CN103275189A

CN103275189A - 一种用于肽树脂的裂解液及其在固相裂解合成生长抑素中的应用

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Publication number: CN103275189A
Application number: CN2013102224657A
Authority: CN
Inventors: 张文治; 刘建; 马亚平; 袁建成
Original assignee: Hybio Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Hybio Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2013-06-06
Filing date: 2013-06-06
Publication date: 2013-09-04
Anticipated expiration: 2033-06-06
Also published as: CN103275189B

Abstract

本发明属于药物合成技术领域，公开了一种用于肽树脂的裂解液，其由以下体积百分比的组分组成：三氟乙酸（TFA）85%～90%，1,2-乙二硫醇（EDT）0%～10%，水0%～10%，苯甲醚（PhOMe）0%～10%，其中组分EDT、水和PhOMe中至少两个不同时为0。此外，本发明还公开了一种制备生长抑素的方法以及上述裂解液在制备生长抑素中的应用，其中采用上述裂解液进行裂解反应。经过分析比对试验，采用本发明改进的裂解液对固相合成树脂进行裂解，有效提高了粗肽纯度和氧化肽的转化率，氧化反应收率提高接近10%。因此，本发明具有明显的经济效益，可以有效降低生产成本。

Description

一种用于肽树脂的裂解液及其在固相裂解合成生长抑素中的应用

技术领域

本发明涉及药物合成技术领域，具体涉及一种用于肽树脂的裂解液及其在固相裂解合成生长抑素中的应用。

背景技术

生长抑素，即生长激素释放抑制因子，英文名称为Somatostatin，分子式为C₇₆H₁₀₄N₁₈O₁₉S₂，分子量为1637.890。其为人体内存在的一种内源性调节激素，对多种生理功能具有广泛的抑制作用，氨基酸结构简式为:

Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-T rp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys(二硫键)。

生长抑素化学结构为分子内带有一对二硫键的十四肽，在人体中主要存在于中枢神经系统和周围器官（如:胃，肠，膜，皮肤等），最大浓度见以下丘脑，但以消化道含量最大。

生长抑素生物功能可抑制腺体释放生长激素、抑制促甲状腺和肾上腺皮质激素、抑制膜腺的内分泌与外分泌、抑制胃粘膜释放胃泌素、抑制肠粘膜释放肠促膜激素和肾脏释放肾素，降低门静脉压力、松驰胆道口扩约肌、剌激单核巨噬细胞系统而减轻内毒素血症，抑制血小板活化因子的释放，直接或间接调节细胞因子链产生细胞保护作用，并可增强抗癌药物的抗增殖作用。临床常应用于严重急性食管静脉曲张破裂出血，严重急性胃、十二指肠溃房出血，急性廉烂性胃炎或出血性胃炎，胰、胆和肠屡的辅助治疗，糖尿病因同症酸中毒的辅助治疗。其他一些作用和用途正随着其基础研究和临床的深入而不断被发现。因此生长抑素的应用前景广阔，市场需求量正逐年增加。

美国专利US4337194、3862925和3917578以及德国的L.Moroder等和加拿大的Hans U.Immer等分别于1973年至1981年报道了采用液相多肽合成法制备生长抑素的方法。在L.Moroder等和Hans U.Immer等报道的方法中，采用Z保护氨基酸进行缩肽反应，需多步骤进行H2/Pd反应，在实际操作中难度较大，且难以大批量制备。在US3862925中，采用氟化氢去保护基，工艺中试验条件和氟化氢的贮运等均难以实现。US3917578采用在14肽线肽合成后，需先形成二硫键环，然后去保护基的方法，使二硫键环形成位阻收率降低。因此这些报道均难以被选作大批量制备生长抑素的方法。

美国专利US4337194报道的合成路线较适合于工业化大批量生产，但该液相法存在反应步骤多，路线冗长、中间体不易纯化分离，实际操作中溶剂蒸除难度较大、试剂和所用氨基酸侧链保护基的来源和制备难度较大，使成本优势降低，难以适合于大批量生产等诸多缺点。

因此，最适合的制备生长抑素的方法是固相多肽合成法。固相多肽合成法具有成本低、操作方便、反应周期短、环境友好等诸多优点。现有的固相多肽合成专利主要集中在使用Wang Resin或2-氯树脂为起始原料，进行逐步固相偶联或片段，然后使用裂解试剂进行裂解，再进行氧化、纯化等。然而，在上述固相多肽合成方法中均采用经典裂解液配比来配制裂解液，从而完成对生长抑素的合成，如CN 1508152A、CN 1552728A和CN 1923851A等，很少有关于改进裂解液，进而有效提高氧化反应收率的报道。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的上述缺陷，提供了一种用于肽树脂的裂解液及其在固相裂解合成生长抑素中的应用，通过采用该裂解液，有效提高了氧化反应的收率。

为此，本发明一方面提供了一种用于肽树脂的裂解液，其由以下体积百分比的组分组成：三氟乙酸（TFA）85%～90%，1,2-乙二硫醇（EDT）0%～10%，水0%～10%，苯甲醚（PhOMe）0%～10%，其中组分EDT、水和PhOMe中至少两个不同时为0。

在不同的优选实施方案中，裂解液为三组分或四组分配比，各组分的体积比可以分别为TFA:EDT:H₂O=85:10:5、TFA:EDT:H₂O=85:5:10、TFA:EDT:H₂O=90:5:5、TFA:EDT:PhOMe=85:10:5、TFA:EDT:PhOMe=85:5:10、TFA:EDT:PhOMe=90:5:5、TFA:H₂O:PhOMe=85:10:5、TFA:H₂O:PhOMe=85:5:10、TFA:H₂O:PhOMe=90:5:5、TFA:EDT:H₂O:PhOMe=85:5:5:5、TFA:EDT:H₂O:PhOMe=90:4:3:3。

本发明的另一方面提供了一种制备生长抑素的方法，其包括如下步骤：

1）Fmoc-Cys(Try)-OH和载体树脂反应，获得Fmoc-Cys(Try)-树脂，

2）Fmoc-Cys(Try)-树脂采用逐一偶联的方式偶联Fmoc保护基团的其他氨基酸，获得生长抑素肽树脂，

3）生长抑素肽树脂经裂解反应，获得生长抑素线性粗肽，

4）生长抑素线性粗肽经氧化后，获得生长抑素粗肽，

5）生长抑素粗肽经纯化和冻干，获得生长抑素；

其中，步骤3）中的裂解反应采用上述裂解液中的任一种。

最后，本发明还提供了上述裂解液在制备生长抑素中的应用。

经过分析比对试验，本发明发现，采用本发明改进的裂解液对固相合成树脂进行裂解，所得线性粗肽进行氧化反应与采用经典的R试剂裂解所得线性粗肽进行氧化反应相比，有效提高了粗肽纯度和氧化肽的转化率，氧化反应收率提高接近10%。因此，本发明具有明显的经济效益，可以有效降低生产成本。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明，旨在用于说明本发明而非限定本发明。应当指出，对于本领域技术人员而言，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也同样落入本发明的保护范围之内。

本发明所使用的缩写的含义列于下表中。

英文缩写	中文含义
		Fmoc	9-芴甲氧羰基
Boc	叔丁氧羰基
		tBu	叔丁基
Trt	三苯甲基
		DMF	N,N-二甲基甲酰胺
DCM	二氯甲烷
		DIC	N,N-二异丙基碳二亚胺

DIPEA	N,N-二异丙基乙胺
		HOBT	1-羟基苯并三唑
TFE	三氟乙醇
		TFA	三氟乙酸
EDT	1,2-乙二硫醇

实施例1：肽树脂的合成

称取替代度为0.65mmol/g的2-CTC树脂15.38g（10.0mmol)，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取11.714gFmoc-Cys(Try)-OH(20.0mmol)用DMF溶解，冰水浴下加入6.6mL DIEA（40mmol)活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时，加入20mL无水甲醇封闭1小时，用DMF洗涤6次。用DBLK脱除Fmoc保护15分钟+15分钟，然后用DMF洗涤6次。

将7.668g Fmoc-Ser(tBu)-OH(20mmol)，2.702g HOBt(20mmol)，3.08ml DIC(20mmol)溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液60ml，加入固相反应柱中，室温反应2h（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h）。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照肽序，依次偶联Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ala-OH。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到肽树脂41.70g，树脂合成收率94.3%。

实施例2：肽树脂的裂解

将实施例1得到的肽树脂41.70g，加入到1000ml烧瓶中，配置400ml裂解液TFA:EDT:H₂O=85:10:5，V/V，将裂解液加入到烧瓶中，室温反应2.5小时，反应结束，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液，将滤液加入到4000ml无水乙醚中沉淀，离心，无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到生长抑素线性粗肽16.21g，线性粗肽收率98.8%。MS=1639.9。

实施例3：肽树脂的裂解

将实施例1得到的肽树脂41.70g，加入到1000ml烧瓶中，配置400ml裂解液TFA:EDT:H₂O=85:5:10，V/V，将裂解液加入到烧瓶中，室温反应2.5小时，反应结束，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液，将滤液加入到4000ml无水乙醚中沉淀，离心，无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到生长抑素线性粗肽16.11g，线性粗肽收率98.2%。MS=1639.9。

实施例4：肽树脂的裂解

将实施例1得到的肽树脂41.70g，加入到1000ml烧瓶中，配置400ml裂解液TFA:EDT:H₂O=90:5:5，V/V，将裂解液加入到烧瓶中，室温反应2.5小时，反应结束，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液，将滤液加入到4000ml无水乙醚中沉淀，离心，无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到生长抑素线性粗肽16.0g，线性粗肽收率97.6%。MS=1639.9。

实施例5：肽树脂的裂解

将实施例1得到的肽树脂41.70g，加入到1000ml烧瓶中，配置400ml裂解液TFA:EDT:苯甲醚=85:10:5，V/V，将裂解液加入到烧瓶中，室温反应2.5小时，反应结束，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液，将滤液加入到4000ml无水乙醚中沉淀，离心，无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到生长抑素线性粗肽15.81g，线性粗肽收率96.3%。MS=1639.9。

实施例6：肽树脂的裂解

将实施例1得到的肽树脂41.70g，加入到1000ml烧瓶中，配置400ml裂解液TFA:EDT:苯甲醚=85:5:10，V/V，将裂解液加入到烧瓶中，室温反应2.5小时，反应结束，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液，将滤液加入到4000ml无水乙醚中沉淀，离心，无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到生长抑素线性粗肽15.92g，线性粗肽收率97.1%。MS=1639.9。

实施例7：肽树脂的裂解

将实施例1得到的肽树脂41.70g，加入到1000ml烧瓶中，配置400ml裂解液TFA:EDT:苯甲醚=90:5:5，V/V，将裂解液加入到烧瓶中，室温反应2.5小时，反应结束，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液，将滤液加入到4000ml无水乙醚中沉淀，离心，无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到生长抑素线性粗肽16.33g，线性粗肽收率99.6%。MS=1639.9。

实施例8：肽树脂的裂解

将实施例1得到的肽树脂41.70g，加入到1000ml烧瓶中，配置400ml裂解液TFA:H₂O:苯甲醚=85:10:5，V/V，将裂解液加入到烧瓶中，室温反应2.5小时，反应结束，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液，将滤液加入到4000ml无水乙醚中沉淀，离心，无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到生长抑素线性粗肽16.24g，线性粗肽收率99.0%。MS=1639.9。

实施例9：肽树脂的裂解

将实施例1得到的肽树脂41.70g，加入到1000ml烧瓶中，配置400ml裂解液TFA:H₂O:苯甲醚=85:5:10，V/V，将裂解液加入到烧瓶中，室温反应2.5小时，反应结束，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液，将滤液加入到4000ml无水乙醚中沉淀，离心，无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到生长抑素线性粗肽15.93g，线性粗肽收率97.1%。MS=1639.9。

实施例10：肽树脂的裂解

将实施例1得到的肽树脂41.70g，加入到1000ml烧瓶中，配置400ml裂解液TFA:H₂O:苯甲醚=90:5:5，V/V，将裂解液加入到烧瓶中，室温反应2.5小时，反应结束，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液，将滤液加入到4000ml无水乙醚中沉淀，离心，无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到生长抑素线性粗肽15.77g，线性粗肽收率96.1%。MS=1639.9。

实施例11：肽树脂的裂解

将实施例1得到的肽树脂41.70g，加入到1000ml烧瓶中，配置400ml裂解液TFA:EDT:H₂O:苯甲醚=85:5:5:5，V/V，将裂解液加入到烧瓶中，室温反应2.5小时，反应结束，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液，将滤液加入到4000ml无水乙醚中沉淀，离心，无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到生长抑素线性粗肽16.13g，线性粗肽收率98.3%。MS=1639.9。

实施例12：肽树脂的裂解

将实施例1得到的肽树脂41.70g，加入到1000ml烧瓶中，配置400ml裂解液TFA:EDT:H₂O:苯甲醚=90:4:3:3，V/V，将裂解液加入到烧瓶中，室温反应2.5小时，反应结束，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液，将滤液加入到4000ml无水乙醚中沉淀，离心，无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到生长抑素线性粗肽16.25g，线性粗肽收率99.1%。MS=1639.9。

实施例13：肽树脂的裂解

将实施例1得到的肽树脂41.70g，加入到1000ml烧瓶中，配置400ml R试剂裂解液TFA:EDT:苯甲硫醚:苯甲醚=90:2:5:3，V/V，将裂解液加入到烧瓶中，室温反应2.5小时，反应结束，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液，将滤液加入到4000ml无水乙醚中沉淀，离心，无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到生长抑素线性粗肽16.32g，线性粗肽收率99.5%。MS=1639.9。

实施例14：线性粗肽氧化

分别取实施例2～12所得的全部线性粗肽进行液相氧化，其操作为按1g粗肽溶于1ml的比例把线性粗肽用纯净水溶解完全，室温搅拌，用稀氨水调溶液pH至6.5～7.0，通氧气进行氧化反应，氧化2天反应结束。HPLC检测，粗肽纯度70～75%，其含量为0.45g/L～0.50g/L。

取实施例13所得的全部线性粗肽进行液相氧化，其操作为按1g粗肽溶于1ml的比例把线性粗肽用纯净水溶解完全，室温搅拌，用稀氨水调溶液pH至6.5～7.0，通氧气进行氧化反应，氧化2天反应结束。HPLC检测，粗肽纯度65.2%，其含量为0.38g/L。

实施例15：纯化

取实施例14所得粗肽进行HPLC纯化，得合格精肽。

Claims

1.一种用于肽树脂的裂解液，其由以下体积百分比的组分组成：三氟乙酸（TFA）85%～90%，1,2-乙二硫醇（EDT）0%～10%，水0%～10%，苯甲醚（PhOMe）0%～10%，其特征在于，组分EDT、水和PhOMe中至少两个不同时为0。

2.根据权利要求1所述的裂解液，其中各组分的体积比为TFA:EDT:H₂O=85:10:5。

3.根据权利要求1所述的裂解液，其中各组分的体积比为TFA:EDT:H₂O=85:5:10。

4.根据权利要求1所述的裂解液，其中各组分的体积比为TFA:EDT:H₂O=90:5:5。

5.根据权利要求1所述的裂解液，其中各组分的体积比为TFA:EDT:PhOMe=85:10:5。

6.根据权利要求1所述的裂解液，其中各组分的体积比为TFA:EDT:PhOMe=85:5:10。

7.根据权利要求1所述的裂解液，其中各组分的体积比为TFA:EDT:PhOMe=90:5:5。

8.根据权利要求1所述的裂解液，其中各组分的体积比为TFA:H₂O:PhOMe=85:10:5。

9.根据权利要求1所述的裂解液，其中各组分的体积比为TFA:H₂O:PhOMe=85:5:10。

10.根据权利要求1所述的裂解液，其中各组分的体积比为TFA:H₂O:PhOMe=90:5:5。

11.根据权利要求1所述的裂解液，其中各组分的体积比为TFA:EDT:H₂O:PhOMe=85:5:5:5。

12.根据权利要求1所述的裂解液，其中各组分的体积比为TFA:EDT:H₂O:PhOMe=90:4:3:3。

13.一种制备生长抑素的方法，包括如下步骤：

1）Fmoc-Cys(Try)-OH和载体树脂反应，获得Fmoc-Cys(Try)-树脂，

3）生长抑素肽树脂经裂解反应，获得生长抑素线性粗肽，

4）生长抑素线性粗肽经氧化后，获得生长抑素粗肽，

5）生长抑素粗肽经纯化和冻干，获得生长抑素；

其特征在于，步骤3）中的裂解反应采用权利要求1-12任一项所述的裂解液。

14.权利要求1-12任一项所述的裂解液在制备生长抑素中的应用。