CN105543340A - 一种羊肉源性成分核酸的恒温扩增检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种羊肉源性成分核酸的恒温扩增检测试剂盒及检测方法，该试剂盒包含恒温扩增反应液、阳性对照和阴性对照；本发明的检测试剂盒特异性高、灵敏度高；核酸扩增反应全部恒定同一温度，恒温扩增仅需30分钟，核酸试纸条检测结果需1-2分钟，全程从接受样品到获得结果整个检测过程仅需40分钟左右，且整个反应过程只需一个恒温仪器，特别适合羊肉源性成分核酸的现场快速检测。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种针对羊肉源性成分核酸的恒温扩增快速检测技术，适合对羊肉源性成分核酸的现场快速定性检测。
(二)背景技术
近年来，肉制品掺假成为社会广泛关注的食品安全问题。2013年，涉及欧洲16国的“马肉风波”震惊了整个欧洲。在我国，媒体也屡屡曝光了多起“挂羊头卖狗肉”的肉类掺假掺杂事件，其中羊肉的掺假事件最为常见。在农贸市场及个别不法商家或个人使用相对廉价的猪肉、鸭肉等低价肉类原料和少量牛羊脂肪、下脚料混合在一起，冒充羊肉制品进行销售以谋取高额利益，这种掺假行为不仅涉及营养价值和食品安全等问题，还严重侵犯了消费者合法权益。
目前，普通PCR及实时荧光定量PCR是肉制品品种鉴别最常用的方法，普通PCR法存在耗时长，操作繁琐，灵敏度不够，容易产生交叉污染等缺点。实时荧光PCR法则有成本昂贵，耗时长，技术要求高，需要大型的仪器设备等缺点，因此其应用仍存在一定的局限性。恒温扩增技术是继PCR技术后近年发展起来的一种新的体外核酸扩增技术，本发明技术研制了恒温扩增羊肉源性成分核酸，并结合核酸试纸条显色来判定检测结果，且整个反应过程不打开反应管盖子，试纸条流动检测过程密闭，杜绝了核酸扩增产物污染外界的可能性。研究表明该羊肉源性成分核酸的恒温扩增-核酸试纸条检测方法具有特异性强、敏感度高、对仪器要求简单、检测时间短等优点，所以非常适用在基层检验机构使用，同时在农贸市场的现场检测上也具有很好的应用前景。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种准确、灵敏、快速地检测羊肉源性成分核酸的恒温扩增检测试剂盒及其检测方法。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种羊肉源性成分核酸的恒温扩增检测试剂盒，所述试剂盒包括如下组成：
(1)恒温扩增反应液，包括：正向外围引物、反向外围引物、一条探针、两条环引物、两条交叉扩增引物、1×Thermolbuffer、MgSO4、dNTPs溶液、BstDNA聚合酶和无菌双蒸水；其中：
所述的外围引物分别为：
正向外围引物为：5′-GCAAACCCACTTAACACTC-3′(SEQIDNO.2)；
反向外围引物为：5′-AGGTCGGCTACTAGGATTC-3′(SEQIDNO.3)；
所述两条环引物的序列分别为：
正向：5′端Biotin标记探针5′-Biotin-
GCGTACGCAAATAGGAAGTATCA-3′(SEQIDNO.4)；
反向：5′-ACATCAAAGCAACGGAGCATAA-3′(SEQIDNO.5)；
所述两条扩增交叉引物分别为：
扩增正向引物：
5′-GGACTCCTCCTAGTTTATTAGGGATCCCTCACATCAAACCTGAA-3′(SEQIDNO.6)；
扩增反向引物：
5′-GTCCTAGTAATTATACCCCTCCTCCATTGACTGATTGGTCGGAAT-3′(SEQIDNO.7)；
5′端Fitc标记探针：5′-Fitc-TCGCCCTAATCCTCTCAATCCT-3′(SEQIDNO.8)；
(2)阳性对照：含有羊属特异性的Cytb基因片段的DNA质粒；
(3)阴性对照：无菌双蒸水。
进一步，本发明所述的1×Thermolbuffer组成为：20mM的Tris-HCl、10mM的KCl、10mM的(NH4)2SO4、2mM的MgSO4以及质量浓度为0.1％的TritonX-100，pH8.8。
进一步，本发明所述阳性对照为含有长221bp的羊属特异性的Cytb基因序列的片段，所述片段的核苷酸序列如下(SEQIDNO.1)：
GCAAACCCACTTAACACTCCCCCTCACATCAAACCTGAATGATACTTCCTATTTGCGTACGCAATCTTACGATCAATCCCTAATAAACTAGGAGGAGTCCTCGCCCTAATCCTCTCAATCCTAGTCCTAGTAATTATACCCCTCCTCCATACATCAAAGCAACGGAGCATAATATTCCGACCAATCAGTCAATGTATATTCTGAATCCTAGTAGCCGACCT。
进一步，本发明所述阳性对照按如下步骤制备：
以包含扩增区域的羊属特异性的Cytb基因片段为模板，通过两条外围引物进行PCR扩增获得目的基因；利用PCR纯化试剂盒(Promega)对PCR扩增产物进行纯化；将纯化后的扩增产物通过T-easy质粒转染试剂盒(Promega)构建完整的含有目的基因的质粒序列，用分光光度计对所抽提的质粒测A280定量并稀释至10个拷贝/μl，获得阳性对照，-20℃保存。
进一步，本发明所述恒温扩增反应液组成为：两条外围引物各自5.7nmol，两条环引物及探针各自11.4nmol，两条交叉引物各自22.8nmol，1×Thermolbuffer，MgSO4为0.2μmol，dNTPs溶液各35pmol，BstDNA聚合酶8U，无菌双蒸水组成补足至25μl。
本发明还提供一种所述羊肉源性成分核酸的恒温扩增检测试剂盒的检测方法，所述检测方法为：
a)提取待检测标本DNA：剪取约米粒大小(50mg)的羊肉样品，加入500μL双蒸水后振荡15s，于95℃作用5min，离心后取上清，即获得DNA；
b)将步骤a)提取得到的DNA作为模板加入到装有恒温扩增反应液的PCR管中，在65℃下扩增反应30分钟；标准阳性模板(即阳性对照)加入阳性对照PCR管中，标准阴性模板(即阴性对照)加入阴性对照PCR管中，所述标准阳性模板为含有羊属特异性的Cytb基因片段的DNA质粒，所述标准阴性模板为无菌双蒸水；
c)将反应后的PCR管放置到核酸试纸条防污染检测装置(杭州优思达生物技术公司3号装置)中进行检测，2分钟以后判读结果，当试纸条的检测线呈阳性时，说明样品中含有羊肉源性成分核酸。该试纸条包括在带有不干胶的衬垫上按顺序有样品垫、有色颗粒结合物垫和吸水滤纸垫，上述各部分在相邻处部分重叠，纤维膜上设有检测线和质控线，其中有色颗粒结合物垫上的有色颗粒有抗Fitc抗体包被，检测线上有亲和素包被，质控线上有抗Fitc抗体，有色颗粒选自胶体金颗粒、乳胶颗粒。
在本发明提供的试剂盒中，有两条外围引物，两条交叉引物和两条检测探针。本试剂盒中的6条寡聚核苷酸序列依靠BstDNA聚合酶的高活性的链置换特性，使得链置换DNA合成不断的自我扩增循环。在本发明提供的羊肉源性成分核酸的恒温扩增检测试剂盒中，对不同的反应条件进行了优化，如引物和探针的浓度，Mg2+浓度，反应温度等的优化，并将本发明与核酸检测试纸条检测系统相结合，建立了羊肉源性成分核酸的恒温扩增定性检测的方法。该试剂盒的灵敏度可在每个反应体系中检出1个拷贝，可以满足快速检测羊肉源性成分核酸的要求。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
(1)本发明简化了肉样品核酸的提取方法，减低了成本，而且大大缩短了检测时间。
(2)羊肉源性成分核酸的恒温扩增检测试剂盒的特异性好，灵敏度高，步骤简单，可重复性高；
(3)反应速度快，单个样本从样本处理到完成检测，仅需40分钟左右；
(4)整个扩增和检测过程中不需要打开PCR管盖，减少了扩增产物污染的机会；整个反应过程不需要复杂的仪器。
(四)附图说明
图1为核酸检测试纸条原理示意图。
图2为本发明试剂盒用于检测羊肉源性成分核酸的特异性，图中1-7分别表示羊肉、鸡肉、鸭肉、猪肉、牛肉、阳性对照品、阴性对照品。
图3为本发明试剂盒用于检测羊肉源性成分核酸的灵敏度，图中1-7分别表示104拷贝/微升、103拷贝/微升、102拷贝/微升、101拷贝/微升、100拷贝/微升、10-1拷贝/微升、阴性对照品。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1本发明试剂盒的组成与配制
a)羊肉源性成分核酸的恒温扩增反应液：两条外围引物(5.7nmol)，一条探针(11.4nmol)，两条环引物(11.4nmol)和两条扩增交叉引物(22.8nmol)，1×Thermolbuffer，MgSO4(0.2μmol)，dNTPs溶液(各35pmol)，BstDNA聚合酶(8U)和无菌双蒸水组成，总反应液体积为25μl；
所述正向外围引物为：5′-GCAAACCCACTTAACACTC-3′；
反向外围引物为：5′-AGGTCGGCTACTAGGATTC-3′；
所述两条环引物的序列分别为：
正向：5′-GCGTACGCAAATAGGAAGTATCA-3′；
反向：5′-ACATCAAAGCAACGGAGCATAA-3′；
所述两条扩增交叉引物分别为：
扩增正向引物：
5′-GGACTCCTCCTAGTTTATTAGGGATCCCTCACATCAAACCTGAA-3′；
扩增反向引物：
5′-GTCCTAGTAATTATACCCCTCCTCCATTGACTGATTGGTCGGAAT-3′；
所述探针序列为：5′-TCGCCCTAATCCTCTCAATCCT-3′；
所述的1×Thermolbuffer组成为：20mM的Tris-HCl、10mM的KCl、10mM的(NH4)2SO4、2mM的MgSO4以及质量浓度为0.1％的TritonX-100，pH7.8。
所有的引物和探针均由上海生工生物有限公司合成。
b)阳性对照：阳性对照为含有长221bp的羊属特异性的Cytb基因序列，序列如下：
GCAAACCCACTTAACACTCCCCCTCACATCAAACCTGAATGATACTTCCTATTTGCGTACGCAATCTTACGATCAATCCCTAATAAACTAGGAGGAGTCCTCGCCCTAATCCTCTCAATCCTAGTCCTAGTAATTATACCCCTCCTCCATACATCAAAGCAACGGAGCATAATATTCCGACCAATCAGTCAATGTATATTCTGAATCCTAGTAGCCGACCT。
阳性对照按如下步骤制备：
以包含扩增区域的羊属特异性的Cytb基因基因片段为模板，通过两条外围引物进行PCR扩增获得目的基因；利用PCR纯化试剂盒对PCR扩增产物进行纯化；将纯化后的扩增产物通过T-easy质粒转染试剂盒构建完整的含有目的基因的质粒序列，用分光光度计对所抽提的质粒测A280定量并稀释至10个拷贝/μl，-20℃保存。
c)阴性对照：无菌双蒸水。
实施例2用本发明试剂盒检测羊肉源性成分核酸的具体方法
a)提取待检测的标本中提取DNA。
b)取标本DNA作为模板，加入到装有羊肉源性成分核酸的恒温扩增反应液的PCR管中，其中标本DNA3μl，反应液22μl，65℃扩增反应30分钟；阳性和阴性对照PCR管中分别加入阳性模板(含有长221bp的羊属特异性的Cytb基因序列)和阴性模板(无菌双蒸水)。
c)将反应后的PCR管放置到核酸试纸条防污染检测装置(杭州优思达生物技术公司3号装置)中进行检测，2分钟以后判读结果。当样本中含有羊肉源性成分核酸时，试纸条的检测线上呈阳性。
反复重复实验3次，检测结果无显著性差异，说明本试剂盒的不同批次间的检测结果具有可比性，具有良好的重复性。上述实施例说明，用本发明的试剂盒来检测重复性好，且对样本的检测仅仅需要40分钟左右就能完成，大大缩短检测时间。
用本发明试剂盒检测羊肉源性成分核酸的重复性好，且对样本的检测仅仅40分钟左右就能完成，大大缩短检测时间。
实施例3用本发明试剂盒检测羊肉源性成分的特异性
按照实施例2的方法检测羊肉、鸡肉、鸭肉、猪肉、牛肉源性成分核酸以及检测试剂盒阳性对照品，结果显示用本发明试剂盒检测羊肉源性成分核酸具有很强的特异性，除了羊肉源性成分核酸和试剂盒阳性对照品，其他肉类检测结果均为阴性。如图2所示，图中1-7分别表示羊肉、鸡肉、鸭肉、猪肉、牛肉、阳性对照品、阴性对照品的实验结果。
实施例4用本发明试剂盒检测羊肉核酸的灵敏度
对含有羊属特异性的Cytb基因片段的质粒DNA进行定量，分别稀释至浓度为104拷贝/微升、103拷贝/微升、102拷贝/微升、101拷贝/微升、100拷贝/微升、10-1拷贝/微升，采用实施例2中所述方法来确定本发明试剂盒用于检测羊肉核酸的灵敏度。结果如图3所示，图中1-7分别表示104拷贝/微升、103拷贝/微升、102拷贝/微升、101拷贝/微升、100拷贝/微升、10-1拷贝/微升、阴性对照品的实验结果，可以发现该试剂盒可在每个反应体系中检出1个拷贝，具有很高的灵敏度，可以满足快速检测羊肉源性成分核酸的要求。
Claims (6)
1.一种羊肉源性成分核酸的恒温扩增检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括下列组成：
(1)恒温扩增反应液，包括：正向外围引物、反向外围引物、一条探针、两条环引物、两条扩增交叉引物、1×ThermolBuffer，MgSO4，dNTPs溶液，BstDNA聚合酶和无菌双蒸水；
所述正向外围引物为：5′-GCAAACCCACTTAACACTC-3′；
反向外围引物为：5′-AGGTCGGCTACTAGGATTC-3′；
所述两条环引物的序列分别为：
正向：5′-GCGTACGCAAATAGGAAGTATCA-3′；
反向：5′-ACATCAAAGCAACGGAGCATAA-3′；
所述两条扩增交叉引物分别为：
扩增正向引物：5′端Biotin标记
5′-GGACTCCTCCTAGTTTATTAGGGAT-CCCTCACATCAAACCTGAA-3′；
扩增反向引物：
5′-GTCCTAGTAATTATACCCCTCCTCC-ATTGACTGATTGGTCGGAAT-3′；
探针：5′端标记Fitc：5′-Fitc-TCGCCCTAATCCTCTCAATCCT-3′；
(2)阳性对照：含有羊属特异性的细胞色素b基因Cytb的DNA质粒；
(3)阴性对照：无菌双蒸水。
2.如权利要求1所述羊肉源性成分核酸的恒温扩增检测试剂盒，其特征在于所述1×ThermolBuffer组成为：20mM的Tris-HCl、10mM的KCl、10mM的(NH4)2SO4、2mM的MgSO4以及质量浓度为0.1％的TritonX-100，pH7.8。
3.如权利要求1所述羊肉源性成分核酸的恒温扩增检测试剂盒，其特征在于所述阳性对照为含有长221bp的羊属特异性的Cytb基因序列的片段，所述片段的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示。
4.如权利要求1所述羊肉源性成分核酸的恒温扩增检测试剂盒，其特征在于所述阳性对照按如下步骤制备：
以包含扩增区域的羊属特异性的Cytb基因片段为模板，通过两条外围引物进行PCR扩增获得目的基因；利用PCR纯化试剂盒对PCR扩增产物进行纯化；将纯化后的扩增产物通过T-easy质粒转染试剂盒构建完整的含有目的基因的质粒序列，用分光光度计对所抽提的质粒定量并稀释至10个拷贝/μl，获得阳性对照，-20℃保存。
5.如权利要求1所述羊肉源性成分核酸的恒温扩增检测试剂盒，其特征在于所述恒温PCR扩增反应液组成为：两条外围引物各自5.7nmol，两条环引物及探针各自11.4nmol，两条交叉引物各自22.8nmol，1×Thermolbuffer，MgSO4为0.2μmol，dNTPs溶液各35pmol，BstDNA聚合酶8U，无菌双蒸水组成补足至25μl。
6.一种权利要求1所述羊肉源性成分核酸的恒温扩增检测试剂盒的检测方法，其特征在于所述检测方法为：
a)提取待检测标本DNA：剪取约米粒大小的羊肉样品，加入500μL双蒸水后振荡15s，于95℃作用5min，离心后取上清，即获得DNA；
b)将步骤a)提取得到的DNA作为模板，加入到装有恒温扩增反应液的PCR管中，在65℃下扩增反应30分钟；标准阳性模板加入阳性对照PCR管中，标准阴性模板加入阴性对照PCR管中，所述标准阳性模板为含有羊属特异性的Cytb基因片段的DNA质粒，所述标准阴性模板为无菌双蒸水；
c)将反应后的PCR管放置到核酸试纸条防污染检测装置中进行检测，2分钟以后判读结果，当试纸条的检测线呈阳性时，说明样品中含有羊肉源性成分核酸。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105063229A (zh) * | 2015-09-14 | 2015-11-18 | 苗丽 | 用于检测肉制品中羊源性成分的荧光定量pcr特异性引物、探针及其试剂盒 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1811447A (zh) * | 2006-02-08 | 2006-08-02 | 杭州优思达生物技术有限公司 | 核酸薄膜层析快速检测方法及其试纸条及其用途 |
| CN101638685A (zh) * | 2008-07-29 | 2010-02-03 | 杭州优思达生物技术有限公司 | 交叉引物扩增靶核酸序列的方法及用于扩增靶核酸序列的试剂盒及其应用 |
| CN105039541A (zh) * | 2015-07-14 | 2015-11-11 | 宁波大学 | 用于河流弧菌lamp-lfd检测的引物和探针序列及引物和探针的应用 |
-
2015
- 2015-11-20 CN CN201510811021.6A patent/CN105543340A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1811447A (zh) * | 2006-02-08 | 2006-08-02 | 杭州优思达生物技术有限公司 | 核酸薄膜层析快速检测方法及其试纸条及其用途 |
| CN101638685A (zh) * | 2008-07-29 | 2010-02-03 | 杭州优思达生物技术有限公司 | 交叉引物扩增靶核酸序列的方法及用于扩增靶核酸序列的试剂盒及其应用 |
| CN105039541A (zh) * | 2015-07-14 | 2015-11-11 | 宁波大学 | 用于河流弧菌lamp-lfd检测的引物和探针序列及引物和探针的应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 李向丽等: "基于LAMP法快速检测羊肉及其制品中的猪、鸭和羊源性成分", 《中国食品卫生杂志》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105063229A (zh) * | 2015-09-14 | 2015-11-18 | 苗丽 | 用于检测肉制品中羊源性成分的荧光定量pcr特异性引物、探针及其试剂盒 |
| CN105063229B (zh) * | 2015-09-14 | 2019-01-04 | 苗丽 | 用于检测肉制品中羊源性成分的荧光定量pcr特异性引物、探针及其试剂盒 |
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