CN100422326C - 一种能抑制口蹄疫病毒复制与感染的siRNA及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明是一种能抑制口蹄疫病毒(FMDV)在动物细胞与个体中复制与感染的siRNA及其制备方法和应用。选取FMDV基因组序列的五个区段，即5NCR，VP4，VPg，POL，3NCR中高度保守的序列部分作为siRNA的靶序列，并且以靶序列中的任何连续的21-25bp的序列设计siRNA。细胞攻毒实验证明，以FMDV基因组中高度保守的序列作为靶基因，应用能与靶基因的DNA序列互补配对的siRNA，可以有效地抑制不同O型FMDV毒株在BHK21细胞中的复制与感染，并能有效的保护乳鼠抵抗病毒的感染，对细胞和乳鼠有很好的保护作用。

Description

一种能抑制口蹄疫病毒复制与感染的siRNA及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于口蹄疫病毒(FMDV)防治技术领域，具体涉及针对FMDV基因组的保守序列，利用体外转录得到siRNA或化学合成得到siRNA，或质粒载体在细菌细胞中表达siRNA，该siRNA在细胞水平上或动物个体水平上能够抑制FMDV复制与防治FMDV的感染。

背景技术

家畜口蹄疫是当今世界上最为严重的家畜传染病，主要危害猪、牛、羊等偶蹄类动物，国际兽医局将口蹄疫列为A类传染病之首。多年来，口蹄疫在世界范围内大规模爆发和流行，给畜牧业造成巨大经济损失。根据免疫原性，口蹄疫病毒有A、O、C、SATI、SATII、SATIII及Asia I共7个血清型及65个以上的亚型。口蹄疫病毒(FMDV)各型之间无交叉免疫反应，一种类型的疫苗不能保护家畜免受另一种类型病毒的感染，已经发现在许多地区会有一个以上病毒流行，如果用一个型的疫苗免疫家畜，有很大的盲目性。为了克服这种免疫的局限性，研究具有广谱抗口蹄疫病毒作用的制剂有重要的实践意义。另外，由于FMDV的具有快速传染性和强致病性的特点，给使用传统的疫苗快速控制口蹄疫的流行带来了障碍。

RNAi技术是科学研究领域近年来取得的重大成就之一，它最大的优点在于具有高度的有效性和特异性并且具有快速的防御与治疗效果。它的作用在基因功能研究领域和各种疾病的治疗领域尤其是病毒性疾病的治疗领域已显现出不可估量的价值，例如在抗艾兹病毒(HIV)，丙型肝炎病毒(HCV)，乙型肝炎病毒(HBV)和脊髓灰白质炎病毒(Poliovirus)等病毒病的研究中都发现RNA干扰，对于抑制这类病毒的复制效果极好，可能为这类病毒病的治疗创立新的、更有效的途径。但是在自然界中，各种病毒都会存在不同突变株，口蹄疫病毒就有七种血清型和很多的变异株。这给口蹄疫病毒病的防治工作带来了巨大的困难。由于siRNA干扰靶序列的高度专一性，使RNAi技术在病毒防治的应用前景中也遇到了不可避免的障碍。

发明内容

本发明的目的是提出一种能抑制同一型中不同毒株甚至不同型的口蹄疫病毒在动物细胞与个体中复制与感染的siRNA，以及该siRNA的制备方法和应用。

本发明提出的能够抑制FMDV复制与感染的siRNA，是以各个型、各个亚型、不同毒株的基因组序列为基准，选取FMDV中高度保守的5NCR，VP4，VPg，POL，3NCR(见图1)为靶序列，设计得到siRNAs，得到的siRNA可以干扰同一型中不同毒株及不同型的FMDV的复制与感染。

本发明中五种对各个型和亚型和不同毒株具有同源性的基因或区段都可作为siRNA的靶序列。

本发明中，上述所选定的靶序列中任何连续的21-25bp长度的RNA序列都可制备为siRNA，该siRNA均有干扰FMDV复制和感染的效果。

本发明所述的siRNA可用下述方法制备获得：在体外合成，转录后用Dicer酶消化得到siRNAs混合物，也可用质粒载体体内表达或者通过化学合成法直接合成针对靶序列的任何一段21-25bp的siRNAs.

本发明中所采用的5NCR中的保守区为149bp(500-648位Nt)，其序列为SEQ IDNO1；VP4中的保守区为170bp(1652-1821位Nt)，其序列为SEQ ID NO2；VPg中的保守区为137bp(5798-5934位Nt)，其序列为SEQ ID NO3；POL中的保守区为185bp(7694-7878位Nt)，其序列为SEQ ID NO4；3NCR中的保守区为91bp(8012-8102位Nt)，其序列为SEQ ID NO5。

通过RT-PCR方法从病毒基因组获得这些序列后，分别通过PCR方法加上T7启动子序列以得到能利用T7RNA聚合酶进行体外转录的模板DNA。经过体外转录及人重组Dicer酶消化转录的dsRNA后，得到21-25bp的siRNA的混合物(图2)。该siRNA混合物包含了在保守区段内的各种序列组合的21-25bp的siRNA。用siRNA混合物在细胞水平上进行FMDV复制与感染的干扰实验，取得了82-99％的干扰效果(图3)。

以先用病毒攻击细胞，再转染本发明的siRNA的方式来抑制FMDV复制与感染，也能取得很好的保护效果，且保护效率高于先转染后攻毒的方式。

本发明选取了FMDV基因组中高度保守的区段作为靶序列，实现了siRNA对不同毒株的复制与感染的干扰作用，为RNAi技术用于家畜、猪、牛、羊等口蹄疫病毒病的预防和治疗提供新的技术路线。

附图说明

图1：本发明中所选取的保守区段示意图。具体为口蹄疫病毒基因组和相应的siRNA的靶基因。选择的靶基因片段以原基因命名，并且用粗线段标出，靶序列的数字表示的是在HKN/2002(GeneBankAccessionAY317098.1)毒株中核苷酸的位置。

图2：本发明中得到的siRNA混合物示意图。从dsRNA中产生的siRNAs。

图3：siRNA特异性抑制BHK21细胞中靶基因的表达。其中A，报告质粒与对应的或者不相关的siRNA共转染细胞，24小时后用荧光显微镜拍照获得的有代表性的照片；B，siRNA对EGFP表达活性的抑制；C，RT-PCR方法评价siRNA对EGFP表达活性的抑制。

图4：siRNA降低了病毒在BHK21细胞中的病毒滴度。其中A，siRNA特异性抑制HKN/2002病毒在BHK21细胞中的复制；B，siRNA特异性抑制CHA/99病毒在BHK21细胞中的复制；C，siRNA不能特异性抑制伪狂犬病毒(PRV)在BHK21细胞中的复制。

图5：两种实验方式的siRNA对BHK21细胞中病毒复制的抑制效果比较。

图6：体内合成的siRNA诱导乳鼠的快速抗病毒应答，提高乳鼠受到病毒攻击后的存活率。

具体实施方式

以5NCR、VP4、VPg、POL、3NCR为靶区段具体描述本发明。用RT-PCR一步法从FMDV O型毒株HKN/2002毒株的细胞培养液中分别扩增到上述5个靶区段，即5NCR(SEQ ID NO.1)、VP4(SEQ ID NO.2)、VPg(SEQ ID NO.3)、POL(SEQ ID NO.4)、3NCR(SEQ ID NO.5)。各个区段的序列均经DNA测序确定。

为了分析siRNA对各个靶区段的干扰效果，我们构建了一系列报告质粒，即将5个靶区段分别克隆到一个荧光蛋白表达载体(pEGFP-N1)的5’端，构成融合基因(如5NCR-EGFP)，该基因由报告质粒转染进入细胞，在细胞内可表达融合的荧光蛋白(EGFP)。若靶区段被siRNA干扰则EGFP的表达量降低，据此可以判断siRNA是否特异性干扰靶基因。

为了通过体外转录和酶切方法获得各区段的siRNA，首先通过PCR方法将T7启动子序列加到5个靶区段上，得到转录模板，然后用T7RNA聚合酶进行体外转录得到长双链RNA(dsRNA)。用重组的Dicer酶消化dsRNA，经纯化后得到短的约22bp的siRNA混合物(附图2)。

首先我们将100ng siRNA与200ng的报告质粒共转染BHK21细胞，培养24h后，用荧光显微镜观察EGFP的表达情况(图3A)，结果表明5个区段的siRNA对各自的靶区段均有明显的干扰效果，对EGFP的表达干扰效率达84％-99％(图3B)；同样通过对细胞中融合基因的mRNA测定(RT-PCR)也证明靶基因的表达受到抑制(图3C)。

为了进一步验证siRNA对病毒复制的干扰能力，我们开展了细胞水平的病毒复制干扰实验。一种方式是先用100ng的siRNA转染BHK21细胞，5h后用100TCID₅₀剂量的HKN/2002病毒液感染细胞，24h后用倒置显微镜观察细胞病变情况，并于48h和96h分别收集细胞培养液以通过测定病毒滴度来确定siRNA的干扰能力。同时用另一个FMDV毒株CHA/99攻毒以检测siRNA的交叉保护效果。另一种方式是先用100TCID₅₀剂量的HKN/2002病毒液感染细胞，1h后用100ng的siRNA转染BHK21细胞，并于48h和96h分别收集细胞培养液测定病毒滴度。结果表明，5个区段的siRNA均能有效的抑制病毒的复制，使细胞免受裂解(图4A)，而且对不同来源的毒株有交叉保护作用(图4B)，但是对异种病毒如伪狂犬病毒(PRV)完全没有抑制作用，这表明所设计的siRNA有序列特异性(图4C)。另一种方式的实验结果表明即使病毒先感染FMDV，siRNA仍然能抑制病毒的复制，防止细胞病变裂解，且干扰效果比先转染siRNA再感染病毒的实验组更为明显(图5)。

接着，我们以POL区段中的一段21NT和63NT的核苷酸为靶设计siRNA，并以质粒载体形式设计成可在体内表达成siRNA的发夹结构。将该构建物经颈部皮下免疫乳鼠并用100LD₅₀的HKN/2002病毒攻击乳鼠。与对照组(用生理盐水免疫或不相关的siRNA质粒构建物pNTH)相比，实验组(pNT21和p63NT)可使80％的乳鼠存活5天以上(图6)。

这些结果说明，针对保守区设计的siRNA可以在细胞水平和动物个体水平上干扰FMDV的感染与复制，因此，可以作为有效预防和治疗FMDV的制剂。

SEQUENCE LISTING

<110>复旦大学

<120>一种能抑制口蹄疫病毒复制与感染的siRNA及其制备方法和应用

<130>11

<160>5

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>149

<212>DNA

<213>口蹄疫病毒

<400>1

tttgcccgtt ttcatgagaa acgggacgtt tgcgcacgaa acgcgccgtc gcttgaggaa  60

gacttgtaca aacacgattt aagcaggttt ccacaactga taaaactcgt gcattttgaa  120

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<210>2

<211>188

<212>DNA

<213>口蹄疫病毒

<400>2

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<210>3

<211>137

<212>DNA

<213>口蹄疫病毒

<400>3

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<210>4

<211>185

<212>DNA

<213>口蹄疫病毒

<400>4

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<210>5

<211>91

<212>DNA

<213>口蹄疫病毒

<400>5

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aaaccgtaag ggcttttccc gcttccttaa t                                   91

Claims (3)

1. 一种能抑制FMDV复制与感染的siRNA，其特征在于以FMDV基因组中下述之一高度保守的序列作为其靶序列，通过PCR方法和添加T7启动子序列，得到能利用T7RNA聚合酶进行体外转录的模板DNA；经过体外转录和人重组Dicer酶消化转录的dsRNA后的任何连续的21-25bp的siRNA的混合物；这些序列分别为SEQ ID NO1：5NCR、SEQ ID NO2：VP4、SEQ ID NO3：VPg、SEQ ID NO4：POL、SEQ ID NO5：3NCR。

2. 一种根据权利要求1所述的能够抑制FMDV复制与感染的siRNA的制备方法，其特征在于对各序列分别通过PCR方法和添加T7启动子序列，得到能利用T7RNA聚合酶进行体外转录的模板DNA；经过体外转录及人重组Dicer酶消化转录的dsRNA后，得到任何连续的21-25bp的siRNA的混合物；所述各序列分别为SEQ ID NO1：5NCR、SEQ IDNO2：VP4、SEQ ID NO3：VPg、SEQ ID NO4：POL、SEQ ID NO5：3NCR。

3. 一种如权利要求1所述的siRNA在制备抑制FMDV复制与感染的制剂中的应用。

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