CN103276104A - 检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的rt-lamp核酸试纸条试剂盒及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒及应用。该试剂盒包含核苷酸序列如SEQ ID NO.1～6所示的引物组和核酸检测试纸条。该试剂盒的使用方法如下：首先配制RT-LAMP反应体系，包含AMV逆转录酶、1倍反应缓冲液、链置换DNA聚合酶、dNTP混合物、甜菜碱、MgSO₄、FIP引物、BIP引物、LoopF引物、LoopB引物、F3引物、B3引物以及待测样品RNA；恒温反应所得产物用核酸检测试纸条检测后直接进行判读：阳性结果为出现两条红色条带，一条位于检测区内，另一条位于质控区内。该试剂盒操作简单、成本低廉，反应结果易于观察，特异性好，非常适用于出口检疫、食品卫生以及畜牧养殖场的现场检测，易于大范围推广应用。

Description

检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒及应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS），俗称“蓝耳病”，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive andrespiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一种主要以母猪繁殖障碍、仔猪呼吸道症状以及断奶仔猪高死亡率为特征的病毒性传染病。此外，临床上还表现在部分康复母猪发情不典型、受孕率低等症状。该病于1987年首先在美国爆发，随后很快在世界范围内迅速蔓延，给养猪业造成了巨大的经济损失。国际兽疫组织将其定为B类传染病，我国将其列为二类传染病。

1991年在我国台湾地区首次报道有该病的发生，1996年郭宝清等首次从国内猪群中分离到以CH-1a为代表的流行株。随着病毒的遗传和变异，2006年夏以来，首先在我国南方省份爆发以高热、厌食、倦怠、大便干燥、后期拉稀、皮肤潮红和呼吸急促等临床症状为特征的“猪高热病”，随后蔓延到全国大部分地区。据初步统计，这些地区猪只的发病率达50%以上，死亡率达20%到100%，给我国养猪生产造成了巨大的经济损失。

PRRSV是一种有囊膜的、不分节段的单股正链RNA病毒，属于尼多病毒目动脉炎病毒科动脉炎病毒属，在生物学特性、结构和遗传性上与马动脉炎病毒、小鼠乳酸脱氢酶升高症病毒及猴出血热病毒密切相关，但它们之间并无血清学交叉反应。根据基因组和抗原性的差异，人们将PRRSV划分为两个血清型，欧洲型和美洲型。

目前常用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法包括病原的分离鉴定、血清学方法和RT-PCR、荧光定量PCR。病原的分离鉴定是最传统的检测方法，其结果准确可靠，但其影响因素多，实际操作起来相当费时费力，因此在临床应用中有一定的局限性；血凝抑制试验、补体结合试验、中和试验和酶联免疫吸附试验等血清学试验的敏感性及特异性较低，操作也比较麻烦；而RT-PCR、荧光定量PCR技术需要特殊的仪器设备（如PCR仪和凝胶成像系统等）和专业人员进行相关的操作，显然无法满足基层和现场检测的需求。

环介导等温核酸扩增技术（LAMP）是由日本学者Notomi于2000年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，该技术利用4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域，通过一种链置换DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）在等温条件下进行靶序列高效快速扩增。近年来，国内外已将该技术广泛应用于病原体检测。Hong TC等人（Development and evaluation of a novel loop-mediatedisothermal amplification method for rapid detection of severe acute respiratorysyndrome coronavirus.Clin Microbiol,2004May；42(5):1956-61）于2004年根据LAMP原理设计了实时定量RT-LAMP方法，以快速检测SARS-Cov，结果RT-LAMP的灵敏度是RT-PCR的100倍；Masaki Imai等人（Rapid diagnosis ofH5N1avian influenza virus infection by newly developed influenza H5hemagglutinin gene-specific loop-mediated isothermal amplification method.VirolMethods.2007May;141(2):173-80.）于2007年建立了快速诊断H5N1禽流感病毒的RT-LAMP检测体系。由于LAMP的扩增产物是白色焦磷酸镁沉淀，用肉眼难以观察，日本已研制出专门对LAMP产物进行实时监控的浊度仪。但是浊度仪的使用不但增加了费用，而且不方便携带；有学者利用往反应后的体系中加入SYBR Green I染料的方法来检测扩增产物，但是这样观察又必需开盖处理，LAMP扩增的高效性及高敏感性使得产物中含有大量目的片段，开盖添加染料极其容易污染环境。后来，有研究对LAMP方法作进一步改进，在原有LAMP反应试剂的基础上添加钙黄绿素和氯化锰后，可以衍生出另外一种更为简便的可视化LAMP，一步即可完成LAMP扩增及结果判定，LAMP产物无需开盖分析即可用肉眼观察结果。但这种方法对弱阳性结果的判别不够准确，且会因为钙黄绿素与锰离子的浓度配比而使实验结果难以判定。

发明内容

本发明首要目的是提供一具有高灵敏度、高特异性、可视化的、操作方法简单的检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒。

本发明的另一目的在于提供实现上述检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒，包含如下引物组和核酸检测试纸条：

所述的引物组的核苷酸序列如下所示：

F3：5’-ATAGCACAGCTCCACAGA-3’；

B3：5’-TCTATGGCTGAGTACACTCC-3’；

FIP：5’-GCAGAAGCCCTAGCAGTCGTTACCTACACGCCAGTGA-3’；

BIP：5’-TACCTTCGGGCACATGACATTCAAGAAGTGCAACTACTGCTC-3’；

LoopF：5’-Biotin-GCCGCGACTTACCTTTAGA-3’；

LoopB：5’-FITC-ACTTTGAGAGCACAAATAGGGT-3’；

所述的核酸检测试纸条为通用型核酸检测试纸条；

所述的检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒优选包含上述引物组和全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置；

所述的全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置为杭州优思达生物技术有限公司产品；该检测装置为将通用型核酸检测试纸条置入一个掌上塑料检测装置内得到；

所述的检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒，还包含dNTP混合物溶液、MgSO₄溶液、反应缓冲液、链置换DNA聚合酶（Bst DNApolymerase）、甜菜碱（Betaine）溶液和AMV逆转录酶；

所述的试剂盒更优选为包含浓度为5U/μL的AMV逆转录酶、10倍反应缓冲液（10×ThermoPol Reaction Buffer）、浓度为8U/L的链置换DNA聚合酶、浓度为2.5mmol/L的dNTP混合物溶液、浓度为10mol/L的甜菜碱溶液、浓度为100mmol/L的MgSO₄溶液、浓度为10μmol/L的引物FIP、浓度为10μmol/L的引物BIP、浓度为10μmol/L的引物F3、浓度为10μmol/L的引物B3、浓度为10μmol/L的引物LoopF和浓度为10μmol/L的引物LoopB；

所述的检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒的应用，包含以下步骤：

（1）配制RT-LAMP反应体系，按终浓度计算，AMV逆转录酶为10⁵U/L、10倍反应缓冲液（10×ThermoPol Reaction Buffer）为1倍（1×）、链置换DNA聚合酶为0.32U/L、dNTP混合物为0.4～0.6mmol/L、甜菜碱为1～2mol/L、MgSO₄为0～3mmol/L、FIP引物为1.6μmol/L、BIP引物为1.6μmol/L、F3引物为0.2μmol/L、B3引物为0.2μmol/L、LoopF引物为0.6μmol/L、LoopB引物为0.6μmol/L，待测样品RNA为12ng/μL；恒温反应；

（2）反应：将步骤（1）恒温反应后的产物用核酸检测试纸条检测，10min观察结果；

（3）结果判读：直接肉眼判读，

①阴性（－）：仅在质控区（C）出现一条红色条带，在检测区（T）内无红色条带出现，证明所检测的样本没有猪繁殖与呼吸综合征病毒感染；

②阳性（＋）：出现两条红色条带，一条位于检测区（T）内，另一条位于质控区（C）内，证明所检测的样本为猪繁殖与呼吸综合征病毒感染；

③无效：质控区（C）和检测区（T）内均无红色条带出现，表明核酸试纸条失效。

步骤（1）中所述的dNTP混合物的终浓度优选为0.4mmol/L；

步骤（1）中所述的甜菜碱的终浓度优选为1mol/L；

步骤（1）中所述的MgSO₄的终浓度优选为2mmol/L；

步骤（2）中所述的恒温反应的时间优选为10～40min；

步骤（2）中所述的恒温反应的条件优选为61℃反应40min。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：

（1）RT-LAMP成本低廉，利用Bst DNA polymerase在61℃实现等温扩增，不需要复杂且昂贵的PCR仪，因此，本发明提供的试剂盒使用成本低。

（2）本发明所提供的试剂盒反应迅速，利用AMV反转录酶实现一步法RT-LAMP，无需增加42℃1h的反转录过程，可以在40min内完成反应，最快可以在10min内完成。

（3）本发明提供的试剂盒得到的反应结果易于观察，虽然LAMP在DNA扩增过程中产生大量焦磷酸镁沉淀使反应液呈现浑浊，在反应结束后无需琼脂糖凝胶电泳即可直接肉眼观察反应管中浑浊来判断阳性与否，但弱阳性结果仍给判别带来较大困难，如果在引物5’端进行特异性生物标记，然后再用核酸检测试纸条对产物进行检测，既可以准确对结果进行快速判读，又可以防止污染。

（4）本发明提供的试剂盒特异性好，对猪瘟病毒、圆环病毒2型等都呈阴性反应；灵敏度高，最低可以检测到1pg的RNA模板，与RT-LAMP琼脂糖凝胶电泳的检测限一致，比钙黄绿素可视化RT-LAMP方法和普通RT-PCR方法检测限高10倍。即使是几个病毒粒子，也能被快速准确的检测出来。

（5）本发明所述的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒可快速、灵敏地检测猪繁殖与呼吸综合征病毒，无需昂贵仪器，只需一个恒温水浴锅即可完成反应。操作简单、成本低廉，反应结果易于观察，特异性好，非常适用于出口检疫、食品卫生以及畜牧养殖场的现场检测，易于大范围推广应用。

附图说明

图1为RT-LAMP反应体系优化结果图，其中：

A为不同dNTP浓度与电泳亮度关系图，泳道M为DNA Marker DL2000，泳道1～6依次对应dNTP浓度分别为0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM和0.6mM得到的反应产物；

B为不同Betaine浓度与电泳亮度关系图，泳道M为DNA Marker DL2000，泳道1～4依次对应Betaine浓度分别为0M、0.5M、1.0M和1.5M得到的反应产物；

C为不同MgSO₄浓度与电泳亮度关系图，泳道M为DNA Marker DL2000，泳道1～8依次对应MgSO₄浓度分别为0mM、0.5mM、1mM、2mM、3mM、4mM、5mM和6mM得到的反应产物；

D为内引物（FIP+BIP）与外引物（F3+B3）不同浓度比例及不同浓度外引物（F3+B3）与电泳亮度关系图，泳道M为DNA Marker DL2000，泳道1～8依次对应内引物和外引物按浓度比为2:1、4:1、6:1、8:1、10:1、3:1、6:1和8:1得到的反应产物，其中，泳道1～5外引物浓度为0.2μmol/L，泳道6～8的外引物浓度为0.4μmol/L；

E为不同环引物（LoopF+LoopB）与外引物（F3+B3）浓度比例与电泳亮度关系图，泳道M为DNA Marker DL2000，泳道1～7依次对应环引物和外引物按浓度比为1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1和0:1得到的反应产物，外引物浓度为0.2μmol/L。

图2为RT-LAMP反应条件优化结果图，其中：

A为不同温度下反应的电泳亮度关系图，泳道M为DNA Marker DL2000，泳道1～8依次对应反应温度为59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃和66℃的产物；

B为不同反应时间下的电泳亮度关系图，泳道M为DNA Marker DL2000，泳道1～6依次对应反应时间为10min、20min、30min、40min、50min和60min的产物。

图3为本发明提供的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒特异性实验中的琼脂糖凝胶电泳结果图，其中：

泳道M为DNA Marker DL2000；泳道1是以PRRSV经典株GD08-2株基因组为模板的RT-LAMP反应产物；泳道2是以PRRSV变异株JXA1-R株基因组为模板的RT-LAMP反应产物；泳道3是以CSFV基因组为模板的RT-LAMP反应产物；泳道4是以JEV基因组为模板的RT-LAMP反应产物；泳道5是以PCV-2基因组为模板的LAMP反应产物；泳道6是以PRV基因组为模板的LAMP反应产物；泳道7是以PPV基因组为模板的LAMP反应产物；8为阴性对照。

图4为RT-LAMP和RT-PCR的灵敏度检测结果图，其中：

A为紫外条件下钙黄绿素法对本发明提供的RT-LAMP产物检测的结果图；

B为利用本发明提供的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳得到的结果图；

C为利用RT-PCR方法得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳得到的图；图中均为：1的模板为PRRSV1ng RNA进行10倍稀释；2的模板为PRRSV1ng RNA进行10²倍稀释；3的模板为PRRSV1ng RNA进行10³倍稀释；4的模板为PRRSV1ng RNA进行10⁴倍稀释；5的模板为PRRSV1ng RNA进行10⁵倍稀释；6为阴性对照。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

以下实施例中所用的引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；BstDNA聚合酶大片段购自New England公司；甜菜碱（Betaine）和MgSO₄购自Sigma公司；Trizol、AMV反转录酶、RNA酶抑制剂、随机引物、Ex-Taq DNA聚合酶、dNTP（2.5mM）、琼脂糖购自Takara公司；全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置购自杭州优思达生物技术有限公司（货号：20120420-32）。

实施例1

一、引物设计

根据LAMP引物设计原则，针对PRRSV ORF6基因的保守区域序列，根据LAMP引物的设计原则，应用在线引物设计软件PrimerExporer4.0设计引物三套，如表1所示（此时，LoopF和LoopB未进行Biotin和FITC标记），引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，-20℃避光保存。对这三套引物分别进行反应温度优化后，在各自最优反应温度下进行反应时间的优化，并对三套引物的反应时间优化结果进行比较，反应体系如表2所示，引物使用各套引物中相对应的引物。第一套引物的最优反应温度为61℃，反应40min产物量即可达到最高。第二套引物的最优反应温度为63℃，反应时间为80min才有产物形成。第三套引物的最优反应温度为62℃，反应为90min才有产物形成。通过筛选，得到反应时间最短的第一套引物（如表1所示），包括1对外部引物（F3和B3）、1对内部引物（FIP和BIP）和1对环引物（LoopF和LoopB）。FIP由F1c（F1的互补序列）和F2序列组成；BIP由B1c和B2（B2c的互补序列）组成。由上海生工生物工程技术服务有限公司分别对第一套引物中的FIP引物和LoopF引物的5’端进行Biotin（生物素）标记，再分别对BIP引物和LoopB引物的5’端进行FITC（异硫氰酸荧光素）标记。对FIP和BIP引物标记组和LoopF和LoopB引物标记组分别进行RT-LAMP的空白样品试验，产物用核酸试纸条进行检测。结果发现FIP和BIP引物标记组的空白样品核酸试纸条检测呈阳性，而LoopF和LoopB引物标记组的空白样品呈阴性，所以选用LoopF和LoopB引物的5’端分别进行Biotin（生物素）和FITC（异硫氰酸荧光素）标记为最佳标记方式（如表1所示）。

表1

下面对第一套引物的设计进行详细描述（以下序列为PRRSV ORF6基因部分序列，Genbank号：FJ231467.1）：F3序列的位置如下所示，B3为B3c的互补序列；FIP由F1c（F1的互补序列）和F2序列组成；BIP由B1c和B2（B2c的互补序列）组成；LoopF为F4的互补序列，LoopB与B4c序列相同。

ATGGGGTCGTCTCTAGACGACTTCTGCAATG

AGGTGCTTTTGGCGTTTTCCATGATATATGC

ACCTTTTGATCTTTCTGAATTGTGCTTTGTGC

CGCGCTCACTATGG

TGG

AACCTGGAAATTCATCACCTCCAGATGCCGTTTGTGCTTGCTAGGCCGCAAGTACATTCTGGCCCCTGCCCACCACGTCGAAAGTGCCGCGGGCTTTCATCCGATTGCGGCAAATGATAACCACGCGTTTGTCGTCCGGCGTCCCGGCTCCACTACGGTCAACGGCACATTGGTGCCCGGGTTGAAAAGCCTCGTGTTGGGTGGCAGAAAAGCTGTTAAGCAAGGAGTGGTAAACCTTGTTAAATATGCCAAATAA。

二、RT-LAMP反应（使用表1中第一套引物进行以下试验）

1、病毒RNA的抽提：

取本实验室保藏猪繁殖与呼吸综合征病毒GD08-2株（猪繁殖与呼吸综合症病毒分离株ORF5和Nsp2基因的序列分析.华南农业大学学报,2010,31(2)：108-112）。使用Trizol Reagent抽提RNA，按照以下步骤进行抽提：

（1）将250μL液体样品加入1.5mL离心管中，再加入750μL冰预冷的RNAiso Reagent（TaKaRa）；

（2）将样品剧烈混匀后，在室温静置5min；

（3）加入250μL氯仿，剧烈振荡10s，使液体充分混匀呈乳白状（无分相现象）后，再室温静置5min；

（4）在4℃条件下，以12000r/min离心15min；

（5）将上层水相转移到一个新的离心管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，然后在4℃条件下静置10～15min；

（6）在4℃条件下，以12000r/min离心15min，小心并尽可能去掉上清；

（7）用1mL体积百分比75%的乙醇溶液洗涤RNA沉淀和管壁，在4℃条件下，以12000r/min离心8min，然后小心弃去乙醇；

（8）将RNA沉淀进行干燥（不能完全干燥）处理后，用10μL RNase-free水将RNA溶解，加入0.5μLRNA酶抑制剂（TaKaRa公司）（40U），-80℃冰箱中储存备用。

2、RT-LAMP检测体系的建立：

参照Notomi等（Notomi，T.,Okayama,H.,Masubuchi,H.,et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J].Nucleic Acids Res,2000,28:E63）提供的方法构建25μL RT-LAMP反应体系，依次对dNTP、Betaine、MgSO₄、内外环引物浓度比例进行优化，得到的结果进行琼脂糖凝胶（质量体积比2%）电泳检测。

通过设置不同终浓度的dNTP：0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM，其他成分的用量如表2所示（结果如图1A所示）；不同终浓度的Betaine：0M、0.5M、1.0M、1.5M，其他成分的用量如表2所示（结果如图1B所示）；不同终浓度的MgSO₄：0mM、0.5mM、1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM，其他成分的用量如表2所示（结果如图1C所示）；不同终浓度的内外引物浓度比例（内引物为BIP+FIP，外引物为B3+F3）及外引物浓度：2:1、4:1、6:1、8：1、10:1、3：1、6：1、8:1，此时具体的引物浓度比为：0.4μM:0.2μM、0.8μM:0.2μM、1.2μM:0.2μM、1.6μM:0.2μM、2.0μM:0.2μM、1.2μM:0.4μM、2.4μM:0.4μM、3.2μM:0.4μM，其他成分的用量如表2所示（结果如图1D所示）。不同终浓度环引物（环引物为LoopF+LoopB）与外引物浓度比例：1:1、2:1、3:1、4:1、5:1，6:1、0:1，此时具体的引物浓度比为：0.2μM:0.2μM、0.4μM:0.2μM、0.6μM:0.2μM、0.8μM:0.2μM、1.0μM:0.2μM、0μM:0.2μM，其他成分的用量如表2所示（结果如图1E所示）。检测条件为61℃恒温40min。根据所得的实验结果，最终确定优化的检测体系（25μL）如表2所示。

表2优化的检测体系

3、RT-LAMP检测条件的优化

为了得到最优化的反应温度，将LAMP反应分别置于59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃，反应时间是60min，反应体系如表2所示。从多次重复试验中确定最佳反应温度，通过质量体积比2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2A所示，说明最佳反应温度为61℃。

以最佳反应温度（61℃），将反应时间按10min、20min、30min、40min、50min、60min递增，反应体系如表2所示，从多次重复试验中确定最佳反应时间（结果如图2B所示），图2B的结果说明最佳反应时间是40min。优化后的检测条件为61℃恒温40min。

4、检测体系特异性、灵敏性分析

使用高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗JXA1-R株（高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗，广东大华农动物保健品有限公司）、猪繁殖与呼吸综合征病毒GD08-2株（猪繁殖与呼吸综合症病毒分离株ORF5和Nsp2基因的序列分析.华南农业大学学报,2010,31(2)：108-112）、猪瘟病毒（CSFV）GXW-07（猪瘟病毒感染对猪外周血T淋巴细胞亚群及TNF-α和IFN-γ的影响.中国预防兽医学报，2011,33（2）：126-129）、日本乙型脑炎病毒（JEV）疫苗株SA14-14-2（武汉科前生物技术有限公司）、猪圆环病毒2型（PCV-2）（猪圆环病毒2型油乳剂灭活疫苗，上海海利生物科技有限公司）、伪狂犬病毒（PRV）（伪狂犬病毒活疫苗，上海海利生物科技有限公司）、猪细小病毒（PPV）（猪细小病毒病油乳剂灭活疫苗，上海海利生物科技有限公司）的基因组为模板检测体系的特异性，同时以水替代核酸模板设置阴性对照。反应体系如表2所示，反应条件为步骤3确定的优化条件，使用全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置以及浓度为质量体积比2%的琼脂糖凝胶电泳对产物进行检测。使用全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置检测（10min后看结果），得到的结果为：以PRRSV GD08-2（经典株）基因组为模板的RT-LAMP反应产物和以PRRSV JXA1-R（变异株）基因组为模板的RT-LAMP反应产物，出现两条红色条带，一条位于检测区（T）内，另一条位于质控区（C）内；以CSFV基因组、JEV基因组、PCV-2基因组、PRV基因组、PPV基因组和水分别为模板得到RT-LAMP反应产物，仅在质控区（C）出现一条红色条带，在检测区（T）内无红色条带出现。使用琼脂糖凝胶电泳（需时40min）的检测结果（图3）如下：只有以高致病性PRRSV疫苗株基因组为模板的RT-LAMP反应产物和以PRRSV经典株GD08-2基因组为模板的RT-LAMP反应产物有目的基因条带。结果显示检测体系的特异性良好，可特异地检测到猪繁殖与呼吸综合征病毒，且用核酸检测试纸条检测，操作更方便、省时。

从250μL猪繁殖呼吸综合征病毒GD08-2株中提取病毒总RNA，在紫外分光光度计上测定其RNA含量（100ng/μL），并制备1ng/μL的标准品。将RNA标准品进行10倍梯度稀释，将稀释后的样品分别进行RT-LAMP（反应体系如表2所示，除了模板有变化；反应条件为步骤3确定的优化条件）、钙黄绿素法可视化RT-LAMP（在表2的反应体系中再加入钙黄绿素（Calcein）和MnCl₂，各自的终浓度分别为25μmol/L和0.5mmol/L，模板有变化；反应条件为步骤3确定的优化条件）。RT-PCR所使用的引物是

P1：5′-GAGTTTCAGCGGAACAATGG-3′；

P2：5′-GCACAAACGGCATCTGGAG-3′；

取10倍梯度稀释的RNA溶液10μL，置于经DEPC处理过的离心管中，再依次加入反转录的其它成分进行反转录。具体反转录体系如表3所示：

表3

5×Buffer	4μL
		dNTPs(10mmol/L)	2μL
RNA酶抑制剂(40U/μL)	1μL
		随机引物(50pmol/μL)	2μL
AMV(5U/μL)	1μL
		RNA溶液（100ng/μL）	10μL
共计	20μL

混匀后使用LX-100手掌型离心机瞬时离心，使液体集中于管底，置42℃水浴中，反应1小时。

反转录结束后，以该cDNA为模板，P1和P2为引物进行PCR，具体体系如表4所示：

表4

ddH2O	17.25μL
		10×PCR Buffer	2.5μL
dNTPs(2.5mmol/L)	2μL

P1(10μmol/L)	0.5μL
		P2(10μmol/L)	0.5μL
Ex-Taq(5U/μL)	0.25μL
		cDNA模板（100ng/μL）	2μL
共计	25μL

PCR程序如下：94℃预变性2min；94℃30s，55℃30s，72℃45s为一个循环，运行30个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。

比较RT-LAMP核酸试纸条检测试剂盒、钙黄绿素法可视化RT-LAMP、RT-LAMP琼脂糖凝胶电泳、RT-PCR琼脂糖凝胶电泳四种检测方法的灵敏度。结果如图4所示，RT-LAMP核酸试纸条检测试剂盒与RT-LAMP琼脂糖凝胶电泳检测限一致，但比钙黄绿素法可视化RT-LAMP和RT-PCR琼脂糖凝胶电泳方法对PRRSV基因组RNA的检测限高10倍，最低可以检测到1pg的PRRSVRNA。可见，本发明提供的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒更加灵敏，操作更加简单，而且用时更短，结果比较直观，易于检测，无需电泳。

4、检测体系的结果鉴定

①阴性（－）：仅在质控区（C）出现一条红色条带，在检测区（T）内无红色条带出现。证明所检测的样本没有猪繁殖与呼吸综合征病毒感染；

②阳性（＋）：出现两条红色条带。一条位于检测区（T）内，另一条位于质控区（C）内。证明所检测的样本为猪繁殖与呼吸综合征病毒感染。

③无效：质控区（C）和检测区（T）内均无红色条带出现，表明核酸试纸条失效。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒，其特征在于包含如下引物组和核酸检测试纸条：

所述的引物组的核苷酸序列如下所示：

F3：5’-ATAGCACAGCTCCACAGA-3’；

B3：5’-TCTATGGCTGAGTACACTCC-3’；

FIP：5’-GCAGAAGCCCTAGCAGTCGTTACCTACACGCCAGTGA-3’；

BIP：5’-TACCTTCGGGCACATGACATTCAAGAAGTGCAACTACTGCTC-3’；

LoopF：5’-Biotin-GCCGCGACTTACCTTTAGA-3’；

LoopB：5’-FITC-ACTTTGAGAGCACAAATAGGGT-3’。

2.根据权利要求1所述的检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒，其特征在于：所述的核酸检测试纸条为通用型核酸检测试纸条。

3.根据权利要求1所述的检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒，其特征在于：包含全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置和权利要求1所述的引物组；全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置为将通用型核酸检测试纸条置入一个掌上塑料检测装置内得到。

4.根据权利要求1所述的检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒，其特征在于：还包含dNTP混合物溶液、MgSO₄溶液、反应缓冲液、链置换DNA聚合酶、甜菜碱溶液和AMV逆转录酶。

5.根据权利要求4所述的检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒，其特征在于：包含浓度为5U/μL的AMV逆转录酶、10倍反应缓冲液、浓度为8U/L的链置换DNA聚合酶、浓度为2.5mmol/L的dNTP混合物溶液、浓度为10mol/L的甜菜碱溶液、浓度为100mmol/L的MgSO₄溶液、浓度为10μmol/L的引物FIP、浓度为10μmol/L的引物BIP、浓度为10μmol/L的引物F3、浓度为10μmol/L的引物B3、浓度为10μmol/L的引物LoopF和浓度为10μmol/L的引物LoopB。

6.权利要求1～5任一项所述的检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒的应用，其特征在于包含以下步骤：

（1）配制RT-LAMP反应体系，按终浓度计算，AMV逆转录酶为10⁵U/L、10倍反应缓冲液为1倍、链置换DNA聚合酶为0.32U/L、dNTP混合物为0.4～0.6mmol/L、甜菜碱为1～2mol/L、MgSO₄为0～3mmol/L、FIP引物为1.6μmol/L、BIP引物为1.6μmol/L、F3引物为0.2μmol/L、B3引物为0.2μmol/L、LoopF引物为0.6μmol/L、LoopB引物为0.6μmol/L，待测样品RNA为12ng/μL；恒温反应；

（2）反应：将步骤（1）恒温反应后的产物用核酸检测试纸条检测，10min观察结果；

（3）结果判读：直接肉眼判读，

①阴性：仅在质控区出现一条红色条带，在检测区内无红色条带出现，证明所检测的样本没有猪繁殖与呼吸综合征病毒感染；

②阳性：出现两条红色条带，一条位于检测区内，另一条位于质控区内，证明所检测的样本为猪繁殖与呼吸综合征病毒感染；

③无效：质控区和检测区内均无红色条带出现，表明核酸试纸条失效。

7.根据权利要求6所述的检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的RT-LAMP核酸试纸条试剂盒的应用，其特征在于：

步骤（1）中所述的dNTP混合物的终浓度为0.4mmol/L；

步骤（1）中所述的甜菜碱的终浓度为1mol/L；

步骤（1）中所述的MgSO₄的终浓度为2mmol/L；

步骤（2）中所述的恒温反应的时间为10～40min；

步骤（2）中所述的恒温反应的条件为61℃反应40min。

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