CN1757725A - 能抑制口蹄疫病毒复制与感染的siRNA及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种能抑制口蹄疫病毒在细胞与动物个体中复制与感染的siRNA及其制备方法和应用。选取口蹄疫病毒基因组中1D结构蛋白基因和3D聚合酶基因为siRNA的干扰靶点，设计并以人重组腺病毒Ad5为载体表达三种siRNA，其中，21VPl siRNA和63VPl siRNA靶向口蹄疫病毒1D基因，56POL siRNA靶向3D基因。通过细胞攻毒实验证明，上述三种siRNA均能高效抑制病毒在细胞中的复制，并百分百保护敏感细胞不受病毒攻击，且对不同口蹄疫病毒毒株起到交叉保护作用。该药物安全性好，效果显著，对家畜有理想的保护效果。
Description
技术领域
本发明属于口蹄疫防治技术领域，具体涉及针对口蹄疫病毒(FMDV)基因组中特异的序列设计siRNA，并以腺病毒为载体构建重组腺病毒表达siRNA，该siRNA能够在细胞水平、动物水平(豚鼠和猪)上抑制FMDV的感染。
背景技术
家畜口蹄疫(FMD)是当今世界上最为严重的家畜传染病，主要危害猪、牛、羊等偶蹄类动物，国际兽医局将口蹄疫列为A类传染病之首。多年来，口蹄疫在世界范围内大规模爆发和流行，给畜牧业造成巨大经济损失。根据免疫原性，口蹄疫病毒有A、O、C、SATI、SATII、SATIII及Asia I共7个血清型及65个以上的亚型。FMDV各型之间无交叉免疫反应，一种类型的疫苗不能保护家畜免受另一种类型病毒的感染，已经发现在许多地区会有一个以上病毒流行，如果用一个型的疫苗免疫家畜，有很大的盲目性。为了克服这种免疫的局限性，研究具有广谱抗FMDV作用的制剂有重要的实践意义。另外，由于FMDV的具有快速传染性和强致病性的特点，给使用传统的疫苗快速控制口蹄疫的流行带来了障碍。
RNAi是上世纪九十年代末发现的一个真核生物在核酸水平的抗病毒分子机制，亦是重要的基因表达调控机制，后来发展成为一项全新的分子生物学技术用于新基因功能研究和遗传性疾病、病毒性疾病的治疗。RNAi技术是科学研究领域近年来取得的重大成就之一，它最大的优点在于具有高度的有效性和特异性并且具有快速的防御与治疗效果。它的作用在基因功能研究领域和各种疾病的治疗领域尤其是病毒性疾病的治疗领域已显现出不可估量的价值，例如在抗艾兹病毒(HIV)，丙型肝炎病毒(HCV)，乙型肝炎病毒(HBV)和脊髓灰白质炎病毒(Poliovirus)等病毒病的研究中都发现RNA干扰，对于抑制这类病毒的复制效果极好，可能为这类病毒病的治疗创立新的、更有效的途径。但是在自然界中，各种病毒都会存在不同突变株，口蹄疫病毒就有七种血清型和很多的变异株。这给口蹄疫病毒病的防治工作带来了巨大的困难。由于siRNA干扰靶序列的高度专一性，使RNAi技术在病毒防治的应用前景中也遇到了不可避免的障碍。
所以本发明利用RNAi技术，选取了FMDV基因组中的特异区段作为靶序列，实现了siRNA对FMDV的快速防治及对不同毒株的复制与感染的干扰作用，为RNAi技术用于家畜、猪、牛、羊等口蹄疫病毒病的预防和治疗提供新的技术路线。
发明内容
本发明的目的是提出一种能快速抑制FMDV在动物细胞与个体中复制与感染的siRNA，以及该siRNA的制备方法和应用。
本发明提出的能够抑制FMDV复制与感染的siRNA，是以各个型、各个亚型、不同毒株的基因组序列为基准，选取FMDV中特异的结构蛋白基因1D和聚合酶基因3D(见图1)为干扰靶点，设计siRNA模板序列，转录获得siRNA。并将其克隆到人重组腺病毒载体，获得能在动物细胞及动物个体中稳定连续表达siRNA的重组腺病毒。针对1D的siRNA可以干扰与其序列一致的病毒毒株，针对3D的siRNA可以干扰同一型中不同毒株及不同型的FMDV的复制与感染。
本发明提出的siRNA，其干扰靶点分别为FMDV的1D和3D基因。1D基因编码FMDV的VP1外壳蛋白，该蛋白对FMDV的复制及FMDV与易感细胞之间的相互作用高度相关。研究表明，在感染过程中，VP1蛋白中的RGD位点必须与易感细胞表面受体相互结合，由该受体介导FMDV病毒基因组进入细胞，并最终导致FMDV的复制扩增。3D基因编码FMDV的RNA依赖性RNA聚合酶POL，FMDV基因组本身的复制必须由该聚合酶启动。选用3D基因作为siRNA干扰靶点的另一出发点是，根据基因数据库分析发现，FMDV的3D基因在不同型不同毒株中具有相对高的序列保守性，而siRNA的干扰效应主要取决于其与靶基因序列上的匹配程度。因此，以该基因为依据设计的siRNA具有对不同毒株交叉抑制的潜力。本发明选用的两个干扰靶点是FMDV复制周期中及其重要的两个基因，从理论上说，siRNA对这两个基因的有效沉默将有效抑制FMDV的复制及FMD的爆发。
RNAi技术中的关键元件是小干扰RNA(即siRNA)，完善的siRNA是长度为19-29核苷酸长度的双链结构，这样的siRNA分子可由长双链RNA或发夹状RNA经有效剪接而成。根据科学研究，siRNA的设计必须考虑多种因素，包括siRNA序列前后的碱基偏好，末端稳定性因素，以及所干扰的靶基因的高级结构所造成的影响等。因此，本发明所设计的siRNA充分考虑上述影响因素，以1D基因的第16位核苷酸到第36位核苷酸(记为SEQ IDNO.1)、1D基因的第10位核苷酸到第72位核苷酸(记为SEQ ID NO.2)、3D基因的第1225位核苷酸到第1280位核苷酸(记为SEQ ID NO.3)作为模板序列，由该模板序列转录获得siRNA，分别命名为21VP1 siRNA(21个核苷酸)，63VP1 siRNA(63个核苷酸)和56POLsiRNA(56个核苷酸)。
本发明中，根据1D基因和3D基因的结构特征，siRNA的模板序列可以根据靶基因序列前后浮动适当个数(一般为6个以内)的核苷酸残基而不影响siRNA对病毒的抑制效应。即本发明将前述模板序列前后浮动6个以内的核苷酸残基的核苷酸序列作为siRNA的模板序列，仍可得到所需的siRNA。同时，siRNA的模板序列因不同FMDV毒株基因变异做相应的改变，这样可以保证siRNA对该FMDV毒株最高效的抑制。
本发明采用人重组腺病毒Ad5作为载体表达上述siRNA。此类腺病毒是人源腺病毒经过基因工程重组，切除病毒基因组中E1A和E1B基因而获得的。由于E1A和E1B基因与病毒的复制能力高度相关但不影响病毒的感染能力，缺失这两个基因的重组腺病毒保存了高效的感染能力但失去了复制能力，因此，具有高度的安全性和作为转基因载体的优质潜力，在生物学研究中被广泛应用成为基因治疗的首选载体。
本发明中，能表达抗口蹄疫siRNA人重组線病毒Ad5的制备方法，包括基因制备、重组及腺病毒的培养扩增，具体步骤如下：
(1)用化学合成方法合成编码siRNA的DNA模板序列，用PCR方法从小鼠或人组织细胞中扩增U6或H1启动子，在DNA水平上将siRNA模板序列和启动子序列连接成完整的表达框；
(2)将上述siRNA表达框插入腺病毒Ad5载体，并转染人胚胎肾成纤维细胞株293细胞；
(3)将转染的293细胞在37℃细胞培养箱培养8到12天，然后收集细胞及其培养液；
(4)将细胞连同培养液在干冰和37℃间反复冻融三次，离心收集上清液；
(5)将上清液用氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒Ad5，溶于PBS制备成抗口蹄疫病毒siRNA药物制剂。
本发明提出的siRNA由小鼠(或人)真核U6启动子或(H1启动子)在真核细胞中稳定持续表达，区别于化学合成或体外试管中转录。本发明采用的小鼠或人的这两类启动子，前者为核糖体RNA启动子，后者为组蛋白RNA启动子，两者均具有精确的碱基启动位点和终止信号，可以保证siRNA最高效的被启动转录。同时，在真核细胞中调控这两类启动子的DNA依赖性RNA聚合酶含量巨大，可以保证siRNA最大量的被转录。
该新型抗FMDV药物根据siRNA转录模板设计的不同用于预防不同类型的FMD或不同毒株的FMDV。同样考虑siRNA的抑制效应，本发明提出：以O型FMDV基因序列为依据构建的siRNA最适用于预防O型口蹄疫；以A型FMDV基因序列为依据构建的siRNA最适用于预防A型口蹄疫；同理，以AsiaI等各型FMDV基因序列为依据构建的siRNA最适用于预防该类型的口蹄疫。
该新型制剂的又一特征是：具有交叉抑制力。即以某一型内某一毒株的FMDV基因序列为依据构建的56POL siRNA广泛适用于在各种易感动物中预防同型口蹄疫病毒不同毒株的感染。
在实际应用上，本发明强调该新型的siRNA可以单独使用，也可以混合使用；可以单次免疫，亦可多次免疫。使用办法可根据不同易感动物，以及该易感动物所处地区FMDV的变异情况而定。
本发明提出的能表达siRNA的重组腺病毒在制备和检验过程中，采用了PCR、基因克隆与序列测定、序列分析、基因重组等基因工程技术与方法；并用细胞培养、腺病毒培养分离与纯化等细胞学方法；细胞病毒攻击、豚鼠及猪抗病毒能力检测等细胞学动物免疫学方法检测了该药物的功效。
实施例中，我们构建了一种能抑制O型FMDV在细胞与动物个体中复制与感染的56POLsiRNA。实验结果如下：
以荧光显微镜观察，重组腺病毒Ad5-POL得到了高效的复制和扩增(见图1)。图中“A”、“B”、“C”、“D”分别表示病毒在培养过程中不同时间的荧光显微镜观察照片。
用5个MOI滴度的Ad5-POL感染培养于96孔板的猪肾成纤维细胞株IBRS-2细胞，12小时后用100TCID50FMDV攻击。结果显示，不被腺病毒感染的对照细胞在FMDV攻击的24小时内发生典型的细胞病变，而被腺病毒感染的细胞在7天的观察期内不发生典型的细胞病理学效应，表明细胞得到了完全的保护(见图2)。
用107pfu滴度的Ad5-POL感染250-300克体重的豚鼠，24小时后用50ID50的FMDV攻击。结果显示，未用腺病毒预先免疫的对照豚鼠在FMDV攻击的48小时内均发生病变，而腺病毒预先免疫的豚鼠对FMDV的攻击产生了强烈的抵抗力，约有60％的豚鼠最终得到保护，另外40％的豚鼠虽然发生疾病，但从症状上分析明显较对照组轻(见表1)。
用109pfu滴度的Ad5-POL感染40-50公斤重的长百猪，24小时后用100 ID50的FMDV攻击。结果显示，对照组的长百猪均发生症状十分严重的口蹄疫疾病，但腺病毒感染过的实验组长百猪症状明显较轻，并且最终有约33％的实验动物获得了保护(见表2)。
表1 能表达56POL siRNA的重组腺病毒Ad5-POL对豚鼠的保护效果
| 组别 | 免疫剂量 | 攻毒时间 | 攻毒剂量 | 保护率 |
| 对照组实验组 | 0106pfu | 24小时后24小时后 | 50ID5050ID50 | 060％ |
表2 能表达56POL siRNA的重组腺病毒Ad5-POL对猪的保护效果
| 组别 | 免疫剂量 | 攻毒时间 | 攻毒剂量 | 保护率 |
| 对照组实验组 | 0109pfu | 24小时后24小时后 | 100ID50100ID50 | 033％ |
附图说明
图1为重组病毒Ad5-POL复制和扩增图示。其中，A、B、C、D分表培养天、3天、5天和7天的荧光显微镜观察照片。
图2为重组病毒AdS-POL与对照组的病理学效应图示。
具体实施方式
实施例：以一种能抑制O型FMDV在细胞与动物个体中复制与感染的56POL siRNA及其制备方法和应用为例具体描述本发明。
用PCR方法从小鼠NIH/3T3细胞中扩增核糖体RNA的U6启动子。
化学合成三段基因序列，分别为：O型FMDV聚合酶3D基因中第1225位到第1280位双链DNA序列，该DNA序列的反向重复序列，以及发夹接头DNA序列。将三段序列串连形成反向重复并且中间以发夹接头DNA连接的siRNA模板序列。
将siRNA模板序列连接在小鼠U6启动子的3’末端，进一步形成siRNA的表达框。为了构建重组腺病毒，我们采用市场化的pAdTrack-CMV腺病毒穿梭载体，将上述siRNA表达框插入pAdTrack-CMV的多克隆位点，获得重组质粒，命名为pCMV-POL。
将pAd5-POL以PmeI内切酶线性化，并与另一携带有人重组腺病毒基因组的pAdEasy-1质粒共转化大肠杆菌BJ5183菌株。培养于氨苄青霉素平板中，37℃倒置过夜。随意挑取转化子，分别以质粒大小和PacI酶切鉴定，DNA测序分析鉴定转化子，从而获得阳性克隆。序列分析证明插入的基因序列与设计相符。将此克隆命名为pAd5-POL。
将pAd5-POL以PacI线性化，用无水乙醇沉淀纯化重组的腺病毒DNA。并用脂质体Lipofactamin 2000将该线性DNA转染进入人293细胞。将细胞继续培养8-12天，收集细胞和上清液，并在干冰和37℃水浴锅之间反复冻融三次，离心收集上清液。取少量带有重组腺病毒的上清液继续接种于新鲜的293细胞，用上述方法反复传代收集多次，获得高滴度的病毒液，该病毒命名为Ad5-POL。
将病毒液以氯化铯密度梯度离心，收集密集的病毒条带，并按一定浓度稀释于PBS缓冲液中，即可获得一种新型的能表达抗O型FMDV siRNA的重组腺病毒。
该重组腺病毒的可有交FMDV的复制与感染，其实验结果见表1和表2和图2所示。
本发明涉及的序列如下：
SEQ ID NO.1：
GAGTCTGCGGACCCCGTGACT
CTCAGACGCCTGGGGCACTGA
SEQ ID NO.2：
GCGGGTGAGTCTGCGGACCCCGTGACTACCACCGTCGAAGACTACGGCGGCGAG
CGCCCACTCAGACGCCTGGGGCACTGATGGTGGCAGCTTCTGATGCCGCCGCTC
ACACAAGTC
TGTGTTCAG
SEQ ID NO.3：
GAGGCTATCCTCTCCTTTGCACGCCGTGGGACCATACAGGAGAAGTTGATCTCCGT
GTCCGATAGGAGAGGAAACGTGCGGCACCCTGGTATGTCCTCTTCAACTAGAGGCT
Claims (5)
1、一种能抑制抗口蹄疫病毒复制与感染的siRNA，其特征在于以口蹄疫病毒基因组中1D结构蛋白基因和3D聚合酶基因为干扰靶点，以1D基因的第16位核苷酸到第36位核苷酸：SEQ ID NO.1、1D基因的第10位核苷酸到第72位核苷酸：SEQ ID NO.2、3D基因的第1225位核苷酸到第1280位核苷酸：：SEQ ID NO.3为模板序列，经转录获得。
2、根据权利要求1所述的siRNA，其特征在于以所述模板序列可前后浮动6个以下的核苷酸残基。
3、一种根据权利要求1或2所述的siRNA的表达框的构建方法，其特征在于将小鼠或人的核糖体RNA的U6启动子或组蛋白基因的H1启动子，克隆并插入人重组腺病毒Ad5基因组中，并以该启动子启动转录。
4、一种能表达抗口蹄疫siRNA的人重组腺病毒，其特征在于将权利要求1所述的能抑制口蹄疫病毒复制与感染siRNA模板序列克隆到人重组腺病毒Ad5而获得。
5、一种如权利要求4所述的能表达抗口蹄疫siRNA人重组腺病毒的制备方法，包括基因制备、重组及腺病毒的培养扩增，其特征在于具体步骤如下：
(1)用化学合成方法合成编码siRNA的DNA模板序列，用PCR方法从小鼠或人组织细胞中扩增U6或H1启动子，在DNA水平上将siRNA模板序列和启动子序列连接成完整的表达框；
(2)将上述siRNA表达框插入腺病毒Ad5载体，并转染人胚胎肾成纤维细胞株293细胞；
(3)将转染的293细胞在37℃细胞培养箱培养8到12天，然后收集细胞及其培养液；
(4)将细胞连同培养液在干冰和37℃间反复冻融三次，离心收集上清液；
(5)将上清液用氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒Ad5，溶于PBS制备成抗口蹄疫病毒siRNA药物制剂。
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