MXPA00011165A - Mumbaistatin, un proceso para su produccion y su empleo como un producto farmaceutico - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un compuesto de nombre Mumbaistatin, el cual se puede obtener por el cultivo del microorganismo HIL-008003 (DSM 11641), y a sus sales y derivados aceptables farmacéuticamente. Este Mumbaistatin es un inhibidor de la translocasa del Glucosa-6-fosfato y se puede usar en el tratamiento de la diabetes mellitus. La presente invención además se refiere a un proceso para la producción de Mumbaistatin, al microorganismo HIL-008003 (DSM 11641), al uso del Mumbaistatin y sus sales y derivados aceptables farmacéuticamente, como productos farmacéuticos, en particular a su uso en el tratamiento de la diabetes mellitus, y a una composición farmacéutica que comprende el Mumbaistatin o una al o derivado, aceptable farmacéuticamente del mismo.

Description

MUMBAISTATIN. UN PROCESO PARA SU PRODUCCIÓN Y SU EMPLEO COMO UN PRODUCTO FARMACÉUTICO La presente invención se refiere a un compuesto nombrado Mumbaistatin, el cual se puede obtener por el cultivo del microorganismo HIL-008003 (DSM 11641), y a sus sales aceptables farmacéuticamente y sus derivados. El Mumbaistatin es un inhibidor de la translocasa de glucosa-6-fosfato y se puede usar en el tratamiento de la diabetes mellitus. La presente invención además se refiere a un proceso para la producción del Mumbaistatin, al microorganismos HIL-008003 (DSM 11641), al uso del Mumbaistatin y sus sales y derivados aceptables farmacéuticamente, como productos farmacéuticos, en particular a su empleo en el tratamiento de la diabetes mellitus, y a las composiciones farmacéuticas que comprenden el Mumbaistatin o una sal o derivado aceptable farmacéuticamente del mismo. El régimen aumentado de la producción de glucosa hepática es una característica general de la diabetes mellitus. En particular, hay una fuerte correlación entre el nivel de glucosa del plasma en ayunas en la diabetes mellitus no dependiente de la insulina (NIDDM) y la producción de la glucosa hepática. Las dos maneras por la cual se produce la glucosa en el hígado son la mi • iiWítittÉtr gluconeogénesis y la glicogenólisis. Las etapas terminales de ambas maneras se cataliza por la glucosa-6-fosfatasa microsomal, una enzima clave en la regulación homeostática de los niveles de glucosa en la sangre. El nivel de esta enzima se ha conocido también se eleva en las condiciones tanto experimentales como patológicas de la diabetes. La interferencia con este sistema de enzimas, por lo tanto, debe resultar en una producción reducida de la glucosa hepática. La glucosa-6-fosfatasa es un sistema de múltiples componentes comprendido de cuando menos tres actividades funcionales: una translocasa del glucosa-6-fosfato (TI), una fosfohidrolasa del glucosa-6-fosfato y una translocasa de fosfato / pirofosfato (TI) . La translocasa del glucosa-6-fosfato facilita el transporte del glucosa-6-fosfato en el lumen del retículo endoplásmico (ER) . La fosfohidrolasa, con su sitio activo situado en la superficie lumenal del ER, hidroliza el glucosa-6-fosfato y libera la glucosa y el fosfato en el lumen. Mientras el flujo del fosfato es facilitado por la translocasa del fosfato / pirofosfato, el mecanismo exacto del flujo de la glucosa aún no es claro. El alto grad9o de la especificidad del substrato de la translocasa del glucosa-6-fosfato hace esto un objetivo potencial para la intervención farmacológica en el tratamiento de la diabetes mellitus. Así, entre los fosfatos . aafafcj.'.*-.. de azúcar que ocurren fisiológicamente, sólo el glucosa-6-fosfato es transportado por la translocasa. En contraste, la fosfatase no es específica y se conoce hidroliza una variedad de esteres de fosfato orgánicos. Una serie de inhibidores no específicos de la glucosa-6-fosfatasa se han descrito en la literatura, por ejemplo phlorrhizin (J. Biol.. Chem. 242, 1955-1960 (1967)), 5, 5'-ditio-bis-2-ácido nitrobenzoico (Biochem, Biophys, Res. Común, 48, 694-699 (1972)), 2, 2 '-diisocitiocianato-estilbeno y 2-isotiocianato-2'-acetoxi-estilbeno (J. Biol.. Chem. 255, 1113-1119 (1980=. Los primeros inhibidores, utilizables terapéuticamente, del sistema de glucosa-6-fosfatasa fueron propuestos en las solicitudes de patente europeas EP-A-587 087 y EP-A-587 088. Las Kodaistainas A, B, C y D descritas en la publicación de patente internacional no. W098/47888, son los primeros inhibidores de la translocasa del glucosa-6-fosfato de fuentes microbiales. Se ha encontrado ahora que de una diferente fuente microbial, un novedoso compuesto con alta actividad inhibidora de la translocasa del glucosa-6-fosfato se puede obtener, la cual ha sido nombrado Mumbaistatin. La presente invención se refiere así a un compuesto denominado Mumbaistatin, el cual tiene la fórmula molecular de C28H20O12, y que se caracteriza por una o más propiedades físico-químicas y espectrales dadas abajo, tal como sus datos espectroscópicos de la 'H NMR, ilustrados en el espectro de la 'H NMR en la Figura 9 y sus datos espectroscópicos 13C NMR, ilustrados en el espectro de 13C NMR en la Figura 10, y sus sales aceptables farmacéuticamente y sus derivados, tal 5 como los esteres, éteres y equivalentes químicos obvios, que incluyen todas las formas isoméricas y todas las formas tautoméricas. El Mumbaistatin tiene una novedosa estructura, hasta ahora sin reportar, que pertenece a la clase de la quinona de los compuestos. Una investigación de la literatura del extracto químico que usa claves de búsqueda de la fórmula molecular estableció que el Mumbaistatin, es un novedoso compuesto. Ningún otro compuesto representa las características estructurales del Mumbaistatin.

Zellkulturen GMBH), Mascheroder Weg IB, D-38124, Braunch eig, Alemania y se le ha dado el número de acceso DSM 11641. Así, la presente invención suministra además un proceso para la producción del novedoso compuesto nombrado Mumbaistatin y sus sales y derivados aceptables farmacéuticamente, de Streptomyces, especies HIL-008003, sus mutantes y variantes. Este proceso comprende el llevar a cabo el cultivo No. HIL-008003, sus mutantes o variantes, bajo condiciones aeróbicas, en un medio nutriente, que contiene una o más fuentes de carbono, y una o más fuentes de nitrógeno y, opcionalmente, sales inorgánicas nutrientes y/o elementos trazas, seguido por el aislamiento del compuesto y su purificación de una manera acostumbrada. El medio nutriente contiene preferiblemente fuentes de carbono, nitrógeno y sales inorgánicas nutrientes y, opcionalmente, elementos trazas. Las fuentes del carbono son, por ejemplo, el almidón, glucosa, sacarosa, dextnna, fructosa, melazas, glicerol, lactosa o galactosa, preferiblemente la glucosa. Las fuentes de nitrógeno son, por ejemplo, la harina de soya, la harina de cacahuate, extracto de levadura, extracto de carne de res, peptona, triptona, extracto de malta, licor de maiz macerado, gelatina o ácidos de casamino, preferiblemente la harina de soya y el licor de maíz macerado.

Las sales inorgánicas nutrientes y los elementos trazas son, por ejemplo, el hidrogen-fosfato de sodio, hidrogen-fosfato de potasio, cloruro de sodio, cloruro de cobalto, cloruro de calcio, carbonato de calcio, nitrato de potasio, sulfato de amonio o sulfato de magnesio, preferiblemente el cloruro de cobalto y el carbonato de calcio. El cultivo de HIL-008003 se lleva a cabo usualmente a temperaturas entre 25 y 30°C y a un pH entre 6.0 y 8.0. Preferiblemente, el cultivo No. HIL-008003 se realiza a 27°C (±1°C) y a un pH de 7.0. La fermentación del HIL-008003 se lleva a cabo preferiblemente durante 40 a 70 horas, cuando se obtiene un rendimiento óptimo del Mumbaistatin de la presente invención. Es particularmente preferido llevar a cabo la fermentación por aproximadamente 40 a 48 horas, bajo condiciones sumergidas, por ejemplo, en frascos agitadores, al igual que en fermentadores de laboratorio. Si se desea, se puede usar el ®Desmophen (óxido de polipropileno) como un agente antiespumante en los fermentadores. El progreso de la fermentación y la formación del Mumbaistatin pueden ser detectados midiendo la inhibición de la actividad de la translocasa del glucosa-6-fosfato en microsomas del hígado de rata sin tratar y perturbados con ©Tritón X-100, en placas microtituladoras, a la temperatura ambiente, usando un ensayo colorimético, como se describe en Methods in Enzymology 174, 58-67 (1989), con algunas modificaciones. En el caldo de cultivo resultante, el Mumbaistatin está presente primariamente en el filtrado de cultivo y puede así ser recuperado por extracción del filtrado de cultivo con un solvente inmiscible en agua, tal como, por ejemplo, el acetato de etilo, diclorometano, cloroformo o butanol, a un pH de 5 a 8, o por la cromatografía de interacción hidrofóbica. que usa las resinas poliméricas, tal como ®Diaion HP-20 (Mitsubishi Chemical Industries Limited, Japón), OAmberlite XAD (Rohm and Haas Industries, U.S.A.) o carbón activado o por la cromatografía de intercambio de iones, a un pH de 5 a 8. El método preferido es la adsorción sobre (SSDiaion HP-20, seguido por la desorción del compuesto, usando diluentes, tal como el agua, metanol, acetona, acetonitrilo, n-propanol, isopropanol, o sus combinaciones. La concentración y la liofilización del eluato activo suministra el compuesto crudo. El material crudo puede ser purificado ulteriormente usando cualquiera de las siguientes técnicas: por la cromatografía de fase normal usando la alúmina o el gel de sílice como la fase estacionaria y diluentes, tal como el acetato de etilo, cloroformo, metanol o sus combinaciones; por la cromatografía de fase inversa, usando el gel de silice de fase inversa, como el gel de dimetiloctadecilsililsílice, también nombrado RP-18, o el gel de dimetiloctilsililsílice, también nombrado RP-8, como la fase estacionaria, y diluentes, tal como el agua, reguladores, tal como el fosfato, acetato, citrato (pH de 2-8) , y solventes orgánicos, tal como el metanol, acetonitplo, acetona, tetrahidrofurano, o combinaciones de estos solventes; por la cromatografía de permeación de gel, usando resinas, tal como ©Sephadex LH-20 (Pharmacia Chemical Industries, Suecia), TSKgel ©Toypearl H -40F (TosoHaas, Toso Corporation, Japón) en solventes, tal como el metanol, cloroformo acetona, acetato de etilo, o combinaciones de estos solventes, o el ©Sephadex G-10 y G-25 en agua; o por la cromatografía en contra-corriente, usando un sistema de diluentes bifásico, obtenido de dos o más solventes, tal como el agua, metanol, etanol, isopropanol, n-propanol, tetrahidrofurano, acetona, acetonitrilo, cloruro de metileno, cloroformo, acetato de etilo, éter de petróleo, benceno y tolueno. Estas técnicas pueden ser usadas repetidamente, o una combinación de diferentes técnicas se pueden usar. El método preferido es la cromatografía sobre ©Toypearl, seguido por la gel de sílice modificada de fase inversa (RP-18) . El compuesto de Mumbaistatin puede ser convertido en sales y derivados aceptables farmacéuticamente, como los esteres y éteres y otros equivalentes químicos obvios, que ? . son todos cubiertos por la presente invención. La invención también cubre todas las sales y derivados del Mumbaistatin, que por si mismos no son adecuados para su uso como productos farmacéuticos, pero que pueden ser usados como productos intermedios en la preparación de las sales y derivados aceptables farmacéuticamente. La invención cubre el Mumbaistatin y todas sus sales y derivados en todas sus formas estereoisoméricas y tautoméricas. Las sales y derivados pueden ser preparados por procedimientos estándar conocidos por los expertos en la material Sales, como aquéllas de sodio y de potasio, por ejemplo, se pueden preparar tratando el Mumbaistatin con bases adecuadas de sodio o potasio. Los esteres pueden ser preparados, por ejemplo, por la reacción del Mumbaistatin con ácidos carboxílicos, en la presencia de reactivos, tal como la diciclo-hexilcarbodiimida (DCC) o tratando el compuesto con agentes de acilación, tal como los cloruros de ácido. Otros métodos de preparación de los esteres son dados en la literatura, por ejemplo, en J. March, Advanced Organic Síntesis, 4th Edición, John Wiley & Sons. 1992. Los esteres del Mumbaistatin, cubiertos por la presente invención, incluyen los esteres intramoleculares, es decir, las lactosas. Un compuesto específicamente mencionado como materia de la presente invención es el compuesto que se ha nombrado L970860 y las sales y derivados aceptables farmacéuticamente del mismo, en todas sus formas estereoisoméricas y tautoméricas, El compuesto L 970860 es una lactona que se puede obtener por el tratamiento del 5 Mumbaistatin con el ácido trifluoroacético. Tiene la fórmula molecular C2ßH?ßOn, y se caracteriza por una o más de sus propiedades físico-químicas y espectrales dadas abajo, tal como los datos espectroscópicos de la lH NMR ilustrados en el espectro de ? NMR en la Figura 7, y sus datos 0 espectroscópicos de 13C NMR, ilustrados en el espectro de l3C NMR en la Figura 8. La lactonización del Mumbaistatin para dar el L970860 puede ser usada con el fin de aislar o purificar el Mumbaistatin. Los éteres se pueden preparar, por ejemplo, del tratamiento de la diabetes mellitus, y, más generalmente, en el tratamiento o profilaxis de condiciones que son causadas por, o asociadas con, una actividad elevada de la translocasa del glucosa-6-fosfato, o de condiciones en las cuales se intenta reducir la actividad de la translocasa del glucosa-6-fosfato. El Mumbaistatin y sus sales y derivados aceptables farmacológicamente, pueden ser administrados a animales, preferiblemente a mamíferos, y en particular a humanos, como los propios productos farmacéuticos, en mezclas con otros y en la forma de composiciones farmacéuticas, que permitan la administración enteral o parenteral. Por lo tanto, la presente invención también se refiere al Mumbaistatin y sus sales y derivados aceptables farmacéuticamente, para el uso como productos farmacéuticos y para el uso del Mumbaistatin y sus sales y derivados aceptables farmacéuticamente en la producción de medicamentos para reducir la actividad de la tanslocasa del glucosa-6-fosfato, en particular en la producción de medicamentos para el tratamiento de la diabetes mellitus. La presente invención además se refiere a composiciones farmacéuticas que contienen una cantidad efectiva del Mumbaistatin y/o una o más de sus sales y/o derivados aceptables farmacéuticamente, junto con un portador aceptable farmacéuticamente.

El Mumbaistatin se puede administrar oral, intramuscular, intravenosamente o por cualquier otro modo de administración. Las composiciones farmacéuticas que contienen el Mumbaistatin o sus sales o derivados aceptables farmacéuticamente, en forma sencilla o en combinaciones, se pueden preparar de acuerdo con técnicas estándar, por la mezcla de los compuestos con uno o más excipientes y/o auxiliares aceptables farmacéuticamente, tal como, por ejemplo, rellenos, emulsionadores, lubricantes, agentes que ocultan sabores, colorantes o substancias reguladoras, y convertir la mezcla en una forma farmacéutica adecuada, tal como, por ejemplo, tabletas, tabletas recubiertas, cápsulas o una suspensión o solución adecuada para la administración enteral o parenteral. Ejemplos de auxiliares y/o excipientes, que pueden ser mencionados, son el almidón, goma de tragacanto, lactosa, talco, agar-agar, poliglicoles, etanol y agua.

Como es costumbre, la formulación galénica y el método de administración, al igual que la dosis, varían en forma adecuada a casos específicos, dependiendo de las especies que se van a tratar y del estado de la condición o 5 enfermedad respectiva, y se pueden optimizar usando métodos conocidos en la técnica. Aparte del uso como ingredientes activos farmacéuticamente y como intermediarios en la producción de derivados, el Mumbastatin y sus sales y derivados, pueden 10 también ser empelados como auxiliares para fines de diagnóstico, por ejemplo, en el diagnóstico in vitro, y para fines de investigación en investigaciones bioquímicas en que una inhibición de la translocasa del glucosa-6-fosfato es conveniente. 15 Los siguientes ejemplos son ilustrativos de la presente invención, pero no limitativos de su alcance. Abreviaturas: MeOH, metanol; DMSO, dimetilsulfóxido, TFA, ácido tpfluoroacético. ^^-aS-í-'-^^--* .,* Ejemplo 1 Aislamiento del cultivo HIL-008003 del suelo (a) Composición del medio de aislamiento de nutrientes Almidón de maíz 10.0 g Caseína 1.0 g Peptona 1.0 g Extracto de levadura 1.0 g K2HP04 0.5 g Polvo de agar 13.0 g Agua desmineralizada 1.0 litro pH 7.5 (b) Capa de suelo y aislamiento 10 g de suelo recogido del lecho del río Hiranysakeshi, cerca de Amboli, Maharashtra, India, se agregaron a 90 ml de agua desmineralizada esterilizada, en un matraz Erlenmeyer de 250 ml, el cual luego se agitó durante 2 horas en un sacudidor rotatorio (220 rpm) . La suspensión anterior del suelo luego se diluyó en serie en etapas, de 10 hasta 10~5. De la última dilución, 1 ml de la suspensión se colocaron en el centro de una caja de Petri de vidrio, estéril (15 cm de diámetro), en la cual luego se vaciaron aproximadamente 50 ml del medio de aislamiento anterior, suplementado con 25 µg/ml de anfotericina B, como un agente antifungal. El medio se enfrió a 45°C, antes de vaciar y la placa se agitó completamente en forma rotatoria.

La mezcla de la suspensión del suelo y el medio se dejaron asentar y se incubaron a 8°C (±1°C) durante 7 días. La caja de Petri se observó periódicamente y el cultivo de microorganismos No. HIL-008003 (cultivo No. Y-9645974) se aisló desde los microorganismos en crecimiento.

Ejemplo 2 Mantenimiento del Cultivo HIL-008003 El cultivo No. HIL-008003 se mantuvo en el siguiente medio: Extracto de malta 10.0 g Extracto de levadura 4.0 g Glucosa 4.0 g Polvo de agar 13.0 g Agua desmineralizada 1 litro pH 7.0 Después de disolver completamente los ingredientes, antes mencionados, por calentamiento, se distribuyeron en tubos de prueba y luego se esterilizaron a 121°C durante 20 minutos. Los tubos de prueba luego se enfriaron y se dejaron solidificar en una posición inclinada. Los tubos de agar inclinados se marcaron con el crecimiento del cultivo No. HIL-008003 por un lazo de alambre y se incubaron a 28°C (± 1°C) hasta observar un buen -frpíi' - tf~"~—°~* crecimiento. Los cultivos crecidos en las cavidades se almacenaron en un refrigerador a 8°C.

Ejemplo 3 Fermentación del cultivo HIL-008003 en frascos agitadores Composición del medio de siembra: Glucosa 15.0 g Harina de soya 15.0 g Licor de maíz macerado 5.0 g NaCl 5.0 g CaC03 2.0 g Agua desmineralizada 1.0 litro pH 7.0 El medio de siembra anterior se distribuyó en cantidades de 80 ml en matraces Erlenmeyer de 500 ml, y se sometieron a autoclave a 121 °C durante 20 minutos. Los matraces se enfriaron a la temperatura ambiente y cada matraz luego se inoculó con un ciclo completo del cultivo de crecimiento en cavidad, mencionado anteriormente, del Ejemplo 2, y se agitó en un sacudidor rotatorio durante 72 horas a 240 rpm y a 27 °C (± 1°C) para dar el cultivo de siembre.

Composición del medio de producción: ¡gBtt-5-f.-s. •sMßBl áS fekz. „. . _aa£»a, Glucosa 20.0 g Harina de soya 10.0 g CaC03 0.2 g Cloruro de cobalto 0.001 g Agua desmineralizada 1 litro pH 7.0.

El medio de producción se distribuyó en cantidades de 60 ml en matraces Erlenmeyer de 500 ml y se sometió a autoclave a 121°C durante 20 minutos. Los matraces se enfriaron a la temperatura ambiente y luego se inocularon con el cultivo de siembra, antes mencionado (1% en volumen/volumen) . La fermentación se llevó a cabo en un sacudidor rotatorio a 240 rpm, y a una temperatura de 27°C (± 1°C) durante 40 a 48 horas. La producción del Mumbaistatin se vigiló midiendo la inhibición de la translocasa del glucosa-6-fosfato. Después de cosechar, el caldo de cultivo se centrífugo y el Mumbaistatin se aisló del filtro de cultivo y se purificó como se describe en el Ejemplo 5.

Ejemplo 4 Fermentación del cultivo HIL-008003 en fermentadores Etapa 1 : Preparación del cultivo de siembra en matraces de vibración. El medio de cultivo del Ejemplo 3 se distribuyó en cantidades de 160 ml en matraces Erlenmeyer de 1 litro y se sometieron a autoclave durante 20 minutos. El cultivo de siembra creció en estos matraces, como se describió en el Ejemplo 3. Etapa 2: Preparación del cultivo de siembra en el fermentador 80 litros del medio de siembra, como se describió en el Ejemplo 3, en un fermentador Marubishi de 100 litros, se esterilizaron in si tu durante 45 minutos, a 121°C, se enfriaron a 27°C ±1° C y se sembraron con 4.5 litros del cultivo de siembra, antes mencionado. La fermentación se realizó con los siguientes parámetros: Temperatura 27°C (± 0.5°C) Agitación 80 rpm Aeración 50 Ipm Tiempo de cosecha 24 horas. a-*-.. **** *-.. ^M^ I?ÍHIÍ nrMM lllT - ? P* Etapa 3: Fermentación a gran escala 700 litros del medio de producción, como se describió en el Ejemplo 3, en un fermentador Maruhishi de 1000 litros, junto con 150 ml de ©Desmophen (óxido de polipropileno) , como un agente antiespumante, se esterilizaron ín si tu durante 45 mininitos, a 121°C, se enfriaron a 27°C ± 1°C y se sembraron con 75 litros del cultivo de siembre de la Etapa 2. La fermentación se realizó con los siguientes parámetros: Temperatura 27°C (± 0.5°C) Agitación 50 rpm Aeración 450 Ipm Tiempo de cosecha 40-44 horas La producción del compuesto se vigiló midiendo la inhibición de la translocasa del glucosa-6-fosfato. Cuando se discontinuó la fermentación, el pH del caldo de cultivo fue de 5.0 a 7.0. Este caldo de cultivo se centrífugo después de cosechar y el Mumbaistatin, inhibidor de la translocasa del glucosa-6-fosfato se aisló del filtrado de cultivo, como se describe abajo en el Ejemplo 5.

Ejemplo 5 Aislamiento y purificación del Mumbaistatin Aproximadamente 1000 litros del caldo de cultivo se cosecharon y separaron del micelio (12 kg) por centrifugación. El compuesto deseado, el Mumbaistatin, se encontró estaba presente primariamente en el filtrado del cultivo. Este filtrado del cultivo (730 litros) se pasó a través de una columna de ©Diaion HP-20 (28 litros, 3-4% volumen/volumen) . La columna se lavó completamente con agua desmineralizada (250 litros) y luego se diluyó con un gradiente de paso de MeOH en agua. Así la dilución se hizo con 10% de MeOH (120 litros) y 40% de MeOH (300 litros) . Las fracciones se recogieron en lotes de 15 litros. Los eluatos activos (15 x 16 litros) obtenidos con 40% de MeOH se combinaron, concentraron bajo presión reducida de 10 a 100 mm de Hg a 35°C y se liofilizaron, para suministrar 240 g presión reducida de 10-100 mm de Hg a 35°C y se liofilizaron para suministrar 20 g de material enriquecido, que muestra una CI5o de 1 µg/ml . El material enriquecido, así obtenido, se purificó por dos cromatografías sucesivas de permeación de gel. Así el material enriquecido anterior se pasó separadamente en 4 lotes de 5 g cada uno, a través de ©Sephadex LH-20 (1.5 litros), empacado en una columna de vidrio de 4 cm x 120 cm. La fase móvil fue de agua y el régimen de flujo se mantuvo en 2.5 ml/min. Las fracciones se recogieron en un tamaño de 25 ml . Los eluatos activos se vigilaron por cromatografía HPLC en una columna de ©Lichrocart 100 RP-18 (250 mm x 4 mm) , usando un gradiente de 0.1% de TFA acuoso a CH3CN en 20 min, a un régimen de flujo de 1 ml/min y la detección a 270 nm. Los eluatos activos con el componente deseado se agruparon y concentraron bajo presión reducida de 10 a 100 mm de Hg, a 35°C, y se liofilizaron para obtener 1 g de material altamente enriquecido con una CI50 de 0.1 a 0.3 µg/ml . El material anterior se pµrificó además en 2 lotes de 500 mg cada uno, pasando a través de ©Sephadex LG-20, empacado en una columna de vidrio (2.5 x 110 cm) . La fase móvil fue de agua y el régimen de flujo se mantuvo en 0.5 ml/min. Las fracciones se recogieron en un tamaño de 6 ml . Las fracciones se agruparon con base en la cromatografía HPLC (con las condiciones antes mencionadas) . Las fracciones activas con el compuesto deseado se agruparon, concentraron bajo presión reducida de 10 a 100 mm de Hg, a 35°C, y se liofilizaron para obtener 160 mg de un compuesto semi-puro, que tiene una CI5o de 0.06 µg/ml. Finalmente, el material semí-puro se purificó por la cromatografía HPLC preparativa sobre una columna ©Eurosphere 100 C 18, lOµ (250 x 16 mm) , usando un gradiente del 5% de metanol en agua, a 40% de metanol en agua, en 30 minutos. El régimen de flujo se mantuvo en 6 ml/min y la detección fue de 270 nm, para obtener el Mumbaistatin (70 mg) . El Mumbaistatin dio pobre calidad de los espectros de íH NMR y 13C NMR. La caracterización del compuesto principal, el Mumbaistatin, por lo tanto se basó primariamente en el análisis espectral de la lactona L970860, que se obtuvo por el tratamiento del Mumbaistatin con TFA, usando el método descrito en el Ejemplo 6.

Ejemplo 6 Preparación de la lactona L970860 A 70 g del Mumbaistatin, disueltos en metanol (5 ml) , se agregó 0.1% de TFA, y la mezcla de reacción se calentó durante 1 hora a 50°C. La mezcla luego se evaporó bajo presión reducida de 10 a 100 mm de Hg, a 35°C, hasta la sequedad. El producto de reacción, así obtenido, se purificó por la cromatografía de HPLC preparativa, sobre una columna ©Eurosphere 100, C18, 10µ(250 mm x 16 mm) , usando un gradiente del 30% de CH3CN en 0.1% de TFA al 80% de CH3CN en 0.1% de TFA en 20 minutos, a un régimen de flujo de 6 ml/minuto y detección de 270 nm para dar la L970860 pura (55 mg) . Las propiedades físico-químicas y espectrales del Mumbaistatin y la lactona L970860 se resumen en la Tabla 1. Los datos espectroscópicos de los compuestos se dan en las Figuras 2, 3 y 5 a 10 de los dibujos. Las Figuras 1 y 4 muestran los cromatogramas de la HPLC. Los contenidos de los dibujos individuales se indican en la Tabla 1. Tabla 1 Tabla 1 (Continuación) Caracterización farmacológica del Mumbaistatin y la lactona L970860 El Mumbaistatin inhibe potentemente la actividad de la translocasa del glucosa-6-fosfato microsomal del hígado de la rata, con un CI50 de aproximadamente 25 nM. EN contraste, el Mumbaistatin inhibe la actividad de la fosfatasa en microsomas perturbados con detergentes con una CI50 de aproximadamente >100 µM, que indica un alto grado de especificidad para la translocasa. Además, el Mumbaistatin no afecta la actividad de la tanslocasa del fosfato / «* **. ».. - 111 -"rrriimia-fitilrTi pirofosfato. El Mumbaistatin es un inhibidor reversible y competitivo de la translocasa del glucosa-6-fosfato. Se evaluó además el Mumbaistatin en hepatocitos de rata aislados en su efecto sobre la producción de glucosa.

Inhibe tanto la gluconeogénesis inducida por la fructosa como la glicogenólisis inducida por el glucagon, con valores de CI50 de aproximadamente 0.3 uM y 0.6µM, respectivamente. La L970860 inhibe la actividad de la translocasa del glucosa-6-fosfato microsomal del hígado de la rata, con 10 una CI50 de aproximadamente 1.8 µM. -*-~—~«="¿- -*-—- "*"• -

Claims (9)

1. REIVINDICACIONES 1. El Mumbaistatin, un compuesto de la fórmula molecular: C28H20O12, caracterizado por su espectro H NMR
2. (Figura 9) y su espectro de 13C NMR (Figura 10) y sus sales y derivados aceptables farmacéuticamente, en sus formas estereoisoméricas y tautoméricas. 2. El Mumbaistatin, un compuesto de la fórmula molecular: C28H20O12, que se puede obtener por el cultivo de las especies del microorganismo Streptomyces HIL-008003 (DSM 11641), bajo condiciones aeróbicas, en un medio nutriente que contiene fuentes de carbono y nitrógeno, seguido por el aislamiento y purificación, de una manera acostumbrada, y sus sales y derivados aceptables farmacéuticamente, en todas sus formas estereoisoméricas y tautoméricas.
3. 3. La lactona, L970860, un compuesto de la fórmula molecular: CzßH?ßOu, cauterizada por su espectro de 1H NMR (Figura 7) y su espectro 13C NMR (Figura 8), y sus sales y derivados aceptables farmacéuticamente, en todas sus formas estereoisoméricas y tautoméricas.
4. 4. Un proceso para la producción del Mumbaistatin, según se reclama en la reivindicación 1 o la reivindicación 2, o la lactona L970860, según se reclama en la reivindicación 3, o una al o derivado del Mumbaistatm o la lactona, que comprende el cultivo de las especies del microorganismo Stpreptomyces HIL-008003 (DSM 11641), bajo condiciones aeróbicas, en un medio nutriente, que contiene fuentes de carbono y nitrógeno, seguido por el aislamiento y purificación del Mumbaistatin, en una manera acostumbrada y, opcionalmente, convertir en la lactona L970860, o una sal o derivado del Mumbaistatin o de la lactona.
5. 5. Las especies de Streptomyces HIL-008003 (DSM 11641) .
6. 6. El Mumbaistatin, según se reclama en la reivindicación 1 o la reivindicación 2, o la lactona L970860, según se reclama en la reivindicación 3, o una sal o derivado, aceptable farmacéuticamente, del Mumbaistatin o la lactona, para su uso como un producto farmacéutico.
7. 7. Una composición farmacéutica, que comprende una cantidad efectiva del Mumbaistatin, según se reclama en la reivindicación 1 o la reivindicación 2, o la lactona L970860, según se reclama en la reivindicación 3, o una sal o derivado, aceptable farmacéuticamente, del Mumbaistatin o la lactona, y un portador aceptable farmacéuticamente.
8. 8. El Mumbaistatin, según se reclama en la reivindicación 1 o la reivindicación 2, o la lactona L970860, según se reclama en la reivindicación 3, o una sal o derivado, aceptable farmacéuticamente, del Mumbaistatin o la lactona, para su uso como un inhibidor de la translocasa del glucosa-6-fosfato.
9. 9. El Mumbaistatin, según se reclama en la reivindicación 1 o la reivindicación 2, o la lactona L970860, según se reclama en la reivindicación 3, o una al o derivado aceptable farmacéuticamente, del Mumbaistatin o la lactona, para su uso en el tratamiento de la diabetes mellitus.