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CN1961069A - 获得间充质干细胞的方法 - Google Patents

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CN1961069A
CN1961069A CNA200580012239XA CN200580012239A CN1961069A CN 1961069 A CN1961069 A CN 1961069A CN A200580012239X A CNA200580012239X A CN A200580012239XA CN 200580012239 A CN200580012239 A CN 200580012239A CN 1961069 A CN1961069 A CN 1961069A
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human tissue
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Abstract

本发明涉及细胞生物学领域。详细地说，涉及从人类组织中获得间充质干细胞。本发明可能用于多种疾病的治疗。由于本发明，将有可能从人类组织中获得具有高均质性细胞悬液的间充质干细胞，因为用于从人类组织中获得间充质干细胞的方法包括将所述组织进行破碎并且用胶原酶在Dulbecco改进Eagle培养基中的溶液进行酶处理，利用裂解溶液除去红细胞，随后过滤所制得的悬液；使用脂肪组织或蜕膜或羊膜或绒毛膜胎盘基质作为人类组织，并先后利用包括100μm和10μm孔径的滤器进行过滤。在脂肪组织、胎盘蜕膜或羊膜的酶处理中使用I型胶原酶，而在绒毛膜胎盘基质的酶处理中使用IV型胶原酶。

Description

获得间充质干细胞的方法
本发明涉及细胞生物学领域。详细地说，涉及从人类组织中获得间充质干细胞。本发明可能用于多种疾病的治疗。
当前在生物医学中有一个新的领域正在发展：细胞治疗。利用细胞移植可以纠正组织功能活性不足，并且可以使受累器官再生。更新和恢复的功能由体内的干细胞接管，干细胞形成所储备的不同细胞型的未分化前体的聚集。因此，干细胞的应用是一个有前途的细胞治疗领域。对于该应用，特别重要的是从人类组织中获得干细胞。
目前人们已经成功地从成人体中获得了不同类型的干细胞。详细地说，涉及造血干细胞(血细胞的前体)、神经元干细胞(神经组织细胞的前体)、间充质干细胞(能够分化为间充质来源的细胞以及分化为其他胚层细胞的细胞)等。
间充质干细胞的特征在于它们能够比较容易地获得和培养；它们还能够在体外增殖较长的一段时间。另外，它们具有广谱分化。在这方面特别注意的是从成人体中获得间充质干细胞。但是，迄今为止还没有用于获得干细胞的通用方法。
第一次，由于干细胞能够粘附于培养皿表面而得以从脊髓中获得(Fridenshtein A.J.，Deriglazova U.F.，Kulagina N.N.等.Precursors forfibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected bythe in vitro colony assay method(通过体外集落测定法检测的不同造血细胞群体中的成纤维细胞前体).Exp.Hematol.1974 Vol.2.P.83-92)。
该方法的缺点在于获得的细胞群体缺乏均质性。但是，间充质干细胞对塑料的粘附已经被确定为进一步改进获得间充质干细胞的方法的基础。
已知一种用于获得间充质干细胞的方法是基于通过使用特定批次的胎牛血清，细胞能够粘附于培养皿表面的能力。因此设法获得了具有高粘附能力、高增殖速度和长时间保持的多能性的细胞(Heynesworth S.E.，Goshima J.，Goldberg V.M.，Calplan A.I.Characterization of cells with osteogenic potential from the human bonemarrow(来自人骨髓的具有成骨能力的细胞的表征)//Bone.1995.Vol.13.P.81-85)。
该方法的缺点在于，在寻找适合细胞培养的批次的过程中对血清的分析需要足大量的时间和劳动；而且，结果的再现是不可能的。
众所周知利用进行抗Stro-1(具有未知功能的抗原)抗体选择的方法获得间充质干细胞，Stro-1在间充质干细胞表面短暂表达(Grontos S.，Simmons P.J.The growth factors requirements of Stro-1positive human stromal precursors under serum-deprived conditions invitro(在体外的除去血清的条件下Stro-1阳性人基质前体的生长因子需求)//Blood.1995.Vol.85.P.929-940)。
该方法涉及极其复杂的过程，由于前期的抗体制备，是非常费时的。
已知一种用于获得间充质干细胞的方法是通过在Ficoll梯度中离心获得单核细胞，选择针对在间充质干细胞表面上表达的表面抗原CD105的抗体，以及培养粘附于塑料的细胞。CD105+细胞的比例占单核细胞的2-3％。结果有可能获得一个细胞群体，该细胞群体显示间充质干细胞特有的形态学和表面抗原表达谱并且还具有软骨形成(chondregenic)能力(Majumdar M.K.，Banks V.，Peluso D.P.，Morris E.A.Isolation，characterization，and chondregenic potential of human bone marrow-derivedmultipotential stromal cells(人骨髓来源的多能基质细胞的分离、表征和软骨形成能力)//J.Cell.Physiol.2000.Vol.185.P.98-106)。
该方法能够获得富含间充质干细胞的CD105+细胞级分，但是该方法需要额外的选择阶段，在该选择阶段中使用固定于磁珠上的抗体。因此损失掉一部分细胞，从而需要额外的劳动。
众所周知，随着年龄的增长，人体中的间充质干细胞的数目显著减少。它们的增殖和分化能力也降低(Rao M.S.，Mattson M.P.Stemcell and aging：expanding the possibilities(干细胞与老化：扩大可能性)//Mech.Ageing Dev.2001.Vol.122.P.713-734)。由于这个原因，人们正在研究具有高增殖活性和分化能力的间充质干细胞的制备，例如分别来源于胎儿组织或幼年器官。
本领域中已知一种用于从胎儿后代血液中获得间充质干细胞的方法。为了获得它们，通过在Ficoll梯度中离心制备单核细胞级分，并且在有利于间充质干细胞生长的条件下进行培养。这样获得的细胞分别显示骨形成或脂肪形成能力(Campagnoli C.，Roberts I.A.，Kumar S.等.Identification of mesenchymal stem/progenitor cells in human first trimesterfetal blood，liver，and bone marrow(人妊娠早期胎儿血液、肝脏和骨髓中间充质干细胞/祖细胞的鉴定)//Blood.2001.Vol.98.P.2396-2402)。
从该来源中获得间充质干细胞的缺点在于胎儿组织在获取方面存在问题。而且，人们不得不面对与其使用相关的伦理问题。此外，已经证实这样获得的细胞群体不是均质性的：76％的样品含有破骨细胞样细胞；它们表达特有的抗原CD45、CD51/CD61，并且是CD64(巨噬细胞的标记)、SH2(间充质干细胞的标记)、CD31(内皮细胞的标记)阴性的。只有26％的样品由类似于间充质干细胞的细胞组成，并且表达SH2、SH3、SH4、MAB1470、CD13、CD29、CD49e、CD54、CD90、ASMA，并且是CD31和vWF(内皮细胞的标记)阴性的。
已知用于从脐静脉的内皮下层获得间充质干细胞的方法(RomanovY.A.，Svinitskaya V.A.，Smirnov V.N.Searching for alternative sources ofpostnatal human mesenchymal stem cells；candiate MSC-like cells fromumbilical cord(寻找出生后人类间充质干细胞的替代来源；来自脐带的候选MSC样细胞)//Stem Cells.2003.Vol.21.P.105-110)。为了这些目的，用胶原酶IV溶液内部短时间(15分钟)处理脐静脉。这样获得的细胞在添加10％FBS的DMEM-LG中培养。这样，获得具有成纤维细胞样形态学的细胞群体；它表达类似于间充质干细胞的一系列抗原：ICAM1+/-、VCAM1+、CD34-；MySM-(平滑肌肌球蛋白)；CD31-、vWF-(内皮细胞的标记)；CD14-、CD45-、CD68-(单核细胞/巨噬细胞的标记)，但是它表达平滑肌纤维肌动蛋白ASMA。这样获得的细胞群体在体外显示骨形成或脂肪形成能力。
该方法的缺点在于获得的细胞群体的异质性：初级培养物中含有内皮细胞和平滑肌细胞，内皮细胞在这些条件下不增殖，而肌细胞部分在培养中保持。
在本领域中已知一种用于从人脂肪抽出物(lipoaspirate)中获得间充质干细胞的方法。在该方法中将切成小片的脂肪组织暴露于胶原酶(I型)的作用下。在中和胶原酶并且漂洗细胞悬液后进行纯化，以利用孔径为100μm的滤器除去细胞残余物。这样，能够获得显示特有的形态学、免疫表型并且能够分别分化为骨、软骨、脂肪、肌肉或神经组织的间充质干细胞群体(Zuk P.A.，Zhu M.，Ashjian P.，De Ugarte D.D.，HuangJ.I.，Mizuno H.，Alfonso Z.C.，Fraiser J.K.Benhaim P.和Hedrick M.H.Human adipose tissue is source of multipotent stem cells(人脂肪组织是多能干细胞的来源)//Molecular Biology of the Cell.2002.Vol.13.P.4279-4295)。
该方法具有所获得的细胞悬液为异质性的并且产量低的缺点。
利用本发明，现在能够从人类组织中获得间充质干细胞，而该细胞悬液具有高均质性。
针对此背景，本发明的一个目的是一种用于从人类组织中获得和/或分离间充质干细胞的方法，包括以下步骤：(a)提供人类组织，(b)通过酶和机械方法处理所述人类组织，获得细胞悬液，(c)从所述悬液中除去红细胞，和(d)过滤所述悬液，获得间充质干细胞，其中在步骤(a)中使用脂肪组织和/或胎盘组织作为人类组织。
在用于从人类组织中获得间充质干细胞的方法的范围内，使用脂肪组织或胎盘作为人类组织。该方法可以包括将所述组织进行破碎并且用胶原酶在Dulbecco改进Eagle培养基中的溶液进行酶处理，利用裂解缓冲液除去红细胞，随后过滤所获得的悬液。过滤可以先后利用包括100μm和10μm孔径的滤器进行。过滤步骤可以利用包括直径约100μm孔径的第一滤器进行，然后利用包括直径10μm孔径的第二滤器进行。
I型胶原酶可以用于对脂肪组织、胎盘的蜕膜或羊膜进行酶处理。对于绒毛膜胎盘基质的酶处理可以使用IV型胶原酶。
本发明的技术结果(细胞悬液均质性的提高，目标产物产量的提高，和细胞生存力的改善)可归因于过滤条件，即所用滤器的滤孔的特定大小和孔的特定比例。这些参数的改变(增加或减少)将造成所述技术结果不能实现，因为在这种情况下，目标产物的产量和所获得的细胞悬液的均质性将显著降低。与已知的类似方法相比，能够获得倍增的细胞产量。据申请人所述，通过进行已知的方法，产量为每个质量为1克的组织样品得到104个细胞，而通过进行本发明的方法，细胞的产量达到每个1克的组织样品得到1.5-3×104至107个细胞。细胞悬液均质性的提高通过形态学分析数据和免疫表型的确定而得到证明。根据申请人的数据所示，利用已知的从脂肪抽出物中获得间充质干细胞群体的方法，该群体含有多种形态学的细胞型；在第4次传代之前，培养物不会分别在细胞形状和表面标记的颗粒化或表达方面成为均质的。
该方法如下实现：
首先，用添加有抗生素(青霉素100单位/ml，链霉素100微克/ml)和抗真菌剂(两性霉素B 0.25微克/ml)、不含Ca2+和Mg2+离子、含有pH7.2磷酸缓冲液(PBS)的生理盐水溶液漂洗组织样品。将待处理的组织切成小片；以1∶5至1∶10的组织：培养基体积比加入含有上述抗生素和抗真菌剂的Dulbecco改进的eagle培养基(DMEM，Dulbecco改进的Eagle培养基)。为了酶处理，向悬液中加入胶原酶溶液直到终浓度达到0.075％。该悬液在37℃下温育30分钟，同时轻轻振荡该悬液。
将这样制备的混合物进行搅拌，直到产生均质的悬液；然后为了中和胶原酶，向制备的混合物中加入等体积的DMEM培养基，其中含有10体积％的胎牛血清(FBS)。之后于1000g离心10分钟。将沉淀物重悬浮于红细胞裂解缓冲液(155mM NH4Cl，10mM KHCO3，0.1mMNa2EDTA)中。将该混合物充分混合，在室温下温育3-5分钟。
用等体积的含有抗生素和抗真菌剂的DMEM培养基稀释该悬液；随后于1000g离心10分钟沉淀细胞。沉淀物用DMEM培养基漂洗，按照所述方法离心再次沉淀。将细胞悬浮于DMEM-LG培养基中，该培养基含有浓度为1g/l的葡萄糖，添加了20％FBS、抗生素和抗真菌剂。利用包括100μm和10μm孔径的滤器过滤这样制备的细胞悬液，每1cm2涂布1百万个细胞。
这样获得的细胞群体的特征在于间充质干细胞具有高均质性，而过滤数据的改变(孔径的增大和/或减小)分别导致目标产物的均质性或细胞产量降低。
针对此背景，本发明的另一个目的是使用人类脂肪组织和/或胎盘组织作为用于获得和/或分离间充质干细胞的来源。
本发明通过以下实施方案加以说明：
实施例1
利用小剪子从胎盘上分离蜕膜。2g组织样品用不含Ca2+和Mg2+离子的pH 7.2的PBS(Gibco)漂洗三次，该PBS分别含有一倍的抗生素或抗真菌剂(Gibco)溶液，其中青霉素的终浓度为100单位/ml，链霉素为100微克/ml，两性霉素B为0.25微克/ml。
用剪子将组织在培养皿中剪成小片；然后加入体积为25ml的含有抗生素和抗真菌剂的DMEM培养基(Gibco)；将该组织重新悬浮，加至50ml试管(Costar)中。
为了酶处理，向这样制备的悬液中加入1ml含有2％I型胶原酶(Gibco)的溶液，直到达到0.075％的终浓度。该悬液在振荡器中37℃温育30分钟，同时应当进行缓慢振荡。
将该混合物充分搅拌，直到产生均质的悬液；之后向该混合物中加入25ml含有10％FBS(HyClone，PerBio)的DMEM培养基，以中和胶原酶。通过于1000g离心10分钟沉淀细胞。
弃去上清液。为了裂解红细胞，将沉淀物重悬浮于20ml含有155mM NH4Cl，10mM KHCO3，0.1mM Na2EDTA的冷缓冲液中。将该混合物充分搅拌，并且在室温下温育3-5分钟。
这样制备的悬液用25ml含有抗生素和抗真菌剂(Gibco)的DMEM培养基稀释；然后于1000g离心10分钟沉淀细胞。
吸出上清液。将细胞上清液悬浮于DMEM培养基中进行洗涤。于1000g离心10分钟沉淀细胞
将这样制备的细胞沉淀物悬浮于25ml DMEM-LG培养基中，该培养基中含有浓度为1g/l的葡萄糖(Gibco)，并且添加了20％FBS(HyClone，PerBio)、一倍必需氨基酸溶液(Gibco)以及一倍抗生素和抗真菌剂溶液(100单位/ml青霉素，100微克/ml链霉素，0.25微克/ml两性霉素B，Gibco)。
先后利用包括100μm和10μm孔径的滤器(Millipore)过滤该细胞悬液，以清除细胞残余物和碎片。
在Gorjajev室中计算纯化细胞的数目。细胞总产量为108/1g组织。将细胞以各1百万/1cm2的密度接种于75cm2培养瓶中。粘附细胞的比例为约1％；从蜕膜获得间充质干细胞的产量为大约106/1g组织。
24小时后，将细胞培养基更换为新鲜培养基。一旦达到单层，即将细胞传代培养，并且利用相差显微镜目视评价其形态学；计算有丝分裂指数和细胞世代时间。
基于形态学分析，根据表型确定了两个主要的细胞群体。第一个细胞型呈现为梭形细胞，直径为15-35μm，具有均质的细胞质，低核：质比，由4至7个核仁组成的中心核。第二个类型包括较大的成纤维细胞样延展细胞，其直径为90μm，含有不同均质性的细胞质；具有低核：质比，含有2至4个核仁的中心核。因此，所分析的细胞具有人类间充质干细胞特有的形态学。
在对数生长期计算有丝分裂指数，即有丝分裂数与细胞总数的比值。有丝分裂指数为29.5‰。细胞世代时间为29小时。
将这样获得的细胞进行免疫表型分析，包括用抗表面抗原CD10、CD13、CD31、CD34、CD44、CD45、CD90、CD105、CD 117的抗体(BectonDickinson)染色，同时使用间接荧光。利用流式细胞仪(Beckman Coulter)进行评价。表面标记表达对应于间充质干细胞的免疫表型：这些细胞是CD13、CD44、CD90、CD105阳性的和CD31、CD34、CD45、CD117阴性的。CD10的表达为中度阳性(表1)。
表1.来自胎盘蜕膜的间充质干细胞表面上表面抗原的表达
  来自蜕膜的间充质干细胞的免疫表型
  CD   ％
  CD10   50.30
  CD13   87.00
  CD31   1.50
  CD34   1.30
  CD44   95.90
  CD45   3.40
  CD90   93.70
  CD105   95.50
  CD117   7.00
实施例2
用小剪子从胎盘上分离绒毛膜基质。5g组织样品用不含Ca2+和Mg2+离子的pH 7.2的PBS(Gibco)漂洗三次，该PBS(Gibco)含有一倍的抗生素和抗真菌剂溶液(Gibco)。青霉素的终浓度为100单位/ml，链霉素为100微克/ml，两性霉素B为0.25微克/ml。
用剪子将该组织在10cm培养皿中剪成小片；然后加入25ml的含有抗生素和抗真菌剂的DMEM培养基(Gibco)；然后将该组织悬浮，加至50ml试管(Costar)中。
为了酶处理，向这样制备的悬液中加入1ml 2％IV型胶原酶(Gibco)的溶液，直到达到0.075％的终浓度。该悬液在振荡器中在缓慢振荡下37℃温育30分钟。
将这样制备的混合物充分搅拌，直到产生均质的悬液；之后加入25ml含有10％FBS(HyClone，PerBio)的DMEM培养基，以中和胶原酶。于1000g离心10分钟沉淀细胞。
弃去上清液。为了裂解红细胞，将沉淀物重悬浮于20ml含有155mM NH4Cl、10mM KHCO3、0.1mM Na2EDTA的冷缓冲液中。将该混合物充分搅拌，并且在室温下温育3-5分钟。
该悬液用体积为25ml的含有抗生素和抗真菌剂(Gibco)的DMEM培养基稀释；然后于1000g离心10分钟沉淀细胞。
吸出上清液。为了洗涤细胞残余物，将后者悬浮于DMEM培养基中。于1000g离心10分钟沉淀细胞。
将这样制备的细胞沉淀物悬浮于25ml DMEM-LG培养基中，该培养基中含有浓度为1mg/ml的葡萄糖(Gibco)，并且添加了20％FBS(HyClone，PerBio)、一倍必需氨基酸溶液(Gibco)以及一倍抗生素和抗真菌剂溶液(100单位/ml青霉素，100微克/ml链霉素，0.25微克/ml两性霉素B，Gibco)。
该细胞悬液先后利用包括100μm和10μm孔径的滤器(Millipore)过滤，以清除细胞残余物和碎片。
通过在Gorjajev室中评价计算纯化细胞的数目。细胞总产量为109/1g组织。将细胞以1百万/1cm2的密度接种于75cm2培养瓶中。粘附细胞的比例为约1％；从绒毛膜基质获得间充质干细胞的产量达到大约107/1g组织。
24小时后，将细胞培养基更换为新鲜培养基。一旦达到单层，即将细胞传代培养，并且利用相差显微镜目视评价其形态学；计算有丝分裂指数和细胞世代时间。
形态学分析的结果是，根据表型鉴定了两个主要的细胞群体。第一个细胞型呈现为梭形细胞，直径为20-40μm，具有均质的细胞质，低核：质比，由4至7个核仁组成的中心核。第二个类型包括较大的成纤维细胞样延展细胞，其直径为100μm，含有不同均质性的细胞质；具有低核：质比，含有2至4个核仁的中心核。因此，所分析的细胞具有人类间充质干细胞特有的形态学。
在对数生长期计算有丝分裂指数：有丝分裂数与细胞总数的比值。有丝分裂指数为31.8‰。细胞世代时间为28小时。
将这样获得的细胞进行免疫表型分析，包括用抗表面抗原CD10、CD13、CD31、CD34、CD44、CD45、CD90、CD105、CD117的抗体(BectonDickinson)染色，同时使用间接荧光。利用流式细胞仪(Beckman Coulter)进行评价。表面标记表达对应于间充质干细胞的免疫表型。这些细胞是CD13、CD44、CD90、CD105阳性的和CD31、CD34、CD45、CD117阴性的。CD10的表达为中度阳性(表2)。
表2.来自绒毛膜胎盘基质的间充质干细胞表面上表面抗原的表达
  来自绒毛膜基质的间充质干细胞的免疫表型
  CD   ％
  CD10   84.40
  CD13   90.90
  CD31   0.20
  CD34   0.30
  CD44   97.60
  CD45   1.50
  CD90   95.30
  CD105   92.70
  CD117   3.90
实施例3
用小剪子从胎盘上分离羊膜。质量为2g的组织样品用不含Ca2+和Mg2+离子的pH 7.2的PBS(Gibco)漂洗三次，该PBS(Gibco)分别含有一倍的抗生素或抗真菌剂溶液(Gibco)。青霉素的终浓度为100单位/ml，链霉素为100微克/ml，两性霉素B为0.25微克/ml。
用剪子将组织在10cm培养皿中剪成小片；然后加入体积为25ml的含有抗生素和抗真菌剂的DMEM培养基(Gibco)；然后将该组织悬浮，转移到50ml试管(Costar)中。
为了酶处理，向这样制备的悬液中加入1ml 1％I型胶原酶(Gibco)溶液，直到达到0.075％的终浓度。该悬液在振荡器中在缓慢振荡下37℃温育30分钟。
将这样制备的混合物充分搅拌，直到产生均质的悬液；之后加入25ml含有10％FBS(HyClone，PerBio)的DMEM培养基，以中和胶原酶。于1000g离心10分钟沉淀细胞。
弃去上清液。为了裂解红细胞，将沉淀物重悬浮于20ml含有155mM NH4Cl、10mM KHCO3、0.1mM Na2EDTA的冷缓冲液中。将该混合物充分搅拌，并且在室温下温育4分钟。
这样制备的悬液用体积为25ml的含有抗生素和抗真菌剂(Gibco)的DMEM培养基稀释；然后于1000g离心10分钟沉淀细胞。
弃去上清液。将细胞沉淀物悬浮于DMEM培养基中进行洗涤。于1000g离心10分钟沉淀细胞。
将这样制备的细胞沉淀物悬浮于25ml DMEM-LG培养基中，该培养基中含有浓度为1g/l的葡萄糖(Gibco)，并且添加了20％FBS(HyClone，PerBio)、一倍必需氨基酸溶液(Gibco)以及一倍抗生素和抗真菌剂溶液(100单位/ml青霉素，100μg/ml链霉素，0.25μg/ml两性霉素B，Gibco)。
然后先后利用包括100μm和10μm孔径的滤器(Millipore)过滤细胞悬液。通过在Gorjajev室中计算评价纯化细胞的数目。细胞总产量为108/1g组织。将细胞以1百万/1cm2的密度接种于75cm2培养瓶中。粘附细胞的比例为约1％；从羊膜获得间充质干细胞的产量达到大约106/1g组织。
24小时后，将细胞培养基更换为新鲜培养基。一旦达到单层，即将细胞传代培养，并且利用相差显微镜目视评价其形态学；计算有丝分裂指数和细胞世代时间。
形态学分析的结果是鉴定了两个主要的细胞群体。第一个细胞型呈现为梭形细胞，直径为10-30μm，含有均质的细胞质，低核：质比，由4至7个核仁组成的中心核。第二个类型包括较大的成纤维细胞样延展细胞，其直径为80μm，含有不同均质性的细胞质；它包括较低的核-质比，由2至4个核仁组成的中心核。因此，所分析的细胞显示人类间充质干细胞特有的形态学。
在对数生长期计算有丝分裂指数：有丝分裂数与细胞总数的比值。有丝分裂指数为31.6‰。细胞世代时间为25.7小时。
将这样获得的细胞进行免疫表型分析，包括用抗表面抗原CD10、CD13、CD31、CD34、CD44、CD45、CD90、CD105、CD117的抗体(BectonDickinson)染色，同时使用间接荧光。利用流式细胞仪(Beckman Coulter)进行评价。表面标记表达对应于间充质干细胞的免疫表型。这些细胞是CD13、CD44、CD90、CD105阳性的和CD31、CD34、CD45、CD117阴性的。CD10的表达为中度阳性(表3)。
表3.来自胎盘羊膜的间充质干细胞表面上表面抗原的表达.
  来自羊膜的间充质干细胞的免疫表型
  CD   ％
  CD10   58.70
  CD13   93.20
  CD31   1.70
  CD34   1.40
  CD44   98.30
  CD45   0.00
  CD90   92.60
  CD105   96.90
  CD117   1.70
实施例4
将质量为10g的脂肪组织样品用不含离子Ca2+和Mg2+的pH 7.2的PBS(Gibco)漂洗三次。该PBS(Gibco)含有一倍的抗生素和抗真菌剂溶液(Gibco)。青霉素的终浓度为100单位/ml，链霉素为100μg/ml，两性霉素B为0.25μg/ml。除去致密的结缔组织部分。
然后用医疗剪将组织在10cm培养皿(Costar)中进行机械碎裂，直到产生细分散的块。将其转移到两个具有锥形底的50ml试管(Costar)中。然后将每个样品都悬浮于25ml含抗生素和抗真菌剂的DMEM培养基中。
之后进行酶处理：向这样制备的悬液中加入1ml 2％Gibco型胶原酶在不含Ca2+和Mg2+的PBS缓冲液中的溶液，直到达到0.075％的酶终浓度。该悬液在缓慢振荡下37℃温育30分钟。
将这样制备的混合物充分混合；然后加入等体积的含有10％FBS、抗生素和抗真菌剂的DMEM。于1000g离心10分钟。除去上清液和脂肪滴。将沉淀物合并，悬浮于10ml含155mM NH4Cl、10mM KHCO3、0.1mM Na2EDTA的冷赖氨酸缓冲液(+4℃)中10分钟。将该混合物充分搅拌，并且在室温下温育3-5分钟。
然后向细胞悬液中加入10ml含抗生素和抗真菌剂的DMEM培养基。于1000g离心10分钟沉淀细胞。
吸出并漂洗上清液。将细胞沉淀物重悬浮于30ml含抗生素和抗真菌剂的DMEM培养基中，于1000g离心10分钟。
将这样获得的沉淀物重悬浮于25ml含抗生素和抗真菌剂的DMEM培养基中。
然后利用包括100μm孔径的滤器过滤这样制备的细胞悬液，并且于300g离心10分钟。将沉淀物重悬浮于体积为25ml的DMEM培养基中，该培养基中添加了抗生素和抗真菌剂、10％FBS和一倍非必需氨基酸溶液(Gibco)。该悬液利用包括10μm孔径的滤器过滤。
这样，产生不含细胞碎片和血细胞的均质细胞级分。
通过在Gorjajev室中计算评价这样制备的细胞悬液，并且接种于75cm2培养瓶中(106细胞/cm2)。粘附细胞的比例为大约1％至1.5％；能够从1g脂肪组织中获得的间充质干细胞的产量为大约1.5-3×104个细胞。
24小时后，将培养基更换为含抗生素(100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素(Gibco))、10％FBS和一倍非必需氨基酸溶液(Gibco)的DMEM。
一旦达到单层，即将细胞传代培养，并且利用相差显微镜目视评价其形态学；计算有丝分裂指数和细胞世代时间。
在获得细胞级分后，根据形态学分析确定了两个亚群。第一个细胞型表现为梭形细胞的亚群，直径为10-15μm，含有准确调节的核和均质的细胞质。第二个细胞型的特征在于是圆细胞，具有在一侧延长的平的胞质向外生长。细胞的大小为40μm；可观察到移至边上的暗核，和非均质的细胞质。也可观察到核区中的颗粒化增多。
在对数生长期计算有丝分裂指数和细胞世代时间。处于有丝分裂的细胞与细胞总数的比例为34％。倍增时间为约54至62小时。
利用间接荧光对这样获得的细胞进行免疫表型分析。利用流式细胞仪(Beckman Coulter)可以确定下列抗原为高表达状态：CD10(CALLA)、CD13(APN)、CD44(透明质酸受体)、CD90(Thy-1)、CD105(endoglin)(Becton Dickinson)。此外，检测到造血细胞的标记CD34、CD45和CD117(Becton Dickinson)缺乏表达(表4)。免疫表型测定的结果证明获得的细胞群体在其表面抗原表达上相当于间充质干细胞。
表4：来自脂肪组织的间充质干细胞表面上表面抗原的表达
  来自脂肪组织的间充质干细胞的免疫表型
  CD   ％
  CD10   68.08
  CD13   96.53
  CD34   4.38
  CD44   93.08
  CD45   3.28
  CD90   98.36
  CD105   90.18
  CD117   2.30

Claims (16)

1.从人类组织中获得和/或分离间充质干细胞的方法，包括下列步骤：
(a)提供人类组织，
(b)通过酶和机械方法处理所述人类组织，获得细胞悬液，
(c)从所述悬液中除去红细胞，和
(d)过滤所述悬液，获得间充质干细胞，
其特征在于，步骤(a)中使用脂肪组织或/和胎盘组织作为人类组织。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在步骤(a)中使用蜕膜作为人类组织。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于在步骤(a)中使用羊膜作为人类组织。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于在步骤(a)中使用绒毛膜基质作为人类组织。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于在步骤(d)中使用至少一个滤器，该滤器包括大小适合除去细胞残余物和/或碎片的滤孔。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于在步骤(d)中所述悬液先后使用包括约50μm至150μm，优选100μm孔径的滤器以及包括约5μm至15μm，优选10μm孔径的滤器过滤。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于在步骤(d)中所述悬液首先通过包括约50μm至150μm，优选100μm孔径的第一滤器过滤，然后通过包括约5μm至15μm，优选10μm孔径的第二滤器过滤。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于在步骤(b)中使用胶原酶进行所述酶处理。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于在使用蜕膜、羊膜和/或脂肪组织作为人类组织的情况下，在步骤(b)中使用I型胶原酶，在使用绒毛膜基质作为人类组织的情况下则使用IV型胶原酶。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于在步骤(b)中在Eagle培养基中，优选在Dulbecco改进Eagle培养基中提供胶原酶用于所述酶处理。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其特征在于在步骤(b)中提供终浓度约为0.075％的胶原酶用于所述酶处理。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其特征在于在步骤(c)中利用能够裂解所述红细胞的缓冲液进行所述红细胞的去除。
13.人类脂肪组织或/和胎盘组织作为用于获得和/或分离间充质干细胞的来源的用途。
14.根据权利要求13所述的用途，其特征在于使用人类蜕膜、羊膜和/或绒毛膜基质作为获得和/或分离间充质干细胞的来源。
15.从人类组织中获得间充质干细胞的方法，包括将所述组织进行破碎并且用胶原酶在Dulbecco改进Eagle培养基中的溶液进行酶处理，利用裂解溶液除去红细胞，随后过滤所制得的悬液，其特征在于使用脂肪组织或蜕膜或羊膜或绒毛膜胎盘基质作为人类组织，而且先后利用包括100μm和10μm孔径的滤器进行过滤。
16.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在脂肪组织、胎盘蜕膜或羊膜的酶处理中使用I型胶原酶，而在绒毛膜胎盘基质的酶处理中使用IV型胶原酶。
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