[go: up one dir, main page]

CN101570570B - 一种生长抑素的合成方法 - Google Patents

一种生长抑素的合成方法 Download PDF

Info

Publication number
CN101570570B
CN101570570B CN2009101424202A CN200910142420A CN101570570B CN 101570570 B CN101570570 B CN 101570570B CN 2009101424202 A CN2009101424202 A CN 2009101424202A CN 200910142420 A CN200910142420 A CN 200910142420A CN 101570570 B CN101570570 B CN 101570570B
Authority
CN
China
Prior art keywords
bzl
boc
phe
cys
add
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN2009101424202A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101570570A (zh
Inventor
达朝山
苏亚宁
洪满贵
保英明
曹福军
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Gansu Zhongke Medicinal Herbs Resource Bioengineering Co ltd
Lanzhou University
Original Assignee
Gansu Zhongke Medicinal Herbs Resource Bioengineering Co ltd
Lanzhou University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Gansu Zhongke Medicinal Herbs Resource Bioengineering Co ltd, Lanzhou University filed Critical Gansu Zhongke Medicinal Herbs Resource Bioengineering Co ltd
Priority to CN2009101424202A priority Critical patent/CN101570570B/zh
Publication of CN101570570A publication Critical patent/CN101570570A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101570570B publication Critical patent/CN101570570B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02PCLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及生长抑素的一种液相合成方法,其合成方法为:首先分别全合成Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl、Boc-Phe-Trp-Lys(Z)-OH、Boc-Asn-Phe-OH和Boc-Ala-Gly-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-OH四4个片段肽,再用EDCI/HOBt进行片段缩合,合成全保护的还原性十四肽,用三氟甲磺酸和苯甲醚系统脱肽链所有的保护基,得到还原性生长抑素,对还原性生长抑素氧化,获得生长抑素粗品,再经C18制备柱分离纯化,冷冻干燥后,得生长抑素。

Description

一种生长抑素的合成方法
技术领域
本发明涉及生长抑素的一种液相合成方法。
背景技术
中文名:生长抑素。其他名:生长激素释放抑制激素。商品名:施他宁。英文名:Somatostatin,Stilamin。
结构式为:
Figure G2009101424202D00011
分子式:C76H104N18O19S2;分子量:1637.8。
生长抑素是下丘脑的正中隆起和胰岛的细胞合成的。1973年由Burgus和Brazean等人首先在下丘脑分离得到并阐述其结构。化学结构为分子内带有一对二硫键的十四肽。人工合成的生长抑素已成为商品用于临床,并于1997年收载入欧洲药典。
生长抑素的药理作用如下::①可以抑制生长激素、甲状腺刺激激素、胰岛素、胰高血糖素的分泌。②可以抑制由试验餐和5肽胃泌素刺激的胃酸分泌,可抑制胃蛋白酶、胃泌素的释放。③可以显著减少内脏血流,降低门静脉压力,降低侧枝循环的血流和压力,减少肝脏血流量。④减少胰腺的内外分泌以及胃小肠和胆囊的分泌,降低酶活性,对胰腺细胞有保护作用。⑤抑制胰高血糖素的分泌。⑥可影响胃肠道吸收和营养功能。药物的适应症为:用于肝硬化门脉高压所致的食管静脉出血;消化性溃疡应激性溃疡、糜烂性胃炎所致的上消化道出血;预防和治疗急性胰腺炎及其并发症;胰、胆、肠瘘的辅助治疗;其他:肢端肥大症、胃泌素瘤、胰岛素瘤及血管活性肠肽瘤。
固相多肽合成法合成生长抑素的报道:1973至1974年,Donald Yamashiro和Jean E.F.Rivier等人分别报道了采用氯甲基树脂固相合成生长抑素,采用常规的固相合成方法合成保护十四肽,但采用HF脱侧链保护;中国专利02155189.8、03128951.7、200510029220.8等采用三苯甲基、2-氯三苯甲基、4-甲氧基、4-甲基树脂为起始原料,按固相合成的方法依次连接Fmoc保护氨基酸,得到保护十四肽树脂,再用TFA切肽试剂脱保护,用空气或MDSO氧化环化,得到生长抑素粗品,最后经C18或C8高压柱分离得到生长抑素精品。虽然具有接肽速率快,收率高,周期短等优点,但仍存在问题:随着合成的肽链的增长,会出现空间位阻等空间因素,阻碍氨基酸的合成,且合成过程易消旋,使产品旋光度降低。因此,为使反应完全每步接肽需要3-5倍的羧基组分和缩合剂且价格昂贵,需大量的DMF和乙醇洗涤(约200ml/mmol),浪费原料和试剂,还需要昂贵的多肽合成仪等大型设备。还有,固相合成产物的纯化难度大、周期长,生产规模较小,成本高。
液相多肽合成法合成生长抑素的报道:美国专利USP.4,337,194;3,862,295;3,917,578和德国L.Moroder,加拿大Hans U.Immer等人与1973年至1981年报道了采用液相多肽合成法合成本品的方法。在L.Moroder和Hans U.Immer等报道的液相合成法合成本品的方法中,采用Z保护氨基酸进行接肽,需要多步H2/Pd反应,理论操作难,且难以大量制备。USP 3,862,295和D.Sarantakis等人的报道中,采用氟化氢去保护,实验设备和氟化氢的储运都难以实现。USP3,917,578和Roy Wade等人采用合成十四线肽后,先氧化形成二硫键,再去保护,使二硫键的形成具有位阻降低了收率。因此这些技术方案均难以作为大量生产的方法。
发明内容
本发明提供一种可解决上述中的不足,设计操作简单,反应过程消旋度底,纯度和收率高,生产成本低,产品质量好的合成生长抑素方法。
本发明的生长抑素合成方法为液相法,它是首先分别全合成Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl、Boc-Phe-Trp-Lys(Z)-OH、Boc-Asn-Phe-OH和Boc-Ala-Gly-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-OH四4个片段肽,再用EDCI/HOBt进行片段缩合,合成全保护的还原性十四肽,用三氟甲磺酸和苯甲醚系统脱肽链所有的保护基,得到还原性生长抑素,对还原性生长抑素氧化,获得生长抑素粗品,再经C18制备柱分离纯化,收集样品洗脱液冻干后,得生长抑素精品。
本发明的合成方法中,片段I:TFA·Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl的合成方法是:
以Boc-Cys(Mob)-OBzl为起始原料,用TFA/CH2Cl2(1/1,v)脱掉Boc后作为氨基组分,Boc-Ser(Bzl)-OH作为羧基组分,采用混合酸酐法合成二肽Boc-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl,再用TFA/CH2Cl2脱掉Boc得到氨基组分,依次用混合酸酐法接Boc-Thr(Bzl)-OH、Boc-Phe-OH、Boc-Thr(Bzl)-OH得到Boc-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl,用TFA/CH2Cl2(1/1,v)脱Boc,用乙醚沉淀,异丙醇重结晶得到TFA·Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl。
片段II:Boc-Phe-Trp-Lys(Z)-OH的合成方法是:
以NH2-Lys(Z)-OMe作为氨基组分,采用混合酸酐法接肽,TFA/CH2Cl2(1/1,v)脱Boc,依次接Boc-Trp-OH、Boc-Phe-OH,得到三肽Boc-Trp-Phe-Lys(Z)-OMe,2N NaOH皂化,得到Boc-Phe-Trp-Lys(Z)-OH。
片段III:Boc-Asn-Phe-OH的合成方法是:
以NH2-Phe-OMe作为氨基组分,Boc-Asn-OH作为羧基组分,采用碳二亚胺法,DIC作为活化剂,合成Boc-Asn-Phe-OMe,2N NaOH皂化,得到Boc-Asn-Phe-OH。
片段IV:Boc-Ala-Gly-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-OH的合成方法是:
以NH2-Lys(Z)-OMe作为氨基组分,采用混合酸酐法接肽,TFA/CH2Cl2(1/1,v)脱Boc,依次接Boc-Cys(MeOBzl)-OH、Boc-Gly-OH、Boc-Ala-OH得到Boc-Ala-Gly-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-OMe,2N NaOH皂化,得到Boc-Ala-Gly-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-OH。
本发明中的片段缩合方法是:
首先以片段II:Boc-Phe-Trp-Lys(Z)-OH为羧基组分,片段I:TFA·Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl为氨基组分,EDCI/HOBT为缩合剂,采用碳二亚胺法合成八肽化合物V:Boc-Phe-Trp-Lys(Z)-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl;该八肽化合物用TFA/CH2Cl2脱Boc后作为氨基组分,片段III:Boc-Asn-Phe-OH作为羧基组分,用EDCI/HOBT进行片段缩合,得到十肽化合物VI:Boc-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Z)-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl;该十肽化合物VI用TFA/CH2Cl2(1/1,v)脱Boc后作为氨基组分,片段IV:Boc-Ala-Gly-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-OH作为羧基组分,用EDCI/HOBT进行片段缩合得到线性全保护十四肽VII:Boc-Ala-Gly-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Z)-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl。
本发明中所说的混合酸酐接肽法是指:它是以N-甲基吗啉为催化剂,采用氯甲酸烷基酯活化羧基,所用氯甲酸烷基酯为氯甲酸乙酯、氯甲酸丙酯、氯甲酸异丙酯、氯甲酸丁酯或氯甲酸异丁酯(ClCOOR,R=Et、Pr、iPr、Bu、iBu),优先选用氯甲酸异丁酯为活化剂,活化氨基端已保护氨基酸的羧基形成高活性的混合酸酐,与氨基端裸露的氨基酸或肽反应生成多肽片段。合成过程包括混合酸酐的生成-过滤-减压浓缩-酸碱洗涤-干燥除水-得到多肽片段。碳二亚胺法是指:用碳二亚胺类的缩合剂如:N,N′-二异丙基碳二亚胺(DIC)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)和1-羟基苯并三唑(HOBt)形成复合的活化剂来活化羧基,与氨基端裸露的氨基酸或肽反应生成多肽片段。经过常规的酸碱洗涤,干燥,浓缩得到固体或反应液倒入水中直接得到固体,干燥后得到多肽片段。TFA/CH2Cl2脱Boc一般方法是:称取氨基端叔丁氧羰基(Boc)保护的氨基酸或多肽片段加入适量体积的二氯甲烷,冷却至0℃以下,加入与二氯甲烷等体积的三氟乙酸,加完恢复室温反应,TLC检测反应结束后,减压浓缩,残物用乙酸乙酯溶解,用稀的碱液洗至溶液中性,饱和食盐水洗,干燥,过滤,浓缩得氨基端裸露的多肽片段。
本发明中的还原性生长抑素的合成是:
将合成的生长抑素全保护的线性肽加到5mmol/mLCF3SO3H的三氟乙酸溶液,以苯甲醚为清除剂,在0℃进行反应,反应结束后用乙醚析出固体,过滤收集固体并干燥处理得还原性生长抑素粗品;
本发明中的氧化环合与纯化工艺是:
将得到的线性粗肽进行室温氧化环合,经自然氧化后进行冻干处理得生长抑素粗品,将粗品溶入水中,经过滤,滤液C18制备柱分离纯柱纯化后合并样品峰洗脱液,冻干处理获得生长抑素。
本发明的合成方法参见下式:
Figure G2009101424202D00041
本发明中用到的缩写有以下含义:
Thr:苏氨酸
Phe:苯丙氨酸
Ser:丝氨酸
Cys:半胱氨酸
Lys:氨酸
Ala:丙氨酸
Gly:甘氨酸
DCM:二氯甲烷
DCC:N,N′-二环己基碳二亚胺
DIC:N,N′-二异丙基碳二亚胺
EDCI:1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐
HOBt:1-羟基苯并三唑
TFA:三氟乙酸
TFMSA:三氟甲基磺酸
NMM:N-甲基吗啉
Boc:叔丁氧羰基
Z:苄氧羰基
Bzl:苄基
MeOBzl:4-甲氧基-苄基
TLC:薄板层析法
ESI-MS:电喷雾质谱
具体实施方式
步骤1、片段I:TFA·Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl的合成
称取4.1g(13.9mmol)Boc-Ser(Bzl)-OH用50ml四氢呋喃溶解,加入1.53ml(13.9mmol)N-甲基吗啉,在冰盐浴-15℃下,搅拌下缓慢滴加1.8ml(13.9mmol)氯甲酸异丁酯,2-4分钟后,加入在冰箱预冷至0℃以下的Cys(MeOBzl)-OBzl 4.6g(13.9mmol)的四氢呋喃溶液20ml。维持在该低温反应30分钟后撤去冰盐浴,恢复室温反应4-6小时,TLC检测反应结束。过滤除去盐,浓缩滤液,残留物溶于乙酸乙酯,用5%NaOH、水、5%HCl、水、饱和食盐水依次洗涤后,用无水NaSO4干燥,浓缩减压去溶剂,得到白色固体Boc-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl8.04g,产率95%。
将得到的Boc-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl 8.04g倒入圆底烧瓶,加入10ml二氯甲烷,冷却至0℃以下,加入10ml三氟乙酸,加完恢复室温反应,TLC检测反应结束后,减压浓缩,残余物用乙酸乙酯溶解,用5%NaOH洗至溶液中性,饱和食盐水洗,干燥,过滤,浓缩得油状物为Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl(不称重按100%产率计算),所得的油状物为氨基组分用30ml四氢呋喃溶解,放置冰箱预冷至0℃以下备用。再称取Boc-Thr(Bzl)-OH4.08g(13.2mmol)用50ml四氢呋喃溶解,加入1.45ml(13.2mmol)N-甲基吗啉,,在冰盐浴-15℃下,搅拌下缓慢滴加1.72ml(13.2mmol)氯甲酸异丁酯,2-4分钟后,加入预冷至0℃以下溶有Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl的30ml四氢呋喃,维持在-15℃反应30分钟后撤去冰盐浴,恢复室温反应4-6小时,TLC检测反应结束。过滤除去盐,浓缩滤液,残留物溶于乙酸乙酯,用5%NaOH、水、5%HCl、水、饱和食盐水依次洗涤后,用无水NaSO4干燥,浓缩减压去溶剂,得到的白色固体用乙酸乙酯和石油醚结晶,得白色固体Boc-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl 9.8g,产率93%。
将得到的Boc-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl 9.8g倒入圆底烧瓶,加入10ml二氯甲烷,冷却至0℃以下,加入10ml三氟乙酸,加完恢复室温反应,TLC检测反应结束后,减压浓缩,残余物用乙酸乙酯溶解,用5%NaOH洗至溶液中性,饱和食盐水洗,干燥,过滤,浓缩得油状物Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl(不称重按100%产率计算),所得的油状物为氨基组分用30ml四氢呋喃溶解,放置冰箱预冷至0℃以下备用。再称取Boc-Phe-OH3.3g(12.3mmol),用40ml四氢呋喃溶解,加入1.35ml(12.3mmol)N-甲基吗啉,在冰盐浴-15℃下,搅拌下缓慢滴加1.6ml(12.3mmol)氯甲酸异丁酯,2-4分钟后,加入预冷至0℃以下的Cys(MeOBzl)-OBzl 4.6g(13.9mmol)的四氢呋喃溶液20ml。维持在-15℃反应30分钟后撤去冰盐浴,恢复室温反应4-6小时,TLC检测反应结束。过滤除去盐,浓缩滤液,残留物溶于乙酸乙酯,用5%NaOH、水、5%HCl、水、饱和食盐水依次洗涤后,用无水NaSO4干燥,浓缩减压去溶剂,得到白色固体Boc-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl,11.0g产率94%。
将得到的Boc-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl 11g倒入圆底烧瓶,加入10ml二氯甲烷,冷却至0℃以下,加入10ml三氟乙酸,加完恢复室温反应,TLC检测反应结束后,减压浓缩,残余物用乙酸乙酯溶解,用5%NaOH洗至溶液中性,饱和食盐水洗,干燥,过滤,浓缩得油状物为Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl,(不称重按100%产率计算),所得的油状物为氨基组分用30ml四氢呋喃溶解,放置冰箱预冷至0℃以下备用。再称取Boc-Thr(Bzl)-OH 3.6g(11.6mmmol),用30ml四氢呋喃溶解,加入1.17ml(11.6mmol)N-甲基吗啉,在冰盐浴-15℃下,搅拌下缓慢滴加1.51ml(11.6mmol)氯甲酸异丁酯,2-4分钟后,加入预冷至0℃以下的Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl的四氢呋喃溶液30ml。维持在-15℃反应30分钟后撤去冰盐浴,恢复室温反应4-6小时,TLC检测反应结束。过滤除去盐,浓缩滤液,残留物溶于乙酸乙酯,用5%NaOH、水、5%HCl、水、饱和食盐水依次洗涤后,用无水NaSO4干燥,浓缩减压去溶剂,得到白色固体为五肽Boc-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl 12.2g,产率93%。
将得到的五肽化合物12.2g倒入圆底烧瓶中,加入10ml二氯甲烷,冷却至0℃以下,加入10ml TFA,加完恢复室温反应,TLC检测反应结束后,将反应液分次倒入到100-150ml冷的乙醚中,析出白色固体,过滤,用异丙醇结晶得片段I:TFA·Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl 11.8g,总收率73.3%,熔点:140-143℃,ESI-MS[M+H]+:1038.4681(理论分子量:1037.46)
步骤2片段II:Boc-Phe-Trp-Lys(Z)-OH的合成
将8.3g(27.3mmol)Boc-Trp-OH溶于55ml THF中,加入3ml N-甲基吗啉(27.3mmol),冰盐浴冷却至-15℃搅拌下,缓慢滴加3.55ml(27.3mmol)氯甲酸异丁酯,2-4分钟后,加入预冷至0℃以下的溶有9g(27.3mmol)HCl·Lys(Z)-OMe和3ml(27.3mmol)的N-甲基吗啉的50ml N,N-二甲基甲酰胺溶液,维持在-15℃温反应30分钟,撤去冰盐浴,恢复室温反应,TLC检测反应结束后过滤除去盐,浓缩滤液,残留物溶于乙酸乙酯,用5%NaOH、水、5%HCl、水、饱和食盐水依次洗涤后,用无水NaSO4干燥,浓缩减压去溶剂,得到的白色固体用乙酸乙酯和石油醚结晶,得到Boc-Trp-Lys(Z)-OMe 15.1g,产率94%。
将得到Boc-Trp-Lys(Z)-OMe 15.1g倒入圆底烧瓶,加20ml二氯甲烷,苯甲醚4.2ml,巯基乙醇2.7ml,充氩气保护,冷却至0℃以下,加入20ml的三氟乙酸,加完后恢复至室温反应,反应结束后,减压浓缩,残余物用乙酸乙酯溶解,用5%NaOH洗至溶液中性,饱和食盐水洗,干燥,过滤,浓缩得油状物为Trp-Lys(Z)-OMe(不称重按100%产率计算),将该油状物用40ml四氢呋喃溶解,放置冰箱预冷至0℃以下备用,再称取Boc-Phe-OH 6.8g(25.6mmol)用50ml四氢呋喃溶解,加入2.82ml(25.6mmol)N-甲基吗啉,冰盐浴冷却至-15℃搅拌下,缓慢滴加3.33ml(25.6mmol)氯甲酸异丁酯,2-4分钟后,加入预冷至0℃以下的Trp-Lys(Z)-OMe的四氢呋喃溶液,维持在-15℃反应30分钟后撤去冰盐浴,恢复室温反应,反应结束后过滤除去盐,浓缩滤液,残留物溶于乙酸乙酯,用5%NaOH、水、5%HCl、水、饱和食盐水依次洗涤后,用无水NaSO4干燥,浓缩减压去溶剂,得到的固体用乙酸乙酯和石油醚结晶得Boc-Phe-Trp-Lys(Z)-OMe 17.2g,再将其用50ml的N,N-二甲基甲酰胺溶解,0℃滴加2N NaOH25ml进行皂化反应,反应结束后,反应液倒入200ml冰水中,用酸调至pH=2-3,用乙酸乙酯萃取,有机相用水洗至中性,饱和食盐水洗,干燥,浓缩得白色固体为片段II:Boc-Phe-Trp-Lys(Z)-OH 5.3g,收率79%,熔点:187-189℃,ESI-MS[M+H]+:714.35(理论分子量:713.3)
步骤3片段III:Boc-Asn-Phe-OH的合成
称取Boc-Asn-OH 12.028g(51.8mmol),1-羟基苯并三唑(HOBt)14g(0.1mmol),用100mlN,N-二甲基甲酰胺溶解,在冰浴冷却至0℃搅拌下滴加入溶有7.2g(57mmol)N,N′-二异丙基碳二亚胺(DIC)的10mlN,N-二甲基甲酰胺溶液,维持在0℃反应一小时,再恢复室温反应一小时后,反应液再降至0℃以下,在其中加入预冷至0℃以下的溶有苯丙氨酸甲酯盐酸盐(HCl·Phe-OMe)12.278g(57mmol)和N-甲基吗啉6.27ml(57mmol)的100ml N,N-二甲基甲酰胺溶液,维持在0℃搅拌一小时后恢复室温反应,TLC检测反应结束,直接将反应液倒入大量水中,析出大量固体,抽滤,用乙醚洗2次,收集固体晾干,得固体19.9g。200ml的N,N-甲基甲酰胺中,0℃滴加2N NaOH 50ml进行反应,反应结束,将反应液倒入500ml冰水中,加酸调至pH=2-3,析出大量固体,抽滤,用水洗至中性,收集固体,晾干,用异丙醇和石油醚重结晶得白色固体为片段III:Boc-Asn-Phe-OH 17.5g,总收率89%,熔点:176-179℃,ESI-MS[M+H]+:380.18(理论分子量:379.17)
步骤4片段IV:Boc-Ala-Gly-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-OH的合成
将9.1g(26.62mmol)Boc-Cys(MeOBzl)-OH溶于50ml四氢呋喃中,加3ml N-甲基吗啉(26.62mmol),冰盐浴冷却至-15℃搅拌下,缓慢滴加3.46ml(26.62mmol)氯甲酸异丁酯,2-4分钟后,加入预冷至0℃以下的溶有8g HCl·Lys(Z)-OMe和2.7ml N-甲基吗啉的40ml N,N-二甲基甲酰胺溶液,维持在-15℃下反应30分钟后撤去冰浴,恢复室温反应,TLC检测反应结束后过滤除去盐,浓缩滤液,残留物溶于乙酸乙酯,用5%NaOH、水、5%HCl、水、饱和食盐水依次洗涤后,有机相用无水NaSO4干燥,浓缩减压去溶剂,得到的白色固体用乙酸乙酯和石油醚结晶,得到Boc-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-OMe 13.6g,产率91%。
将得到Boc-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-OMe 13.6g倒入圆底烧瓶,加入15ml二氯甲烷,冷却至0℃以下,加入15ml三氟乙酸,加完恢复室温反应,TLC检测反应结束后,减压浓缩,残余物用乙酸乙酯溶解,用5%NaOH洗至溶液中性,饱和食盐水洗,干燥,过滤,浓缩得油状物为Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-OMe(不称重按100%产率计算),该油状物作为氨基组分用40ml四氢呋喃溶解,放置冰箱预冷至0℃以下备用。将3.85g(22mmol)Boc-Gly-OH溶于50ml四氢呋喃中,加2.42ml N-甲基吗啉(22mmol),冰盐浴冷却至-15℃搅拌下,缓慢滴加2.9ml(22mmol)氯甲酸异丁酯,2-4分钟后,加入预冷至0℃以下溶有Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-Ome的四氢呋喃溶液,维持在-15℃反应30分钟,撤去冰盐浴,恢复室温反应,TLC检测反应结束后过滤除去盐,浓缩滤液,残留物溶于乙酸乙酯,用5%NaOH、水、5%HCl、水、饱和食盐水依次洗涤后,用无水NaSO4干燥,浓缩减压蒸去溶剂,得到的固体用乙酸乙酯和石油醚结晶得Boc-Gly-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-OMe 13.9g,产率94%。
将得到13.9g Boc-Gly-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-OMe倒入圆底烧瓶,加入15ml二氯甲烷,冷却至0℃以下,加入15ml三氟乙酸,加完恢复室温反应,TLC检测反应结束后,减压浓缩,残余物用乙酸乙酯溶解,用5%NaOH洗至溶液中性,饱和食盐水洗,干燥,过滤,浓缩得油状物为Gly-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-OMe(不称重按100%产率计算),该油状物作为氨基组分用40ml四氢呋喃溶解,放置冰箱预冷至0℃以下备用。将3.9g(20.7mmol)Boc-Ala-OH溶于50ml四氢呋喃中,加2.3ml N-甲基吗啉(20.7mmol),冰盐浴冷却至-15℃搅拌下,缓慢滴加2.7ml(20.7mmol)氯甲酸异丁酯,2-4分钟后,加入预冷至0℃以下溶有Gly-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-Ome的四氢呋喃溶液,维持在-15℃反应30分钟后撤去冰盐浴,恢复室温反应4-6小时,TLC检测反应结束。过滤除去盐,浓缩滤液,残留物溶于乙酸乙酯,用5%NaOH、水、5%HCl、水、饱和食盐水依次洗涤后,用无水NaSO4干燥,浓缩减压去溶剂,得到的固体用乙酸乙酯和石油醚结晶得Boc-Ala-Gly-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-OMe 14.3g。将得到该四肽用100ml N,N-二甲基甲酰胺溶解,加入2N的NaOH 20ml进行皂化反应,反应结束后反应液倒入300ml水中,用酸调至pH=2-3,用乙酸乙酯萃取,有机相用水洗至中性,饱和食盐水洗,干燥,浓缩得白色固体为片段IV:Boc-Ala-Gly-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-OH 13.3g,总收率76%,熔点:89-93℃,ESI-MS[M+H]+:732.3318(理论分子量:731.3)
步骤5八肽化合物V:Boc-Phe-Trp-Lys(Z)-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl的合成
称取Boc-Phe-Trp-Lys(Z)-OH 3.0g(4.2mmol),1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDCI 1.2g(6.3mmol),1-羟基苯并三唑(HOBt)1.13g(8.4mmol),用30ml N,N-二甲基甲酰胺溶解,冰浴降至0℃,加0.7ml N-甲基吗啉,反应液维持在0℃搅拌30分钟,再恢复室温搅拌30分钟,然后将反应液再次降至0℃,加入预冷至0℃以下的溶有3.2g(2.8mmol)TFA·Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MBzl)-OBzl和0.33ml(3.1mmol)N-甲基吗啉的20ml的N,N-二甲基甲酰胺溶液,此混合液维持0℃搅拌30分钟后,再恢复室温反应,反应结束后,将反应液直接倒入200ml水中,析出大量白色固体,抽滤,滤饼用水洗后,再用甲醇洗,乙醚洗,晾干,得到八肽化合物Boc-Phe-Trp-Lys(Z)-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl 4.5g,收率92%,熔点:187-190℃,ESI-MS[M+H]+:1733.62(理论分子量:1732.79)。
步骤6十肽化合物VI:Boc-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Z)-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl的合成
称取上步得到的八肽化合物V4.5g(2.58mmol),加二氯甲烷5ml,苯甲醚0.84ml(7.74mmol),巯基乙醇0.35ml(5.1mmol),充氩气保护,浸泡15分钟后,降至0℃以下加入5ml三氟乙酸,维持0℃搅拌10分钟后,再恢复室温反应至TLC检测结束,减压抽干二氯甲烷,残余液倒入冷的乙醚,析出固体,抽滤,滤饼用乙醚洗,晾干,得到八肽化合物V的三氟乙酸盐TFA·Phe-Trp-Lys(Z)-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl 4.49g,将该三氟乙酸盐用30ml 30ml的N,N-二甲基甲酰胺溶解,再加N-甲基吗啉0.31ml,室温搅拌30分钟后放置冰箱预冷至0℃以下备用.称取Boc-Asn-Phe-OH 1.46g(3.85mmol),1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDCI 1.1g(5.74mmol),1-羟基苯并三唑(HOBt)1.05g(7.77mmol),用30mlN,N-二甲基甲酰胺溶解,冰水浴降至0℃,加0.6ml(5.74mmol)N-甲基吗啉,反应液维持在0℃搅拌30分钟,再恢复室温搅拌30分钟,然后将反应液再次将至0℃,加入预冷至0℃以下的溶有Phe-Trp-Lys(Z)-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl的N,N-二甲基甲酰胺溶液,将混合液维持在0℃搅拌30分钟,再恢复室温反应,反应结束后,将反应液直接倒入200ml水中,析出大量白色固体,滤出固体后将滤饼用水洗后,再用甲醇洗,乙醚洗,晾干,得到十肽化合物VI Boc-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Z)-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl4.8g,收率93.7%,熔点:220-224℃,ESI-MS[M+H]+:1995.3(理论分子量:1993.9)
步骤7全保护十四肽化合物VII:Boc-Ala-Gly-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Z)-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl的合成
称取上步得到的十肽化合物VI4.8g(2.4mmol),加二氯甲烷4ml,苯甲醚0.78ml(7.2mmol),巯基乙醇0.33ml(4.8mmol),充氩气保护,浸泡15分钟后,降至0℃以下加入4ml三氟乙酸,维持0℃搅拌10分钟后,再恢复室温反应至TLC检测结束,减压抽干二氯甲烷,残余液倒入冷的乙醚,析出固体,抽滤,滤饼用乙醚洗几次,晾干,得到十肽化合物VI的三氟乙酸盐TFA·Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Z)-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MBzl)-OBzl(2.35mmol)4.7g。将该三氟乙酸盐用40ml的N,N-二甲基甲酰胺溶解,再在其中加入0.28ml的N-甲基吗啉,室温搅拌30分钟,置入冰箱冷冻至0℃以下备用。称取Boc-Ala-Gly-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-OH 2.58g(3.5mmol),1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDCI 1.0g(5.25mmol),1-羟基苯并三唑(HOBt)0.95g(7mmol),用30mlN,N-二甲基甲酰胺溶解,冰浴降至0℃,加0.58ml N-甲基吗啉(5.25mmol),反应液维持0℃搅拌30分钟,再恢复室温搅拌30分钟,然后将反应液再次将至0℃,加入预冷至0℃以下溶有Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Z)-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MOBzl)-OBzl的N,N-二甲基甲酰胺溶液.将此混合液维持0℃搅拌30分钟,再恢复室温反应,反应结束后将反应液直接倒入200ml水中,析出大量白色固体,滤出固体后将滤饼用水洗后,再用甲醇洗,乙醚洗,晾干,得到生长抑素全保护的线性肽化合物,也就是十四肽化合物VII:Boc-Ala-Gly-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Z)-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl4.47g,收率92%,熔点:230-235℃,ESI-MS[M+H]+:2608(理论分子量2607.16)。
步骤8还原性生长抑素的合成
称取合成的生长抑素全保护的线性肽化合物VII2g,加苯甲醚6.6ml,冲氩气保护,冰浴冷却至0℃,加5mmol/mL的CF3SO3H的三氟乙酸溶液12ml,维持0℃反应1小时后,反应液中加入100ml预冷至0℃以下的无水乙醚,即析出大量白色固体,过滤,收集固体,真空干燥,得生长抑素粗品;
步骤9氧化环合与纯化工艺
将得到的线性粗肽按0.08-0.1mg/ml进行室温氧化环合,通入氧气或空气自然氧化,PH调至7.5-8.0,搅拌2-3天,冻干得生长抑素粗品。将粗品溶入水中,过滤,滤液分批经C18制备柱纯化,流动相:乙腈(0.1%TFA):H2O(0.1%TFA),乙腈(0.1%TFA)浓度10%-70%,60分钟梯度洗脱。检测波长:280nm,收集样品洗脱液冻干后,获得精品生长抑素400mg,HR-MS[M+H]+:1637.7239(理论分子量:1636.72),收率32%(以全保护十四肽计)。

Claims (3)

1.一种生长抑素液相合成方法,其特征是首先分别全合成Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl、Boc-Phe-Trp-Lys(Z)-OH、Boc-Asn-Phe-OH和Boc-Ala-Gly-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-OH四个片段肽,再用EDCI/HOBt进行片段缩合,合成全保护的十四肽,用三氟甲磺酸和苯甲醚系统脱肽链所有的保护基,得到还原性生长抑素,对还原性生长抑素氧化,获得生长抑素粗品,再经C18制备柱分离纯化,收集样品洗脱液冻干后,得生长抑素精品,其中: 
片段I:TFA·Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl的合成方法是: 
以Boc-Cys(MeOBzl)-OBzl为起始原料,用TFA/CH2Cl2脱掉Boc后作为氨基组分,Boc-Ser (Bzl)-OH作为羧基组分,采用混合酸酐法合成二肽Boc-Ser(Bzl)-Cys(Mob)-OBzl,再用TFA/CH2Cl2脱掉Boc得到氨基组分,依次用混合酸酐法,接Boc-Thr(Bzl)-OH、Boc-Phe-OH、Boc-Thr(Bzl)-OH、得到Boc-Thr(Bzl)-Phe-Thr-(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl,用TFA/CH2Cl2脱Boc,用乙醚沉淀,异丙醇重结晶得到TFA·Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(Me OBzl)-OBzl; 
片段II:Boc-Phe-Trp-Lys(Z)-OH的合成方法是: 
以NH2-Lys(Z)-OMe 作为氨基组分,采用混合酸酐法接肽,依次接Boc-Trp-OH、Boc-Phe-OH,得到三肽Boc-Trp-Phe-Lys(Z)-OMe,2N NaOH皂化,得到Boc-Phe-Trp-Lys(Z)-OH; 
片段III:Boc-Asn-Phe-OH的合成方法是: 
以NH2-Phe-OMe 作为氨基组分,Boc-Asn-OH作为羧基组分,DIC作为缩合剂,采用碳二亚胺法,合成Boc-Asn-Phe-OMe,2N NaOH皂化,得到Boc-Asn-Phe-OH; 
片段IV:Boc-Ala-Gly-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-OH的合成方法是: 
以NH2-Lys(Z)-OMe 作为氨基组分,采用混合酸酐法接肽,依次接Boc-Cys(MeOBzl)-OH、Boc-Gly-OH、Boc-Ala-OH得到Boc-Ala-Gly-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-OMe,2N NaOH皂化,得到Boc-Ala-Gly-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-OH; 
片段缩合方法是用上述合成的4个片段,用EDCI/HOBT为缩合剂,合成得到生长抑素全保护的线性十四肽Boc-Ala-Gly-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Z)-Thr(Bzl)-Phe-Thr (Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl; 
还原性生长抑素的合成是: 
将合成的生长抑素全保护的线性肽加到CF3SO3H的三氟乙酸溶液,以苯甲醚为清除剂,在0℃进行反应,反应结束后用乙醚析出固体,过滤收集固体并干燥处理得生长抑素粗品; 
氧化环合与纯化工艺是: 
将得到的线性粗肽进行室温氧化环合,经自然氧化后进行冻干处理得生长抑素粗品,将粗品溶入水中,经过滤,滤液C18制备柱分离纯柱纯化后合并样品,冻干处理获得生长抑素; 
所述用混合酸酐合成片段I、II和IV时采用氯甲酸烷基酯活化羧基,所用氯甲酸烷基酯为氯甲酸乙酯、氯甲酸丙酯、氯甲酸异丙酯、氯甲酸丁酯或氯甲酸异丁酯(ClCOOR,R=Et、Pr、iPr、Bu、iBu)。 
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,使用混合酸酐合成片段I、II和IV时采用的氯甲酸烷基酯为氯甲酸异丁酯。 
3.根据权利要求1或2所述生长抑素液相合成方法,其特征是: 
A.肽片段合成 
a.片段I.Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl的合成: 
称取4.1g Boc-Ser(Bzl)-OH用50ml四氢呋喃溶解,加入1.53ml N-甲基吗啉,在冰盐浴冷却至-15℃,搅拌下缓慢滴加1.8ml的氯甲酸异丁酯,2-4分钟后,缓慢加入预冷到0℃以下溶有4.6g Cys(MeOBzl)-OBzl的20ml四氢呋喃溶液,维持在-15℃反应30分钟后撤去冰盐浴,恢复室温反应,反应结束后过滤除去盐,浓缩滤液,残留物溶于乙酸乙酯,用5%NaOH、水、5%HCl、水、饱和食盐水依次洗涤后,用无水NaSO4 干燥,浓缩减压去溶剂,得到白色固体Boc-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl; 
将得到的Boc-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl8.04g倒入圆底烧瓶,加入10ml二氯甲烷,冷却至0℃以下,加入10ml三氟乙酸,加完恢复室温反应,反应结束后,减压浓缩,残余物用乙酸乙酯溶解,用5%NaOH洗至溶液中性,饱和食盐水洗,干燥,过滤,浓缩得油状物Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl,将所得的油状物用30ml四氢呋喃溶解,放置冰箱预冷至0℃以下备用,再称取Boc-Thr(Bzl)-OH4.08g用50ml四氢呋喃溶解,加入1.45ml N-甲基吗啉,在冰盐浴-15℃下,搅拌下缓慢滴加1.72ml的氯甲酸异丁酯,2-4分钟后,加入预冷至0℃以下溶有Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-Obzl的30ml四氢呋喃,维持在-15℃反应30分钟后撤去冰盐浴,恢复室温反应4-6小时,反应结束后过滤除去盐,浓缩滤液,残留物溶于乙酸乙酯,用5%NaOH、水、5%HCl、水、饱和食盐水依次洗涤后,用无水NaSO4 干燥,浓缩减压去溶剂,再将得到的白色固体用乙酸乙酯和石油醚结晶,得白色固体Boc-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl; 
将得到的Boc-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl9.8g倒入圆底烧瓶,加入10ml二氯 甲烷,冷却至0℃以下,加入10ml三氟乙酸,加完恢复室温反应,反应结束后,减压浓缩,残余物用乙酸乙酯溶解,用5%NaOH洗至溶液中性,饱和食盐水洗,干燥,过滤,浓缩得油状物Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl,所得的油状物用30ml四氢呋喃溶解,放置冰箱预冷至0℃以下备用,再称取Boc-Phe-OH3.3g,用40ml四氢呋喃溶解,加入1.35ml N-甲基吗啉,在冰盐浴-15℃下,搅拌下缓慢滴加1.6ml氯甲酸异丁酯,2-4分钟后,加入预冷至0℃以下的溶有Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-Obzl的20ml的四氢呋喃,维持在-15℃反应30分钟后撤去冰盐浴,恢复室温反应至反应结束,过滤除去盐,浓缩滤液,残留物溶于乙酸乙酯,用5%NaOH、水、5%HCl、水、饱和食盐水依次洗涤后,用无水NaSO4 干燥,浓缩减压去溶剂,得到的固体用乙酸乙酯和石油醚结晶,得到白色固体Boc-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOB zl)-OBzl; 
将得到的Boc-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl11g倒入圆底烧瓶,加入10ml二氯甲烷,冷却至0℃以下,加入10ml三氟乙酸,加完后恢复到室温进行反应,反应结束后,减压浓缩,残余物用乙酸乙酯溶解,用5%NaOH洗至溶液中性,饱和食盐水洗,干燥,过滤,浓缩得油状物为Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl,所得的油状物用30ml四氢呋喃溶解,放置冰箱预冷至0℃以下备用; 
再称取Boc-Thr(Bzl)-OH3.6g,用30ml四氢呋喃溶解,加入1.17ml的N-甲基吗啉,在冰盐浴-15℃下,搅拌下缓慢滴加1.51ml的氯甲酸异丁酯,2-4分钟后,加入在冰箱预冷至0℃以下的Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl的四氢呋喃溶液,维持在-15℃反应30分钟后撤去冰盐浴,恢复室温反应,反应结束,过滤除去盐,浓缩滤液,残留物溶于乙酸乙酯,用5%NaOH、水、5%HCl、水、饱和食盐水依次洗涤后,用无水NaSO4 干燥,浓缩减压去溶剂,得到白色固体为五肽Boc-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl; 
将得到的五肽化合物12.2g倒入圆底烧瓶中,加入10ml二氯甲烷,冷却至0℃以下,加入10ml三氟乙酸,加完后恢复室温反应,结束后,将反应液分次倒入到100-150ml冰箱预冷至0℃以下的无水乙醚中,析出白色固体,过滤,再用异丙醇结晶得片段I:TFA·Thr(Bzl)-Phe -Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl; 
b.片段II:Boc-Phe-Trp-Lys(Z)-OH的合成: 
将8.3g Boc-Trp-OH溶于55ml四氢呋喃中,加入3ml N-甲基吗啉,冰盐浴冷却至-15℃搅拌下,缓慢滴加3.55ml氯甲酸异丁酯,2-4分钟后,加入预冷至0℃以下的溶有9gHCl·Lys(Z)-OMe和3ml的N-甲基吗啉的50ml N,N-二甲基甲酰胺溶液,维持在-15℃温反应30分钟,撤去冰盐浴,恢复室温反应,反应结束后过滤除去盐,浓缩滤液,残留物溶于乙酸 乙酯,用5%NaOH、水、5%HCl、水、饱和食盐水依次洗涤后,用无水NaSO4 干燥,浓缩减压去溶剂,得到的白色固体用乙酸乙酯和石油醚结晶,得到Boc-Trp-Lys(Z)-OMe; 
将得到Boc-Trp-Lys(Z)-OMe15.1g倒入圆底烧瓶,加20ml二氯甲烷,苯甲醚4.2ml,巯基乙醇2.7ml,充氩气保护,冷却至0℃以下,加入20ml的三氟乙酸,加完后恢复至室温反应,反应结束后,减压浓缩,残余物用乙酸乙酯溶解,用5%NaOH洗至溶液中性,饱和食盐水洗,干燥,过滤,浓缩得油状物为Trp-Lys(Z)-OMe,将该油状物用40ml四氢呋喃溶解,放置冰箱预冷至0℃以下备用,再称取Boc-Phe-OH6.8g用50ml四氢呋喃溶解,加入2.82ml的N-甲基吗啉,冰盐浴冷却至-15℃搅拌下,缓慢滴加3.33ml氯甲酸异丁酯,2-4分钟后,加入预冷至0℃以下的Trp-Lys(Z)-OMe四氢呋喃溶液,维持在-15℃反应30分钟后撤去冰盐浴,恢复室温反应,反应结束后过滤除去盐,浓缩滤液,残留物溶于乙酸乙酯,用5%NaOH、水、5%HCl、水、饱和食盐水依次洗涤后,用无水NaSO4 干燥,浓缩减压去溶剂,得到的固体用乙酸乙酯和石油醚结晶得Boc-Phe-Trp-Lys(Z)-OMe17.2g,再将其用50ml的N,N-二甲基甲酰胺溶解,0℃滴加2N NaOH25ml进行皂化反应,反应结束,反应液倒入200ml冰水中,用酸调至pH=2-3,用乙酸乙酯萃取,有机相用水洗至中性,饱和食盐水洗,干燥,浓缩得白色固体为片段II:Boc-Phe-Trp-Lys(Z)-OH; 
c.片段III:Boc-Asn-Phe-OH的合成 
称取Boc-Asn-OH12.028g,1-羟基苯并三唑(HOBt)14g,用100ml N,N-二甲基甲酰胺溶解,在冰浴冷却至0℃搅拌下滴加入溶有7.2g N,N′-二异丙基碳二亚胺(DIC)的10ml N,N-二甲基甲酰胺溶液,再恢复室温反应,反应结束后将反应液再降至0℃以下,在其中加入预冷至0℃以下的溶有苯丙氨酸甲酯盐酸盐(HCl·Phe-OMe)12.278g和N-甲基吗啉6.27ml的100ml N,N-二甲基甲酰胺溶液,维持在0℃搅拌一小时后,恢复室温反应至反应结束,将反应液倒入300-400ml水中,析出大量固体,滤出的固体用乙醚洗涤后将固体干燥处理,再将该固体19.9g溶于200ml的N,N-二甲基甲酰胺中,0℃滴加2N NaOH50ml进行反应,反应结束,将反应液倒入500ml冰水中,加酸调至pH=2-3,析出大量固体,抽滤,用水洗至中性,收集固体,晾干,用异丙醇和石油醚重结晶得白色固体为片段III:Boc-Asn-Phe-OH; 
d.片段IV:Boc-Ala-Gly-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-OH的合成 
将9.1g Boc-Cys(MeOBzl)-OH溶于50ml四氢呋喃中,加3mlN-甲基吗啉,冰盐浴冷却至-15℃,搅拌下缓慢滴加3.46ml氯甲酸异丁酯,2-4分钟后,加入预冷至0℃以下的溶有8gHCl·Lys(Z)-OMe和2.7ml N-甲基吗啉的40ml N,N-二甲基甲酰胺溶液,维持在-15℃下反应30分钟后撤去冰浴,恢复室温反应,反应结束后过滤除去盐,浓缩滤液,残留物溶于乙酸乙 酯,用5%NaOH、水、5%HCl、水、饱和食盐水依次洗涤后,有机相用无水NaSO4 干燥,浓缩减压去溶剂,得到的白色固体用乙酸乙酯和石油醚结晶,得到Boc-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-OMe; 
将得到Boc-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-OMe13.6g倒入圆底烧瓶,加入15ml二氯甲烷,冷却至0℃以下,加入15ml三氟乙酸,加完恢复室温反应,反应结束后,减压浓缩,残余物用乙酸乙酯溶解,用5%NaOH洗至溶液中性,饱和食盐水洗,干燥,过滤,浓缩得油状物为Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-OMe,该油状物用40ml四氢呋喃溶解,放置冰箱预冷至0℃以下备用,将3.85g的Boc-Gly-OH溶于50ml的四氢呋喃中,加2.42ml N-甲基吗啉,冰盐浴冷却,在-15℃搅拌下,缓慢滴加2.9ml氯甲酸异丁酯,2-4分钟后,加入预冷至0℃以下溶有Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-Ome的四氢呋喃溶液,维持在-15℃反应30分钟,撤去冰盐浴,恢复室温反应,反应结束后过滤除去盐,浓缩滤液,残留物溶于乙酸乙酯,用5%NaOH、水、5%HCl、水、饱和食盐水依次洗涤后,用无水NaSO4 干燥,浓缩减压蒸去溶剂,得到的固体用乙酸乙酯和石油醚结晶得Boc-Gly-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-OMe; 
将得到Boc-Gly-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-OMe13.9g倒入圆底烧瓶,加入15ml二氯甲烷,冷却至0℃以下,加入15ml三氟乙酸,加完后恢复反应体系到室温反应,反应结束后,减压浓缩,残余物用乙酸乙酯溶解,用5%NaOH洗至溶液中性,饱和食盐水洗,干燥,过滤,浓缩得油状物为Gly-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-OMe,该油状物40ml四氢呋喃溶解,放置冰箱预冷至0℃以下备用,将3.9gBoc-Ala-OH溶于50ml四氢呋喃中,加2.3ml N-甲基吗啉,冰盐浴冷却,在-15℃搅拌下,缓慢滴加2.7ml氯甲酸异丁酯,2-4分钟后,加入预冷至0℃以下溶有Gly-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-Ome的四氢呋喃溶液,维持在-15℃反应30分钟,撤去冰盐浴,恢复室温反应,反应结束后过滤除去盐,浓缩滤液,残留物溶于乙酸乙酯,用5%NaOH、水、5%HCl、水、饱和食盐水依次洗涤后,用无水NaSO4 干燥,浓缩减压去溶剂,得到的固体用乙酸乙酯和石油醚结晶得Boc-Ala-Gly-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-OMe14.3g,将得到该四肽用100ml N,N-二甲基甲酰胺溶解,加入2N的NaOH20ml进行皂化反应,反应结束后反应液倒入300ml水中,用酸调至pH=2-3,用乙酸乙酯萃取,有机相用水洗至中性,饱和食盐水洗,干燥,浓缩得白色固体为片段IV:Boc-Ala-Gly-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-OH; 
B.片段缩合 
a.八肽化合物V:Boc-Phe-Trp-Lys(Z)-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl 的合成 
称取Boc-Phe-Trp-Lys(Z)-OH3.0g,1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐1.2g,1-羟 基苯并三唑1.13g,用30ml N,N-二甲基甲酰胺溶解,冰浴降至0℃,加0.7ml N-甲基吗啉,反应液维持在0℃搅拌30分钟,再恢复室温搅拌30分钟,然后将反应液再次降至0℃,加入预冷至0℃以下的溶有3.2g TFA·Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MBzl)-OBzl和0.33ml N-甲基吗啉的20ml的N,N-二甲基甲酰胺溶液,此混合液维持0℃搅拌30分钟后,再恢复室温反应,反应结束后,将反应液直接倒入200ml水中,析出大量白色固体,抽滤,滤饼用水洗后,再用甲醇洗,乙醚洗,晾干,得到八肽化合物Boc-Phe-Trp-Lys(Z)-Thr(Bzl)-Phe-Thr(BZl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl; 
b.十肽化合物VI:Boc-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Z)-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeO Bzl)-OBzl的合成 
称取上步得到的八肽化合物V4.5g,加二氯甲烷5ml,苯甲醚0.84ml,巯基乙醇0.35ml,充氩气保护,浸泡15分钟后,降至0℃以下加入5ml三氟乙酸,维持0℃搅拌10分钟后,再恢复室温反应至TLC检测结束,减压抽干二氯甲烷,残余液倒入冷的乙醚,析出固体,抽滤,滤饼用乙醚洗,晾干,得到八肽化合物V的三氟乙酸盐TFA·Phe-Trp-Lys(Z)-Thr(Bzl)-Phe -Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl 4.49g,将该三氟乙酸盐用30ml的N,N-二甲基甲酰胺溶解,再加N-甲基吗啉0.31ml,室温搅拌30分钟后放置冰箱预冷至0℃以下备用,称取Boc-Asn-Phe-OH1.46g,1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDCI1.1g,1-羟基苯并三唑(HOBt)1.05g,用30ml的N,N-二甲基甲酰胺溶解后降温至0℃,加0.6ml的N-甲基吗啉NMM,反应液维持在0℃搅拌30分钟,再恢复室温搅拌30分钟,然后将反应液再次将至0℃,加入预冷至0℃以下的溶有Phe-Trp-Lys(Z)-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl的N,N-二甲基甲酰胺溶液,将混合液维持在0℃搅拌30分钟,再恢复室温反应,反应结束后,将反应液直接倒入200ml水中,析出大量白色固体,滤出固体后将滤饼用水洗后,再用甲醇洗,乙醚洗,晾干,得到十肽化合物VIBoc-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Z)-Thr (Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl; 
c.十四肽化合物VII:Boc-Ala-Gly-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Z)-Thr(Bzl) -Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl的合成 
称取上步得到的十肽化合物VI4.8g,加二氯甲烷4ml,苯甲醚0.78ml,巯基乙醇0.33ml,充氩气保护,浸泡15分钟后,降至0℃以下加入4ml三氟乙酸,维持0℃搅拌10分钟后,再恢复室温反应至反应结束,减压抽干二氯甲烷,残余液倒入冷的乙醚,析出固体,抽滤,滤饼用乙醚洗涤后晾干,得到十肽化合物VI的三氟乙酸盐TFA·Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Z)-Thr (Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MOBzl)-OBzl,将该三氟乙酸盐用40ml的N,N-二甲基甲酰胺 溶解,再在其中加入0.28ml的N-甲基吗啉,室温搅拌30分钟,置入冰箱冷冻至0℃以下备用,称取Boc-Ala-Gly-Cys(MOBzl)-Lys(Z)-OH2.58g,1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐1.0g,1-羟基苯并三唑(HOBt)0.95g,用30ml的N,N-二甲基甲酰胺溶解,降温至0℃,加入0.58ml的N-甲基吗啉,反应液维持0℃搅拌30分钟,再恢复室温搅拌30分钟,然后将反应液再次将至0℃,加入预冷至0℃以下溶有Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Z)-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser (Bzl)-Cys(MOBzl)-OBzl的N,N-二甲基甲酰胺溶液 ,将此混合液维持0℃搅拌30分钟,再恢复室温反应,反应结束后将反应液直接倒入200ml水中,析出大量白色固体,滤出固体后将滤饼用水洗后,再用甲醇洗,乙醚洗,晾干,得到生长抑素全保护的线性肽化合物,也就是十四肽化合物VII:Boc-Ala-Gly-Cys(MeOBzl)-Lys(Z)-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys(Z)-Thr(Bzl)-Phe-Thr (Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(MeOBzl)-OBzl; 
C.还原性生长抑素的合成 
称取合成的生长抑素全保护的线性肽化合物VII2g,加苯甲醚6.6ml,冲氩气保护,冰浴冷却至0℃,加5mmol/mL的CF3SO3H的三氟乙酸溶液12ml,维持0℃反应1小时后,反应液中加入100ml预冷至0℃以下的无水乙醚,即析出大量白色固体,过滤,收集固体,真空干燥,得生长抑素粗品; 
D.将得到的线性粗肽按0.08-0.1mg/ml进行室温氧化环合,通入氧气或空气自然氧化,pH调至7.5-8.0,搅拌2-3天,冻干得生长抑素粗品,将粗品溶入水中,过滤,滤液分批经C18制备柱纯化,纯化条件为:流动相为含有0.1%三氟乙酸的乙腈和含有0.1%三氟乙酸的水,采用梯度洗脱,检测波长:280nm,收集样品洗脱液冻干后,获得精品生长抑素。 
CN2009101424202A 2009-06-03 2009-06-03 一种生长抑素的合成方法 Active CN101570570B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2009101424202A CN101570570B (zh) 2009-06-03 2009-06-03 一种生长抑素的合成方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2009101424202A CN101570570B (zh) 2009-06-03 2009-06-03 一种生长抑素的合成方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101570570A CN101570570A (zh) 2009-11-04
CN101570570B true CN101570570B (zh) 2013-07-10

Family

ID=41230065

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2009101424202A Active CN101570570B (zh) 2009-06-03 2009-06-03 一种生长抑素的合成方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN101570570B (zh)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103374054B (zh) * 2012-04-28 2014-12-24 上海第一生化药业有限公司 一步法固相合成多肽的方法
CN102690325B (zh) * 2012-06-08 2014-01-15 上海太阳生物技术有限公司 多肽PyroGlu-Pro-Arg-pNA·HCl的合成
CN103265620B (zh) * 2013-05-24 2014-07-30 成都天台山制药有限公司 生长抑素及其制备方法
CN103275189B (zh) * 2013-06-06 2014-08-06 深圳翰宇药业股份有限公司 一种用于肽树脂的裂解液及其在固相裂解合成生长抑素中的应用
CN106279354A (zh) * 2016-10-09 2017-01-04 温州医科大学 一种氨基酸神经二肽的合成方法
CN106478771A (zh) * 2016-10-09 2017-03-08 李世军 一种氨基酸神经四肽的合成方法
CN113702560B (zh) * 2021-08-31 2022-07-08 哈尔滨吉象隆生物技术有限公司 一种化学合成生长抑素中产生副产物的检测方法
CN115043928A (zh) * 2022-06-22 2022-09-13 四川吉晟生物医药有限公司 一种生长抑素的制备方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3917578A (en) * 1973-12-10 1975-11-04 Ayerst Mckenna & Harrison Process for producing somatostatin and intermediates
US4093609A (en) * 1976-12-10 1978-06-06 American Home Products Corporation Somatostatin synthesis
US4337194A (en) * 1979-03-23 1982-06-29 C. M. Industries Process for the preparation of somatostatin
CN1508152A (zh) * 2002-12-17 2004-06-30 常州市第四制药厂有限公司 生长抑素全合成新方法
CN1552728A (zh) * 2003-05-29 2004-12-08 上海子能药物研究有限公司 一种生长抑素的合成方法
CN1640889A (zh) * 2004-01-13 2005-07-20 兰州凯博生物化学技术有限公司 混合酸酐法合成胸腺五肽的方法
CN1923851A (zh) * 2005-08-30 2007-03-07 上海子能制药有限公司 固相多肽合成生长抑素的制备方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3917578A (en) * 1973-12-10 1975-11-04 Ayerst Mckenna & Harrison Process for producing somatostatin and intermediates
US4093609A (en) * 1976-12-10 1978-06-06 American Home Products Corporation Somatostatin synthesis
US4337194A (en) * 1979-03-23 1982-06-29 C. M. Industries Process for the preparation of somatostatin
CN1508152A (zh) * 2002-12-17 2004-06-30 常州市第四制药厂有限公司 生长抑素全合成新方法
CN1552728A (zh) * 2003-05-29 2004-12-08 上海子能药物研究有限公司 一种生长抑素的合成方法
CN1640889A (zh) * 2004-01-13 2005-07-20 兰州凯博生物化学技术有限公司 混合酸酐法合成胸腺五肽的方法
CN1923851A (zh) * 2005-08-30 2007-03-07 上海子能制药有限公司 固相多肽合成生长抑素的制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
D. Sarantakis and W.A. McKinley.Total synthesis of hypothalamic somatostatin..《BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS》.1973,第54卷(第1期),234-238页.
Total synthesis of hypothalamic somatostatin.;D. Sarantakis and W.A. McKinley;《BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS》;19731231;第54卷(第1期);234-238页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN101570570A (zh) 2009-11-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101570570B (zh) 一种生长抑素的合成方法
WO2017114191A9 (zh) 索玛鲁肽的制备方法
CN104387454B (zh) 一种片段缩合制备曲普瑞林的方法
US20100292436A1 (en) Method for producing bivalirudin
NO812612L (no) Enzym-inhibitorer.
OA11501A (en) Process for the preparation of resin-bound cyclic peptides.
EP2062909A1 (en) Peptide production and purification process
CN108047329A (zh) 一种阿巴帕肽的制备方法
CN102875649B (zh) 一种制备特拉匹韦及其中间体的方法及所述中间体
CN109734794A (zh) 一种阿巴帕肽的制备方法
KR101238133B1 (ko) 엡티피바타이드 및 관련 중간체 화합물의 제조 방법
CN112175046A (zh) 一种多肽固液组合合成曲普瑞林的方法
AU2019323613B2 (en) Solution phase routes for Wnt hexapeptides
CN113150108B (zh) 一种利拉鲁肽的固相合成方法
JPS61291599A (ja) 環状ヘキサペプチドソマトスタチン類縁体
CN107778351B (zh) 一种全固相合成奥曲肽的方法
CN112876541B (zh) 一种地加瑞克的固相合成方法
CN110642936B (zh) 一种制备特立帕肽的方法
JP4580928B2 (ja) ソマトスタチンペプチドの製造
US6448031B1 (en) Process for producing LH-RH derivatives
CN116836258A (zh) 一种利拉鲁肽的固相合成方法
CN1199988C (zh) 醋酸奥曲肽的液相合成方法
CN109810169B (zh) 一种Reltecimod的液相制备方法
UCHIYAMA et al. Studies on Secretin. I. Synthesis of Completely Protected Secretin
KR20110060779A (ko) 루프로라이드의 제조방법

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant