CN104762257A

CN104762257A - 一种从脐带制备间充质干细胞的方法

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Publication number: CN104762257A
Application number: CN201510171887.5A
Authority: CN
Inventors: 刘拥军; 李福彬; 徐萌; 余鹏程; 刘世勇; 刘洋
Original assignee: Yunnan And Southwest Pool Bio Tech Ltd
Current assignee: Yunnan And Southwest Pool Bio Tech Ltd
Priority date: 2015-04-13
Filing date: 2015-04-13
Publication date: 2015-07-08
Anticipated expiration: 2035-04-13
Also published as: CN104762257B

Abstract

本发明涉及一种从脐带制备间充质干细胞的方法，以及利用该方法制备的间充质干细胞。所述方法包括下述步骤：(1)取脐带样品；(2)去除血管以及其周围紧贴血管的组织；(3)制备脐带组织片；(4)分离羊膜下层组织；(5)对羊膜下层组织进行处理；(6)无细胞培养液培养；(7)加入细胞培养液继续培养；(8)胰酶消化；(9)过滤；(10)将滤液离心并去除上清，重新悬浮获得脐带组织间充质干细胞。利用本发明的方法制备的间充质干细胞纯度高，增殖和分化潜能大，在基础研究和临床治疗中具有广泛的应用前景。

Description

一种从脐带制备间充质干细胞的方法

技术领域

本发明涉及一种从脐带制备间充质干细胞的方法，尤其涉及从脐带的羊膜下层组织分离间充质干细胞，属于生物工程技术领域。

背景技术

干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞。根据个体发育过程中出现的先后次序不同，分为胚胎干细胞(ESC)和成体干细胞(ASC)。胚胎干细胞是从囊胚的内细胞团中分离出来的细胞，能够无限自我更新，可分化为内、中、外3个胚层的各种细胞和组织。但由于干细胞研究的胚胎来源困难、本身具有致瘤性、免疫排斥及伦理等问题而限制了其在临床的应用。随着干细胞技术的发展，现在己证实可以将成体的终末分化细胞通过导入几个关键的因子使其再编程为胚胎干细胞样的细胞，这种细胞被称为诱导性多能干细胞，它可以绕过伦理道德问题，但因为需要借助病毒载体导入基因，有编程效率低、成瘤性等问题，从而限制了它们在临床上的应用。成体干细胞是存在于胎儿、儿童和成人组织中的多能干细胞的统称，现在已经在多种组织器官被发现，如造血干细胞、神经干细胞、肝脏干细胞、心脏干细胞及间充质干细胞(MSC)等。一般认为，成体干细胞只能分化为其组织器官的细胞类型，然而近几年的研究表明，这些干细胞的分化能力远超过传统观点局限的范围，如神经干细胞可以分化为血液细胞，脐带血干细胞可以分化为神经细胞等。

间充质干细胞是来源于中胚层的成体干细胞，广泛存在于全身结缔组织和器官间质中，具有良好的增殖能力和多向分化潜能。在不同的诱导条件下，间充质干细胞不但可分化为软骨、骨、骨骼肌、肌腱、脂肪等中胚层细胞，同时还可向外胚层的神经细胞和内胚层的肝卵圆性细胞及多种细胞和组织分化。间充质干细胞易于分离和培养，易于外源基因的导入和表达，分泌的多种细胞因子具有调节免疫、支持造血的特性，免疫原性弱，遗传背景稳定并且不受胚胎干细胞研究中遇到的伦理问题限制。因此，间充质干细胞是组织工程、基因工程和细胞治疗的理想种子细胞来源。

目前已经进行的临床试验研究证实，具有自我更新、多向分化潜能的间充质干细胞可以应用于多种疾病的治疗和康复。但是，所有的研究或治疗方案都必须建立在获得足量间充质干细胞的基础上，快速有效的分离间充质干细胞作为种子细胞具有非常重要的研究价值和经济利益。在研究和实际应用中发现种子细胞存在种种问题，例如，自体骨髓虽然存在大量的间充质干细胞，但随着年龄增大，自体骨髓中的间充质干细胞数目会显著降低，且增殖能力也会大幅衰退，同时，从骨髓采集间充质干细胞操作复杂，不宜应用推广。

因此，研究者开始寻找间充质细胞的其他来源，其中，脐带间充质干细胞来源充足、病毒污染概率低、免疫源性弱、细胞更为原始，也不存在社会、伦理和法律方面的争议。人脐带连接于母体和胎儿之间，妊娠期间为胎儿提供营养，主要由三部分构成：羊膜被覆上皮、脐带血管和位于两者之间被称为华通氏胶(Wharton’s Jelly)的黏液结缔组织。脐带间充质干细胞的主要的来源是华通氏胶和脐血。

目前对于脐带间充质干细胞分离的方法主要有贴壁法和酶消化法两种。其中贴壁法操作简便，对实验条件要求低，容易掌握。这种方法的缺点在于，获得原代细胞的周期长，液体的浮力使组织块漂起，使其丧失了长出细胞的能力，减少了细胞数量，此外，产物中混有部分内皮细胞，需要通过后期的酶消化处理进行进一步的筛选。采用胶原酶消化法虽然可在短时间内获得细胞，杂质少，但费用较高，并且条件不易掌握，如果常温中消化时间长可能损伤细胞，致使细胞不易贴壁和传代；如果消化时间短则液体粘稠，难以通过离心获得足够量细胞。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种不采用消化酶又不同于常规贴壁法的脐带间充质干细胞制备方法。本发明的发明人通过对脐带中不同的间充质干细胞来源、实验条件等进行了大量研究和探索，发现从脐带的羊膜下层组织可以制备出高纯度、高活性的间充质干细胞。本发明的发明人还对实验条件进行了优化，发现分离出羊膜下层组织后先不加细胞培养液在38.5℃培养一段时间，然后再加入细胞培养液培养，可以显著提高间充质干细胞的回收率。本发明的方法操作简单，得到的间充质干细胞纯度高，具有增强的自我更新及多向分化潜能。

为了实现本发明的目的，本发明提供一种从脐带制备间充质干细胞的方法，包括下述步骤：(1)取脐带样品；(2)去除血管以及其周围紧贴血管的组织；(3)制备脐带组织片；(4)分离羊膜下层组织；(5)对羊膜下层组织进行处理；(6)不加细胞培养液进行培养；(7)加入培养液继续培养；(8)胰酶消化；(9)过滤；(10)将滤液离心并去除上清，重新悬浮获得脐带组织间充质干细胞。

优选的，本发明的方法包括下述步骤：(1)取新生儿的脐带，用含青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲液反复冲洗干净，去除残留的血液，获得干净脐带；(2)将干净的脐带用手术刀纵向切开，用镊子去除静脉血管和动脉血管以及其周围紧贴血管的组织；(3)将剩下的组织摊平，脐带内侧朝上，用镊子小心剔除脐带内侧胶质部分，剥除干净，直至剩下约1mm厚度的组织片；(4)固定脐带组织片靠表皮一侧，用镊子撕下脐带内侧整齐的组织层即羊膜下层组织，剩下薄薄一层透明的脐带表皮即羊膜层组织；(5)将羊膜下层组织用剪刀剪成约1cm²的组织片，将靠近表皮侧贴在培养皿中整齐排开；(6)不加细胞培养液，直接放置于5％CO₂、38.5℃培养箱内，静置一小时后，倒置两小时；(7)然后加入细胞培养液5mL，置于5％CO₂、37℃培养箱内继续培养，当组织片周围的细胞达到80％融合时，将培养皿从培养箱内取出；(8)胰酶消化：先用磷酸盐缓冲液清洗培养皿两次，吸弃洗液，吸取含0.25％胰酶和0.1％EDTA的磷酸盐缓冲液，加入到培养皿内，消化3～5分钟，再将细胞培养液加入到培养皿中，反复吹打，使脐带组织间充质干细胞进入消化液中；(9)将消化液经100目灭菌滤网过滤，去掉脐带组织片，获得含脐带组织间充质干细胞的滤液；(10)将滤液在900rpm下离心5分钟，去除上清，重新悬浮细胞，获得脐带组织间充质干细胞。

优选的，上述方法中的磷酸盐缓冲液的组成如下：8g/L NaCl，0.2g/LKCl，1.15g/L Na₂HPO₄，0.2g/L KH₂PO₄，pH 7.4。

优选的，上述方法中含青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲液中，青霉素的浓度为100U/ml，链霉素的浓度为0.1mg/ml。

优选的，上述方法中的细胞培养液是包含10-30％胎牛血清和5-15ng/mLEGF的D-MEM/F12培养液。更优选的，所述细胞培养液是包含20％胎牛血清和10ng/mL EGF的D-MEM/F12培养液。

本发明还包括利用上述方法制备的间充质干细胞。

对于根据本发明所述方法制备的间充质干细胞，按照“国际细胞疗法协会”(ISCT)制订的标准进行生物学表型鉴定，表现出以下技术特征：

①标准培养条件下粘附于塑料培养器皿成纤维样生长；

②表达CD29，CD44，CD90，CD105，不表达CD31，CD34，CD45，CD71；

③体外可诱导分化为神经细胞。

脐带的羊膜下层组织是位于脐带中羊膜下层部位的组织，即羊膜层和华通氏胶之间的组织(参见图1)。上述鉴定结果表明本发明从脐带的羊膜下层组织中分离的干细胞属于间充质干细胞，而不含造血干细胞。

按本发明方法制备的原始干细胞因其所用材料来源和成品细胞的性能，可以解决在干细胞应用领域目前困扰医学界的多项难题。本发明的方法不采用消化酶，避免了间充质干细胞分离过程中，消化酶对脐带间充质干细胞引入动物源蛋白和动物源病原物的污染风险，又比普通的贴片法获得更高纯度的间充质干细胞，去除了外胚层和内胚层的杂质细胞干扰，提高了细胞纯度。此外，本发明的方法经过优化，提高了从羊膜下层组织分离间充质干细胞的回收率，并且制备的间充质干细胞具有更高的增殖和分化潜能，有利于其在后期研究和临床应用中发挥更加重要的作用。

附图说明

图1是脐带结构示意图。

A表示羊膜，B表示羊膜下层组织，C表示华通氏胶，D表示血管周细胞，E表示脐带血管。

具体实施方式

为了使本领域技术人员对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，下面通过实施例对本发明作进一步的说明，但不应理解为对本发明的限制。

实施例1：从脐带制备间充质干细胞

按照下述步骤从脐带制备间充质干细胞：

(一)脐带选取：选择包括乙肝表面抗原、丙肝抗体、梅毒抗体和艾滋病毒抗体免疫4项阴性，准备进行剖腹产的健康孕妇。在剖腹产手术时截取脐带约10cm，速置于D-Hank平衡液中送至细胞培养室，在超净台内对脐带进行处理。

(二)脐带预处理：用含青霉素和链霉素(青霉素的浓度为100U/ml，链霉素的浓度为0.1mg/ml)的磷酸盐缓冲液(8g/L NaCl，0.2g/L KCl，1.15g/L Na₂HPO₄，0.2g/L KH₂PO₄，pH 7.4)反复冲洗脐带组织，去除残留的血液，获得干净脐带。

(三)去除血管：将干净的脐带用手术刀纵向切开，用镊子去除静脉血管和动脉血管以及其周围紧贴血管的组织。

(四)制备组织片：将剩下的组织摊平，脐带内侧朝上，用镊子小心剔除脐带内侧胶质部分，剥除干净，直至剩下约1mm厚度的组织片。

(五)分离羊膜下层组织：固定脐带组织片靠表皮一侧，用镊子撕下脐带内侧整齐的组织层即羊膜下层组织，剩下薄薄一层透明的脐带表皮即羊膜层组织。

(六)组织处理：将获得的羊膜下层组织用剪刀剪成约1cm²的组织片，将靠近表皮侧贴在培养皿中整齐排开。

(七)无培养液培养：不加细胞培养液，直接放置于5％CO₂、38.5℃培养箱内，静置一小时后，倒置两小时。

(八)加入培养液培养：加入细胞培养液5mL，置于5％CO₂、37℃培养箱内继续培养七天左右，在培养皿中脐带组织开始有大量细胞爬出，十四天左右，待组织周围细胞达到80％的融合度时，将培养皿从培养箱内取出。

(九)胰酶消化：用磷酸缓冲液清洗培养皿两次，每次用量10mL，吸弃洗液，吸取1mL含0.25％胰酶和0.1％EDTA的磷酸缓冲液，加入到培养皿内，消化3-5分钟，再将5mL含20％牛血清和10ng/mL EGF的D-MEM/F12培养液加入到培养皿中，反复吹打，使脐带组织间充质干细胞进入消化液中。

(十)过滤：消化液经100目灭菌滤网过滤，去掉脐带组织片，获得含脐带组织间充质干细胞的滤液。

(十一)离心重悬：将滤液在900rpm下离心5分钟，去除上清，使用3mLD-MEM/F12培养液重新悬浮均匀细胞，获得脐带组织间充质干细胞。

实施例2：分离的间充质干细胞的鉴定

对利用实施例1的方法制备的间充质干细胞进行鉴定检测，鉴定检测项目包括：

1.形态学观察：细胞贴壁成纤维样生长。

2.生物学表型鉴定：利用流式细胞仪检测细胞表型。

①将实施例1制备的间充质干细胞分别与荧光标记的抗CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD71、CD90和CD105的抗体温育，用FITC和PE标记的小鼠IgG同型抗体作为对照；

②4℃温育45分钟，离心收集细胞；

③利用磷酸盐缓冲液清洗细胞3次，然后将细胞重悬于300μl磷酸盐缓冲液中，进行流式细胞仪分析，计算细胞表面标记物的阳性率。

表1显示流式细胞仪分析结果。

表1

由表1可以看出，利用本发明的方法制备的间充质干细胞，CD29、CD44、CD90和CD105的阳性率较高，都大于95％；而CD31、CD34、CD45和CD71的阳性率非常低，都小于1％。这说明所述间充质干细胞的纯度较高，没有造血干细胞的污染。

3.安全指标检测：对实施例1所获得的间充质干细胞进行安全指标检测，包括①细菌培养；②病毒检测；③支原体检测；④包括乙肝表面抗原、丙肝病毒抗体、梅毒抗体、艾滋病毒抗体在内的免疫学检测。所有批次该四项检测均为阴性，说明本发明的方法制备的产品安全性较高。

实施例3：不同来源的脐带间充质干细胞分化潜能的对比实验

本实施例的目的是为了鉴定在存在神经细胞诱导剂的条件下，不同来源的脐带间充质干细胞分化为神经细胞的潜能是否存在差异。

1.实验样品：(1)利用实施例1的方法制备的间充质干细胞；(2)从脐带华通氏胶制备的间充质干细胞(具体制备方法请参见，杨晓清等，“人脐带华通氏胶间充质干细胞的分离、培养、鉴定及冻存、复苏”，《南通大学学报(医学版)》，2010年，第30卷，第6期)。

2.实验方法：

(1)将来自实施例1或脐带华通氏胶的间充质干细胞以5×10⁹个/L的细胞浓度在培养皿中接种传代，进行增殖、纯化培养；

(2)在传代培养的细胞培养液中加入含碱性成纤维生长因子、多聚赖氨酸、二甲基亚砜和抗氧剂组合(β-巯基乙醇+全反式维甲酸)的神经细胞诱导剂，培养10天后各取6孔进行形态学观察，并加入神经元特异性烯醇化酶抗体和微管相关蛋白2(MAP-2)抗体，温育后在荧光显微镜下观察成熟神经元标志物(神经元特异性烯醇化酶和MAP-2)阳性的表达情况，统计阳性细胞比例(结果见表2)。

表2

从表2可以看出，利用实施例1的方法制备的间充质干细胞的分化潜能要显著高于华通氏胶来源的间充质干细胞。本发明经过优化的从脐带羊膜下层组织制备间充质干细胞的方法相对于现有技术中从脐带制备间充质干细胞的方法具有明显的优势。

虽然已参考上述实施例对本发明进行描述，但要理解的是，对其进行的修正和改变被包括在本发明的精神和范围内。

Claims

1.一种从脐带制备间充质干细胞的方法，其特征在于，包括下述步骤：(1)取脐带样品；(2)去除血管以及其周围紧贴血管的组织；(3)制备脐带组织片；(4)分离羊膜下层组织；(5)对羊膜下层组织进行处理；(6)无细胞培养液培养；(7)加入细胞培养液继续培养；(8)胰酶消化；(9)过滤；(10)将滤液离心并去除上清，重新悬浮获得脐带组织间充质干细胞。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括下述步骤：(1)取新生儿的脐带，用磷酸盐缓冲液反复冲洗干净，去除残留的血液，获得干净脐带；(2)将干净的脐带用手术刀纵向切开，用镊子去除静脉血管和动脉血管以及其周围紧贴血管的组织；(3)将剩下的组织摊平，脐带内侧朝上，用镊子小心剔除脐带内侧胶质部分，剥除干净，直至剩下约1mm厚度的组织片；(4)在脐带组织片靠表皮一侧，固定脐带组织片靠表皮一侧，用镊子撕下脐带内侧整齐的组织层即羊膜下层组织，剩下薄薄一层透明的脐带表皮即羊膜层组织；(5)将羊膜下层组织用剪刀剪成约1cm²的组织片，将靠近表皮侧贴在培养皿中整齐排开；(6)不加培养液，直接放置于5％CO₂、38.5℃培养箱内，静置一小时后，倒置两小时；(7)然后加入细胞培养液5mL，置于5％CO₂、37℃培养箱内继续培养，当组织片周围的细胞达到80％融合时，将培养皿从培养箱内取出；(8)胰酶消化：先用磷酸盐缓冲液清洗培养皿两次，吸弃洗液，吸取含0.25％胰酶和0.1％EDTA的磷酸盐缓冲液，加入到培养皿内，消化3-5分钟，再将细胞培养液加入到培养皿中，反复吹打，使脐带组织间充质干细胞进入消化液中；(9)将消化液经100目灭菌滤网过滤，去掉脐带组织片，获得含脐带组织间充质干细胞的滤液；(10)将滤液在900rpm下离心5分钟，去除上清，重新悬浮细胞，获得脐带组织间充质干细胞。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的组成如下：8g/L的NaCl，0.2g/L的KCl，1.15g/L的Na₂HPO₄，0.2g/L的KH₂PO₄，pH为7.4。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述含青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲液中，青霉素的浓度为100U/ml，链霉素的浓度为0.1mg/ml。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述细胞培养液是包含10-30％胎牛血清和5-15ng/mL的EGF的D-MEM/F12培养液。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述细胞培养液是包含20％胎牛血清和10ng/mL的EGF的D-MEM/F12培养液。

7.一种利用权利要求1～6中任一项所述的方法制备的间充质干细胞。