CN105002146A - 火鸡疱疹病毒株rHVT-H9HA及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及表达H9亚型禽流感病毒(AIV)血凝素蛋白的重组火鸡疱疹病毒(HVT)rHVT-H9HA及其构建方法，所述疫苗株rHVT-H9HA的保藏号为CGMCC？No：10907。从载体pEGFP-C1中分离GFP表达盒插入到HVT基因组中，获得重组病毒rHVT-GFP。通过再次同源重组将H9N2亚型AIV流行株A/Chicken/Jiangsu/WJ57/2012的HA基因替换重组病毒rHVT-GFP的GFP基因，挑选不带荧光的重组病毒，获得稳定表达H9亚型AIV？HA基因的火鸡疱疹病毒株rHVT-H9HA。该重组病毒株成本低、安全性好、免疫期长，适合于疫苗的大规模生产，可用于制造疫苗。

Description

火鸡疱疹病毒株rHVT-H9HA及其构建方法

技术领域

本发明涉及重组病毒疫苗领域，更具体地，本发明涉及一种表达禽流感H9亚型HA基因的火鸡疱疹病毒株rHVT-H9HA，用于疫苗的研制。本发明还提供一种研制重组火鸡疱疹病毒疫苗株的方法。

背景技术

在引发禽类疾病的众多病原体当中，禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)和马立克病毒(Marek’s disease virus,MDV)占据着重要地位。防控禽流感与马立克氏病在禽类中的爆发，对动物健康、公共卫生和世界经济具有重大意义。

禽流感(Avian influenza,AI)是一种严重危害全球养禽业发展的病毒性传染病。AIV属于正黏病毒科中的A型流感病毒属，依据对鸡的致病性差异，AIV可以分为低致病性AIV和高致病性AIV。其中低致病性H9亚型AIV不仅可以感染家禽，导致产蛋下降、免疫抑制及与其它病原体混合感染后导致的高死亡率外，还可以感染人、猪等哺乳动物。值得注意的是，该亚型的病毒频繁为新型流感病毒的出现提供内部基因，如感染人的H5N1、H7N9、H10N8的六个内部片段皆来自H9N2，因此具有重要的公共卫生意义。目前，禽流感疫苗主要是全病毒灭活苗，虽然免疫保护效果较好，但仍存在制作成本高、使用不方便、干扰血清学监测、使用过程中受母源抗体的干扰较大、仅能诱导体液免疫以及存在安全隐患，可能造成人为散毒等一系列不足。目前市场上还没有H9亚型AIV活疫苗。因此，研制出新型高效的新一代疫苗用以防控H9亚型AIV具有重要的现实意义。

火鸡疱疹病毒(Herpesvirus of Turkey,HVT)是一种典型无致病性的α疱疹病毒。因HVT与鸡MDV在遗传学和血清学上具有相关性，自1970年以来，HVT Fc-126株作为MD疫苗被广泛使用。该疫苗具有不会引发致瘤发生、保护效果良好、在体内持续存在、可以冻干、便于储存和运输等诸多优点，在MD的防控过程中发挥了重要的作用。近年来，HVT作为病毒载体方面的研究取得了许多进展，因HVT与其它禽病毒载体相比具有许多独特优势，包括：HVT对鸡及其他动物无致病性，安全性好；可以在动物体内持续存在、有利于外源基因的持续表达、刺激机体产生较高的抗体水平；HVT可引起高强度的细胞介导的免疫反应、免疫出现早、持续时间长、接种一次可达到终生免疫；HVT重组疫苗具有生产成本低、可以冻干、易于贮存和运输；HVT具有很强的细胞结合特性、病毒于细胞间传播、因此作为重组疫苗，可以突破母源抗体的干扰等[Bublot,M.,et al.,Use of a vectored vaccine against infectious bursaldisease of chickens in the face of high-titred maternally derived antibody.J Comp Pathol,2007.137Suppl 1:p.S81-4.]。目前，传染性法氏囊病毒等多种禽病保护性抗原均已在HVT载体中成功表达[Tsukamoto,K.,et al.,Complete,Long-Lasting Protection against Lethal Infectious BursalDisease Virus Challenge by a Single Vaccination with an Avian Herpesvirus Vector Expressing VP2Antigens.Journal of Virology,2002.76(11):p.5637-5645.]。应用上述水平制备的Vaxxitex^RHVT+IBD重组疫苗已经获得生产许可，成为商品化的以疱疹病毒为载体的动物源性疫苗，使HVT成为最具有开发前景的病毒载体。其技术核心利用同源重组原理：通过外源基因两侧的非必需区同源臂与HVT基因组相对应区段进行同源交换，从而将外源基因导入基因组中。1992年Morgan等人首次利用同源重组方法构建了表达NDV(F)基因的重组HVT，该重组病毒既能抵抗致死性MDV的攻击，又能预防新城疫，其保护率接近传统疫苗的保护效果[Morgan,R.W.,et al.,Protection of chickens from Newcastle and Marek's diseases with arecombinant herpesvirus of turkeys vaccine expressing the Newcastle disease virus fusion protein.Avian Dis,1992.36(4):p.858-70.]。后来，Gao等人使用上述方法将AIV H5N1(HA)基因插入到HVT基因组不同的位置中，构建了两株rHVT重组病毒，疫苗试验表明这两株重组病毒均可以同时抵抗AI和MD[Gao,H.,et al.,Expression of HA of HPAI H5N1 Virus at US2 GeneInsertion Site of Turkey Herpesvirus Induced Better Protection than That at US10 Gene InsertionSite.PLoS ONE,2011.6(7):p.e22549.]。2012年，古小兵等于常州武进分离到一株具有代表性的H9N2亚型AIV流行毒株A/Chicken/Jiangsu/WJ57/2012，其HA效价为11log2，EID₅₀为9.17，具有很好的抗原性；其HA基因在遗传进化上来源于H9N2亚型AIV欧亚谱系中的A/Duck/HongKong/Y280/97-like亚系。遗传进化分析表明，WJ57株处于流行分支上，具有代表性。因此，本发明以HVT Fc-126株为病毒载体，构建可表达H9亚型AIV血凝素蛋白的重组疫苗株，用于应对当前H9亚型AI和MD的流行。

重组病毒构建过程中，筛选是成功获得目的重组病毒很重要的一个环节。由于HVT具有很强的细胞结合特性，这给HVT重组病毒的筛选带来很大的困难。目前最常用的是标记基因插入法来筛选重组病毒，但是，标记基因的存在带来许多弊端，如用携带大肠杆菌LacZ基因的重组病毒免疫动物，LacZ基因的表达可能会干扰重组病毒的免疫效果；另外，携带抗生素基因的重组病毒免疫动物，也会使动物产生相抗药性。因此，选择一种有效的重组病毒构建和筛选方法，不仅可以大大减少筛选重组病毒的工作量，而且还可以为获得一个高效重组病毒疫苗垫定技术基础。

发明内容

本发明的第一个目的在于克服现有禽流感全病毒灭活苗的上述不足，发明一种以火鸡疱疹病毒为载体表达H9亚型AIV血凝素蛋白的重组疫苗株，用于制造疫苗。

本发明表达H9亚型AIV血凝素蛋白的重组火鸡疱疹病毒株rHVT-H9HA，于2015年6月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号CGMCC No：10907。

本发明的第二个目的在于发明一种重组火鸡疱疹病毒疫苗株的构建方法：

本发明利用同源重组原理，从载体pEGFP-C1中分离GFP表达盒插入到HVT基因组中，经过数轮筛选和纯化，获得表达绿色荧光蛋白的重组病毒rHVT-GFP。重组rHVT-GFP具有一定通用属性，用相同同源臂构建的含其它外源基因的转移质粒载体和rHVT-GFP基因组DNA共转染细胞，通过其它外源基因与GFP基因进行置换，可获得更多表达外源基因的重组HVT。

通过再次同源重组将本实验室分离的一株H9亚型AIV WJ57流行株的HA基因替换重组病毒rHVT-GFP中的GFP基因，挑选不带荧光的重组病毒，经过数轮筛选和纯化，获得了一株稳定表达H9亚型禽流感HA基因的火鸡疱疹病毒株rHVT-H9HA。

我们应用同源重组原理经过第一步筛选，先获取一个带标记基因的重组HVT，然后经与用相同非必需片段构建的含其它外源基因的转移质粒载体进行再次同源重组，用其它外源基因置换标记基因，利用反向筛选方法获取带有其它外源基因的重组HVT。该方法获取的重组HVT病毒跟母本HVT最接近，除了表达的目的基因以外，没有其它任何外源基因，克服标记基因的表达带来的许多弊端，提高了重组火鸡疱疹病毒疫苗的研制和开发价值；同时也极大地方便人们获得各种表达外源基因的重组HVT，为新型疫苗的研制和开发提供了新的思路。

本发明包括以下具体步骤：

1)DNA片段的扩增与克隆

采用PCR分别扩增H9亚型AIV WJ57株的HA，质粒pEGFP-C1中的GFP和HVT Fc-126株基因组的外源基因插入位点两侧序列，并将这些DNA片段定向克隆到质粒载体中，得到重组质粒pHA、pEGFP、pUP、pDOWN。

2)重组转移载体的构建

①中间质粒pCUS2的构建

先将上述获得的重组质粒pUP、pDOWN，经过一系列的酶切和连接反应构建中间质粒pCUS2。

②含EGFP标记基因的转移载体的构建

先将上述获得的重组质粒pEGFP、pCUS2，经过一系列的酶切和连接反应构建含EGFP标记基因的转移载体pCMGFP。

③含HA目的基因的转移载体的构建

先将上述获得的重组质粒pHA、pCUS2、pCMGFP，经过一系列的酶切和连接反应构建含HA目的基因的转移载体pCMHA。

3)重组病毒的构建及纯化

①表达绿色荧光蛋白的重组病毒rHVT-GFP的构建及纯化：

从HVT Fc-126株提取基因组DNA与转移载体pCMGFP的DNA，采用磷酸钙法进行共转染CEF细胞，两者发生同源重组，将含GFP基因的表达盒插入到HVT基因组中。挑取带有荧光的病毒蚀斑，经过数轮筛选和纯化后，直到确信所有的病毒蚀斑都带荧光。获得了带有筛选标记-绿色荧光的重组病毒株rHVT-GFP；

②表达H9亚型禽流感HA蛋白的重组病毒rHVT-H9HA的构建及纯化：

从上述纯化好的重组病毒rHVT-GFP提取基因组DNA与转移载体pCMHA的DNA，采用磷酸钙法进行共转染细胞CEF，两者发生同源重组，将含HA基因的表达盒插入到HVT基因组中。挑取不带有荧光的病毒蚀斑，经过数轮筛选和纯化(直到所有的病毒蚀斑都不带荧光)后获得重组病毒火鸡疱疹病毒株rHVT-H9HA。

附图说明

图1重组质粒pUS2构建模式图。

图2转移载体质粒pCMGFP、pCMHA的EcoR I酶切鉴定。

图3重组病毒rHVT-GFP、rHVT-H9HA构建模式图。

图4重组病毒rHVT-GFP荧光图片。

图5重组病毒rHVT-H9HA不带荧光图片。

图6重组病毒rHVT-H9HA感染CEF外源基因表达情况的检测。

病毒株rHVT-H9HA，于2015年6月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，名称为：重组火鸡疱疹病毒株rHVT-H9HA；其保藏号CGMCC No：10907。

具体实施方式

步骤一：DNA片段的扩增

生物材料准备：

HVT Fc-126株[胡传伟,彭大新,张如宽,刘秀梵.表达鸡马立克氏病病毒gB基因的重组鸡痘病毒与火鸡疱疹病毒二价冻干疫苗的免疫效力[J].中国兽医学报,2006,01:11‐13.]，由扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室保存。

含有H9N2亚型AIV流行毒株WJ57株HA基因阳性克隆质粒pPWJM[丁平云,刘秀梵等.H9亚型禽流感与新城疫重组二联疫苗株的构建与拯救[J].中国家禽,2013,16:16-20.]，由扬州大学农业部畜禽传染病实验室构建，保存。

pEGFP-C1真核表达质粒：购自BD Biosciences Clontech公司；pCR2.1载体：购自Invitrogen公司；High fidelity DNA polymerase、T4 DNA连接酶、Agarose Gel DNA Extraction Kit购自Roche公司；质粒抽提试剂盒(QIAprep Spin MiniPrep Kit)为QIAGEN公司产品；其余常规试剂均为国产分析纯。

1)H9亚型AIV WJ57株HA的扩增

设计DNA引物一对，两端带有Nhe I和Kpn II酶切位点，序列为：

HA-F：5’-CATgctagcATGGAGACAGTATCACTAATAACT-3’(Nhe I)(SEQ ID NO.1)

HA-R：5’-GGCtccggaTTATATACAAATGTTGCATCTG-3’(Kpn II)(SEQ ID NO.2)

PCR扩增HA基因全长片段(50μL反应体系)：以含有HA基因的质粒pPWJM作模板，吸至0.5mL PCR反应管中，以引物HA-F和HA-R扩增WJ57株的HA基因，具体操作方法如下：

PCR反应循环参数：94℃预变性3min；94℃30s，56℃45s，72℃延伸2min，20个循环后72℃延伸10min，4℃保存。

2)筛选标记基因GFP表达盒的扩增

设计DNA引物一对，两端带有EcoR V和Not I酶切位点，序列为：

GFP-F：5’-CCCgatatcTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGG-3’(EcoR V)(SEQ ID NO.3)

GFP-R：5’-AAAgcggccgcGTTAAGATACATTGATGAGTT-3’(Not I)(SEQ ID NO.4)

PCR反应体系：具体操作方法如下：

PCR反应循环参数：94℃预变性4min；94℃30s，55℃45s，72℃延伸，延伸时间为1min/kb，20个循环后72℃延伸10min，4℃保存。

3)HVT基因组的外源基因插入位点左右两侧序列的扩增

HVT感染细胞DNA的制备

原代和次代CEF细胞按常规方法制备，HVT Fc-126株接种于T75细胞培养瓶中培养的次代CEF，37℃培养，80％细胞产生典型的细胞病变，收获细胞，按照传统方法提取HVT基因组。具体操作步骤如下：去掉培养基，用PBS(pH7.2)洗一次，弃掉PBS，每瓶加入5mL PK溶液(含200mM Tris-HCl，pH8.0；1.5M NaCl；20mM EDTA，pH8.0；5％SDS；1mg蛋白酶K)，室温静置10min，将裂解的细胞转移到50mL离心管中，37℃温箱中放置1.5h；加入1/2体积的苯酚，轻轻颠倒混匀，用2min；加入1/2体积的氯仿/异戊醇(24:1)，轻轻摇匀，8000r/min离心10min；取上层水相到干净的离心管中，加入1体积的氯仿/异戊醇，轻轻摇匀，8000r/min离心10min；取上层水相到干净的离心管中，加入1/10体积的3mol/L的醋酸钠(pH5.2)和2体积95％的乙醇，轻轻混匀，放-20℃，沉淀30min,5000r/min离心5min，弃上清；加入10mL70％乙醇洗涤沉淀，5000r/min离心5min，弃上清，沉淀自然干燥后溶解于PH7.0的TE中，测定DNA含量分装到无菌的指行管中，4℃保存备用。

设计DNA引物UP-F和UP-R用于扩增UP序列，两端带有Hind III和Sac I酶切位点，序列为：

UP-F：5’-CCCaagcttATCCTTTACTAGCGCCGATT-3’(Hind III)(SEQ ID NO.5)

UP-R：5’-TTTgagctcGGGCCATTCCATGTGAGATACAAAC-3’(Sac I)(SEQ ID NO.6)

设计DNA引物DOWN-F和DOWN-R用于扩增DOWN序列，两端带有Not I和Xba I酶切位点，序列为：

DOWN-F：5’-AAAAAAgcggccgcCCGGAACCGGGCATACCACT-3’(Not I)(SEQ ID NO.7)

DOWN-R：5’-TTTgagctcGGGCCATTCCATGTGAGATACAAAC-3’(Xba I)(SEQ ID NO.8)

PCR反应体系：具体操作方法如下：

PCR反应循环参数：94℃预变性4min；94℃30s，60℃45s，72℃延伸，延伸时间为1min/kb，25个循环后72℃延伸10min，4℃保存。

用引物UP-F和UP-R扩增HVT基因组139401nt～140408nt区域，用引物DOWN-F和DOWN-R扩增基因组140651nt～141657nt区域。

步骤二：DNA片段的克隆

将RT-PCR和PCR产物经电泳后切割含目的大小片段的凝胶，用Agrose Gel DNAExtraction Kit回收纯化后与pCR-2.1T载体相连，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取质粒，经EcoR I酶切鉴定正确后送南京金斯瑞生物科技有限公司测序，将序列测定正确的阳性质粒分别命名pHA、pEGFP、pUP、pDOWN。

步骤三：重组转移载体的构建

1、中间载体pCUS2的构建

将质粒pUP用Hind III和Sac I酶切，提取插入片段，再克隆到质粒pCR2.1载体的HindIII和Sac I位点，获得pCR2.1-UP。将质粒pDOWN用Not I和Xba I酶切，同样提取插入片段，再克隆到载体pCR2.1-UP的Not I和Xba I位点，构建成中间质粒用PCR方法鉴定，阳性克隆命名pCUS2(图1)。

2、含GFP标记基因转移载体的构建

将质粒pEGFP用EcoR V和Not I酶切，提取插入片段，再克隆到中间质粒pCUS2的EcoRV和Not I位点，构建的重组质粒用酶切和PCR方法鉴定，阳性克隆命名为pCMGFP(图2)。

3、含HA目的基因转移载体的构建

以Nhe I和Kpn II切割的pCMGFP质粒为载体，将质粒pHA经Nhe I和Kpn II酶切置换转移载体pCMGFP中对应的序列GFP基因，构建的重组质粒用酶切和PCR方法鉴定，阳性克隆命名为pCMHA(图2)。

步骤四：重组病毒的构建与纯化

1、重组病毒rHVT-GFP构建与纯化

(1)HVT感染细胞DNA的制备

原代和次代CEF细胞按常规方法制备，在每瓶T75细胞培养瓶的次代CEF中接种10⁵空斑形成单位(PFU)的HVT Fc-126株，培养3-5天，80％细胞产生典型的细胞病变，收获细胞，按照传统方法提取HVT基因组，具体操作步骤同上。

(2)转移载体pCMGFP和HVT基因组DNA共转染CEF

用QIAprep Spin MiniPrep Kit(QIAGEN)抽提转移载体pCMGFP质粒DNA。CEF按常规方法制备，在开始转染试验1h前制备次代CEF，每个60mm培养皿铺3x10⁶细胞，于37℃、5％CO2条件下培养。

在无菌的指形管中依次加入以下试剂：

无菌超纯水194μL

HVT DNA                                 5μg

转移载体pCMGFP质粒                      1μg

TE                                      补足至25μL

同时需设不加转移载体pCMGFP质粒的HVT对照组，体系如下：

无菌超纯水                                 194μL

HVT DNA                                    5μg

TE                                         补足至25μL

混匀上述体系后，从管底缓慢加入31μL 2mol/L CaCl₂溶液和250μL 2xHBSP溶液(42mmol/L HEPES、1.4mmol/L Na₂HP04、274mmol/L NaCl、5mmol/L KCI、pH 7.05的6mmol/L葡萄糖)，用吸管轻轻从管底吹出数个气泡，室温静置30min，形成CaP0₄-DNA混合物。向每个铺有次代CEF细胞的60mm培养皿中加入500μL CaP0₄-DNA复合物，轻轻摇匀，继续培养4h。弃掉培养基，每个细胞培养皿中加入2mL的甘油休克。

2.5ml甘油休克液的体系按如下：

无菌超纯水                                   0.9mL

甘油                                         0.35mL

2xHBSP                                       1.25mL

混匀上述体系后作用1min后弃掉休克液，用维持液(V)培养基洗涤细胞，弃掉洗涤液，加入含4％胎牛血清的生长液(G)培养基，继续培养5-7d后用倒置荧光显微镜观察。

(3)重组病毒rHVT-GFP的筛选和纯化

将转染后的CEF用倒置荧光显微镜观察，标记出带有绿色荧光的病毒空斑。弃掉培养基，用带有少许胰酶的吸管刮取病毒空斑，转移至l0mL生长液培养基中进行稀释，每一个病毒空斑接种一块已铺次代CEF细胞的96孔板，每孔接种l00μL稀释的病毒空斑，置于37℃、5％CO2条件下培养。重复上述步骤，直到96孔细胞培养板上所有的病毒空斑都带有绿色荧光，并且组成每个病毒空斑的细胞都带有荧光，说明重组病毒纯化完全，将该重组病毒命名为rHVT-GFP(图3、4)。

2、重组病毒rHVT-H9HA构建与纯化

(1)rHVT-GFP感染细胞DNA的制备

原代和次代CEF细胞按常规方法制备，在每瓶T75细胞培养瓶的次代CEF中接种10⁵空斑形成单位(PFU)的重组rHVT-GFP病毒株、培养3-5天、等80％细胞产生典型的细胞病变后收获细胞、按照传统方法提取HVT基因组，具体操作步骤同上。

(2)转移载体pCMHA和rHVT-GFP基因组DNA共转染CEF细胞

用QIAprep Spin MiniPrep Kit(QIAGEN)抽提转移载体pCMHA质粒DNA。CEF按常规方法制备，在开始转染试验1h前制备次代CEF，每个60mm培养皿铺3x10⁶细胞，于37℃、5％CO2条件下培养。

在无菌的指形管中依次加入以下试剂：

同时需设不加转移载体pCMGFP质粒的HVT对照组，体系如下：

无菌超纯水                             194μL

rHVT-GFP DNA                           5μg

TE                                     补足至25μL

混匀上述体系后，从管底缓慢加入31μL 2mol/L CaCl₂溶液和250μL 2xHBSP溶液(42mmol/L HEPES、1.4mmol/L Na₂HP04、274mmol/L NaCl、5mmol/L KCI、pH7.05的6mmol/L葡萄糖)，用吸管轻轻从管底吹出数个气泡，室温静置30min，形成CaP0₄-DNA混合物。向每个铺有次代CEF细胞的60mm培养皿中加入500μL CaP0₄-DNA复合物，轻轻摇匀，继续培养4h。弃掉培养基，每个细胞培养皿中加入2mL的甘油休克。

2.5ml甘油休克液的体系按如下：

无菌超纯水                                   0.9mL

甘油                                         0.35mL

2xHBSP                                       1.25mL

混匀上述体系后作用1min后弃掉休克液，用维持液(V)培养基洗涤细胞，弃掉洗涤液，加入含4％胎牛血清的生长液(G)培养基，继续培养5-7d后用倒置荧光显微镜观察。

(3)重组病毒rHVT-H9HA的筛选和纯化

将转染后的CEF用倒置荧光显微镜观察，标记出不带有绿色荧光的病毒空斑。弃掉培养基，用带有少许胰酶的吸管刮取病毒空斑，转移至l0mL生长液(G)培养基中进行稀释，每一个病毒空斑接种一块已铺次代CEF细胞的96孔板，每孔接种l00μL稀释的病毒空斑，置于37℃、5％CO2条件下培养。重复上述步骤，直到96孔细胞培养板上所有的病毒空斑都不带有绿色荧光，并且组成每个病毒空斑的细胞都不带有荧光，说明重组病毒纯化完全，将该重组病毒命名为rHVT-H9HA(图3、5)。

步骤五：重组病毒的传代及鉴定

(1)rHVT-GFP在CEF细胞上传20代后，置荧光镜下观察，未出现荧光丢失现象，说明该重组病毒能够稳定的遗传。

(2)rHVT-H9HA在CEF细胞上传20代，每隔五代，用PCR方法鉴定一次，鉴定结果表明第5代、10代、15代、20代的HA基因都成功插入到HVT基因组中，并且测序正确。

(3)rHVT-H9HA表达H9HA的检测

间接免疫荧光试验(IFA)：以rHVT-H9HA感染次代CEF细胞，3-5天形成病毒空斑；用冷甲醇固定细胞30分钟，PBS洗涤3次；加工作浓度的抗AIVHA多克隆抗体(H9血清)，37℃作用1小时，PBS洗涤2-3次；加工作浓度的抗鸡IgG/lgM荧光单抗，37℃作用1小时，用PBS洗涤2-3次；置荧光镜下观察，结果表明组成病毒空斑的所有细胞均带荧光(图6)。

Claims (4)

1.表达H9亚型禽流感病毒(AIV)血凝素蛋白的重组火鸡疱疹病毒株rHVT-H9HA，其特征在于：能稳定表达H9亚型AIV的HA蛋白，它的保藏号CGMCC No：10907。

2.如权利要求1所述表达H9亚型AIV血凝素蛋白的重组火鸡疱疹病毒(HVT)rHVT-H9HA的构建方法，其特征在于：应用同源重组原理，从pEGFP-C1载体中分离GFP表达盒插入到HVT基因组中，经过筛选和纯化获得表达绿色荧光蛋白的重组病毒rHVT-GFP；通过再次同源重组将HA基因替换重组病毒rHVT-GFP中的GFP基因，挑选不带荧光的重组病毒，经过筛选和纯化，获得稳定表达H9亚型禽流感HA基因的火鸡疱疹病毒株rHVT-H9HA。

3.如权利要求2所述表达H9亚型AIV血凝素蛋白的重组火鸡疱疹病毒株rHVT-H9HA的构建方法，其特征在于包括以下具体步骤：

1)DNA片段的扩增与克隆：

构建阳性质粒pHA：用引物HA-F、HA-R从质粒pPWJM中扩增出基因片段HA，将基因片段HA与pCR2.1载体相连，获得阳性质粒pHA；

构建阳性质粒pEGFP：以pEGFP-C1质粒作模板，用引物GFP-F、GFP-R扩增出GFP表达盒，将基因片段GFP表达盒与pCR2.1载体相连，获得阳性质粒pEGFP；

构建阳性质粒pUP、pDOWN：分别从HVT Fc-126株基因组的139401nt～140408nt、140651nt～141657nt位置克隆出基因片段UP、DOWN，将基因片段UP、DOWN与质粒pCR2.1载体相连，获得阳性质粒pUP、pDOWN；

上述用于扩增的引物序列如下：

HA-F：5’-CATgctagcATGGAGACAGTATCACTAATAACT-3’

HA-R：5’-GGCtccggaTTATATACAAATGTTGCATCTG-3’

GFP-F：5’-CCCgatatcTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGG-3’

GFP-R：5’-AAAgcggccgcGTTAAGATACATTGATGAGTT-3’

2)重组转移载体的构建

中间质粒pCUS2的构建：将质粒pUP用Hind III和Sac I酶切，提取插入片段，定向克隆到pCR2.1载体的Hind III和Sac I位点上，获得pCR2.1-UP；将质粒pDOWN用Not I和Xba I酶切，同样提取插入片段，亚克隆至载体pCR2.1-UP的Not I和Xba I位点上，获得pCUS2；

含GFP标记基因转移载体的构建：将质粒pEGFP用EcoR V和Not I酶切，提取插入片段，亚克隆至中间质粒pCUS2的EcoR V和Not I位点上，获得通用转移质粒pCMGFP；

含HA目的基因转移载体的构建：以Nhe I和Kpn II酶切的pCMGFP质粒为载体，将质粒pHA经Nhe I和Kpn II酶切置换转移载体pCMGFP中对应的序列GFP基因，获得转移载体pCMHA；

3)重组病毒的构建及纯化

①表达绿色荧光蛋白的重组病毒rHVT-GFP的构建及纯化：

从HVT Fc-126株提取基因组DNA与转移载体pCMGFP的DNA，采用磷酸钙法进行共转染鸡胚成纤维细胞(CEF)，两者发生同源重组，将含GFP基因的表达盒插入到HVT基因组中；挑取带有荧光的病毒蚀斑，经过数轮筛选和纯化，直到所有的病毒蚀斑都带荧光，获得带筛选标记-绿色荧光的重组病毒株rHVT-GFP；

②表达H9亚型AIV HA蛋白的重组病毒rHVT-H9HA的构建及纯化：

从上述纯化好的重组病毒rHVT-GFP提取基因组DNA与转移载体pCMHA的DNA，采用磷酸钙法进行共转染细胞CEF细胞，两者发生同源重组，将含HA基因的表达盒插入到HVT基因组中；挑取不带有荧光的病毒蚀斑，经过数轮筛选和纯化，直到所有的病毒蚀斑都不带荧光，获得火鸡疱疹病毒株rHVT-H9HA。

4.根据权利要求3所述表达H9亚型AIV血凝素蛋白的重组火鸡疱疹病毒株rHVT-H9HA的构建方法，其特征在于步骤1，

从HVT Fc-126株基因组克隆出基因片段UP的引物是：

UP-F：5’-CCCaagcttATCCTTTACTAGCGCCGATT-3’

UP-R：5’-TTTgagctcGGGCCATTCCATGTGAGATACAAAC-3’

从HVT Fc-126株基因组克隆出基因片段DOWN的引物是：

DOWN-F：5’-AAAAAAgcggccgcCCGGAACCGGGCATACCACT-3’

DOWN-R：5’-TTTgagctcGGGCCATTCCATGTGAGATACAAAC-3’。