CN104560862B - 分离脂肪组织活细胞方法、医药组合物及其用途、细胞库 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种分离脂肪组织活细胞方法、医药组合物及其用途、细胞库，以解决现有以手持刀具切碎脂肪组织作为分离脂肪组织中活细胞的前置步骤，仅能分离出少量活细胞且具较低的细胞存活率的缺点；本发明的方法包括：提供一脂肪组织；利用一切割装置将前述脂肪组织均质切碎；于前述已切碎的脂肪组织中加入一试剂进行水解；进一步离心分离；移除上清液，以获取一细胞沉淀物；借此，可缩短切碎脂肪组织的时间，且避免刀具重复使用造成污染，并提高自每单位重量的脂肪组织获得活细胞数，且不降低细胞存活率，作为分离脂肪组织活细胞的用途。
Description
技术领域
本发明涉及一种分离脂肪组织活细胞方法、医药组合物及其用途、细胞库，尤其是指一种利用一切割装置将脂肪组织快速均质切碎，以利进一步自脂肪组织中分离出活细胞，以提高自每单位重量的脂肪组织获得活细胞数，且不降低细胞存活率。
背景技术
按，间叶干细胞的来源可自人体许多不同组织分离出来，例如由手术直接切除或经由抽脂手术取得的脂肪组织即为一干细胞丰富的来源，可分离出脂肪干细胞(Adiposetissue-derived stem cells, ADSCs)，其具有的优点有：取得方式侵入性低，对人体伤害小、且一次取得的量较多、可于体外增生培养等；加上脂肪干细胞亦拥有可分化成硬骨、软骨、肌肉以及脂肪细胞的潜力(Zuk et al., 2002)，因此，脂肪干细胞被认为是最具研究发展潜力的干细胞之一。
现今对于手术直接切除而得的块状脂肪组织切碎处理方式尚未有一套合适的自动化系统来搭配使用，而一般切碎处理方式有如中国台湾专利201331366号一种「体外无血清成体干细胞放大培养技术」，其方法中揭示经手术切脂取得脂肪组织块，并进一步利用手术刀具切碎该脂肪组织后与胶原蛋白酶酵素作用，再经分离可得基质血管层细胞(Stromalvascular fraction，SVF)，为基质细胞、血液细胞、血管内皮细胞与脂肪干细胞等共同组合而成。惟，其利用手术刀具切碎脂肪组织的步骤，需要耗费较多时间才得以将脂肪组织尽可能的切碎，以获取较多的基质血管层细胞；而操作切碎步骤的时间越长，对前述基质血管层细胞的存活率影响就越大，以至所获取的脂肪间质干细胞其存活率相对较低。此外，操作人员于操作不同来源检体时较容易因重复使用手术刀具而产生检体交叉污染的风险。
另如中国台湾专利201235471号「包含眼窝脂肪衍生的干细胞（ＯＦＳＣ）的细胞群及彼等的分离与应用」，其方法中揭示由眼眶内腔直接移除的眼窝组织中收集而得，或由眼睑内翻、眼睑外翻、眼睑下垂或眼袋的睑造型手术所收集而得的眼窝脂肪，可简易的使用剪刀或镊子支解该眼窝脂肪组织再与胶原蛋白酶酵素作用，再进行过滤、离心分离以获得细胞沉淀物，并将该细胞沉淀物进行细胞培养以获得具有群落形成能力的细胞。惟，该案所揭示的方法同样存在有使用剪刀或镊子支解该眼窝脂肪组织，需要耗费较多时间才得以将脂肪组织尽可能的切碎，以获取较多的细胞沉淀物；且相对地，其操作切碎步骤的时间越长，对前述细胞沉淀物中细胞的存活率的影响就越大。
综合上述，为了解决上述现有利用手术刀具进行脂肪组织切碎作业所带来的缺失，亟需要一可快速切碎脂肪组织以分离活细胞的方法，在不降低细胞存活率前提下，以进一步提高自每单位重量的脂肪组织取得活细胞数目。
发明内容
本发明的目的在于提供一种分离脂肪组织活细胞方法、医药组合物及其用途、细胞库，以期达到提高自每单位重量的脂肪组织取得活细胞数且不降低细胞存活率的目的。
为了达成上述目的，本发明的解决方案是：
一种分离脂肪组织活细胞方法，其包括有下列步骤：
步骤a提供一脂肪组织；
步骤b将该脂肪组织置于一切割装置的封闭容器中；
步骤c使该切割装置对该封闭容器施予一作用力，令该封闭容器中的一预设切削刀具对该脂肪组织执行快速均质切碎，获得一均质化脂肪组织；
步骤d于前述已切碎的该均质化脂肪组织中加入一试剂，进行水解反应；
步骤e将前述经水解反应处理过的该均质化脂肪组织进行过滤、离心分离；及
步骤f将离心分离后的上清液移除，以获取一细胞沉淀物。
于上述步骤a前可包含一以磷酸缓冲溶液清洗前述脂肪组织的步骤。
上述步骤a中所述的脂肪组织是来自哺乳类动物外科手术切除而得来的块状脂肪组织。
上述哺乳类动物是人类。
上述步骤b中所述的切割装置是一抛弃式的均质机。
上述抛弃式的均质机包含有一抛弃式封闭容器及一动力单元，且该抛弃式封闭容器内具有一切削刀具。
上述步骤c均质切碎条件为于15毫升体积的抛弃式封闭容器内置入1公克至6公克脂肪组织，进行快速均质切碎。
上述步骤c均质切碎较佳条件为于15毫升体积的抛弃式封闭容器内置入3公克脂肪组织，进行快速均质切碎。
上述动力单元的转速为300每分钟转数至3000 每分钟转数，而作用时间为3分钟至10分钟。
上述动力单元的较佳转速为为600每分钟转数至1500 每分钟转数。
上述步骤d中所述的试剂是选自一胰蛋白酶、一中性蛋白酶、一胶酶、一玻尿酸酶、一第一型胶原蛋白酶或一第四型胶原蛋白酶所构成群组之一或其组合。
上述步骤d中所述的水解反应是全程置于一恒温杂交反应烘箱中进行，且条件为摄氏4度至45度、转速为5每分钟转数至50每分钟转数，以及时间0.5小时至24小时。
上述较佳的条件为摄氏37度、转速为15每分钟转数以及时间8小时。
上述步骤e中所述离心的条件为400×g、时间10分钟。
上述步骤e更包含将过滤掉脂肪组织碎渣后所得一过滤液移入一离心管的步骤，以进行离心分离。
上述步骤f中所述的细胞沉淀物是一基质血管层细胞。
上述步骤f之后更包括一步骤g将磷酸缓冲溶液加入前述细胞沉淀物中，清洗前述细胞沉淀物，再次离心以去除含有血水及前述试剂的上清液，获得一清洗后的细胞沉淀物。
上述步骤g之后更包括一步骤h将前述清洗后的细胞沉淀物置入一培养基中培养，以获取一扩增的细胞。
上述培养基包含：一基础培养基、一血清添加物、一第二型纤维母细胞生长因子。
上述血清添加物是一胎牛血清，且使用的体积百分浓度为百分之2至百分之10，而该第二型纤维母细胞生长因子使用浓度为1毫微克/毫升至20毫微克/毫升。
上述扩增的细胞是实质未分化的一脂肪间质干细胞。
上述的脂肪间质干细胞是至少表现细胞表面抗原CD90或CD105或其组合，且不表现CD45的细胞群。
上述的脂肪间质干细胞是应用于细胞治疗的材料、再生医学或细胞组织工程之一或其组合。
一种包含上述的分离脂肪组织活细胞方法所获取前述实质未分化的脂肪间质干细胞在制备细胞治疗的医药组合物的用途，是应用于退化性疾病、修复组织损伤、器官再生或组织再生之一或其组合。
于上述步骤h之后包括一步骤i冷冻保存前述扩增的脂肪间质干细胞，用于更进一步的应用。
一种细胞库，其包含由上述步骤i所冷冻保存的扩增的脂肪间质干细胞。
于上述步骤h之后包括一步骤i`执行诱导分化前述扩增的脂肪间质干细胞，以获取一自前述扩增的脂肪间质干细胞所分化的细胞。
自上述扩增的脂肪间质干细胞所分化的细胞，包括骨细胞、脂肪细胞或软骨细胞之一。
一种医药组合物，其包含上述分离脂肪组织活细胞方法所获取自前述脂肪间质干细胞所分化的细胞或前述实质未分化的脂肪间质干细胞之一或其组合。
采用上述结构后，本发明的功效在于：
缩短切碎脂肪组织步骤所需时间：本发明借由利用前述切割装置可较现有以手术刀具执行切碎的方法更为缩短切碎脂肪组织步骤所需时间，且可降低操作人员间因技巧熟练差异所造成的影响，从而减低脂肪组织中细胞因离开人体时间过长所造成的细胞死亡现象，进而提高细胞存活率。
提高活细胞收获率：本发明借由利用前述切割装置将脂肪组织均质切碎，以增加脂肪组织与所添加的水解反应试剂的接触面积增加，提高水解反应效果，以提高自每单位重量的脂肪组织取得基质血管层细胞的数目，并提高前述基质血管层细胞于进一步培养后，所得的脂肪间质干细胞数目，且不降低细胞存活率。
降低检体交叉污染：本发明是利用一抛弃式封闭容器以及一动力单元对所取得的块状脂肪组织检体进行快速均质切碎步骤，不同来源的检体各置入一抛弃式封闭容器中，可避免操作人员于操作不同来源检体时因误触所造成的交叉污染现象。
获取具有分化潜能的脂肪间质干细胞：借由本发明方法所获取的脂肪间质干细胞系属至少表现细胞表面抗原CD90及CD105，且不表现CD45的细胞群，且具有分化为硬骨、软骨及脂肪的能力，使经本发明方法所获取的脂肪间质干细胞为具有分化潜能的多潜能干细胞的丰富来源。
附图说明
图1为本发明的方法流程图；
图2A为本发明中其一捐赠者的不同脂肪组织公克数可得基质血管层细胞数目比较图；
图2B为说明本发明中其一捐赠者的不同脂肪组织公克数所得基质血管层细胞的存活率比较图；
图2C为本发明中其二捐赠者的不同脂肪组织公克数可得基质血管层细胞数目比较图；
图2D为说明本发明中其二捐赠者的不同脂肪组织公克数所得基质血管层细胞的存活率比较图；
图3A为本发明中经外科手术剪刀处理与均质机不同转速条件下处理脂肪组织可得基质血管层细胞数目比较图；
图3B为本发明中经外科手术剪刀处理与均质机不同转速条件下处理脂肪组织所得基质血管层细胞的存活率比较图；
图4A为本发明中9个捐赠者的脂肪组织以均质机切碎相对手术剪刀的可获基质血管层细胞的总细胞得率比值比较图；
图4B为本发明中9个捐赠者的脂肪组织以均质机切碎相对手术剪刀的可获基质血管层细胞的存活率比值比较图；
图5A为本发明中9个捐赠者的脂肪组织以均质机切碎相对手术剪刀的可获脂肪间质干细胞的总细胞得率比值比较图；
图5B为本发明中9个捐赠者的脂肪组织以均质机切碎相对手术剪刀的可获脂肪间质干细胞的存活率比值比较图；
图6A为本发明中捐赠者身体质量指数与每公克脂肪组织的基质血管层细胞分得率(细胞/公克)关系图；
图6B为本发明中捐赠者身体质量指数与每公克脂肪组织的脂肪间质干细胞分得率(细胞/公克)关系图；
图7A为本发明中脂肪间质干细胞经诱导分化为硬骨细胞后，经碱性磷酸酶染色结果图；
图7B为本发明中脂肪间质干细胞经诱导分化为硬骨细胞后，经冯库萨染色结果图；
图7C为本发明中脂肪间质干细胞经诱导分化为软骨细胞后，经阿尔辛蓝染色结果图；
图7D为本发明中脂肪间质干细胞经诱导分化为脂肪细胞后，经油红O染色结果图；
图8为本发明中步骤b及c的操作示意图。
符号说明
a提供一脂肪组织
b将该脂肪组织置于一切割装置的封闭容器中
c使该切割装置对该封闭容器施予一作用力，令该封闭容器中的一预设切削刀具对该脂肪组织执行快速均质切碎，获得一均质化脂肪组织
d于前述已切碎的该均质化脂肪组织中加入一试剂，进行水解反应
e将前述经水解反应处理过的该均质化脂肪组织进行过滤、离心分离
f将离心分离后的上清液移除，以获取一细胞沉淀物
g将磷酸缓冲溶液加入前述细胞沉淀物中，清洗前述细胞沉淀物，再次离心以去除含有血水及前述试剂的上清液，获得一清洗后的细胞沉淀物
h将前述清洗后的细胞沉淀物置入一培养基中培养，以获取一扩增的细胞
i冷冻保存前述扩增的细胞
i`诱导分化前述扩增的细胞，以获取一自前述扩增的细胞所分化的细胞
1脂肪组织 1A均质化脂肪组织
2均质机 21抛弃式封闭容器
211切削刀具 22动力单元。
具体实施方式
为了进一步解释本发明的技术方案，下面通过具体实施例来对本发明进行详细阐述。
首先，请参图1，本发明方法的流程图，本发明提供一种分离脂肪组织活细胞方法，其包括下列步骤：步骤a提供一脂肪组织，其来自哺乳类动物外科手术切除而得来的块状脂肪组织，而本发明以来自人类外科手术切除而得来的块状脂肪组织为实施例；步骤b将该脂肪组织1置于一抛弃式的均质机2的抛弃式封闭容器21中的步骤，该均质机2(DT-20 gamma,IKA ULTRA TURRAX Tube drive)包含有一15毫升容积的抛弃式封闭容器21及一动力单元22，且该抛弃式封闭容器21内具有一切削刀具211(参图8)；步骤c使该动力单元22对该抛弃式封闭容器21施予一作用力，令该抛弃式封闭容器21中的切削刀具211对该脂肪组织1执行快速均质切碎，获得一均质化脂肪组织1A(参图8)，本发明将1公克至6公克脂肪组织1置入该抛弃式封闭容器21内，进行均质切碎，而较佳实施例为将3公克脂肪组织1置入该抛弃式封闭容器21内，进行均质切碎。较佳的是，前述动力单元22的转速为300每分钟转数至3000每分钟转数，而作用时间为3分钟至10分钟；而较佳转速为600每分钟转数至1500每分钟转数，最佳转速为1200每分钟转数；步骤d于前述已切碎的该均质化脂肪组织1A中加入一试剂，进行水解反应，其中该试剂选自一胰蛋白酶(Trypsin)、一中性蛋白酶(Dispase)、一胶酶(Gelatase)、一玻尿酸酶(Hyaluronidase)、一第一型胶原蛋白酶(Collagenase type I)或一第四型胶原蛋白酶(Collagenase type IV)所构成群组之一或其组合；较佳的是，本发明以该第一型胶原蛋白酶或该第四型胶原蛋白酶(Worthington BiochemicalCorporation)为实施例，且使用浓度为0.2毫克/毫升至20毫克/毫升；较佳的是，前述水解反应全程置于一恒温杂交反应烘箱(MO-01, Double Eagle Enterprise)中进行，且条件为温度摄氏4度至45度、转速为5每分钟转数至50每分钟转数以及时间0.5小时至24小时，而最佳条件为温度摄氏37度、转速为15每分钟转数以及时间8小时。步骤e将前述经水解反应处理过的脂肪组织先过滤掉脂肪组织碎渣以获得一过滤液，其中前述过滤方式可以任何技术领域中已知的方式(例如滤膜或滤网)进行以获得前述过滤液；再将该过滤液移入一50毫升体积的离心管进行离心分离，而前述离心的条件为400×g，时间10分钟；及步骤f将分离后的上清液移除，以获取一细胞沉淀物，该细胞沉淀物是一基质血管层细胞(StromalVascular Fraction , SVF)，其由一基质细胞、一血液细胞、一血管内皮细胞与一脂肪间质干细胞所组成。
较佳的是，前述步骤f之后更包括一步骤g将磷酸缓冲溶液加入前述细胞沉淀物中，清洗前述细胞沉淀物，再次离心以去除含有血水及前述试剂的上清液，获得一清洗后的细胞沉淀物。较佳的是，前述步骤g之后更包括一步骤h将前述清洗后的细胞沉淀物置入一培养基中培养，以获取扩增的实质未分化的一脂肪间质干细胞。较佳的是，前述脂肪间质干细胞系属细胞表面抗原CD45 －、CD90 ＋ 及CD105 ＋的细胞群。较佳的是，前述培养基包含：一基础培养基(IMDM)、一血清添加物、一第二型纤维母细胞生长因子；其中，该血清添加物是一胎牛血清，且使用的体积百分浓度为百分之2至百分之10，而该第二型纤维母细胞生长因子使用浓度为1毫微克/毫升至20毫微克/毫升，较佳为10毫微克/毫升。
较佳的是，于前述步骤h之后包括一步骤i冷冻保存前述扩增的脂肪间质干细胞，用于更进一步的应用，例如临床医学研究、再生医学研究或细胞组织工程的发展。较佳的是，亦可于前述步骤h之后包括一步骤I`执行诱导分化前述扩增的脂肪间质干细胞，以获取自前述扩增的脂肪间质干细胞所分化的细胞，而前述分化的细胞包含有骨细胞、脂肪细胞或软骨细胞之一。
本发明同时提供一种细胞库，包含前述步骤i所冷冻保存的扩增的脂肪间质干细胞。
较佳的是，此处所使用的「冷冻保存」一词通常是指将细胞加入冷冻保护剂如二甲亚砜(DMSO)或是甘油后冷却至零下的温度保存的方法，例如为负80℃或是负196℃(液态氮的沸点)。冷冻保存可如熟知此技艺的人士所进行的方法与流程，惟非本发明诉求重点因此不予赘述 (参阅1997年HummaPress公司所出版第2版Pollard，J.W.与Walker，J.M.．所著基础细胞培养流程；2000年Wiley-Liss公司所出版第4版Freshney, R.I.，所著动物细胞的培养)。
本发明再提供一种医药组合物，其包含前述步骤i`所获自前述扩增的脂肪间质干细胞所分化的细胞或前述实质未分化的脂肪间质干细胞之一或其组合。
较佳的是，前述医药组合物包含前述脂肪间质干细胞、自前述脂肪间质干细胞所分化的细胞、前述脂肪间质干细胞所分泌的一细胞分泌物或是前述脂肪间质干细胞的一细胞萃取物之一或其组合与合适的治疗上可接受的一载体/赋形剂。较佳的是，熟知本项技术领域的技艺人士者皆知，原则上任何经由研究报导指出适合由人类间质干细胞所治疗的状况或是疾病，皆可由本发明的医药组合物所治疗。其中像是干细胞移植可有效的作为特定治疗用途；例如，生成造血族的干细胞可用于代替骨髓中的造血系统；生成间质族系的干细胞可用于修复肌肉骨骼疾病；干细胞分化为上皮族系者可用于修复表面损伤；干细胞分化为神经细胞族系者可用于治疗神经退化性疾病。
较佳的是，本发明的方法所获取的脂肪间质干细胞系属至少表现细胞表面抗原CD90及CD105，且不表现CD45的细胞群，且同时具有分化为硬骨、软骨及脂肪的潜能，使经本发明方法所获取的脂肪间质干细胞为具有分化潜能的多潜能干细胞的丰富来源，且同时具有细胞治疗潜在的临床应用性。因此，本发明的方法所获取的脂肪间质干细胞可应用于细胞治疗的材料、再生医学及细胞组织工程上，例如未来可运用在治疗或延缓退化性疾病、修复组织损伤、器官再生或组织再生。
本发明的实施例是以取自人类外科手术切除而得来的块状脂肪组织的实施例予以示范阐明，但本发明不受下述实施例所限制。
「实验一」分离脂肪组织中基质血管层细胞
1. 每公克脂肪组织可得基质血管层细胞的细胞数及细胞存活率
本实验于佛教慈济综合医院所属通过ISO14644 Class 7认证的基因与干细胞再生实验室内进行，且本实验操作人员的训练是依循人体细胞组织优良操作规范(GTP)进行。本发明搜集来自敏盛医院11位剖腹产捐赠者的腹部皮下脂肪组织块检体，重量各约30公克，且本发明所搜集的检体是通过敏盛医院内部审查委员会批准进行。先以其中两位捐赠者的检体进行本实验，其一捐赠者的检体重量分为1公克、2公克、3公克、4公克、5公克及6公克等六组，而其二捐赠者的检体重量分为1公克、2公克、3公克、4公克、5公克等五组，进行分离，其分离步骤如前所述般，不再赘述，而细胞存活率测定部分是将各别所得的基质血管层细胞以一碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)染色后，经一自动细胞计数仪(Adam-MC,NanoEnTek)来计算各组所分离出的基质血管层细胞数；另基质血管层细胞的细胞数测定是先以一细胞膜溶解缓冲溶液将细胞膜打破，再以碘化丙啶染细胞核的DNA，借此以避免该基质血管层细胞所包含的红血球细胞影响该基质血管层细胞数目的计数，以获得较精确的细胞数目测定值。
1.1 实验结果
本实验数据经微软Excel软件t测试(t-test)统计分析, 以p＜0.05 为显著水平，并将结果量化为统计图。请先参阅图2A，前述其一捐赠者的不同脂肪组织公克数可得基质血管层细胞数目比较图，由结果发现，取3公克脂肪组织置入前述15毫升体积的抛弃式封闭容器中进行均质切碎的那组，其每公克脂肪组织可得基质血管层细胞的细胞数目超过2.5×105个，为最高的一组；续参图2B，前述其一捐赠者的不同脂肪组织公克数所得基质血管层细胞存活率比较图，由结果可发现，取3公克脂肪组织置入前述15毫升体积的抛弃式封闭容器中进行均质切碎的那组，其细胞存活率超过百分之80，为较高的一组。另参图2C，前述其二捐赠者的不同脂肪组织公克数可得基质血管层细胞数目比较图，由结果可发现，同样取3公克脂肪组织置入前述15毫升体积的抛弃式封闭容器中进行均质切碎的那组，其每公克脂肪组织可得基质血管层细胞的细胞数目超过7.0×104个，为最高的一组；续参图2D，前述其二捐赠者的不同脂肪组织公克数所得基质血管层细胞存活率比较图，由结果可发现，取3公克脂肪组织置入前述15毫升体积的抛弃式封闭容器中进行均质切碎的那组，其细胞存活率约百分之90，为较高的一组。借由上述实验得知，取3公克脂肪组织块置入前述15毫升体积的抛弃式封闭容器中进行均质切碎为较佳条件，可于每公克脂肪组织获得该基质血管层细胞的较佳细胞数目及较佳细胞存活率。
2. 外科手术刀具与本发明中抛弃式的均质机不同转速条件对细胞数目及细胞存活率的影响比较
本实验是取前述其一捐赠者的脂肪组织块，并分为外科手术剪刀组、转速400组、转速600组、转速1200组及转速1500组等五组，进行脂肪组织的均质切碎步骤，以利后续该基质血管层细胞的分离，而后续分离步骤与前述方法相同；且本实验的细胞存活率测定方法与基质血管层细胞的细胞数测定方法皆与前述实验相同，不再赘述。
2.1 实验结果
本实验数据经微软Excel软件t测试(t-test)统计分析, 以p＜0.05 为显著水平，并将结果量化为统计图。参图3A所示，外科手术剪刀处理与该均质机不同转速条件下处理脂肪组织可得基质血管层细胞数目比较图。由结果可知，在该均质机转速1200那组，获得约1.2×106个细胞数目，为最高的一组，远超过该外科手术剪刀组所能获得的细胞数目。续参图3B，外科手术剪刀处理与该均质机不同转速条件下处理脂肪组织所得基质血管层细胞的存活率比较图。由结果可知，在该均质机转速1200那组，其所获得基质血管层细胞的存活率约为百分之80，为较高的一组，而该外科手术剪刀组所获得基质血管层细胞的存活率却不到百分之70。借由上述实验结果可知，借由本发明方法中以该均质机取代现有手术刀具进行脂肪组织块的均质切碎作业，不仅可以提高所获得基质血管层细胞的细胞数目，且又不会降低该基质血管层细胞的细胞存活率。
3. 抛弃式的均质机处理相对手术剪刀处理下，所得基质血管层细胞的总细胞得率比值与存活率比值比较
本实验是利用前述9个捐赠者的腹部皮下块状脂肪组织检体，各分为手术剪刀组与均质机转速1200组等两组，各组取3公克脂肪组织块进行均质切碎作业，以利后续该基质血管层细胞的分离，而后续分离步骤与前所述方法相同。本实验的细胞存活率测定方法与基质血管层细胞的细胞数测定方法皆与前述实验相同，不再赘述；惟，将所得结果转换为均质机/手术剪刀的比值(倍)方式呈现。
3.1 实验结果
本实验数据经微软Excel软件t测试(t-test)统计分析, 以p＜0.05 为显著水平，并将结果量化为统计图。参图4A，本发明中9个捐赠者的脂肪组织以该均质机切碎相对手术剪刀的可获基质血管层细胞的总细胞得率比值(倍)比较图。由结果可发现，在前述9个捐赠者的脂肪组织以本发明方法中该均质机切碎相对手术剪刀的可获基质血管层细胞的总细胞得率比值(倍)介于1.3倍至10.2倍间，比值大小因个体而异。续参图4B，本发明中9个捐赠者的脂肪组织以该均质机切碎相对手术剪刀的所获基质血管层细胞的细胞存活率比值(倍)比较图。由结果可发现，在前述9个捐赠者的脂肪组织以本发明方法中该均质机切碎相对手术剪刀的所获基质血管层细胞的细胞存活率比值(倍)介于0.9倍至2.3倍间，比值大小因个体而异。由此可知，本发明的方法中以该均质机取代现有手术刀具进行脂肪组织块的均质切碎作业，不仅可以提高所获得基质血管层细胞的细胞数目，且又不会降低该基质血管层细胞的细胞存活率。
4. 抛弃式的均质机处理相对手术剪刀处理下，所得脂肪间质干细胞的总细胞得率比值与存活率比值比较
本实验的分组方式与前述「实验一」的3.相同，且进一步将各组所得的基质血管层细胞培养于一培养基中5天，以获取脂肪间质干细胞，并分析均质机处理相对手术剪刀处理下，对所得脂肪间质干细胞的总细胞得率与存活率的影响。前述培养基包含有：一胎牛血清添加物(GIBCO-Invitrogen)、一第二型纤维母细胞生长因子(FGF-2, R&D Systems)的基础培养基(IMDM, GIBCO-Invitrogen)中；其中，该胎牛血清添加物使用的体积百分浓度为百分之2至百分之10，该第二型纤维母细胞生长因子使用浓度为10毫微克/毫升。每组的基质血管层细胞以每平方公分10000颗细胞(cells/cm2)的细胞密度培养于细胞培养盘中(Becton Dickinson)，且所有细胞皆培养于摄氏37度、百分之5二氧化碳分压及百分之95湿度环境下的培养箱(Forma Series II Model 3110, Thermo)，并每3天更换一次培养基。将培养5天后各组脂肪间质干细胞以磷酸盐缓冲溶液(PBS)清洗过一次后，以胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Trypsin-EDTA, GIBCO-Invitrogen)溶液于摄氏37度作用5分钟后再以细胞刮勺小心移除未被作用完全的细胞，加入等比例含胎牛血清的培养基中和胰蛋白酶的酵素作用活性。细胞存活率的测定是以一细胞计算器(Vi-CELL AS, Beckman Coulter)计算。存活的细胞以0.4%台盼蓝(Trypan-blue, GIBCO-Invitrogen)来与死细胞作区别，计算时判定活的间质干细胞的参数设定为：100 images, 大小 10至30微米，75%现场亮度，5%现场区域。另各组的脂肪间质干细胞分得率是利用倍增时间(DT)的公式来进行计算，DT = t/(3.32[log10Nt - log10N0])，其中Nt指细胞最后密度，而N0指细胞起始密度。本实验同样将所得结果转换为均质机/手术剪刀的比值(倍)方式呈现。
4.1 实验结果
本实验数据经微软Excel软件t测试(t-test)统计分析, 以p＜0.05 为显著水平，并将结果量化为统计图。参图5A，本发明中9个捐赠者的脂肪组织以该均质机切碎相对手术剪刀的可获脂肪间质干细胞的总细胞得率比值比较图。由结果显示可知，在前述9个捐赠者的脂肪组织以本发明方法中该均质机切碎相对手术剪刀的可获脂肪间质干细胞的总细胞得率比值(倍)介于1.2倍至7.8倍间，比值大小因个体而异。续参图5B，本发明中9个捐赠者的脂肪组织以该均质机切碎相对手术剪刀的所获脂肪间质干细胞的细胞存活率比值(倍)比较图。由结果可发现，在前述9个捐赠者的脂肪组织以本发明方法中该均质机切碎相对手术剪刀的所获脂肪间质干细胞的细胞存活率比值(倍)介于0.8倍至4.8倍间，比值大小因个体而异。由此可知，本发明的方法中以该均质机取代现有手术刀具进行脂肪组织块的均质切碎作业，不仅可以提高所获得脂肪间质干细胞的细胞数目，且又不会降低该脂肪间质干细胞的细胞存活率。
5. 捐赠者的身高体重指数(BMI)与每公克脂肪组织中基质血管层细胞及脂肪间质干细胞的分得率关系
本实验针对前述9个捐赠者的身高体重指数与前述抛弃式的均质机处理及现有外科手术剪刀处理所得实验结果结合，以进一步分析身高体重指数与每公克脂肪组织中基质血管层细胞及脂肪间质干细胞的分得率关系。
5.1 实验结果
参图6A，本发明中9位捐赠者身高体重指数与每公克脂肪组织的基质血管层细胞分得率(细胞/公克)关系图。图中本发明中抛弃式的均质机组的各点，经回归计算出一R2为0.0794的趋势虚线，而该外科手术剪刀组的各点，经回归计算出一R2为0.0155的趋势实线，由此可看出，本发明的方法相较外科手术剪刀组在捐赠者身高体重指数相对较低时，可以自每公克脂肪组织中获取较多的基质血管层细胞。续参图6B，本发明中9位捐赠者身高体重指数与每公克脂肪组织的脂肪间质干细胞分得率(细胞/公克)关系图。图中本发明中该抛弃式的均质机组的各点，经回归计算出一R2为0.3262的趋势虚线，而该外科手术剪刀组的各点，经回归计算出一R2为0.2146的趋势实线，由此可看出，本发明的方法相较外科手术剪刀组在捐赠者身高体重指数相对较高时，可以自每公克脂肪组织中获取较多的脂肪间质干细胞。
「实验二」 经本发明方法所获得的脂肪间质干细胞的分析与应用
1. 典型间叶干细胞的细胞表面抗原分析
本实验是以流式细胞仪(FACSCalibur, Becton Dickinson)进行细胞表面抗原的测定。将经本发明方法所获得的脂肪间质干细胞继代培养后，以胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Trypsin-EDTA)溶液于摄氏37度作用5分钟去附着，并以磷酸缓冲液清洗回收后离心，移除上清液以获得一细胞沉淀物，再回溶于适量的磷酸缓冲液中，分别对不同的抗原以相对应的免疫荧光一级抗体进行染色，包括CD13、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105、β2微球蛋白(B2M)以及 HLA-DR等抗体(Becton Dickinson)。避光于室温下染色15分钟后，加入适量磷酸缓冲液后上机分析，经流式细胞仪收集数据后，以流式细胞仪分析软件(FACSCalibur,Becton Dickinson)进行分析。其中负控制组为省略上述一级抗体的染色步骤。
1.1 实验结果
参下列表一，由结果可以发现经本发明方法所获得的脂肪间质干细胞，其细胞族群为CD13 ＋、CD34 －、CD44 ＋、CD45 －、CD73 ＋、CD90 ＋、CD105 ＋，为类似间质干细胞的细胞族群，亦即表示说，经本发明方法所获得的脂肪间质干细胞仍保有类似间质干细胞的表面抗原特征。
表一. 细胞表面抗原分析
| 细胞表面抗原 | 百分比(%) |
| CD13 | 100.0 |
| CD34 | 2.0 |
| CD44 | 99.9 |
| CD45 | 0.1 |
| CD73 | 99.9 |
| CD90 | 100.0 |
| CD105 | 97.4 |
| HLA-DR | 0.3 |
2. 脂肪间质干细胞的分化
文献报导指出，脂肪间质干细胞具有分化成中胚层细胞的能力，像是脂肪和骨头细胞。本实验是将脂肪间质干细胞经适当诱导分化培养后，使其分化成硬骨细胞、软骨细胞及脂肪细胞，以确认经本发明方法所获得的脂肪间质干细胞，是否仍具有干细胞多功能性分化能力。本发明中的诱导分化实验是依据现有文献中已被普遍使用的干细胞诱导分化系统(Kanda et al., 2011；Song et al., 2010)，因非本案诉求重点因此不予赘述，其主要目的是于确认经本发明方法所获得的脂肪间质干细胞，是否仍具有干细胞多功能性分化能力。分化的硬骨细胞以碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, ALP)进行染色，该碱性磷酸酶为成熟骨母细胞分化的重要指标，而其染色方法是依照现有染色技术进行(Yoshimura etal., 2011)，在此不再赘述；另再进行一现有的冯库萨(Von-kossa)染色，以确认有磷酸钙的存在。分化的软骨细胞是以阿尔辛蓝染色法(Alcian blue)来确认软骨组织中拥有的蛋白多醣(Proteoglycan)的存在(Song et al., 2010)。分化的脂肪细胞以油红O染色(Oilred O staining)，以确认是否有脂质空泡(Lipid vacuoles)的存在(Kanda et al.,2011)。
2.1 实验结果
参图7A，是碱性磷酸酶染色结果，比例尺为500 微米(μm)，经本发明方法所获得的脂肪间质干细胞，经诱导分化为硬骨细胞，经碱性磷酸酶染色后，有呈现黑色结晶的部分，亦即代表碱性磷酸酶的存在；续参图7B，是冯库萨(Von-kossa)染色结果，比例尺为500 微米，可发现呈现有黑色或茶褐色的磷酸钙结晶，再次说明了经本发明方法所获得的脂肪间质干细胞具有分化为硬骨细胞的能力。再参图7C，是阿尔辛蓝染色结果，比例尺为500 微米，可发现呈现出蓝色的蛋白多醣染色结果，代表经本发明方法所获得的脂肪间质干细胞具有分化为软骨细胞的能力。续参图7D，是油红O染色结果，比例尺为500 微米，可发现有呈现出红色的脂质空泡染色结果，亦即代表经本发明方法所获得的脂肪间质干细胞具有分化为脂肪细胞的能力。经由上述分化结果可得知，经本发明方法所获得的脂肪间质干细胞确实具有干细胞多功能性分化能力。
综合上述实验结果可知，本发明的方法中以一抛弃式的均质机取代现有手术刀具进行脂肪组织块的均质切碎作业，不仅可以提高所获得脂肪间质干细胞的细胞数目，且又不会降低该脂肪间质干细胞的细胞存活率。另经本发明方法所获得的脂肪间质干细胞确实具有间质干细胞的细胞表面抗原特征以及多功能性分化能力，令本发明方法所获得的脂肪间质干细胞为具有分化潜能的多潜能干细胞的丰富来源，且同时具有细胞治疗潜在的临床应用可能性。借此可进一步将前述脂肪间质干细胞做为制备医药组成物之用，以应用于细胞治疗的材料、再生医学及细胞组织工程上，例如未来可运用在治疗或延缓退化性疾病、修复组织损伤、器官再生及组织再生；亦或冷冻保存前述脂肪间质干细胞并建立一细胞库以为后续应用，例如临床医学研究、再生医学研究或细胞组织工程的发展。
上述实施例和附图并非限定本发明的产品形态和式样，任何所属技术领域的普通技术人员对其所做的适当变化或修饰，皆应视为不脱离本发明的专利范畴。
Claims (20)
1.一种分离脂肪组织活细胞中的基质血管层细胞的方法，其特征在于，包括有下列步骤：
步骤a提供一人类的脂肪组织；
步骤b将该脂肪组织置于一切割装置的封闭容器中；
步骤c使该切割装置对该封闭容器施予一作用力，令该封闭容器中的一预设切削刀具对该脂肪组织执行快速均质切碎，获得一均质化脂肪组织；
步骤d于前述已切碎的该均质化脂肪组织中加入一试剂，进行水解反应；
步骤e将前述经水解反应处理过的该均质化脂肪组织进行过滤、离心分离；及
步骤f将离心分离后的上清液移除，以获取一细胞沉淀物，其中前述步骤b中所述的切割装置是一抛弃式的均质机，前述抛弃式的均质机包含有一抛弃式封闭容器及一动力单元，且该抛弃式封闭容器内具有一切削刀具；前述步骤c均质切碎条件为于15毫升体积的抛弃式封闭容器内置入3公克至6公克脂肪组织，且所述均质机的转速为1200每分钟转数至1500每分钟转数，而作用时间为3分钟至10分钟，以进行快速均质切碎。
2.如权利要求1所述的分离脂肪组织活细胞中的基质血管层细胞的方法，其特征在于：于步骤a前可包含一以磷酸缓冲溶液清洗前述脂肪组织的步骤。
3.如权利要求1所述的分离脂肪组织活细胞中的基质血管层细胞的方法，其特征在于：步骤c均质切碎较佳条件为于15毫升体积的抛弃式封闭容器内置入3公克脂肪组织，进行快速均质切碎。
4.如权利要求1所述的分离脂肪组织活细胞中的基质血管层细胞的方法，其特征在于：前述步骤d中所述的试剂是选自一胰蛋白酶(Trypsin)、一中性蛋白酶(Dispase)、一胶酶(Gelatase)、一玻尿酸酶(Hyaluronidase)、一第一型胶原蛋白酶(Collagenase type I)或一第四型胶原蛋白酶(Collagenase type IV)所构成群组之一或其组合。
5.如权利要求1所述的分离脂肪组织活细胞中的基质血管层细胞的方法，其特征在于：前述步骤d中所述的水解反应是全程置于一恒温杂交反应烘箱中进行，且条件为摄氏4度至45度、转速为5每分钟转数至50每分钟转数，以及时间0.5小时至24小时。
6.如权利要求5所述的分离脂肪组织活细胞中的基质血管层细胞的方法，其特征在于：条件为摄氏37度、转速为15每分钟转数以及时间8小时。
7.如权利要求1所述的分离脂肪组织活细胞中的基质血管层细胞的方法，其特征在于：前述步骤e中所述离心的条件为400×g、时间10分钟。
8.如权利要求1所述的分离脂肪组织活细胞中的基质血管层细胞的方法，其特征在于：前述步骤e更包含将过滤掉脂肪组织碎渣后所得一过滤液移入一离心管的步骤，以进行离心分离。
9.如权利要求1所述的分离脂肪组织活细胞中的基质血管层细胞的方法，其特征在于：前述步骤f中所述的细胞沉淀物是一基质血管层细胞。
10.如权利要求1所述的分离脂肪组织活细胞中的基质血管层细胞的方法，其特征在于：前述步骤f之后更包括一步骤g将磷酸缓冲溶液加入前述细胞沉淀物中，清洗前述细胞沉淀物，再次离心以去除含有血水及前述试剂的上清液，获得一清洗后的细胞沉淀物。
11.如权利要求10所述的分离脂肪组织活细胞中的基质血管层细胞的方法，其特征在于：前述步骤g之后更包括一步骤h将前述清洗后的细胞沉淀物置入一培养基中培养，以获取一扩增的细胞。
12.如权利要求11所述的分离脂肪组织活细胞中的基质血管层细胞的方法，其特征在于：所述培养基包含：一基础培养基、一血清添加物、一第二型纤维母细胞生长因子。
13.如权利要求12所述的分离脂肪组织活细胞中的基质血管层细胞的方法，其特征在于：该血清添加物是一胎牛血清，且使用的体积百分浓度为百分之2至百分之10，而该第二型纤维母细胞生长因子使用浓度为1毫微克/毫升至20毫微克/毫升。
14.如权利要求11所述的分离脂肪组织活细胞中的基质血管层细胞的方法，其特征在于：所述扩增的细胞是实质未分化的一脂肪间质干细胞。
15.如权利要求14所述的分离脂肪组织活细胞中的基质血管层细胞的方法，其特征在于：所述的脂肪间质干细胞是至少表现细胞表面抗原CD90或CD105或其组合，且不表现CD45的细胞群。
16.如权利要求14所述的分离脂肪组织活细胞中的基质血管层细胞的方法，其特征在于：于前述步骤h之后包括一步骤i`执行诱导分化前述扩增的脂肪间质干细胞，以获取一自前述扩增的脂肪间质干细胞所分化的细胞。
17.如权利要求16所述的分离脂肪组织活细胞中的基质血管层细胞的方法，其特征在于：自前述扩增的脂肪间质干细胞所分化的细胞，包括骨细胞、脂肪细胞或软骨细胞之一。
18.一种脂肪间质干细胞在制备用于细胞治疗、再生医学或细胞组织工程之一或其组合的医药组合物的用途，其特征在于，所述的脂肪间质干细胞是由权利要求15所述的方法获取的脂肪间质干细胞。
19.一种脂肪间质干细胞在制备用于更进一步的应用的医药组合物的用途，其特征在于，所述的脂肪间质干细胞是由权利要求14所述的方法获取的扩增的脂肪间质干细胞于前述步骤h之后包括一步骤i冷冻保存。
20.一种脂肪间质干细胞在制备用于治疗退化性疾病、修复组织损伤、器官再生或组织再生之一或其组合的医药组合物的用途，其特征在于，所述的脂肪间质干细胞是由权利要求14所述的方法获取的实质未分化的脂肪间质干细胞。
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