CN102586198B - 抗口蹄疫病毒复制与感染的重组腺病毒及制备与应用 - Google Patents
抗口蹄疫病毒复制与感染的重组腺病毒及制备与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102586198B CN102586198B CN 201210016518 CN201210016518A CN102586198B CN 102586198 B CN102586198 B CN 102586198B CN 201210016518 CN201210016518 CN 201210016518 CN 201210016518 A CN201210016518 A CN 201210016518A CN 102586198 B CN102586198 B CN 102586198B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sirna
- promoter
- recombinant adenovirus
- transcription template
- recombinant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 title claims abstract description 62
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 title claims abstract description 42
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 title claims abstract description 29
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 8
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 title claims description 12
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 title claims description 11
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims abstract description 54
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims abstract description 54
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 43
- 208000007212 Foot-and-Mouth Disease Diseases 0.000 claims abstract description 13
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims abstract description 13
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 59
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 38
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 26
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims description 24
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 20
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 20
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 15
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 claims description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 10
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 claims description 8
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 6
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 claims description 6
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 claims description 5
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 claims description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 4
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 3
- 101100175482 Glycine max CG-3 gene Proteins 0.000 claims 4
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 8
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 7
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 6
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 4
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 108010014477 Foot-and-mouth disease virus virus-infection-associated antigen Proteins 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 2
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 241000710189 Aphthovirus Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 1
- 241001135989 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus Species 0.000 description 1
- 241000580858 Simian-Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 241001493546 Suina Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000013373 clone screening Methods 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开一种抗口蹄疫病毒复制与感染的重组腺病毒及其制备与应用。本发明通过将siRNA-3D的转录模板、siRNA-L的转录模板、siRNA-2B的转录模板与siRNA-VP1的转录模板分别与U6启动子连接，克隆入载体pAdeno-X，得到能分别转录、串联结构的质粒，再将该质粒线性化后通过包装细胞包装，得到重组腺病毒rAdeno-3D-L-2B-VP1。该重组腺病毒rAdeno-3D-L-2B-VP1的防治效果优于重组腺病毒rAdeno-2B-VP1应用的效果。可见，本发明提供的重组质粒能有效抑制口蹄疫病毒复制和抗口蹄疫病感染。
Description
技术领域
本发明属于口蹄疫防治技术领域，特别涉及一种抗口蹄疫病毒复制与感染的重组腺病毒及制备与应用。
背景技术
口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdisease virus，FMDV)引起偶蹄类动物的一种急性、热性、高度接触性传染病。该病感染率高，感染后发病率最高可达100％，易感动物多达70余种，其中重要的经济畜种如猪、牛、羊等均易感。鉴于FMD不仅降低动物生产性能，造成巨大的直接经济损失，而且还影响动物及动物产品的国际贸易，因此所造成的间接损失更大，同时还会影响一个国家的国际形象，故素有“政治经济病”之称。
各国学者对FMDV进行了广泛而又深入的研究。FMDV属小RNA病毒科(Picornaviridae)口蹄疫病毒属(Aphthovirus)成员。该病毒有7个血清型，分别为A型、O型、C型、Asia I型、SAT I型、SAT II型和SAT III型，且血清型间无血清交叉反应和交叉免疫现象。各血清型又根据抗原亲缘关系分为不同的亚型，其亚型间抗原也有很大的差异。
目前，FMD是严重威胁畜牧业发展的重要传染病，发达国家主要采取扑杀为主的防控措施，发展中国家主要采取疫苗接种和扑杀相结合的方法。但是疫苗接种后需要至少七天的时间才能产生保护作用，同时由于FMDV血清型多，各血清型之间几乎没有交叉保护性，所以现在应用的单血清型疫苗难以达到对不同血清型和亚型的变异毒株产生保护作用。
RNA干扰(RNAinterference，RNAi)现象的发现为疾病防控开启了希望之门。RNA干扰(RNA interference，RNAi)是由功能性双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)引发的序列特异性转录后同源靶基因沉默现象，是近几年迅速发展起来的一项用于抑制病毒复制的新技术。科研人员将RNAi技术应用于多种病毒性疾病的治疗研究，如艾滋病病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、禽流感病毒等；RNAi技术也为抗FMDV感染方面的研究提供了新的思路。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种抗口蹄疫病毒复制与感染的重组腺病毒。
本发明的另一目的在于提供所述抗口蹄疫病毒复制与感染的重组腺病毒的制备方法。
本发明的再一目的在于提供所述抗口蹄疫病毒复制与感染的重组腺病毒的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种抗口蹄疫病毒复制与感染的重组腺病毒，为腺病毒重组质粒pAdeno-3D-L-2B-VP1线性化后，经过包装细胞包装得到；
所述的腺病毒重组质粒pAdeno-3D-L-2B-VP1的载体为pAdeno-X，重组基因片段为四个串联的、能分别独立转录的基因片段；
所述的四个串联的、能分别独立转录的片段为U6启动子与siRNA-3D的转录模板融合基因片段、U6启动子与siRNA-L的转录模板融合基因片段、U6启动子与siRNA-2B的转录模板融合基因片段和U6启动子与siRNA-VP1的转录模板融合基因片段；
所述的重组基因片段优选为U6启动子与siRNA-3D的转录模板融合基因片段、U6启动子与siRNA-L的转录模板融合基因片段、U6启动子与siRNA-2B的转录模板融合基因片段和U6启动子与siRNA-VP1的转录模板融合基因片段依次串联得到；
siRNA-3D的转录模板的核苷酸序列如下所示：
正义链为(5’-3’)：
反义链为(5’-3’)：
GTTGATCTCCGTGGCAGGATtctcttgaa
siRNA-L的转录模板的核苷酸序列如下所示：
正义链为(5’-3’)：
反义链为(5’-3’)：
ACACCGGAATCGGCACCGCtctcttgaa
siRNA-2B的转录模板的核苷酸序列如下所示：
正义链为(5’-3’)：
反义链为(5’-3’)：
GCCAGATGCAGGAAGACATG
CATGTCTTCCTGCATCTGG；
siRNA-VP1的转录模板的核苷酸序列如下所示：
正义链为(5’-3’)：
反义链为(5’-3’)：
GGAGTCTGCGGACCCCGTGACT
AGTCACGGGGTCCGCAGACTC；
以上序列的小写部分为茎环结构，粗体部分和斜体部分互补，以以上序列为模板，转录得到的siRNA为具有loop结构的dsRNA；
所述的抗口蹄疫病毒复制与感染的重组腺病毒的制备方法，优选包含以下步骤：
(1)将如下所示的siRNA-3D的转录模板、siRNA-L的转录模板、siRNA-2B的转录模板和siRNA-VP1的转录模板分别克隆入PSIREN-shuttle穿梭载体，位于U6启动子的下游，得到重组质粒pShuttle-3D、pShuttle-L、pShuttle-2B和pShuttle-VP1；
siRNA-3D的转录模板的核苷酸序列如下所示：
正义链为(5’-3’)：
GATCCG
ttcaagagaA
CTTTTTTTCTAGAG
反义链为(5’-3’)：
AATTCTCTAGAAAAAAGTTGATCTCCGTGGCAGGATtctcttgaa
CG
siRNA-L的转录模板的核苷酸序列如下所示：
正义链为(5’-3’)：
GATCCG
ttcaagaga
CTTTTTTTCTAGAG
反义链为(5’-3’)：
AATTCTCTAGAAAAAAAGACACCGGAATCGGCACCGCtctcttgaa
CG
siRNA-VP1的转录模板的核苷酸序列如下所示：
正义链为(5’-3’)：
GATCCG
ttcaagaga
CTTTTTTTCTAGAG；
反义链为(5’-3’)：
AATTCTCTAGAAAAAAAGGAGTCTGCGGACCCCGTGACT
CG
siRNA-2B的转录模板的核苷酸序列如下所示：
正义链为(5’-3’)：
GATCCG
ttcaagaga
CTTTTTTTCTAGAG；
反义链为(5’-3’)：
AATTCTCTAGAAAAAAAGCCAGATGCAGGAAGACATG
CG
正义链寡核苷酸的5’端突出部分是BamHI酶切位点粘性末端，反义链寡核苷酸的5’端突出部分是EcoRI酶切位点粘性末端，加粗部分为siRNA正义链，斜体部分为siRNA的反向互补链，小写字体为loop环序列，下划线部分为7个连续T终止信号及其互补序列；
(2)以重组质粒pShuttle-3D、pShuttle-L、pShuttle-2B和pShuttle-VP1为模板，通过PCR分别得到U6启动子+3D融合片段、U6启动子+L融合片段、U6启动子+2B融合片段、U6启动子+VP1融合片段，再将这四个融合片段分别克隆入克隆载体上，得到串联结构、能分别独立转录的重组质粒pUC-3D-L-2B-VP1；
(3)通过体外连接法将PI-Sce I/I-Ceu I双酶切重组质粒pUC-3D-L-2B-VP1得到的目的片段与人复制缺陷型5型腺病毒质粒载体pAdeno-X载体骨架连接，得到重组质粒pAdeno-3D-L-2B-VP1；
(4)重组质粒pAdeno-3D-L-2B-VP1线性化后，通过包装细胞包装，得到重组腺病毒rAdeno-3D-L-2B-VP1；
步骤(1)中所述的克隆的具体步骤优选为：首先通过BamHI和EcoRI双酶切pSIREN-shuttle穿梭载体；其次将上述的转录模板分别进行处理，将正义链和反义链按摩尔比1∶1混合，变性处理，接着自然降温，得到有突出末端的双链；接着将有突出末端的双链与双酶切后的PSIREN-shuttle穿梭载体连接，再转化大肠杆菌，筛选阳性克隆，得到目的重组质粒；
步骤(2)中所述的克隆载体优选为pUC57载体；
步骤(4)中所述的线性化优选为通过PacI酶切线性化；
步骤(4)中所述的包装细胞优选为人胚肾细胞株HEK293。
一种抗口蹄疫病毒复制与感染的生物制剂，由上述的抗口蹄疫病毒复制与感染的重组腺病毒制备得到。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明提供的抗口蹄疫病毒复制与感染的重组腺病毒，能有效抑制口蹄疫病毒复制和抗口蹄疫病感染。通过实验证实，重组腺病毒rAdeno-3D-L-2B-VP1的防治效果优于重组腺病毒rAdeno-2B-VP1应用的效果。
附图说明
图1是筛选重组腺病毒质粒pAdeno-3D-L-2B-VP1进行的质粒PCR鉴定电泳图；其中，泳道1～8为被筛选的质粒；泳道9为阴性对照；泳道M为DNAMarker DL2000。
图2是重组腺病毒质粒pAdeno-3D-L-2B-VP1的PacI酶切鉴定电泳图；其中，泳道M为DNA Marker DL15000；泳道N为DNA Marker DL2000；泳道1和泳道2为重组腺病毒质粒pAdeno-3D-L-2B-VP1 PacI酶切产物。
图3是不同时间点上清中FMDV滴度的测定图。
图4是预防和治疗方式结合下不同重组腺病毒对感染FMDV豚鼠的保护率。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
本发明是以不同年代和地区分离的O型FMDV为基础，选择FMDV 3D、L、2B、VP1基因高度保守序列设计合成siRNA，克隆入PSIREN-shuttle穿梭载体，构建重组质粒pShuttle-3D、pShuttle-L、pShuttle-2B和pShuttle-VP1，具体过程如下(以下构建过程连接反应按照T4 DNA连接酶说明书操作，阳性克隆筛选按照分子克隆实验指南操作，其中所用的感受态细胞为大肠杆菌DH5α(宝生物工程公司)：
(1)将siRNA-3D的转录模板、siRNA-L的转录模板、siRNA-2B的转录模板和siRNA-VP1的转录模板分别用去离子水稀释成相同的浓度(5pmol/μL)，分别把互补的两段寡核苷酸(各5μL混合)混匀后放在PCR扩增仪上，95℃2min，然后自然降到常温进行处理。将处理后形成的双链siRNA寡核苷酸片段分别与经BamHI和EcoRI双酶切处理后的pSIREN-Shuttle(Clontech公司)连接，得到pShuttle-3D(siRNA-3D的转录模板位于U6启动子下游)、pShuttle-L(siRNA-L的转录模板位于U6启动子下游)、pShuttle-2B(siRNA-2B的转录模板位于U6启动子下游)和pShuttle-VP1(siRNA-VP1的转录模板位于U6启动子下游)。
siRNA-3D的转录模板的核苷酸序列如下所示：
正义链为(5’-3’)：
GATCCG
ttcaagagaA 
CTTTTTTTCTAGAG；
反义链为(5’-3’)：
AATTCTCTAGAAAAAAGTTGATCTCCGTGGCAGGATtctcttgaa
CG。
siRNA-L的转录模板的核苷酸序列如下所示：
正义链为(5’-3’)：
GATCCG
ttcaagagaCTTTTTTTCTAGAG；
反义链为(5’-3’)：
AATTCTCTAGAAAAAAAGACACCGGAATCGGCACCGCtctcttgaa
CG。
siRNA-VP1的转录模板的核苷酸序列如下所示：
正义链为(5’-3’)：
GATCCG
ttcaagaga
CTTTTTTTCTAGAG；
反义链为(5’-3’)：
AATTCTCTAGAAAAAAAGGAGTCTGCGGACCCCGTGACT
CG。
siRNA-2B的转录模板的核苷酸序列如下所示：
正义链为(5’-3’)：
GATCCG
ttcaagagaCTTTTTTTCTAGAG；
反义链为(5’-3’)：
AATTCTCTAGAAAAAAAGCCAGATGCAGGAAGACATG
CG。
(2)①设计引物P3D-F/P3D-R，以pShuttle-3D为模板，用PCR方法扩增U6启动子与siRNA-3D融合片段(理论扩增片段长为420bp)、融合片段连入pUC57(宝生物工程公司，按照说明书操作)的EcoRV位点，得到pUC57-3D。引物序列如下(5’-3’)：
P3D-F：gactaggtaccACCTGACGTAACTATAACGGTCCTAAGG；
P3D-R：gtgtaCTGCAGTTCCTCGAGCTCCGCACCCGACATAGATGAATTC。
反应程序：94℃5min，94℃45s，54℃30s，72℃1min，30个循环；最后72℃延伸10min。
②设计引物PL-F/PL-R，引物序列如下：
PL-F：GACATCTCGAGGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCC
PL-R：GTGATCTGCAGTGCCATTTCATTACCTCTTTCTCCGCAC
以pShuttle-L为模板，用PCR方法扩增U6启动子与siRNA-L融合片段(理论扩增片段长为390bp)、融合片段连入pUC57-3D的Xhol/PstI位点，构建重组质粒pUC-3D-L。
反应程序：94℃5min，94℃45s，52℃45s，72℃1min，30个循环；最后72℃延伸10min。
③分别设计2对引物PVP1-F/PVP1-R与P2B-F/P2B-R，模板分别为pShuttle-VP1和pShuttle-2B，用PCR方法分别扩增U6启动子与siRNA-VP1融合片段(理论扩增片段长为329bp)、U6启动子与siRNA-2B融合片段(理论扩增片段长为325bp)，引物序列如下(5’-3’)：
PVP1-F：CCGCTCGAGGGGCAGGAAGAGGGCCTA；
PVP1-R：AAAACTGCAGTGCCATTTCATTACCTCTTTCTC；
P2B-F：ATAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCG；
P2B-R：AACTGCAGACTCTCGAGGCACCCGACATAGATGAATTC。
PCR体系按TaKaRa公司Ex-Taq DNA聚合酶使用说明进行，反应程序：94℃5min，94℃30s，60℃15s，72℃45s，30个循环，最后72℃延伸3min。
将U6启动子与siRNA-VP1融合片段、U6启动子与siRNA-2B融合片段分别克隆入pMD19-T simple载体(宝生物工程公司，按照说明书操作)中，得到的连接产物转化感受态细胞大肠杆菌DH5α(宝生物工程公司)后，筛选得到质粒TVP1和质粒T2B。用限制性内切酶Pst I、Xho I进行双酶切质粒TVP1，回收和纯化大小约为350bp的片段，用限制性内切酶Pst I、Xho I进行双酶切质粒T2B，回收载体。酶切体系如下表所示：
反应条件：37℃酶切6h。
将长度为350bp的含有U6启动子与siRNA-VP1的片段克隆入质粒T2B载体中，得到含2B-VP1双基因串联shRNA表达盒的重组质粒T2B-VP1，VP1和2B的排列顺序为U6-2B-U6-VP1。
以限制性内切酶PI-Sce I/I-Ceu I双酶切(参照NEB产品说明操作)重组质粒T2B-VP1和人复制缺陷型5型腺病毒质粒载体pAdeno-X(Clontech公司)，利用体外连接法(参照BD Adeno-XTM Expression System说明书操作)获得了重组质粒；经过PCR扩增鉴定(上游引物P1：5′-CGGGAAAACTGAATAAGACG-3′和下游引物P2：5′-CATCAAACGAGTTGGTGCT-3′)、酶切鉴定(PacI酶切鉴定)及序列测定，证实成功构建了重组腺病毒质粒pAdeno-2B-VP1。
PCR扩增鉴定条件：94℃5min，94℃45s，50℃45s，72℃1min，30个循环；最后72℃延伸10min。
以pAdeno-2B-VP1为模板，引物为P2B-F-2/PVP1-R-2，扩增得到760bp的融合片段，通过Acc65I/HindIII酶切位点克隆入pUC57载体，得到重组质粒pUC-2B-VP1。引物序列如下(5’-3’)：
P2B-F-2：TAACTATAACGGTCCTAAGGTAGGGTACCTCTAAGCTTGGGCAGGA；
PVP1-R-2：GTAGTCTGCCATTTCATTACCTCTTTCTCCGCAC。
④以步骤②得到的pUC-3D-L为模板，引物P3D-F和PL-R，扩增长度约750bp的片段，克隆入pUC-2B-VP1的Acc65I/HindIII位点，构建串联siRNA表达盒的重组质粒pUC-3D-L-2B-VP1，排列顺序为U6-3D-U6-L-U6-2B-U6-VP1。
反应程序：94℃5min，94℃45s，55℃45s，72℃1min，30个循环；最后72℃延伸10min。
(3)以限制性内切酶PI-Sce I/I-Ceu I双酶切(参照NEB产品说明操作)重组质粒pUC-3D-L-2B-VP1和人复制缺陷型5型腺病毒质粒载体pAdeno-X(Clontech公司)，利用体外连接法(参照BD Adeno-XTM Expression System说明书操作)获得了重组质粒；经过PCR扩增鉴定(上游引物P1和下游引物P2：)、酶切鉴定(PacI酶切鉴定)及序列测定，证实成功构建了重组腺病毒质粒pAdeno-3D-L-2B-VP1(图1、图2)。该含有4个串联的FMDV特异性siRNA片段，且每个独立片段前均带有U6启动子基因序列。
PCR扩增鉴定条件：94℃5min，94℃45s，50℃45s，72℃1min，30个循环；最后72℃延伸10min。
本发明构建的重组腺病毒质粒pAdeno-3D-L-2B-VP1用PacI酶切线性化，参照BD Adeno-XTM Expression System说明书，将纯化后的酶切产物转染人胚肾细胞(HEK293细胞，中国科学院细胞库)，包装含有FMDV 3D、L、2B、VP1多基因串联的siRNA片段的重组腺病毒rAdeno-3D-L-2B-VP1，病毒经增殖、纯化(参照BIOMIGA ViraTrapTM Adenovirus Puricication Miniprep Kit说明书操作)。利用终点稀释法分别测定纯化前和纯化后的重组腺病毒rAdeno-3D-L-2B-VP1，纯化前的病毒滴度为108pfu/mL，纯化后的病毒滴度为3×1010pfu/mL。同样的方法通过处理重组腺病毒质粒pAdeno-2B-VP1，得到包装含有FMDV 2B、VP1基因串联的siRNA片段的重组腺病毒rAdeno-2B-VP1，病毒经增殖、纯化(参照BIOMIGA ViraTrapTM Adenovirus Puricication MiniprepKit说明书)，利用终点稀释法测定病毒滴度为4×1010pfu/mL，将其用于做对照。
本发明中将猪肾细胞IBRS-2细胞(美国模式培养物集存库ATCC)以细胞密度为3×105/mL，按每孔100μL的量加到96孔细胞培养板上，细胞达到90％融合时，用重组腺病毒rAdeno-3D-L-2B-VP1以10MOI的量感染IBRS-2细胞，12h后再接种100TCID50 FMDV O型(FMDV O/HKN/2003)(已在文献《口蹄疫病毒对猪树突状细胞的免疫生物学特性影响的研究》，中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会论文集，2008，502-508”中公开)，其后立即以10 MOI的量的重组腺病毒rAdeno-3D-L-2B-VP1感染IBRS-2细胞。重组腺病毒rAdeno-2B-VP1的操作同前。检测结果显示，相对于重组腺病毒rAdeno-2B-VP1，本发明提供的rAdeno-3D-L-2B-VP1采用预防和治疗相结合的方式72h内可以100％抑制FMDV在IBRS-2细胞中的复制，重组腺病毒rAdeno-3D-L-2B-VP1在细胞水平上对FMDV感染具有较好的保护效果。
应用豚鼠(250～300g/只豚鼠(雌雄各半)购自广东省医学实验动物中心)作为动物模型，评估重组腺病毒rAdeno-3D-L-2B-VP1在动物个体内对FMDV感染的抑制效应。各组豚鼠(5只/组)，将豚鼠分别预先接种未纯化(即纯化前)重组腺病毒rAdeno-3D-L-2B-VP1、纯化重组腺病毒rAdeno-2B-VP1及纯化重组腺病毒rAdeno-3D-L-2B-VP1，接种量分别为108PFU；24h后感染FMDV，并分别立即以未纯化重组腺病毒rAdeno-3D-L-2B-VP1、纯化重组腺病毒rAdeno-2B-VP1及纯化重组腺病毒rAdeno-3D-L-2B-VP1分别进行治疗，接种量分别为108PFU。结果发现，两次注射纯化重组腺病毒rAdeno-3D-L-2B-VP1保护率(未发病率)在4天内达到了100％，至第7d保护率维持在60％。以上结果说明用108PFU纯化重组腺病毒rAdeno-3D-L-2B-VP1进行预防和治疗能最大程度地增强豚鼠对FMDV的抵抗力，而且纯化的重组腺病毒比未纯化的重组腺病毒防控效果较高(对豚鼠的保护率高20％)。虽然rAd-3D-L-2B-VP1相比rAdeno-2B-VP1，在7d内对豚鼠的保护率基本相当，但较后者可以推迟豚鼠的发病时间。
可见，rAd-3D-L-2B-VP1在动物水平上对FMDV感染具有较好的保护效果。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种抗口蹄疫病毒复制与感染的重组腺病毒，其特征在于：为腺病毒重组质粒pAdeno-3D-L-2B-VP1线性化后，经过包装细胞包装得到；
所述的腺病毒重组质粒pAdeno-3D-L-2B-VP1的载体为pAdeno-X，重组基因片段为四个串联的、能分别独立转录的基因片段；
所述的四个串联的、能分别独立转录的片段为U6启动子与siRNA-3D的转录模板融合基因片段、U6启动子与siRNA- L的转录模板融合基因片段、U6启动子与siRNA-2B的转录模板融合基因片段和U6启动子与 siRNA- VP1的转录模板融合基因片段；
siRNA-3D的转录模板的核苷酸序列如下所示：
正义链为：
5’-GTTGATCTCCGTGGCAGGAttcaagagaATCCTGCCACGGAGATCAAC-3’
反义链为：
5’-GTTGATCTCCGTGGCAGGAT tctcttgaaTCCTGCCACGGAGATCAAC-3’
siRNA-L的转录模板的核苷酸序列如下所示：
正义链为：
5’-ACACCGGAATCGGCACCGCttcaagagaGCGGTGCCGATTCCGGTGT-3’
反义链为：
5’-ACACCGGAATCGGCACCGCtctcttgaaGCGGTGCCGATTCCGGTGT-3’
siRNA-2B的转录模板的核苷酸序列如下所示：
正义链为：
5’-CCAGATGCAGGAAGACATGttcaagagaCATGTCTTCCTGCATCTGGC-3’；
反义链为：
5’-GCCAGATGCAGGAAGACATGtctcttgaaCATGTCTTCCTGCATCTGG-3’；
siRNA-VP1的转录模板的核苷酸序列如下所示：
正义链为：
5’-GAGTCTGCGGACCCCGTGACTttcaagagaAGTCACGGGGTCCGCAGACTCC-3’；
反义链为：
5’-GGAGTCTGCGGACCCCGTGACTtctcttgaaAGTCACGGGGTCCGCAGACTC-3’；
以上序列的小写部分为茎环结构，粗体部分和斜体部分互补。
2.根据权利要求1所述的抗口蹄疫病毒复制与感染的重组腺病毒，其特征在于：所述的重组基因片段为U6启动子与siRNA-3D的转录模板融合基因片段、U6启动子与siRNA- L的转录模板融合基因片段、U6启动子与siRNA-2B的转录模板融合基因片段和U6启动子与 siRNA- VP1的转录模板融合基因片段依次串联得到。
3.权利要求1或2所述的抗口蹄疫病毒复制与感染的重组腺病毒的制备方法，其特征在于包含以下步骤：
（1）将如下所示的siRNA-3D的转录模板、siRNA-L的转录模板、siRNA-2B的转录模板和siRNA-VP1的转录模板分别克隆入psiren-shuttle穿梭载体，位于U6启动子的下游，得到重组质粒pShuttle-3D、pShuttle-L、pShuttle-2B和pShuttle-VP1；
siRNA-3D的转录模板的核苷酸序列如下所示：
正义链为：
5’-GATCCGGTTGATCTCCGTGGCAGGAttcaagagaATCCTGCCACGGAGATCAACCTTTTTTTCTAGAG-3’
反义链为：
5’-AATTCTCTAGAAAAAA GTTGATCTCCGTGGCAGGATtctcttgaaTCCTGCCACGGAGATCAACCG-3’
siRNA-L的转录模板的核苷酸序列如下所示：
正义链为：
5’-GATCCGACACCGGAATCGGCACCGCttcaagagaGCGGTGCCGATTCCGGTGTCTTTTTTTCTAGAG-3’
反义链为：
5’-AATTCTCTAGAAAAAAAGACACCGGAATCGGCACCGCtctcttgaaGCGGTGCCGATTCCGGTGTCG-3’
siRNA-VP1的转录模板的核苷酸序列如下所示：
正义链为：
5’-GATCCGGAGTCTGCGGACCCCGTGACTttcaagagaAGTCACGGGGTCCGCAGACTCCTTTTTTTCTAGAG-3’；
反义链为：
5’-AATTCTCTAGAAAAAAAGGAGTCTGCGGACCCCGTGACTtctcttgaaAGTCACGGGGTCCGCAGACTCCG-3’
siRNA-2B的转录模板的核苷酸序列如下所示：
正义链为：
5’-GATCCGCCAGATGCAGGAAGACATGttcaagagaCATGTCTTCCTGCATCTGGCTTTTTTTCTAGAG-3’；
反义链为：
5’-AATTCTCTAGAAAAAAAGCCAGATGCAGGAAGACATGtctcttgaaCATGTCTTCCTGCATCTGGCG-3’；
正义链寡核苷酸的5’端突出部分是BamHI酶切位点粘性末端，反义链寡核苷酸的5’端突出部分是EcoRI酶切位点粘性末端，粗体部分和斜体部分互补，小写字体为loop环序列，下划线部分为7个连续T终止信号及其互补序列；
（2）以重组质粒pShuttle-3D、pShuttle-L、pShuttle-2B和pShuttle-VP1为模板，通过PCR分别得到U6启动子+3D融合片段、U6启动子+L融合片段、U6启动子+2B融合片段、U6启动子+VP1融合片段，再将这四个融合片段分别克隆入克隆载体上，得到串联结构、能分别独立转录的重组质粒pUC-3D-L-2B-VP1；
（3）通过体外连接法将PI-Sce I / I-Ceu I双酶切重组质粒pUC-3D-L-2B-VP1得到的目的片段与人复制缺陷型5型腺病毒质粒载体pAdeno-X载体骨架连接，得到重组质粒pAdeno-3D-L-2B-VP1；
（4）重组质粒pAdeno-3D-L-2B-VP1线性化后，通过包装细胞包装，得到重组腺病毒rAdeno-3D-L-2B-VP1。
4.根据权利要求3所述的抗口蹄疫病毒复制与感染的重组腺病毒的制备方法，其特征在于：步骤（1）所述的克隆的具体步骤为：首先通过BamHI和EcoRI双酶切psiren-shuttle穿梭载体；其次将权利要求3中所述的转录模板分别进行处理，将正义链和反义链按摩尔比1:1混合，变性处理，接着自然降温，得到有突出末端的双链；接着将有突出末端的双链与双酶切后的Psiren-shuttle穿梭载体连接，再转化大肠杆菌，筛选阳性克隆，得到目的重组质粒。
5.根据权利要求3所述的抗口蹄疫病毒复制与感染的重组腺病毒的制备方法，其特征在于：步骤（2）所述的克隆载体为pUC57载体。
6.根据权利要求3所述的抗口蹄疫病毒复制与感染的重组腺病毒的制备方法，其特征在于：步骤（4）中所述的线性化为通过PacI酶切线性化。
7.根据权利要求3所述的抗口蹄疫病毒复制与感染的重组腺病毒的制备方法，其特征在于：步骤（4）中所述的包装细胞为人胚肾细胞株HEK293。
8.一种抗口蹄疫病毒复制与感染的生物制剂，其特征在于：由权利要求1或2所述的抗口蹄疫病毒复制与感染的重组腺病毒制备得到。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201210016518 CN102586198B (zh) | 2012-01-06 | 2012-01-17 | 抗口蹄疫病毒复制与感染的重组腺病毒及制备与应用 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210005106.1 | 2012-01-06 | ||
| CN201210005106 | 2012-01-06 | ||
| CN 201210016518 CN102586198B (zh) | 2012-01-06 | 2012-01-17 | 抗口蹄疫病毒复制与感染的重组腺病毒及制备与应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102586198A CN102586198A (zh) | 2012-07-18 |
| CN102586198B true CN102586198B (zh) | 2013-07-31 |
Family
ID=46475433
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 201210016518 Expired - Fee Related CN102586198B (zh) | 2012-01-06 | 2012-01-17 | 抗口蹄疫病毒复制与感染的重组腺病毒及制备与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102586198B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102703504B (zh) * | 2012-07-02 | 2015-04-22 | 复旦大学 | 能抑制口蹄疫病毒的shRNA转基因重组质粒及其应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1757725A (zh) * | 2005-08-04 | 2006-04-12 | 复旦大学 | 能抑制口蹄疫病毒复制与感染的siRNA及其制备方法 |
| KR20110135532A (ko) * | 2010-06-11 | 2011-12-19 | 대한민국(관리부서 : 농림수산식품부 농림수산검역검사본부) | 구제역 바이러스 억제를 위한 3개의 서로 다른 ｓｉＲＮＡ를 발현하는 바이러스 벡터 및 이를 포함하는 구제역 바이러스 백신 |
-
2012
- 2012-01-17 CN CN 201210016518 patent/CN102586198B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1757725A (zh) * | 2005-08-04 | 2006-04-12 | 复旦大学 | 能抑制口蹄疫病毒复制与感染的siRNA及其制备方法 |
| KR20110135532A (ko) * | 2010-06-11 | 2011-12-19 | 대한민국(관리부서 : 농림수산식품부 농림수산검역검사본부) | 구제역 바이러스 억제를 위한 3개의 서로 다른 ｓｉＲＮＡ를 발현하는 바이러스 벡터 및 이를 포함하는 구제역 바이러스 백신 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Adenovirus-vectored shRNAs targeted to the highly conserved regions of VP1 and 2B in tandem inhibits replication of foot-and-mouth disease virus both in vitro and in vivo;Xu Yan-Fang 等;《Journal of virological methods》;20120430;第181卷(第1期);第51-58页 * |
| Su-Mi Kim 等.Synthetic and adenovirus delivered small interference RNA pools targeting conserved regions of foot-and-mouth disease virus.《Journal of bacteriology and virology》.2010,第4卷(第40期),第199-206页. |
| Synthetic and adenovirus delivered small interference RNA pools targeting conserved regions of foot-and-mouth disease virus;Su-Mi Kim 等;《Journal of bacteriology and virology》;20101224;第4卷(第40期);第199-206页 * |
| Xu Yan-Fang 等.Adenovirus-vectored shRNAs targeted to the highly conserved regions of VP1 and 2B in tandem inhibits replication of foot-and-mouth disease virus both in vitro and in vivo.《Journal of virological methods》.2012,第181卷(第1期),第51-58页. |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102586198A (zh) | 2012-07-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2014516536A5 (zh) | ||
| CN102757942A (zh) | A型口蹄疫重组疫苗株及其制备方法和应用 | |
| CN113061586B (zh) | 表达血清8型禽腺病毒纤突蛋白重组血清4型禽腺病毒以及制备方法 | |
| CN110904153A (zh) | 表达非洲猪瘟病毒p12或p17蛋白的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的构建方法及其应用 | |
| Gutiérrez-Álvarez et al. | Middle East respiratory syndrome coronavirus vaccine based on a propagation-defective RNA replicon elicited sterilizing immunity in mice | |
| CN112760320B (zh) | 有效抑制猪流行性腹泻病毒复制的外源性人工miRNA及其用途 | |
| CN103695465A (zh) | 猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗株cDNA感染性克隆及其应用 | |
| CN110904152A (zh) | 表达非洲猪瘟病毒p54蛋白的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的构建方法及其应用 | |
| CN102212554A (zh) | 肠道病毒71型感染性克隆及构建方法 | |
| CN102586198B (zh) | 抗口蹄疫病毒复制与感染的重组腺病毒及制备与应用 | |
| CN102296069B (zh) | 有效抑制不同毒株猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的非翻译区特异人工微小rna | |
| CN115820638A (zh) | 一种抑制水禽源禽呼肠孤病毒复制的外源性人工miRNA及其应用 | |
| CN102512694B (zh) | 抗口蹄疫病毒复制与感染的生物制剂及其制备方法与应用 | |
| CN103667347A (zh) | 一种高效表达抗癌基因的受特定miRNA调控的在胶质瘤细胞中特异增殖的腺病毒及其用途 | |
| CN106636001B (zh) | 一种重组肠道病毒表型混合系统的构建方法和应用 | |
| CN101914566B (zh) | 基于E2基因的可插入式猪瘟病毒cDNA载体构建及应用 | |
| Guo et al. | Recombinant adenovirus expression of FMDV P1-2A and 3C protein and its immune response in mice | |
| CN104212912A (zh) | 鉴别鸭坦布苏病毒强毒株和弱毒疫苗株的试剂盒及其应用 | |
| CN101225395A (zh) | 亚洲一型口蹄疫病毒感染性cDNA及其构建方法 | |
| Cao et al. | Inhibition of highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus replication by recombinant pseudorabies virus-mediated RNA interference in piglets | |
| CN1757725A (zh) | 能抑制口蹄疫病毒复制与感染的siRNA及其制备方法 | |
| CN103316358A (zh) | 一种双价dna疫苗及其制备方法 | |
| CN102286465B (zh) | 一种抑制口蹄疫病毒增殖的猪ifitm3基因及构建方法和应用 | |
| CN111485004A (zh) | 猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒超易感细胞系及其应用 | |
| WO2012121071A1 (ja) | VA-RNAsが発現しないアデノウイルスベクター |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20130731 Termination date: 20160117 |
|
| EXPY | Termination of patent right or utility model |