CZ20023310A3

CZ20023310A3 - Percyquinnin, způsob jeho přípravy, organismus pro tento způsob a farmaceutický prostředek obsahující percyquinnin

Info

Publication number: CZ20023310A3
Application number: CZ20023310A
Authority: CZ
Inventors: Cordula Hopmann; Michael Kurz; Guenter Mueller; Luigi Toti
Original assignee: Aventis Pharma Deutschland Gmbh
Priority date: 2000-04-07
Filing date: 2001-03-24
Publication date: 2003-01-15
Also published as: SI1274698T1; BR0109854A; KR20020084299A; EP1142886A1; DE60103995T2; IL152073A; HUP0300327A2; HK1052005A1; AU784902B2; PL357909A1; US20020039768A1; HRP20020796A2; MXPA02007895A; RU2266290C2; ES2222992T3; AU2006203704B8; CN1199959C; EE200200572A; KR100791798B1; SK14322002A3

Description

Předkládaný vynález se týká sloučeniny zvané Percyquinnin, která lze získat kultivací Basidiomycety Stereum complicatum, ST 001837 (DSM 13303), a jejích farmaceuticky přijatelných solí a derivátů. Předkládaný vynález se dále týká způsobu přípravy Percyquinninu, houby ST 001837 (DSM 13303), použití Percyquinninu a jeho farmaceuticky přijatelných solí a derivátů jako léčiv, zejména jejich použití jako inhibitorů lipázy, a farmaceutických kompozic obsahujících Percyquinnin nebo jeho farmaceuticky přijatelnou sůl nebo derivát.

Dosavadní stav techniky

V metabolismu lipidů se za normálních okolností udržuje křehká rovnováha mezi syntézou a degradací. Pokud se tato rovnováha naruší, může nastat hyperlipidémiě, která může způsobit atherosklerózu, hypertenzi, diabetes atd. Očekává se, že při regulaci těchto onemocnění budou použitelné modulátory metabolismu lipidů.

Předpokládá se, že inhibice lipolýzy u non-insulin dependentního diabetes mellitus (NIDDM) snižuje hyperglykémii. Počátečním jevem při využívání tuků jako energetického zdroje je hydrolýza triacylglycerolu pomocí lipáz, např. hormon senzitivní lipázy a monoacylglycerolové lipázy. Hydrolýzy triacylglycerolů vedou ke zvýšení hladin glycerolu a mastných kyselin v krvi. Očekává se, že inhibitory lipázy budou snižovat jak plazmatické hladiny mastných kyselin, tak hyperglykémii, a to s menšími nežádoucími účinky.

Obezita a hypercholesterolémie jsou do určité míry spojeny s vysokým příjmem tuků v potravě. Klíčovým enzymem absorbce ·« ··· · triglyceridů z potravy je pankreatická lipáza. Proto může být výsledkem inhibice pankreatické lipázy inhibice absorbce tuků.

Podstata vynálezu

Nyní se zjistilo, že nová sloučenina zvaná Percyquinnin inhibuje lipolýzu. Předkládaný vynález se proto týká Percyquinninu, tj. sloučeniny vzorce

OH

a jeho farmaceuticky přijatelných solí a derivátů, jako jsou estery, ethery a obvyklé chemické ekvivalenty, včetně všech stereoizomerních forem a všech tautomerních forem.

Percyquinnin má molekulový vzorec Ci2Hi₆O₃ (molekulová hmotnost 208) a lze ho charakterizovat pomocí libovolné jedné či více z jeho fyzikálně chemických a spektrálních charakteristik uvedených níže, jako jsou jeho ¹H-NMR spektroskopická data a jeho ¹³C-NMR spektroskopická data uvedená v tabulce 1 a 2.

Percyquinnin lze popsat jako nový β-lakton s anelovaným pětičlenným kruhem nesoucím hydroxymethylovou skupinu a 2,3-isopentenylový boční řetězec v pozici a laktonu. Percyquinnin má dosud nepublikovanou novou strukturu. Rešerše anotací chemické literatury potvrzuje, že je Percyquinnin novou sloučeninou. Žádná z dalších sloučenin nemá strukturní vlastnosti Percyquinninu.

• · ·· · ·

Percyquinnin lze získat kultivací mikroorganismu označovaného jako kultura č. ST 001837 (dále pouze ST 001837). Tato houba použitá k výrobě Percyquinninu byla sebrána u Percy Quinn, Mississippi State Park in Pike County, USA. Houba ST 001837 patří do řádu Basidiomycetes, druh Stereum complicatum, a byla uložena 11. února 2000 u Německé sbírky mikroorganismů a buněčných kultur (DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH), Braunschweig, Německo a bylo ji přiděleno číslo DSM No. 13303.

Proto předkládaný vynález dále poskytuje způsob přípravy nové sloučeniny zvané Percyquinnin pomocí Basidiomycety druhu ST 001837, jeho mutací a variací, za anaerobních podmínek v živném mediu obsahujícím jeden či více zdrojů uhlíku a jeden či více zdrojů dusíku a popřípadě živné anorganické soli nebo/a stopové prvky, což je následováno izolací uvedené sloučeniny a purifikací běžnými způsoby.

Živné medium obsahuje výhodně zdroje uhlíku, dusíku a živné anorganické soli. Zdroji uhlíku jsou například škrob, glukóza, sacharóza, dextrin, fruktóza, molázy, glycerol, laktóza nebo galaktóza, výhodně glukóza. Zdroji dusíku jsou například sojová moučka, moučka z burských oříšků, kvasinkový extrakt, hovězí extrakt, pepton, sladový extrakt, kukuřičný výluh, želatina nebo kasaminokyseliny, výhodně sladový extrakt a kvasinkový extrakt. Živnými anorganickými solemi jsou například hydrogenfosforečnan sodný, hydrogenfosforečnan draselný, hydrogenfosforečnan amonný, chlorid sodný, chlorid vápenatý, uhličitan vápenatý, dusičnan draselný, síran amonný nebo síran hořečnatý, výhodně hydrogenfosforečnan amonný.

Kultivaci ST 001837 lze provádět při teplotách mezi 20 až 35° C a pH mezi 3,0 a 8,0. Výhodně se ST 001837 kultivuje při 25° C (± 1° C) a pH mezi 3 a 5.

Kultivace ST 001837 se výhodně provádí po dobu 96 až 300 hodin, kdy se získá optimální výtěžek inhibitoru lipázy Percyquinninu podle vanálezu. Obzvláště výhodné je provádět kultivací pomocí fermentace po dobu 216 až 264 hodin za ponoření, například v protřepávacích baňkách a rovněž tak v laboratorních fermenterech. Vývoj fermentace a tvorby Percyquinninu lze detekovat pomocí vysokotlaké kapalinové chromatografie (HPLC) a stanovením bioaktivity kultivačního bujónu. Ve výsledném kultivačním bujónu je Percyquinnin přítomen v kultivačním filtrátu a rovněž tak v myceliu, výhodně v myceliu.

Percyquinnin lze izolovat pomocí známých způsobů separace. Proto ho lze získat z kultivačního filtrátu extrakcí pomocí rozpouštědla němísitelného s vodou, jako jsou ethylacetát, dichlormethan, chloroform nebo butanol, při pH 5 až 8 nebo pomocí hydrofobní interakční chromatografie s použitím polymerních pryskyřic, jako jsou „Diaion HP-20® nebo „MCI® Gel CHP-20P (Mitsubishi Chemicals Industries Limited, Japonsko), „Amberlite XAD® (Rohm and Haas Industries U.S.A), aktivního uhlí nebo iontoměničové chromatografie při pH 5 až 8. Výhodným způsobem je chromatografie na MCI® Gel CHP-20P. Účinnou látku lze také získat z mycelia, a to extrakcí pomocí rozpouštědla mísitelného s vodou, jako jsou methanol, aceton, acetonitril, n-propanol nebo isopropanol, nebo rozpouštědla němísitelného s vodou, jako jsou ethylacetát, dichlormethan, chloroform nebo butanol, při pH 5 až 8 a výhodným způsobem je extrakce pomocí methanolu. Koncentrací a lyofilizací extraktů se získá surová účinná látka.

Ze surové látky lze Percyqunnin podle předkládaného vynálezu získat například následovně:

Frakcionací s použitím následujících způsobů: chromatografie s normální fází (s použitím alumina nebo silikagelu jako stacionární fáze a eluentů jako je petrolether, ethylacetát, methylenchlorid, aceton, chloroform, methanol nebo jejich kombinace a přísad aminů, jako je NEt₃) , chromatografie s reverzní fází (s použitím silikagelu s reverzní fází, jako je dimethyloktadecylsilyl-silíkagel, též zvaný RP-18, nebo dimethyloktylsilyl-silikagel, též zvaný RP-8, jako stacionární fáze a eluentů, jako jsou voda, pufry, jmenovitě fosfátový, acetátový, citrátový (pH 2 až 8) a organická rozpouštědla, jako je methanol, acetonitril, aceton, tetrahydrofuran nebo kombinace těchto rozpouštědel) , gelové permeační chromatografie s použitím pryskyřic, jako jsou ®Sephadex LH-20 (Pharmacia Chemicals Industries, Švédsko), TSKgel ®Toyopearl HW (TosoHaas, Tosoh Corporation, Japonsko) v rozpouštědlech, jako jsou methanol, chloroform, aceton, ethylacetát nebo jejich kombinace nebo ®Sephadex G-10 a G-25 ve vodě; nebo protisměrné chromatografie s použitím bifázických eluačních systémů tvořených dvěmi či více rozpouštědly, jako je voda, methanol, ethanol, isopropanol, n-propanol, tetrahydrofuran, aceton, acetonitril, methylenchlorid, chloroform, ethylacetát, petrolether, benzen a toluen. Tyto způsoby lze použít opakovaně nebo lze použít kombinace různých způsobů. Výhodným způsobem je chromatografie pomocí silikagelu s reverzní fází (RP-18).

Sloučeninu Percyquinnin lze přeměnit na farmaceuticky přijatelné soli nebo deriváty, jako jsou estery a ethery a další obvyklé ekvivalenty, které všechny předkládaný vynález pokrývá. Soli a deriváty lze připravit běžnými způsoby, které jsou odborníkovi v oboru známé. Soli, jako je sodná a draselná sůl, lze připravit podrobením Percyquinninu působení vhodných sodných nebo draselných bází.

Estery ethery lze připravit způsoby popsanými v literatuře, například v Advanced Organic Synthesis, 4 vydání, J. March, John Wiley / vytvořit reakcí s karboxylovými aminokyseli-nami, např. leucinem, aminoskupiny aminokyseliny lze

Sons,

1992

Estery lze kyselinami nebo například glycinem nebo alaninem. Z po esterifikaci odstranit ·♦ ··♦ · chránící skupinu nebo ji lze chránit např. pomocí formylové skupiny. Esterifikaci lze provádět v přítomnosti dehydratačního činidla, např. dicyklohexylkarbodiimidu (DCC), jak je popsáno v literatuře (Smith a kol., J. Am. Chem. Soc. 1958, 80, str. 6204; Arrieta a kol., Synth. Commun. 1983, 13, str. 471) .

Dvojné vazby lze redukovat způsoby popsanými v literatuře, například v Advanced Organic Synthesis, 4. vydání, J. March, John Wiley & Sons., 1992, str. 771 až 775 nebo jako v R. Bloch a kol., J. Org. Chem. 1987, 52, str. 4603 až 4605. Lze je hydrohalogenovat způsoby popsanými H. O. Housem v „Modern Synthetic Reactions, W. A. Benjymin, lne., New York, 1972, str. 446 až 452. Hydroxylované deriváty lze připravovat reakcí dvojných vazeb s činidly, jako je OsO₄, jak je popsáno v literatuře, např. v Chem. Rev. 1980, 80, str. 187.

Deriváty lze také vytvořit konverzí dvojných vazeb na epoxidy pomocí oxidace, např. použitím kyseliny m-chlorperoxybenzoové, jak je popsáno v Advanced Organic Synthesis, 4. vydání, J. March, John Wiley & Sons., 1992, str. 826 nebo jako v A. J. Pearson a kol., J. Org. Chem. 1986, 51, str. 2505 až 2511.

Deriváty lze také vytvořit pomocí ozonolýzy dvojné vazby ísopentenylového bočního řetězce. V závislosti na postupu zpracování může toto vést k aldehydu (např. s Zn/HOAc nebo dimethylsulfid/methanol), ke karboxylové kyselině (např. s H2O2) nebo k alkoholu (např. s L1AIH4 nebo NaBH₄) jako funkční skupině [W. Curruthers, „Some Modern Methods of Organic Synthesis, Cambridge University Press, 1971, kapitola 6; White, King and 0'Brien, Tetrahedron Lett. 3591, 1971; Bailey, P. S., „Ozonisation in Organic Chemistry, Sv. 1 a sv. 2, New York, Academie Press, 1978, 1982]. Reakcí takto vytvořených aldehydů s fosforany, známé z literatury jako Wittigova reakce, lze připojit boční řetězce obsahující 4 až 10 • fl flflflfl • fl ·· • · · • · « ♦ · · • flfl • fl flfl · 1 uhlíkových atomů. Tyto nově připojené řetězce mohou nést, např. skupinu OR¹, ve které R¹ znamená atom vodíku nebo alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy; skupinu

NR²R³, ve které R² a R znamenají nezávisle atom vodíku nebo alkylovou skupinu obsahující 1 az uhlíkové atomy; atom fluoru, atom chloru, atom bromu nebo atom jodu jako funkční

Bestmann skupiny, jak je popsáno v H. J.

Topics of the Wittig Reaction in the Synthesis of Natural Products, Topics in Current Chemistry 109, 85, 1983.

,Selected

Percyquinnin vykazuje inhibici lipázy s IC50 ve výši 2 pmol (NBD-analýza, viz příklad 6).

Předkládaný vynález se týká také použití Percyquinninu ve formě racemátů, racemických směsí a čistých enanciomerů, a jejich diastereomerů a jejich směsí.

Farmaceuticky přijatelné soli jsou zejména vhodné pro medicínské přípravky, a to díky tomu, že jsou ve vodě více rozpustné oproti původním sloučeninám, ze kterých jsou odvozeny. Tyto soli musí obsahovat farmaceuticky přijatelný anion nebo kation. Vhodnými farmaceuticky přijatelnými adičními solemi s kyselinou Percyquinninu jsou soli anorganických kyselin, jako jsou kyselina chlorovodíková, kyselina bromovodíková, kyselina fosforečná, kyselina metafosforečná, kyselina dusičná a kyselina sírová, a jsou například kyselina octová, kyselina benzoová, kyselina organických kyselin, jako kyselina benzensulfonová, citrónová, kyselina ethansulfonová, kyselina glukonová, kyselina glykolová, kyselina fumarová, kyselina isethionová, kyselina mléčná, kyselina laktobionová, kyselina maleinová, kyselina jablečná, kyselina methansulfonová, kyselina jantarová, kyselina p-toluensulfonová, kyselina vinná a kyselina trifluoroctová. Pro medicínské účely je zejména výhodné použití chloridů. Vhodnými farmaceuticky přijatelnými bazickými solemi jsou amonné soli, soli alkalických kovů, jako •0 999 9 je sodná a draselná sůl, a soli kovů alkalických zemin, jako je horečnatá a vápenatá sůl.

Soli s farmaceuticky nepřijatelným aniontem jsou také předmětem předkládaného vynálezu jako meziprodukty použitelné pro přípravu nebo purifikaci farmaceuticky přijatelných solí nebo/a pro použití pro jiné než terapeutické účely, např. in vitro.

Zde použitý termín „fyziologicky funkční derivát označuje libovolný fyziologicky tolerovatelný derivát sloučeniny podle vynálezu, například ester, který je při podání savci, jako je například člověk, schopný vytvořit (přímo či nepřímo) tuto sloučeninu nebo její účinný metabolit.

Dalším provedením předkládaného vynálezu je použití profarmak Percyqunninu. Tato profarmaka lze in vivo metabolizovat na Percyqunnin. Tato profamaka mohou být sama o sobě účinná či nikoliv.

Percyqunnin se může také vyskytovat v různých polymorfních formách, například jako jsou amorfní a krystalické polymorfní formy. Také všechny polymorfní formy Percyqunninu představují předmět předkládaného vynálezu a jsou dalším provedením předkládaného vynálezu.

Všechny níže uvedené zmínky o Percyquinninu se týkají Percyquinninu, jak je popsán výše a jeho solí, solvátů a fyziologických derivátů, jak jsou popsány výše.

Množství Percyqunninu nezbytné pro dosažení požadovaného biologického účinku závisí na mnoha faktorech, například na konkrétní zvolené sloučenině, zamýšleném použití, způsobu podávání a klinickém stavu pacienta. Denní dávka se obecně pohybuje v rozmezí od 0,3 mg do 100 mg, typicky od 3 mg do 50 mg, na den a kilogram tělesné hmotnosti, například 3 až 10 mg/kg/den. Intravenózní dávka se může například pohybovat v rozmezí od 0,3 mg do 1,0 mg/kg a lze ji vhodně podávat jako infúzi 10 ng až 100 ng na kilogram a minutu. Infúzní roztoky vhodné pro tyto účely mohou obsahovat například 0,1 ng až 10 mg, typicky od 1 ng do 10 mg, na mililitr. Jednotlivé dávky mohou obsahovat například od 1 mg do 10 g účinné látky. Proto mohou ampule pro injekce obsahovat například od 1 mg do 100 mg a jednodávkové přípravky, které lze podávat orálně, od 1,0 do 1000 mg, typicky od 10 do 600 mg. V případě farmaceuticky přijatelných solí jsou výše uvedené hmotnostní údaje vztaženy ke hmotnosti aminothíazolového iontu odvozeného ze soli. Percyqunnin lze použít k prevenci nebo léčení výše uvedených stavů sám o sobě jako sloučeninu, avšak výhodně je ve formě farmaceutické kompozice s vhodným kompatibilním nosičem. Nosič samozřejmě kompatibilní ve smyslu kompatibility látkami kompozice a nesmí být škodlivý pro pacientovo zdraví. Nosičem může být pevná látka nebo kapalina nebo pevná látka i kapalina a výhodně je se sloučeninou v podobě jednotlivé dávky, například jako tableta, která může % hmotn. účinné látky. Farmaceutické lze připravovat jedním ze známých které se v podstatě skládají ze musí být s dalšími obsahovat od 0,05 % do 95 kompozice podle farmaceutických smíchání látek vynálezu způsobů, s farmaceuticky přijatelnými nosiči nebo/a pomocnými látkami.

Farmaceutickými kompozicemi podle vynálezu jsou ty, které jsou vhodné pro orální, rektální, místní, perorální (například sublinguální) a parenterální (například subkutánní, intramuskulámí, intradermální nebo intravenózní) podávání, ačkoliv nejvhodnější způsob podávání závisí v každém konkrétním případě na povaze a závažnosti stavu, který má být léčen, a na povaze Percyqunninu použitého v každém z těchto případů. Předmětem předkládaného vynálezu jsou také potažené přípravky a potažené přípravky s pomalým uvolňováním. Výhodné jsou přípravky odolné vůči kyselinám a žaludečním šťávám. Vhodné potahy odolné vůči žaludečním šťávám obsahují acetát10 » · * » · ♦ «· ···· ftalát celulózy, polyvinyl-acetát-ftalát, ftalát hydroxypropylmethylcelulózy a aniontové polymery kyseliny methakrylové a methylmetakrylátu.

Vhodné farmaceutické sloučeniny pro orální podávání mohou být ve formě oddělených jednotek, jako jsou například kapsle, kachety, pastilky nebo tablety, z nichž každá obsahuje definované množství Percyqunninu; jako prášek či granule; jako roztok nebo suspenze ve vodné nebo nevodné kapalině; nebo jako emulze typu olej ve vodě nebo voda v oleji. Tyto kompozice lze, jak již bylo řečeno, připravit libovolným vhodným farmaceutickým způsobem, který zahrnuje stupeň, při němž se účinná látka a nosič (který se může skládat z jedné nebo více pomocných látek) přivedou do kontaktu. Obecně se kompozice připravují jednotným a homogenním smícháním účinné látky s kapalným nebo/a jemně dispergovaným pevným nosičem, po čemž se produkt tvaruje, pokud je to nezbytné. Tabletu tak lze připravit stlačením nebo vytvarováním prášku nebo granulí sloučeniny, a když je to vhodné, s jednou nebo více pomocných látek. Stlačené tablety lze připravit pomocí tabletování sloučeniny ve volně tekoucí formě, jako je například prášek nebo granule, pokud je to vhodné, smíchané s pojivém, lubrikantem, inertním ředidlem nebo/a jedním či více povrchově aktivních/disperzních činidel, ve vhodném zařízení. Tvarované tablety lze připravovat tvarováním sloučeniny, která je v práškové formě a je zvlhčena inertním kapalným ředidlem, ve vhodném zařízení.

Farmaceutické kompozice vhodné pro perorální (sublinguální) podávání zahrnují cucavé tablety, které obsahují Percyquinnin s ochucovadlem, obvykle sacharózou, a arabskou gumu nebo tragakant, a pastilky, které obsahují sloučeninu v inertní bázi, jako je želatina a glycerol nebo sacharóza a arabská guma.

♦··· • 0 0

9»

0 9 9

90 ·0 • 9 9 0 · 9

99 • · ·

0 · • 00

9 0

0000

Vhodné farmaceutické kompozice pro parenterální podávání výhodně zahrnují sterilní vodné přípravky Percyquinninu, které jsou výhodně isotonické s krví zamýšleného příjemce. Tyto přípravky se výhodně podávají intravenózně, ačkoliv lze podávání provádět také pomocí subkutánní, intramuskulární nebo intradermální injekce. Tyto přípravky lze výhodně připravit smícháním sloučeniny s vodou a upravením výsledného roztoku tak, aby byl sterilní a izotonický s krví. Injektovatelné kompozice podle vynálezu obecně obsahují od 0,1 do 5 % hmotn. účinné sloučeniny.

Vhodné farmaceutické kompozice pro rektální podávání jsou výhodně ve formě jednodávkových čípků. Tyto lze připravit smícháním Percyquinninu s jedním nebo více běžnými pevnými nosiči, například kakaovým máslem, a tvarováním výsledné směsi.

Vhodné farmaceutické kompozice pro místní použití na kůži jsou výhodně ve formě masti, krému, lotion, pasty, spreje, aerosolu či oleje. Nosiči, které lze použít, jsou vazelína, lanolin, polyethylenglykoly, alkoholy a kombinace dvou či více těchto látek. Účinná látka je obecně obsažena v koncentraci od 0,1 do 15 % hmotn. kompozice, například od 0,5 do 2 %.

Možné je také transdermální podávání. Vhodné farmaceutické kompozice pro transdermální použití mohou být ve formě jednotlivých náplastí, které jsou vhodné pro dlouhodobý těsný kontakt s epidermis pacienta. Náplasti tohoto typu vhodně obsahují účinnou složku ve vodném roztoku, který je, pokud je to vhodné, pufrován, rozpuštěn nebo/a dispergován v lepidle nebo dispergován v polymeru. Vhodná koncentrace účinné látky se pohybuje přibližně mezi 1 % až 35 %, výhodně přibližně 3 % až 15 %. Účinnou látku lze zejména uvolňovat pomocí elektrotransportu nebo iontoforézy, jak je popsáno například v Pharmaceutical Research, 2 (6): str. 318, 1986.

Následující příklady provedení vynálezu slouží k ilustraci předkládaného vynálezu, avšak nikterak předkládaný vynález neomezuj í.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Udržování kultury ST 001837

a) Vytvoření udržovacího media

Po důkladném rozpuštění látek pomocí zahřívání byl výsledný roztok sterilizován při 121° C po dobu 20 minut a rozdělen do Petriho misek (15 ml/miska). Po ztuhnutí byly desky naočkovány startovací kulturou a inkubovány při 25° C dokud nebyl pozorován dobrý růst. Pro následující konzervační stupně byly použity dobře narostlé kultury.

Udržovací medium sladový extrakt kvasinkový extrakt glukóza (NH₄) ₂HPO₄ agar-agar

2,00

1,00

0,05

2,00

b) Konzervace při -135° C

1,5 ml sterilního 10% roztoku dimethylsulfoxidu (DMSO) bylo nalito do 2 ml kryoampulek. Kousek agaru z udržovacího agaru o velikosti 2 cm² byl přidán k roztoku DMSO, postupně zmrazován (1° C za minutu) a uchováván při -135° C.

r» *·· · » ·« • * · · • · · t · »

9 * • 99 9« • 9 ««

9 9 · · • 99 9

9·9

9999

c) konzervace v tekutém dusíku

1,5 ml sterilního 50% roztoku glycerolu bylo nalito do 2 ml kryoampulek. Kousek agaru z udržovacího agaru o velikosti 2 cm² byl vyjmut a přidán k roztoku glycerolu, postupně zmrazován (1° C za minutu) až na -80° C a poté uchováván v tekutém dusíku.

Příklad 2

Fermentace kultury č. ST 001837 v protřepávacích baňkách

Příprava inokulační kultury v protřepávacích baňkách

Inokulační medium (viz níže) bylo rozděleno po 100 ml množstvích do 300 ml protřepávacích baněk a autoklávováno při 121° C po dobu 20 minut. Baňky byly ochlazeny na pokojovou teplotu a naočkovány agarovými kousky o velikosti 2 cm²získanými ze 6 dní staré agarové deskové kultury nebo obsahem jedné konzervované ampulky (-135° C nebo kapalný dusík). Inkubace byla prováděna po dobu 96 hodin na rotační třepačce při 140 otáčkách za minutu a 25 ° C.

Inokulační medium

kukuřičný výluh	o o 0,50
rajčatová pasta	4,00
ovesná mouka	1,00
glukóza	1, 00
stopové prvky	1,00 ml
pH 6,8

	« « « „www - 14 - ; : ., : : :. »444 · · ♦ ·· · *»· 4 4	• · · • « 4 « 4 · 44 4444
Roztok stopových prvků
FeSO₄x7H₂O	O. U 0,1000
MnSO₄xlH₂O	0,1000
CuC1₂x2H₂O	0,0025
CaCl₂x2H₂O	0,0100
H3BO3	0,0056
(NH₄) 6MO70₂₄x4H₂0	0,0019
ZnSO₄x7H₂O	0,0200
Produkční podmínky
Produkční medium	(viz níže) bylo rozděleno po 100	ml
množstvích do 300 ml	protřepávacích baněk a autoklávováno	při

121° C po dobu 20 minut. Baňky byly ochlazeny na pokojovou teplotu a naočkovány 2 ml 4 dny staré inokulační kultury. Inkubace byla prováděna po dobu 240 hodin na rotační třepačce při 140 otáčkách za minutu a 25° C. Produkce inhibitoru Percyqunninu byla stanovována testováním bioaktivity proti inhibici lipázy, jak je popsáno (příklad 6) a pomocí HPLC analýzy.

Produkční medium

O sladový extrakt 2,00 kvasinkový extrakt 0,20 glukóza 1,00 (NH₄)₂HPO₄ 0,05

Příklad 3

Kultivace kultury č. ST 001837 ve fermenterech (12 1)

Příprava inokulační kultury v protřepávacích baňkách • «

• ·

4 • 4 · ·

Inokulační medium bylo rozděleno po 500 ml množstvích do 2

Erlemeyerových baněk a autoklávováno při 121° C po dobu 30 minut. Inokulační kultura byla pěstována v těchto baňkách jak je popsáno v příkladu 2.

Fermentace ve velkém množství

Vytvoření produkčního media

1 produkčního media ve 12 1 fermenteru (ve dvou fermenterech) bylo společně s 1 ml(/10 1 fermenter) přípravku ®Desmophen jako odpěňovadla bylo sterilizováno in sítu po dobu 45 minut při 121° C, vychlazeno na 25° C (± 1° C) a oseto 0,5 1 (6,25 % 12 1 fermenteru) inokulační kultury uvedené výše.

Fermentace probíhala za následujících parametrů:

teplota míchání provzdušnění čas odběru

25° C

600 otáček za minutu (v_ti_P= 1,57 m/s) : 0,5 vvm (objem vzduchu (měřený při standardní teplotě a tlaku) na objem kultivačního média za minutu)

237 h

Produkce inhibitoru lipázy Percyquinninu byla stanovována testováním inhibice lipázy, jak je popsáno v příkladu 6. Konečná hodnota pH kultivačního bujónu činila 3 až 4. Kultivační bujón byl odebrán a odstřeďován a sloučenina Percyquinnin byla izolována a purifikována z kultivačního filtrátu a mycelia způsobem popsaným v příkladu 4.

Příklad 4

Izolace a purifikace Percyqunninu

Kultivační bujón (3 litry) byl odebrán a odstřeďován k separaci mycelia (20 g) a kultivačního filtrátu. Mycelium bylo extrahováno methanolem (3 litry) a aktivní extrakty byly smíchány a koncentrovány za sníženého tlaku na objem 50 ml. Tento surový materiál byl purifikován pomocí preparativní HPLC za použití následující podmínek:

1.) sloupec: MCI® Gel CHP-20P (BioCart, 50 x 100 mm; Kronlab) eluent: A) H₂O B) methanol (MeOH) gradient: min %A %B

95 5

0 100 tok: 45 ml/min detekce: 220 a 254 nm

Aktivní frakce byly eluovány po 17 min. Smíchané frakce byly koncentrovány za sníženého tlaku a sušeny mrazem.

Konečná purifikace byla provedena pomocí preparativní HPLC za použití následujích podmínek:

1.) sloupec: Purospher Star RP-18e (5 μ, 125 x 25 mm; Merck) eluent: A) 0,1% kyselina trifluoroctová (TFA)

B) CH₃CN

gradient:	min	%A	%B
	0	95	5
	5	95	5
	45	0	100
rychlost	toku:	: 38	ml/min
detekce:	210	a 300 nm

Frakce obsahující Percyqunnin byly eluovány po 21 min. Smíchané frakce byly koncentrovány za sníženého tlaku a sušeny mrazem.

•· ·· 4« * 4 4 4 4 • · ··· ·

2.)

sloupec:	Purospher Star RP-18e (5 μ, 125 x 25 mm; Merck)
eluent:	A) 0,1% B) CH₃CN	kyselina trifluoroctová (TFA)
gradient:	min	%A	%B
	0	80	20
	10	80	20
	10,1	75	25
	17	75	25
	17,1	70	30
	50	70	30
	55	0	100
	100	0	100
rychlost	toku:	5 ml/min
detekce:	210	nm

Frakce obsahující Percyqunnin byly eluovány po 37 min. Smíchané frakce byly koncentrovány za sníženého tlaku a sušeny mrazem. Celkový výtěžek z 20 g mycelia byl 2 mg sloučeniny Percyquinnin.

Fyzikálně chemické a spektrální vlastnosti Percyquinninu ukazují tabulka 1 a tabulka 2.

Tabulka 1

Vzhled : Rozpustnost : HPLC (vysokotlaká : kapalinová chromatografie bledě žlutý olej methanol, dimethylsulfoxid sloupec: Purospher Star RP-18e (Merck) ,55x4 mm, 3 μπι, eluent: CH₃CN/0,01 % H₃PO₄ (85%) gradient:

čas	% CH₃CN
0,00	5, 0
3,00	95,0
5,00	95,0
6,00	5,0
10,00	5,0

• · · · · · • · ·· tok: 2 ml/min teplota: 40° C detekce 210 nm, 254, 280, 320, 380 retenční doba: 2,1 min

EI-MS (56eV) : m/z = 208 [M⁺]

GC-MS (v CH₂C1₂ + MSTFA,

56eV) : m/z = 280 [M+-H+TMS (tetramethylsilan)] molekulový vzorec : Ci₂Hi₆C>3 ¹H-NMR : viz tabulka 2 ¹³C-NMR : viz tabulka 2

Tabulka 2 ¹H- a ¹³C-NMR spektroskopická data Percyquinninu v DMSO při 300 K

	^XH	¹³c
1	-	172,97
2	-	74,24
3	-	148,37
4	5,51	120,45
5	2,73/2,57	36, 99
6	4,93 ·	78,41
7	2,54/2,37	27,05
8	5, 11	117,92
9	-	134,66
10	1,60	17,77
11	1,68	25,57
12	4,01	59,39
12-OH	4,97	-

• · · · · ·

Příklad 5

Příprava a purifikace lipázy

Pomocí působení kolagenázy popsaného v literatuře byly ze samčích krys (Wistar 220 až 250 g) izolovány adipocyty. Tukové buňky 10 krys byly promyty, každá třikrát pomocí flotace s použitím 50 ml homogenizačního pufru (25 ml Tris/HCl, pH 7,4, 0,25 mol sacharózy, 1 mmol EDTA (kyseliny ethylendiamintetraoctové), 1 mmol DTT (dithiothreitolu) , 10 μg/ml

Leupeptinu, 10 μρ/ml Antipainu, 20 μρ/πιΐ Pepstatinu) . Poté bylo přidáno 10 ml homogenizačního pufru. Tukové buňky byly homogenizovány v zařízení typu „teflon ve skle (teflon-in-glass) (Braun-Melsungen) při 1500 otáčkách za minutu a 15° C. Homogenní produkt byl odstřeďován (Sorvall SM 24 tubes, 500 otáček za minutu, 10 min, 4° C) . Vrstva mezi horní tukovou vrstvou a peletou byla separována a znovu centrifugována. Separace spodní vrstvy byla zopakována a tato odstředěna potřetí při 200 otáčkách za minutu podobu 45 minut při 4° C. Výsledná matečná vrstva byla přidána k 1 g Heparin Sepharose (Pharmacia-Biotech, CL-6B, pětkrát promyta 25 mmol Tris/HCl, pH 7,4, 150 mjnol NaCl) . Po inkubaci po dobu 60 minut při 4° C (protřepáváno v intervalech 15 minut) byl roztok odstřeďován (Sorvall SM 24 tubes, 3000 otáček za minutu, 10 min, 4° C) . Bylo upraveno pH horní vrstvy na hodnotu 5,2 pomocí kyseliny octové a dále inkubováno po dobu 30 minut při 4° C. Precipitáty byly izolovány pomocí odstřeďován! (Sorvall SS 34 tubes, 12000 otáček za minutu, 10 min, 4° C) a suspendovány ve 2,5 ml 20 mmol Tris/HCl, pH 7,0, 1 mmol EDTA, 65 mmol NaCl, % sacharózy, 1 mmol DTT, 10 μρ/ιηΐ Leupeptin/PepstatinAntipain. Syspenze byla dialyzována po celou noc při 4° C proti 25 mmol Tris/HCl, pH 7,4, 50 % glycerolů, 1 mmol DTT, 10 μς/ιηΐ

Leupeptin, Pepstatin, Antipain a následně absorbována na hydroxyapatitový sloupec (0,1 g/1 ml suspenze vyvážené 10 mmol fosforečnanu draselného, pH 7,0, 30 % glycerolu, 1 mmol DTT).

Sloupec byl čtyřikrát promyt vyrovnávacím pufrem (tok: 20 až ml/h). Lipázy byla eluována 0,5M pufrem fosforečnanu draselného. Produkt byl dialyzován a koncentrován (5 až lOkrát) ultrafiltrací (Amicon Diaflo PM 10) pří 4° C.

Poločistou lipázu lze uchovávat po 4 až 6 týdnů při -70° C.

Příklad 6

Analýza bioaktivity

Jako substrát byl použit fluorescentní lipidový analog, mono-NBD-acylglycerol (NAG), který mění svou barvu po integraci do f osf olipidových vesikul od 481 nm do 550 nm. Testovaná sloučenina rozpuštěná v DMSO byla zředěna analyzačním pufrem (25 mmol Tris/HCl, pH 7,4, 150 mmol NaCl.) v poměru 1:5. Ke 2,5 μΐ tohoto roztoku bylo přidáno 180 μΐ roztoku substrátu ošetřeného ultrazvukem (20 μς/ιηΐ fosfatidylcholinu, 10 μς/ιηΐ fosfatidylinositolu, 50 μς/ιπΐ NAG v analyzační pufru) . Po předinkubaci při 30° C po dobu 15 minut bylo přidáno 20 μΐ enzymového roztoku, předem zředěného v poměru 1:2 v analyzačním pufru a bezprostředně nato byla měřena absorbce při 485 nm. Po 60 minutách inkubace při 30° C byla absorbce stanovována znovu. Vzrůst absorbance při 480 nm byl mírou enzymové aktivity. Stanovení hodnot IC₅₀ bylo provedeno s použitím 10 koncentrací čerstvě rozpuštěné testované sloučeniny. K analýze dat byl použit softwarový paket GRAPHIT, Elsvier-Biosoft.

Percyquinnin vykazuje inhibici lipázy s hodnotou IC₅₀ ve výši 2 μπιοί.

Claims

1. Sloučenina Percyquinnin vzorce

OH a její farmaceuticky přijatelné soli a deriváty, ve všech jejich stereoisomerních a tautomerních formách.

2. Sloučenina Percyquinnin molekulového vzorce C₁₂H₁₆O3 získatelná kultivací houby ST 001837, tj. DSM 13303, za aerobních podmínek v živném mediu obsahujícím zdroje uhlíku a dusíku, následovanou izolací a purifikací běžnými způsoby, a její farmaceuticky přijatelné soli a deriváty, ve všech jejich stereoisomerních a tautomerních formách.

3. Způsob přípravy Percyquinninu nebo jeho soli či derivátu podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že se kultivuje basidiomyceta druh ST 001837, tj . DSM 13303, za aerobních podmínek v živném mediu obsahujícím zdroje uhlíku a dusíku, a následně se produkt izoluje a purifikuje běžnými způsoby.

4. Druh basidiomycety ST 001837, tj. DSM 13303.

5. Sloučenina Percyquinnin nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl či derivát podle nároku 1 nebo 2 pro použití jako léčivo.

6. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství Percyquinninu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli či derivátu podle nároku 1 nebo 2 a farmaceuticky přijatelný nosič.

• 919 ·· 11

11 111 • lil * • · · · · · • · · i ·

99 11 1111

Ί. Percyquinnin nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl či derivát podle nároku 1 nebo 2 pro použití jako inhibitor lipázy.