CN101570570B - 一种生长抑素的合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生长抑素的一种液相合成方法,其合成方法为:首先分别全合成Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl、Boc-Phe-Trp-Lys(Z)-OH、Boc-Asn-Phe-OH和Boc-Ala-Gly-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-OH四4个片段肽,再用EDCI/HOBt进行片段缩合,合成全保护的还原性十四肽,用三氟甲磺酸和苯甲醚系统脱肽链所有的保护基,得到还原性生长抑素,对还原性生长抑素氧化,获得生长抑素粗品,再经C18制备柱分离纯化,冷冻干燥后,得生长抑素。
Description
技术领域
本发明涉及生长抑素的一种液相合成方法。
背景技术
中文名:生长抑素。其他名:生长激素释放抑制激素。商品名:施他宁。英文名:Somatostatin,Stilamin。
分子式:C76H104N18O19S2;分子量:1637.8。
生长抑素是下丘脑的正中隆起和胰岛的细胞合成的。1973年由Burgus和Brazean等人首先在下丘脑分离得到并阐述其结构。化学结构为分子内带有一对二硫键的十四肽。人工合成的生长抑素已成为商品用于临床,并于1997年收载入欧洲药典。
生长抑素的药理作用如下::①可以抑制生长激素、甲状腺刺激激素、胰岛素、胰高血糖素的分泌。②可以抑制由试验餐和5肽胃泌素刺激的胃酸分泌,可抑制胃蛋白酶、胃泌素的释放。③可以显著减少内脏血流,降低门静脉压力,降低侧枝循环的血流和压力,减少肝脏血流量。④减少胰腺的内外分泌以及胃小肠和胆囊的分泌,降低酶活性,对胰腺细胞有保护作用。⑤抑制胰高血糖素的分泌。⑥可影响胃肠道吸收和营养功能。药物的适应症为:用于肝硬化门脉高压所致的食管静脉出血;消化性溃疡应激性溃疡、糜烂性胃炎所致的上消化道出血;预防和治疗急性胰腺炎及其并发症;胰、胆、肠瘘的辅助治疗;其他:肢端肥大症、胃泌素瘤、胰岛素瘤及血管活性肠肽瘤。
固相多肽合成法合成生长抑素的报道:1973至1974年,Donald Yamashiro和Jean E.F.Rivier等人分别报道了采用氯甲基树脂固相合成生长抑素,采用常规的固相合成方法合成保护十四肽,但采用HF脱侧链保护;中国专利02155189.8、03128951.7、200510029220.8等采用三苯甲基、2-氯三苯甲基、4-甲氧基、4-甲基树脂为起始原料,按固相合成的方法依次连接Fmoc保护氨基酸,得到保护十四肽树脂,再用TFA切肽试剂脱保护,用空气或MDSO氧化环化,得到生长抑素粗品,最后经C18或C8高压柱分离得到生长抑素精品。虽然具有接肽速率快,收率高,周期短等优点,但仍存在问题:随着合成的肽链的增长,会出现空间位阻等空间因素,阻碍氨基酸的合成,且合成过程易消旋,使产品旋光度降低。因此,为使反应完全每步接肽需要3-5倍的羧基组分和缩合剂且价格昂贵,需大量的DMF和乙醇洗涤(约200ml/mmol),浪费原料和试剂,还需要昂贵的多肽合成仪等大型设备。还有,固相合成产物的纯化难度大、周期长,生产规模较小,成本高。
液相多肽合成法合成生长抑素的报道:美国专利USP.4,337,194;3,862,295;3,917,578和德国L.Moroder,加拿大Hans U.Immer等人与1973年至1981年报道了采用液相多肽合成法合成本品的方法。在L.Moroder和Hans U.Immer等报道的液相合成法合成本品的方法中,采用Z保护氨基酸进行接肽,需要多步H2/Pd反应,理论操作难,且难以大量制备。USP 3,862,295和D.Sarantakis等人的报道中,采用氟化氢去保护,实验设备和氟化氢的储运都难以实现。USP3,917,578和Roy Wade等人采用合成十四线肽后,先氧化形成二硫键,再去保护,使二硫键的形成具有位阻降低了收率。因此这些技术方案均难以作为大量生产的方法。
发明内容
本发明提供一种可解决上述中的不足,设计操作简单,反应过程消旋度底,纯度和收率高,生产成本低,产品质量好的合成生长抑素方法。
本发明的生长抑素合成方法为液相法,它是首先分别全合成Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl、Boc-Phe-Trp-Lys(Z)-OH、Boc-Asn-Phe-OH和Boc-Ala-Gly-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-OH四4个片段肽,再用EDCI/HOBt进行片段缩合,合成全保护的还原性十四肽,用三氟甲磺酸和苯甲醚系统脱肽链所有的保护基,得到还原性生长抑素,对还原性生长抑素氧化,获得生长抑素粗品,再经C18制备柱分离纯化,收集样品洗脱液冻干后,得生长抑素精品。
本发明的合成方法中,片段I:TFA·Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl的合成方法是:
以Boc-Cys(Mob)-OBzl为起始原料,用TFA/CH2Cl2(1/1,v)脱掉Boc后作为氨基组分,Boc-Ser(Bzl)-OH作为羧基组分,采用混合酸酐法合成二肽Boc-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl,再用TFA/CH2Cl2脱掉Boc得到氨基组分,依次用混合酸酐法接Boc-Thr(Bzl)-OH、Boc-Phe-OH、Boc-Thr(Bzl)-OH得到Boc-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl,用TFA/CH2Cl2(1/1,v)脱Boc,用乙醚沉淀,异丙醇重结晶得到TFA·Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl。
片段II:Boc-Phe-Trp-Lys(Z)-OH的合成方法是:
以NH2-Lys(Z)-OMe作为氨基组分,采用混合酸酐法接肽,TFA/CH2Cl2(1/1,v)脱Boc,依次接Boc-Trp-OH、Boc-Phe-OH,得到三肽Boc-Trp-Phe-Lys(Z)-OMe,2N NaOH皂化,得到Boc-Phe-Trp-Lys(Z)-OH。
片段III:Boc-Asn-Phe-OH的合成方法是:
以NH2-Phe-OMe作为氨基组分,Boc-Asn-OH作为羧基组分,采用碳二亚胺法,DIC作为活化剂,合成Boc-Asn-Phe-OMe,2N NaOH皂化,得到Boc-Asn-Phe-OH。
片段IV:Boc-Ala-Gly-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-OH的合成方法是:
以NH2-Lys(Z)-OMe作为氨基组分,采用混合酸酐法接肽,TFA/CH2Cl2(1/1,v)脱Boc,依次接Boc-Cys(MeOBzl)-OH、Boc-Gly-OH、Boc-Ala-OH得到Boc-Ala-Gly-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-OMe,2N NaOH皂化,得到Boc-Ala-Gly-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-OH。
本发明中的片段缩合方法是:
首先以片段II:Boc-Phe-Trp-Lys(Z)-OH为羧基组分,片段I:TFA·Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl为氨基组分,EDCI/HOBT为缩合剂,采用碳二亚胺法合成八肽化合物V:Boc-Phe-Trp-Lys(Z)-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl;该八肽化合物用TFA/CH2Cl2脱Boc后作为氨基组分,片段III:Boc-Asn-Phe-OH作为羧基组分,用EDCI/HOBT进行片段缩合,得到十肽化合物VI:Boc-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Z)-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl;该十肽化合物VI用TFA/CH2Cl2(1/1,v)脱Boc后作为氨基组分,片段IV:Boc-Ala-Gly-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-OH作为羧基组分,用EDCI/HOBT进行片段缩合得到线性全保护十四肽VII:Boc-Ala-Gly-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Z)-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl。
本发明中所说的混合酸酐接肽法是指:它是以N-甲基吗啉为催化剂,采用氯甲酸烷基酯活化羧基,所用氯甲酸烷基酯为氯甲酸乙酯、氯甲酸丙酯、氯甲酸异丙酯、氯甲酸丁酯或氯甲酸异丁酯(ClCOOR,R=Et、Pr、iPr、Bu、iBu),优先选用氯甲酸异丁酯为活化剂,活化氨基端已保护氨基酸的羧基形成高活性的混合酸酐,与氨基端裸露的氨基酸或肽反应生成多肽片段。合成过程包括混合酸酐的生成-过滤-减压浓缩-酸碱洗涤-干燥除水-得到多肽片段。碳二亚胺法是指:用碳二亚胺类的缩合剂如:N,N′-二异丙基碳二亚胺(DIC)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)和1-羟基苯并三唑(HOBt)形成复合的活化剂来活化羧基,与氨基端裸露的氨基酸或肽反应生成多肽片段。经过常规的酸碱洗涤,干燥,浓缩得到固体或反应液倒入水中直接得到固体,干燥后得到多肽片段。TFA/CH2Cl2脱Boc一般方法是:称取氨基端叔丁氧羰基(Boc)保护的氨基酸或多肽片段加入适量体积的二氯甲烷,冷却至0℃以下,加入与二氯甲烷等体积的三氟乙酸,加完恢复室温反应,TLC检测反应结束后,减压浓缩,残物用乙酸乙酯溶解,用稀的碱液洗至溶液中性,饱和食盐水洗,干燥,过滤,浓缩得氨基端裸露的多肽片段。
本发明中的还原性生长抑素的合成是:
将合成的生长抑素全保护的线性肽加到5mmol/mLCF3SO3H的三氟乙酸溶液,以苯甲醚为清除剂,在0℃进行反应,反应结束后用乙醚析出固体,过滤收集固体并干燥处理得还原性生长抑素粗品;
本发明中的氧化环合与纯化工艺是:
将得到的线性粗肽进行室温氧化环合,经自然氧化后进行冻干处理得生长抑素粗品,将粗品溶入水中,经过滤,滤液C18制备柱分离纯柱纯化后合并样品峰洗脱液,冻干处理获得生长抑素。
本发明的合成方法参见下式:
本发明中用到的缩写有以下含义:
Thr:苏氨酸
Phe:苯丙氨酸
Ser:丝氨酸
Cys:半胱氨酸
Lys:氨酸
Ala:丙氨酸
Gly:甘氨酸
DCM:二氯甲烷
DCC:N,N′-二环己基碳二亚胺
DIC:N,N′-二异丙基碳二亚胺
EDCI:1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐
HOBt:1-羟基苯并三唑
TFA:三氟乙酸
TFMSA:三氟甲基磺酸
NMM:N-甲基吗啉
Boc:叔丁氧羰基
Z:苄氧羰基
Bzl:苄基
MeOBzl:4-甲氧基-苄基
TLC:薄板层析法
ESI-MS:电喷雾质谱
具体实施方式
步骤1、片段I:TFA·Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl的合成
称取4.1g(13.9mmol)Boc-Ser(Bzl)-OH用50ml四氢呋喃溶解,加入1.53ml(13.9mmol)N-甲基吗啉,在冰盐浴-15℃下,搅拌下缓慢滴加1.8ml(13.9mmol)氯甲酸异丁酯,2-4分钟后,加入在冰箱预冷至0℃以下的Cys(MeOBzl)-OBzl 4.6g(13.9mmol)的四氢呋喃溶液20ml。维持在该低温反应30分钟后撤去冰盐浴,恢复室温反应4-6小时,TLC检测反应结束。过滤除去盐,浓缩滤液,残留物溶于乙酸乙酯,用5%NaOH、水、5%HCl、水、饱和食盐水依次洗涤后,用无水NaSO4干燥,浓缩减压去溶剂,得到白色固体Boc-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl8.04g,产率95%。
将得到的Boc-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl 8.04g倒入圆底烧瓶,加入10ml二氯甲烷,冷却至0℃以下,加入10ml三氟乙酸,加完恢复室温反应,TLC检测反应结束后,减压浓缩,残余物用乙酸乙酯溶解,用5%NaOH洗至溶液中性,饱和食盐水洗,干燥,过滤,浓缩得油状物为Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl(不称重按100%产率计算),所得的油状物为氨基组分用30ml四氢呋喃溶解,放置冰箱预冷至0℃以下备用。再称取Boc-Thr(Bzl)-OH4.08g(13.2mmol)用50ml四氢呋喃溶解,加入1.45ml(13.2mmol)N-甲基吗啉,,在冰盐浴-15℃下,搅拌下缓慢滴加1.72ml(13.2mmol)氯甲酸异丁酯,2-4分钟后,加入预冷至0℃以下溶有Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl的30ml四氢呋喃,维持在-15℃反应30分钟后撤去冰盐浴,恢复室温反应4-6小时,TLC检测反应结束。过滤除去盐,浓缩滤液,残留物溶于乙酸乙酯,用5%NaOH、水、5%HCl、水、饱和食盐水依次洗涤后,用无水NaSO4干燥,浓缩减压去溶剂,得到的白色固体用乙酸乙酯和石油醚结晶,得白色固体Boc-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl 9.8g,产率93%。
将得到的Boc-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl 9.8g倒入圆底烧瓶,加入10ml二氯甲烷,冷却至0℃以下,加入10ml三氟乙酸,加完恢复室温反应,TLC检测反应结束后,减压浓缩,残余物用乙酸乙酯溶解,用5%NaOH洗至溶液中性,饱和食盐水洗,干燥,过滤,浓缩得油状物Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl(不称重按100%产率计算),所得的油状物为氨基组分用30ml四氢呋喃溶解,放置冰箱预冷至0℃以下备用。再称取Boc-Phe-OH3.3g(12.3mmol),用40ml四氢呋喃溶解,加入1.35ml(12.3mmol)N-甲基吗啉,在冰盐浴-15℃下,搅拌下缓慢滴加1.6ml(12.3mmol)氯甲酸异丁酯,2-4分钟后,加入预冷至0℃以下的Cys(MeOBzl)-OBzl 4.6g(13.9mmol)的四氢呋喃溶液20ml。维持在-15℃反应30分钟后撤去冰盐浴,恢复室温反应4-6小时,TLC检测反应结束。过滤除去盐,浓缩滤液,残留物溶于乙酸乙酯,用5%NaOH、水、5%HCl、水、饱和食盐水依次洗涤后,用无水NaSO4干燥,浓缩减压去溶剂,得到白色固体Boc-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl,11.0g产率94%。
将得到的Boc-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl 11g倒入圆底烧瓶,加入10ml二氯甲烷,冷却至0℃以下,加入10ml三氟乙酸,加完恢复室温反应,TLC检测反应结束后,减压浓缩,残余物用乙酸乙酯溶解,用5%NaOH洗至溶液中性,饱和食盐水洗,干燥,过滤,浓缩得油状物为Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl,(不称重按100%产率计算),所得的油状物为氨基组分用30ml四氢呋喃溶解,放置冰箱预冷至0℃以下备用。再称取Boc-Thr(Bzl)-OH 3.6g(11.6mmmol),用30ml四氢呋喃溶解,加入1.17ml(11.6mmol)N-甲基吗啉,在冰盐浴-15℃下,搅拌下缓慢滴加1.51ml(11.6mmol)氯甲酸异丁酯,2-4分钟后,加入预冷至0℃以下的Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl的四氢呋喃溶液30ml。维持在-15℃反应30分钟后撤去冰盐浴,恢复室温反应4-6小时,TLC检测反应结束。过滤除去盐,浓缩滤液,残留物溶于乙酸乙酯,用5%NaOH、水、5%HCl、水、饱和食盐水依次洗涤后,用无水NaSO4干燥,浓缩减压去溶剂,得到白色固体为五肽Boc-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl 12.2g,产率93%。
将得到的五肽化合物12.2g倒入圆底烧瓶中,加入10ml二氯甲烷,冷却至0℃以下,加入10ml TFA,加完恢复室温反应,TLC检测反应结束后,将反应液分次倒入到100-150ml冷的乙醚中,析出白色固体,过滤,用异丙醇结晶得片段I:TFA·Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl 11.8g,总收率73.3%,熔点:140-143℃,ESI-MS[M+H]+:1038.4681(理论分子量:1037.46)
步骤2片段II:Boc-Phe-Trp-Lys(Z)-OH的合成
将8.3g(27.3mmol)Boc-Trp-OH溶于55ml THF中,加入3ml N-甲基吗啉(27.3mmol),冰盐浴冷却至-15℃搅拌下,缓慢滴加3.55ml(27.3mmol)氯甲酸异丁酯,2-4分钟后,加入预冷至0℃以下的溶有9g(27.3mmol)HCl·Lys(Z)-OMe和3ml(27.3mmol)的N-甲基吗啉的50ml N,N-二甲基甲酰胺溶液,维持在-15℃温反应30分钟,撤去冰盐浴,恢复室温反应,TLC检测反应结束后过滤除去盐,浓缩滤液,残留物溶于乙酸乙酯,用5%NaOH、水、5%HCl、水、饱和食盐水依次洗涤后,用无水NaSO4干燥,浓缩减压去溶剂,得到的白色固体用乙酸乙酯和石油醚结晶,得到Boc-Trp-Lys(Z)-OMe 15.1g,产率94%。
将得到Boc-Trp-Lys(Z)-OMe 15.1g倒入圆底烧瓶,加20ml二氯甲烷,苯甲醚4.2ml,巯基乙醇2.7ml,充氩气保护,冷却至0℃以下,加入20ml的三氟乙酸,加完后恢复至室温反应,反应结束后,减压浓缩,残余物用乙酸乙酯溶解,用5%NaOH洗至溶液中性,饱和食盐水洗,干燥,过滤,浓缩得油状物为Trp-Lys(Z)-OMe(不称重按100%产率计算),将该油状物用40ml四氢呋喃溶解,放置冰箱预冷至0℃以下备用,再称取Boc-Phe-OH 6.8g(25.6mmol)用50ml四氢呋喃溶解,加入2.82ml(25.6mmol)N-甲基吗啉,冰盐浴冷却至-15℃搅拌下,缓慢滴加3.33ml(25.6mmol)氯甲酸异丁酯,2-4分钟后,加入预冷至0℃以下的Trp-Lys(Z)-OMe的四氢呋喃溶液,维持在-15℃反应30分钟后撤去冰盐浴,恢复室温反应,反应结束后过滤除去盐,浓缩滤液,残留物溶于乙酸乙酯,用5%NaOH、水、5%HCl、水、饱和食盐水依次洗涤后,用无水NaSO4干燥,浓缩减压去溶剂,得到的固体用乙酸乙酯和石油醚结晶得Boc-Phe-Trp-Lys(Z)-OMe 17.2g,再将其用50ml的N,N-二甲基甲酰胺溶解,0℃滴加2N NaOH25ml进行皂化反应,反应结束后,反应液倒入200ml冰水中,用酸调至pH=2-3,用乙酸乙酯萃取,有机相用水洗至中性,饱和食盐水洗,干燥,浓缩得白色固体为片段II:Boc-Phe-Trp-Lys(Z)-OH 5.3g,收率79%,熔点:187-189℃,ESI-MS[M+H]+:714.35(理论分子量:713.3)
步骤3片段III:Boc-Asn-Phe-OH的合成
称取Boc-Asn-OH 12.028g(51.8mmol),1-羟基苯并三唑(HOBt)14g(0.1mmol),用100mlN,N-二甲基甲酰胺溶解,在冰浴冷却至0℃搅拌下滴加入溶有7.2g(57mmol)N,N′-二异丙基碳二亚胺(DIC)的10mlN,N-二甲基甲酰胺溶液,维持在0℃反应一小时,再恢复室温反应一小时后,反应液再降至0℃以下,在其中加入预冷至0℃以下的溶有苯丙氨酸甲酯盐酸盐(HCl·Phe-OMe)12.278g(57mmol)和N-甲基吗啉6.27ml(57mmol)的100ml N,N-二甲基甲酰胺溶液,维持在0℃搅拌一小时后恢复室温反应,TLC检测反应结束,直接将反应液倒入大量水中,析出大量固体,抽滤,用乙醚洗2次,收集固体晾干,得固体19.9g。200ml的N,N-甲基甲酰胺中,0℃滴加2N NaOH 50ml进行反应,反应结束,将反应液倒入500ml冰水中,加酸调至pH=2-3,析出大量固体,抽滤,用水洗至中性,收集固体,晾干,用异丙醇和石油醚重结晶得白色固体为片段III:Boc-Asn-Phe-OH 17.5g,总收率89%,熔点:176-179℃,ESI-MS[M+H]+:380.18(理论分子量:379.17)
步骤4片段IV:Boc-Ala-Gly-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-OH的合成
将9.1g(26.62mmol)Boc-Cys(MeOBzl)-OH溶于50ml四氢呋喃中,加3ml N-甲基吗啉(26.62mmol),冰盐浴冷却至-15℃搅拌下,缓慢滴加3.46ml(26.62mmol)氯甲酸异丁酯,2-4分钟后,加入预冷至0℃以下的溶有8g HCl·Lys(Z)-OMe和2.7ml N-甲基吗啉的40ml N,N-二甲基甲酰胺溶液,维持在-15℃下反应30分钟后撤去冰浴,恢复室温反应,TLC检测反应结束后过滤除去盐,浓缩滤液,残留物溶于乙酸乙酯,用5%NaOH、水、5%HCl、水、饱和食盐水依次洗涤后,有机相用无水NaSO4干燥,浓缩减压去溶剂,得到的白色固体用乙酸乙酯和石油醚结晶,得到Boc-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-OMe 13.6g,产率91%。
将得到Boc-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-OMe 13.6g倒入圆底烧瓶,加入15ml二氯甲烷,冷却至0℃以下,加入15ml三氟乙酸,加完恢复室温反应,TLC检测反应结束后,减压浓缩,残余物用乙酸乙酯溶解,用5%NaOH洗至溶液中性,饱和食盐水洗,干燥,过滤,浓缩得油状物为Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-OMe(不称重按100%产率计算),该油状物作为氨基组分用40ml四氢呋喃溶解,放置冰箱预冷至0℃以下备用。将3.85g(22mmol)Boc-Gly-OH溶于50ml四氢呋喃中,加2.42ml N-甲基吗啉(22mmol),冰盐浴冷却至-15℃搅拌下,缓慢滴加2.9ml(22mmol)氯甲酸异丁酯,2-4分钟后,加入预冷至0℃以下溶有Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-Ome的四氢呋喃溶液,维持在-15℃反应30分钟,撤去冰盐浴,恢复室温反应,TLC检测反应结束后过滤除去盐,浓缩滤液,残留物溶于乙酸乙酯,用5%NaOH、水、5%HCl、水、饱和食盐水依次洗涤后,用无水NaSO4干燥,浓缩减压蒸去溶剂,得到的固体用乙酸乙酯和石油醚结晶得Boc-Gly-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-OMe 13.9g,产率94%。
将得到13.9g Boc-Gly-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-OMe倒入圆底烧瓶,加入15ml二氯甲烷,冷却至0℃以下,加入15ml三氟乙酸,加完恢复室温反应,TLC检测反应结束后,减压浓缩,残余物用乙酸乙酯溶解,用5%NaOH洗至溶液中性,饱和食盐水洗,干燥,过滤,浓缩得油状物为Gly-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-OMe(不称重按100%产率计算),该油状物作为氨基组分用40ml四氢呋喃溶解,放置冰箱预冷至0℃以下备用。将3.9g(20.7mmol)Boc-Ala-OH溶于50ml四氢呋喃中,加2.3ml N-甲基吗啉(20.7mmol),冰盐浴冷却至-15℃搅拌下,缓慢滴加2.7ml(20.7mmol)氯甲酸异丁酯,2-4分钟后,加入预冷至0℃以下溶有Gly-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-Ome的四氢呋喃溶液,维持在-15℃反应30分钟后撤去冰盐浴,恢复室温反应4-6小时,TLC检测反应结束。过滤除去盐,浓缩滤液,残留物溶于乙酸乙酯,用5%NaOH、水、5%HCl、水、饱和食盐水依次洗涤后,用无水NaSO4干燥,浓缩减压去溶剂,得到的固体用乙酸乙酯和石油醚结晶得Boc-Ala-Gly-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-OMe 14.3g。将得到该四肽用100ml N,N-二甲基甲酰胺溶解,加入2N的NaOH 20ml进行皂化反应,反应结束后反应液倒入300ml水中,用酸调至pH=2-3,用乙酸乙酯萃取,有机相用水洗至中性,饱和食盐水洗,干燥,浓缩得白色固体为片段IV:Boc-Ala-Gly-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-OH 13.3g,总收率76%,熔点:89-93℃,ESI-MS[M+H]+:732.3318(理论分子量:731.3)
步骤5八肽化合物V:Boc-Phe-Trp-Lys(Z)-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl的合成
称取Boc-Phe-Trp-Lys(Z)-OH 3.0g(4.2mmol),1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDCI 1.2g(6.3mmol),1-羟基苯并三唑(HOBt)1.13g(8.4mmol),用30ml N,N-二甲基甲酰胺溶解,冰浴降至0℃,加0.7ml N-甲基吗啉,反应液维持在0℃搅拌30分钟,再恢复室温搅拌30分钟,然后将反应液再次降至0℃,加入预冷至0℃以下的溶有3.2g(2.8mmol)TFA·Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MBzl)-OBzl和0.33ml(3.1mmol)N-甲基吗啉的20ml的N,N-二甲基甲酰胺溶液,此混合液维持0℃搅拌30分钟后,再恢复室温反应,反应结束后,将反应液直接倒入200ml水中,析出大量白色固体,抽滤,滤饼用水洗后,再用甲醇洗,乙醚洗,晾干,得到八肽化合物Boc-Phe-Trp-Lys(Z)-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl 4.5g,收率92%,熔点:187-190℃,ESI-MS[M+H]+:1733.62(理论分子量:1732.79)。
步骤6十肽化合物VI:Boc-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Z)-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl的合成
称取上步得到的八肽化合物V4.5g(2.58mmol),加二氯甲烷5ml,苯甲醚0.84ml(7.74mmol),巯基乙醇0.35ml(5.1mmol),充氩气保护,浸泡15分钟后,降至0℃以下加入5ml三氟乙酸,维持0℃搅拌10分钟后,再恢复室温反应至TLC检测结束,减压抽干二氯甲烷,残余液倒入冷的乙醚,析出固体,抽滤,滤饼用乙醚洗,晾干,得到八肽化合物V的三氟乙酸盐TFA·Phe-Trp-Lys(Z)-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl 4.49g,将该三氟乙酸盐用30ml 30ml的N,N-二甲基甲酰胺溶解,再加N-甲基吗啉0.31ml,室温搅拌30分钟后放置冰箱预冷至0℃以下备用.称取Boc-Asn-Phe-OH 1.46g(3.85mmol),1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDCI 1.1g(5.74mmol),1-羟基苯并三唑(HOBt)1.05g(7.77mmol),用30mlN,N-二甲基甲酰胺溶解,冰水浴降至0℃,加0.6ml(5.74mmol)N-甲基吗啉,反应液维持在0℃搅拌30分钟,再恢复室温搅拌30分钟,然后将反应液再次将至0℃,加入预冷至0℃以下的溶有Phe-Trp-Lys(Z)-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl的N,N-二甲基甲酰胺溶液,将混合液维持在0℃搅拌30分钟,再恢复室温反应,反应结束后,将反应液直接倒入200ml水中,析出大量白色固体,滤出固体后将滤饼用水洗后,再用甲醇洗,乙醚洗,晾干,得到十肽化合物VI Boc-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Z)-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl4.8g,收率93.7%,熔点:220-224℃,ESI-MS[M+H]+:1995.3(理论分子量:1993.9)
步骤7全保护十四肽化合物VII:Boc-Ala-Gly-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Z)-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl的合成
称取上步得到的十肽化合物VI4.8g(2.4mmol),加二氯甲烷4ml,苯甲醚0.78ml(7.2mmol),巯基乙醇0.33ml(4.8mmol),充氩气保护,浸泡15分钟后,降至0℃以下加入4ml三氟乙酸,维持0℃搅拌10分钟后,再恢复室温反应至TLC检测结束,减压抽干二氯甲烷,残余液倒入冷的乙醚,析出固体,抽滤,滤饼用乙醚洗几次,晾干,得到十肽化合物VI的三氟乙酸盐TFA·Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Z)-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MBzl)-OBzl(2.35mmol)4.7g。将该三氟乙酸盐用40ml的N,N-二甲基甲酰胺溶解,再在其中加入0.28ml的N-甲基吗啉,室温搅拌30分钟,置入冰箱冷冻至0℃以下备用。称取Boc-Ala-Gly-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-OH 2.58g(3.5mmol),1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDCI 1.0g(5.25mmol),1-羟基苯并三唑(HOBt)0.95g(7mmol),用30mlN,N-二甲基甲酰胺溶解,冰浴降至0℃,加0.58ml N-甲基吗啉(5.25mmol),反应液维持0℃搅拌30分钟,再恢复室温搅拌30分钟,然后将反应液再次将至0℃,加入预冷至0℃以下溶有Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Z)-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MOBzl)-OBzl的N,N-二甲基甲酰胺溶液.将此混合液维持0℃搅拌30分钟,再恢复室温反应,反应结束后将反应液直接倒入200ml水中,析出大量白色固体,滤出固体后将滤饼用水洗后,再用甲醇洗,乙醚洗,晾干,得到生长抑素全保护的线性肽化合物,也就是十四肽化合物VII:Boc-Ala-Gly-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Z)-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl4.47g,收率92%,熔点:230-235℃,ESI-MS[M+H]+:2608(理论分子量2607.16)。
步骤8还原性生长抑素的合成
称取合成的生长抑素全保护的线性肽化合物VII2g,加苯甲醚6.6ml,冲氩气保护,冰浴冷却至0℃,加5mmol/mL的CF3SO3H的三氟乙酸溶液12ml,维持0℃反应1小时后,反应液中加入100ml预冷至0℃以下的无水乙醚,即析出大量白色固体,过滤,收集固体,真空干燥,得生长抑素粗品;
步骤9氧化环合与纯化工艺
将得到的线性粗肽按0.08-0.1mg/ml进行室温氧化环合,通入氧气或空气自然氧化,PH调至7.5-8.0,搅拌2-3天,冻干得生长抑素粗品。将粗品溶入水中,过滤,滤液分批经C18制备柱纯化,流动相:乙腈(0.1%TFA):H2O(0.1%TFA),乙腈(0.1%TFA)浓度10%-70%,60分钟梯度洗脱。检测波长:280nm,收集样品洗脱液冻干后,获得精品生长抑素400mg,HR-MS[M+H]+:1637.7239(理论分子量:1636.72),收率32%(以全保护十四肽计)。
Claims (3)
1.一种生长抑素液相合成方法,其特征是首先分别全合成Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl、Boc-Phe-Trp-Lys(Z)-OH、Boc-Asn-Phe-OH和Boc-Ala-Gly-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-OH四个片段肽,再用EDCI/HOBt进行片段缩合,合成全保护的十四肽,用三氟甲磺酸和苯甲醚系统脱肽链所有的保护基,得到还原性生长抑素,对还原性生长抑素氧化,获得生长抑素粗品,再经C18制备柱分离纯化,收集样品洗脱液冻干后,得生长抑素精品,其中:
片段I:TFA·Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl的合成方法是:
以Boc-Cys(MeOBzl)-OBzl为起始原料,用TFA/CH2Cl2脱掉Boc后作为氨基组分,Boc-Ser (Bzl)-OH作为羧基组分,采用混合酸酐法合成二肽Boc-Ser(Bzl)-Cys(Mob)-OBzl,再用TFA/CH2Cl2脱掉Boc得到氨基组分,依次用混合酸酐法,接Boc-Thr(Bzl)-OH、Boc-Phe-OH、Boc-Thr(Bzl)-OH、得到Boc-Thr(Bzl)-Phe-Thr-(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl,用TFA/CH2Cl2脱Boc,用乙醚沉淀,异丙醇重结晶得到TFA·Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(Me OBzl)-OBzl;
片段II:Boc-Phe-Trp-Lys(Z)-OH的合成方法是:
以NH2-Lys(Z)-OMe 作为氨基组分,采用混合酸酐法接肽,依次接Boc-Trp-OH、Boc-Phe-OH,得到三肽Boc-Trp-Phe-Lys(Z)-OMe,2N NaOH皂化,得到Boc-Phe-Trp-Lys(Z)-OH;
片段III:Boc-Asn-Phe-OH的合成方法是:
以NH2-Phe-OMe 作为氨基组分,Boc-Asn-OH作为羧基组分,DIC作为缩合剂,采用碳二亚胺法,合成Boc-Asn-Phe-OMe,2N NaOH皂化,得到Boc-Asn-Phe-OH;
片段IV:Boc-Ala-Gly-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-OH的合成方法是:
以NH2-Lys(Z)-OMe 作为氨基组分,采用混合酸酐法接肽,依次接Boc-Cys(MeOBzl)-OH、Boc-Gly-OH、Boc-Ala-OH得到Boc-Ala-Gly-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-OMe,2N NaOH皂化,得到Boc-Ala-Gly-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-OH;
片段缩合方法是用上述合成的4个片段,用EDCI/HOBT为缩合剂,合成得到生长抑素全保护的线性十四肽Boc-Ala-Gly-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Z)-Thr(Bzl)-Phe-Thr (Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl;
还原性生长抑素的合成是:
将合成的生长抑素全保护的线性肽加到CF3SO3H的三氟乙酸溶液,以苯甲醚为清除剂,在0℃进行反应,反应结束后用乙醚析出固体,过滤收集固体并干燥处理得生长抑素粗品;
氧化环合与纯化工艺是:
将得到的线性粗肽进行室温氧化环合,经自然氧化后进行冻干处理得生长抑素粗品,将粗品溶入水中,经过滤,滤液C18制备柱分离纯柱纯化后合并样品,冻干处理获得生长抑素;
所述用混合酸酐合成片段I、II和IV时采用氯甲酸烷基酯活化羧基,所用氯甲酸烷基酯为氯甲酸乙酯、氯甲酸丙酯、氯甲酸异丙酯、氯甲酸丁酯或氯甲酸异丁酯(ClCOOR,R=Et、Pr、iPr、Bu、iBu)。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,使用混合酸酐合成片段I、II和IV时采用的氯甲酸烷基酯为氯甲酸异丁酯。
3.根据权利要求1或2所述生长抑素液相合成方法,其特征是:
A.肽片段合成
a.片段I.Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl的合成:
称取4.1g Boc-Ser(Bzl)-OH用50ml四氢呋喃溶解,加入1.53ml N-甲基吗啉,在冰盐浴冷却至-15℃,搅拌下缓慢滴加1.8ml的氯甲酸异丁酯,2-4分钟后,缓慢加入预冷到0℃以下溶有4.6g Cys(MeOBzl)-OBzl的20ml四氢呋喃溶液,维持在-15℃反应30分钟后撤去冰盐浴,恢复室温反应,反应结束后过滤除去盐,浓缩滤液,残留物溶于乙酸乙酯,用5%NaOH、水、5%HCl、水、饱和食盐水依次洗涤后,用无水NaSO4 干燥,浓缩减压去溶剂,得到白色固体Boc-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl;
将得到的Boc-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl8.04g倒入圆底烧瓶,加入10ml二氯甲烷,冷却至0℃以下,加入10ml三氟乙酸,加完恢复室温反应,反应结束后,减压浓缩,残余物用乙酸乙酯溶解,用5%NaOH洗至溶液中性,饱和食盐水洗,干燥,过滤,浓缩得油状物Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl,将所得的油状物用30ml四氢呋喃溶解,放置冰箱预冷至0℃以下备用,再称取Boc-Thr(Bzl)-OH4.08g用50ml四氢呋喃溶解,加入1.45ml N-甲基吗啉,在冰盐浴-15℃下,搅拌下缓慢滴加1.72ml的氯甲酸异丁酯,2-4分钟后,加入预冷至0℃以下溶有Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-Obzl的30ml四氢呋喃,维持在-15℃反应30分钟后撤去冰盐浴,恢复室温反应4-6小时,反应结束后过滤除去盐,浓缩滤液,残留物溶于乙酸乙酯,用5%NaOH、水、5%HCl、水、饱和食盐水依次洗涤后,用无水NaSO4 干燥,浓缩减压去溶剂,再将得到的白色固体用乙酸乙酯和石油醚结晶,得白色固体Boc-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl;
将得到的Boc-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl9.8g倒入圆底烧瓶,加入10ml二氯 甲烷,冷却至0℃以下,加入10ml三氟乙酸,加完恢复室温反应,反应结束后,减压浓缩,残余物用乙酸乙酯溶解,用5%NaOH洗至溶液中性,饱和食盐水洗,干燥,过滤,浓缩得油状物Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl,所得的油状物用30ml四氢呋喃溶解,放置冰箱预冷至0℃以下备用,再称取Boc-Phe-OH3.3g,用40ml四氢呋喃溶解,加入1.35ml N-甲基吗啉,在冰盐浴-15℃下,搅拌下缓慢滴加1.6ml氯甲酸异丁酯,2-4分钟后,加入预冷至0℃以下的溶有Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-Obzl的20ml的四氢呋喃,维持在-15℃反应30分钟后撤去冰盐浴,恢复室温反应至反应结束,过滤除去盐,浓缩滤液,残留物溶于乙酸乙酯,用5%NaOH、水、5%HCl、水、饱和食盐水依次洗涤后,用无水NaSO4 干燥,浓缩减压去溶剂,得到的固体用乙酸乙酯和石油醚结晶,得到白色固体Boc-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOB zl)-OBzl;
将得到的Boc-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl11g倒入圆底烧瓶,加入10ml二氯甲烷,冷却至0℃以下,加入10ml三氟乙酸,加完后恢复到室温进行反应,反应结束后,减压浓缩,残余物用乙酸乙酯溶解,用5%NaOH洗至溶液中性,饱和食盐水洗,干燥,过滤,浓缩得油状物为Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl,所得的油状物用30ml四氢呋喃溶解,放置冰箱预冷至0℃以下备用;
再称取Boc-Thr(Bzl)-OH3.6g,用30ml四氢呋喃溶解,加入1.17ml的N-甲基吗啉,在冰盐浴-15℃下,搅拌下缓慢滴加1.51ml的氯甲酸异丁酯,2-4分钟后,加入在冰箱预冷至0℃以下的Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl的四氢呋喃溶液,维持在-15℃反应30分钟后撤去冰盐浴,恢复室温反应,反应结束,过滤除去盐,浓缩滤液,残留物溶于乙酸乙酯,用5%NaOH、水、5%HCl、水、饱和食盐水依次洗涤后,用无水NaSO4 干燥,浓缩减压去溶剂,得到白色固体为五肽Boc-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl;
将得到的五肽化合物12.2g倒入圆底烧瓶中,加入10ml二氯甲烷,冷却至0℃以下,加入10ml三氟乙酸,加完后恢复室温反应,结束后,将反应液分次倒入到100-150ml冰箱预冷至0℃以下的无水乙醚中,析出白色固体,过滤,再用异丙醇结晶得片段I:TFA·Thr(Bzl)-Phe -Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl;
b.片段II:Boc-Phe-Trp-Lys(Z)-OH的合成:
将8.3g Boc-Trp-OH溶于55ml四氢呋喃中,加入3ml N-甲基吗啉,冰盐浴冷却至-15℃搅拌下,缓慢滴加3.55ml氯甲酸异丁酯,2-4分钟后,加入预冷至0℃以下的溶有9gHCl·Lys(Z)-OMe和3ml的N-甲基吗啉的50ml N,N-二甲基甲酰胺溶液,维持在-15℃温反应30分钟,撤去冰盐浴,恢复室温反应,反应结束后过滤除去盐,浓缩滤液,残留物溶于乙酸 乙酯,用5%NaOH、水、5%HCl、水、饱和食盐水依次洗涤后,用无水NaSO4 干燥,浓缩减压去溶剂,得到的白色固体用乙酸乙酯和石油醚结晶,得到Boc-Trp-Lys(Z)-OMe;
将得到Boc-Trp-Lys(Z)-OMe15.1g倒入圆底烧瓶,加20ml二氯甲烷,苯甲醚4.2ml,巯基乙醇2.7ml,充氩气保护,冷却至0℃以下,加入20ml的三氟乙酸,加完后恢复至室温反应,反应结束后,减压浓缩,残余物用乙酸乙酯溶解,用5%NaOH洗至溶液中性,饱和食盐水洗,干燥,过滤,浓缩得油状物为Trp-Lys(Z)-OMe,将该油状物用40ml四氢呋喃溶解,放置冰箱预冷至0℃以下备用,再称取Boc-Phe-OH6.8g用50ml四氢呋喃溶解,加入2.82ml的N-甲基吗啉,冰盐浴冷却至-15℃搅拌下,缓慢滴加3.33ml氯甲酸异丁酯,2-4分钟后,加入预冷至0℃以下的Trp-Lys(Z)-OMe四氢呋喃溶液,维持在-15℃反应30分钟后撤去冰盐浴,恢复室温反应,反应结束后过滤除去盐,浓缩滤液,残留物溶于乙酸乙酯,用5%NaOH、水、5%HCl、水、饱和食盐水依次洗涤后,用无水NaSO4 干燥,浓缩减压去溶剂,得到的固体用乙酸乙酯和石油醚结晶得Boc-Phe-Trp-Lys(Z)-OMe17.2g,再将其用50ml的N,N-二甲基甲酰胺溶解,0℃滴加2N NaOH25ml进行皂化反应,反应结束,反应液倒入200ml冰水中,用酸调至pH=2-3,用乙酸乙酯萃取,有机相用水洗至中性,饱和食盐水洗,干燥,浓缩得白色固体为片段II:Boc-Phe-Trp-Lys(Z)-OH;
c.片段III:Boc-Asn-Phe-OH的合成
称取Boc-Asn-OH12.028g,1-羟基苯并三唑(HOBt)14g,用100ml N,N-二甲基甲酰胺溶解,在冰浴冷却至0℃搅拌下滴加入溶有7.2g N,N′-二异丙基碳二亚胺(DIC)的10ml N,N-二甲基甲酰胺溶液,再恢复室温反应,反应结束后将反应液再降至0℃以下,在其中加入预冷至0℃以下的溶有苯丙氨酸甲酯盐酸盐(HCl·Phe-OMe)12.278g和N-甲基吗啉6.27ml的100ml N,N-二甲基甲酰胺溶液,维持在0℃搅拌一小时后,恢复室温反应至反应结束,将反应液倒入300-400ml水中,析出大量固体,滤出的固体用乙醚洗涤后将固体干燥处理,再将该固体19.9g溶于200ml的N,N-二甲基甲酰胺中,0℃滴加2N NaOH50ml进行反应,反应结束,将反应液倒入500ml冰水中,加酸调至pH=2-3,析出大量固体,抽滤,用水洗至中性,收集固体,晾干,用异丙醇和石油醚重结晶得白色固体为片段III:Boc-Asn-Phe-OH;
d.片段IV:Boc-Ala-Gly-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-OH的合成
将9.1g Boc-Cys(MeOBzl)-OH溶于50ml四氢呋喃中,加3mlN-甲基吗啉,冰盐浴冷却至-15℃,搅拌下缓慢滴加3.46ml氯甲酸异丁酯,2-4分钟后,加入预冷至0℃以下的溶有8gHCl·Lys(Z)-OMe和2.7ml N-甲基吗啉的40ml N,N-二甲基甲酰胺溶液,维持在-15℃下反应30分钟后撤去冰浴,恢复室温反应,反应结束后过滤除去盐,浓缩滤液,残留物溶于乙酸乙 酯,用5%NaOH、水、5%HCl、水、饱和食盐水依次洗涤后,有机相用无水NaSO4 干燥,浓缩减压去溶剂,得到的白色固体用乙酸乙酯和石油醚结晶,得到Boc-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-OMe;
将得到Boc-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-OMe13.6g倒入圆底烧瓶,加入15ml二氯甲烷,冷却至0℃以下,加入15ml三氟乙酸,加完恢复室温反应,反应结束后,减压浓缩,残余物用乙酸乙酯溶解,用5%NaOH洗至溶液中性,饱和食盐水洗,干燥,过滤,浓缩得油状物为Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-OMe,该油状物用40ml四氢呋喃溶解,放置冰箱预冷至0℃以下备用,将3.85g的Boc-Gly-OH溶于50ml的四氢呋喃中,加2.42ml N-甲基吗啉,冰盐浴冷却,在-15℃搅拌下,缓慢滴加2.9ml氯甲酸异丁酯,2-4分钟后,加入预冷至0℃以下溶有Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-Ome的四氢呋喃溶液,维持在-15℃反应30分钟,撤去冰盐浴,恢复室温反应,反应结束后过滤除去盐,浓缩滤液,残留物溶于乙酸乙酯,用5%NaOH、水、5%HCl、水、饱和食盐水依次洗涤后,用无水NaSO4 干燥,浓缩减压蒸去溶剂,得到的固体用乙酸乙酯和石油醚结晶得Boc-Gly-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-OMe;
将得到Boc-Gly-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-OMe13.9g倒入圆底烧瓶,加入15ml二氯甲烷,冷却至0℃以下,加入15ml三氟乙酸,加完后恢复反应体系到室温反应,反应结束后,减压浓缩,残余物用乙酸乙酯溶解,用5%NaOH洗至溶液中性,饱和食盐水洗,干燥,过滤,浓缩得油状物为Gly-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-OMe,该油状物40ml四氢呋喃溶解,放置冰箱预冷至0℃以下备用,将3.9gBoc-Ala-OH溶于50ml四氢呋喃中,加2.3ml N-甲基吗啉,冰盐浴冷却,在-15℃搅拌下,缓慢滴加2.7ml氯甲酸异丁酯,2-4分钟后,加入预冷至0℃以下溶有Gly-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-Ome的四氢呋喃溶液,维持在-15℃反应30分钟,撤去冰盐浴,恢复室温反应,反应结束后过滤除去盐,浓缩滤液,残留物溶于乙酸乙酯,用5%NaOH、水、5%HCl、水、饱和食盐水依次洗涤后,用无水NaSO4 干燥,浓缩减压去溶剂,得到的固体用乙酸乙酯和石油醚结晶得Boc-Ala-Gly-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-OMe14.3g,将得到该四肽用100ml N,N-二甲基甲酰胺溶解,加入2N的NaOH20ml进行皂化反应,反应结束后反应液倒入300ml水中,用酸调至pH=2-3,用乙酸乙酯萃取,有机相用水洗至中性,饱和食盐水洗,干燥,浓缩得白色固体为片段IV:Boc-Ala-Gly-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-OH;
B.片段缩合
a.八肽化合物V:Boc-Phe-Trp-Lys(Z)-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl 的合成
称取Boc-Phe-Trp-Lys(Z)-OH3.0g,1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐1.2g,1-羟 基苯并三唑1.13g,用30ml N,N-二甲基甲酰胺溶解,冰浴降至0℃,加0.7ml N-甲基吗啉,反应液维持在0℃搅拌30分钟,再恢复室温搅拌30分钟,然后将反应液再次降至0℃,加入预冷至0℃以下的溶有3.2g TFA·Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MBzl)-OBzl和0.33ml N-甲基吗啉的20ml的N,N-二甲基甲酰胺溶液,此混合液维持0℃搅拌30分钟后,再恢复室温反应,反应结束后,将反应液直接倒入200ml水中,析出大量白色固体,抽滤,滤饼用水洗后,再用甲醇洗,乙醚洗,晾干,得到八肽化合物Boc-Phe-Trp-Lys(Z)-Thr(Bzl)-Phe-Thr(BZl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl;
b.十肽化合物VI:Boc-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Z)-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeO Bzl)-OBzl的合成
称取上步得到的八肽化合物V4.5g,加二氯甲烷5ml,苯甲醚0.84ml,巯基乙醇0.35ml,充氩气保护,浸泡15分钟后,降至0℃以下加入5ml三氟乙酸,维持0℃搅拌10分钟后,再恢复室温反应至TLC检测结束,减压抽干二氯甲烷,残余液倒入冷的乙醚,析出固体,抽滤,滤饼用乙醚洗,晾干,得到八肽化合物V的三氟乙酸盐TFA·Phe-Trp-Lys(Z)-Thr(Bzl)-Phe -Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl 4.49g,将该三氟乙酸盐用30ml的N,N-二甲基甲酰胺溶解,再加N-甲基吗啉0.31ml,室温搅拌30分钟后放置冰箱预冷至0℃以下备用,称取Boc-Asn-Phe-OH1.46g,1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDCI1.1g,1-羟基苯并三唑(HOBt)1.05g,用30ml的N,N-二甲基甲酰胺溶解后降温至0℃,加0.6ml的N-甲基吗啉NMM,反应液维持在0℃搅拌30分钟,再恢复室温搅拌30分钟,然后将反应液再次将至0℃,加入预冷至0℃以下的溶有Phe-Trp-Lys(Z)-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl的N,N-二甲基甲酰胺溶液,将混合液维持在0℃搅拌30分钟,再恢复室温反应,反应结束后,将反应液直接倒入200ml水中,析出大量白色固体,滤出固体后将滤饼用水洗后,再用甲醇洗,乙醚洗,晾干,得到十肽化合物VIBoc-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Z)-Thr (Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl;
c.十四肽化合物VII:Boc-Ala-Gly-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Z)-Thr(Bzl) -Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl的合成
称取上步得到的十肽化合物VI4.8g,加二氯甲烷4ml,苯甲醚0.78ml,巯基乙醇0.33ml,充氩气保护,浸泡15分钟后,降至0℃以下加入4ml三氟乙酸,维持0℃搅拌10分钟后,再恢复室温反应至反应结束,减压抽干二氯甲烷,残余液倒入冷的乙醚,析出固体,抽滤,滤饼用乙醚洗涤后晾干,得到十肽化合物VI的三氟乙酸盐TFA·Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Z)-Thr (Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MOBzl)-OBzl,将该三氟乙酸盐用40ml的N,N-二甲基甲酰胺 溶解,再在其中加入0.28ml的N-甲基吗啉,室温搅拌30分钟,置入冰箱冷冻至0℃以下备用,称取Boc-Ala-Gly-Cys(MOBzl)-Lys(Z)-OH2.58g,1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐1.0g,1-羟基苯并三唑(HOBt)0.95g,用30ml的N,N-二甲基甲酰胺溶解,降温至0℃,加入0.58ml的N-甲基吗啉,反应液维持0℃搅拌30分钟,再恢复室温搅拌30分钟,然后将反应液再次将至0℃,加入预冷至0℃以下溶有Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Z)-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser (Bzl)-Cys(MOBzl)-OBzl的N,N-二甲基甲酰胺溶液 ,将此混合液维持0℃搅拌30分钟,再恢复室温反应,反应结束后将反应液直接倒入200ml水中,析出大量白色固体,滤出固体后将滤饼用水洗后,再用甲醇洗,乙醚洗,晾干,得到生长抑素全保护的线性肽化合物,也就是十四肽化合物VII:Boc-Ala-Gly-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Z)-Thr(Bzl)-Phe-Thr (Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl;
C.还原性生长抑素的合成
称取合成的生长抑素全保护的线性肽化合物VII2g,加苯甲醚6.6ml,冲氩气保护,冰浴冷却至0℃,加5mmol/mL的CF3SO3H的三氟乙酸溶液12ml,维持0℃反应1小时后,反应液中加入100ml预冷至0℃以下的无水乙醚,即析出大量白色固体,过滤,收集固体,真空干燥,得生长抑素粗品;
D.将得到的线性粗肽按0.08-0.1mg/ml进行室温氧化环合,通入氧气或空气自然氧化,pH调至7.5-8.0,搅拌2-3天,冻干得生长抑素粗品,将粗品溶入水中,过滤,滤液分批经C18制备柱纯化,纯化条件为:流动相为含有0.1%三氟乙酸的乙腈和含有0.1%三氟乙酸的水,采用梯度洗脱,检测波长:280nm,收集样品洗脱液冻干后,获得精品生长抑素。
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