CN105301237A - 一种用胶体金层析技术检测核酸的方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用胶体金层析技术检测核酸的方法及试剂盒，属于医学生物技术领域。本发明提供核酸检测通用试纸条，将通用探针1标记上胶体金颗粒后固定于玻璃纤维素膜上，该探针序列设计为通用序列，所述试纸条被固定于PVC底板上，从左往右依次是样品垫、玻璃纤维、NC膜、吸水纸，NC膜上有T线（检测线）和C线（质控线），所述检测线上包被抗标记物b的抗体，所述质控线上包被抗标记物a的抗体；特异探针A系列和特异探针B系列成功地将金标探针和核酸扩增片段串联结合到一块，实现核酸片段的特异检测。本方法对实验人员技术要求低，所需检测时间短，无需特殊的仪器设备，易于向基层及偏远农村医疗机构的推广。
Description
技术领域
本发明涉及医学生物技术，特别涉及一种用胶体金层析技术检测核酸的方法及试剂盒。
背景技术
胶体金技术是上世纪80年代继三大标记技术（荧光素、放射性同位素和酶）后发展起来的固相标记免疫测定技术。最初该方法仅用于免疫电镜技术，但随着生物技术的不断发展，现在已经出现免疫斑点渗滤以及免疫层析技术等。胶体金免疫层析技术已经广泛应用于临床诊断，如早孕、乙肝、寄生虫、性病和病毒细菌的检测。该方法最大的特点是价格低廉、简单快速、特异敏感、不需要任何仪器设备和试剂，几分钟就可用肉眼观察到颜色鲜明的实验结果。
现在市面上应用胶体金免疫层析技术开发出的检测试剂盒绝大部分都是检测某种抗原或抗体，即他们的检测对象都是蛋白质，应用该技术检测病原体核酸的几乎没有。采用金标试纸条检测抗原或抗体时，大多采用的是双夹心法免疫测定原理，先将胶体金颗粒标记在相应病原体抗体或抗原上，检测时若有相应抗原或抗体就会与标金的蛋白结合，结合物沿硝酸纤维膜向前移动，遇到膜上的包被线时就会形成金标抗体-抗原-抗体复合物被固定在该检测线上，形成肉眼可见的富集线。这些单纯以检测蛋白为目标的胶体金试纸条存在很多不足，如所需的大量单克隆抗体昂贵且制备周期长，检测的特异性也不是很高，在缩短检测窗口期、提高病原体检出率方面也不具有优势。
核酸检测技术比起常规的血清学检测具有灵敏度高、特异性强等特点，在缩短检测窗口期、提高病原体检出率方面具有相当的优势，是对免疫学检测方法的重要补充。
目前常用的核酸检测技术是聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction，PCR)。在临床应用中，通过PCR技术获得的扩增产物最初是通过琼脂糖凝胶电泳的方法根据特条带的大小来判断阴阳性，这样操作不仅费时、繁琐、容易产生污染，而且只通过扩增产物大小判断阴阳性特异性也不高。随着分子生物学技术的飞速发展，PCR技术也是日新月异，特别是荧光定量PCR(RealtimefluorescencequantitativePCR，RTFQPCR)的发明，给整个分子诊断行业注入了新的活力。荧光定量PCR技术在临床应用中具有灵敏度高，特异性强等特点，但该技术对实验人员和仪器设备提出了很高的要求。现在市面上很多荧光定量PCR检测试剂盒都指定了专门的仪器设备，这些设备价格昂贵，应用单一；同时，试剂盒操作人员要求有专业的实验技能和知识背景，这样以来，应用荧光定量PCR技术衍生出来的很多核酸检测试剂盒就很难普及到基层医院，为人民的健康谋福利。
PCR是变温核酸扩增技术，与PCR不同的是近些年来恒温扩增技术也逐渐发展应用起来。恒温扩增技术在扩增时所需的温度是不变的，这样就避免了像PCR扩增时温度的上下大幅度浮动。所以恒温扩增技术也降低了仪器的要求，一般的水浴锅就可以满足实验条件。这些核酸恒温扩增技术如：依赖核酸序列的扩增技术（NucleicAcidSequence-basedAmplification，NASBA），依赖解旋酶扩增技术(Helicase-dependentAmplification，HDA)，滚环扩增技术(RollingCircleAmplification，RCA)，环介导等温扩增技术(Loop-mediatedIsothermalAmplification，LAMP），转录介导的扩增技术(TranscriptionMediatedAmplification，TMA)等。这些技术根据不同的原理在某一特定的温度条件下（如42℃）实现特异性核酸DNA或RNA的扩增。无论是采用哪种恒温扩增技术，扩增产物都需要通过一定的技术手段来实现定性检测。如，有人引入分子信标(molecularbeacon)探针实现恒温扩增产物的检测。但是分子信标极不稳定，对溶液离子环境要求特别高，且分子信标信号的检测也需要高端仪器，不利于普及。
如何将胶体金层析技术的快速、操作简单的优点应用于核酸检测？1996年，美国西北大学Mirkin研究组利用纳米金与巯基之间能够形成稳定的Au-S键的性质制备了纳米金-DNA复合纳米探针，可用于检测DNA，纳米金与巯基形成的Au-S键是牢固的共价键。BrittanyA.Rohrman等人用胶体金免疫层析技术成功的检测了HIV病毒核酸扩增产物。他们在实验时，共设计了三种探针，一种探针标记胶体金颗粒，作为特异探针去杂交HIV特异扩增产物，另外两种核酸探针分别包被在检测线和质控线上，用来捕获HIV核酸扩增产物---金标核酸探针复合物和游离的金标核酸探针，从而形成T线和C线。这是胶体金检测核酸的一次成功的例子。但是将核酸探针包被在膜上作为单捕获探针去捕获HIV核酸扩增产物---金标核酸探针复合物效率并不高，必须借助金显色增强液（goldenhancementsolution）来增加显色，提高灵敏度。胶体金在DNA芯片的检测已有相关报道，通常是将目标分子标记上巯基,因胶体金颗粒的表面包围着一层结合力比较弱的带电配体如柠檬酸,这些配体分子很容易被结合力强的巯基基团所取代,因而可以将胶体金连接上目标核酸,然后将标记的目标分子与芯片上的探针杂交实现对其的检测。但这种方法操作繁琐,且每次杂交均需标记特异的靶标分子,不具备通用性。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种检测核酸的胶体金标检测试剂盒，包括：
（1）、通用胶体金试纸条：所用试纸条被固定于PVC底板上，从左往右依次是样品垫、玻璃纤维、NC膜、吸水纸；NC膜上有T线（检测线）和C线（质控线），所述检测线上包被能特异性结合标记物b的物质，所述质控线上包被能特异性结合标记物a的分子，所述标记物b不同于标记物a；通用探针1上标记有胶体金颗粒或同时在另一端标记有标记物a，且固定于试纸条的玻璃纤维素膜上；
（2）、分别盛有特异探针A系列、特异探针B系列的探针管：特异探针A系列的一端和待测核酸杂交，并标记有标记物a，另一端和通用探针1杂交，或当通用探针1既标记有胶体金颗粒又标记有标记物a时，特异探针A系列不带任何标记，特异探针A系列可以有多种，如A1、A2……，分别和待测核酸的不同区域互补配对杂交，装在不同的探针管里；特异探针B系列一端和待测核酸杂交，另一端标记有标记物b，或者当还包括带有标记物b的通用探针2时，其同时和通用探针2互补配对杂交，此时特异探针B系列不带任何标记，特异探针B系列可以有多种，如B1、B2……，分别和待测核酸的不同区域互补配对杂交，分别装在不同的探针管里。
所述标记物a、b可以为抗原或半抗原，如可以为生物素、地高辛或荧光染料（如Cy3、Cy5、Fam、Fit等），则在试纸条上的T线或C线上与它们特异性结合的分子为链霉亲和素、抗地高辛抗体、相应抗荧光染料抗体。
所述通用探针1可以用于所有病原体核酸片段的检测，在设计时必须注重GC%的比例，尽量避免与金颗粒的一些非特异结合；通用探针1和通用探针2还必须注意和其他探针结合部分序列的Tm值，尽量提高在较低温度条件下杂交的有效性，经过实验效果的比较，所公布的通用探针1序列为最优设计序列。所述通用探针1序列为：
5-SH-CATCTTCCAGCGGCCTTATGCAGTTGCTCTCCATTTTTAGAAGGCGTCCGTCTTTGAGGC-3（SeqNo.1），其中SH为巯基，5’端为巯基修饰，也可进行其他化学基团修饰，如-NH2等。
本发明提供一种核酸金标快速检测方法，将胶体金免疫层析技术的操作简单、快速、价格低廉等特点应用到核酸的检测中来。包括如下步骤：
（1）、设计探针：通用探针1、特异探针A系列、特异探针B系列，其中，通用探针1的5’端巯基化修饰（也可进行其他化学基团修饰，如-NH2等）后标记胶体金颗粒，或同时在另一端标记有标记物a；特异探针A系列，其一端和待测核酸杂交，另一端和通用探针1杂交，标记有标记物a，或当通用探针1既标记有胶体金颗粒又标记有标记物a时，特异探针A系列不带任何标记，特异探针A系列可以有多种，如A1、A2……，分别和待测核酸的不同区域互补配对杂交；特异探针B系列一端和待测核酸杂交，另一端标记有标记物b，或者当试剂盒还包括带有标记物b的通用探针2时，其同时和通用探针2互补配对杂交，此时特异探针B系列不带任何标记，特异探针B系列可以有多种，如B1、B2……，分别和待测核酸的不同区域互补配对杂交；
（2）、制备通用试纸条：所述试纸条被固定于PVC底板上，从左往右依次是样品垫、玻璃纤维、NC膜、吸水纸；NC膜上有T线（检测线）和C线（质控线）；所述检测线上包被抗标记物b的抗体，能特异性捕获结合标记物b的通用探针2或结合标记物b的特异探针B系列；所述质控线上包被抗标记物a，能特异性捕获结合标记物a的特异探针A或既标记有胶体金颗粒又标记有标记物a的通用探针1；将通用探针1标记上胶体金颗粒或同时标记上标记物a后固定于玻璃纤维素膜上，将特异探针A、特异探针B或同时加入通用探针2和待测核酸杂交后滴在样品垫上层析，检测线显色表示有待测核酸存在，质控线显色表示检测有效。
所述的标记物b和标记物a可以为地高辛、生物素及其他的抗原或半抗原，如荧光染料（Cy3、Cy5、Fam、Fit），则在试纸条T线或C线上与它们特异性结合的分子为相应的抗地高辛抗体、链霉亲和素或抗荧光染料抗体。
所述的特异探针A系列或通用探针1标记地高辛，特异探针B系列或通用探针2标记生物素，则在试纸条T线处包被链霉亲和素，C线处包被抗地高辛抗体。
所述通用探针1可以用于所有病原体核酸片段的检测，在设计时必须注重GC%的比例，尽量避免与金颗粒的一些非特异结合；通用探针1和通用探针2还必须注意和其他探针结合部分的Tm值，尽量提高在较低温度条件下杂交的有效性，经过实验效果的比较，所公布的通用探针1序列为最优设计序列。所述通用探针1序列为：5-SH-CATCTTCCAGCGGCCTTATGCAGTTGCTCTCCATTTTTAGAAGGCGTCCGTCTTTGAGGC-3（SeqNo.1），其中SH为巯基，5’端为巯基修饰，也可进行其他化学基团修饰，如-NH2（氨基）等。
结合工作原理，对本发明上述方法的工作过程介绍如下：
1、设计四种探针：通用探针1、通用探针2、特异探针A（可以有多种，如A1、A2......）、特异探针B（可以有多种，如B1、B2......）。其中，通用探针1巯基化修饰后标记胶体金颗粒，且可以和特异探针A互补配对杂交；通用探针2标记生物素（Biotin，也可以是其他物质，如地高辛或荧光染料，如Cy3、Cy5、Fam、Fitc等），且可以和特异探针B互补配对杂交；特异探针A系列标记地高辛（也可以是其他物质，如生物素或荧光染料，如Cy3、Cy5、Fam、Fitc等），其一端可以和待测核酸片段杂交，另一端也可以和通用探针1杂交；特异探针B系列一端可以和待测核酸片段杂交，另一端也可以和通用探针2杂交。
2、试纸条上“T线”（检测线）处包被链霉亲和素（该处还可以包被其他物质，但是该物质可以和通用探针2上的标记物结合），可以捕捉通用探针2上的biotin，形成T线；“C线”（质控线）处包被地高辛抗体（也可以是其他物质，如抗体，但该物质必须要和特异探针A系列标记的物质进行结合）用来捕捉游离的标有胶体金的通用探针1--特异探针A系列复合物，形成C线。
3、通用探针1标记胶体金颗粒后，可以和特异探针A系列杂交，形成金颗粒通用探针1--特异探针A地高辛复合物。
4、标有biotin的通用探针2可以和特异探针B系列杂交，形成biotin通用探针2--特异探针B复合物。
5、当有待测核酸片段时，待测核酸片段可以和4中的复合物杂交结合，形成核酸片段--特异探针B--biotin通用探针2复合物。
6、将5中形成的待测核酸片段--特异探针B--biotin通用探针2复合物与3中形成的金颗粒通用探针1--特异探针A地高辛复合物进行杂交结合，形成金颗粒通用探针1--特异探针A地高辛--待测核酸片段--特异探针B--biotin通用探针2复合物。
7、步骤6中得到的胶体金复合物在NC膜上通过毛细现象沿纤维膜向前渗析，当到达T线处，与T线处包被的链霉亲和素结合，从而将6中得到的复合物滞留在T线上，形成肉眼可见的有色条带，此为阳性（如图1）。
8、当待测核酸片段不存在时，就不会发生5～6步，就不能形成金颗粒通用探针1--特异探针A地高辛--待测核酸片段--特异探针B--biotin通用探针2复合物，胶体金颗粒就不能在T线处聚集，就不会形成肉眼可见的条带，此为阴性（如图2）。
9、无论有无待测核酸片段，步骤3中形成的金颗粒通用探针1--特异探针A地高辛复合物都会有富余，则多余的金颗粒通用探针1--特异探针A地高辛复合物会越过T线继续沿着纤维膜向前流动，当到达C线时，与C线处包被的地高辛抗体结合，从而滞留在C线处，形成肉眼可见的有色条带，此为实验结果有效。（如图1所示）
基于上述方法相似的思路，本发明还提供另外一种单通用探针的检测核酸方法，其工作原理如下：
1、设计三种探针：通用探针1、特异探针A（可以有多种，如A1、A2......）、、特异探针B（可以有多种，如B1、B2......）。其中，通用探针1标记胶体金颗粒，且可以和特异探针A系列互补配对杂交；特异探针A系列标记地高辛（也可以是其他物质，如生物素或荧光染料，如Cy3、Cy5、Fam、Fitc等），其一端可以和待测核酸片段杂交，另一端也可以和通用探针1杂交；特异探针B系列标记biotin（也可以是其他物质，如地高辛或荧光染料，如Cy3、Cy5、Fam、Fitc等），其可以和待测核酸片段杂交结合。
2、NC膜上“T线”（检测线）处包被链霉亲和素（该处还可以包被其他物质，但是该物质可以和特异探针B系列上的标记物结合），可以捕捉特异探针B系列上的biotin，形成T线；“C线”（质控线）处包被地高辛抗体（也可以是其他物质，如抗体，但该物质必须要和特异探针A系列标记的物质进行结合）用来捕捉游离的标有胶体金的通用探针--特异探针A系列复合物，形成C线。
3、通用探针1标记胶体金颗粒后，可以和特异探针A系列杂交，形成金颗粒通用探针1--特异探针A地高辛复合物。
4、当有待测核酸片段时，待测核酸片段可以和标有biotin的特异探针B系列杂交结合，形成待测核酸片段--特异探针B--biotin复合物。
5、将4中形成的待测核酸片段--特异探针B--biotin复合物与3中形成的金颗粒通用探针1--特异探针A地高辛复合物进行杂交结合，形成金颗粒通用探针1--特异探针A地高辛--待测核酸片段--特异探针B--biotin复合物。
6、步骤5中得到的胶体金复合物在溶液中通过毛细现象沿纤维膜向前流动，当流到T线处，与T线处包被的链霉亲和素结合，从而将5中得到的复合物滞留在T线上，形成肉眼可见的有色条带，此为阳性（如图3）。或者，
7、当待测核酸不存在时，就不会发生4～6步，就不能形成金颗粒通用探针1--特异探针A地高辛--待测核酸--特异探针B--biotin复合物，胶体金颗粒就不能再T线处聚集，就不会形成肉眼可见的条带，此为阴性（如图4）。
8、无论有无待测核酸，步骤3中形成的金颗粒通用探针--特异探针A地高辛复合物都会有富余，则多余的金颗粒通用探针1--特异探针A地高辛复合物会越过T线继续沿着纤维膜向前流动，当到达C线时，与C线处包被的地高辛抗体结合，从而滞留在C线处，形成肉眼可见的有色条带，此为实验结果有效。（如图3所示）
基于上述方法相似的思路，本发明还提供另外一种单通用探针的检测核酸方法，其工作原理如下：
1、设计三种探针：通用探针1、特异探针A（可以有多种，如A1、A2......）、特异探针B（可以有多种，如B1、B2......）。其中，通用探针1标记地高辛（也可以是其他物质，如生物素或荧光染料，如Cy3、Cy5、Fam、Fitc等）后再标记胶体金颗粒，且可以和特异探针A系列互补配对杂交；特异探针A系列其一端可以和待测核酸杂交，另一端也可以和通用探针1杂交；特异探针B系列标记biotin（也可以是其他物质，如地高辛或荧光染料，如Cy3、Cy5、Fam、Fitc等），可以和待测核酸杂交。
2、NC膜上“T线”（检测线）处包被链霉亲和素（该处还可以包被其他物质，但是该物质可以和特异探针B系列上的标记物结合），可以捕捉特异探针B系列上的biotin，形成T线；“C线”（质控线）处包被地高辛抗体（也可以是其他物质，如抗体，但该物质必须要和通用探针标记的物质进行结合）用来捕捉游离的标有胶体金的通用探针1，形成C线。
3、通用探针标记胶体金颗粒后，可以和特异探针A系列杂交，形成地高辛--金颗粒通用探针1--特异探针A复合物。
4、当有待测核酸时，待测核酸可以和标有biotin的特异探针B系列杂交结合，形成待测核酸--特异探针B--biotin复合物。
5、将4中形成的待测核酸--特异探针B--biotin复合物与3中形成的地高辛--金颗粒通用探针1--特异探针A复合物进行杂交结合，形成地高辛--金颗粒通用探针1--特异探针A--待测核酸--特异探针B--biotin复合物。
6、步骤5中得到的胶体金复合物在溶液中通过毛细现象沿纤维膜向前流动，当流到T线处，特异探针B系列上的biotin与T线处包被的链霉亲和素结合，从而将5中得到的复合物滞留在T线上，形成肉眼可见的有色条带，此为阳性（如图5）。或者，
7、当待测核酸不存在时，就不会发生4～5步，就不能形成地高辛--金颗粒通用探针1--特异探针A--待测核酸--特异探针B--biotin复合物，胶体金颗粒就不能再T线处聚集，就不会形成肉眼可见的条带，此为阴性。（如图6）
8、无论有无待测核酸，地高辛--金颗粒通用探针1都会有富余，则多余的地高辛--金颗粒通用探针1会越过T线继续沿着纤维膜向前流动，当到达C线时，与C线处包被的地高辛抗体结合，从而滞留在C线处，形成肉眼可见的有色条带，此为实验结果有效。（如图5所示）
本发明的核酸快速检测方法，巧妙的结合了胶体金技术检测的快速、简便等优点。本发明方法最大的特点在于将胶体金颗粒直接标记在核酸探针上，且标记的核酸探针序列设计为通用序列，该通用序列直接和特异探针序列结合。通用探针的引入可以直接应用于不同病原体核酸的检测，这就避免了检测不同病原体核酸时针对每种病原体都要将探针进行标金的麻烦，有了标金的通用探针后，在检测不同病原体时只需设计不同的特异探针即可。标记生物素的通用探针2也有上述标记胶体金的通用探针1的相同作用。本发明中还引入了生物素、地高辛等标记物（统称为抗原或半抗原）。生物素可以和链霉亲和素结合，地高辛可以和抗地高辛抗体结合，两者都是特异性结合，且结合力强。在检测线和质控线处包被了抗标记物的抗体，和标记胶体金的通用探针1一起构成检测核酸的通用试纸条，从而提高效率降低成本。另外，这些抗原或半抗原标记物的引入，成功的将核酸杂交复合物（特异探针-病原体核酸-特异探针复合物）转化成具有免疫原性的分子复合物，该具有免疫原性的分子复合物就可以灵敏地被通用试纸条检测到。
本发明在检测一种病原体核酸时，设计两套特异探针，即特异探针A和特异探针B。两套探针的使用，其中任何一套探针不能够和病原体核酸匹配杂交，都不能够形成被试纸条检出的复合物，也就出现不了阳性检测结果，保证了检测的特异性。其中每套探针都可以设计两条以上，这样的设计又有利于提高试纸条的灵敏度。在本发明中设计时引入的特异探针A和特异探针B有桥分子成分的作用，两种探针成功的将金标探针和待检核酸片段串联结合到一块，实现核酸片段的特异检测。桥分子的引入避开了金标探针直接去杂交结合待检核酸片段，这样可以根据待检核酸片段的不同区域，多设计一些特异探针A，实现一条待检核酸片段结合多条金标探针，大大提高检测灵敏度。
本发明可以作为一项检测核酸特异扩增物的通用技术，应用本发明的检测方法和检测试剂盒可广泛应用于各种病原体核酸的检测。常见的病原体有寄生虫、真菌、细菌、病毒、支原体以及衣原体等，针对这些病原体只要设计不同的特异检测探针，都可以用本方法检测到。因为本方法检测核酸的通用性，自然也有着十分广泛的应用。本发明方法可以应用于临床传染性疾病病原体的检测，如引起呼吸道疾病的病原体（如流感病毒、合胞病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体等）、性病病原体（如艾滋病毒、淋球菌等）以及手足口病病原体（如肠道病毒）等。本发明方法和试纸条可以应用于农业、牧业、进出口检验检疫、食品工业、产前检查以及法医鉴定等方方面面。
本发明首次将通用核酸直接标金技术应用于核酸特异扩增物的检测，提供通用试纸条，具有其独特的优点：
检测特异性强：本发明方法引入两套特异检测探针，可准确检测核酸扩增物；
灵敏度高：本发明方法引入的特异检测探针有两套，每套特异探针可以设计两条以上，使核酸检测试纸条灵敏度大大提高；
操作简单，技术要求低：只需将检测物特异核酸扩增物滴到核酸检测试纸上即可，对实验人员技术要求低，可广泛应用于基层及偏远农村医疗机构；
结果判读简单，无需特殊仪器：通过试纸条检测核酸，可直接肉眼观察结果，结果判读直观，无需借助特殊仪器；
检测结果快速，耗时短：通过试纸条检测核酸，只需10min左右即可进行结果判读。
价格便宜，检测成本低：该方法虽为检测核酸，但费用远比现有的荧光定量和基因芯片的费用低。
附图说明
图1为用胶体金层析技术（通用探针1、2、特异探针A、B）检测待测核酸阳性结果的原理示意图
图2为用胶体金层析技术（通用探针1、2、特异探针A、B）检测待测核酸阴性结果的原理示意图
图3为用胶体金层析技术（仅标记金颗粒的通用探针1、特异探针A、B）检测待测核酸阳性结果的原理示意图
图4为用胶体金层析技术（仅标记金颗粒的通用探针1、特异探针A、B）检测待测核酸阴性结果的原理示意图
图5为用胶体金层析技术（既标记地高辛又标记金颗粒的通用探针1、特异探针A、B）检测待测核酸阳性结果的原理示意图
图6为用胶体金层析技术（既标记地高辛又标记金颗粒的通用探针1、特异探针A、B）检测待测核酸阴性结果的原理示意图
图7为核酸检测通用试纸条的组装结构图
图8为用胶体金层析技术检测呼吸道合胞病毒核酸阳性、阴性结果图
图9为用胶体金层析技术检测副流感病毒Ⅲ型核酸阳性、阴性结果图
图10为用胶体金层析技术检测肺炎衣原体核酸阳性、阴性结果图。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室指南》第3版（NewYork:ColdSpringHarborlaboratoryPress,2005)中所述的条件进行。
【实施例1】通用核酸探针标记胶体金颗粒
1、设计巯基化的通用探针序列：
5’-SH-CATCTTCCAGCGGCCTTATGCAGTTGCTCTCCATTTTTAGAAGGCGTCCGTCTTTGAGGC-3’，（SeqNo.1）
2、将设计好的通用探针（终浓度0.1mM）加入到TCEP-HCl（终浓度100mM）中，还原巯基化DNA通用探针；
3、将处理后的通用探针加入到30nm直径颗粒的胶体金液中，室温过夜孵
育。
4、加入2%SDS液使其终浓度为0.01%，室温孵育30min。
5、向溶液中逐滴加入2M的NaCl，至终浓度为0.15M。
6、离心纯化金标核酸探针：15000rpm离心15min，沉淀用洗涤液（0.15M
NaCl，0.01%SDS）洗四次，胶体金沉淀重悬于重悬液（0.15MNaCl，5%BSA，
0.25%Tween，10%蔗糖）中，既得标记好的通用核酸探针标记胶体金颗
粒。
【实施例2】核酸检测试纸条的制备
在制备核酸检测试纸条时需要的主要原材料：玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜（NC膜）、样本垫、PVC底板等。
1、胶体金垫的制备：将玻璃纤维膜切割成0.5×1cm见方小模块，每个模块上用枪均匀滴加10μl的标金核酸探针液，室温使之干燥，封闭保存备用。
2、喷膜：
检测线（T线）：亲和素（约0.5~1.0mg/ml），喷膜量：1.5~3μl/cm；
质控线（C线）：抗地高辛抗体（约0.5~1.0mg/ml），喷膜量：1.5~3μl/cm；
喷膜完毕后，将膜条放于37℃洁净恒温箱内干燥5~6小时，存于干燥环境中备用。
3、试纸条组装
分别裁取2cm长的吸水纸、包被好的NC膜、吸附金标探针的玻璃纤维膜、样品垫从上到下依次固定于PVC底板上，即成检测试纸条。试纸条的组装结构图如图7。
【实施例3】通用核酸探针直接标金法（双通用探针），检测呼吸道合胞病毒（RSV）T7线性扩增产物
扩增RSV核酸的引物序列：
R引物：5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGAATGCAGGTGTAACTACACCTGTAAG-3’
F引物：5’-GTGGTAATTGTACTACATATGCTAAG-3’
检测RSV的特异探针A序列为：
5’-Dig-ATCATTGATTAATGATTTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTCT-3’
检测RSV的特异探针B1、B2（两条）为：
5’-TTAACATATAAGTGCTTTTTGGCCTCTAAGTCGTAGCCCA-3’
5’-TACAGGTGTAGTTACATTTTGGCCTCTAAGTCGTAGCCCA-3’
标有生物素的通用探针2序列为：
5’-Biotin-TGGGCTACGACTTAGAGGCC-3’
a、T7线性扩增呼吸道合胞病毒核酸：
| 组分 | 体积（μl） |
| 呼吸道合胞病毒核酸（或裂解物） | 2 |
| 扩增反应液：含dNTPs、NTPs、引物R&F以及各种盐离子 | 17 |
| 合计 | 19 |
95℃，2min，42℃，2min后加扩增酶混合液（AMV&T7聚合酶&RNaseH）1μl，在42℃反应45min后，待检。
b、检测a中的呼吸道合胞病毒特异扩增产物：
扩增产物：10μl
标有生物素的通用探针2（1μM）：1μl
标有Dig的特异探针A（5μM）：1μl
特异探针B1（5μM）：1μl
特异探针B2（5μM）：1μl
层析液（含5%甲酰胺的4×SSC）至总体积100μl
42℃10min后点在试纸条上5~10min后观察结果（如图8）。
【实施例4】通用核酸探针直接标金法（单通用探针），检测人副流感病毒（PIV3）T7线性扩增产物
扩增PIV3核酸的引物序列：
R引物：5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGAACAACAATGCATACAATATTGTC-3’
F引物：5’-GATTAATTCTGTGATTGTCTCT-3’
检测PIV3的特异探针A序列为：
5’-Dig-GTCTCTTTGATTGTTTTTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTCT-3’
检测PIV3标有生物素的特异探针B1、B2（两条）为：
5’-Biotin-TGGGCTACGACTTAGAGGCCTTTTGGAGGATACTGTCATG-3’
5’-Biotin-TGGGCTACGACTTAGAGGCCTTTTATATTCGTTTTCATAC-3’
a、T7线性扩增人副流感病毒（PIV3）核酸：
| 组分 | 体积（μl） |
| PIV3核酸（或裂解物）： | 2 |
| 扩增反应液：含dNTPs、NTPs、引物R&F以及各种盐离子 | 17 |
| 合计 | 19 |
95℃，2min，42℃，2min后加扩增酶混合液（AMV&T7聚合酶&RNaseH）1μl，在42℃反应45min后，待检。
b、检测a中的人PIV3特异扩增产物
扩增产物：10μl
标有Dig的特异探针A（5μM）：1μl
标有生物素的特异探针B1（1μM）：1μl
标有生物素的特异探针B2（1μM）：1μl
层析液（含5%甲酰胺的4×SSC）至总体积100μl
42℃10min后点在试纸条上5~10min后观察结果（如图9）。
【实施例5】标记上地高辛的通用探针直接标金法（单通用探针），检测肺炎衣原体（Cpn）T7线性扩增产物
扩增Cpn核酸的引物序列：
R引物：5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGAACACTACATTCGGTATTAGCGATC-3’
F引物：5’-CTGAGAATTTGATCTTGGTTCAGAT-3’
标记上地高辛的金标通用探针：
5’-SH-CATCTTCCAGCGGCCTTATGCAGTTGCTCTCCATTTTTAGAAGGCGTCCGTCTTTGAGGC-Dig-3’
检测Cpn的特异探针A序列为：
5’-CTGAGAATTTGATCTTTTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTCT-3’
检测Cpn标有生物素的特异探针B1、B2（两条）为：
5’-Biotin-TGGGCTACGACTTAGAGGCCTTTTGAATAATGACTTCGGT-3’
5’-Biotin-TGGGCTACGACTTAGAGGCCTTTTAAGGGTTAGTAATACA-3’
a、T7线性扩增肺炎衣原体核酸：
| 组分 | 体积（μl） |
| 肺炎衣原体核酸（或裂解物） | 2 |
| 扩增反应液：含dNTPs、NTPs、引物R&F以及各种盐离子 | 17 |
| 合计 | 19 |
95℃，2min，42℃，2min后不加扩增酶混合液（AMV&T7聚合酶&RNaseH）1μl，分别在42℃反应45min后，待检。
b、用通用核酸探针直接标金法检测a中得到的肺炎衣原体特异扩增产物：
扩增产物：10μl
特异探针A（5μM）：1μl
标有生物素的特异探针B1（1μM）：1μl
标有生物素的特异探针B2（1μM）：1μl
层析液（含5%甲酰胺的4×SSC）至总体积100μl
42℃10min后点在试纸条上5~10min后观察结果（如图10）。
SEQUENCELISTING
<110>武汉中帜生物科技股份有限公司
<120>一种用胶体金层析技术检测核酸的方法及试剂盒
<130>1
<160>17
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>60
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>通用探针1
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>5'端为巯基修饰或氨基修饰
<400>1
catcttccagcggccttatgcagttgctctccatttttagaaggcgtccgtctttgaggc60
<210>2
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<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>扩增RSV核酸的R引物
<400>2
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<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>扩增RSV核酸的F引物
<400>3
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<211>42
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>检测RSV的特异探针A
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>5'端Dig修饰
<400>4
atcattgattaatgatttttgcctcaaagacggacgccttct42
<210>5
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<212>DNA
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<220>
<223>检测RSV的特异探针B1
<400>5
ttaacatataagtgctttttggcctctaagtcgtagccca40
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<211>40
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>检测RSV的特异探针B2
<400>6
tacaggtgtagttacattttggcctctaagtcgtagccca40
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>标有生物素的通用探针2
<220>
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<222>(1)..(1)
<223>5'端标记Bio
<400>7
tgggctacgacttagaggcc20
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<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>扩增PIV3核酸的R引物
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<210>9
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<213>Artificial
<220>
<223>扩增PIV3核酸的F引物
<400>9
gattaattctgtgattgtctct22
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<211>42
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>检测PIV3的特异探针A
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<222>(1)..(1)
<223>5’端Dig修饰
<400>10
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<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>检测PIV3的特异探针B1
<220>
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<222>(1)..(1)
<223>5'端标记Bio
<400>11
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<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>检测PIV3的特异探针B2
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>5'端标记Bio
<400>12
tgggctacgacttagaggccttttatattcgttttcatac40
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<223>扩增Cpn核酸的R引物
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<223>扩增Cpn核酸的F引物
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<220>
<223>检测Cpn的特异探针A序列
<400>15
ctgagaatttgatcttttttgcctcaaagacggacgccttct42
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<213>Artificial
<220>
<223>检测Cpn的特异探针B1
<220>
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<222>(1)..(1)
<223>5'端标记Biotin
<400>16
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<213>Artificial
<220>
<223>检测Cpn的特异探针B2
<220>
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<222>(1)..(1)
<223>5'端标记Biotin
<400>17
tgggctacgacttagaggccttttaagggttagtaataca40
Claims (8)
1.一种检测核酸的胶体金标检测试剂盒，包括：
（1）、通用胶体金试纸条：所用试纸条被固定于PVC底板上，从左往右依次是样品垫、玻璃纤维、NC膜、吸水纸；NC膜上有T线（检测线）和C线（质控线），所述检测线上包被能特异性结合标记物b的物质，所述质控线上包被能特异性结合标记物a的分子，所述标记物b不同于标记物a；通用探针1上标记有胶体金颗粒或同时在另一端标记有标记物a，且固定于试纸条的玻璃纤维素膜上；
（2）、分别盛有特异探针A系列、特异探针B系列的探针管：特异探针A系列的一端和待测核酸杂交，并标记有标记物a，另一端和通用探针1杂交，或当通用探针1既标记有胶体金颗粒又标记有标记物a时，特异探针A系列不带任何标记，特异探针A系列可以有多种，如A1、A2……，分别和待测核酸的不同区域互补配对杂交，装在不同的探针管里；特异探针B系列一端和待测核酸杂交，另一端标记有标记物b，或者当试剂盒中还包括带有标记物b的通用探针2时，其同时和通用探针2互补配对杂交，此时特异探针B系列不带任何标记，特异探针B系列可以有多种，如B1、B2……，分别和待测核酸的不同区域互补配对杂交，分别装在不同的探针管里。
2.根据权利要求1所述的检测核酸的胶体金标检测试剂盒，其特征在于：所述标记物a、b可以为抗原或半抗原，如生物素、地高辛或荧光染料，其中荧光染料可以为Cy3、Cy5、Fam、Fit等，则在试纸条上的T线或C线上与它们特异性结合的分子为链霉亲和素、抗地高辛抗体、相应抗荧光染料抗体。
3.根据权利要求3所述的检测核酸的胶体金标检测试剂盒，其特征在于：所述的特异探针A系列标记地高辛，通用探针2标记生物素，则在试纸条T线处包被链霉亲和素，C线处包被抗地高辛抗体。
4.权利要求1-3任一项所述的检测核酸的胶体金标检测试剂盒在病原体核酸检测中的应用，其特征在于：所述的病原体是寄生虫、真菌、细菌、病毒、支原体以及衣原体。
5.根据权利要求1-3任一项所述的检测核酸的胶体金标检测试剂盒，其特征在于：所述通用探针1序列为：5’-SH-CATCTTCCAGCGGCCTTATGCAGTTGCTCTCCATTTTTAGAAGGCGTCCGTCTTTGAGGC-3’（SeqNo.1），其中SH为巯基，5’端为巯基修饰，也可进行其他化学基团修饰，如-NH2。
6.一种核酸金标快速检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）、设计探针：通用探针1、特异探针A系列、特异探针B系列，其中，通用探针1的5’端巯基化修饰，也可进行其他化学基团修饰，如-NH2，然后标记胶体金颗粒，或同时在另一端标记有标记物a；特异探针A系列，其一端和待测核酸杂交，另一端和通用探针1杂交，标记有标记物a，或当通用探针1既标记有胶体金颗粒又标记有标记物a时，特异探针A系列不带任何标记，特异探针A系列可以有多种，如A1、A2……，分别和待测核酸的不同区域互补配对杂交；特异探针B系列一端和待测核酸杂交，另一端标记有标记物b，或者当试剂盒还包括带有标记物b的通用探针2时，其同时和通用探针2互补配对杂交，此时特异探针B系列不带任何标记，特异探针B系列可以有多种，如B1、B2……，分别和待测核酸的不同区域互补配对杂交；
（2）、制备通用试纸条：所述试纸条被固定于PVC底板上，从左往右依次是样品垫、玻璃纤维、NC膜、吸水纸；NC膜上有T线（检测线）和C线（质控线）；所述检测线上包被抗标记物b的抗体，能特异性捕获结合标记物b的通用探针2或结合标记物b的特异探针B系列；所述质控线上包被抗标记物a，能特异性捕获结合标记物a的特异探针A或既标记有胶体金颗粒又标记有标记物a的通用探针1；将通用探针1标记上胶体金颗粒或同时标记上标记物a后固定于玻璃纤维素膜上，将特异探针A、特异探针B或同时加入通用探针2和待测核酸杂交后滴在样品垫上层析，检测线显色表示有待测核酸存在，质控线显色表示检测有效。
7.根据权利要求6所述的核酸金标快速检测方法，其特征在于：所述的标记物b和标记物a可以为地高辛、生物素及其他的抗原或半抗原，如荧光染料（Cy3、Cy5、Fam、Fit），则在试纸条T线或C线上与它们特异性结合的分子为相应的抗地高辛抗体、链霉亲和素或抗荧光染料抗体。
8.根据权利要求6-7所述的核酸金标快速检测方法，其特征在于：所述的特异探针A系列标记地高辛，通用探针2标记生物素，则在试纸条T线处包被链霉亲和素，C线处包被抗地高辛抗体。
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| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105301237A (zh) |
Cited By (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106970076A (zh) * | 2017-04-17 | 2017-07-21 | 西安交通大学 | 一种用于TNF‑α检测的半定量核酸适配体试纸条及其制备方法 |
| CN109070130A (zh) * | 2016-04-11 | 2018-12-21 | 亚普蒂恩（B V I）公司 | 用于标记纤维素产品的方法 |
| CN109642869A (zh) * | 2016-04-15 | 2019-04-16 | 伯克利之光生命科技公司 | 用于坞内测定的方法、系统和试剂盒 |
| CN110878369A (zh) * | 2019-12-19 | 2020-03-13 | 武汉中帜生物科技股份有限公司 | 一种基于rna恒温扩增-金探针层析技术检测淋病奈瑟菌核酸的试剂盒及其应用 |
| CN110923362A (zh) * | 2019-12-19 | 2020-03-27 | 武汉中帜生物科技股份有限公司 | 用于同时检测单纯疱疹病毒i型/ii型胶体金层析试剂盒及其应用 |
| CN110923344A (zh) * | 2019-12-19 | 2020-03-27 | 武汉中帜生物科技股份有限公司 | 金黄色葡萄球菌及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因mecA检测试剂盒及其应用 |
| CN110938710A (zh) * | 2019-12-19 | 2020-03-31 | 武汉中帜生物科技股份有限公司 | 一种轮状病毒和肠道腺病毒联合检测胶体金层析试剂盒及其应用 |
| CN110951918A (zh) * | 2019-12-19 | 2020-04-03 | 武汉中帜生物科技股份有限公司 | 一种基于rna恒温扩增-金探针层析技术联合检测甲、乙型流感病毒的试剂盒及其应用 |
| CN111172242A (zh) * | 2019-12-19 | 2020-05-19 | 武汉中帜生物科技股份有限公司 | 一种基于双扩增技术联合检测甲、乙型流感病毒的试剂盒及其应用 |
| CN111381023A (zh) * | 2020-03-16 | 2020-07-07 | 廖世奇 | 一种适配体快速筛查呼气中病原体的方法及系统 |
| CN111500780A (zh) * | 2020-05-07 | 2020-08-07 | 安徽科技学院 | 一种检测新型冠状病毒的试剂盒及其制备方法 |
| CN111575406A (zh) * | 2020-05-14 | 2020-08-25 | 张阳 | 基于核酸恒温扩增的新型冠状病毒快速筛查方法与试剂盒 |
| CN112881672A (zh) * | 2021-01-11 | 2021-06-01 | 南京钟鼎生物技术有限公司 | 通用型多核酸产物检测胶体金试纸条及其制备方法和应用 |
| CN113687066A (zh) * | 2021-09-16 | 2021-11-23 | 固安北吉生物科技有限公司 | 一种基于crispr系统的分子侧向层析检测方法及检测试纸条 |
| CN114113632A (zh) * | 2021-12-03 | 2022-03-01 | 河南省农业科学院动物免疫学重点实验室 | 一种通用型动物疫病抗体检测免疫层析方法与应用 |
| CN115389760A (zh) * | 2022-10-27 | 2022-11-25 | 艾康生物技术(杭州)有限公司 | 用于免疫分析试条的检测试剂 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050227275A1 (en) * | 2004-04-07 | 2005-10-13 | Access Bio, Inc. | Nucleic acid detection system |
| CN1811447A (zh) * | 2006-02-08 | 2006-08-02 | 杭州优思达生物技术有限公司 | 核酸薄膜层析快速检测方法及其试纸条及其用途 |
| CN101358231A (zh) * | 2007-07-31 | 2009-02-04 | 上海翼和应用生物技术有限公司 | 一种通用荧光标记探针在pcr-ldr基因单核苷酸多态性芯片上的应用 |
| CN101603077A (zh) * | 2008-06-11 | 2009-12-16 | 北京大学 | 一种通用分子信标核酸探针及其检测dna的方法 |
| CN103276066A (zh) * | 2013-05-17 | 2013-09-04 | 武汉中帜生物科技有限公司 | 一种核酸检测试剂盒和多生物素信号放大检测核酸的方法 |
| CN103555834A (zh) * | 2013-10-22 | 2014-02-05 | 中国海洋大学 | 盒形藻的检测探针 |
| CN103642924A (zh) * | 2013-12-10 | 2014-03-19 | 华南师范大学 | 基于非对称pcr结合试纸条平台快速鉴别食品致病菌亚型的方法和试剂盒 |
-
2015
- 2015-10-12 CN CN201510658991.7A patent/CN105301237A/zh active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050227275A1 (en) * | 2004-04-07 | 2005-10-13 | Access Bio, Inc. | Nucleic acid detection system |
| CN1811447A (zh) * | 2006-02-08 | 2006-08-02 | 杭州优思达生物技术有限公司 | 核酸薄膜层析快速检测方法及其试纸条及其用途 |
| CN101358231A (zh) * | 2007-07-31 | 2009-02-04 | 上海翼和应用生物技术有限公司 | 一种通用荧光标记探针在pcr-ldr基因单核苷酸多态性芯片上的应用 |
| CN101603077A (zh) * | 2008-06-11 | 2009-12-16 | 北京大学 | 一种通用分子信标核酸探针及其检测dna的方法 |
| CN103276066A (zh) * | 2013-05-17 | 2013-09-04 | 武汉中帜生物科技有限公司 | 一种核酸检测试剂盒和多生物素信号放大检测核酸的方法 |
| CN103555834A (zh) * | 2013-10-22 | 2014-02-05 | 中国海洋大学 | 盒形藻的检测探针 |
| CN103642924A (zh) * | 2013-12-10 | 2014-03-19 | 华南师范大学 | 基于非对称pcr结合试纸条平台快速鉴别食品致病菌亚型的方法和试剂盒 |
Cited By (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109070130B (zh) * | 2016-04-11 | 2022-03-22 | 亚普蒂恩（B V I）公司 | 用于标记纤维素产品的方法 |
| CN109070130A (zh) * | 2016-04-11 | 2018-12-21 | 亚普蒂恩（B V I）公司 | 用于标记纤维素产品的方法 |
| CN109642869A (zh) * | 2016-04-15 | 2019-04-16 | 伯克利之光生命科技公司 | 用于坞内测定的方法、系统和试剂盒 |
| CN109642869B (zh) * | 2016-04-15 | 2022-04-12 | 伯克利之光生命科技公司 | 用于坞内测定的方法、系统和试剂盒 |
| CN106970076A (zh) * | 2017-04-17 | 2017-07-21 | 西安交通大学 | 一种用于TNF‑α检测的半定量核酸适配体试纸条及其制备方法 |
| CN111172242B (zh) * | 2019-12-19 | 2023-06-02 | 武汉中帜生物科技股份有限公司 | 一种基于双扩增技术联合检测甲、乙型流感病毒的试剂盒及其应用 |
| CN110878369A (zh) * | 2019-12-19 | 2020-03-13 | 武汉中帜生物科技股份有限公司 | 一种基于rna恒温扩增-金探针层析技术检测淋病奈瑟菌核酸的试剂盒及其应用 |
| CN110951918A (zh) * | 2019-12-19 | 2020-04-03 | 武汉中帜生物科技股份有限公司 | 一种基于rna恒温扩增-金探针层析技术联合检测甲、乙型流感病毒的试剂盒及其应用 |
| CN111172242A (zh) * | 2019-12-19 | 2020-05-19 | 武汉中帜生物科技股份有限公司 | 一种基于双扩增技术联合检测甲、乙型流感病毒的试剂盒及其应用 |
| CN110938710A (zh) * | 2019-12-19 | 2020-03-31 | 武汉中帜生物科技股份有限公司 | 一种轮状病毒和肠道腺病毒联合检测胶体金层析试剂盒及其应用 |
| CN110878369B (zh) * | 2019-12-19 | 2023-09-05 | 武汉中帜生物科技股份有限公司 | 一种基于rna恒温扩增-金探针层析技术检测淋病奈瑟菌核酸的试剂盒及其应用 |
| CN110938710B (zh) * | 2019-12-19 | 2023-09-05 | 武汉中帜生物科技股份有限公司 | 一种轮状病毒和肠道腺病毒联合检测胶体金层析试剂盒及其应用 |
| CN110951918B (zh) * | 2019-12-19 | 2023-09-05 | 武汉中帜生物科技股份有限公司 | 一种基于rna恒温扩增-金探针层析技术联合检测甲、乙型流感病毒的试剂盒及其应用 |
| CN110923362B (zh) * | 2019-12-19 | 2023-06-06 | 武汉中帜生物科技股份有限公司 | 用于同时检测单纯疱疹病毒i型/ii型胶体金层析试剂盒及其应用 |
| CN110923344A (zh) * | 2019-12-19 | 2020-03-27 | 武汉中帜生物科技股份有限公司 | 金黄色葡萄球菌及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因mecA检测试剂盒及其应用 |
| CN110923362A (zh) * | 2019-12-19 | 2020-03-27 | 武汉中帜生物科技股份有限公司 | 用于同时检测单纯疱疹病毒i型/ii型胶体金层析试剂盒及其应用 |
| CN111381023A (zh) * | 2020-03-16 | 2020-07-07 | 廖世奇 | 一种适配体快速筛查呼气中病原体的方法及系统 |
| CN111500780A (zh) * | 2020-05-07 | 2020-08-07 | 安徽科技学院 | 一种检测新型冠状病毒的试剂盒及其制备方法 |
| CN111575406A (zh) * | 2020-05-14 | 2020-08-25 | 张阳 | 基于核酸恒温扩增的新型冠状病毒快速筛查方法与试剂盒 |
| CN112881672A (zh) * | 2021-01-11 | 2021-06-01 | 南京钟鼎生物技术有限公司 | 通用型多核酸产物检测胶体金试纸条及其制备方法和应用 |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
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