekvence k ní komplementární tak, aby mohl být použit jako primer, a použitím dvojice DNA molekul při • · ···· · * ·· · amplifikaci DNA vzniká amplikon charakteristický pro DNA extrahovanou z rostliny pšenice 33391 tolerantní vůči glyfosátu nebo jejích potomků.
- 8. Způsob detekce přítomnosti DNA molekuly charakteristické pro rostlinu pšenice 33391 tolerantní vůči glyfosátu nebo její potomky, vyznačující se tím, že zahrnuje:(a) extrakci vzorku DNA z dané rostliny pšenice 33391 nebo potomků osiva a rostlin nebo z částí rostlin; a (b) poskytnutí DNA molekuly primerů SEQ ID č.7 a SEQ ID č.8; a (c) poskytnutí reakčních podmínek DNA amplifikace; a (d) provedení dané DNA amplifikační reakce za vzniku amplikonové DNA molekuly; a (e) detekce amplikonové DNA molekuly.
- 9. Způsob podle nároku 8, amplikonové DNA molekula obsahuje DNA molekuly SEQ ID č.7 a SEQID č.8.
- 10. Způsob detekce přítomnosti DNA molekuly SEQ ID č.5 ve vzorku DNA, vyznačující se tím, že zahrnuje:(a) extrakci vzorku DNA z rostliny pšenice;(b) kontakt vzorku DNA s molekulou DNA, která zahrnuje oblast spojení genomové DNA pšenice 33391 a DNA inzertu SEQ ID č.5, kde molekula DNA je DNA proba, která hybridizuje za stringentních podmínek s DNA molekulou SEQ ID č.5; a (c) vystavení vzorku a proby stringentním hybridizačním podmínkám; a detekci hybridizace proby s cílovou DNA.
- 11. Způsob detekce přítomnosti DNA molekuly SEQ ID č.6 ve vzorku DNA, vyznačující se tím, že zahrnuje:(a) extrakci vzorku DNA z rostliny pšenice;(b) kontakt vzorku DNA s molekulou DNA, která zahrnuje oblast spojení genomové DNA pšenice 33391 a DNA inzertu SEQ ID č.6, kde molekula DNA je DNA proba, která hybridizuje za stringentních podmínek s DNA molekulou SEQ ID č.6; a (c) vystavení vzorku a proby stringentním hybridizačním podmínkám; a detekci hybridizace proby s cílovou DNA.
- 12. Způsob zmnožení vlastnosti tolerance vůči glyfosátu do rostlin pšenice vyznačující se tím, že zahrnuje:a) křížení potomka pšenice 33391 tolerantní vůči glyfosátu s rostlinou pšenice, která není tolerantní vůči glyfosátu; ab) produkci potomků křížení rostlin pšenice; ac) extrakci vzorku DNA z potomků rostlin pšenice;• · • · • ·d) kontakt DNA vzorku s markerovou molekulou nukleové kyseliny, která hybridizuje s SEQ ID č.5 nebo SEQ ID č.6 nebo s jejich komplementárními sekvencemi; ae) provedení metody zmnožení za pomocí markéru pro vlastnost tolerance vůči glyfosátu, kde tolerance vůči glyfosátu je geneticky vázána ke komplementu markerové molekuly nukleové kyseliny.
- 13. DNA detekční kit vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jednu DNA molekulu dostatečné délky souvislého řetězce nukleotidů homologních nebo komplementárních k SEQ ID č.5 nebo SEQ ID č.6, která má funkci DNA primeru nebo proby specifické pro rostliny pšenice 33391 a její potomky.
- 14. Způsob detekce případu pšenice 33391 a jejích potomků, vyznačující se tím, že zahrnuje:(a) extrakci vzorku proteinů případu pšenice 33391; a (b) otestování extrahovaných proteinů způsobem založeným na imunologickém stanovení pomocí protilátek specifických vůči proteinu CP4 EPSPS; a (c) detekci reakce protilátek s proteinem CP4 EPSPS.
- 15. Osivo pšenice označené 33391 v Americké sbírce typů kultur pod záznamem č. PTA-2347.
- 16. Rostlina pšenice nebo její části vyprodukované pěstováním osiva podle nároku 15.
- 17. Rostlina pšenice podle nároku 16, kde rostlina pšenice je tolerantní vůči glyfosátu.
- 18. Rostlina pšenice nebo její části, kde alespoň jeden předek dané rostliny pšenice je rostlina pšenice nebo její část podle nároku 17.
- 19. Způsob produkce rostlin pšenice tolerantních vůči aplikaci glyfosátu, vyznačující se tím, že zahrnuje:(a) sexuální křížení první rostliny pšenice vyrostlé z pšeničného osiva 33391 ATCC č. PTA-2347, která zajišťuje toleranci vůči aplikaci glyfosátu a druhé rostliny pšenice, která nemá toleranci vůči glyfosátu, za vzniku velkého množství rostlin prvního potomstva; a (b) selekci prvního potomstva rostlin, kteří jsou tolerantní vůči aplikací glyfosátu; a (c) vegetativní rozmnožování rostlin prvního potomstva za vzniku velkého množství druhých potomků rostlin; a (d) selekci rostlin z druhého potomstva tolerantních vůči glyfosátu.
- 20. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že dále obsahuje krok zpětného křížení rostliny prvního potomstva, které jsou tolerantní vůči glyfosátu, nebo rostliny z druhého potomstva s tolerancí vůči glyfosátu s jakoukoliv rostlinou pšenice netolerující aplikaci glyfosátu; a selekci jejich potomků tolerantních vůči glyfosátu.
- 21. Způsob selektivního ovlivňování plevele na polích s plodinou pšenice, vyznačující se tím, že se vysadí osivo pšenice 33391 nebo osivo jejích potomků, přičemž zahrnuje kroky:(a) vyseti osiva pšenice 33391 nebo jejích potomků, které jsou tolerantní vůči glyfosátu; a (b) aplikaci dostatečného množství glyfosátového herbicidu na pole pšenice s plevelem tak, aby bylo ovlivněno množství plevele bez významného ovlivnění plodiny pšenice.Notl 8886
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US23665300P | 2000-09-29 | 2000-09-29 | |
| US23676200P | 2000-09-29 | 2000-09-29 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2003629A3 true CZ2003629A3 (cs) | 2003-08-13 |
| CZ300073B6 CZ300073B6 (cs) | 2009-01-21 |
Family
ID=26929984
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20030629A CZ300073B6 (cs) | 2000-09-29 | 2001-09-25 | Zpusob vylepšení tolerance vuci glyfosátu u rostliny pšenice, její bunka, její DNA, dvojice molekulDNA primeru, zpusoby její detekce, zpusob šírení vlastnosti tolerance vuci glyfosátu u rostlin, DNAdetekcní kit |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US6689880B2 (cs) |
| EP (1) | EP1322773A2 (cs) |
| AR (2) | AR030812A1 (cs) |
| AU (2) | AU2001293044B2 (cs) |
| CA (1) | CA2420406C (cs) |
| CZ (1) | CZ300073B6 (cs) |
| PL (1) | PL214848B1 (cs) |
| WO (1) | WO2002027004A2 (cs) |
Families Citing this family (179)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BRPI0100752B1 (pt) | 2000-06-22 | 2015-10-13 | Monsanto Co | moléculas e pares de moléculas de dna, processos para detectar molécula de dna e para criar um traço tolerante a glifosato em plantas de milho, bem como kit de detecção de dna |
| CA2851035C (en) | 2002-07-18 | 2018-05-29 | Stanislaw Flasinski | Methods for using artificial polynucleotides and compositions thereof to reduce transgene silencing |
| ATE553202T1 (de) | 2003-01-31 | 2012-04-15 | Monsanto Technology Llc | Glyphosat-tolerante luzernepflanzen und verfahren zu deren detektion |
| WO2004090167A1 (en) * | 2003-04-14 | 2004-10-21 | Temasek Life Sciences Laboratory Limited | Detection of a target nucleic acid, by polymerase reaction and enzymatic detection of released pyrophosphate |
| MXPA06002253A (es) * | 2003-10-28 | 2006-08-31 | Univ Washington | Supresion de patogenos foliares y transmitidos por el suelo. |
| RS54170B1 (en) | 2003-12-15 | 2015-12-31 | Monsanto Technology, Llc | MON88017 MAIZE PLANT AND COMPOSITIONS AND DETECTION PROCEDURES |
| WO2005069986A2 (en) | 2004-01-20 | 2005-08-04 | Monsanto Technology Llc | Chimeric promoters for use in plants |
| US20070197474A1 (en) * | 2004-03-30 | 2007-08-23 | Clinton William P | Methods for controlling plants pathogens using N-phosphonomethylglycine |
| AR048411A1 (es) | 2004-03-30 | 2006-04-26 | Monsanto Technology Llc | Metodos para controlar patogenos de plantas que utilizan n-fosfonometilglicina |
| FR2878532B1 (fr) * | 2004-11-26 | 2007-03-02 | Genoplante Valor Soc Par Actio | Methode d'adressage d'acides nucleiques vers des plastes |
| AP2693A (en) * | 2005-05-27 | 2013-07-16 | Monsanto Technology Llc | Soybean event MON89788 and methods for detection thereof |
| EP2021359A4 (en) * | 2006-05-12 | 2009-11-25 | Commw Scient Ind Res Org | ENZYMES FOR REMOVING HERBICIDES |
| US20080064032A1 (en) * | 2006-09-13 | 2008-03-13 | Syngenta Participations Ag | Polynucleotides and uses thereof |
| AU2009214710B2 (en) | 2008-02-15 | 2014-03-06 | Monsanto Technology Llc | Soybean plant and seed corresponding to transgenic event MON87769 and methods for detection thereof |
| WO2010024976A1 (en) | 2008-08-29 | 2010-03-04 | Monsanto Technology Llc | Soybean plant and seed corresponding to transgenic event mon87754 and methods for detection thereof |
| WO2010037016A1 (en) | 2008-09-29 | 2010-04-01 | Monsanto Technology Llc | Soybean transgenic event mon87705 and methods for detection thereof |
| WO2010117735A1 (en) * | 2009-03-30 | 2010-10-14 | Monsanto Technology Llc | Transgenic rice event17314 and methods of use thereof |
| WO2010135324A1 (en) | 2009-05-18 | 2010-11-25 | Monsanto Technology Llc | Use of glyphosate for disease suppression and yield enhancement in soybean |
| UA118535C2 (uk) | 2010-06-04 | 2019-02-11 | Монсанто Текнолоджи Ллс | Рекомбінантна молекула днк, що надає рослині brassica стійкості до гліфосату |
| US9493786B2 (en) | 2010-10-12 | 2016-11-15 | Monsanto Technology Llc | Soybean plant and seed corresponding to transgenic event MON87712 comprising a B-box zinc finger protein 32, and methods for detection thereof |
| CA2792804A1 (en) | 2011-10-18 | 2013-04-18 | Dow Agrosciences Llc | Materials and methods for detecting the aryloxyalkanoate dioxygenase gene (aad-12) containing event pdab4472-1606 in plants |
| EP2806739A1 (en) | 2012-01-25 | 2014-12-03 | Bayer Intellectual Property GmbH | Active compound combinations containing fluopyram and biological control agent |
| EP2676536A1 (en) | 2012-06-22 | 2013-12-25 | AIT Austrian Institute of Technology GmbH | Method for producing plant seed containing endophytic micro-organisms |
| CA2884895C (en) | 2012-09-14 | 2024-05-14 | Bayer Cropscience Lp | Hppd variants and methods of use |
| AR093909A1 (es) | 2012-12-12 | 2015-06-24 | Bayer Cropscience Ag | Uso de ingredientes activos para controlar nematodos en cultivos resistentes a nematodos |
| MX368358B (es) | 2013-02-05 | 2019-09-30 | Univ Saskatchewan | Simbiontes microbianos endofiticos en cuidados previos a la germinacion de plantas. |
| UA122046C2 (uk) | 2013-03-07 | 2020-09-10 | Атенікс Корп. | Рекомбінантний поліпептид із інсектицидною активністю |
| MX358633B (es) | 2013-04-19 | 2018-08-28 | Bayer Cropscience Ag | Metodo de uso mejorado del potencial de produccion de plantas transgenicas. |
| TW201507722A (zh) | 2013-04-30 | 2015-03-01 | Bayer Cropscience Ag | 做為殺線蟲劑及殺體內寄生蟲劑的ｎ－（２－鹵素－２－苯乙基）－羧醯胺類 |
| WO2014177514A1 (en) | 2013-04-30 | 2014-11-06 | Bayer Cropscience Ag | Nematicidal n-substituted phenethylcarboxamides |
| US10136646B2 (en) | 2013-06-26 | 2018-11-27 | Indigo Ag, Inc. | Agricultural endophyte-plant compositions, and methods of use |
| MX366758B (es) | 2013-06-26 | 2019-07-23 | Symbiota Inc | Poblaciones endofitas derivadas de semillas, composiciones y métodos de uso. |
| CA3209979A1 (en) | 2013-09-04 | 2015-03-12 | Indigo Ag, Inc. | Agricultural endophyte-plant compositions, and methods of use |
| WO2015053998A1 (en) | 2013-10-09 | 2015-04-16 | Monsanto Technology Llc | Transgenic corn event mon87403 and methods for detection thereof |
| US10813359B2 (en) | 2013-11-06 | 2020-10-27 | The Texas A & M University System | Fungal endophytes for improved crop yields and protection from pests |
| WO2015100432A2 (en) | 2013-12-24 | 2015-07-02 | Symbiota, Inc. | Method for propagating microorganisms within plant bioreactors and stably storing microorganisms within agricultural seeds |
| US9364005B2 (en) | 2014-06-26 | 2016-06-14 | Ait Austrian Institute Of Technology Gmbh | Plant-endophyte combinations and uses therefor |
| CA3101008A1 (en) | 2013-12-24 | 2015-07-02 | Indigo Ag, Inc. | Plants containing beneficial endophytes |
| WO2015138394A2 (en) | 2014-03-11 | 2015-09-17 | Bayer Cropscience Lp | Hppd variants and methods of use |
| MX367032B (es) | 2014-06-20 | 2019-08-02 | The Flinders Univ Of South Australia | Inoculantes y metodos para su uso. |
| US10212911B2 (en) | 2014-06-26 | 2019-02-26 | Indigo Agriculture, Inc. | Endophytes, associated compositions, and methods of use thereof |
| US10760089B2 (en) | 2014-11-14 | 2020-09-01 | Basf Plant Science Company Gmbh | Materials and methods for increasing the tocopherol content in seed oil |
| CA2972904C (en) | 2014-12-30 | 2023-11-14 | Indigo Agriculture, Inc. | Seed endophytes across cultivars and species, associated compositions, and methods of use thereof |
| AR104495A1 (es) | 2015-05-01 | 2017-07-26 | Indigo Agriculture Inc | Composiciones complejas de endófitas aisladas y métodos para caracteres mejorados en plantas |
| BR112017023551A2 (pt) | 2015-05-01 | 2018-07-24 | Indigo Agriculture Inc | composições de endófitos complexos projetados e métodos para melhorar características da planta. |
| EP3097782A1 (en) | 2015-05-29 | 2016-11-30 | Bayer CropScience Aktiengesellschaft | Methods for controlling phytopathogenic nematodes by combination of fluopyram and biological control agents |
| US10750711B2 (en) | 2015-06-08 | 2020-08-25 | Indigo Ag, Inc. | Streptomyces endophyte compositions and methods for improved agronomic traits in plants |
| KR20180043838A (ko) | 2015-09-11 | 2018-04-30 | 바이엘 크롭사이언스 악티엔게젤샤프트 | Ｈｐｐｄ 변이체 및 사용 방법 |
| CN105219767B (zh) | 2015-10-09 | 2018-02-13 | 上海交通大学 | 大豆转化事件shzd32‑01及其应用方法 |
| US11751515B2 (en) | 2015-12-21 | 2023-09-12 | Indigo Ag, Inc. | Endophyte compositions and methods for improvement of plant traits in plants of agronomic importance |
| WO2017198451A1 (en) * | 2016-05-17 | 2017-11-23 | Bayer Cropscience Nv | Method for increasing yield in small grain cereals such as wheat and rice |
| BR112019010476A2 (pt) | 2016-11-23 | 2019-09-10 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | molécula de ácido nucleico recombinante, vetor, célula hospedeira, planta transgênica, semente transgênica, polipeptídeo recombinante, composição, método para controlar uma população de pragas, para matar pragas, para produzir um polipeptídeo, planta ou célula vegetal, método para proteger uma planta contra uma praga, para aumentar o rendimento em uma planta, uso e produto primário |
| WO2018102733A1 (en) | 2016-12-01 | 2018-06-07 | Indigo Ag, Inc. | Modulated nutritional quality traits in seeds |
| WO2018119419A1 (en) | 2016-12-23 | 2018-06-28 | The Texas A&M University System | Fungal endophytes for improved crop yields and protection from pests |
| US11279946B2 (en) | 2017-01-18 | 2022-03-22 | Basf Argicultural Solutions Seed Us Llc | BP005 toxin gene and methods for its use |
| US11286498B2 (en) | 2017-01-18 | 2022-03-29 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Use of BP005 for the control of plant pathogens |
| WO2018160245A1 (en) | 2017-03-01 | 2018-09-07 | Indigo Ag, Inc. | Endophyte compositions and methods for improvement of plant traits |
| BR112019018232A2 (pt) | 2017-03-01 | 2020-07-28 | Indigo Ag, Inc. | composições endofíticas e métodos para aprimoramento dos traços vegetais |
| CA3055317A1 (en) | 2017-03-07 | 2018-09-13 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Hppd variants and methods of use |
| AU2018259162A1 (en) | 2017-04-27 | 2019-11-21 | The Flinders University Of South Australia | Bacterial inoculants |
| US11263707B2 (en) | 2017-08-08 | 2022-03-01 | Indigo Ag, Inc. | Machine learning in agricultural planting, growing, and harvesting contexts |
| WO2019055968A2 (en) | 2017-09-18 | 2019-03-21 | Indigo Ag, Inc. | MARKERS OF VEGETABLE HEALTH |
| WO2019057958A1 (en) | 2017-09-22 | 2019-03-28 | Technische Universität Graz | POLYMER PARTICLES CONTAINING MICROORGANISMS |
| WO2019083810A1 (en) | 2017-10-24 | 2019-05-02 | Basf Se | IMPROVING HERBICIDE TOLERANCE FOR 4-HYDROXYPHENYLPYRUVATE DIOXYGENASE (HPPD) INHIBITORS BY NEGATIVE REGULATION OF HPPD EXPRESSION IN SOYBEANS |
| WO2019083808A1 (en) | 2017-10-24 | 2019-05-02 | Basf Se | IMPROVING HERBICIDE TOLERANCE AGAINST HPPD INHIBITORS BY REGULATION OF PUTATIVE REDUCED 4-HYDROXYPHENYLPYRUVATE REDUCES IN SOYBEANS |
| WO2019226938A1 (en) | 2018-05-23 | 2019-11-28 | The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture | Fruit-specific promoters |
| JP2022541612A (ja) | 2019-07-22 | 2022-09-26 | バイエル、アクチエンゲゼルシャフト | 殺虫剤としての５－アミノ置換ピラゾールおよびトリアゾール |
| JP7689109B2 (ja) | 2019-07-23 | 2025-06-05 | バイエル・アクチエンゲゼルシヤフト | 農薬としての新規ヘテロアリール－トリアゾール化合物 |
| BR112022000942A2 (pt) | 2019-07-23 | 2022-05-17 | Bayer Ag | Compostos de heteroaril-triazol como pesticidas |
| EP3701796A1 (en) | 2019-08-08 | 2020-09-02 | Bayer AG | Active compound combinations |
| EP4034656A1 (en) | 2019-09-26 | 2022-08-03 | Bayer Aktiengesellschaft | Rnai-mediated pest control |
| EP4037485A1 (en) | 2019-10-02 | 2022-08-10 | Bayer Aktiengesellschaft | Active compound combinations comprising fatty acids |
| WO2021069569A1 (en) | 2019-10-09 | 2021-04-15 | Bayer Aktiengesellschaft | Novel heteroaryl-triazole compounds as pesticides |
| TW202128664A (zh) | 2019-10-09 | 2021-08-01 | 德商拜耳廠股份有限公司 | 作為除害劑之新穎雜芳基三唑化合物 |
| EP4045519A4 (en) | 2019-10-14 | 2024-02-28 | Basf Agricultural Solutions Seed Us Llc | NOVEL INSECT RESISTANT GENES AND METHODS OF USE |
| AU2020367523A1 (en) | 2019-10-14 | 2022-04-28 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Novel insect resistant genes and methods of use |
| US20220380318A1 (en) | 2019-11-07 | 2022-12-01 | Bayer Aktiengesellschaft | Substituted sulfonyl amides for controlling animal pests |
| WO2021097162A1 (en) | 2019-11-13 | 2021-05-20 | Bayer Cropscience Lp | Beneficial combinations with paenibacillus |
| US20220408727A1 (en) | 2019-11-18 | 2022-12-29 | Bayer Aktiengesellschaft | Active compound combinations comprising fatty acids |
| TW202134226A (zh) | 2019-11-18 | 2021-09-16 | 德商拜耳廠股份有限公司 | 作為殺蟲劑之新穎雜芳基-三唑化合物 |
| TW202136248A (zh) | 2019-11-25 | 2021-10-01 | 德商拜耳廠股份有限公司 | 作為殺蟲劑之新穎雜芳基-三唑化合物 |
| MX2022009333A (es) | 2020-01-31 | 2022-10-07 | Pairwise Plants Services Inc | Supresion de la respuesta de evasion de la sombra en las plantas. |
| EP4107151A1 (en) | 2020-02-18 | 2022-12-28 | Bayer Aktiengesellschaft | Heteroaryl-triazole compounds as pesticides |
| EP3708565A1 (en) | 2020-03-04 | 2020-09-16 | Bayer AG | Pyrimidinyloxyphenylamidines and the use thereof as fungicides |
| WO2021209490A1 (en) | 2020-04-16 | 2021-10-21 | Bayer Aktiengesellschaft | Cyclaminephenylaminoquinolines as fungicides |
| MX2022012878A (es) | 2020-04-16 | 2022-12-08 | Pairwise Plants Services Inc | Metodos para controlar el tama?o del meristema para la mejora de cultivos. |
| WO2021213978A1 (de) | 2020-04-21 | 2021-10-28 | Bayer Aktiengesellschaft | 2-(het)aryl-substituierte kondensierte heterocyclen-derivate als schädlingsbekämpfungsmittel |
| US20230348392A1 (en) | 2020-05-06 | 2023-11-02 | Bayer Aktiengesellschaft | Pyridine (thio)amides as fungicidal compounds |
| TW202208347A (zh) | 2020-05-06 | 2022-03-01 | 德商拜耳廠股份有限公司 | 作為殺蟲劑之新穎雜芳基三唑化合物 |
| JP2023525349A (ja) | 2020-05-12 | 2023-06-15 | バイエル、アクチエンゲゼルシャフト | 殺真菌性化合物としてのトリアジンおよびピリミジン（チオ）アミド化合物 |
| WO2021233861A1 (en) | 2020-05-19 | 2021-11-25 | Bayer Aktiengesellschaft | Azabicyclic(thio)amides as fungicidal compounds |
| WO2021247477A1 (en) | 2020-06-02 | 2021-12-09 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods for controlling meristem size for crop improvement |
| WO2021245087A1 (en) | 2020-06-04 | 2021-12-09 | Bayer Aktiengesellschaft | Heterocyclyl pyrimidines and triazines as novel fungicides |
| KR20230024343A (ko) | 2020-06-10 | 2023-02-20 | 바이엘 악티엔게젤샤프트 | 살진균제로서의 아자비시클릴-치환된 헤테로사이클 |
| CA3186972A1 (en) | 2020-06-17 | 2021-12-23 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods for controlling meristem size for crop improvement |
| WO2021255071A1 (en) | 2020-06-18 | 2021-12-23 | Bayer Aktiengesellschaft | 3-(pyridazin-4-yl)-5,6-dihydro-4h-1,2,4-oxadiazine derivatives as fungicides for crop protection |
| EP4167738A1 (en) | 2020-06-18 | 2023-04-26 | Bayer Aktiengesellschaft | Composition for use in agriculture |
| UY39276A (es) | 2020-06-19 | 2022-01-31 | Bayer Ag | Uso de compuestos de 1,3,4–oxadiazol–2–ilpirimidina para controlar microorganismos fitopatógenos, métodos de uso y composiciones. |
| BR112022025710A2 (pt) | 2020-06-19 | 2023-03-07 | Bayer Ag | 1,3,4-oxadiazol pirimidinas e 1,3,4-oxadiazol piridinas como fungicidas |
| WO2021255091A1 (en) | 2020-06-19 | 2021-12-23 | Bayer Aktiengesellschaft | 1,3,4-oxadiazoles and their derivatives as fungicides |
| UY39275A (es) | 2020-06-19 | 2022-01-31 | Bayer Ag | 1,3,4-oxadiazol pirimidinas como fungicidas, procesos e intermediarios para su preparación, métodos de uso y usos de los mismos |
| EP3929189A1 (en) | 2020-06-25 | 2021-12-29 | Bayer Animal Health GmbH | Novel heteroaryl-substituted pyrazine derivatives as pesticides |
| JP2023532548A (ja) | 2020-07-02 | 2023-07-28 | バイエル・アクチエンゲゼルシヤフト | 有害生物防除剤としてのヘテロサイクレン誘導体 |
| WO2022033991A1 (de) | 2020-08-13 | 2022-02-17 | Bayer Aktiengesellschaft | 5-amino substituierte triazole als schädlingsbekämpfungsmittel |
| WO2022053453A1 (de) | 2020-09-09 | 2022-03-17 | Bayer Aktiengesellschaft | Azolcarboxamide als schädlingsbekämpfungsmittel |
| WO2022058327A1 (en) | 2020-09-15 | 2022-03-24 | Bayer Aktiengesellschaft | Substituted ureas and derivatives as new antifungal agents |
| EP3974414A1 (de) | 2020-09-25 | 2022-03-30 | Bayer AG | 5-amino substituierte pyrazole und triazole als schädlingsbekämpfungsmittel |
| CN112266419B (zh) * | 2020-10-29 | 2023-02-03 | 中国科学院微生物研究所 | 一种人工合成的抗除草剂蛋白 |
| EP3915971A1 (en) | 2020-12-16 | 2021-12-01 | Bayer Aktiengesellschaft | Phenyl-s(o)n-phenylamidines and the use thereof as fungicides |
| WO2022129190A1 (en) | 2020-12-18 | 2022-06-23 | Bayer Aktiengesellschaft | (hetero)aryl substituted 1,2,4-oxadiazoles as fungicides |
| WO2022129196A1 (en) | 2020-12-18 | 2022-06-23 | Bayer Aktiengesellschaft | Heterobicycle substituted 1,2,4-oxadiazoles as fungicides |
| CN116669554A (zh) | 2020-12-18 | 2023-08-29 | 拜耳公司 | 使用Dhodh抑制剂来防治作物中的抗性植物病原性真菌 |
| WO2022129188A1 (en) | 2020-12-18 | 2022-06-23 | Bayer Aktiengesellschaft | 1,2,4-oxadiazol-3-yl pyrimidines as fungicides |
| EP4036083A1 (de) | 2021-02-02 | 2022-08-03 | Bayer Aktiengesellschaft | 5-oxy substituierte hetereozyklen, als schädlingsbekämpfungsmittel |
| BR112023015909A2 (pt) | 2021-02-11 | 2023-11-21 | Monsanto Technology Llc | Métodos e composições para modificar níveis de citocinina oxidase em plantas |
| EP4298118A1 (en) | 2021-02-25 | 2024-01-03 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for modifying root architecture in plants |
| WO2022207496A1 (en) | 2021-03-30 | 2022-10-06 | Bayer Aktiengesellschaft | 3-(hetero)aryl-5-chlorodifluoromethyl-1,2,4-oxadiazole as fungicide |
| BR112023019400A2 (pt) | 2021-03-30 | 2023-12-05 | Bayer Ag | 3-(hetero)aril-5-clorodifluorometil-1,2,4-oxadiazol como fungicida |
| BR112023022763A2 (pt) | 2021-05-06 | 2024-01-02 | Bayer Ag | Imidazóis anulados substituídos por alquilamida e uso dos mesmos como inseticidas |
| US20240294533A1 (en) | 2021-05-12 | 2024-09-05 | Bayer Aktiengesellschaft | 2-(het)aryl-substituted condensed heterocycle derivatives as pest control agents |
| WO2022266271A1 (en) | 2021-06-17 | 2022-12-22 | Pairwise Plants Services, Inc. | Modification of growth regulating factor family transcription factors in soybean |
| UY39827A (es) | 2021-06-24 | 2023-01-31 | Pairwise Plants Services Inc | Modificación de genes de ubiquitina ligasa e3 hect para mejorar los rasgos de rendimiento |
| US20230027468A1 (en) | 2021-07-01 | 2023-01-26 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for enhancing root system development |
| WO2023019188A1 (en) | 2021-08-12 | 2023-02-16 | Pairwise Plants Services, Inc. | Modification of brassinosteroid receptor genes to improve yield traits |
| CA3228942A1 (en) | 2021-08-13 | 2023-02-16 | Bayer Aktiengesellschaft | Active compound combinations and fungicide compositions comprising those |
| UY39902A (es) | 2021-08-17 | 2023-03-31 | Pairwise Plants Services Inc | Métodos y composiciones para modificar genes de histidina quinasa receptores de citoquinina en plant |
| KR20240051198A (ko) | 2021-08-25 | 2024-04-19 | 바이엘 악티엔게젤샤프트 | 농약제로서 신규 피라지닐-트리아졸 화합물 |
| WO2023034731A1 (en) | 2021-08-30 | 2023-03-09 | Pairwise Plants Services, Inc. | Modification of ubiquitin binding peptidase genes in plants for yield trait improvement |
| EP4144739A1 (de) | 2021-09-02 | 2023-03-08 | Bayer Aktiengesellschaft | Anellierte pyrazole als schädlingsbekämpfungsmittel |
| AR126938A1 (es) | 2021-09-02 | 2023-11-29 | Pairwise Plants Services Inc | Métodos y composiciones para mejorar la arquitectura de las plantas y los rasgos de rendimiento |
| US20230087522A1 (en) | 2021-09-21 | 2023-03-23 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for reducing pod shatter in canola |
| UY39966A (es) | 2021-10-04 | 2023-04-28 | Pairwise Plants Services Inc | Métodos para mejorar la fertilidad de la flor y el rendimiento de semillas |
| WO2023060152A2 (en) | 2021-10-07 | 2023-04-13 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods for improving floret fertility and seed yield |
| CN118541353A (zh) | 2021-11-03 | 2024-08-23 | 拜耳公司 | 作为杀真菌化合物的双(杂)芳基硫醚(硫代)酰胺 |
| WO2023099445A1 (en) | 2021-11-30 | 2023-06-08 | Bayer Aktiengesellschaft | Bis(hetero)aryl thioether oxadiazines as fungicidal compounds |
| AR127904A1 (es) | 2021-12-09 | 2024-03-06 | Pairwise Plants Services Inc | Métodos para mejorar la fertilidad de floretes y el rendimiento de semillas |
| AR128372A1 (es) | 2022-01-31 | 2024-04-24 | Pairwise Plants Services Inc | Supresión de la respuesta de evitación de la sombra en las plantas |
| CN119012913A (zh) | 2022-02-01 | 2024-11-22 | 环球化学股份有限公司 | 控制害虫的方法和组合物 |
| EP4472414A1 (en) | 2022-02-01 | 2024-12-11 | Globachem NV | Methods and compositions for controlling pests in cereals |
| MX2024010647A (es) | 2022-03-02 | 2024-09-06 | Pairwise Plants Services Inc | Modificacion de genes del receptor de brasinoesteroides para mejorar rasgos de rendimiento. |
| WO2023192838A1 (en) | 2022-03-31 | 2023-10-05 | Pairwise Plants Services, Inc. | Early flowering rosaceae plants with improved characteristics |
| WO2023196886A1 (en) | 2022-04-07 | 2023-10-12 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for improving resistance to fusarium head blight |
| US20230383305A1 (en) | 2022-04-21 | 2023-11-30 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for improving yield traits |
| WO2023215704A1 (en) | 2022-05-02 | 2023-11-09 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for enhancing yield and disease resistance |
| EP4519256A1 (en) | 2022-05-03 | 2025-03-12 | Bayer Aktiengesellschaft | Crystalline forms of (5s)-3-[3-(3-chloro-2-fluorophenoxy)-6-methylpyridazin-4-yl]-5-(2-chloro-4-methylbenzyl)-5,6-dihydro-4h-1,2,4-oxadiazine |
| JP2025516324A (ja) | 2022-05-03 | 2025-05-27 | バイエル、アクチエンゲゼルシャフト | 望ましくない微生物を防除するための（５ｓ）－３－［３－（３－クロロ－２－フルオロフェノキシ）－６－メチルピリダジン－４－イル］－５－（２－クロロ－４－メチルベンジル）－５，６－ジヒドロ－４ｈ－１，２，４－オキサジアジンの使用 |
| CN119325481A (zh) | 2022-05-05 | 2025-01-17 | 成对植物服务股份有限公司 | 用于改变根构型和/或改善植物产量性状的方法和组合物 |
| AR129709A1 (es) | 2022-06-27 | 2024-09-18 | Pairwise Plants Services Inc | Métodos y composiciones para modificar el escape a la sombra en plantas |
| EP4547692A1 (en) | 2022-06-29 | 2025-05-07 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for controlling meristem size for crop improvement |
| AR129748A1 (es) | 2022-06-29 | 2024-09-25 | Pairwise Plants Services Inc | Métodos y composiciones para controlar el tamaño del meristemo para el mejoramiento de cultivos |
| WO2024030984A1 (en) | 2022-08-04 | 2024-02-08 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for improving yield traits |
| US20240060081A1 (en) | 2022-08-11 | 2024-02-22 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for controlling meristem size for crop improvement |
| WO2024054880A1 (en) | 2022-09-08 | 2024-03-14 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for improving yield characteristics in plants |
| WO2024068519A1 (en) | 2022-09-28 | 2024-04-04 | Bayer Aktiengesellschaft | 3-(hetero)aryl-5-chlorodifluoromethyl-1,2,4-oxadiazole as fungicide |
| EP4295688A1 (en) | 2022-09-28 | 2023-12-27 | Bayer Aktiengesellschaft | Active compound combination |
| WO2024068517A1 (en) | 2022-09-28 | 2024-04-04 | Bayer Aktiengesellschaft | 3-(hetero)aryl-5-chlorodifluoromethyl-1,2,4-oxadiazole as fungicide |
| WO2024068520A1 (en) | 2022-09-28 | 2024-04-04 | Bayer Aktiengesellschaft | 3-(hetero)aryl-5-chlorodifluoromethyl-1,2,4-oxadiazole as fungicide |
| WO2024068518A1 (en) | 2022-09-28 | 2024-04-04 | Bayer Aktiengesellschaft | 3-heteroaryl-5-chlorodifluoromethyl-1,2,4-oxadiazole as fungicide |
| EP4385326A1 (en) | 2022-12-15 | 2024-06-19 | Kimitec Biogorup | Biopesticide composition and method for controlling and treating broad spectrum of pests and diseases in plants |
| AR131409A1 (es) | 2022-12-19 | 2025-03-19 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Genes de toxina de insecto y métodos de uso de estos |
| WO2024173622A1 (en) | 2023-02-16 | 2024-08-22 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for modifying shade avoidance in plants |
| AR132019A1 (es) | 2023-03-02 | 2025-05-21 | Pairwise Plants Services Inc | Métodos y composiciones para modificar la evitación de la sombra en plantas |
| AR132071A1 (es) | 2023-03-09 | 2025-05-21 | Pairwise Plants Services Inc | Modificación de genes de la vía de señalización de brasinoesteroide para mejorar rasgos de rendimiento en plantas |
| WO2024238902A1 (en) | 2023-05-18 | 2024-11-21 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for improving yield characteristics in plants |
| WO2025008447A1 (en) | 2023-07-05 | 2025-01-09 | Bayer Aktiengesellschaft | Composition for use in agriculture |
| WO2025008446A1 (en) | 2023-07-05 | 2025-01-09 | Bayer Aktiengesellschaft | Composition for use in agriculture |
| US20250027101A1 (en) | 2023-07-18 | 2025-01-23 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for modifying root architecture in plants |
| WO2025024617A1 (en) | 2023-07-27 | 2025-01-30 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for modifying plant yield traits |
| WO2025026738A1 (en) | 2023-07-31 | 2025-02-06 | Bayer Aktiengesellschaft | 6-[5-(ethylsulfonyl)-1-methyl-1h-imidazol-4-yl]-7-methyl-3-(pentafluoroethyl)-7h-imidazo[4,5-c]pyridazine derivatives as pesticides |
| EP4501112A1 (en) | 2023-08-01 | 2025-02-05 | Globachem NV | Plant defense elicitors |
| WO2025026815A1 (en) | 2023-08-01 | 2025-02-06 | Globachem Nv | Insecticidal mixtures |
| WO2025032038A1 (en) | 2023-08-09 | 2025-02-13 | Bayer Aktiengesellschaft | Pyridazin-4-yloxadiazines as novel fungicides |
| WO2025031668A1 (en) | 2023-08-09 | 2025-02-13 | Bayer Aktiengesellschaft | Azaheterobiaryl-substituted 4,5-dihydro-1h-2,4,5-oxadiazines as novel fungicides |
| WO2025064734A1 (en) | 2023-09-21 | 2025-03-27 | Pairwise Plants Services, Inc. | Early flowering black raspberry plants with improved characteristics |
| WO2025080600A1 (en) | 2023-10-11 | 2025-04-17 | Pairwise Plants Services, Inc. | Methods and compositions for improving crop yield traits |
| WO2025078128A1 (en) | 2023-10-11 | 2025-04-17 | Bayer Aktiengesellschaft | Pyridazin-3-one-4-yloxadiazines as novel fungicides |
| WO2025098876A1 (en) | 2023-11-10 | 2025-05-15 | Bayer Aktiengesellschaft | Active compound combinations having insecticidal/acaricidal properties |
| WO2025098874A1 (en) | 2023-11-10 | 2025-05-15 | Bayer Aktiengesellschaft | Active compound combinations having fungicidal/insecticidal/acaricidal properties |
| WO2025098875A1 (en) | 2023-11-10 | 2025-05-15 | Bayer Aktiengesellschaft | Active compound combinations having insecticidal/acaricidal properties |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6777589B1 (en) * | 1990-01-22 | 2004-08-17 | Dekalb Genetics Corporation | Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof |
| US5633435A (en) * | 1990-08-31 | 1997-05-27 | Monsanto Company | Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases |
| US5948956A (en) | 1997-10-16 | 1999-09-07 | Oms Investments, Inc. | Transgenic plants and method for node segment transformation |
| WO1999046396A2 (en) * | 1998-03-09 | 1999-09-16 | Monsanto Company | Glyphosate as a gametocide |
| WO2001019976A2 (en) * | 1999-09-16 | 2001-03-22 | Monsanto Technology Llc | Plant regulatory sequences for control of gene expression |
| BRPI0100752B1 (pt) * | 2000-06-22 | 2015-10-13 | Monsanto Co | moléculas e pares de moléculas de dna, processos para detectar molécula de dna e para criar um traço tolerante a glifosato em plantas de milho, bem como kit de detecção de dna |
-
2001
- 2001-09-25 EP EP01973471A patent/EP1322773A2/en not_active Withdrawn
- 2001-09-25 CZ CZ20030629A patent/CZ300073B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2001-09-25 AU AU2001293044A patent/AU2001293044B2/en not_active Expired
- 2001-09-25 AU AU9304401A patent/AU9304401A/xx active Pending
- 2001-09-25 WO PCT/US2001/029902 patent/WO2002027004A2/en active Search and Examination
- 2001-09-25 US US09/682,597 patent/US6689880B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-09-25 CA CA2420406A patent/CA2420406C/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-09-25 PL PL365885A patent/PL214848B1/pl unknown
- 2001-09-28 AR ARP010104580A patent/AR030812A1/es active IP Right Grant
-
2003
- 2003-12-04 US US10/727,423 patent/US7268274B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-12-16 US US10/737,487 patent/US7071325B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2008
- 2008-11-12 AR ARP080104938A patent/AR069294A2/es active IP Right Grant
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2420406C (en) | 2014-12-09 |
| AU9304401A (en) | 2002-04-08 |
| AU2001293044B2 (en) | 2006-07-13 |
| PL365885A1 (en) | 2005-01-10 |
| US20040133940A1 (en) | 2004-07-08 |
| CZ300073B6 (cs) | 2009-01-21 |
| AR030812A1 (es) | 2003-09-03 |
| AR069294A2 (es) | 2010-01-13 |
| CA2420406A1 (en) | 2002-04-04 |
| US20020062503A1 (en) | 2002-05-23 |
| PL214848B1 (pl) | 2013-09-30 |
| WO2002027004A3 (en) | 2002-12-05 |
| WO2002027004A2 (en) | 2002-04-04 |
| US6689880B2 (en) | 2004-02-10 |
| US7071325B2 (en) | 2006-07-04 |
| EP1322773A2 (en) | 2003-07-02 |
| US7268274B2 (en) | 2007-09-11 |
| US20040133939A1 (en) | 2004-07-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ2003629A3 (cs) | Rostlina pšenice 33391 tolerantní ke glyfosátu a kompozice a způsoby její detekce | |
| US7223907B2 (en) | Cotton event MON15985 and compositions and methods for detection thereof | |
| US7193071B2 (en) | Corn event PV-ZMGT32(nk603) and compositions and methods for detection thereof | |
| US8071735B2 (en) | Cotton event MON 88913 and compositions and methods for detection thereof | |
| US7807357B2 (en) | Cotton event PV-GHGT07(1445) and compositions and methods for detection thereof | |
| AU2001293044A1 (en) | Glyphosate tolerant wheat plant 33391 and compositions and methods for detection thereof | |
| CN113201531B (zh) | 转基因玉米事件lw2-1及其检测方法 | |
| AU2017284519B9 (en) | Nucleic acid sequence for detecting existence of transgenic soybean event DBN9004 in biological sample, kit containing same and detection method therefor | |
| AU2002215363A1 (en) | Cotton event PV-GHGT07(1445) and compositions and methods for detection thereof | |
| WO2017215327A1 (zh) | 用于检测除草剂耐受性大豆植物dbn9008的核酸序列及其检测方法 | |
| CN104830845B (zh) | 用于检测除草剂耐受性玉米植物dbn9878的核酸序列及其检测方法 | |
| WO2016173540A1 (zh) | 除草剂耐受性玉米植物dbn9888及用于检测其的核酸序列和方法 | |
| CN104830846B (zh) | 用于检测除草剂耐受性玉米植物dbn9898的核酸序列及其检测方法 | |
| WO2016173539A1 (zh) | 除草剂耐受性玉米植物dbn9868及用于检测其的核酸序列和方法 | |
| US20040009504A1 (en) | Cotton event pv-ghgto7(1445) and compositions and methods for detection thereof | |
| RU2712730C2 (ru) | Растение кукурузы dbn9858, устойчивое к гербициду, и нуклеотидная последовательность и способ для ее выявления | |
| ZA200301081B (en) | Glyphosate tolerant wheat plant 33391 and compositions and methods for detection thereof. | |
| ME00840B (me) | Dnk sekvence vezane za kukuruzni transformant pv-zmgt 32 (nk 603) i preparati i metode za njegovu detekciju |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20210925 |