CN1811447A - 核酸薄膜层析快速检测方法及其试纸条及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种特异性核酸序列扩增物的单探针检测方法，还公开了一种特异性核酸序列扩增物的双探针检测方法，还公开了用于核酸扩增物检测的试纸条，以及试纸条的用途。本发明的方法使用通用的抗体A和抗体B，因而用本发明方法制作的标准试纸条可用于检测任何来源的核酸序列扩增物，其特异性由扩增引物和探针共同保证。

Description

核酸薄膜层析快速检测方法及其试纸条及其用途

技术领域

本发明涉及特异性核酸序列扩增物的检测方法，更具体地说，涉及利用核酸薄膜层析快速检测靶核酸序列扩增物的方法，本发明还涉及了用于快速检测靶核酸序列扩增物的试纸条及其在检测传染病病原体中的用途。

背景技术

以免疫反应为基础的酶联(ELISA)试剂/胶体金(试纸条)技术，已发展得相当成熟，并已有相当规模的市场。此类产品以其操作简单、价格低廉、检测速度可靠和快捷等特点，已经进入了各医院的检验科甚至普通人的家庭，给人们诊断疾病带来了许多方便之处，参见例如周友泉，“免疫胶体金的制备及其在医学检验中的应用”， 检验医学信息网(网址： http：//www.clinet. com.cn/edu/resource/article/2001093010.htm)，以及CN2358455(申请号：99203566，发明名称：“乙型肝炎表面抗原(HBsAg)胶体金免疫层析试纸”，申请人：中国人民解放军第二五三医院)。

现有的金标检测试纸条大都是采用双夹心法免疫测定原理来检测某种抗原或抗体。在检测时，由于层析作用反应复合物沿硝酸纤维膜向前移动，形成抗原-抗体-金标颗粒复合物而富集在包被线上，形成红色沉淀线。同时在包被膜上还有一条质控线对照，故当有两条红线时判为阳性，只有一条红线时，判为阴性。但以免疫反应为基础的检测试剂也有不足之处，真正阻碍这种蛋白质薄膜层析诊断技术发展的不是技术与设备，而是特异性单克隆抗体的制备。单克隆抗体的制备复杂费时，使得蛋白质层析诊断的产品研制周期长，不能很快形成系列产品，难以形成有效的覆盖面。而且检验的灵敏度和特异性有时还不够理想。

PCR技术经过近二十年的发展，已成为实验室的常规技术。它是现代分子生物学研究中不可缺少的手段，是一种极为敏感的放大系统。相比于传统的临床诊断方法，核酸诊断是分子水平上的诊断技术，可以弥补传统临床诊断方法的某些缺陷，比如，核酸诊断能直接揭示病原体的存在，能客观反映病原体在人体内感染及活动情况，可以作为临床治疗中的一个有效监控手段。另外采用核酸诊断技术还可以检测到常规检测方法难以检测到的病原体，例如可以克服酶免检测技术中从感染到抗体产生的窗口期问题。因此，以PCR技术为代表的核酸诊断技术在临床诊断中得到日益广泛的应用。但PCR技术在临床诊断上也有局限性和缺点，如

1、PCR产物极易造成的实验室污染而出现假阳性；

2、核酸扩增后结果检测(琼脂糖凝胶电泳或ELISA)操作复杂，需要专业的实验室和仪器设备，而且对操作人员专业技术要求较高；

3、琼脂糖凝胶电泳只能判断扩增物的大小，其特异性也不高；

4、操作时间长，扩增后检测时间琼脂糖凝胶电泳需要1-2小时左右，而ELISA检测则需要2-3小时。

由于以上原因，使PCR技术在临床诊断中的应用也受到限制。

另外，近年来发展起来的荧光定量PCR技术，又从定性检测迈上了可以量化的台阶，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。所谓的实时荧光定量PCR就是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。其基本原理是在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断积累，荧光信号强度也等比例增加。但此种检测方法需要价格昂贵的设备和试剂，并不适合推广于基层医院，特别是农村医院。

与PCR不同的是近年来陆续出现的恒温扩增技术。这些扩增技术应用不同的原理和方法，可在某一特定温度条件下(如37℃)，实现核酸(DNA或RNA)的扩增。国际上已有的恒温扩增技术如下：

链置换扩增术(Strand Displacement Amplification，SDA)

核酸序列扩增术(Nucleic Acid Sequence Based Amplification，NASBA)

转录酶扩增术(Transcription Mediated Amplification，TMA)

滚环扩增技术(Rolling Circle Amplification，RCA)

圆环恒温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)

解链酶扩增技术(Helicase Dependant Amplification，HAD)

此外，一些非特异性的全基因组DNA扩增方法目前已经进入商品化阶段。这些核酸扩增术的对象有些是DNA，还有些是RNA。核酸恒温扩增术的特点是扩增反应的全过程(除初始的杂交步骤外)均在同一温度下进行，而不象PCR反应那样，需要经历几十个温度变化的循环过程。恒温扩增技术的这一特点，使得它们对所需仪器的要求大大简化，反应时间大大缩短，因而具有巨大的实际应用价值。

无论是PCR或恒温扩增技术，其扩增产物均为核酸(DNA或RNA)。这些核酸产物均需以一定的技术手段予以检测。如实时荧光定量PCR是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的激光扫描从而实时检测核酸产物量。琼脂糖凝胶电泳是通过对核酸产物分离后染色，从而直观地看到扩增产物。但该方法只能判断扩增物的大小，其特异性不高。

以免疫反应为基础的胶体金(试纸条)技术检测的主要对象是蛋白质抗原。该技术以其直观，快速，方便，成熟，廉价等优点而十分受欢迎。有人也曾把胶体金(试纸条)技术用于检测双链DNA，参见例如CN1580776(申请人：王继华，申请号：200410027291.X，发明名称：“胶体金层析法检测双链DNA抗体的试纸条及其制备方法”)。但该发明是把双链DNA整体作为抗原检测，不能区别不同的DNA序列，因而是非特异性的，不能用于特异性检测，如传染病的诊断。

以免疫反应为基础的胶体金(试纸条)检测技术是一种目前十分成熟的蛋白质快速检测技术，利用抗原和抗体的特异性结合的特点，形成抗原-抗体-有色颗粒复合物而富集在包被线上，形成有色沉淀线。

以双抗体夹心法为例，其基本原理是：

1、将特异性抗体(常为单克隆抗体)吸附于有色颗粒(如胶体金颗粒，乳胶颗粒等)，在颗粒表面形成抗体包被。

2、将另一特异性抗体(常为针对同一抗原的单克隆抗体，无色)以线条状固定于膜上(常为硝酸纤维膜或尼龙膜)，形成检测线。

3、检测时，当存在病原体特异性抗原时，待检病原体的特异性抗原首先与颗粒表面的抗体结合，形成抗原-抗体复合物。

4、有色的抗原-抗体复合物在溶液中通过毛细现象沿纤维膜向上流动。当抗原-抗体复合物遇到固定于膜上的另一特异性抗体线条时，待检病原体的特异性抗原与线条上的抗体结合，形成抗体-抗原-抗体复合物(双抗体夹心)。有色的抗体-抗原-抗体复合物滞留在线上，形成肉眼可见的有色线条，此为阳性。

5、当不存在病原体特异性抗原时，不能形成抗体-抗原-抗体复合物。有色颗粒将不能与膜上的检测线结合而越过此线，不能形成肉眼可见的有色线条，此为阴性。

如上所述，以免疫反应为基础的胶体金(试纸条)检测技术是一种目前已十分成熟的蛋白质快速检测技术，广泛地应用于免疫诊断，科学研究，防疫检测，法医鉴定等领域。

发明内容

如果能将蛋白质快速检测技术的原理用于核酸诊断，将能把核酸诊断的高度敏感性和特异性与蛋白质检测技术的成熟性和快速性相结合，创造出一种新型的快速核酸诊断试剂。本发明人经过长期研究，发现用抗原或半抗原小分子标记单链寡核苷酸探针，使标记的特异性探针与待检的特异性靶核酸扩增物杂交，从而形成具备免疫原性的分子复合物，该复合物即可用与蛋白质试纸条检测相类似的方法被检测，从而完成本发明。

因此，一方面，本发明提供一种特异性核酸序列扩增物的单探针检测方法，其包括：

1)将一种特异性抗体，抗A抗体吸附于有色颗粒，在颗粒表面形成抗体包被；

2)将另一种特异性抗体，无色的抗B抗体以线条状固定于膜上形成检测线；

3)当存在待检的特异性核酸时，发生核酸扩增，其中的一条引物用抗原或半抗原A(以下简称抗原A)标记，形成一条链带有抗原A的核酸扩增物；

4)将步骤3)得到的带有抗原A的核酸扩增物链与一条用抗原或半抗原B(以下简称抗原B)标记的探针杂交，形成扩增物抗原A-探针抗原B杂交物；

5)将步骤4)得到的扩增物抗原A-探针抗原B杂交物与颗粒表面抗体包被的抗体A结合，形成扩增物抗原A-颗粒抗体A-探针抗原B有色颗粒复合物；

6)步骤5)得到的有色颗粒复合物在溶液中通过毛细现象沿纤维膜向上流动至抗体B检测线，与线条上的抗体B结合，形成有色的扩增物抗原A-颗粒抗体A-探针抗原B-线条抗体B颗粒复合物，从而滞留在检测线上，形成肉眼可见的有色线条，此为阳性；或者

7)当特异性核酸不存在时，不发生上述步骤3)-6)，有色颗粒将不能与膜上的检测线结合而越过此线，不能形成肉眼可见的有色线条，此为阴性。

另一方面，本发明还提供了一种特异性核酸序列扩增物的双探针检测方法，其包括：

1)将一种特异性抗体，抗A抗体吸附于有色颗粒，在颗粒表面形成抗体包被；

2)将另一种特异性抗体，无色抗B抗体以线条状固定于膜上形成检测线；

3)当存在待检的特异性核酸时，发生核酸扩增，未经标记的核酸扩增物与探针A和探针B杂交，其中探针A有A抗原标记，探针B有B抗原标记，从而形成扩增物-探针抗原A-探针抗原B杂交物；

4)将步骤3)形成的扩增物-抗原A-抗原B杂交物与颗粒表面抗体包被中的抗体A结合，形成扩增物-探针抗原A-颗粒抗体A-探针抗原B有色颗粒复合物；

5)步骤4)得到的有色颗粒复合物在溶液中通过毛细现象沿纤维膜向上流动至抗体B检测线条，与线条上的抗体B结合，形成扩增物-探针抗原A-颗粒抗体A-探针抗原B-线条抗体B有色颗粒复合物，从而滞留在检测线上，形成肉眼可见的有色线条，此为阳性；或者

6)当待检的特异性核酸不存在时，不发生上述步骤3)-5)，不能形成扩增物-探针抗原A-探针抗原B复合物，也不能形成扩增物-探针抗原A-颗粒抗体A-探针抗原B-线条抗体B有色颗粒复合物，有色颗粒将不能与膜上的检测线结合而越过此线，不能形成肉眼可见的有色线条，此为阴性。

另一方面，本发明还提供了用于核酸序列扩增物的通用标准试纸条。

另一方面，本发明还提供了上述检测方法和试纸条在检测传染病病原体中的用途。

附图的简要说明

附图1是关于本发明的单探针检测方法的基本原理示意图；

附图2是关于本发明的双探针检测方法的基本原理示意图；

附图3显示本发明的核酸序列扩增物检测的试纸条的基本结构；

附图4是核酸检测试纸条的检测结果示意图；

附图5是显示核酸扩增后试纸条与凝胶电泳检测法的敏感度比较结果；

附图6是显示用实施例3的方法，采用单探针检测淋球菌PCR-试纸条的检测结果；和

附图7是显示用实施例4的方法，采用双探针检测淋球菌PCR-试纸条的检测结果

发明内容详述

在一方面，本发明提供了特异性核酸序列扩增物的检测方法，其包括：

1)将一种特异性抗体，抗A抗体吸附于有色颗粒，如胶体金颗粒、乳胶颗粒等，在颗粒表面形成抗体包被；

2)将另一种特异性抗体，无色的抗B抗体以线条状固定于膜上形成检测线，所述膜通常为硝酸纤维膜或尼龙膜；

3)当存在待检的特异性核酸时，发生核酸扩增，其中的一条引物用抗原A标记，形成一条链带有抗原A的核酸扩增物；

4)将步骤3)得到的带有抗原A的核酸扩增物链与一条用抗原B标记的探针杂交，形成扩增物抗原A-探针抗原B杂交物；

5)将步骤4)得到的扩增物抗原A-探针抗原B杂交物首先与颗粒表面抗体包被的抗体A结合，形成扩增物抗原A-颗粒抗体A-探针抗原B有色颗粒复合物；

6)步骤5)得到的有色颗粒复合物在溶液中通过毛细现象沿纤维膜向上流动至抗体B检测线时，与线条上的抗体B结合，形成有色的扩增物抗原A-颗粒抗体A-探针抗原B-线条抗体B颗粒复合物(双抗体双抗原夹心)，从而滞留在线上，形成肉眼可见的有色线条，此为阳性；或者

7)当特异性扩增物不存在时，不发生上述步骤3)-6)，有色颗粒将不能与膜上的检测线结合而越过此线，不能形成肉眼可见的有色线条，此为阴性。

更具体地，本发明提供了一种特异性核酸序列扩增物的通用标准试纸条单探针检测方法，其包括：

1)设计两条特异性扩增引物，其中一条引物B用抗原或半抗原B标记(以下简称抗原B)；在适宜的扩增条件下，当有被检核酸存在时，特异性核酸片段被扩增并被抗原B标记；当被检核酸不存在时，无特异性核酸片段扩增物；

2)设计一条特异性探针A，探针序列与扩增物片段序列碱基互补，因此可以特异性杂交，形成扩增物-探针杂交复合物；

3)将探针A用抗原或半抗原A标记(以下简称抗原A)；

4)将一种标准的通用抗体，抗A抗体吸附于有色颗粒，在颗粒表面形成抗体包被；

5)将另一种标准的通用抗体，无色的抗B抗体以线条状固定于膜上形成检测线；

6)当存在待检的特异性扩增物时，核酸扩增物与探针A杂交，其中探针A有A抗原标记，引物B有B抗原标记，从而形成扩增物-探针抗原A-引物抗原B杂交物；

7)将步骤6)形成的扩增物-探针抗原A-引物抗原B杂交物与颗粒表面抗体包被中的抗体A结合，形成扩增物-探针抗原A-颗粒抗体A-引物抗原B有色颗粒复合物；

8)步骤7)得到的有色颗粒复合物在溶液中通过毛细现象沿纤维膜向上流动至抗体B检测线条，与线条上的抗体B结合，形成扩增物-探针抗原A-颗粒抗体A-引物抗原B-线条抗体B有色颗粒复合物，从而滞留在检测线上，形成肉眼可见的有色线条，此为阳性；或者

9)当特异性扩增物不存在时，不发生上述步骤6)-8)，不能形成扩增物-探针抗原A-探针抗原B复合物，也不能形成扩增物-探针抗原A-颗粒抗体A-引物抗原B-线条抗体B有色颗粒复合物，有色颗粒将不能与膜上的检测线结合而越过此线，不能形成肉眼可见的有色线条，此为阴性。

上述方法的基本原理如附图1中所示。

另一方面，本发明还提供了一种特异性核酸序列扩增物的检测方法，其包括：

1)将一种特异性抗体，抗A抗体吸附于有色颗粒，在颗粒表面形成抗体包被；

2)将另一种特异性抗体，无色抗B抗体以线条状固定于膜上形成检测线；

3)当存在待检的特异性核酸时，发生核酸扩增，未经标记的核酸扩增物与探针A和探针B杂交，其中探针A有A抗原标记，探针B有B抗原标记，从而形成扩增物-探针抗原A-探针抗原B杂交物；

4)将步骤3)形成的扩增物-抗原A-抗原B杂交物与颗粒表面抗体包被中的抗体A结合，形成扩增物-探针抗原A-颗粒抗体A-探针抗原B有色颗粒复合物；

5)步骤4)得到的有色颗粒复合物在溶液中通过毛细现象沿纤维膜向上流动至抗体B检测线条，与线条上的抗体B结合，形成扩增物-探针抗原A-颗粒抗体A-探针抗原B-线条抗体B有色颗粒复合物，从而滞留在检测线上，形成肉眼可见的有色线条，此为阳性；或者

6)当待检的特异性核酸不存在时，不发生上述步骤3)-5)，不能形成扩增物-探针抗原A-探针抗原B复合物，也不能形成扩增物-探针抗原A-颗粒抗体A-探针抗原B-线条抗体B有色颗粒复合物，有色颗粒将不能与膜上的检测线结合而越过此线，不能形成肉眼可见的有色线条，此为阴性。

更具体地，本发明提供了一种特异性核酸序列扩增物的通用标准试纸条双探针检测方法，其包括：

1)设计两条特异性扩增引物；在适宜的扩增条件下，当有被检核酸存在时，特异性核酸片段被扩增；当被检核酸不存在时，无特异性核酸片段扩增物；

2)设计两条特异性探针A和B。探针序列与扩增物片段序列碱基互补，因此可以特异性杂交，形成扩增物-探针杂交复合物；

3)将探针A用抗原A标记；

4)将探针B用抗原B标记；

5)将一种标准的通用抗体，抗A抗体吸附于有色颗粒，在颗粒表面形成抗体包被；

6)将另一种标准的通用抗体，无色的抗B抗体以线条状固定于膜上形成检测线；

7)当存在待检的特异性扩增物时，核酸扩增物与探针A和探针B杂交，其中探针A有A抗原标记，探针B有B抗原标记，从而形成扩增物-探针抗原A-探针抗原B杂交物；

8)将步骤7)形成的扩增物-抗原A-抗原B杂交物与颗粒表面抗体包被中的抗体A结合，形成扩增物-探针抗原A-颗粒抗体A-探针抗原B有色颗粒复合物；

9)步骤8)得到的有色颗粒复合物在溶液中通过毛细现象沿纤维膜向上流动至抗体B检测线条，与线条上的抗体B结合，形成扩增物-探针抗原A-颗粒抗体A-探针抗原B-线条抗体B有色颗粒复合物，从而滞留在检测线上，形成肉眼可见的有色线条，此为阳性；或者

10)当特异性扩增物不存在时，不发生上述步骤7)-9)，不能形成扩增物-探针抗原A-探针抗原B复合物，也不能形成扩增物-探针抗原A-颗粒抗体A-探针抗原B-线条抗体B有色颗粒复合物，有色颗粒将不能与膜上的检测线结合而越过此线，不能形成肉眼可见的有色线条，此为阴性。

上述双探针法核酸纸条检测的基本原理如附图2所示。

在本发明的检测方法中，所使用的抗原A和抗原B可以是标准的通用抗原或半抗原。尤其适用于本发明方法的用于标记探针A和探针B的抗原或半抗原选自：生物素、地高辛或荧光染料，如Cy3、Cy5、Tetramethylrhodamine、AlexaFluor、Rhodamine、Fam、FitC，等。优选的抗原或半抗原为生物素、地高辛或FitC。探针A和探针B应选用不同的抗原或半抗原标记。

在本发明的检测方法中，所使用的标准的通用抗体，抗A抗体可选自：亲和素、抗地高辛抗体或抗荧光染料抗体，如抗Cy3抗体、抗Cy5抗体、抗Tetramethylrhodamine抗体、抗AlexaFluor抗体、抗Rhodamine抗体、抗Fam抗体、抗FitC抗体等。其中优选的抗体为生物素、抗地高辛抗体或抗FitC抗体。用于吸附抗A抗体的有色颗粒可以是，如胶体金颗粒、乳胶颗粒等。在本发明的检测方法中，所使用的另一种标准的通用抗体，无色的抗B抗体可选自上述标准的通用抗体，但应选用与抗A抗体不同的抗体。所述膜通常为硝酸纤维素膜或尼龙膜。

本发明说明书中所使用的技术术语解释：

引物：DNA合成的起始物。一般为一对单链寡核苷酸，在与模板杂交后，DNA合成从其3’末端开始。

探针：探测靶核酸(DNA或RNA)的单链寡核苷酸。通常有可检测的信号分子标记，如半抗原，荧光等。

标记：将可检测的信号分子(如半抗原，荧光，放射性等)与单链寡核苷酸相偶连的方法。

杂交：特指互补的DNA单链通过碱基配对形成双链结构。

核酸：脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的通称。

抗原和半抗原：具备免疫原性的物质。通常为大分子蛋白质或细胞组分。但有些小分子也具备免疫原性，被称为半抗原(Hapten)。半抗原常被用于标记探针。

抗体：能与抗原或半抗原特异性结合的蛋白质分子。

复合体：由两种或两种以上分子特异性结成的结合物。

免疫试纸条：用于快速检测的医学工具。又称为呈色薄膜层析。

核酸聚合酶：合成核酸长链的酶类。分为DNA聚合酶和RNA聚合酶两大类。

另一方面，本发明提供了用于核酸扩增物检测的试纸条，其包括在带有不干胶的衬垫按顺序有样品垫1、有色颗粒结合物垫2、纤维膜3和吸水滤纸垫4，上述各部分在相邻处部分重叠，纤维膜上还设有检测线5和质控线6，其中有色颗粒结合物垫2上的有色颗粒有抗A抗体包被，检测线5上有抗B抗体包被，质控线6上有抗A抗体。有色颗粒是胶体金颗粒或乳胶颗粒，纤维膜通常为硝酸纤维素膜或尼龙膜。

核酸扩增物检测试纸条的基本结构如附图3所示。

本发明将以免疫反应为基础的蛋白质试纸条检测技术改造成核酸诊断试剂，其要点在于将待检的靶核酸扩增物转变为具备免疫原性的分子或分子复合物。如此，以免疫反应为基础的蛋白质试纸条检测技术基本方法均可应用与核酸试纸条检测。

将待检的靶核酸扩增物转变为具备免疫原性的分子或分子复合物的基本方法是用抗原或半抗原(以下简称抗原)标记探针，使标记的特异性探针与待检的靶核酸扩增物杂交，从而形成具备免疫原性的分子复合物，该复合物即可用与蛋白质试纸条检测相类似的方法被检测。

与现有技术中检测双链DNA抗体的方法不同，本发明使用了抗原或半抗原标记物，单链寡核苷酸探针，并以分子杂交的方式检测特异性靶基因单链DNA。与免疫胶体金(试纸条)技术相比，本发明的不同之处不仅在于标记物，探针和杂交，而且还在于检测对象的不同：由检测蛋白质变为检测核酸。

由于本发明是以特异性的探针检测特异性的靶核酸扩增物，能够保证检测的高度特异性，从而保证了检测结果的准确性。本发明的新颖之处在于既有免疫胶体金(试纸条)技术的直观，快速，方便，成熟，廉价等优点，又有PCR或恒温扩增技术的高度灵敏性，还有本发明所提供的高度特异性。因此，本发明的方法是一种理想的特异性检测手段。

此外，在免疫反应为基础的胶体金蛋白质试纸条检测技术中，所使用的抗体都必须是特异性的，如梅毒特异性抗螺旋体抗体(TP-Ab)，抗乙型肝炎表面抗原(HBsAg)抗体等。因此，一种试纸条只能检测一种病原体。而本发明提供了使用通用的抗体A和抗体B的方法。用本发明方法制作的标准试纸条可用于检测任何病原体的核酸序列扩增物。其特异性由扩增引物和探针共同保证，而不是由试纸条决定。

作为一个核酸扩增物检测的通用技术平台，本发明的方法及其试纸条可以广泛用于传染病病原体临床检测，突发性公共卫生事件的战略性技术储备，农牧业和食品工业，海关检验检疫，环境检测，生物武器检测，人类遗传病检测，婚前、产前检查及优生优育和法医鉴定和血缘鉴定等领域。

常见的病原体包括细菌、真菌、病毒、支原体、衣原体、寄生虫等。这些都可以是本发明的核酸扩增物检测试纸检测的对象。由这些病原体引起的疾病多达数百种，这可以是本发明的核酸扩增物检测试纸及相关的试剂盒应用的范围，例如呼吸系统的流感和禽流感，SARS、肺结核等，性病系列的淋病、艾滋病，梅毒，支原体性病，衣原体性病，单疱病毒，HPV等。

核酸诊断试剂不仅可以鉴别这些病原体，而且可以鉴别它们的亚型、有毒菌株、突变株和抗药性等。

另一方面，本发明的核酸扩增物检测方法和试纸条可作为突发性公卫事件的战略性技术储备。国家已投入巨资建立全国性的传染病预防和控制系统，诊断烈性传染病的快速诊断试剂将作为这些中心的常规储备，以便在突发性公卫事件发生时可迅速鉴别病原体，有效控制。这方面的检测对象包括例如：禽流感、SARS、霍乱、鼠疫、炭疽病、伊波拉、流行性出血热等。

另一方面，本发明的核酸扩增物检测方法和试纸条可用于食品工业，食物中毒常有发生，因此对牛奶、饮料、肉类制品等的出厂前检验很有必要。如霉菌，大肠杆菌，沙门氏菌，肉毒杆菌等。

另一方面，本发明的核酸扩增物检测方法和试纸条可用于农业，对主要农作物的有害微生物的鉴别诊断，将产生巨大的经济和社会效益。

另一方面，本发明的核酸扩增物检测方法和试纸条可用于牧业，在牲畜、鱼类和家禽的疾病诊断方面有广阔的市场。

另一方面，本发明的核酸扩增物检测方法和试纸条可用于海关进出口检疫。这也是一个稳定而可靠的市场。例如外贸进口，为防止境外有害微生物、病虫卵、转基因产品传入我国。需要有一套完整、灵敏、可靠的快速诊断系统。例如外贸出口，向进口国提供一套完整的检疫资料，将大大地促进我国农牧业、林业、食品工业等产品的外贸出口，减少贸易纠纷。

另一方面，本发明的核酸扩增物检测方法和试纸条可用于对土壤、水源、空气等环境有害微生物的检测及鉴别。一套简便、灵敏、快速的现场检验方法对环境检测具有重要意义。

另一方面，本发明的核酸扩增物检测方法和试纸条可用于检测生物武器。各国都在发展检测生物武器的技术，我国也应及早准备。常见的生物武器病原体有：霍乱、鼠疫、炭疽病、伊波拉、流行性出血热以及人工改造过的细菌和病毒等。

另一方面，本发明的核酸扩增物检测方法和试纸条可用于检测基因突变。现代分子遗传学已经证明人类的绝大多数疾病在不同程度上都与基因有关。根据单核苷酸多态性(SNP)的研究，每个人的基因组型都不一样。因此对各种疾病的易感性和对药物的敏感性也不一样。由此提出了“个性化医学”。如重要疾病易感性预测。根据每个人的基因型决定他对药物的敏感性和耐受性，精确给药等。常见的基因突变引起的疾病有上百种，包括基因缺失，基因易位等基因突变。本发明的核酸扩增物检测方法和试纸条可用于开发人类遗传病系列诊断产品，以满足这个巨大的市场需求。

另一方面，本发明的核酸扩增物检测方法和试纸条可用于婚前检查，产前检查，优生优育等。

另一方面，本发明的核酸扩增物检测方法和试纸条可用于犯罪现场血液、精液、毛发及其它样品的DNA鉴定，以及犯罪嫌疑人DNA的鉴定。

另一方面，本发明的核酸扩增物检测方法和试纸条可用于血缘鉴定，基因身份证，人群基因数据库等方面。

核酸试纸条检测方法的发明将大大简化核酸扩增后的检测程序。结果判读简单明了、直观(检测示意结果如附图4)。

本专利所申请的核酸试纸条快速检测技术作为一种新型的核酸扩增后检测技术，具有以下优点：

·操作简单：只需要把核酸扩增后的样品直接滴到核酸试剂检测版上即可，不需要专业人员操作，不仅可用于大医院，也可适用于农村，边远地区和基层医院；

·快速：检测5分钟后判读结果；

·灵敏：与琼脂糖凝胶电泳相比，检测灵敏度提高近100-200倍；

·特异性高：由于在检测过程中加入了1-2特异性探针，使结果更加准确；

·价格便宜：费用大大低于传统的凝胶电泳和ELISA检测。

如下实施例举例说明本发明的检测方法及其检测效果。实施例仅用来举例，并不构成对本发明保护范围的任何限制，本发明的保护范围在所附的权利要求书说明。

实施例

实施例1

核酸检测试纸条材料的处理和制备

1)聚酯膜(连接垫)处理：

a)聚酯膜处理液配制：

Tris-HCl(PH9.0)                            100毫摩

吐温-20                                    0.5％

PVP                                        100毫克

纯化水                                     至10毫升

混匀待用；

b)将聚酯膜平铺在不锈钢盆中，倒入处理液，以淹没所有聚酯膜为止；

c)在洁净环境中浸泡过夜；

d)取出聚酯膜，放入37℃烘箱过夜；

e)取出后干燥密封保存。

2)玻纤(样品垫)处理

a)玻纤处理液配制：

Tris-HCl(pH9.0)        0.4摩尔

Na₂CO₃              0.2摩尔

吐温-20                1％，

PVP                    100毫克

纯化水                 至10毫升

搅拌过夜；

b)将玻纤切成相应宽度，平铺在不锈钢网架上，用枪或针筒均匀喷上相对应的溶液量；

c)玻纤连同网架一同放入37℃烘箱过夜；

d)取出后干燥密封保存。

3)喷膜：

a)喷膜机：

b)测试线：抗体：亲和素(1.3毫克/毫升)，喷膜量：2微升/厘米；

c)质量控制线：抗地高辛抗体(1.3毫克/毫升)，喷膜量：2微升/厘米。

d)喷膜后在45℃烘箱中干燥4-5个小时；放在干燥环境中备用。

4)乳胶颗粒包被：

a)将10％的乳胶颗粒用1×MES稀释成1％的浓度，混匀，置4℃离心机，12000转/分，离心10-20分钟。

b)去上清液，再加入等量的1×MES，超声3秒，3次(根据具体情况增减)再置4℃离心机，12000转/分，离心10-20分钟，如此重复清洗2-4次

c)洗完后加入等量的1×MES(使浓度约为1％)，超声，使溶液充分混匀，加入1.3毫克/毫升的抗体(如抗FITC抗体或抗地高辛抗体)，充分混匀，10-30分钟。

d)加入0.16毫克/毫升的EDAC(一般EDAC原液配成浓度为毫克/毫升)，混匀0.5小时以上。

e)置4℃离心机，12000转/分，离心15-20分钟，去上清液，加入等量的乳胶稀释液，超声1秒3-4次(根据具体情况增减)，如此用稀释液清洗3次以上。

f)最后加入乳胶稀释液，使其终浓度约为1％，超声混匀后置4℃保存备用。

5)试纸条组装：

a)粘膜：在室温和湿度小于30％环境下，取片材一张，剪取与片材同长度硝酸纤维素膜一条。撕去片材中间粘膜处的不干胶，双手拉紧硝酸纤维素膜，膜下边对齐撕去不干胶处的下边，相距约2毫米左右放下，放下后切勿再次挪动NC膜，以防膜被损坏。

b)在一个洁净且相对湿度小于30％的室温环境中，分别取出处理好的片材、带乳胶的聚酯膜(下简称聚酯膜)、玻纤、滤纸等，按所需切好；

c)聚酯膜上边对准NC膜下边，贴上约2毫米左右，粘好；

d)玻纤下边对片材底边，上边覆盖乳胶1/3-1/2左右为佳，压紧；

e)滤纸上边对片材上边，下边覆盖NC膜约2-3毫米，压紧；

f)粘上不干胶；

g)用切割机以4毫米宽度切成条；

h)放入干燥密封的环境中保存。

以上所述仪器及试剂在商业上可由市售或直接从国内和国外公司获得，如上海虹光公司，北京舒伯伟公司，美国的Milipore公司，Ahlstrom公司，Jackson Immuno Research Laboratoties，INC.，Sigma公司，Arista公司，印度的MDI公司等。

实施例2

核酸试纸条检测方法的灵敏性

将PCR扩增产物以1，1/2，1/4，1/8，1/16，1/32，1/64，1/128，1/256，1/512，1/1024和1/2048的比例稀释。分别取5微升用于琼脂糖凝胶电泳。凝胶电泳条件为：1X TBE缓冲液，电压100V，电泳时间30分。同时分别取5微升用于核酸试纸条检测。5微升样品与探针在100微升杂交液(TBS，Tris-HCl，pH7.5，10毫摩，氯化钠150毫摩)中杂交后，点于样品垫，5分钟后观察结果。

核酸扩增后试纸条与凝胶电泳的敏感度比较结果显示于附图5中，由附图5的结果可以看出，与传统的凝胶电泳相比，其敏感度增加100-200倍。

实施例3

采用单探针法，淋球菌的核酸PCR扩增物的检测：

●PCR扩增：

氯化钾(500毫摩)                        2微升

Tris-HCl(pH8.3，100毫摩)               2微升

氯化镁(20毫摩)                         2微升

dNTP(2毫摩)                            2微升

正向引物(生物素标记，2微摩)            2微升

反向引物(2微摩)                        2微升

淋球菌                                 4000个

Taq DNA聚合酶                          0.5单位

总量20微升

95℃    30秒

60℃    30秒

72℃    30秒

共35循环

●试纸条检测：

PCR扩增物                          8微升

反向FITC标记探针(2微摩)            2微升

TBS(Tris-HCl 10毫摩pH7.5，氯化钠150毫摩)100微升

95C，5分钟，冷却至室温后，点在试纸条上5分钟后观察结果。

单探针法淋球菌PCR-试纸条检测结果见附图6。

实施例4：

采用双探针法，以生物素和FITC分别标记两条探针，淋球菌的核酸PCR

扩增物的检测：

●PCR扩增：

氯化钾(500毫摩)                    2微升

Tris-HCl(pH8.3，100毫摩)           2微升

氯化镁(20毫摩)                     2微升

dNTP(2毫摩)                        2微升

正向引物(2微摩)                    2微升

反向引物(2微摩)                    2微升

淋球菌                             4000个

Taq DNA聚合酶                      0.5单位

总量20微升

95℃    30秒

60℃    30秒

72℃    30秒

共35循环

●试纸条检测：

PCR扩增物                    8微升

反向生物素标记探针(2微摩)    2微升

反向FITC标记探针(2微摩)      2微升

TBS(Tris-HCl，pH7.510毫摩，氯化钠150毫摩)100微升

95C，5分钟，冷却至室温后，点在试纸条上5分钟后观察结果。

采用双探针法，淋球菌PCR-试纸条的检测结果见附图7。

Claims (12)

1、一种特异性核酸序列扩增物的检测方法，其包括：

1)将一种特异性抗体，抗A抗体吸附于有色颗粒，如胶体金颗粒、乳胶颗粒等，在颗粒表面形成抗体包被；

2)将另一种特异性抗体，无色的抗B抗体以线条状固定于膜上形成检测线，所述膜通常为硝酸纤维膜或尼龙膜；

3)当存在待检的核酸时，发生特异性核酸扩增，其中的一条引物用抗原A标记，形成一条链带有抗原A的核酸扩增物；

4)将步骤3)得到的带有抗原A的核酸扩增物链与一条用抗原B标记的探针杂交，形成扩增物抗原A-探针抗原B杂交物；

5)将步骤4)得到的扩增物抗原A-探针抗原B杂交物首先与颗粒表面抗体包被的抗体A结合，形成扩增物抗原A-颗粒抗体A-探针抗原B有色颗粒复合物；

6)步骤5)得到的有色颗粒复合物在溶液中通过毛细现象沿纤维膜向上流动至抗体B检测线时，与线条上的抗体B结合，形成有色的扩增物抗原A-颗粒抗体A-探针抗原B-线条抗体B颗粒复合物(双抗体双抗原夹心)，从而滞留在线上，形成肉眼可见的有色线条，此为阳性；或者

7)当待检的核酸不存在时，不发生上述步骤3)-6)，有色颗粒将不能与膜上的检测线结合而越过此线，不能形成肉眼可见的有色线条，此为阴性。

2、一种特异性核酸序列扩增物的通用标准试纸条单探针检测方法，其包括：

1)设计两条特异性扩增引物，其中一条引物B用抗原或半抗原B标记；在适宜的扩增条件下，当有被检核酸存在时，特异性核酸片段被扩增并被抗原B标记；当被检核酸不存在时，无特异性核酸片段扩增物；

2)设计一条特异性探针A，探针序列与扩增物片段序列碱基互补，因此可以特异性杂交，形成扩增物-探针杂交复合物；

3)将探针A用抗原A标记；

4)将一种标准的通用抗体，抗A抗体吸附于有色颗粒，在颗粒表面形成抗体包被；

5)将另一种标准的通用抗体，无色的抗B抗体以线条状固定于膜上形成检测线；

6)当存在待检的特异性扩增物时，核酸扩增物与探针A杂交，其中探针A有A抗原标记，引物B有B抗原标记，从而形成扩增物-探针抗原A-引物抗原B杂交物；

7)将步骤6)形成的扩增物-抗原A-抗原B杂交物与颗粒表面抗体包被中的抗体A结合，形成扩增物-探针抗原A-颗粒抗体A-引物抗原B有色颗粒复合物；

8)步骤7)得到的有色颗粒复合物在溶液中通过毛细现象沿纤维膜向上流动至抗体B检测线条，与线条上的抗体B结合，形成扩增物-探针抗原A-颗粒抗体A-引物抗原B-线条抗体B有色颗粒复合物，从而滞留在检测线上，形成肉眼可见的有色线条，此为阳性；或者

9)当特异性扩增物不存在时，不发生上述步骤6)-8)，不能形成扩增物-探针抗原A-探针抗原B复合物，也不能形成扩增物-探针抗原A-颗粒抗体A-引物抗原B-线条抗体B有色颗粒复合物，有色颗粒将不能与膜上的检测线结合而越过此线，不能形成肉眼可见的有色线条，此为阴性。

3、一种特异性核酸序列扩增物的检测方法，其包括：

1)将一种特异性抗体，抗A抗体吸附于有色颗粒，如胶体金颗粒、乳胶颗粒等，在颗粒表面形成抗体包被；

2)将另一种特异性抗体，无色的抗B抗体以线条状固定于膜上形成检测线，所述膜通常为硝酸纤维膜或尼龙膜；

3)当存在待检的特异性核酸扩增物时，未经标记的核酸扩增物与探针A和探针B杂交，其中探针A有A抗原标记，探针B有B抗原标记，从而形成扩增物-探针抗原A-探针抗原B杂交物；

4)将步骤3)形成的扩增物-抗原A-抗原B杂交物与颗粒表面抗体包被中的抗体A结合，形成扩增物-探针抗原A-颗粒抗体A-探针抗原B有色颗粒复合物；

5)步骤4)得到的有色颗粒复合物在溶液中通过毛细现象沿纤维膜向上流动至抗体B检测线条，与线条上的抗体B结合，形成扩增物-探针抗原A-颗粒抗体A-探针抗原B-线条抗体B有色颗粒复合物，从而滞留在检测线上，形成肉眼可见的有色线条，此为阳性；或者

6)当特异性核酸扩增物不存在时，不发生上述步骤3)-5)，不能形成扩增物-探针抗原A-探针抗原B复合物，也不能形成扩增物-探针抗原A-颗粒抗体A-探针抗原B-线条抗体B有色颗粒复合物，有色颗粒将不能与膜上的检测线结合而越过此线，不能形成肉眼可见的有色线条，此为阴性。

4、一种特异性核酸序列扩增物的通用标准试纸条双探针检测方法，其包括：

1)设计两条特异性扩增引物；在适宜的扩增条件下，当有被检核酸存在时，特异性核酸片段被扩增；当被检核酸不存在时，无特异性核酸片段扩增物；

2)设计两条特异性探针A和B，探针序列与扩增物片段序列碱基互补，因此可以特异性杂交，形成扩增物-探针杂交复合物；

3)将探针A用抗原A标记；

4)将探针B用抗原B标记；

5)将一种标准的通用抗体，抗A抗体吸附于有色颗粒，在颗粒表面形成抗体包被；

6)将另一种标准的通用抗体，无色的抗B抗体以线条状固定于膜上形成检测线；

7)当存在待检的特异性扩增物时，核酸扩增物与探针A和探针B杂交，其中探针A有A抗原标记，探针B有B抗原标记，从而形成扩增物-探针抗原A-探针抗原B杂交物；

8)将步骤7)形成的扩增物-抗原A-抗原B杂交物与颗粒表面抗体包被中的抗体A结合，形成扩增物-探针抗原A-颗粒抗体A-探针抗原B有色颗粒复合物；

9)步骤8)得到的有色颗粒复合物在溶液中通过毛细现象沿纤维膜向上流动至抗体B检测线条，与线条上的抗体B结合，形成扩增物-探针抗原A-颗粒抗体A-探针抗原B-线条抗体B有色颗粒复合物，从而滞留在检测线上，形成肉眼可见的有色线条，此为阳性；或者

10)当特异性扩增物不存在时，不发生上述步骤7)-9)，不能形成扩增物-探针抗原A-探针抗原B复合物，也不能形成扩增物-探针抗原A-颗粒抗体A-探针抗原B-线条抗体B有色颗粒复合物，有色颗粒将不能与膜上的检测线结合而越过此线，不能形成肉眼可见的有色线条，此为阴性。

5、权利要求1-4的任何之一所述的检测方法，其中用于标记探针A和探针B的抗原或半抗原选自：生物素、地高辛或荧光染料，所述荧光染料选自Cy3、Cy5、Tetramethylrhodamine、AlexaFluor、Rhodamine、Fam或FitC；探针A和探针B应选用不同的抗原或半抗原标记；所使用的标准的通用抗体，抗A抗体和无色的抗B抗体可选自：亲和素、抗地高辛抗体或抗荧光染料抗体，所述抗荧光染料抗体选自抗Cy3抗体、抗Cy5抗体、抗Tetramethylrhodamine抗体、抗AlexaFluor抗体、抗Rhodamine抗体、抗Fam抗体或抗FitC抗体；抗B抗体应选用与抗A抗体不同的抗体。

6、权利要求5所述的方法，其中抗原或半抗原为生物素、地高辛或FitC；抗体为亲和素、抗地高辛抗体或抗FitC抗体。

7、权利要求1-4的任何之一所述的方法，其中用于吸附抗A抗体的有色颗粒是胶体金颗粒或乳胶颗粒，所述的膜为硝酸纤维素膜或尼龙膜。

8、用于核酸扩增物检测的试纸条，其包括在带有不干胶的衬垫(7)上按顺序有样品垫(1)、有色颗粒结合物垫(2)、纤维膜(3)和吸水滤纸垫(4)，上述各部分在相邻处部分重叠，纤维膜上还设有检测线(5)和质控线(6)，其中有色颗粒结合物垫(2)上的有色颗粒有抗A抗体包被，检测线(5)上有抗B抗体包被，质控线(6)上有抗A抗体。

9、权利要求8所述的用于核酸扩增物检测的试纸条，其中抗A抗体和无色的抗B抗体可选自：亲和素、抗地高辛抗体或抗荧光染料抗体，所述抗荧光染料抗体选自抗Cy3抗体、抗Cy5抗体、抗Tetramethylrhodamine抗体、抗AlexaFluor抗体、抗Rhodamine抗体、抗Fam抗体或抗FitC抗体；抗B抗体应选用与抗A抗体不同的抗体。

10、权利要求9所述的用于核酸扩增物检测的试纸条，其中所述抗体选自亲和素、抗地高辛抗体或抗FitC抗体；。

11、权利要求8所述的用于核酸扩增物检测的试纸条，其中有色颗粒是胶体金颗粒或乳胶颗粒，所述的纤维膜为硝酸纤维素膜或尼龙膜。

12、权利要求8所述的试纸条用于检测核酸及其扩增物的用途。

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