CN1923851A - 固相多肽合成生长抑素的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种固相多肽合成生长抑素的制备方法。本发明的方法包括如下步骤：以三苯甲基树脂、4－甲基三苯甲基树脂或4－甲氧基三苯甲基树脂为起始原料，按固相合成的方法依次连接保护氨基酸，获得保护的十四肽树脂，其间依次脱去Fmoc－保护基，脱侧链保护基团、切肽，获得还原型生长抑素，并在pH7－11用空气氧化，获得生长抑素粗品，再经C18(或C8)高压柱分离纯化，制得生长抑素精品。本发明的方法，具备规模化生产能力，工艺稳定，原辅材料来源方便，生产周期短，收率高，质量稳定，生产成本低，接肽收率高，避免使用氟化氢等剧毒试剂，三废污染少，每步接肽收率均在99％以上；切肽后收率为：95.4％，纯化收率高于25％以上，总收率为：25％。
Description
技术领域
本发明涉及生长抑素的制备方法，尤其涉及固相多肽合成生长抑素的制备方法。
背景技术
中文名：生长抑素。其他名称：生长抑素释放抑制激素，商品名：施他宁。英文名：Somatostatin，Stilamin。
结构式：
分子式及分子量：C76H104N18O19S2，1637.9。
临床用途：严重急性食管静脉曲张破裂出血，严重急性胃、十二指肠溃疡出血，急性糜烂性胃炎或出血性胃炎，胰、胆和肠屡的辅助治疗，糖尿病酮症酸中毒的辅助治疗。
不良反应：少数病例有恶心、旋晕、面部潮红。注射速度高于每分钟50μg时，可发生恶心和呕吐现象。
生长抑素是下丘脑的正中隆起和胰岛的δ细胞合成的。1973年由Burgus和Brazean等人首先由下丘脑分离得到并阐明其结构。化学结构为分子内带有一对二硫键的十四肽。其生物功能可抑制腺体释放生长激素、抑制促甲状腺和肾上腺皮质激素、抑制胰腺的内分泌与外分泌、抑制胃粘膜释放胃泌素、抑制肠粘膜释放肠促胰激素和肾脏释放肾素，降低门静脉压力、松弛胆道口括约肌、刺激单核巨噬细胞系统而减轻内毒素血症，抑制血小板活化因子的释放，直接或间接调节细胞因子链产生细胞保护作用，并可增强抗癌药物的抗增殖作用。
在国外，合成的生长抑素早已成为商品用于临床，并于1997年收载入欧洲药典。瑞士的Serono公司生产的生长抑素，其商品名为施他宁(Stilamin)，迄今为止也是世界上唯一的生产公司，目前独占我国市场，注册证号为，X930471。
1985龚岳亭院士发表的论文[1]，选用Wang树脂作为起始物，采用片段固相缩合法合成，总收率可高达36％，但该法需预先制备四个片段肽，反应周期太长，操作十分繁琐。
中国专利02155189.8公开了一种生长抑素的制备方法，该方法用2-氯三苯甲基树脂作固相载体，在该树脂首先连接保护半胱氨酰基(Fmoc-Cys(Trt)-)，采用Fmoc保护氨基酸的程序接肽法完成生长抑素线肽的合成，用三氟醋酸一次脱除线肽侧链保护基团，并切割树脂，得到生长抑素线肽的三氟醋酸。该中间产物在双氧水或二甲基亚砜水溶液中氧化环合，得到生长抑素三氟醋酸盐粗制品。该粗制品经C#-[18]键合硅胶中压柱，用甲醇-水梯度洗脱方法分离纯化，得生长抑素三氟醋酸精制产品。该产品用醋酸离子交换树指交换，并冷冻干燥得最终产品。该专利所存在的一个显著缺陷是：以三氟醋酸盐的形式进行纯化，污染环境；中间产物在双氧水或二甲基亚砜水溶液中氧化环合，三废污染严重；用C#-[18]键合硅胶中压柱进行纯化，则因中压柱的柱效低且又费时，纯化收率低而成本大大提高。因此目前的方法限制了生长抑素的大规模生产和使用。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是公开一种固相多肽合成生长抑素的制备方法，以克服现有技术存在的上述缺陷。
本发明的方法包括如下步骤：
以三苯甲基树脂、(Trityl Chloride Resin)、4-甲基三苯甲基树脂(4-MethyltritylChloride Resin)或4-甲氧基三苯甲基树脂(4-Methoxytrityl Chloride Resin)为起始原料，按照固相合成的方法依次连接具有保护基团的氨基酸，获得保护的十四肽树脂，其间依次脱去Fmoc-保护基团，用TBTU或HBTU及HOBT为缩合剂进行接肽反应，得保护的还原型十四肽树脂后，同步进行脱侧链保护基团及切肽，获得还原型生长抑素，并在pH7-11的条件下用空气氧化，获得生长抑素粗品，再经C18(或C8)高压柱(柱效高而快速)进行分离纯化，再经冷冻干燥后，制得生长抑素精品。
按照本发明，依次连接具有保护基团的氨基酸，获得保护十四肽树脂，其间依次脱去Fmoc-保护基团的方法包括如下步骤：
(1)制备Fmoc-Cys(Trt)-树脂：
称50克取三苯甲基树脂、4-甲基三苯甲基树脂或4-甲氧基三苯甲基树脂50克(100-400目，0.3-1.5mmol/g)，用500mlDMF浸泡10～60分钟，使树脂充分溶胀，加30-60ml DIPEA，Fmoc-Cys(Trt)-OH，10-50℃反应0.5-5小时。再加甲醇10-60ml，10-50℃反应0.5-5小时。氮气吹干，树脂用DMF洗三次，氮气吹干。
所说的树脂取代量为：0.3-1.5mmol/g；
混合物中：
树脂的重量体积浓度为5～20ml/g；下同。
Fmoc-Cys(Trt)-OH的摩尔数为树脂的2～5倍。
(2)制备Fmoc-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂：
在步骤(1)的Fmoc-Cys(Trt)-树脂中，加入脱帽试剂，10～50℃反应5～60分钟，吹干，用DMF洗涤，吹干，加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Ser(tBu)-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，20～30℃反应0.5～5小时，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂；
混合物中：
所说的脱帽试剂为：PIP∶DMF＝1∶2～5，体积比，下同；
所说的接肽试剂为：NMM∶DMF＝1∶5～15，体积比，下同；
树脂的重量与接肽试剂的加入量的比例为5～20ml/g，下同；
树脂的重量体积浓度为5～20ml/g；下同；
TBTU/HBTU的摩尔数为树脂的2～5倍。下同；
HOBT摩尔数为树脂的2～5倍；下同；
Fmoc-Ser(tBu)-OH的摩尔数为树脂的2～5倍。
树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为5～20ml/g，下同；
(3)制备Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂
在步骤(2)的Fmoc-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入脱帽试剂，反应，吹干，用DMF洗涤，吹干。加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Thr(tBu)-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂；
混合物中：
树脂的重量与接肽试剂的加入量的比例为5～20ml/g；
Fmoc-Thr(tBu)-OH的摩尔数为树脂的2～5倍；
其余操作以及工艺条件同上；
(4)制备Fmoc-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂：
在步骤(3)的Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入脱帽试剂，反应，吹干，用DMF洗涤，吹干。加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Phe-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂；
混合物中：
树脂的重量与接肽试剂的加入量的比例为5～20ml/g；
Fmoc-Phe-OH的摩尔数为树脂的2～5倍；
其余操作以及工艺条件同上；
(5)制备Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂：
在步骤(4)的Fmoc-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入脱帽试剂，反应，吹干，用DMF洗涤，吹干。加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Thr(tBu)-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂；
混合物中：
树脂的重量与接肽试剂的加入量的比例为5～20ml/g；
Fmoc-Thr(tBu)-OH的摩尔数为树脂的2～5倍；
其余操作以及工艺条件同上；
(6)制备Fmoc-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂：
在步骤(5)的Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入脱帽试剂，反应，吹干，用DMF洗涤，吹干，加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Lys(Boc)-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂；
混合物中：
树脂的重量与接肽试剂的加入量的比例为5～20ml/g；
Fmoc-Lys(Boc)-OH的摩尔数为树脂的2～5倍。
其余操作以及工艺条件同上；
(7)制备Fmoc-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂：
在步骤(6)的Fmoc-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入脱帽试剂，反应，吹干，用DMF洗涤，吹干，加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Trp-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂；
混合物中：
树脂的重量与接肽试剂的加入量的比例为5～20ml/g；
Fmoc-Trp-OH的摩尔数为树脂的2～5倍；
其余操作以及工艺条件同上；
(8)制备Fmoc-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂：
在步骤(7)的Fmoc-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入脱帽试剂，反应，吹干，用DMF洗涤，吹干，加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Phe-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂；
混合物中：
树脂的重量与接肽试剂的加入量的比例为5～20ml/g；
Fmoc-Phe-OH的摩尔数为树脂的2～5倍。
其余操作以及工艺条件同上；
(9)制备Fmoc-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂：
在步骤(8)的Fmoc-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入脱帽试剂，反应，吹干，用DMF洗涤，吹干，加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Phe-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)树脂：
混合物中：
树脂的重量与接肽试剂的加入量的比例为5～20ml/g；
Fmoc-Phe-OH的摩尔数为树脂的2～5倍；
其余操作以及工艺条件同上。
(10)制备Fmoc-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂：
在步骤(9)的Fmoc-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入脱帽试剂，反应，吹干，用DMF洗涤，吹干，加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Asn(Trt)-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)树脂：
混合物中：
树脂的重量与接肽试剂的加入量的比例为5～20ml/g；
Fmoc-Asn(Trt)-OH的摩尔数为树脂的2～5倍；
其余操作以及工艺条件同上。
(11)制备Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂：
在步骤(10)的Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入脱帽试剂，反应，吹干，用DMF洗涤，吹干，加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Lys(Boc)-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂：
混合物中：
树脂的重量与接肽试剂的加入量的比例为5～20ml/g；
Fmoc-Lys(Boc)-OH的摩尔数为树脂的2～5倍；
其余操作以及工艺条件同上。
(12)制备Fmoc-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂：
在步骤(11)的Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入脱帽试剂，反应，吹干，用DMF洗涤，吹干，加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Cys(Trt)-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂：
混合物中：
树脂的重量与接肽试剂的加入量的比例为5～20ml/g；
Fmoc-Cys(Trt)-OH的摩尔数为树脂的2～5倍；
其余操作以及工艺条件同上。
(13)制备Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂：
在步骤(12)的Fmoc-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入脱帽试剂，反应，吹干，用DMF洗涤，吹干，加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Gly-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂：
混合物中：
树脂的重量与接肽试剂的加入量的比例为5～20ml/g；
Fmoc-Gly-OH的摩尔数为树脂的2～5倍；
其余操作以及工艺条件同上。
(14)制备Boc-Ala-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂：
在步骤(13)的Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入脱帽试剂，反应，吹干，用DMF洗涤，吹干，加入用接肽试剂溶解的Boc-Ala-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Boc-Ala-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂：
混合物中：
树脂的重量与接肽试剂的加入量的比例为5～20ml/g；
Boc-Ala-OH的摩尔数为树脂的2～5倍；
其余操作以及工艺条件同上。
(15)制备Ala-Gly-Cys(SH)-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys(SH)-OH：
在步骤(14)的Boc-Ala-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入预冷至-10℃～30℃的切肽试剂(TFA/EDT/H2O/TIS＝90-95/2-5/2-5/1-5，体积比)，10℃～50℃反应1～5小时，减压蒸除溶剂，加入乙醚沉淀，收集沉淀物，用乙醚洗，P2O5真空干燥，获得切肽后的还原型生长抑素；
切肽试剂中，树脂的浓度为：5～50ml/g；
(16)制备
在步骤(15)的Ala-Gly-Cys(SH)-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys(SH)-OH中，用氢氧化钠或氨水调节pH至7-12，在10℃～50℃下，通入空气或氧气氧化反应8～30小时，获得生长抑素粗品。
按照本发明，粗品经C18(或C8)柱分离纯化分离纯化的方法包括如下步骤：
将生长抑素粗品溶于乙酸中，过滤，滤液经C18(或C8)柱纯化，流动相：0.1MNH4Ac∶乙腈(7.5∶2.5)；流速为100-650ml/min；检测波长为：280nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液，样品峰合并后去盐，冻干，获得成品(MW：1638)，总收率为22-30％(以树脂的mmol计)。
乙酸的重量浓度为0.5～10％，乙酸中生长抑素粗品的重量浓度为1～50％。
本发明的生长抑素工艺路线有下列特点，具备规模化生产能力，工艺稳定，原辅材料来源方便，生产周期短，生产成本低，三废少，收率高，质量稳定，生产成本低，极具市场竞争力，接肽收率高(每步接肽收率为≥98％)，降低了成本，采用切肽试剂(TFA/EDT/H2O/TIS)进行切肽，加入乙醚沉淀粗品的方法，避免使用氟化氢等剧毒试剂，三废污染少，且提高收率，采用C18(或C8)柱进行分离纯化，避免使用TFA(三氟醋酸)进行纯化，减少三废，纯化收率高达25％以上，每步接肽收率均在98％以上；切肽后收率为：95.4％，总收率为22-30％。
具体实施方式
实施例1
实施例和前述过程中所采用的原料列表如下：
| No | 原料及试制品名 | 来源 |
| 1 | 三苯甲基类树脂 | 天津和成科技有限公司 |
| 2 | Boc-Ala-OH | 四川三高生化股份有限公司 |
| 3 | Fmoc-Asn(Trt)-OH | 四川三高生化股份有限公司 |
| 4 | Fmoc-Cys(Trt)-OH | 四川三高生化股份有限公司 |
| 5 | Fmoc-Gly-OH | 四川三高生化股份有限公司 |
| 6 | Fmoc-Lys(Boc)-OH | 四川三高生化股份有限公司 |
| 7 | Fmoc-Phe-OH | 四川三高生化股份有限公司 |
| 8 | Fmoc-Ser(Tbu)-OH | 四川三高生化股份有限公司 |
| 9 | Fmoc-Thr(tBu)-OH | 四川三高生化股份有限公司 |
| 10 | Fmoc-Trp-OH | 四川三高生化股份有限公司 |
| 11 | HOBt | 四川三高生化股份有限公司 |
| 12 | TBTU | 四川三高生化股份有限公司 |
| 13 | 三氟乙酸(TFA) | 美国Fluka公司 |
| 14 | N-甲基吗啡啉(NMM) | 美国Fluka公司 |
| 15 | 乙二硫醇(EDT) | 美国Fluka公司 |
| 16 | 三异丙基硅烷(TIS) | 美国Fluka公司 |
| 17 | 乙腈 | 美国Merck公司 |
| 18 | 二甲基甲酰胺(DMF) | 美国Merck公司 |
| 19 | 甲醇 | 上海振兴化工一厂 |
| 20 | 六氢吡啶(PIP) | 上海化学试剂公司 |
| 19 | DIPEA(N，N’Diisopropylethylamine) | 美国Fluka公司 |
| 20 | DMAP(4-Dimethylaminopyridine) | 美国Fluka公司 |
实施例中：
所说的接肽试剂为：NMM∶DMF＝1∶10，体积比；
所说的脱帽试剂为：PIP∶DMF＝1∶3.5，体积比；
合成肽链
(1)制备Fmoc-Cys(Trt)-树脂：
称取三苯甲基树脂50克(100-400目，1.0mmol/g)，用500mlDMF浸泡30分钟，使树脂充分溶胀，加DIPEA 44ml，Fmoc-Cys(Trt)-OH 87.9g，25℃反应1小时。再加甲醇20ml，25℃反应1小时。氮气吹干，树脂用DMF洗三次，氮气吹干。
(2)制备Fmoc-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂：
在步骤(1)的Fmoc-Cys(Trt)-树脂中，加入脱帽试剂500ml，25℃反应30分钟，吹干，用DMF洗涤，吹干，加入用400ml接肽试剂溶解的Fmoc-Ser(tBu)-OH 57.5g、TBTU 48.1g和HOBT 20.2g的混合物，25℃反应2小时，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂；
(3)制备Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂
在步骤(2)的Fmoc-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入脱帽试剂500ml，25℃反应30分钟，吹干，用DMF洗涤，吹干。加入用400ml接肽试剂溶解的Fmoc-Thr(tBu)-OH59.6g、TBTU 48.1g和HOBT 20.2g的混合物，25℃反应2小时，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂；
混合物中：
Fmoc-Thr(tBu)-OH的摩尔数为树脂的2～5倍。
其余操作以及工艺条件同上；
(4)制备Fmoc-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂：
在步骤(3)的Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入500ml脱帽试剂，25℃反应30分钟，吹干，用DMF洗涤，吹干。加入用400ml接肽试剂溶解的Fmoc-Phe-OH58.1g、TBTU 48.1g和HOBT 20.2g的混合物，25℃反应2小时，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂；
(5)制备Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂：
在步骤(4)的Fmoc-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入500ml脱帽试剂，反应，吹干，用DMF洗涤，吹干。加入用400ml接肽试剂溶解的Fmoc-Thr(tBu)-OH 59.6g、TBTU 48.1g和HOBT 20.2g的混合物，25℃反应2小时，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂；
混合物中：
Fmoc-Thr(tBu)-OH的摩尔数为树脂的2～5倍；
其余操作以及工艺条件同上；
(6)制备Fmoc-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂：
在步骤(5)的Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入500ml脱帽试剂，反应，吹干，用DMF洗涤，吹干。加入用400ml接肽试剂溶解的Fmoc-Lys(Boc)-OH 70.3、TBTU 48.1g和HOBT 20.2g的混合物，25℃反应2小时，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂；
(7)制备Fmoc-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂：
在步骤(6)的Fmoc-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入500ml脱帽试剂，反应，吹干，用DMF洗涤，吹干。加入用400ml接肽试剂溶解的Fmoc-Trp-OH 64g、TBTU 48.1g和HOBT 20.2g的混合物，25℃反应2小时，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂；
(8)制备Fmoc-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂：
在步骤(7)的Fmoc-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入500ml脱帽试剂，反应，吹干用DMF洗涤，吹干，加入用400ml接肽试剂溶解的Fmoc-Phe-OH 58.1g、TBTU 48.1g和HOBT 20.2g的混合物，25℃反应2小时，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂；
(9)制备Fmoc-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂：
在步骤(8)的Fmoc-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入500ml脱帽试剂，反应，吹干，用DMF洗涤，吹干。加入用400ml接肽试剂溶解的Fmoc-Phe-OH 58.1g、TBTU 48.1g和HOBT 20.2g的混合物，25℃反应2小时，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)树脂。
(10)制备Fmoc-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂：
在步骤(9)的Fmoc-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入500ml脱帽试剂，反应，吹干，用DMF洗涤，吹干，加入用400ml接肽试剂溶解的Fmoc-Asn(Trt)-OH 89.5g、TBTU 48.1g和HOBT 20.2g的混合物，25℃反应2小时，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)树脂：
(11)制备Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂：
在步骤(10)的Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入500ml脱帽试剂，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，加入用400ml接肽试剂溶解的Fmoc-Lys(Boc)-OH 70.3g、TBTU 48.1g和HOBT20.2g的混合物，25℃反应2小时，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂。
(12)制备Fmoc-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂：
在步骤(11)的Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入500ml脱帽试剂，反应，吹干，用DMF洗涤，吹干，加入用400ml接肽试剂溶解的Fmoc-Cys(Trt)-OH 87.9g、TBTU 48.1g和HOBT20.2g的混合物，25℃反应2小时，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂。
(13)制备Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂：
在步骤(12)的Fmoc-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入500ml脱帽试剂，反应，吹干，用DMF洗涤，吹干，加入用400ml接肽试剂溶解的Fmoc-Gly-OH 44.6g、TBTU 48.1g和HOBT 20.2g的混合物，25℃反应2小时，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂：
(14)制备Boc-Ala-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂：
在步骤(13)的Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入500ml脱帽试剂，反应，吹干，用DMF洗涤，吹干，加入用400ml接肽试剂溶解的Boc-Ala-OH 28.4g、TBTU 48.1g和HOBT 20.2g的混合物，25℃反应2小时，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Boc-Ala-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂，约得保护的十四肽树脂130g。
(15)制备Ala-Gly-Cys(SH)-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys(SH)-OH
在步骤(14)的Boc-Ala-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入预冷至0℃的切肽试剂(TFA/EDT/H2O/TIS＝1260ml/56ml/35ml/14ml)，25℃反应3小时，减压除溶剂后，加入500ml乙醚沉淀，收集沉淀物，用乙醚洗，P2O5真空干燥，获得切肽后的还原型生长抑素，约60g。
(16)制备
在步骤(15)的Ala-Gly-Cys(SH)-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys(SH)-OH中，用氨水调节pH至7.9，在30℃下，通入空气进行氧化反应24小时。获得生长抑素粗品。
将生长抑素粗品溶于5％乙酸中，过滤，滤液经C18柱纯化，流动相：0.1MNH4Ac∶乙腈(7.5∶2.5)；流速为350ml/min；检测波长为：280nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液，样品峰合并后去盐，冻干，获得成品16.2g(MW：1638)，总收率为25％。
实施例2
采用与实施例1相同的方法和工艺条件，其中：
以4-甲氧基三苯甲基树脂作起始原料，同前法接上Fmoc-Cys(Trt)-OH后，再加入脱帽试剂，25℃反应0.5小时，加入用接肽试剂溶解的Fmoc-氨基酸、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，25℃反应2小时，再经切肽、氧化等反应，得到14.8g白色疏松块状物成品。
Claims (7)
1.一种固相多肽合成生长抑素的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
以三苯甲基树脂作树脂、4-甲基三苯甲基树脂或4-甲氧基三苯甲基树脂为起始原料，按固相合成的方法依次连接具有保护基团的氨基酸，获得保护的十四肽树脂，其间依次脱去Fmoc-保护基团，用TBTU或HBTU及HOBT为缩合剂进行接肽反应，得保护的还原型十四肽树脂后，同步进行脱侧链保护基团及切肽，获得还原型生长抑素，并在pH7-11的条件下用空气氧化，获得生长抑素粗品，再经C18或C8高压柱分离纯化，冷冻干燥后，制得生长抑素精品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，依次连接具有保护基团的氨基酸，获得保护十四肽树脂，其间依次脱去Fmoc-保护基团的方法包括如下步骤：
(1)制备Fmoc-Cys(Trt)-树脂：
取三苯甲基树脂或4-甲基三苯甲基树脂或4-甲氧基三苯甲基树脂(100-400目，0.3-1.5mmol/g)，用DMF浸泡，使树脂溶胀，加DIPEA或DMAP，Fmoc-Cys(Trt)-OH反应，再加甲醇继续反应，氮气吹干，树脂用DMF洗涤，获得Fmoc-Cys(Trt)-树脂；
混合物中：
树脂的重量体积浓度为5～20ml/g；下同；
Fmoc-Cys(Trt)-OH的摩尔数为树脂的2～5倍；
树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为5～20ml/g，下同；
(2)制备Fmoc-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂：
在步骤(1)的Fmoc-Cys(Trt)-树脂中，加入脱帽试剂，反应，吹干，用DMF洗涤，吹干，加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Ser(tBu)-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Ser(tBu)-Cys(Trt)树脂；
混合物中：
所说的脱帽试剂为：PIP∶DMF＝1∶2～5，下同；
所说的接肽试剂为：NMM∶DMF＝1∶5～15，体积比，下同；
Fmoc-Ser(tBu)-OH的摩尔数为树脂的2～5倍；
树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为5～20ml/g，下同；
(3)制备Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂
在步骤(2)的Fmoc-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入脱帽试剂，反应，吹干，用DMF洗涤，吹干。加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Thr(tBu)-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂；
混合物中：
Fmoc-Thr(tBu)-OH的摩尔数为树脂的2～5倍；
其余操作以及工艺条件同上；
(4)制备Fmoc-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂：
在步骤(3)的Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入脱帽试剂，反应，吹干，用DMF洗涤，吹干，加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Phe-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂；
混合物中：
Fmoc-Phe-OH的摩尔数为树脂的2～5倍；
其余操作以及工艺条件同上；
(5)制备Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂：
在步骤(4)的Fmoc-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入脱帽试剂，反应，吹干，用DMF洗涤，吹干。加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Thr(tBu)-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂；
混合物中：
Fmoc-Thr(tBu)-OH的摩尔数为树脂的2～5倍；
其余操作以及工艺条件同上；
(6)制备Fmoc-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂：
在步骤(5)的Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入脱帽试剂，反应，吹干，用DMF洗涤，吹干，加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Lys(Boc)-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂；
混合物中：
Fmoc-Lys(Boc)-OH的摩尔数为树脂的2～5倍。
其余操作以及工艺条件同上；
(7)制备Fmoc-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂：
在步骤(6)的Fmoc-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入脱帽试剂，反应，吹干，用DMF洗涤，吹干，加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Trp-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂；
混合物中：
Fmoc-Trp-OH的摩尔数为树脂的2～5倍；
其余操作以及工艺条件同上；
(8)制备Fmoc-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂：
在步骤(7)的Fmoc-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入脱帽试剂，反应，吹干，用DMF洗涤，吹干，加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Phe-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂；
混合物中：
Fmoc-Phe-OH的摩尔数为树脂的2～5倍。
其余操作以及工艺条件同上；
(9)制备Fmoc-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂：
在步骤(8)的Fmoc-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入脱帽试剂，反应，吹干，用DMF洗涤，吹干，加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Phe-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，吹于，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)树脂：
混合物中：
Fmoc-Phe-OH的摩尔数为树脂的2～5倍；
其余操作以及工艺条件同上；
(10)制备Fmoc-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂：
在步骤(9)的Fmoc-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入脱帽试剂，反应，吹干，用DMF洗涤，吹干，加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Asn(Trt)-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂：
混合物中：
Fmoc-Asn(Trt)-OH的摩尔数为树脂的2～5倍；
其余操作以及工艺条件同上；
(11)制备Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂：
在步骤(10)的Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入脱帽试剂，反应，吹干，用DMF洗涤，吹干，加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Lys(Boc)-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂：
混合物中：
Fmoc-Lys(Boc)-OH的摩尔数为树脂的2～5倍；
其余操作以及工艺条件同上；
(12)制备Fmoc-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂：
在步骤(11)的Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入脱帽试剂，反应，吹干，用DMF洗涤，吹干，加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Cys(Trt)-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂：
混合物中：
Fmoc-Cys(Trt)-OH的摩尔数为树脂的2～5倍；
其余操作以及工艺条件同上；
(13)制备Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂：
在步骤(12)的Fmoc-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入脱帽试剂，反应，吹干，用DMF洗涤，吹干，加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Gly-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂：
混合物中：
Fmoc-Gly-OH的摩尔数为树脂的2～5倍；
其余操作以及工艺条件同上；
(14)制备Boc-Ala-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂：
在步骤(13)的Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入脱帽试剂，反应，吹干，用DMF洗涤，吹干，加入用接肽试剂溶解的Boc-Ala-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Boc-Ala-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂：
混合物中：
Boc-Ala-OH的摩尔数为树脂的2～5倍；
其余操作以及工艺条件同上。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，加入脱帽试剂，10～50℃反应5～60分钟，加入用接肽试剂后，20～50℃反应0.5～5小时。
4.根据权利要求1所述的方法即步骤(15)，其特征在于，所说的切肽包括如下步骤：将权利要求2步骤(14)中所获得的Boc-Ala-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂加入预冷至-10℃～30℃的切肽试剂(TFA/EDT/H2O/TIS＝90-95/2-5/2-5/1-5，体积比)中，10℃～50℃反应1～5小时，减压蒸除溶剂，加入乙醚沉淀，收集沉淀物，用乙醚洗，P2O5真空干燥，获得切肽后的粗品。
5.根据权利要求1所述的方法即步骤(16)，其特征在于，用氢氧化钠或氨水调节pH至7-12，在10℃～50℃下，通入空气或氧气进行氧化反应8-30小时，获得生长抑素粗品。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，粗品经C18或C8柱分离纯化分离纯化的方法包括如下步骤：
将生长抑素粗品溶于乙酸中，过滤，滤液经C18或C8高压柱进行纯化，流动相：0.1MNH4Ac∶乙腈(8-6∶2-4)；流速为100-650ml/min；检测波长为：280nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液，样品峰合并后去盐，冻干，获得成品(MW：1638)，总收率25％。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，乙酸铵的重量浓度为0.01～10％。乙腈的重量浓度为10～40％。
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|---|---|
| CN (1) | CN1923851A (zh) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101531699B (zh) * | 2009-04-30 | 2012-02-15 | 昆明积大制药有限公司 | 一种多肽固相合成法 |
| CN101508724B (zh) * | 2009-04-09 | 2012-05-23 | 吴永平 | 十四肽生长抑素的制备方法 |
| CN102952175A (zh) * | 2011-08-19 | 2013-03-06 | 上海苏豪逸明制药有限公司 | 固相多肽合成生长抑素的方法 |
| CN101357938B (zh) * | 2007-07-31 | 2013-07-03 | 周逸明 | 固相多肽合成Exenatide的制备方法 |
| CN101570570B (zh) * | 2009-06-03 | 2013-07-10 | 兰州大学 | 一种生长抑素的合成方法 |
| CN103275189A (zh) * | 2013-06-06 | 2013-09-04 | 深圳翰宇药业股份有限公司 | 一种用于肽树脂的裂解液及其在固相裂解合成生长抑素中的应用 |
| CN109180803A (zh) * | 2018-10-18 | 2019-01-11 | 成都天台山制药有限公司 | 生长抑素及其制备方法和药物组合物 |
-
2005
- 2005-08-30 CN CNA2005100292208A patent/CN1923851A/zh active Pending
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101357938B (zh) * | 2007-07-31 | 2013-07-03 | 周逸明 | 固相多肽合成Exenatide的制备方法 |
| CN101508724B (zh) * | 2009-04-09 | 2012-05-23 | 吴永平 | 十四肽生长抑素的制备方法 |
| CN101531699B (zh) * | 2009-04-30 | 2012-02-15 | 昆明积大制药有限公司 | 一种多肽固相合成法 |
| CN101570570B (zh) * | 2009-06-03 | 2013-07-10 | 兰州大学 | 一种生长抑素的合成方法 |
| CN102952175A (zh) * | 2011-08-19 | 2013-03-06 | 上海苏豪逸明制药有限公司 | 固相多肽合成生长抑素的方法 |
| CN103275189A (zh) * | 2013-06-06 | 2013-09-04 | 深圳翰宇药业股份有限公司 | 一种用于肽树脂的裂解液及其在固相裂解合成生长抑素中的应用 |
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Open date: 20070307 |