CN100338090C - 生长抑素全合成新方法 - Google Patents

Abstract

本发明属生物技术领域，本发明公开了生长抑素(14肽)的固相合成新方法。本方法采用2-氯三苯甲基树脂作固相载体，在该树脂首先连接保护半胱氨酰基(Fmoc-Cys(Trt)-)，采用Fmoc保护氨基酸的程序接肽法完成生长抑素线肽的合成，用三氟醋酸一次脱除线肽侧链保护基团，并切割树脂，得到生长抑素线肽的三氟醋酸。该中间产物在双氧水或二甲基亚砜水溶液中氧化环合，得到生长抑素三氟醋酸盐粗制品。该粗制品经C₁₈键合硅胶中压柱，用甲醇-水梯度洗脱方法分离纯化，得生长抑素三氟醋酸精制产品。该产品用醋酸离子交换树指交换，并冷冻干燥得最终产品。本方法制备生长抑素具有产率高，合成快，不易消旋，可分子内选择性氧化环合，纯度好，方法简便等优点。可用于大批量生产制备。

Description

生长抑素全合成新方法

技术领域

本发明属生物技术领域。具体涉及一种生长抑素全合成方法。

背景技术

生长抑素(somatostatin)化学名：丙氨酰-甘氨酰-半胱氨酰-赖氨酰-天冬酰胺酰-苯丙氨酰-苯丙氨酰-色氨酰-赖氨酰-苏氨酰-苯丙氨酰-苏氨酰-丝氨酰-半胱氨酸(3，14)二硫环(Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cysteine Cydic(3→14)disulphide

化学结构式为：

分子式：C₇₆H₁₀₄N₁₈O₁₉S₂

分子量：1638

本品是人工合成的14肽环状化合物。化学结构与天然生长抑素(生长素释放抑制素，growth hormone release inhibitory hormone)是完全相同的。人工合成本品的报道有化学合成法和生物合成法，其中化学合成法又有液相多肽合成法和固相多肽合成法，生物合成法是近年发展起来的新合成方法，但生物表达技术尚不成熟。同时，产品的纯化和产率方面离产业化生产尚有较大距离。目前，上市产品的来源主要采用化学合成方法制备。我们改进的合成方法，采用新型2-氯-三苯甲基树脂进行固相合成本品。

缩写表：

TFA	三氟醋酸
		DCC	双环己基碳二亚胺

SPPS	固相多肽合成
		DCM	二氯甲烷

HOBt	N-羟基-苯并三氮唑
		DMF	二甲基甲酰胺
Fmoc	9-芴甲氧-羰基
		Boc	叔丁氧羰基
TBu	叔丁基
		DMSO	二甲亚砜

Thioanisole	苯甲硫醚
		RP-CC	反相柱层析
RP-HPLC	反相高效液相色谱
		Cbz，Z	苄氧羰基
AcOH	醋酸

液相多肽合成法的报道

美国专利USP.4,337,194；3,862,295；3,917,578和德国L.Moroder等；加拿大Hans U.Immer等分别于1973年至1981年报道了采用液相多肽合成法制备本品的方法。在L.Moroder等和HansU.Immer等报道的液相法合成本品的方法中，采用Z保护氨基酸进行缩肽反应，需多步骤进行H₂/Pd反应，在实际操作中难度较大，且难以大批量制备。在USP3,862,925报道中，采用氟化氢去保护基，工艺中试验条件和氟化氢的贮运等均难以实现。USP3,917,578采用在14肽线肽合成后，需先形成二硫键环，然后去保护基的方法，使二硫键环形成位阻收率降低。因此这些报道均难以选作大批量制备本品的方法。

USP4,337,194报道的合成路线较适合于工业化大批量生产。但该液相法存在：(1)反应步骤多，路线冗长。(2)中间体不易纯化分离，实际操作中溶剂蒸除难度较大。(3)试剂和所用氨基酸侧链保护基的来源和制备难度较大，使成本优势降低，难以适合于大批量生产。

固相多肽法合成本品的报道

1974年Jean E.F.Rivier报道了采用氯甲基化树脂固相多肽法合成本品的方法。

该方法的主要特点是采用了常规的固相合成方法。使合成操作简单方便，时间大大缩短，克服了液相法操作步骤长，需中间体纯化等不足。最终线肽纯化方法采用交联葡聚糖常压柱分离。但是该方法仍存在：(1)合成过程易消旋，使产品旋光性降低。(2)合成中去除侧链保护基须使用氟化氢(HF)。需要有特殊的合成设备和去除氟化氢装置。生产时氟化氢的来源，存放和操作等问题均不易解决，难以用于生产。

固相—液相混合法合成本品的文献报道

1978年美国专利USP4,093,609公开了美国家用产品公司申请的专利，采用固相—液相混合法合成本品。该方法还需采用氟化氢等条件，没有改变上述固相法和液相法中不足。

通过对报道的固相法合成路线方法进行研究和对试剂材料的调研，认为采用固相法合成多肽技术发展很快。随着近年各种新型号树脂和保护氨基酸的研究开发成功，逐步可以解决固相法合成中影响大批量生产肽的三项技术难点，(1)路线中可以不使用氟化氢。(2)较长肽链的缩肽过程中的消旋化影响大大降低。(3)树脂的取代值和强度都有较大的提高。(4)通过手工方法可以大大方便地完成缩肽过程。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，设计操作简便，反应过程消旋化低、产品质量好、收率高的合成方法。

本发明提供了一种生长抑素全合成方法，该方法包括以下步骤：

1.程序反应

生长抑素线肽合成采用程序反应，步骤如下：

步骤	溶剂(或试剂)	用量(ml/g)	次数	时间(分钟/次)	备注
						1	二氯甲烷	5-7	2	2	1，2交替洗
2	甲醇	5-7	2	2
						3	20％哌啶/DMF	10	2	20
4	二氯甲烷	5-7	3	2	4，5交替洗
						5	甲醇	5-7	3	2
6	加入1-3当量Fmoc保护氨基酸，1-3当量HOBt，用二氯甲烷溶解，若难溶，加少许DMF，而后加入1-3当量1mol/l DCC/DCM，机械搅拌。		1	4小时
						7	二氯甲烷	5-7	3	2	7，8交替洗
8	甲醇	5-7	3	2

2.切割反应

合成生长抑素树脂线肽采用K试剂切割，方法如下：

将K试剂加入到树脂中(约10ml-30ml/g树脂)，树脂立即变为紫红色，冰水浴下机械搅拌反应5小时后，过滤，并用K试剂洗涤树脂，加入大量冷乙醚，即析出大量白色固体，过滤，收集白色固体，余渣用10％醋酸洗涤后，合并，冷冻干燥；

K试剂由三氟乙酸、苯甲硫醚、乙二硫醇、苯酚、水组成。

3.氧化环合与纯化工艺

对得到的线形肽按照1mg/1.5ml的浓度进行室温氧化环合，氧化溶剂为0.01-1％双氧水或0.1-5％二甲亚砜/水；≥5小时后，氧化环合完全；直接上C₁₈填料的中压色谱柱，5-500mg/g填料；先用蒸馏水将双氧水或二甲亚砜从色谱柱上洗脱，然后用0-80％MeOH/H₂O：0.1-10％AcOH将产品从色谱柱洗脱，浓缩后，冷冻干燥，一次性可得到除去双氧水或二甲亚砜的产品。提高纯度，按一定梯度(MeOH/H₂O/AcOH体系)进行二次纯化。冷冻干燥后，冰箱冷冻室保存。

生长抑素合成工艺：

本发明全合成方法的产品质量控制如下：

1.中间体质量控制

(1)产物的检测及反应终点的跟踪用茚三酮定性显色测试法

(2)显色反应为阳性结果的洗脱液为样品溶液

(3)生长抑素含量≥94％

2.中间体控制方法

取少量树脂(3-6mg)，放置于试管中，依次加入Kaiser试剂，混合后，将试管置于沸水浴中3-10分钟，观察颜色。

结果判断：

当树脂中有游离的伯胺基(-NH2-)存在时，该氨基可与茚三酮试剂形成兰色化合物，使反应混合物呈兰色，溶液中蓝色的深浅与树脂上的游离氨基的浓度成正比，若反应混合物呈兰色，表示联接不完全，如混合物呈无色淡黄色则表明游离氨基几乎或已不存在联接反应达终点。

当树脂仅载有仲胺基(NH-)时，该游离仲氨基仅与茚三酮试剂显紫色，如游离仲氨基几乎或全部被酰化，试验结果应为无色或淡黄色。

上述茚三酮定性实验需重复一次，并用反应前的树脂和空白试剂作对照。

3.线肽的检测方法：HPLC方法，含量＞50％。(检测结果见附图1)

4.氧化环合反应的质量控制方法：HPLC方法，含量＞95％。(检测结果见附图2)

5.原辅材料名称、规格

本发明的方法是一种生长抑素全合成的新方法，为固相法，一次完成侧链保护的生长抑素线肽，有以下特点：(1)采用Fmoc-保护氨基酸，配比为1-3摩尔；采用2-氯三苯甲基树脂作固相合成载体；采用取代值为0.2-0.8mmol/克树脂优选0.5mmol/克树脂；(2)采用三氟乙酸切割生长抑素线肽，同时完成对线肽肽侧链保护基的去除，切割试剂由三氟乙酸、苯酚、乙二硫醇、苯甲硫醚、水组成；(3)采用双氧水和二甲基亚砜氧化环合，双氧水浓度为0.01％-1％，优选0.1％(W/V)，二甲基亚砜浓度为0.1％-10％，优选1％(W/V)，氧化液浓度为0.01％-1％(W/V)，优选0.06％(W/V)，氧化温度为0-40℃，双氧水氧化优选20℃，二甲基亚砜氧化优选35℃，氧化时间为5-120小时，双氧水氧化优选15小时，二甲基亚砜氧化优选24小时；(4)采用非高压液相色谱方法进行纯化分离，采用反相C₁₈键合硅胶装填层析柱，层析分离装载量为5-100mg/克C₁₈键合硅胶，优选20mg/克，采用水作为洗脱氧化剂流动相，采用水/醇/有机酸作层析流动相，优选水/甲醇/乙酸，采用水/甲醇梯度洗脱方法；(5)采用醋酸离子交换树脂去除三氟醋酸。

具体实施方式

实施例1

N^α-9-芴甲氧羰基-O-叔丁基-丝氨酰-N^min-三苯甲基-半胱氨酰-2-氯-三苯甲基树脂的制备

试剂	投料量	摩尔数
			Nα-9-芴甲氧羰基-O-叔丁基-丝氨酸Fmoc-Ser(tBu)-OH	1.54g	4mmol
Fmoc-Cys(Trt)-	4g	2mmol
			HOBt	0.54g	4mmol
DCC/DCM溶液	4ml	4mmol
			20％哌啶/DMF溶液	50ml×2
DCM	约320ml
			MeOH	约300ml
DMF	适量

操作：(1)将Fmoc-Cys(Trt)-树脂置于多肽合成器中，用DCM、MeOH各30ml×2交替洗2次，2min/次，抽干，加20％哌啶/DMF溶液50ml×2室温。搅拌20min，2次(去Fmoc)，抽干，树脂用DCM、MeOH各30ml×3交替洗3次，2min/次，抽干。Kasier试剂检测，结果呈阳性，Fmoc已去，若显阴性，继续去Fmoc II至呈阳性。

(2)将含有Fmoc-Ser(tBu)-OH，HOBt的DCM/DMF溶液加入树脂中，加DCC/DCM溶液4ml，室温搅拌4小时。

(3)抽干，树脂用DCM/MeOH各30ml×3交替洗3次，2min/次，抽干。

(4)用Kaiser试剂进行显色，检测偶联反应。

(5)若反应4小时后仍显阳性，重复偶联反应，直至检测显阴性，反应结束。

(1)得

实施例2

N^α-9-芴甲氧羰基-O-叔丁基-苏氨酰-O-叔丁基-丝氨酰-N^im-三苯甲基-半胱氨酰-2-氯-三苯甲基树脂的制备

反应式：

投料量及摩尔比

试剂	投料量	摩尔数
			树脂		2mmol
Fmoc-Thr(tBu)-OH	1.6g	4mmol
			HOBt	0.54g	4mmol
DCC/DCM溶液	4ml	4mmol
			20％哌啶/DMF溶液	100ml
DCM	约320ml
			MeOH	约300ml
DMF	适量

操作：(1)向树脂中加入20％哌啶/DMF溶液50ml×2，室温搅拌20min，2次(去Fmoc)，抽干，树脂用DCM、MeOH各30ml×3交替洗3次，2min/次，抽干Kaiser试剂。检测，结果呈阳性，Fmoc已去，若显阴性，继续去Fmoc直至呈阳性。

(2)将含有Fmoc-Thr(tBu)-OH，HOBt的DCM/DMF溶液加入树脂中，加DCC/DCM溶液4ml，室温搅拌4小时。

(3)抽干，树脂用DCM/MeOH各30ml×3交替洗3次，2min/次，抽干。

(4)用Kaiser试剂，检测偶联反应。

(5)若反应4小时后仍显阳性，重复偶联反应，直至检测显阴性，反应结束。

(2)得

实施例3

N^α-9-芴甲氧羰基-苯丙氨酰-O-叔丁基-苏氨酰-O-叔丁基-丝氨酰-N^im-三苯甲基-半胱氨酰-2-氯-三苯甲基树脂的制备

反应式：

投料量及摩尔比

试剂	投料量	摩尔数
			树脂		2mmol
Fmoc-Phe-OH	1.55g	4mmol
			HOBt	0.54g	4mmol
DCC/DCM溶液	4ml	4mmol
			20％哌啶/DMF溶液	100ml
DCM	约320ml
			MeOH	约300ml
DMF	适量

操作：(1)向树脂中加入20％哌啶/DMF溶液50ml×2，室温搅拌20min，2次(去Fmoc)，抽干，树脂用DCM、MeOH各30ml×3交替洗3次，2min/次，抽干Kaiser试剂。检测：结果显阳性，Fmoc已去。

(2)将含有Fmoc-Phe-OH，HOBt的DCM/DMF溶液加入树脂中，加DCC/DCM溶液4ml，室温搅拌4小时。

(3)抽干，树脂用DCM/MeOH各30ml×3交替洗3次，2min/次，抽干。

(4)用Kaiser试剂，检测偶联反应。

(5)若反应4小时后仍显阳性，重复偶联反应，直至检测显阴性，反应结束。

(6)得

实施例4

N^α-9-芴甲氧羰基-O-叔丁基-苏氨酰-苯丙氨酰-O-叔丁基-苏氨酰-O-叔丁基-丝氨酰-N^im-三苯甲基-半胱氨酰-2-氯-三苯甲基树脂的制备

反应式：

投料量及摩尔比

试剂	投料量	摩尔数
			树脂		2mmol
Fmoc-Thr(tBu)-OH	1.6g	4mmol
			HOBt	0.54g	4mmol
DCC/DCM溶液	4ml	4mmol
			20％哌啶/DMF溶液	100ml
DCM	约320ml
			MeOH	约300ml
DMF	适量

操作：固相合成方法，中间体控制同3

得

实施例5

N^α-9-芴甲氧羰基-叔丁氧羰基-赖氨酰-O-叔丁基-苏氨酰-苯丙氨酰-O-叔丁基-苏氨酰-O-叔丁基-丝氨酰-N^im-三苯甲基-半胱氨酰-2-氯-三苯甲基树脂的制备

反应式：

投料量及摩尔比

试剂	投料量	摩尔数
			树脂		2mmol
Fmoc-Lys(Boc)-OH	1.89g	4mmol
			HOBt	0.54g	4mmol
DCC/DCM溶液	4ml	4mmol
			20％哌啶/DMF溶液	100ml
DCM	约320ml
			MeOH	约300ml
DMF	少许

操作：固相合成方法，中间体控制同3

得

实施例6

N^α-9-芴甲氧羰基-色氨酰-叔丁氧羰基-赖氨酰-O-叔丁基-苏氨酰-苯丙氨酰-O-叔丁基-苏氨酰-O-叔丁基-丝氨酰-N^im-三苯甲基-半胱氨酰-2-氯-三苯甲基树脂的制备

反应式：

投料量及摩尔比

试剂	投料量	摩尔数
			树脂		2mmol
Fmoc-Trp-OH	1.71g	4mmol
			HOBt	0.54g	4mmol
DCC/DCM溶液	4ml	4mmol
			20％哌啶/DMF溶液	100ml
DCM	约320ml
			MeOH	约300ml
DMF	适量

操作：固相合成方法，中间体控制同3

得

实施例7

N^α-9-芴甲氧羰基-苯丙氨酰-色氨酰-叔丁氧羰基-赖氨酰-O-叔丁基-苏氨酰-苯丙氨酰-O-叔丁基-苏氨酰-O-叔丁基-丝氨酰-N^im-三苯甲基-半胱氨酰-2-氯-三苯甲基树脂的制备

反应式：

投料量及摩尔比

试剂	投料量	摩尔数
			树脂		2mmol
Fmoc-Phe-OH	1.55g	4mmol
			HOBt	0.54g	4mmol
DCC/DCM溶液	4ml	4mmol
			20％哌啶/DMF溶液+吲哚(1mg/ml)	100ml
DCM	约320ml
			MeOH	约300ml
DMF	适量

操作：固相合成方法，中间体控制同3

得：

实施例8

N^α-9-芴甲氧羰基-苯丙氨酰-苯丙氨酰-色氨酰-叔丁氧羰基-赖氨酰-O-叔丁基-苏氨酰-苯丙氨酰-O-叔丁基-苏氨酰-O-叔丁基-丝氨酰-N^im-三苯甲基-半胱氨酰-2-氯-三苯甲基树脂的制备

反应式：

投料量及摩尔比

试剂	投料量	摩尔数
			树脂		2mmol
Fmoc-Phe-OH	1.55g	4mmol
			HOBt	0.54g	4mmol
DCC/DCM溶液	4ml	4mmol
			20％哌啶/DMF溶液+吲哚(1mg/ml)	100ml
DCM	约320ml
			MeOH	约300ml
DMF	适量

操作：固相合成方法，中间体控制同.3

得：

实施例9

N^α-9-芴甲氧羰基-N^im-三苯甲基-天冬酰胺酰-苯丙氨酰-苯丙氨酰-色氨酰-叔丁氧羰基-赖氨酰-O-叔丁基-苏氨酰-苯丙氨酰-O-叔丁基-苏氨酰-O-叔丁基-丝氨酰-N^im-三苯甲基-半胱氨酰-2-氯-三苯甲基树脂的制备

反应式：

投料量及摩尔比

试剂	投料量	摩尔数
			树脂		2mol
Fmoc-Asn(trt)	2.4g	4mmol

-OH
			HOBt	0.54g	4mmol
DCC/DCM溶液	4ml	4mmol
			20％哌啶/DMF溶液+吲哚(1mg/ml)	100ml
吲哚	100ml
			DCM	约320ml
MeOH	约300ml
			DMF	适量

操作：固相合成方法，中间体控制同3

得：

实施例10

N^α-9-芴甲氧羰基-叔丁氧羰基-赖氨酰-N^im-三苯甲基-天冬酰胺酰-苯丙氨酰-苯丙氨酰-色氨酰-叔丁氧羰基-赖氨酰-O-叔丁基-苏氨酰-苯丙氨酰-O-叔丁基-苏氨酰-O-叔丁基-丝氨酰-N^im-三苯甲基-半胱氨酰-2-氯-三苯甲基树脂的制备

反应式：

投料量及摩尔比

试剂	投料量	摩尔数
			树脂		2mmol
Fmoc-Lys(Boc)-OH	1.89g	4mmol
			HOBt	0.54g	4mmol
DCC/DCM溶液	4ml	4mmol
			20％哌啶/DMF溶液+吲哚(1mg/ml)	100ml
DCM	约320ml
			MeOH	约300ml

DMF

适量

操作：固相合成方法，中间体控制同3

得：

实施例11

N^α-9-芴甲氧羰基-N^im-三苯甲基-半胱氨酰-叔丁氧羰基-赖氨酰-N^im-三苯甲基-天冬酰胺酰-苯丙氨酰-苯丙氨酰-色氨酰-叔丁氧羰基-赖氨酰-O-叔丁基-苏氨酰-苯丙氨酰-O-叔丁基-苏氨酰-O-叔丁基-丝氨酰-N^im-三苯甲基-半胱氨酰-2-氯-三苯甲基树脂的制备

反应式：

投料量及摩尔比

试剂	投料量	摩尔数
			树脂		2mmol
Fmoc-Cys(Trt)-OH	2.37g	4mmol
			HOBt	0.54g	4mmol
DCC/DCM溶液	4ml	4mmol
			20％哌啶/DMF溶液+吲哚(1mg/ml)	100ml
DCM	约320ml
			MeOH	约300ml
DMF	适量

操作：固相合成方法，中间体控制同3

得：

实施例12

叔丁氧羰基-丙氨酰-甘氨酰-N^im-三苯甲基-半胱氨酰-叔丁氧羰基-赖氨酰-N^im-三苯甲基-天冬酰胺酰-苯丙氨酰-苯丙氨酰-色氨酰-叔丁氧羰基-赖氨酰-O-叔丁基-苏氨酰-苯丙氨酰-O-叔丁基-苏氨酰-O-叔丁基-丝氨酰-N^im-三苯甲基-半胱氨酰-2-氯-三苯甲基树脂的制备

反应式：

投料量及摩尔比

试剂	投料量	摩尔数
			树脂		2mmol
Boc-Ala-Gly-OH	0.99g	4mmol
			HOBt	0.54g	4mmol
DCC/DCM溶液	4ml	4mmol
			20％哌啶/DMF溶液+吲哚(1mg/ml)	100ml
DCM	约320ml
			MeOH	约300ml
DMF	适量

操作：固相合成方法，中间体控制同3

得

实施例13

将树脂干燥(真空)称重得：5.982g淡黄色树脂。

脱离反应：丙氨酰-甘氨酰-半胱氨酰-赖氨酰-天冬酰胺酰-苯丙氨酰-苯丙氨酰-色氨酰-赖氨酰-苏氨酰-苯丙氨酰-苏氨酰-丝氨酰-半胱氨酸的制备

反应式：

投料量及摩尔比

试剂	投料量	摩尔数
			树脂	5.982g
K试剂	90ml
			乙醚	大量(约4升)

操作：将K试剂加入树脂中，冰水浴冷却搅拌5小时，过滤，树脂用40mlK试剂洗涤。合并滤液。向滤液中加入大量乙醚，析出大量白色固体，过滤，滤饼用乙醚洗涤，收集白色固体。干燥，得线肽(粗品)(TFA盐)1.68g。

实施例14

氧化环合反应

反应式：

试剂	投料量	摩尔数
			0.1％H2O2或5％DMSO/H2O	2520ml
线肽	1.68g

操作方法：

将线肽1.68g投入2520ml5％DMSO/H₂O溶液中，振荡溶解后，室温放置24小时(避光)后点样。展开剂：n-BuOH∶AcOH∶Py∶H₂O＝9∶2∶3∶4

氧化环合完全后直接上样

得：

实施例15

分离纯化

除双氧水或二甲亚砜

试剂	投料量
		生长抑素粗品水溶液	2520ml
80％MeOH/H2O	3000ml
		蒸馏水	约2000ml

装置：

操作方法：

(3)将生长抑素/DMSO/H₂O溶液上柱

(4)用蒸馏水进行洗脱，直至将DMSO除去

(5)用80％MeOH/H₂O：1mlAcOH进行洗脱

(6)收集洗脱液，浓缩冷冻干燥

(7)得生长抑素粗品1.44g

纯化

试剂	投料量
		生长抑素粗品	1.44g
H2O	15ml
		MeOH/H2O：AcOH	梯度洗脱

装置：C₁₈制备柱(22×300mm)

操作：(1)生长抑素粗品用15ml水溶解后上柱；

(2)收集洗脱液；

(3)浓缩，冷冻干燥；

(4)其他低于98％洗脱液合并，冷冻干燥，重新纯化；

(5)得生长抑素，TFA白色固体560mg。

RP-CC纯化

条件：洗脱液A：0.2％AcOH/MeOH

      洗脱液B：0.2％AcOH/H₂O

层析柱：C18制备柱(22×300mm)

洗脱梯度                        时间(分)

100％B	100ml	50
			0-20％A	各100ml	100
20％-30％A	各100ml	100
			30％-40％A	各100ml	100
40％-60％A	各100ml	100

60％-100％A

各100ml

100

流速2ml/min

紫外检测波长220nm

实施例16

交换反应(醋酸生长抑素制备)

投料量

试剂	投料量
		生长抑素TFA盐	560mg
10％醋酸	10ml

装置：离子交换树脂柱(25×300mm)

操作：

(1)将生长抑素三氟醋酸盐溶于10％醋酸中

(2)将此溶液加入到盛有强碱性离子交换树脂柱上(25×300mm)

(3)用10％醋酸水溶液洗脱样品

(4)收集洗脱液

(5)用茚三酮显色反应进行跟踪

(6)合并样品洗脱液

(7)浓缩、冷冻干燥得醋酸生长抑素白色固体450mg。

Claims (3)

1.一种生长抑素全合成方法，其特征在于该方法包括下列步骤：

I.程序反应

生长抑素线肽合成采用程序反应，步骤如下：

以Fmoc-Cys(Trt)-2-氯三苯甲基树脂(Fmoc-Cys(Trt)-resin)为起始固相合成载体，每次通过程序反应：

第一次与Fmoc-Ser(tBu)-OH反应得Fmoc-Ser(tBu)-Cys(Trt)-resin；

第二次与Fmoc-Thr(tBu)-OH反应得Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-resin；

第三次与Fmoc-Phe-OH反应得Fmoc-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-resin；

第四次与Fmoc-Thr(tBu)-OH反应得

Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-resin；

第五次与Fmoc-Lys(Boc)-OH反应得

Fmoc-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-resin；

第六次与Fmoc-Trp-OH反应得

Fmoc-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-resin；

第七次与Fmoc-Phe-OH反应得

Fmoc-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-resin；

第八次与Fmoc-Phe-OH反应得

Fmoc-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-resin

第九次与Fmoc-Asn(Trt)-OH反应得

Fmoc-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-resin；

第十次与Fmoc-Lys(Boc)-OH反应得

Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-rein；

第十一次与Fmoc-Cys(Trt)-OH反应得

Fmoc-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-rein；

第十二次与Boc-Ala-Gly-OH反应得Boc-Ala-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-rein；

程序反应用下列步骤洗涤：

(1)用二氯甲烷5-7ml/g洗2次，每次2分钟；

(2)用甲醇5-7ml/g洗2次，每次2分钟；

(3)用20％哌啶/DMF 10ml/g洗2次，每次20分钟；

(4)用二氯甲烷5-7ml/g洗3次，每次2分钟；

(5)用甲醇5-7ml/g洗3次，每次2分钟；

(6)加入1-3当量Fmoc保护氨基酸，1-3当量HOBt，所述HOBt用二氯甲烷或二氯甲烷与N，N，-二甲基甲酰胺溶解，而后加入1-3当量1mol/l N，N，-二环己基碳酰亚胺/二氯甲烷，机械搅拌，4小时；

(7)用二氯甲烷5-7ml/g洗3次，每次2分钟；

(8)用甲醇5-7ml/g洗3次，每次2分钟；

II.切割反应

步骤I程序反应得到的合成生长抑素树脂线肽采用K试剂切割：

将K试剂加入到10ml-30ml/g树脂中，树脂立即变为紫红色，冰水浴下机械搅拌反应5小时后，过滤，并用K试剂洗涤树脂，加入过量冷乙醚，即析出白色固体，过滤，收集白色固体，余渣用10％醋酸洗涤后，合并，冷冻干燥得线肽；所述K试剂由三氟乙酸、苯甲硫醚、乙二硫醇、苯酚、水组成，它们的体积比为33∶2∶2∶2∶1；

III.氧化环合与纯化工艺

对得到的线肽按照1mg/1.5ml的浓度进行室温氧化环合，氧化溶剂为0.01-1％双氧水或0.1-5％二甲亚砜水溶液；大于或等于5小时后，氧化环合完全；直接上C₁₈填料的中压色谱柱，所述中压色谱柱为5-500mg/g填料；先用蒸馏水将双氧水或二甲亚砜从色谱柱上洗脱，然后，用0-80％MeOH/H₂O以及0.1-10％AcOH将产品从色谱柱梯度洗脱，浓缩后，冷冻干燥，一次性可得到除去双氧水或二甲亚砜的产品，最后通过柱层析纯化，用0.2％AcOH/MeOH和0.2％AcOH/H₂O洗脱，进行二次纯化，冷冻干燥得纯化产品；

IV.交换反应制备醋酸生长抑素

(1)将步骤III得到的生长抑素三氟醋酸盐溶于10％醋酸中；

(2)将此溶液加入到强碱性离子交换树脂柱上；

(3)用10％醋酸水溶液洗脱样品；收集洗脱液；用茚三酮显色反应进行跟踪；合并洗脱液浓缩、冷冻干燥得醋酸生长抑素白色固体。

2.根据权利要求1所述的一种生长抑素全合成方法，其特征在于其中所述的III氧化环合步骤采用双氧水或二甲基亚砜进行氧化的温度为0-40℃；氧化时间为5-120小时。

3.根据权利要求1所述的一种生长抑素全合成方法，其特征在于其中所述的III纯化分离步骤采用非高压液色谱方法，并且采用反相C₁₈键合硅胶装填层析柱；层析分离装载量为5-100mg/克C₁₈键合硅胶；采用水作为洗脱氧化剂流动相；采用水/醇/有机酸作层析流动相；采用水/甲醇梯度洗脱方法。