CN103160459A - 一种优秀冰雪运动员胎盘干细胞分离培养及鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及优秀冰雪运动员胎盘干细胞分离培养方法，其中利用优秀冰雪运动员胎盘组织作为材料，通过优秀冰雪运动员胎盘干细胞的消化分离、原代培养、传代培养、优秀冰雪运动员胎盘干细胞的生物学特性的鉴定、优秀冰雪运动员胎盘干细胞的诱导分化及其鉴定，最终获得最佳的优秀冰雪运动员胎盘干细胞的分离培养方法。

Description

一种优秀冰雪运动员胎盘干细胞分离培养及鉴定方法

技术领域：

本发明涉及一种优秀冰雪运动员胎盘干细胞分离培养及鉴定方法，具体地说是利用优秀冰雪运动员胎盘组织通过剪碎、胶原酶消化、原代及传代培养、并对培养细胞进行相关生物学鉴定及诱导分化鉴定的方法。属于体育学，运动生物学领域，运动分子生物学领域。

背景技术：

从20世纪90年代开始，世界范围内掀起了一股干细胞研究热潮，干细胞所具有的增殖与分化特性受到越来越多研究者的关注。随着干细胞理论的日臻完善和技术的迅猛发展必将带来传统医疗手段和观念的一场重大革命。干细胞作为具有自我更新能力及全能性的细胞，其特性与优秀冰雪运动员遗传资源的保存与利用相结合原则相符，也让其可以用于优秀冰雪运动员遗传资源保存。

再生医学是一个新兴的多学科领域，它借鉴了生物学、医学和基因工程的研究方法，致力于修复因疾病或外伤造成的组织器官功能。由于干细胞具有全能性，在再生医学领域是不可多得的治疗材料和手段，但在干细胞的使用上还存在一些问题，大大制约其在再生医学领域的应用，例如，胚胎干细胞的获得需要破坏正常的胚胎；胚胎干细胞移植后具有较高的肿瘤发生率；骨髓间充质干细胞移植过程中会引起病毒感染；干细胞治疗的效果随供体年龄的增加大幅下降等。这些问题不但涉及到生命安全而且涉及到伦理性问题，这就需要继续开发出来源清晰、取材方便且不涉及伦理问题的干细胞新来源。

研究人员不断搜寻新的干细胞组织来源，最终将目标锁定于胎盘上，胎盘组织所具有的潜在优势使其顺理成章的成为了再生医学领域新干细胞组织来源的首选目标。首先，胎盘来源于胚胎发育的最初阶段，在其组织内部还保留有从早期胚胎上遗留下来的具有可塑性的干细胞的几率非常大。第二，胎盘是在妊娠过程中维持集体免疫耐受性的基础，胎盘组织的细胞具有先天性的免疫调节能力的可能非常高。第三，胎盘在胎儿分娩之后就被丢弃，从丢弃的组织中获取细胞不会涉及到任何伦理性问题。这三个方面的优势，完美解决了再生医学对干细胞组织来源的需求。

细胞的可塑性是原肠胚形成前胚胎细胞所具有的特点，这些细胞具有分化为多种成体细胞系的能力，而胎盘组织恰恰是来源于胚胎发育早期，甚至早于原肠胚发生，这一事实有力的支持了胎盘组织中存在有全能性细胞可能性的假设。受精后4-5天，由受精卵分裂而来的桑葚胚进入子宫腔，继续发育为囊胚，内细胞团聚集在囊胚腔的一侧。滋养层细胞包围在外层。当囊胚接触到子宫内膜后，滋养层细胞分化为2层：具有侵略性的多核外层细胞被称为合胞体滋养层，他们是相邻滋养层细胞融合的结果；另外一层就是位于内侧的单核细胞层，这种分层的组织形式是之后胚胎在发育过程中的典型模式。同时滋养层细胞会继续分化为特异性的细胞，与胎儿内细胞团分化来的特异性细胞一起，构成连接母体与胎儿之间的营养及代谢通道。受精后第2周，着床进入第二阶段，细胞团形态发生改变，形成由靠近滋养层的外胚层及靠近囊胚腔的内胚层组成的双层胚盘。从此时起，来源于滋养层细胞的外胚层会逐渐生成一个空腔，即后来的羊膜腔，而这些滋养层细胞则发育为羊膜上皮细胞。同时，一些来自于内胚层的细胞沿着囊胚腔内壁形成胚外体腔膜，之前的囊胚腔则发育为卵黄囊。来自胚外体腔膜的细胞和与其向邻近的滋养层细胞形成胚外网结构，一些内胚层细胞沿着这一结构的边缘形成胚外中胚层，它最后的形成羊膜中胚层和绒毛膜中胚层。从胎盘的最后结构上来看，羊膜上皮区域起源于外胚层，羊膜和绒毛膜的中层起源于胚外中胚层，而绒毛膜滋养层细胞则来自原原始胚胎的滋养层。从人胎盘各个结构发育的过程来看，至少有四种类型的细胞可以被分离并用于干细胞研究。它们是，人羊膜上皮细胞、人羊膜间充质基质细胞、人绒毛膜滋养层细胞和人绒毛膜间充质干细胞。

从胚外中胚层发育而来的人羊膜间充质基质细胞，具有可塑性，能够进行多向分化。目前，人羊膜间充质干细胞主要是通过将羊膜从绒毛膜上剥离下来，然后用胶原酶或胰酶处理分离得到的。其表面分子标记与骨髓间充质干细胞具有很高的相似度，都表达典型的间质细胞标记，包括CD90、CD105、CD71等，而不表达造血细胞标记(CD34、CD45)和单核细胞标记(CD14)，同时，在人羊膜间充质干细胞中还能检测到阶段性的胚胎特异性抗原基因SSEA-3、SSEA-4和OCT-4的表达，这也支持了其具有多潜能性的能力。其中第一和第三期的羊膜间充质干细胞会表达微弱的HLA-ABC，而不表达HLA-DR，这表明这些细胞还具有免疫豁免性，能够用于临床器官移植。为验证这一假说，科研工作者不停地将羊膜和绒毛膜细胞注入到新生猪或小鼠体内，发现这些细胞能够成功的嵌入试验动物大脑，肺部，骨髓，胰脏，脾脏，肾脏和肝脏等器官组织中并稳定增殖。这些胎盘来源细胞的迁移性与人羊膜间充质干细胞(Human amniotic membrane mesenchymal stem cells hAMSC)所表达的L-selectin、VLA-5、CD29、P-selectin Ligand1、MMP-2和MMP-9的功能相吻合。除了继续发育为间质细胞外，人羊膜间充质干细胞还表现出多能性，这种前原肠细胞所具有的能力往往可以使细胞向中胚层、外胚层和内胚层细胞发育。现有体内、体外实验表明，人羊膜间充质干细胞可以很好的应用于再生医学和心脏病治疗当中。2004年，Sakuragawa成功在体外诱导人间充质干细胞分化为神经胶质表型的细胞，并表达出神经标记性基因，但未在体内实验中获得成功。Zhao等将人羊膜间充质干细胞嵌入新生小鼠的心脏中，发育为心肌样细胞，直接将羊膜间充质干细胞移植进患有心肌梗塞的小鼠体内，同样可以发育为心肌样细胞，并能够延长小鼠寿命。

从免疫学角度讲，怀孕是个很特殊的阶段，此时母体的免疫系统处于一种特殊的工作模式下，它既不能发生免疫抑制，同时又要能够完全接纳婴儿这个移植物。基于胎盘在妊娠过程中在胎儿和母体进行物质交换中的特殊作用，胎盘组织和细胞很可能在控制母体对婴儿免疫耐受性方面具有重要作用。

羊膜最早在临床上被用于治疗皮肤创伤、皮肤烧伤和腿部慢性溃疡的修复手术及预防术后组织粘连等伤病，后来又被应用于眼表重建手术中，当羊膜与被移植的角膜或结膜上皮组织共同移植到受体后，可以在不对受体进行免疫抑制处理的情况下，有效阻止免疫排斥的发生。这些实验及应用都表明羊膜不具有免疫原性。此外，研究人员同样发现，人胎盘细胞在移植到具有免疫活性的动物内后，可以存活很长一段时间。通过对混合注射羊膜和绒毛膜细胞后的新生猪和小鼠的研究，发现注射一段时间后，这些动物的一些器官发生了微嵌合现象，这说明，胎盘来源的细胞同样不具有免疫原性。旨在研究宿主对同基因和异基因来源的胎盘分化细胞免疫反应机理的体外研究发现，羊膜和绒毛膜细胞均不会引起同基因或异基因移植物导致的混合淋巴细胞的反应，且能够抑制由其他抗原或通过TCR受体引起的混合淋巴细胞的反应，这说明人羊膜间充质干细胞可能会分泌一些可溶性免疫调控因子来调节受体的免疫反应。Magatti等报道了两种亚群的羊膜间充质层细胞，它们均能够表现出对T细胞刺激的抑制功能，不过其在免疫抑制过程中的具体机制还有待进一步研究。这些工作为免疫耐受和免疫排斥研究奠定了基础，同时为细胞治疗技术找到了更好的，能降低宿主免疫排斥反应的细胞源-胎盘。

我们所期望的，以及目前所关心的，是找到一种既符合道德法律，又容易获得的干细胞来源，以用于再生医学，来克服当前细胞治疗中的缺点。早期胚胎起源过程中，胎盘组织的的发育要早于原肠，这暗示我们胎盘中某些细胞可能还保留有其祖先细胞的多能性，具有干细胞的特性。同时胎盘来源的细胞大多又没有免疫原性，可以被用来防止免疫排斥。此外，最难得的是胎盘不涉及任何伦理道德方面的问题，这为其在再生医学方面的应用奠定了基础。

我国的冰雪运动员是世界上最优秀的冰雪运动员群体之一，如何利用生物学技术，将优秀冰雪运动员的遗传资源保护好成为目前重要的课题之一。因此为保护我国的优秀冰雪运动员的遗传资源，一种有效的方法就是胎盘干细胞分离培养方法。

因此，本发明可为细胞生物学、分子生物学、基因工程、遗传标记等生命科学研究提供大量高品质材料；在国际体育上可以丰富并改良冰雪运动员的遗传资源，同时也可作为优秀冰雪运动员遗传资源的的保种手段之一。

发明内容

本发明的目的是提供高针对性、高精确的高质量优秀冰雪运动员的胎盘干细胞。

本发明的另一目的在于提供上述胎盘干细胞的分离培养方法，胎盘组织来源于优秀冰雪运动员；胶原酶消化分离成单个细胞并进行原代培养、传代培养、最后对优秀冰雪运动员胎盘干细胞进行相关的生物学特性的鉴定以及诱导分化。

本发明的主要内容是一种优秀冰雪运动员胎盘干细胞分离培养方法，其特征在于取材目标特别，根据优秀冰雪运动员胎盘的子叶型结构，对取样部位及分离方法进行了优化。从优秀冰雪运动员胎盘上取绒毛膜及子叶微绒毛两个部位进行分离培养。并对分离方法进行了优化采用胶原酶IV进行消化，37.5℃消化15分钟。

具体实施方案：

1、优秀冰雪运动员的胎盘间充质干细胞的分离及培养

(1)75％酒精冲洗除菌，在无菌环境下取出胎盘，置于5％双抗的PBS溶液中。

(2)在PBS中去除子叶背面的血管，并用PBS多次清洗样品。

(3)剪取子叶上的微绒毛，PBS清洗3次。

(4)将微绒毛置于6cm皿中，剪碎，加入IV型胶原酶4ml，37℃消化30分钟【37.5℃消化15分钟】，期间用1ml枪头吹打样品3次，使酶与样品充分接触。

(5)加入5ml全培养基终止消化，用1ml枪头吹散细胞悬液，300目筛子过滤。

(6)收集滤过液，140g离心8分钟。

(7)弃上清，加入新鲜的全培养基。按照4×10⁵个/孔接种于6孔板中，置于培养箱中，37℃培养。

(8)接种后24小时全量更换培养基，之后每2天换液。

分别对胎盘绒毛膜及绒毛膜微绒毛进行II型胶原酶、IV型胶原酶及胰酶消化分离原代胎盘间充质干细胞细胞。比较结果表明胰酶消化法在原代分离过程中对组织损伤较大，获得细胞数量较少，48小时贴壁细胞极少，甚至未发现贴壁细胞，故不适合胎盘间充质干细胞的原代分离。两种胶原酶均能够从组织样品上分理处足够的原代细胞，但II型胶原酶处理的微绒毛组织细胞在48小时仍未能发现贴壁细胞，绒毛膜组织贴壁细胞也很少，至6天仍未见大量生长，也不能符合原代分离培养要求。IV型胶原酶消化处理两个组织样品在48小时均能发现较多贴壁细胞，6天后细胞增殖明显，与前两者相比更适合胎盘间充质干细胞原代细胞分离。

使用IV型胶原酶分别消化绒毛膜与微绒毛两种组织样品，随着细胞不断增殖，发现绒毛膜组织来源的细胞中上皮样细胞越来越多，而微绒毛组织来源的细胞中则相对较少，虽然在之后的传代培养中能逐步去除上皮样细胞，但无疑延长了纯化细胞的时间。综合上面的结果，最终确定使用胎盘子叶微绒毛为材料，1％IV型胶原酶消化30分钟的方法对胎盘间充质干细胞原代进行分离。

胶原酶(collagenase)是从溶组织梭状细胞芽孢杆菌提取制备的，主要水解结缔组织中胶原蛋白成分，适合消化含有较多结缔组织或胶原成分的组织样品。胶原酶仅对细胞间质有消化作用，而对上皮细胞影响不大。又可分为I、II、III、IV、V型和干细胞专用胶原酶。其中II型胶原酶适用于肝脏，骨，甲状腺，心脏和唾液腺组织，IV型胶原酶含有7种以上蛋白酶成分，适用于多种组织样品。胰蛋白酶(Trypsin)的作用是使细胞间的蛋白质水解，从而使细胞离散，不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应又不一样，在使用胰酶过程中，要注意浓度、温度和作用时间，胰酶消化过度造成细胞损伤。在本实验中所取胎盘子叶绒毛样品，其结缔组织含量较多，故胰酶分离效果较差；同时，相对于适用范围更广的IV型胶原酶，II型胶原酶也不适合从子叶绒毛中分离胎盘间充质干细胞。

2、优秀冰雪运动员的胎盘间充质干细胞传代及冻存

待细胞长至90％汇合，进行传代：PBS清洗2次，0.2％胰酶消化3分钟，加入全培养基终止消化，枪头轻轻吹打使细胞均匀分散于培养基中，按照1∶2的比例进行传代。传代后24小时半量更换培养基，之后每2天换液。每天观察细胞形态。

从P2代开始对细胞进行冻存。常规方法消化细胞制备细胞悬液，140g离心8分钟，尽量去除上清液，按照10⁶个/ml密度加入细胞冻存液，分装后置于4℃平衡30分钟，再放入程序冷冻盒于-80℃中程序降温。稳定后放入液氮长期保存。

3、优秀冰雪运动员胎盘间充质干细胞原代分离培养体系优化

根据优秀冰雪运动员胎盘的子叶型结构及现有原代分离方法，对取样部位及分离方法进行了优化。通过对6天之内原代细胞生长速度、细胞形态的比较，选择适合原代分离培养的体系。

从优秀冰雪运动员胎盘上取绒毛膜及子叶微绒毛两个部位进行分离培养。在分离过程中，使用0.2％胰酶15分钟、1％II型胶原酶30分钟和1％IV型胶原酶30分钟三种酶系对组织样品进行消化处理。

优秀冰雪运动员胎盘间充质干细胞特性鉴定

1、优秀冰雪运动员的胎盘干细胞增殖能力检测

(1)优秀冰雪运动员的胎盘干细胞生长曲线测定

对优秀冰雪运动员胎盘干细胞进行生长曲线测定。常规消化细胞，制备细胞悬液，按照2×10⁴个/孔接种于24孔板中。以接种日为第0天，连续8天，每天随机选取3孔细胞用血细胞板进行计数。

以培养时间为横坐标，细胞数为纵坐标，绘制生长曲线。根据生长曲线计算细胞的群体倍增时间(population doubling time，PDT)。

计算公式为：PDT＝(t1-t0)lg2/(1gNt-lgNO)

其中，t0:N0所对应的时间；t1:Nt所对应的时间；N0：对数生长期起始时间点细胞数；Nt：对数生长期内某一时间点细胞数。

(2)优秀冰雪运动员的胎盘干细胞克隆形成能力检测

对优秀冰雪运动员胎盘干细胞进行克隆形成能力检测。常规消化细胞，制备细胞悬液。稀释细胞悬液浓度为1000个/ml，按照100个/孔的密度接种到6cm皿中进行培养。每2天换液，7天后对单克隆细胞进行吉姆萨染色。镜下计算细胞克隆数，并计算克隆形成率。

克隆形成率＝(克隆数/100)×100％

(3)优秀冰雪运动员的胎盘干细胞细胞周期检测

使用流式细胞仪对处于指数生长期的优秀冰雪运动员胎盘干细胞进行细胞周期检测。

a、常规消化处于对数指数生长期的细胞，离心收集细胞。

b、PBS清洗细胞3次。

c、加入新鲜的70％乙醇，重悬细胞。4℃固定24小时。

d、140g离心8分钟收集固定好的细胞，PBS清洗2次。

f、加入500μlPI染液，染色30分钟。

g、70μm筛网过滤，流式细胞仪上机检测。

h、每个代次细胞检测3次，每次上机检测细胞总数大于10⁴个。

2、优秀冰雪运动员的胎盘干细胞特异性分子标记检测

(1)优秀冰雪运动员的胎盘干细胞特异性分子标记免疫荧光检测

利用免疫荧光的方法，检测细胞CD29、CD44两个分子标记在细胞中的表达。并计算荧光强度。

常规方法消化细胞，制备细胞悬液，按照2×10⁴个/孔的密度接种到24孔板中，待细胞汇合至70％左右时进行免疫荧光检测。

免疫荧光方法：

a、小心吸出培养液，用PBS清洗细胞3次，每次2分钟。

b、4％多聚甲醛室温下固定30分钟，PBS清洗3次，第一次2分钟，后两次1分钟。

c、0.1％TritonX-100打孔处理20，PBS漂洗3次，第一次2分钟，后两次1分钟。

d、PBS配制的10％山羊血清室温下封闭30分钟。

e、用含1％BSA的PBS溶液按1∶200比例稀释Nestin一抗，24孔板中每孔加入200μl，室温下孵育1小时。

f、用PBS漂洗3次，每次2分钟。以洗去与细胞非特异性结合的抗体。

g、避光条件下，用PBS按1∶100比例稀释FITC标记的二抗，每孔200μl室温下孵育1小时。

h、PBS漂洗3次，每次2分钟。

i、用PBS按1∶1000比例稀释DAPI染液，每孔200μl室温下孵育20分钟。

j、PBS漂洗3次，每次3分钟。激光共聚焦显微镜检测。

(2)优秀冰雪运动员的胎盘干细胞特异性分子标记RT-PCR检测

Trizol法提取细胞总RNA。以细胞总RNA为模板，使用M-MLV反转录体系进行反转录。根据优秀冰雪运动员基因序列，设计合成9个特异性基因检测引物，是CD106、CD166、CD44、CD73、CD45、CD29、CD90、CD34、BLA-DR。以细胞反转录产物为模板进行PCR扩增检测。

RT-PCR：以优秀冰雪运动员胎盘干细胞的总RNA为模板，配制M-MLV反转录体系，置于PCR仪中进行反转录。反转录程序：30℃-10分钟；42℃-60分钟；99℃-5分钟；5℃-5分钟。产物于4℃保存。

M-MLV反转录体系

根据NCBI提供的基因序列，使用Primer5设计相关基因检测引物，以反转录产物为模板进行扩增检测。PCR反应程序如下：95℃预变性，5分钟；94℃40秒钟-60℃*40秒钟-72℃40秒钟扩增35循环；72℃延伸10分钟，4℃保存。2％琼脂糖凝胶电泳检测，并对目的扩增片段进行测序。(*根据退火温度设定)

优秀冰雪运动员胎盘间充质干细胞诱导分化

将优秀冰雪运动员的胎盘干细胞向成骨细胞及脂肪细胞诱导分化。

1、优秀冰雪运动员的胎盘干细胞向成骨细胞诱导分化

(1)优秀冰雪运动员的胎盘干细胞向成骨细胞诱导分化

常规法消化细胞，制备细胞悬液，按照10⁵个/孔的密度接种于6孔板中。待细胞汇合至50-60％时，弃去培养液，PBS清洗2次，加入成骨细胞诱导液，之后每3天换液。直至诱导出现明显的钙结节，进行进一步检测。同时设立正常培养基的非诱导对照组。

(2)诱导成骨细胞检测

钙结节茜素红染色

吸去诱导液，PBS清洗3次；4％多聚甲醛固定30分钟，弃去固定液，PBS清洗2次，加入事先配置好的2％茜素红染液，37℃孵育30分钟；75％酒精脱色1分钟；PBS清洗3次。显微镜下观察着色情况。

2、优秀冰雪运动员的胎盘干细胞向脂肪细胞诱导分化

(1)优秀冰雪运动员的胎盘干细胞向脂肪细胞诱导分化

常规法消化细胞，制备细胞悬液，按照10⁵个/孔的密度接种于6孔板中。待细胞汇合至60％时，弃去培养液，PBS清洗2次，加入脂肪细胞诱导液，之后每3天换液。直至镜下能观察到细胞内出现明显的脂滴，进行进一步检测。同时设立正常培养基的非诱导对照组。

(2)诱导脂肪细胞检测

油红O染色

吸去诱导液，PBS清洗3次；4％多聚甲醛固定30分钟，弃去固定液，PBS清洗2次，加入事先配置好的油红O染液，37℃孵育30分钟；PBS清洗3次脱色。显微镜下观察着色情况。

Claims (2)

1.一种优秀冰雪运动员胎盘干细胞分离培养方法，其特征在于取材目标特别，根据优秀冰雪运动员胎盘的子叶型结构，对取样部位及分离方法进行了优化。从优秀冰雪运动员胎盘上取绒毛膜及子叶微绒毛两个部位进行分离培养。

2.根据权利要求1里所述方法其特征在于分离方法优化，采用胶原酶IV进行消化，【37.5℃消化15分钟。】