CN104099413B

CN104099413B - 美国白蛾恒温核酸检测试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN104099413B
Application number: CN201410271083.8A
Authority: CN
Inventors: 詹国辉; 郑斯竹; 陈景云; 葛华林
Original assignee: SUZHOU CITY INVASIVE PEST PREVENTION AND CONTROL TECHNOLOGY CENTER
Current assignee: Zheng Sizhu
Priority date: 2014-06-18
Filing date: 2014-06-18
Publication date: 2016-03-09
Anticipated expiration: 2034-06-18
Also published as: CN104099413A

Abstract

本发明公开了一种美国白蛾核酸的恒温检测试剂盒及其检测方法，该试剂盒组成包括：1）DNA检测装置；2）美国白蛾核酸恒温扩增反应液；3）阳性对照：为含有美国白蛾线粒体COI基因的DNA片段；4）阴性对照：为无菌双蒸水。本发明的检测试剂盒特异性高、灵敏度高；反应速度快，单个样本从样本处理到完成检测，仅需1~1.5小时；可同时满足中通量和低通量的样品检测，特别适合现场检测使用，且整个反应过程只需一个恒温仪器。

Description

美国白蛾恒温核酸检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明属于美国白蛾检测技术领域，具体涉及一种美国白蛾恒温核酸的检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

美国白蛾（Hyphantria cunea）（Drury）又名美国灯蛾（白蛾属），是举世瞩目的世界性检疫害虫。主要危害果树、行道树和观赏树木，对园林树木、经济林、农田防护林等造成严重的危害。目前已被列入我国首批外来入侵物种。美国白蛾最主要的扩展途径可由各个虫态随货物借助于交通工具进行传播。以4龄以上的幼虫和蛹传播的机会最多。近几年屡见该虫随由国外运入的包装箱输入中国，应引起注意。美国白蛾侵入中国后，失去了原有天敌的控制，其种群密度迅速增长并蔓延成灾。据吴坚介绍，统计显示，每年因生物入侵给中国林业造成的损失达660亿。

为了治理美国白蛾，早在1981年国务院办公厅转发了农业部、林业部《关于加强对美国白蛾检疫和防治工作的报告》的通知；1984年国务院、中央军委发出《关于迅速扑陕西境内美国白蛾的紧急通知》；北方各省市政府都成立了由地方主要领导参加的美国白蛾防治领导小组，如1995年天津发现美国白蛾后，1996年北京市成立“严防指挥部”，以杜绝美国白蛾进京。西安、咸阳、锦州等地利用人工、机械、化学等方法成功控制了美国白蛾的危害。

目前，加强植物检疫，对来自疫区的苗木、接穗、花卉、鲜果及包装箱填充物和交通工具等必须严格检疫。对来自疫区的木材、苗木、鲜果、蔬菜以及馐箱、填充物和交通工具都必须认真检查。总体说来，缺乏实际有效的能应用与现场的快速有效的检测技术。核酸检测是一种快速特异的检测方法。常规的PCR技术虽然具备快速、灵敏、特异等特点，但由于实验室扩增物污染极易造成假阳性结果而限制了其在临床上的广泛应用。而且进口诊断试剂则由于采购供货周期长，价格昂贵，基层单位难于常规应用。近年来的发展起来的荧光定量PCR（Fluorescence Quantitative PCR， FQ-PCR）技术以其灵敏度高，速度快，特异性强等优点在基因检测水平上有着广泛的应用，但目前国内市场上尚未有关于美国白蛾定量检测试剂盒。FQ-PCR虽然有着简便，快速，灵敏的优势，但是其检测需要昂贵的仪器，且容易造成假阳性等问题。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供一种美国白蛾恒温核酸的检测试剂盒，利用交叉引物核酸恒温扩增以及封闭式核酸扩增物快速检测美国白蛾。本发明的另一目的在于提供上述试剂盒的检测方法。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：

一种美国白蛾核酸的恒温检测试剂盒，组成包括：

（1）美国白蛾核酸恒温扩增反应液；

（2）DNA检测装置；

（3）阳性对照：为含有美国白蛾线粒体COI基因的DNA片段；

（4）阴性对照：为无菌双蒸水；

其中，美国白蛾核酸恒温扩增反应液的组成为：0.01～0.05μmol正向外围引物；0.01～0.05μmol反向外围引物；0.01～0.05μmol反向交叉引物；0.1～0.5μmol正向探针；0.1～0.5μmol反向探针；3～6mmol MgSO₄；0.2～0.4mmol dNTPs溶液；6～10U Gst DNA聚合酶；2μL Betaine（5M）；2μL 10×Thermol buffer；无菌双蒸水补足到18μL；

正向外围引物序列为：AGCAGGAACTGGATGAACA；反向外围引物序列为：GTATGGTAATAGCTCCAGC；反向交叉引物序列为：ATTACTACAATCATTAACATACGATTTTCCTACTGCTCATACGAA；正向探针为5’端标记Biotin序列：ATTACTACAATCATTAACATACGATT；反向探针为5’端标记FitC的序列：AATTTATCATTTGATCAAATACCT。

所述美国白蛾核酸恒温扩增反应液，优选组成为：0.03～0.05μmol正向外围引物；0.03～0.05μmol反向外围引物；0.03～0.05μmol反向交叉引物；0.3～0.5μmol正向探针；0.3～0.5μmol反向探针；5～6mmol MgSO₄；0.3～0.4mmol dNTPs溶液；8～10U Bst DNA聚合酶；2μL 10×Thermol buffer；无菌双蒸水补足到18μL。

所述美国白蛾核酸恒温扩增反应液的组成，再优选为：0.05μmol正向外围引物；0.05μmol反向外围引物；0.05μmol反向交叉引物；0.5μmol正向探针；0.5μmol反向探针；6mmol MgSO₄；0.4mmol dNTPs溶液；2μL Betaine（5M）；10U Gst DNA聚合酶；2μL 10×Thermol buffer；无菌双蒸水补足到18μL。

所述的10×Thermol buffer含有摩尔浓度为20mM的Tris-HCl、10mM的KCl、10mM的（NH₄）₂SO₄、2mM的MgSO₄以及质量浓度为0.1%的Triton X-100，pH8.8。

所述DNA检测装置为全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置，所使用的试纸条为用于核酸扩增物检测的试纸条。

所述阳性对照的含有美国白蛾线粒体COI基因的DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

一种所述美国白蛾核酸的检测试剂盒的检测美国白蛾的方法，具体步骤为：

a）使用常规DNA提取方法从待检测的标本中提取DNA样品；

b）将步骤a）提取得到的DNA样品作为模板加入到装有恒温扩增反应液的PCR管中，在60～65℃下扩增反应60～65分钟，对照PCR管中分别加入标准阳性模板和标准阴性模板；

c）将反应后的PCR管放置到核酸防污染检测装置中进行检测，15分钟以后判读结果。

步骤b）中，在63℃下扩增反应60分钟。

美国白蛾阳性对照中的美国白蛾DNA制备方法，包括下列步骤：

（1）利用两条外围引物进行PCR扩增获得目的基因；

（2）对步骤（1）得到的PCR扩增产物进行纯化；

（3）将步骤（2）得到的纯化后的扩增产物通过质粒转染试剂盒构建完整的含有目的基因的质粒序列；

（4）将所抽提的质粒定量并稀释至10⁶拷贝/μL，-20℃保存。

其中，在步骤（2）中，采用Promega的PCR纯化试剂盒对PCR扩增产物进行纯化；在步骤（3）中采用Promega的T-easy质粒转染试剂盒。

有益效果：与现有技术相比，本发明的优点如下：本发明的检测试剂盒特异性高、灵敏度高；反应速度快，单个样本从样本处理到完成检测，仅需1~1.5小时；可同时满足中通量和低通量的样品检测，特别适合现场检测使用，且整个反应过程只需一个恒温仪器。

附图说明

图1是试纸条的检测线结果图；

图2是利用检测试剂盒检测美国白蛾的灵敏度的实验结果图；图中，序号1-7依次为10⁴个菌/μL、10³个菌/μL、10²个菌/μL、10¹个菌/μL、10⁰个菌/μL的菌液、TB阳性对照品（10⁴拷贝/mL）、空白对照。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步说明。

实施例1 检测试剂盒的组成与配制

（1）DNA检测装置：CN1811447A中所公开的核酸薄膜层析快速检测方法的试纸条，CN1888902A中所公开的全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置。

（2）美国白蛾核酸恒温扩增反应液：两条外围引物（0.05μmol），两条探针（0.5μmol），和扩增交叉引物（0.5μmol），10×Thermol buffer，MgSO₄（6mmol），dNTPs溶液（0.4mmol），Bst DNA聚合酶（10U）和无菌双蒸水组成，总反应液体积为18μL。其中：两条外围引物的正向外围引物序列为5’- AGCAGGAACTGGATGAACA-3’，反向外围引物序列为5’- GTATGGTAATAGCTCCAGC-3’；两条探针的序列分别为：正向5’端Biotin标记探针 5’-biotin- ATTACTACAATCATTAACATACGATT-3’，反向5’端异硫氰酸荧光素标记探针5’-FitC-AATTTATCATTTGATCAAATACCT-3’；一条扩增交叉引物为：5’-ATTACTACAATCATTAACATACGATTTTCCTACTGCTCATACGAA-3’。

10×Thermol buffer的组成：20mM Tris-HCl（pH8.8），10mM KCl，10mM（NH₄）₂SO₄，2mM MgSO₄，0.1% Triton X-100。

所有的引物和探针均由上海生工生物有限公司合成。

阳性对照：美国白蛾DNA模板（为含有美国白蛾线粒体COI基因的DNA片段，SEQ ID NO.6所示序列）。制备步骤：利用两条外围引物和以美国白蛾的基因组DNA模板进行PCR扩增获得目的基因；用Promega的PCR 纯化试剂盒对PCR扩增产物进行纯化；将纯化后的扩增产物通过Promega的T-easy质粒试剂盒，构建含有目的基因片段的质粒；用分光光度计测A₂₈₀定量并稀释至10⁶拷贝/μL，-20℃保存。

阴性对照：无菌双蒸水。

实施例2 用实施例1的试剂盒检测美国白蛾核酸的方法

以包括美国白蛾在内的16种灯蛾科昆虫作为供试标本，这16种灯蛾科昆虫成幼虫在外部形态上都与美国白蛾难以区分。供试标本详见表1。

表1 供试标本

1）DNA的制备：DNA的提取采用GenMagBio 动物细胞组织/细胞基因组DNA 磁珠提取试剂盒进行提取。具体过程如下：

直接剪取供试标本足和胸部30mg放入2mL试管，无水乙醇浸泡保存标本用无菌蒸馏水冲洗浸泡4~5次，弃水；干标本无菌蒸馏水浸泡3h后吸干水分。置于2mL离心管，MM400球磨仪中震荡碾磨（30次/s）30s，加入180μL Lysis Buffer、20μL Proteinase K，震荡混匀，常温过夜，55℃震荡温浴3-5h，12000rpm离心10min，取上清，加入200μL Binding Buffer和200μL无水乙醇，充分混匀，加入20μL磁珠，轻柔颠倒混匀10min。离心管置于磁力架，吸弃管内液体，保留磁珠，Wash Buffer І 500uL颠倒混匀2min置于磁力架，弃去管内液体，Wash Buffer Ⅱ同样洗涤两次，离心管仍置于磁力架上，缓慢加入Wash Buffer Ⅲ，1min后移走管内液体。加入20μL Elution Buffer，55℃水浴10min洗脱磁珠上吸附的DNA，4℃储存备用。

2）将待检测样品提取出的DNA作为模板加入到装有美国白蛾核酸恒温扩增反应液的PCR管中，在60℃进行扩增反应90分钟，其中标本DNA 4μL，反应液16μL；对照PCR管中分别加入阳性对照模板和阴性对照模板。

3）将反应后的PCR管放置到核酸防污染检测装置中进行检测，15分钟以后判读结果。如图1所示，当待检测样品为美国白蛾时，试纸条的检测线为两条，呈阳性，其他样品及阴性对照检测线为1条，呈阴性。

反复重复实验3次，检测结果无显著性差异，说明本试剂盒的不同批次间的检测结果具有可比性，具有良好的重复性。上述实施例说明，用本发明的试剂盒来检测重复性好，且对样本的检测仅仅需要2个小时就能完成，大大缩短检测时间。同时本试剂盒只需要1个人就可以完成所有的操作过程，可一次性检测一个到数百个样本，这样也减少了人力的浪费。

实施例3

提取培养的美国白蛾的DNA，对其进行定量，分别稀释至浓度为10⁴拷贝/μL、10³拷贝/μL、10²拷贝/μL、10¹拷贝/μL，采用实施例2中所述方法来确定本发明试剂盒用于检测美国白蛾核酸的灵敏度。

结果如图2所示，图中1-4分别表示10⁴拷贝/μL、10³拷贝/μL、10²拷贝/μL、10¹拷贝/μL，5是阴性对照，可以发现该试剂盒可在每个反应体系中检出10个拷贝，具有很高的灵敏度，可以满足快速检测美国白蛾的要求（拷贝为克隆单位）。

SEQUENCE LISTING

<110> 苏州市外来有害生物防控技术中心

<120> 美国白蛾恒温核酸检测试剂盒及其检测方法

<130> 100

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 正向外围引物序列

<400> 1

agcaggaact ggatgaaca 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 反向外围引物序列

<400> 2

gtatggtaat agctccagc 19

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 正向5'端Biotin标记探针

<400> 3

attactacaa tcattaacat acgatt 26

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 反向5'端异硫氰酸荧光素标记探针

<400> 4

aatttatcat ttgatcaaat acct 24

<210> 5

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 扩增交叉引物

<400> 5

attactacaa tcattaacat acgattttcc tactgctcat acgaa 45

<210> 6

<211> 261

<212> DNA

<213> Hyphantria cunea

<400> 6

caggaactgg atgaacagtt tatccccccc tttcctctaa tattgctcat ggtggaagat 60

cagttgattt agctattttt tctcttcatt tagcaggaat ttcttcaatt ttaggagcaa 120

ttaattttat tactacaatc attaacatac gattaaataa tttatcattt gatcaaatac 180

ctttattcgt atgagcagta ggaattacag cttttctatt acttctttct cttcctgttt 240

tagctggagc tattaccata c 261

Claims

1.一种美国白蛾核酸的恒温检测试剂盒，其特征在于，组成包括：

(1)美国白蛾核酸恒温扩增反应液；

(2)DNA检测装置；

(3)阳性对照：为含有美国白蛾线粒体COI基因的DNA片段；

(4)阴性对照：为无菌双蒸水；

其中，美国白蛾核酸恒温扩增反应液的组成为：0.01～0.05μmol正向外围引物；0.01～0.05μmol反向外围引物；0.01～0.05μmol反向交叉引物；0.1～0.5μmol正向探针；0.1～0.5μmol反向探针；3～6mmol MgSO₄；0.2～0.4mmol dNTPs溶液；6～10U Bst DNA聚合酶；2μL三甲铵乙内酯5M；2μL 10×热缓冲液；无菌双蒸水补足到18μL；

正向外围引物序列为：AGCAGGAACTGGATGAACA；反向外围引物序列为：

GTATGGTAATAGCTCCAGC；反向交叉引物序列为：

ATTACTACAATCATTAACATACGATTTTCCTACTGCTCATACGAA；正向探针为5’端标记Biotin序列：ATTACTACAATCATTAACATACGATT；反向探针为5’端标记FitC的序列：AATTTATCATTTGATCAAATACCT。

2.根据权利要求1所述的美国白蛾核酸的恒温检测试剂盒，其特征在于：所述美国白蛾核酸恒温扩增反应液的组成为：0.03～0.05μmol正向外围引物；0.03～0.05μmol反向外围引物；0.03～0.05μmol反向交叉引物；0.3～0.5μmol正向探针；0.3～0.5μmol反向探针；

5～6mmol MgSO₄；0.3～0.4mmol dNTPs溶液；8～10U Bst DNA聚合酶；2μL 10×热缓冲液；无菌双蒸水补足到18μL。

3.根据权利要求1或2所述的美国白蛾核酸的恒温检测试剂盒，其特征在于：所述DNA检测装置为全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置，DNA检测装置所使用的试纸条为用于核酸扩增物检测的试纸条。

4.根据权利要求1所述的美国白蛾核酸的恒温检测试剂盒，其特征在于：所述阳性对照的含有美国白蛾线粒体COI基因的DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

5.一种权利要求1所述美国白蛾核酸的恒温检测试剂盒的检测美国白蛾的方法，其特征在于，具体步骤为：

a)使用常规DNA提取方法从待检测的标本中提取DNA样品；

b)将步骤a)提取得到的DNA样品作为模板加入到装有恒温扩增反应液的PCR管中，在60～65℃下扩增反应60～65分钟，对照PCR管中分别加入标准阳性模板和标准阴性模板；

c)将反应后的PCR管放置到核酸防污染检测装置中进行检测，15分钟以后判读结果。

6.根据权利要求5所述的美国白蛾核酸的恒温检测试剂盒的检测美国白蛾的方法，其特征在于，步骤b)中，在63℃下扩增反应60分钟。