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CN1489627A - 利用多识别位点合成核酸分子的方法和组合物 - Google Patents

利用多识别位点合成核酸分子的方法和组合物 Download PDF

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CN1489627A CNA01822539XA CN01822539A CN1489627A CN 1489627 A CN1489627 A CN 1489627A CN A01822539X A CNA01822539X A CN A01822539XA CN 01822539 A CN01822539 A CN 01822539A CN 1489627 A CN1489627 A CN 1489627A
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Abstract

本发明提供用于重组克隆的组合物和方法。该组合物包含含有多个重组位点和/或多个拓扑异构酶识别位点的载体。该方法允许同时克隆两种或多种不同的核酸分子。在一些实施方案中，这些分子融合在一起，而在其它实施方案中，这些分子插入一种载体中的不同位点内。本发明通常也用于通过重组连接可能相同或者可能不同的多种分子和/或化合物(例如化学化合物、药物、蛋白质或肽、脂类、核酸、碳水化合物等)。本发明或按照本发明的方法准备，也提供包含本发明的组合物、宿主细胞和核酸分子的试剂盒，它们可用来根据本发明的方法合成核酸分子。

Description

利用多识别位点合成核酸分子的方法和组合物
发明背景
发明领域
本发明涉及生物技术和分子生物学领域。具体而言，本发明涉及连接多种含有一个或多个重组位点和/或一个或多个拓扑异构酶识别位点的核酸分子。本发明也涉及利用重组克隆方法克隆这些连接的核酸分子，例如使用拓扑异构酶和/或重组蛋白的方法。本发明也涉及利用重组位点和/或拓扑异构酶识别位点连接多种肽以及肽与核酸分子的组合。其它分子和化合物或分子和化合物的组合也可以通过根据本发明的重组位点和/或拓扑异构酶识别位点连接。这些肽、核酸和其它分子和/或化合物(或其组合)也可以通过重组反应和/或通过拓扑异构酶连接反应与根据本发明的一种或多种载体或结构连接或结合。
相关技术
位点特异性重组酶
位点特异性重组酶是多种生物(例如病毒和细菌)中存在的蛋白质，已经被表征为具有内切核酸酶和连接酶特性。这些重组酶(在一些情况下与结合的蛋白质一起)识别核酸分子中的特异碱基序列，并交换位于这些序列侧翼的核酸片段。重组酶和结合的蛋白质通称为“重组蛋白”(参见，例如Landy，A.，Current Opinion in Biotechnology3：699-707(1993))。
已经描述了来自不同生物的大量重组系统。参见，例如Hoess等人，Nucleic Acids Research 14(6)：2287(1986)；Abremski等人，J.Biol.Chem.261(1)：391(1986)；Campbell，J.Bacteriol.174(23)：7495(1992)；Qian等人，J.Biol.Chem.267(11)：7794(1992)；Araki等人，J.Mol.Biol.225(1)：25(1992)；Maeser和Kahnmann，Mol.Gen.Genet.230：170-176(1991)；Esposito等人，Nucl.Acids Res.25(18)：3605(1997)。其中许多属于重组酶的整合酶家族(Argos等人，EMBO J.5：433-440(1986)；Voziyanov等人，Nucl.Acids Res.27：930(1999))。其中研究最多的也许是来自噬菌体的整合酶/att系统(Landy，A.Current Opinions inGenetics and Devel.3：699-707(1993))、来自噬菌体P1的Cre/LoxP系统(Hoess和Abremski(1990)，《核酸与分子生物学》，第4卷，编者：Eckstein和Lilley，Berlin-Heidelberg：Springer-Verlag；pp.90-109)，和来自酿酒酵母2μ环形质粒的FLP/FRT系统(Broach等人，Cell29：227-234(1982))。
重组位点
无论上述反应被称为重组、转座还是整合，是由重组酶、转座酶还是整合酶催化，它们在参与反应的核酸分子上都共有特异识别序列的主要特征，通常称为“重组位点”。这些重组位点是在整合或重组最初阶段由重组蛋白识别并结合的有关核酸分子上的核酸部分或片段。例如，Cre重组酶的重组位点是loxP，它是34个碱基对的序列，由位于8碱基对核心序列侧翼的两个13碱基对的反向重复序列(作为重组酶结合位点)组成。参见Sauer，B.，Curr.Opin.Biotech.5：521-527(1994)中的图1。识别序列的其它例子包括可被重组蛋白识别的attB、attP、attL和attR序列。(Int.attB是一种约25碱基对的序列，含有两个9碱基对的核心型Int结合位点，和一个7碱基对的重叠区，而attP是一种约240碱基对的序列，含有核心型Int结合位点和臂型Int结合位点，以及辅助蛋白整合宿主因子(IHF)、FIS和切除酶(Xis)的位点。见Landy，Curr.Opin.Biotech.3：699-707(1993))。
常规核酸克隆
核酸片段的克隆现在在许多研究实验室已是常规，是许多遗传分析的必要步骤。然而，这些克隆的目的不同，一般可考虑两个目的：(1)最初从大DNA或RNA片段(染色体、YACs、PCR片段、mRNA等)克隆核酸，这在相对少数的已知载体如pUC、pGem、pBlueScript中进行，和(2)这些核酸片段向特化载体内的亚克隆，以进行功能分析。大量时间和精力花费在将核酸片段从最初的克隆载体向更特化的载体转移的过程中。这种转移被称为亚克隆。
克隆的基本方法已经知道很多年，在这段时间内没有多少改变。一个典型克隆方案如下：
(1)用一种或两种限制性内切酶消化目的核酸；
(2)知道时，凝胶纯化目的核酸片段；
(3)适当时，通过用适当限制性内切酶酶切、用磷酸酶处理、凝胶纯化等，制备载体。
(4)连接核酸片段与载体，用适当的对照除去未酶切和自连接的载体背景；
(5)将得到的载体导入大肠杆菌宿主细胞内；
(6)挑取选择的菌落，培养小量培养物过夜；
(7)制备核酸小量制备物；和
(8)在琼脂糖凝胶上(通常在诊断性限制性内切酶消化后)或通过PCR分析分离的质粒。
用于亚克隆核酸片段的特化载体是功能多样化的。包括但不限于：在不同生物中表达核酸分子的载体；调节核酸分子表达；提供有助于蛋白质纯化或允许示踪细胞中蛋白质的标记；用于修饰克隆的核酸片段(例如产生缺失)；用于合成探针(例如核糖探针)；为核酸测序制备模板；用于鉴定蛋白质编码区；用于不同蛋白质编码区的融合；产生大量目的核酸，等等。一项具体研究通常包括向几种不同的特化载体内亚克隆目的核酸片段。
本领域公知，简单的亚克隆能在一天内完成(例如，核酸片段不大，限制酶切位点与亚克隆载体的位点相容)。然而，其它许多亚克隆可能要花费几周的时间，特别是那些关于未知序列、长片段、毒性基因、限制酶切位点位置不当、高背景、酶不纯等的亚克隆。最冗长、耗时最长的亚克隆类型之一包括，为了构建希望的克隆，向载体上依次添加几种核酸片段。这类克隆的一个例子是基因靶向载体的构建。基因靶向载体一般包含两个核酸片段，其中每一个都与靶基因的一部分相同，位于一个选择性标记侧翼。为了构建这种载体，必须依次克隆每个片段，即，首先将一个基因片段插入载体内，然后插入选择性标记和第二个靶基因片段。对于克隆的每个片段，可能需要大量消化、纯化、连接和分离步骤。因此，亚克隆核酸片段通常被视为尽可能少进行的琐事。
曾经描述了几种促进核酸片段克隆的方法，例如，下列参考文献所述。
Ferguson，J.等人，Gene 16：191(1981)公开了用于亚克隆酵母核酸片段的一个载体家族。这类载体编码卡那霉素抗性。能够部分消化较长酵母核酸片段的克隆，并连接于亚克隆载体内。如果最初的克隆载体提供氨苄青霉素抗性，则在转化之前不必纯化，因为将进行卡那霉素筛选。
Hashimoto-Gotoh，T.等人，Gene 41：125(1986)公开了在链霉素敏感性基因内含有独特克隆位点的一种亚克隆载体；在链霉素抗性宿主中，只有显性敏感性基因含有插入或缺失的质粒才能在链霉素筛选后存活。
尽管这些方法具有改进，但是采用限制性内切酶和连接酶的传统亚克隆仍是耗时且相对不可靠的。耗费了大量的劳动，并且如果在两天或更多天以后在候选质粒中没有发现希望的亚克隆，则必须用备选条件重复整个过程。
重组克隆
以前在美国专利号5,888,732、6,143,557、6,171,861、6,270,969和6,277,608中描述了在确定的重组位点进行重组的克隆系统，在此引用作为参考。简言之，在本申请和相关用途部分提到的申请中描述的GatewayTM克隆系统采用含有至少一个、优选地至少两个不同位点特异性重组位点的载体，这些位点基于噬菌体λ系统(例如att1和att2)，由野生型(att0)位点突变而来。每个突变位点对相同类型的同源配偶att位点(例如attB1与attP1或attL1与attR1)有独特特异性，不与其它突变类型的重组位点或者不与野生型att0位点交叉反应。利用GatewayTM系统，通过置换受体质粒分子(有时称为目标载体)上位于重组位点侧翼的选择性标记(例如ccdB)，克隆和亚克隆位于重组位点侧翼的核酸片段。然后通过转化ccdB敏感宿主株和根据受体分子上的标记正选择，筛选希望的克隆。在其它生物中能够使用类似的负选择策略(例如使用毒性基因)，如哺乳动物和昆虫中的胸苷激酶(TK)。
att位点核心区中的突变的特定残基能产生大量不同的att位点。至于在GatewayTM中使用的att1和att2位点，每一个其它突变可能产生一个新的att位点，该位点具有独特的特异性，即只与含有相同突变的同源配偶att位点重组，而不与其它任何突变或野生型att位点交叉反应。新的突变att位点(例如attB 1-10、attP 1-10、attR 1-10和attL 1-10)在1999年5月28日提交的专利申请系列号60/136,744中有描述，在此引用作为参考。具有独特特异性的其它重组位点(即第一个位点可与相应的位点重组，但不与具有不同特异性的第二个位点重组或基本不重组)可以用来实施本发明。合适的重组位点的例子包括但不限于：loxP位点和衍生物，如loxP511(参见美国专利号5,851,808)、frt位点和衍生物、dif位点和衍生物、psi位点和衍生物、cer位点和衍生物。本发明提供利用这些重组位点结合或连接多种核酸分子或片段的新方法，更具体而言，将多种片段克隆到含有一个或多个重组位点的一种或多种载体(如任何GatewayTM载体，包括目标载体)内。
发明概述
本发明部分涉及包含一个或多个(例如1、2、3、4、5个等)重组位点(例如一个或多个att位点、一个或多个lox位点等)和/或一个或多个(例如1、2、3、4、5个等)拓扑异构酶识别位点(例如一个或多个IA型拓扑异构酶、IB型拓扑异构酶、II型拓扑异构酶等的识别位点)的核酸分子，以及用拓扑异构酶(例如位点特异性拓扑异构酶)切割的核酸分子。本发明也涉及包含一个或多个重组位点和/或一种或多种拓扑异构酶的核酸分子。更具体而言，本发明涉及结合或连接至少一种第一种核酸分子和至少一种第二种核酸分子，第一种核酸分子包含至少一种含有至少一个重组位点的第一种核酸分子，第二种核酸分子包含至少一个拓扑异构酶识别位点和/或至少一个拓扑异构酶。在将这些至少第一种分子和第二种分子连接后，可产生至少一种第三种(嵌合)分子，其包含：(1)至少一个重组位点和(2)至少一个拓扑异构酶识别位点和/或至少一个拓扑异构酶。这些核酸分子可以是线性的或者是闭合环状的(例如松弛型、超螺旋型等)。这些重组位点、拓扑异构酶识别位点和拓扑异构酶能够位于本发明的多种核酸分子上的任何位置，包括位于或靠近核酸分子的末端和/或核酸分子内。而且，根据本发明可以使用相同或不同重组位点、拓扑异构酶识别位点和/或拓扑异构酶的任意组合。
本发明部分包括核酸分子和包含核酸分子的组合物(例如反应混合物)，其中该核酸分子包含：(1)至少一个(例如1、2、3、4、5、6、7、8个等)重组位点和(2)至少一个(例如1、2、3、4、5、6、7、8个等)拓扑异构酶(例如共价连接的拓扑异构酶)或至少一个(例如1、2、3、4、5、6、7、8个等)拓扑异构酶识别位点。在特别实施方案中，上述核酸分子的拓扑异构酶或拓扑异构酶识别位点以及重组位点能够位于内部或位于或靠近一个或两个末端。例如，一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8个等)至少一个拓扑异构酶或至少一个拓扑异构酶识别位点以及一个或多个至少一种重组位点能够位于或靠近一个5’端、位于或靠近一个3’端、位于或靠近两个5’端、位于或靠近两个3’端、位于或靠近一个5’端和一个3’端、位于或靠近一个5’端和两个3’端、或位于或靠近一个3’端和两个5’端。本发明还提供制备和应用本发明的核酸分子和组合物的方法。
在特别的方面，本发明提供以下核酸分子：(1)不同类型的拓扑异构酶(例如IA型拓扑异构酶、IB型拓扑异构酶、II型拓扑异构酶等)与之附着(例如共价结合)，和/或(2)含有两个或多个可被不同类型拓扑异构酶识别的拓扑异构酶识别位点，以及制备和应用包含这些核酸分子的组合物的方法。在许多实施方案中，这些核酸分子还包含一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8个等)重组位点。
本发明还提供连接两种或多种核酸片段的方法，其中至少一种核酸片段含有至少一个拓扑异构酶或拓扑异构酶识别位点和/或一个或多个重组位点。此外，当本发明的方法中使用的核酸片段在相同或不同的核酸片段上含有一个以上的(例如1、2、3、4、5、6、7、8个等)拓扑异构酶时，这些拓扑异构酶可以是相同类型或不同类型的。类似地，当本发明的方法中使用的核酸片段在相同或不同的核酸片段上含有一个以上的拓扑异构酶识别位点时，这些拓扑异构酶识别位点可能被相同类型或不同类型的拓扑异构酶识别。另外，当本发明的方法中使用的核酸片段含有一个或多个重组位点时，这些重组位点也许能够与相同或不同核酸片段上的一个或多个重组位点重组。因此，本发明提供利用使用任何一种拓扑异构酶或拓扑异构酶识别位点的方法连接核酸片段的方法。本发明还提供利用使用(1)拓扑异构酶或拓扑异构酶识别位点的任意组合和/或(2)重组位点的任意组合的方法连接核酸片段的其它方法。本发明也提供通过上述方法生产的核酸分子，以及这些分子和包含这些分子的组合物的用途。
一般而言，本发明部分提供连接多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10个等)含不同功能或结构元件的核酸片段的方法。因此，本发明部分提供将多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10个等)使核酸分子产物具有不同选择性的核酸片段连接在一起的方法。在许多情况中，本发明的方法导致核酸分子的形成，其中连接在一起的各核酸片段的特性和/或元件之间具有有效的相互作用(例如，表达控制序列与开放阅读框之间有效的相互作用/连接)。可赋予产物分子的(1)功能和结构元件和(2)特性的例子包括但不限于：多克隆位点(例如，含有至少两个限制性内切核酸酶酶切位点的核酸区)、包装信号(例如，腺病毒包装信号、甲病毒包装信号等)、限制性内切核酸酶酶切位点、开放阅读框(例如intein编码序列、亲和纯化标记编码序列等)、表达控制序列(例如启动子、操纵基因等)，等等。核酸片段能够赋予产物核酸分子的其它元件和特性在本文其它部分描述。本发明也提供通过上述方法生产的核酸分子，以及这些分子和包含这些分子的组合物的用途。
另外，本发明部分包括连接两种或多种(例如2、3、4、5、6、7、8种等)核酸片段的方法，其中至少一种(例如1、2、3、4、5、6、7、8种等)核酸片段包含一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8个等)拓扑异构酶和/或一个或多个拓扑异构酶识别位点，至少一种核酸片段包含一个或多个重组位点。在特别实施方案中，本发明提供连接至少两种(例如2、3、4、5、6、7、8种等)核酸分子的方法(例如，利用重组和/或由一种或多种拓扑异构酶介导的方法)，其中核酸片段之一包含一个或多个拓扑异构酶或拓扑异构酶识别位点，但是不含重组位点，而其它核酸片段包含一个或多个重组位点，但是不含拓扑异构酶或拓扑异构酶识别位点。因此，本发明的方法能用来通过连接核酸片段制备连接或嵌合的核酸分子，其中产物核酸分子包含：(1)一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8个等)拓扑异构酶和/或一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8个等)拓扑异构酶识别位点，和(2)一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8个等)重组位点。本发明还提供利用这些方法制备的核酸分子、包含这些核酸分子的组合物和应用这些核酸分子的方法。
本发明也提供包含一种或多种此处所述核酸片段和/或核酸分子的组合物。这些组合物可以包含一种或多种选自下列的其它成分：一种或多种其它核酸分子(可能包含重组位点、拓扑异构酶识别位点、拓扑异构酶等)、一种或多种核苷酸、一种或多种聚合酶、一种或多种逆转录酶、一种或多种重组蛋白、一种或多种拓扑异构酶、一种或多种缓冲液和/或盐、一种或多种固体载体、一种或多种聚胺、一种或多种载体、一种或多种限制性内切酶等。例如，本发明的组合物包括但不限于包含一种核酸片段的混合物(例如反应混合物)，该核酸片段包含至少一个拓扑异构酶识别位点和至少一个拓扑异构酶，该拓扑异构酶至少可识别该核酸片段的至少一个拓扑异构酶识别位点之一。本发明的组合物还包含至少一种核酸片段，该核酸片段包含：(1)至少一个拓扑异构酶识别位点，或至少一种拓扑异构酶附着(例如共价结合)的至少一种核酸片段，和(2)一种或多种其它成分。这种其它成分的例子包括但不限于：拓扑异构酶；其它核酸片段，可包含或者可能不含一个或多个拓扑异构酶或拓扑异构酶识别位点；缓冲液；盐；聚胺(例如精胺、亚精胺等)；水；等等。本发明的组合物中所含的核酸片段还可包含一个或多个重组位点和/或一种或多种重组酶。
通过本发明的方法生产或者与本发明的方法联合使用的核酸分子或片段，以及本发明的核酸分子或其片段，包括此处特别描述的那些分子或片段，以及与此处所述分子或片段具有基本序列同一性的分子或片段。与特定分子或片段具有“基本序列同一性”的分子或片段是指，该分子或片段与给定的(或“参照”)分子或片段至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。含有与参照核酸分子或片段例如至少65％“相同”的核苷酸序列的核酸分子或片段是指，除了该核酸分子或片段可包含每100个参照核苷酸序列核苷酸最高达35个点突变之外，该核酸分子或片段的核苷酸序列与参照序列相同。换句话说，为了获得含有与参照核苷酸序列至少65％相同的核苷酸序列的多核苷酸，参照序列中最高达5％的核苷酸可以缺失或被置换为另一种核苷酸，或者可以向参照序列内插入最高可占参照序列中总核苷酸数35％的核苷酸。参照序列的这些突变可能发生在参照核苷酸序列的5’或3’端位置(或这两处)，或者在这些末端位置之间的任一位置，单个散布于参照序列的核苷酸之间，或以一个或多个相邻基团的形式存在于参照序列内。
一个实际问题是，任何一种特定核酸分子或片段与一种给定的参照分子或片段是否至少约65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同，能用已知的计算机程序常规确定，如FASTA(Heidelberg，德国)、BLAST(Washington，DC)或BESTFIT(Wisconsin序列分析软件包，第8版，for Unix，Genetics ComputerGroup，University Research Park，575 Science Drive，Madison，WI53711)，它采用一种局部同源性算法(Smith和Waterman，Advances inApplied Mathematics 2：482-489(1981))来发现两条序列之间的最佳同源片段。当使用FASTA、BLAST、BESTFIT或其它任何序列比对程序确定一种特定序列与根据本发明的参照序列是否(例如)65％相同时，参数设置为使得在全长参照核苷酸序列上计算百分同一性，并允许有最高占参照序列核苷酸总数35％的同源性缺口。
以拓扑异构酶(例如位点特异性拓扑异构酶)切割的核酸分子通常进一步使拓扑异构酶分子与核酸分子的磷酸基共价结合。本发明还包括制备上述及本文其它部分所述的核酸分子的方法，以及应用这些分子的重组方法。
在特定实施方案中，本发明的核酸分子是载体。在其它实施方案中，本发明包括含有本发明的核酸分子的宿主细胞，以及制备和利用这些宿主细胞(例如)生产表达产物(例如蛋白质、多肽、抗原、抗原决定簇、表位等或其片段)的方法。
在特定实施方案中，本发明的核酸分子包含两个或多个重组位点，在重组位点之间含有一个或多个(例如1、2、3、4、5个等)拓扑异构酶识别位点。在其它特定实施方案中，本发明的核酸分子可包含两个或多个拓扑异构酶识别位点，在两个或多个拓扑异构酶识别位点之间含有一个或多个(例如1、2、3、4、5个等)重组位点。
在其它特定实施方案中，本发明的核酸分子包含两个重组位点，在这两个重组位点之间含有两个拓扑异构酶识别位点。因此，如果在拓扑异构酶识别位点之间切割使这些分子线性化，则产生的线性分子中拓扑异构酶识别位点将位于重组位点的远端(即靠近线性分子的两个末端)。本发明还提供含有一个或多个重组位点和一个或多个拓扑异构酶识别位点的线性核酸分子。在特定实施方案中，一个或多个拓扑异构酶识别位点位于一个或多个重组位点的远端。以下实施例8中描述了这些分子的例子。
第一种核酸分子的重组位点和拓扑异构酶识别位点的定位可能使得拓扑异构酶介导的该分子与第二种核酸分子的连接导致第二种核酸分子位于两个或多个重组位点之间。一个例子是，线性第一种核酸分子可以含有位于或靠近每个末端的一个重组位点，还可包含一个位于两个重组位点之一远端的拓扑异构酶识别位点。在这种情况中，能够设计线性化第一种核酸分子与一种拓扑异构酶温育，使拓扑异构酶与第一种核酸分子共价连接，其中该拓扑异构酶位于或靠近第一种核酸分子的末端和相邻/最近重组位点的远端。第一种核酸分子的这一末端可以是平端，或者可以含有5’或3’突出端。当与合适的第二种核酸分子(例如与第一种核酸分子的拓扑异构酶修饰末端的至少一条链序列互补的分子)温育时，第二种核酸分子一端的一条或两条链能够与第一种核酸分子一端的一条或两条链共价连接。此外，如果希望是环状核酸分子，则可通过拓扑异构酶、连接酶或其它方法将第二种核酸分子的第二末端与第一种核酸分子的第二末端连接。上述方法的结果是产生一种在两个重组位点之间含有核酸插入片段的核酸分子。以下实施例8中描述了有关方法的具体例子。利用拓扑异构酶共价连接核酸分子的方法在本文其它部分更详细地描述。
使核酸插入片段位于一个或多个重组位点之间后，即可以通过重组克隆将该插入片段以及相邻的核酸转移到其它核酸分子中。因此，本发明也提供生产上述及本文其它部分所述核酸分子的方法。
本发明的核酸分子所含重组位点与拓扑异构酶识别位点之间的距离(根据核苷酸数)随该分子的用途而不同，但是可能是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、20、25、30、40、50、60、80、100、150、200、300、500、700、900、1000个等或更多的核苷酸。而且，本发明的核酸分子所含重组位点与拓扑异构酶识别位点之间的距离(根据核苷酸数)可以在下列范围内：0-10个核苷酸、10-30个核苷酸、20-50个核苷酸、40-80个核苷酸、70-100个核苷酸、90-200个核苷酸、120-400个核苷酸、200-400个核苷酸、200-1000个核苷酸、200-2000个核苷酸等。
本发明一般也提供用于连接或结合本发明的两种或多种(例如，3种或3种以上，4种或4种以上，5种或5种以上，等)核酸片段或分子的材料与方法。一方面，对于将要结合的这些分子，至少一种片段或分子可包含至少一个重组位点，而至少一种片段或分子可包含至少一个拓扑异构酶识别位点。用于连接根据本发明的多种核酸分子的这些方法可以在体内或体外进行。因此，本发明涉及生产新型或独特序列组合的方法，并涉及通过这些方法产生的序列。通过本发明的方法产生的核酸分子可以用于本领域技术人员公知的任何目的。一方面，利用本发明的方法连接的至少一种(通常是两种或两种以上)核酸分子或片段包含至少一个、优选地至少两个重组位点，尽管每个分子可以包含多个重组位点(例如，3个或3个以上，4个或4个以上，5个或5个以上，等)。另一方面，该核酸分子可以包含至少一个拓扑异构酶识别位点和/或至少一个拓扑异构酶。再另一方面，该分子可包含：(1)至少一个重组位点，和(2)至少一个拓扑异构酶识别位点和/或至少一个拓扑异构酶。这些重组位点和拓扑异构酶识别位点(可以是相同的或是不同的)可位于每种核酸分子或片段的不同位置，本发明使用的核酸可具有不同的大小和不同的形式，包括环形、超螺旋、线性等。本发明使用的核酸分子也可包含一种或多种载体或者使分子在宿主细胞中能作为载体的一种或多种序列(如复制起点)。一方面，用于本发明的核酸分子或片段是线性分子，其在该分子的至少一端处或附近含有至少一个重组位点，优选地在该分子的两端处或附近包含至少一个重组位点。另一方面，当目的核酸分子上含有多个重组位点时，这些位点基本上不能重组，或者不能在该分子上彼此重组。在该实施方案中，将要利用本发明的方法连接的一种或多种其它核酸分子上优选地含有相应的结合配体重组位点。例如，本发明中使用的第一种核酸分子可包含至少一个第一种和第二种重组位点，第二种核酸分子可包含至少一个第三种和第四种重组位点，其中第一种与第二种位点不能彼此重组，第三种与第四种位点不能彼此重组，尽管第一种与第三种和/或第二种与第四种位点可以重组。
将要利用本发明的方法连接的核酸分子(例如“起始分子”)可以用来生产一种或多种含有起始分子的全部或一部分的杂合分子(例如“产物核酸分子”)。起始分子可以是来自任何来源或通过任何方法生产的任何核酸分子。这些分子可以来自天然来源(如来自任何动物或非动物来源的细胞、组织和器官)，或者可以是非天然的(例如衍生核酸)或合成产生的。用于本发明的片段或分子可以通过本领域技术人员公知的任何方法生产，包括但不限于：扩增，如PCR扩增，从天然来源分离，化学合成，大核酸分子(如基因组或cDNA)的剪切或限制性消化，转录，逆转录等，并且可以利用本领域技术人员公知的任何方法向这些分子上添加重组位点和/或拓扑异构酶识别位点和/或拓扑异构酶，包括含有重组位点和/或拓扑异构酶识别位点和/或拓扑异构酶的连接体的连接，利用含重组位点和/或拓扑异构酶识别位点和/或拓扑异构酶的引物扩增或核酸合成，含重组位点和/或拓扑异构酶识别位点和/或拓扑异构酶的核酸分子(例如转座子或整合序列)的插入或整合，等等。一方面，本发明使用的核酸分子是分子群体，如核酸文库或cDNA文库。
利用如此处所述方法重组连接核酸分子后，可以利用拓扑异构酶介导的连接方法和/或此处所述的重组介导的连接方法将这些核酸分子与其它核酸分子连接。
用于本发明的重组位点可以是一种参与重组蛋白催化或促进的重组反应的核酸分子上的任何识别序列。在使用一个以上重组位点的本发明的实施方案中，这些重组位点可以是相同或不同的，可以彼此重组，或者可能彼此不重组或基本不重组。本发明涉及的重组位点也包括野生型或天然存在的重组位点的突变体、衍生物或变体。优选的重组位点修饰包括可提高重组的位点，这种提高选自：(i)有利于整合重组；(ii)有利于切除重组；(iii)减少对宿主因子的需要；(iv)提高共整合或产物形成的效率；(v)提高共整合或产物形成的特异性。优选的修饰包括可提高重组特异性、除去一个或多个终止密码子和/或避免发夹形成的修饰。也能对重组位点进行希望的修饰，使得当通过修饰重组位点发生翻译或转录时，转录或翻译产物(例如mRNA或蛋白质)能包含希望的氨基酸改变。可根据本发明使用的重组位点包括att位点、frt位点、dif位点、psi位点、cer位点和lox位点，或其突变体、衍生物和变体(或其组合)。本发明涉及的重组位点也包括这些重组位点的部分。
每种起始核酸分子除了一个或多个重组位点和/或一个或多个拓扑异构酶识别位点和/或一个或多个拓扑异构酶之外，还可包含多种序列(或其组合)，包括但不限于：适于作为引物位点的序列(例如，一种引物如测序引物或扩增引物可与之杂交，启动核酸合成、扩增或测序的序列)，转录或翻译信号或调节序列，如启动子和/或操纵基因，核糖体结合位点，拓扑异构酶识别序列(或位点)，Kozak序列，起始密码子，转录和/或翻译终止信号，如终止密码子(可以被一种或多种抑制tRNA分子最佳抑制)，tRNA(例如抑制tRNA)，复制起点，选择性标记，可以用来生产融合蛋白的基因或基因部分(例如N端或羧基端)，如GST、GUS、GFP，开放阅读框(orf)序列，和可能是希望的或在多种分子生物学技术中使用的其它任何目的序列，包括用于同源重组(例如基因打靶)的序列。
本发明也涉及生产共价连接的重组核酸分子的方法，方法是将两种或多种(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10种等)核酸分子(另外，等同地，在此也可以称为“核苷酸序列”)，例如双链(“ds”)或单链(“ss”)核酸分子，与至少一种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种等)拓扑异构酶接触。本领域技术人员应当理解，此处提到的所有核酸分子或核苷酸序列，例如此处公开的方法、组合物和试剂盒采用的或通过它们生产的，可以是单链或是双链核酸分子或核苷酸序列，无论这些分子或序列在此是否称为单链和/或双链。
在一个这样的方面，本发明的方法允许以希望的方向和/或顺序连接这些核酸序列，希望时，能够进一步操作或在多种测定或方法中使用，包括，例如用于能在体外或体内进行的转录或转染方法、翻译反应或其它蛋白质表达方法、重组反应等。另一方面，3种或3种以上、4种或4种以上、5种或5种以上等相同或不同的核酸序列，或其群体或文库能够按照本发明的一种方法连接。另一方面，能够利用本发明的方法连接一种核酸分子的每一端，形成共价闭环的或超螺旋的分子。
将要连接的核酸序列能够来自于任何来源，可以是天然存在的和化学或重组合成的核酸分子，如cDNA、基因组DNA、载体、寡核苷酸等。此外，核酸序列能够但不需要含有一种或多种功能序列，如基因调节元件、复制起点、剪接位点、聚腺苷酸化位点、开放阅读框，它们能编码例如标记序列、可检测的或选择性标记、细胞定位域或其它肽或多肽，等等。这样，本发明可使多种核酸序列(可以是相同的或不同的)连接，包括在希望时以预定的顺序或方向或以此顺序和方向连接。
将要连接的核酸分子(例如双链或单链核酸分子)可以是任何形式，例如，是单链或双链、线性、环状或超螺旋的，其特征部分在于将要连接的每种核酸分子都是拓扑异构酶的一种底物，或者能够修饰成为这种底物。这种拓扑异构酶可以是优选地能够通过磷酸二酯键共价连接一种核酸分子的至少一条链与另一种核酸分子的至少一条链的任何一种拓扑异构酶。这种拓扑异构酶可以是一种位点特异性拓扑异构酶，或者能够具有松弛特异性，优选地在切割位点处或附近与该核酸分子的一条链形成稳定的复合物(例如共价复合物)。
本发明的方法通常如下进行：在一种核酸分子一端的两条链与至少一种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种等)其它核酸分子的一端的两条链连接的条件下，使拓扑异构酶接触欲连接的核酸分子(例如双链或单链核酸分子)。这样，本发明的方法产生一种共价连接的重组核酸分子(可以是单链的或是双链的)，该分子在底物核酸分子连接的位点处不含切口。本发明也提供通过这种方法制备的重组核酸分子。在本发明的某些方面，这些重组核酸分子还包含一个或多个重组位点。
本发明的一种方法能够利用不同组合的成分进行。例如，该方法能够如下进行：将要共价连接的两种或多种底物核酸分子(例如单链核酸分子或双链核酸分子)与至少一种拓扑异构酶接触，其中该拓扑异构酶切割核酸分子的一条或两条链，在切割位点一端与核苷酸形成稳定的复合物。携带拓扑异构酶的末端或携带拓扑异构酶的核酸分子然后彼此接触，使底物核酸分子的每条链连接，从而产生一种或多种共价连接的重组核酸分子。优选地，拓扑异构酶介导在每个连接位点形成磷酸二酯键。该方法也能如下进行：单独地或在过量拓扑异构酶存在下接触两种或多种携带拓扑异构酶的核酸分子，或者使一种或多种携带拓扑异构酶的核酸分子(可以是单链或是双链)与一种或多种含有一个拓扑异构酶切割位点和一种拓扑异构酶的核酸分子(可以是单链或是双链)接触。本发明也提供通过这些方法制备的重组核酸分子。在本发明的这些方面，这些重组核酸分子还包含一个或多个重组位点。在不同实施方案中，拓扑异构酶可能具有相对松弛的特异性，因此它能结合并切割多种不同的核苷酸序列，或者拓扑异构酶可能是一种位点特异性拓扑异构酶，它能结合并切割一种特定的核苷酸序列。拓扑异构酶也可能是I型拓扑异构酶，切割双链核酸分子的一条链，或者可能是II型拓扑异构酶，切割双链核酸分子的两条链。当拓扑异构酶是II型拓扑异构酶时，切割的结果是产生线性双链核酸分子，在一个或两个末端含有拓扑异构酶。在此方面，与含有结合拓扑异构酶的链互补的双链核酸分子的链将形成突出序列。
实施本发明的方法的一个优点是，用拓扑异构酶进行的连接反应能在宽温度范围内极快地发生。另一个优点是，根据本发明的方法产生的重组核酸分子在两种核酸分子连接的位点处不含切口。这样，在随后的步骤中能够直接使用共价连接的重组核酸分子，例如，作为扩增反应如聚合酶链反应(PCR)的底物。
例如，本发明的一种方法能够如下进行：在所有成分可以接触并且拓扑异构酶能够达到其活性的条件下，接触下列成分：1)第一种核酸分子(可以是单链或是双链)，其具有第一端和第二端，其中在第一端或第二端或这两个末端处，第一种核酸分子在3’端处或附近含有一个拓扑异构酶识别位点；2)至少一种第二种核酸分子(可以是单链或是双链)，其具有第一端和第二端，其中在第一端或第二端或这两个末端处，至少第二种双链核苷酸序列在3’端处或附近含有一个拓扑异构酶识别位点；3)一种位点特异性拓扑异构酶。与含有拓扑异构酶识别序列的链互补的链可能包含一个5’羟基，在拓扑异构酶切割后，可能还包含5’突出序列。
本发明的一种方法也能如下进行：在所有成分可以接触并且拓扑异构酶能够达到其活性的条件下，接触下列成分：1)具有第一端和第二端的一种核酸分子(可以是单链或是双链)，其中第一端和第二端均在3’端处或附近含有一个拓扑异构酶识别位点，和2)一种位点特异性拓扑异构酶。例如，该拓扑异构酶可以是IB型拓扑异构酶，如牛痘拓扑异构酶或酿酒酵母拓扑异构酶。这种方法提供一种制备共价闭环或超螺旋双链核酸分子的方法。
本发明的一种方法也能如下进行：在所有成分可以接触并且至少一种拓扑异构酶能够达到其活性的条件下，接触下列成分：1)第一种核酸分子(可以是单链或是双链)，其具有第一端和第二端，其中第一种核酸分子在第一端或第二端或这两个末端的5’端处或附近含有一个拓扑异构酶识别位点；2)至少一种第二种核酸分子(可以是单链或是双链)，其具有第一端和第二端，其中至少第二种双链核苷酸序列在第一端或第二端或这两个末端的5’端处或附近含有一个拓扑异构酶识别位点；和3)至少一种位点特异性拓扑异构酶。例如，拓扑异构酶可以是IA型拓扑异构酶，如大肠杆菌拓扑异构酶I或拓扑异构酶III，或真核拓扑异构酶III。在一种核酸分子切割后，拓扑异构酶优选地与5’端稳定结合。含有拓扑异构酶识别位点或结合拓扑异构酶的3’端能包含一个3’羟基，或者能被修饰而包含一个3’羟基。在用拓扑异构酶切割后，切割后的核酸分子可包含3’突出序列。
如此处所述的方法能用两种或多种位点特异性拓扑异构酶进行，其中第一种、第二种或其它核酸底物在一个末端的3’端或5’端处或附近相应地含有对应于两种或多种拓扑异构酶之一的拓扑异构酶识别位点。使用两种或多种拓扑异构酶和相应的拓扑异构酶识别位点能有利于核酸分子(可以是单链或是双链)以预定的顺序、方向或组合连接。因此，应当认识到，在用一种拓扑异构酶说明本发明的方法时，该方法类似地能用两种或多种拓扑异构酶进行。在某些情况中，尽管提到使用至少一种拓扑异构酶，但是除非另外指出，也能用一种、两种、三种或更多种拓扑异构酶进行这些方法，只要底物核酸分子含有合适的拓扑异构酶识别位点。类似的考虑与携带拓扑异构酶的核酸底物有关，因为这些拓扑异构酶可能是相同或不同的。
在另一个实施方案中，本发明的方法能够如下进行：在所有成分可以接触并且所有拓扑异构酶均能够达到其活性的条件下，接触下列成分：1)第一种核酸分子(可以是单链或是双链)，其具有第一端和第二端，其中第一种核酸分子在第一端或第二端或这两个末端的3’端处或附近含有一个拓扑异构酶识别位点，在5’端处或附近也含有一个拓扑异构酶识别位点；2)至少一种第二种核酸分子(也可以是单链或是双链)，其具有第一端和第二端；和3)至少两种(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10种等)位点特异性拓扑异构酶。在第一种核酸分子底物末端用拓扑异构酶切割后，一个或两个末端的5’端或3’端可包含一种突出序列，或者可能是平端，或者一端能含有一个突出端而第二端可能是平端。当存在突出序列时，其通常与第二种(或其它)核酸分子的突出序列有足够的互补性，以使两种分子能够彼此特异杂交。
核酸分子通过拓扑异构酶介导的本发明的连接方法连接后，产生的核酸分子然后可用于重组反应，如本文其它部分所述的反应。
在该实施方案中有用的不同拓扑异构酶的数量部分取决于第一种核酸分子是仅在第一端或第二端含有拓扑异构酶识别位点，还是在两个末端都含有拓扑异构酶识别位点，进而，当核酸分子在两个末端含有拓扑异构酶识别位点时，取决于是否至少3’识别位点或5’识别位点是不同的。另外，也能够进行该方法，使得一种或多种至少第二种核酸分子也能在第一端或第二端或这两个末端的3’端处或附近含有一个拓扑异构酶识别位点，和/或在其5’端处或附近含有一个拓扑异构酶识别位点，其中位于或靠近其它核酸分子的3’端或5’端或两端的拓扑异构酶识别位点可能与第一种核酸分子中的拓扑异构酶识别位点相同或不同。这样，不同拓扑异构酶的数量进一步取决于根据本发明的方法连接的不同底物核酸分子的数量。
利用位点特异性拓扑异构酶进行本发明的方法的一个优点是，第一种核酸分子、第二种核酸分子和一种或多种其它核酸分子(可以是单链或是双链)能够以预定的方向共价连接。另一个优点是，通过利用希望的共价连接的重组核酸分子末端特异的引物进行扩增反应，能够在体外选择功能产物。同样，根据本发明的方法生产的共价连接的重组核酸分子(可以是单链或是双链)能够直接在进一步的程序中使用，例如转染细胞，或者作为模板进行扩增(例如PCR)、重组反应(例如，如此处所述的重组反应)、体外转录反应或偶联的转录/翻译反应。因此，不用进一步操作，共价连接的重组核酸分子即可用于不同目的。
在本发明的一个方面，第一种核酸分子以及在本发明的方法中使用的其它核酸可来源于至少第一群核酸分子，例如，来源于cDNA文库或组合文库，如合成寡核苷酸组合文库，第二种核酸分子以及在本发明的方法中使用的其它核酸可来源于至少第二群核酸分子。根据该方法，第一种核酸分子与第二种核酸分子的连接提供了一种生产共价连接的重组核酸分子(可以是单链或是双链)的组合群体的方法。根据该方法，一种或多种靶核酸分子也能与该群体的重组核酸分子连接，产生其它群体。这些组合分子群体能够进一步操作或分析，例如，通过蛋白质表达和筛选具有希望的特征的融合蛋白。
在一个实施方案中，实施本发明的一种方法，使得第一种核酸分子(可以是单链或是双链)以及在本发明的方法中使用的其它核酸包含一种开放阅读框，例如，一种分离的cDNA或基因编码序列，第二种核酸分子(可以是单链或是双链)包含一种调节元件，如启动子，它能与编码序列的5’端有效共价连接，使得编码序列能够由此转录。第二种核酸分子以及在本发明的方法中使用的其它核酸也能包含两种或多种调节元件，如启动子(例如GAL4启动子)、操纵基因(例如tet操纵基因、半乳糖操纵子操纵基因、lac操纵子操纵基因等)、内部核糖体进入位点和ATG起始甲硫氨酸密码子，它们彼此有效连接，能够根据本发明的方法与包含编码序列的第一种核酸分子的5’端有效共价连接。这种方法可进一步包括接触第三种核酸分子(可以是单链或是双链)，其包含例如聚腺苷酸化信号，它能与编码序列的3’端有效共价连接。该方法能用于生产表达型核酸分子，它们能够作为功能单位转录、翻译或转录并翻译。另外，根据本发明的方法能够将编码可检测标记物(例如表位标记)的核酸分子与第一种或第二种(或其它)核酸分子有效连接。例如，在通过拓扑异构酶共价连接的核酸分子的末端含有互补5’突出序列可有利于生产在这种构建体中具有希望的核苷酸序列方向的重组核酸分子(可以是单链或双链)。
在另一个实施方案中，实施本发明的一种方法，使得至少第一种核酸分子或至少第二种核酸分子以及在本发明的方法中使用的其它核酸是核苷酸序列群体之一，例如，cDNA文库、核苷酸序列组合文库或多样化核苷酸序列群体。在另一个实施方案中，本发明的一种方法还包括使产生的共价连接的双链重组核酸分子(例如在一条或两条链共价连接的重组核酸分子)接触PCR引物对，并扩增共价连接的重组核酸分子的全部或一部分。除了产生大量产物之外，扩增反应能够筛选包含希望的共价连接的双链重组核酸分子的构建体，特别是在将要共价连接的核酸分子包含互补突出序列时。因此，本发明的方法提供一种适于高通量分析的体外筛选方法。
本发明的一种方法也能通过接触下列成分进行：1)第一种核酸分子(可以是单链或是双链)，其具有第一端和第二端，其中在第一端或第二端或这两个末两端处，第一种核酸分子含有一个与3’端结合的拓扑异构酶(“携带拓扑异构酶”)；2)至少第二种携带拓扑异构酶的核酸分子(可以是单链或是双链)。优选地，携带拓扑异构酶的核酸分子在含有结合拓扑异构酶的末端含有一个5’羟基，尽管5’羟基也能用磷酸酶产生。本发明的方法能够只用第一种核酸分子和第二种核酸分子进行，或者在希望时可能包括第三种、第四种或更多种核酸分子(可以是单链或是双链)，其中所有核苷酸序列均确定。第一种或第二种(或其它)核酸分子可独立地含有与核苷酸序列一端的3’端或两端共价结合的拓扑异构酶，除非另外指出，第一种和第二种(或其它)核酸分子可能是相同或不同的。在这些方面，此处所述方法中使用的至少一种核酸分子可包含至少一个重组位点。进而，通过上述方法产生的核酸分子可用于重组反应，如本文其它部分所述的重组反应。
本发明的方法还可通过接触下列成分进行：1)具有第一端和第二端的第一种核酸分子(可以是单链或是双链)，其中在第一端或第二端或这两个末端处，第一种核酸分子含有一个与5’端共价结合的拓扑异构酶(即携带拓扑异构酶的5’端)；和2)至少一种第二种携带拓扑异构酶的核酸分子(可以是单链或是双链)，其包含至少一个携带拓扑异构酶的5’端。携带拓扑异构酶的核酸分子在含有结合拓扑异构酶的末端能含有一个3’羟基，或者能够用磷酸酶产生3’羟基。如此处公开的，这种方法能够只用第一种核酸分子和第二种核酸分子进行，或者在希望时可能包括第三种、第四种或更多种核酸分子(可以是单链或是双链)，其中每种核苷酸序列均确定，包括包含至少一个携带拓扑异构酶的5’端。第一种或第二种(或其它)核酸分子可独立地含有与核酸分子一端的5’端或两端共价结合的拓扑异构酶，除非另外指出，第一种和第二种(或其它)核酸分子可能是相同或不同的。在这些方面，此处所述方法中使用的至少一种核酸分子可包含至少一个重组位点。进而，通过上述和本文其它部分所述的方法产生的核酸分子可用于重组反应，如本文其它部分所述的重组反应。
本发明的一种方法还可通过接触下列成分进行：1)具有第一端和第二端的第一种核酸分子，其中在第一端或第二端或这两个末端处，第一种核酸分子含有与第一端或第二端或这两个末端的5’端共价结合的第一个拓扑异构酶，和与3’端共价结合的第二个拓扑异构酶(即，一个或两个末端含有携带拓扑异构酶的5’端和携带拓扑异构酶的3’端)；和2)至少一种第二种核酸分子，其优选地在将与含有拓扑异构酶的第一种核酸分子的一个末端共价连接的一端的5’端和3’端处含有或者能够使之含有羟基。该方法也能如下进行，其中含有携带拓扑异构酶的3’端或携带拓扑异构酶的5’端的末端的5’端或3’端分别含有一个拓扑异构酶识别位点，其中该方法还包括使这些成分接触在拓扑异构酶识别位点能够达到其活性的一种拓扑异构酶。在这些方面，此处所述方法中使用的至少一种核酸分子可包含至少一个重组位点。进而，通过上述和本文其它部分所述的方法产生的核酸分子可用于重组反应，如本文其它部分所述的重组反应。
本发明的这种方法能够只用第一种核酸分子和第二种核酸分子进行，或者在希望时能够包括第三种、第四种或更多种核酸分子，其中这些核酸分子如同第一种核酸分子、第二种核酸分子或其组合所定义的。第一种或第二种(或其它)核酸分子独立地能够、但不是必须含有与第二末端(即未确定的末端)的5’端、3’端或5’和3’端共价结合的一个或多个拓扑异构酶。此外，一种或多种这样的核酸分子还可包含一个或多个重组位点。除非另外指出，第一种和第二种(或者其它)核酸分子能够相同或不同。
本发明还涉及一种生产共价连接的双链重组核酸分子的方法，包括：1)利用一种PCR引物对扩增第一种核酸分子的一部分，其中该引物对的至少一条引物编码拓扑异构酶识别位点和任选地一个或多个重组位点的互补体，从而产生扩增的具有第一端和第二端的第一种核酸分子，其中第一端或第二端或这两个末端在3’端处或附近含有一个拓扑异构酶识别位点；和2)在拓扑异构酶能够切割扩增的含有一个拓扑异构酶识别位点的第一种核酸分子的末端，和含有一个拓扑异构酶识别位点的至少第二种核酸分子的末端，并且能够达到其连接活性的条件下，接触下列成分：a)扩增的第一种核酸分子；b)至少一种第二种核酸分子，其具有第一端和第二端，其中第一端或第二端或这个末两端在3’端处或附近含有一个拓扑异构酶识别位点或其切割产物，并且在同一末端的5’端含有或者能够使之含有一个羟基；和c)一种位点特异性拓扑异构酶。编码拓扑异构酶识别位点的互补体的PCR引物在其5’端能含有一个羟基，或者用该引物扩增的第一种核酸分子能够与一种磷酸酶接触，在其5’端产生一个羟基。编码拓扑异构酶识别位点的互补体的PCR引物也能在其5’端包含一种核苷酸序列，使得在位点特异性拓扑异构酶切割用引物扩增的第一种核酸分子后，该核酸分子含有5’突出序列，该序列与将要根据本发明的方法与第一种核酸分子共价连接的第二种(或其它)核酸分子的5’突出序列互补。在这些方面，此处所述方法中使用的至少一种核酸分子包含至少一个重组位点。进而，通过上述及本文其它部分所述的方法产生的核酸分子也可用于重组反应，如本文其它部分所述的反应。
本发明也涉及一种生产共价连接的双链重组核酸分子的方法，包括：1)利用一种PCR引物对扩增第一种核酸分子的一部分，其中该引物对的至少一条引物编码拓扑异构酶识别位点和任选地一个或多个重组位点的互补体，从而产生扩增的具有第一端和第二端的第一种核酸分子，其中第一端或第二端或这两个末端在5’端处或附近含有一个拓扑异构酶识别位点；和2)在至少一种拓扑异构酶能够切割扩增的含有一个拓扑异构酶识别位点的第一种核酸分子的末端和含有一个拓扑异构酶识别位点的至少第二种核酸分子的末端，并且能够达到其连接活性的条件下，接触下列成分：a)扩增的第一种核酸分子；b)至少第二种核酸分子，其具有第一端和第二端，其中第一端或第二端或这两个末端在5’端处或附近含有一个拓扑异构酶识别位点或者在同一末端的3’端处含有或者能够使之含有一个羟基；和c)至少一种位点特异性拓扑异构酶。扩增的第一种核酸分子通常在含有拓扑异构酶识别位点的末端的3’端处含有一个羟基，或者能够使之含有这种3’羟基。编码拓扑异构酶识别位点的PCR引物在其5’端(即拓扑异构酶识别位点的5’端)还包含一种核苷酸序列，使得在用位点特异性拓扑异构酶切割扩增的第一种核酸分子后，该核酸分子含有一种3’突出序列，该序列与将要根据本发明的方法与第一种核酸分子共价连接的第二种(或其它)核酸分子的3’突出序列互补。在这些方面，此处所述方法中使用的至少一种核酸分子包含至少一个重组位点。进而，通过上述及本文其它部分所述的方法产生的核酸分子也可用于重组反应，如本文其它部分所述的反应。
本发明还涉及一种生产共价连接的双链重组核酸分子的方法，包括：1)利用一种PCR引物对扩增第一种核酸分子的一部分，其中该引物对的至少一条引物包含一个拓扑异构酶识别位点、与拓扑异构酶识别位点互补的核苷酸序列和任选地一个重组位点，从而产生扩增的具有第一端和第二端的第一种核酸分子，其中扩增的第一种核酸分子在第一端或第二端或这两个末端的5’端处或附近含有一个拓扑异构酶识别位点，在3’端处或附近含有一个拓扑异构酶识别位点；和2)在i)至少一种拓扑异构酶能够在扩增的第一种核酸分子的末端的5’端处或附近切割拓扑异构酶识别位点，并且能够达到其连接活性，和ii)至少一种拓扑异构酶能够在扩增的第一种核酸分子的末端的3’端处或附近切割拓扑异构酶识别位点，并且能够达到其连接活性的条件下，接触下列成分：a)扩增的第一种核酸分子；b)至少一种第二种核酸分子，其具有第一端和第二端，其中第二种核酸分子在第一端或第二端或这两个末端处含有或者能够使之含有一个5’羟基和一个3’羟基；和c)至少两种位点特异性拓扑异构酶。因此，本发明提供一种核酸分子，它在一个或两个末端的5’端处或附近含有一个拓扑异构酶识别位点，在3’端处或附近含有一个拓扑异构酶识别位点。另外，本发明还提供这种核酸分子，它在5’端或3’端或这两个末端处携带拓扑异构酶。在这些方面，此处所述方法中使用的至少一种核酸分子包含至少一个重组位点。进而，通过上述及本文其它部分所述的方法产生的核酸分子也可用于重组反应，如本文其它部分所述的反应。
本发明还涉及一种寡核苷酸，其含有一种或多种IA型位点特异性拓扑异构酶的至少一个识别位点、与一种或多种IB型位点特异性拓扑异构酶的识别位点互补的至少一种核苷酸序列，和任选地至少一个重组位点。这种寡核苷酸例如可用作引物延伸反应的引物，或者可作为进行扩增反应如PCR引物对之一。这种寡核苷酸，此处称为寡核苷酸引物，可以是引物对中的一条，能用于产生双链核酸扩增产物，该产物在一个末端的5’端处或附近含有一个IA型拓扑异构酶识别位点，在同一末端的3’端处或附近含有一个IB型拓扑异构酶识别位点。寡核苷酸引物对还能含有一种核苷酸序列，该序列编码(或互补于)其它任何目的核苷酸序列或肽，例如，限制性内切酶识别位点、肽标记，和(希望时)一种或多种其它IA型或IB型拓扑异构酶识别位点，从而允许选择一种或多种方便或易于获得的拓扑异构酶实施本发明的方法。寡核苷酸引物还能在其5’端(即IA型拓扑异构酶识别位点或的5’端，或与IB型拓扑异构酶识别位点互补的核苷酸序列的5’端)包含一种核苷酸序列，使得在用位点特异性拓扑异构酶切割扩增的第一种核酸分子后，该核酸分子分别含有3’或5’突出序列，该序列分别与将要根据本发明的方法与第一种核酸分子共价连接的第二种(或其它)核酸分子的3’或5’突出序列互补，或者能够如下设计寡核苷酸引物，使得在切割由此产生的扩增的核酸分子后，产生一种携带拓扑异构酶的平端核酸分子。
本发明还涉及一种寡核苷酸，其含有至少一个拓扑异构酶识别位点或与之互补的核苷酸序列，和至少一个重组位点。这种寡核苷酸可以如上所述使用，例如，作为引物对的一个成员。
本发明的寡核苷酸长度通常为15-20、15-30、15-50、20-30、20-50、30-40、30-50、30-80、30-100、40-50、40-70、40-80、40-100、50-60、50-80、50-100、15-80、15-100或20-100(等)个核苷酸。
本发明也提供一种引物对，其包含至少一种如上所述的寡核苷酸引物，其中引物之一用作扩增反应的正向引物，另一条引物用作反向引物。该引物对中的第二条引物能够、但不是必须包含IA型拓扑异构酶识别位点、与IB型拓扑异构酶识别位点互补的核苷酸序列或这两种，并且能包含其它任何目的核苷酸序列和/或至少一个重组位点。在一个实施方案中，该引物对包含本发明的两种寡核苷酸引物，其中一条寡核苷酸引物可用作正向引物，第二条寡核苷酸引物用作反向引物，该引物对例如可用于生产在两个末端的两端含有拓扑异构酶识别位点和/或一个或多个重组位点的一种核酸分子扩增产物，其中位于该末端的IA型或IB型或这两种拓扑异构酶识别位点相同或不同。
因此，本发明还涉及一种核酸分子，它具有第一端和第二端，在第一端或第二端或这两个末端的5’端处或附近含有一个IA型拓扑异构酶识别位点，在3’端处或附近含有一个IB型拓扑异构酶识别位点。另外，本发明还提供如上所述的一种核酸分子，其中该核酸分子是一种携带拓扑异构酶的分子，如希望的，在一个或两个末端处包含一种稳定结合的IA型拓扑异构酶或IB型拓扑异构酶或这两种。这些核酸分子还可包含一个或多个重组位点。
在一个实施方案中，第一种核酸分子以及在本发明的方法中使用的其它核酸包含一种表达型核苷酸序列，该序列编码以下分子，如：多肽(例如，可以是含有intein的多肽)、反义核苷酸序列、干涉RNA(即“RNAi”)分子、核酶、转移RNA(即tRNA，包括但不限于抑制tRNA)、三螺旋核苷酸序列等，第二种(或其它)核酸分子包含一种转录调节元件，如启动子(例如GAL4操纵基因)、操纵基因(例如tet操纵基因、半乳糖操纵子操纵基因、lac操纵子操纵基因等)、增强子、沉默子、翻译起始位点或聚腺苷酸化信号，或者编码一种翻译调节元件，如起始甲硫氨酸、终止密码子、细胞区室化域、同源域等，或者有效连接的组合。第二种(或其它)核酸分子以及在本发明的方法中使用的其它核酸，可能是如扩增的第一种核酸分子一样制备的扩增的第二种(或其它)核酸分子，也能包含一个或多个多克隆位点(“MCS”)、可检测标记，例如酶、酶底物、荧光化合物、发光化合物、化学发光化合物、放射性核素、顺磁化合物和生物素；或者能包括一种标记物，可以是寡核苷酸标记，或者可以是肽标记，例如聚组氨酸标记、V5表位或myc表位。
在另一个实施方案中，用编码一种多肽(例如含有intein的多肽)或其结构域的第一种核酸分子和编码一种转录激活域或DNA结合域的第二种(或其它)核酸分子实施本发明的方法。该方法能用来生产共价连接的双链重组核酸分子，其编码可用于进行双杂交测定系统、特别是高通量双杂交测定的嵌合多肽。在另一个实施方案中，第一种核酸分子包含核苷酸序列群体，可以是cDNA文库、核苷酸序列组合文库、多样化核苷酸序列群体等。
本发明的方法提供一种生产共价连接的双链重组核酸分子的方法，该分子可用于向靶基因组DNA序列内位点特异地插入。靶基因组DNA序列可以是任何基因组序列，特别是基因，优选的是部分或全部核苷酸序列已知的基因。该方法能用两组PCR引物对和一种核酸分子进行。该核酸分子具有第一端和第二端，编码一种多肽，例如一种选择性标记，其中该核酸分子在每个末端的3’端包含一个拓扑异构酶识别位点或其切割产物，任选地，在每个末端的5’端含有一个羟基，其中5’端优选地包含彼此互不相同的突出序列。类似地，该核酸分子能够在一个或两个末端的5’端处或附近包含拓扑异构酶识别位点或其切割产物，任选地在一个或两个末端的3’端处含有一个羟基，其中一个或两个3’端能包含突出序列；或者该核酸分子的一个或两个末端的5’端和3’端均可包含一个拓扑异构酶识别位点或其切割产物(见图11)。在这些方面，此处所述方法中使用的至少一种核酸分子包含至少一个重组位点。进而，通过上述及本文其它部分所述的方法产生的核酸分子也可用于重组反应，如本文其它部分所述的重组反应。
通常如下选择两组PCR引物对，使得在适当DNA聚合酶如Taq聚合酶和包含待扩增序列的模板存在下，该引物扩增位于用于插入多肽(例如选择性标记)的靶位点上游(并且相邻)和下游(并且相邻)的基因组DNA序列部分。也可设计几组PCR引物对，使得扩增产物至少在将要与选择性标记共价连接的末端处，包括在5’端或3’端或这两端处或附近，含有一个拓扑异构酶识别位点，适于实施的本发明的特定方法。因此，第一组PCR引物对可包括，例如：1)第一条引物，它以5’-3’方向包含互补于将要与扩增产物共价连接的选择性标记末端5’突出序列的核苷酸序列、与拓扑异构酶识别位点互补的核苷酸序列和与靶基因组DNA序列的3’序列互补的核苷酸序列；和2)第二条引物，其包含位于与第一条引物互补的3’序列上游的靶基因组DNA的核苷酸序列。第二组PCR引物对包括：1)第一条引物，它从5’-3’包含互补于将要共价连接的选择性标记末端的5’突出序列的核苷酸序列、与拓扑异构酶识别位点互补的核苷酸序列和靶基因组DNA序列的5’序列的核苷酸序列，其中靶基因组DNA的5’序列位于与第一组PCR引物对的第一条引物互补的靶基因组DNA 3’序列的下游；和2)第二条引物，其包含与靶基因组DNA的3’序列互补的核苷酸序列，位于第一条引物所含靶基因组DNA的5’序列的下游。
在包含选择性标记的核酸分子、PCR扩增产物和至少一种拓扑异构酶接触后，利用本发明的方法产生共价连接的双链重组核酸分子。产生的双链重组核酸分子可用于进行基因组的同源重组，例如敲除细胞中一种基因的功能，或者使含有产生的双链重组核酸分子的细胞具有一种新的表型。该方法能够进一步用来生产在其基因组中稳定保留产生的重组核酸分子的转基因非人类生物。
本发明也涉及根据本发明的方法制备的组合物，并涉及可用于实施该方法的组合物。这些组合物可包括在本发明的方法中使用的一种或多种反应物和/或根据本发明的方法生产的一种或多种双链重组核酸分子。这些组合物可包括，例如：一种或多种含有一个或多个拓扑异构酶识别位点的核酸分子；一种或多种携带拓扑异构酶的核酸分子；一种或多种包含一个或多个重组位点的核酸分子；一种或多种引物，其可用于制备在用该引物制备的扩增产物的一端或两端的一个或两个末端含有一个拓扑异构酶识别位点的核酸分子；一种或多种拓扑异构酶；一种或多种底物核酸分子，包括，例如：核苷酸序列编码标记、标记物、调节元件等；根据本发明的方法生产的一种或多种共价连接的双链重组核酸分子；一种或多种包含或可用于包含如此处公开的核酸分子、引物或重组核酸分子的细胞；一种或多种用于进行引物延伸或扩增反应的聚合酶；一种或多种反应缓冲液；等等。在一个实施方案中，本发明的一种组合物包含两种或多种不同的携带拓扑异构酶的核酸分子和/或两个或多个不同的重组位点。该组合物还能包含至少一种拓扑异构酶。本发明的一种组合物也能包含一种位点特异性拓扑异构酶和一种共价连接的双链重组核酸分子，其中该重组核酸分子在每条链上含有位点特异性拓扑异构酶的至少一个拓扑异构酶识别位点，其中一条链上的拓扑异构酶识别位点与互补链上拓扑异构酶识别位点相距大约100个核苷酸以内，通常在大约5、10、20或30个核苷酸以内。
通过本发明的方法生产的产物分子可包含起始分子(或其部分)的任意组合，并且可以是任意大小和任何形式的(例如环形、线性、超螺旋等)，这取决于起始核酸分子或片段、分子上重组位点的位置和位点的重组顺序。
本发明的任何产物分子可以进一步操作、分析或在多种标准分子生物学技术或这些技术的组合中使用(体外或体内)。这些技术包括测序、扩增、核酸合成、蛋白质或肽表达(例如融合蛋白表达、抗体表达、激素表达等)、蛋白质-蛋白质相互作用(2-杂合体或反向2-杂合体分析)、同源重组或基因打靶和组合文库分析和操作。本发明也涉及(优选地通过重组)向一种或多种载体内克隆本发明的核酸分子，或者通过添加某些功能载体序列(例如复制起点)将本发明的核酸分子转移到载体内。一方面，重组和/或拓扑异构酶介导的连接在体外实现，进一步的操作或分析直接在体外进行。因此，进一步的分析和操作将不受向宿主细胞内导入本发明的分子和/或在宿主细胞中保留该分子的能力所限制。因此，直接在体外进一步操作或分析本发明的分子可以达到较短的时间和较高的通量，尽管体外分析或操作也能在通过宿主细胞传代后进行，或者能够直接在体内进行(在宿主细胞内)。
根据本发明的核酸合成步骤可包括：
(a)将目的核酸分子或模板与一种或多种引物和一种或多种核苷酸混合，形成一种混合物；和
(b)在足以合成与该分子或模板的全部或一部分互补的一种核酸分子的条件下温育该混合物。
合成的分子然后可以作为模板进一步合成与第一种合成分子的全部或一部分互补的核酸分子。因此，可以制备一种双链核酸分子(例如DNA)。优选地，在足以合成与第一种核酸分子的全部或一部分互补的第二种核酸分子的条件下，在一种或多种引物和一种或多种核苷酸存在下，进行这第二个合成步骤。一般而言，在一种或多种聚合酶(优选地可以是热稳定或嗜温的DNA聚合酶)的存在下进行一种或多种核酸分子的合成，尽管在这些合成反应中也可使用逆转录酶。因此，作为合成其它核酸分子的模板的核酸分子可以是RNA、mRNA、DNA或非天然或衍生的核酸分子。利用含有这种引物位点的起始核酸分子向产物分子中掺入一个或多个引物位点，可有利于根据本发明的核酸合成。因此，利用本发明的方法，可以在产物分子的一个或多个希望的位置处添加引物位点，这取决于起始分子内引物位点的位置和向产物分子中添加起始分子的顺序。
根据本发明的测序步骤可包括：
(a)将待测序的核酸分子与一种或多种引物、一种或多种核苷酸和一种或多种终止剂混合，形成一种混合物；
(b)在足以合成与待测序分子的全部或一部分互补的分子群体的条件下温育该混合物；和
(c)分离该群体，测定待测分子的全部或一部分的核苷酸序列。
这些测序步骤优选地在一种或多种聚合酶(例如DNA聚合酶和/或逆转录酶)和一种或多种引物存在下进行。用于测序的优选终止剂包括衍生的核苷酸，如双脱氧核苷酸(ddATP、ddTTP、ddGTP、ddCTP及其衍生物)。利用含有这种引物位点的起始核酸分子向产物分子内掺入一个或多个测序引物位点，可有利于根据本发明的核酸测序。因此，利用本发明的方法，可以在产物分子的一个或多个希望的位置处添加测序引物位点，这取决于起始分子内引物位点的位置和向产物分子中添加起始分子的顺序。
根据本发明的蛋白质表达步骤可包括：
(a)获得一种待表达的核酸分子，其包含一种或多种表达信号；和
(b)在该表达信号的控制下表达该核酸分子的全部或一部分，从而产生由该分子或其部分编码的肽或蛋白质。
在本文中，表达信号可与待表达的序列有效连接。表达的蛋白质或肽优选地在宿主细胞中(体内)表达，尽管也可以利用本领域众所周知的技术在体外进行表达。在蛋白质或肽表达后，可任选地分离或纯化蛋白质或肽产物。而且，表达的蛋白质或肽可在多种蛋白质分析技术中使用，包括2-杂种相互作用、蛋白质功能分析和激动剂/拮抗剂-蛋白质相互作用(例如通过药物、化合物或其它肽刺激或抑制蛋白质功能)。本发明生产的，特别是由本发明的组合分子表达产生的新的、独特的杂种蛋白质或肽(例如融合蛋白)通常可用于治疗。利用含有这些序列的起始核酸分子向产物分子内掺入一种或多种转录或翻译信号或调节序列、起始密码子、终止信号、剪接供体/受体序列(例如内含子序列)等有利于根据本发明的蛋白质表达。因此，利用本发明的方法，可以在产物分子的一个或多个希望的位置处添加表达序列，这取决于这些序列在起始分子内的位置和向产物分子中添加起始分子的顺序。
根据本发明的同源重组可包括：
(a)混合至少一种包含一个或多个重组位点和/或一个或多个拓扑异构酶识别位点的本发明的第一种核酸分子(优选地是一种产物分子)与至少一种靶核酸分子，其中第一种分子和靶分子含有一种或多种同源序列；和
(b)通过同源重组使第一种分子与靶核酸分子重组。图37显示能用于同源重组的核酸构建体的一个例子。本发明还包括制备能用于同源重组的核酸分子的方法，和通过这些方法制备的核酸分子，以及根据本发明的方法进行同源重组的细胞。
这种同源重组可以在体外发生，但优选地在体内(例如在宿主细胞内)完成。优选地，同源重组使含有重组位点的本发明的核酸分子(第一种核酸分子)的全部或一部分转移到含有同源序列的靶核酸分子的一个或多个位置。为了选择希望的产物和/或不希望的产物，正选择或负选择(例如使用选择性标记)有利于这种同源重组的选择。在一个优选方面，本发明的核酸分子包含至少一种选择性标记和至少两种与靶分子同源的序列。优选地，第一种分子包含至少两种同源序列，其位于至少一种选择性标记侧翼。
本发明有利于基因靶向核酸分子或载体的构建，该分子或载体可以用来敲除或突变目的序列或基因(或改变存在的序列，例如将突变序列转化为野生型序列)，特别是宿主或宿主细胞(如动物、植物、人、昆虫细菌等)内的基因或序列，或这些宿主或宿主细胞内的外来病原如病毒的序列。这种基因靶向优选地可包括靶向这些宿主细胞基因组上的序列。这种基因靶向可以在体外或体内进行。因此，在一个优选方面，本发明涉及一种靶向或突变一种序列或基因的方法，包括：
(a)获得至少一种本发明的核酸分子，其包含一个或多个重组位点和/或一个或多个拓扑异构酶识别位点(优选地一种或多种选择性标记)，其中该分子包含一种或多种与靶基因或目的序列同源的序列(一种或多种同源序列优选地位于本发明的分子上的一种或多种选择性标记的侧翼)；和
(b)在足以在靶序列或目的基因与本发明的分子之间的一个或多个位点处引起同源重组的条件下，使该分子接触一种或多种靶基因或目的序列，从而使本发明的分子的全部或一部分插入靶序列或基因内。
这种靶向方法可能引起序列或靶基因的缺失、灭活或部分灭活，使得该序列正常表达的表达产物(一般是蛋白质或肽)不产生或者以较高或较低水平产生，或者含有改变的蛋白质序列，可导致更高或更低的活性，或产生灭活或部分灭活的表达产物。优选地存在于本发明的分子上的选择性标记物有利于选择同源重组事件成功完成的候选物(例如宿主细胞)。因此，本发明提供一种生产宿主细胞、组织、器官和动物(例如转基因动物)的方法，其中含有通过本发明的靶向方法生产的修饰基因或序列。修饰序列或基因优选地包含通过本发明的方法产生的至少一个重组位点和/或至少一种选择性标记。
因此，更具体而言，本发明涉及一种靶向或突变一种序列或基因的方法，包括：
(a)获得至少一种本发明的核酸分子，其包含一个或多个重组位点、侧翼为与靶基因或目的序列同源的一种或多种序列的至少一种选择性标记，和任选地一个或多个拓扑异构酶识别位点；
(b)在足以在靶序列或目的基因与该分子之间的一个或多个位点处引起同源重组的条件下，使该分子接触一种或多种靶基因或目的序列，从而使本发明的分子的全部或一部分插入(优选地使至少一种选择性标记和/或至少一个重组位点插入)靶序列或基因内；和
(c)任选地选择包含本发明的分子的全部或一部分的序列或基因，或选择一种宿主细胞，其含有包含本发明的分子的全部或一部分的该基因或序列。
在本发明的另一方面，根据本发明引入靶序列的重组位点可以用来切割或切除插入靶序列内的分子的全部或一部分。因此，本发明允许在体外或体内切除这些序列，从而使靶基因或序列再次激活。在某些实施方案中，在鉴定和分离含有如上所述引入的改变的序列后，可以切除本发明的分子上存在的选择性标记。
本发明也提供向一种或多种载体内克隆本发明的起始或产物核酸分子或将本发明的产物分子转化为一种或多种载体的方法。一方面，重组起始分子，使一种或多种产物分子和这些产物分子(优选地通过重组)克隆到一种或多种载体内。另一方面，起始分子可直接克隆到一种或多种载体内，使得大量起始分子在载体内连接，从而产生含有本发明的产物分子的一种载体。另一方面，起始分子可直接克隆到一种或多种载体内，使得起始分子在载体内不连接(即起始分子被载体序列隔开)。另一方面，产物分子与起始分子的组合可以以任意顺序克隆到一种或多种载体内，从而产生一种载体，其包含由最初的起始分子和产物分子组合产生的新产物分子。
因此，本发明涉及一种克隆方法，包括：
(a)获得至少一种本发明的核酸分子，其包含一个或多个重组位点和/或一个或多个拓扑异构酶识别位点；和
(b)将该分子的全部或一部分转移到一种或多种载体内。本发明还包括通过这些方法制备的载体、包含这些载体的组合物和应用这些载体的方法。
这些载体通常包含一个或多个重组位点和/或一个或多个拓扑异构酶识别位点，该分子向载体内的转移优选地通过在载体上的一个或多个位点与本发明的分子上的一个或多个位点之间重组实现。另一方面，通过包含必要的载体序列(例如复制起点)，本发明的产物分子可以转化为可用作载体的分子。因此，根据本发明，利用含有这些序列的起始分子，可将这些载体序列掺入产物分子内。这些载体序列可以添加于产物分子的一个或多个希望的位置处，这取决于该序列在起始分子内的位置和向产物分子中添加起始分子的顺序。含有载体序列的产物分子可以为线性形式，或者可以通过在产物分子内的重组位点重组，或进行拓扑异构酶介导的连接反应，转化为环形或超螺旋形。这种产物分子的环化通常通过重组位于或靠近产物分子两端的重组位点完成。
本发明使用的载体序列可包含一种或多种元件和/或功能序列和/或位点(或其组合)，包括一个或多个测序位点或扩增引物位点、一个或多个多克隆位点、一种或多种选择性标记(例如，毒性基因、抗生素抗性基因、选择性标记等)、一种或多种转录或翻译位点或信号、一个或多个转录或翻译终止位点、一个或多个拓扑异构酶识别位点、一种或多种拓扑异构酶、一个或多个复制起点、一个或多个重组位点(或其部分)等。本发明使用的载体序列也可包含终止密码子，终止密码子可被抑制，从而使此处所述的希望的融合蛋白表达。因此，根据本发明，可利用载体序列向本发明的任何核酸分子内导入一种或多种元件、功能序列和/或位点，这些序列可用来进一步操作或分析克隆到这些载体内的任何核酸分子。例如，载体具有的引物位点(优选地位于克隆到载体内的插入片段的两端)允许测序或扩增克隆到载体内的产物分子的全部或一部分。另外，载体所含的转录或调节序列可使克隆到载体内的产物分子的全部或一部分所编码的肽、多肽或蛋白质表达。同样，载体所含的基因、基因部分或序列标记(如GUS、GST、GFP、His标记、表位标记等)允许产生含有克隆到载体内的产物分子的基因融合群体，或者允许产生由载体所含的序列标记与克隆到载体内的产物序列共同编码的大量肽、多肽或融合蛋白。这些基因、基因部分或序列标记可以与任选地受到抑制的终止密码子联合应用，以受控制地表达由克隆到载体内的插入序列和载体提供的基因或标记序列编码的融合蛋白。在一种构建体中，载体可包含一个或多个重组位点、一个或多个终止密码子和一种或多种标记序列。在一些实施方案中，标记序列可以与重组位点相邻。为了向目的基因中受控制地添加标记序列，任选地，可将终止密码子掺入标记序列或重组位点序列中。在这类实施方案中，目的基因可以通过重组克隆插入载体内，使得标记和目的基因的编码序列在同一阅读框内。当终止密码子不受抑制时，为了使含有天然N端的基因表达，目的基因可含有翻译起始信号，例如Shine-Delgarno序列、Kozak序列和/或IRES序列。目的基因也可在编码序列的3’端含有一个终止密码子。在某些实施方案中，在目的基因的N端和C端可含有一种标记序列。任选地，位于N端的标记序列可能含有一个终止密码子，目的基因可能含有一个终止密码子，而位于C端的标记可含有一个终止密码子。终止密码子可以是相同或不同的。在某些实施方案中，N端标记的终止密码子不同于目的基因的终止密码子。在这类实施方案中，可提供对应于一种或两种终止密码子的抑制tRNA。当含有两种终止密码子时，在同一载体、不同载体或宿主细胞基因组中可能独立地含有每一种抑制tRNA。抑制tRNA不需要都以相同的方式提供，例如，一种可以在含有目的基因的载体上，另一种可以在宿主细胞基因组中。这样，本发明一方面的核酸分子可包含一个隔开两个编码区的抑制型终止密码子。根据表达信号(例如启动子)的位置，抑制tRNA的表达导致终止密码子的抑制，从而产生一种融合肽，例如在表达蛋白质的N端和/或C端含有一种亲和标记序列的一种融合肽。不需抑制终止密码子，即可实现不含N端和/或C端标记序列的目的序列的表达。因此，本发明可通过重组有效构建含有目的基因或序列(例如一种或多种开放阅读框或“orfs”)的载体，用来根据需要可控制地表达融合蛋白。优选地，克隆到一种或多种载体内的本发明的起始核酸分子或产物分子包含至少一种开放阅读框(orf)。这种起始或产物分子也可包含功能序列(例如引物位点、转录或翻译位点或信号、终止位点(例如可任选地抑制的终止密码子)、复制起点等)，优选地包含调节基因表达的序列，包括转录调节序列和作为内部核糖体进入位点(IRES)的序列。优选地，至少起始或产物分子和/或载体之一包含可用作启动子的序列。这种起始或产物分子和/或载体也可包含转录终止序列、选择性标记、限制性内切酶识别位点等。
在一些实施方案中，载体包含两个拷贝的相同选择性标记，每个拷贝的侧翼为重组位点和/或拓扑异构酶识别位点。在其它实施方案中，载体包含两种不同的选择性标记，其侧翼均为两个重组位点。在一些实施方案中，一种或多种选择性标记可以是负选择性标记。
在特定方面，本发明提供一种克隆方法，包括生产包含至少第一和第二重组位点的至少一种第一种核酸分子，和包含至少第三和第四重组位点的至少一种第二种核酸分子，其中第一和第二重组位点能够与第三或第四重组位点重组，然后进行重组反应，使得两种核酸分子重组为一种或多种产物核酸分子，并将产物核酸分子克隆到一种或多种载体内。在这些实施方案中，重组位点位于第一种和/或第二种核酸分子的侧翼。而且，克隆步骤通常通过产物分子向包含一个或多个重组位点的载体内的重组反应完成。一方面，克隆步骤包括在产物核酸分子的位点之间进行重组反应，该产物核酸分子在第一次重组反应中与含有能与未反应的位点重组的重组位点的载体不能反应。
在某些实施方案中，可以利用常规偶联技术将重组位点和/或拓扑异构酶识别位点与目的分子附着。例如，能够合成包含重组位点和/或拓扑异构酶识别位点的寡核苷酸，使之包含可能相同或不同的一种或多种反应性功能部分。合适的反应性功能部分包括但不限于：氨基、环氧基、乙烯基、硫醇基等。包含一种或多种反应性功能部分的寡核苷酸的合成在本领域中属于常规。合成后，包含一种或多种反应性功能部分的寡核苷酸可以附着于目的分子或化合物上存在的一种或多种反应性基团。寡核苷酸可以通过一种或多种反应性功能部分与一种或多种反应性功能基团反应直接附着。在某些实施方案中，可以利用一种适当的连接基团实现这种附着，该连接基团能够与寡核苷酸上存在的一种或多种反应性功能部分反应，并与目的分子上存在的一种或多种反应性基团反应。在其它实施方案中，直接附着和通过连接基团附着都可以采用。本领域技术人员应当理解，寡核苷酸上的反应性功能部分可以与目的分子和/或化合物上的反应性功能部分相同或不同。适于寡核苷酸与目的分子偶联的试剂和技术可见Hermanson，《生物偶联技术》，Academic Press Inc.，San Diego，CA，1996。
本发明也涉及用于实施本发明的方法的组合物，包含这些组合物的试剂盒，和产生的用于实施本发明的方法的组合物。
本发明的组合物、方法和试剂盒可以用噬菌体-λ位点特异的重组系统制备和实施。此外，这些组合物、方法和试剂盒也可以用GATEWAYTM重组克隆系统和/或TOPO克隆系统和/或pENTR定向TOPO克隆系统制备和实施，这些系统可从Invitrogen Corporation(Carlsbad，California)获得。
在其它方面，本发明提供包含一个或多个(例如1、2、3、4、5个等)重组位点和/或一个或多个(例如1、2、3、4、5个等)拓扑异构酶识别位点的分离的核酸分子。本发明的这样一种分子在一个拓扑异构酶识别位点侧翼含有两个或多个重组位点。本发明的另一种这样的分子含有两个或多个重组位点和两个和多个拓扑异构酶识别位点，其中每个重组位点都可位于一个拓扑异构酶识别位点的侧翼。根据本发明该方面的核酸分子可以是线性、环状的，或者具有多种几何和结构中的任何一种，如螺旋、超螺旋等。在根据本发明该方面的核酸分子中方便地使用的重组位点包括但不限于：att位点(包括但不限于attB位点、attP位点、attL位点、attR位点等)、lox位点(包括但不限于loxP位点、loxP511位点等)、psi位点、dif位点、cer位点、frt位点和这些重组位点的突变体、变体和衍生物，它们保留进行重组的能力。在本发明该方面的核酸分子中方便地使用的拓扑异构酶识别位点优选地被下列酶识别并结合：I型拓扑异构酶(如IA型拓扑异构酶(包括但不限于：大肠杆菌拓扑异构酶I、大肠杆菌拓扑异构酶III、真核拓扑异构酶II、archeal逆促旋酶、酵母拓扑异构酶III、果蝇拓扑异构酶III、人拓扑异构酶III、肺炎链球菌拓扑异构酶III和质粒RP4的traE蛋白)和IB型拓扑异构酶(包括但不限于：真核生物核I型拓扑异构酶和痘病毒(如从痘苗病毒、兔纤维瘤病毒、ORF病毒、禽痘病毒、触染性软疣病毒和桑缘灯蛾昆虫痘病毒分离或产生的))，和II型拓扑异构酶(包括但不限于：细菌促旋酶、细菌DNA拓扑异构酶IV、真核DNA拓扑异构酶II(如小牛胸腺II型拓扑异构酶)和T偶数噬菌体编码的DNA拓扑异构酶)。
本发明也提供包含这些分离的核酸分子的载体(可以是表达载体)。根据本发明该方面的代表性载体包括但不限于：pcDNAGW-DT(sc)、pENTR-DT(sc)、pcDNA-DEST41、pENTR/D-TOPO、pENTR/SD/D-TOPO、pcDNA3.2/V5/GWD-TOPO和pcDNA6.2/V5/GWD-TOPO。本发明也提供包含本发明的这些分离的核酸分子或载体的宿主细胞。
在相关方面，本发明提供克隆核酸分子的体外方法。根据本发明该方面的方法可包含一个或多个步骤，包括：
(a)获得待克隆的一种核酸分子(在某些实施方案中可以是线性分子(可以是平端的或者不是)，如PCR产物，可任选地包含一种或多种基因或开放阅读框)；
(b)将要体外克隆的核酸分子与一种载体(可以是一种表达载体)混合，该载体包含至少一个侧翼为至少一个第一重组位点的拓扑异构酶识别位点和至少一个第二重组位点，其中第一和第二重组位点不能彼此重组，并与至少一种拓扑异构酶混合；和
(c)在能使待克隆的核酸分子插入载体中第一与第二拓扑异构酶识别位点之间的条件下温育该混合物，从而产生在第一与第二重组位点之间包含该核酸分子的第一种产物分子。本发明还包括通过上述方法制备的核酸分子。
根据本发明该方面的方法可包括另外一个或多个步骤，包括，例如：在有利于在第一与第三和第二与第四重组位点之间重组的条件下，使第一种产物分子接触至少一种载体，该载体包含至少一个彼此不能重组的第三和第四重组位点，从而产生至少一种第二种产物分子。根据本发明，可将通过这些方法生产的第一种和/或第二种产物分子插入一种宿主细胞内。本发明该方面使用的载体可包含至少一种其它核酸序列，选自：选择性标记、克隆位点、限制酶切位点、启动子、操纵子、复制起点、基因或部分基因(即基因片段或元件)。
本发明该方面的方法中使用的重组位点和拓扑异构酶识别位点包括但不限于本文其它部分所述。在特定方法中，在至少一种重组蛋白的存在下，第二种产物核酸分子与载体结合，这种重组蛋白可以是但不限于：Cre、Int、IHF、Xis、Fis、Hin、Gin、Cin、Tn3解离酶、TndX、XerC或XerD。在这些实施方案中，重组蛋白是Cre、Int、Xis、IHF或Fis。
本发明也提供包含这些分离的本发明的核酸分子的试剂盒，任选地可包含一种或多种其它成分，其选自：一种或多种拓扑异构酶、一种或多种重组蛋白、一种或多种载体、一种或多种具有聚合酶活性的多肽、一种或多种宿主细胞。
根据本领域所知，根据本发明的下列附图和描述，并根据权利要求书，本领域技术人员将了解本发明的其它优选实施方案。
附图简述
图1是一种基本重组克隆反应的示意图。
图2是利用本发明通过进行LR重组反应克隆两种核酸片段的示意图。
图3是利用本发明克隆两种核酸片段的示意图，包括：利用LR反应连接片段，然后利用BP重组反应将连接片段插入目标载体内。
图4是利用本发明克隆两种核酸片段的示意图，包括进行BP反应，然后进行LR反应。
图5是含有克隆的attB位点的两种核酸片段的示意图，其克隆方法包括：进行第一次BP反应，在一条片段上产生一个attL位点，在另一条片段上产生一个attR位点，附后通过LR反应结合这些片段。在该方法的变型中，P1、P2和/或P3可以是寡核苷酸或线性核苷酸片段。
图6是利用LR反应向目标载体的两个不同位点内克隆两种核酸片段的示意图。
图7是利用BP反应向目标载体的两个不同位点内克隆两种核酸片段的示意图。
图8A和图8B显示通过本发明的方法生产共价连接的双链核苷酸序列，该序列在每一端均含有一个元件。“PCR”是指聚合酶链反应；“TOPO”是指拓扑异构酶；拓扑异构酶示为与序列相连的圆形；“P1”和“P2”是指PCR引物。拓扑异构酶识别位点以黑体表示。
图9A-9C显示PCR产物的末端，代表巨细胞病毒启动子元件(“CMV”)、绿色荧光蛋白元件(“GFP”)和牛生长激素聚腺苷酸化信号(“BGH”)元件。用来构建图9A、9B和9C的PCR产物的引物用“F”数字表示(见图9D)。显示了包含拓扑异构酶识别位点(CCCTT)的一个或两个末端的部分。黑体表示突出序列。在图9A和9B中，一种(图9B)或两种(图9A)突出序列本身是回文序列。序列以常规方向显示，顶链从左至右为5’-3’方向，底链从左至右为3’-5’方向。序列之上或之下的括号中的数字表示SEQ ID NOs。
图10A和10B显示构建体(图10A)和实验结果(图10B)，该实验用来检测利用共价连接的编码多肽的双链重组核酸分子进行双杂交测定的能力。图10A显示用于转染的每种构建体的量。反应物的数量或体积之前的“p”表示质粒形式，“l”表示线形，“PCR”表示PCR扩增反应混合物。图10B显示与每种转染样品有关的β-半乳糖苷酶活性水平(“LacZ活性”)。LacZ活性提高表示阳性相互作用。
图11A-11F代表用于生产一条链共价连接的双链重组核酸分子的组合物和方法的不同实施方案。注意图11B-11F所示分子的一条或两条链中的切口。
图12A-12D显示用于生产共价连接的双链重组核酸分子的本发明的组合物和方法的不同实施方案。拓扑异构酶显示为实心圆，与底物核酸分子末端连接，或者在连接反应后释放。如图所示，底物核酸分子含有5’突出端，尽管它们类似地也能含有3’突出端或者可能是平端。另外，所示核酸分子显示含有与之结合的拓扑异构酶(携带拓扑异构酶)，显示含有与之结合的拓扑异构酶的一个或多个末端也能表示为含有一个拓扑异构酶识别位点，在此情况中，连接反应还需要在适当时添加一种或多种位点特异性拓扑异构酶。
图12A显示第一种核酸分子，其含有与一个末端的5’端和3’端连接的拓扑异构酶，还显示第一种核酸分子与第二种核酸分子的连接。
图12B显示第一种核酸分子，其含有与一个末端的3’端结合的拓扑异构酶，和第二种核酸分子，其含有与一个末端的3’端结合的拓扑异构酶，进一步显示由于接触含有携带拓扑异构酶的底物核酸分子的末端而产生的共价连接的双链重组核酸分子。
图12C显示第一种核酸分子，其含有与一个末端的5’端结合的拓扑异构酶，和第二种核酸分子，其含有与一个末端的5’端结合的拓扑异构酶，进一步显示由于接触含有携带拓扑异构酶的底物核酸分子的末端而产生的共价连接的双链重组核酸分子。
图12D显示一种核酸分子，其含有与两个末端的5’端和3’端连接的拓扑异构酶，进一步显示携带拓扑异构酶的核酸分子与两种核酸分子的连接(一端一个)。位于5’端和/或位于3’端的拓扑异构酶可以是相同或是不同的。
图13显示表达型双链重组核酸分子的产生和表达型双链重组核酸分子的扩增。表达型双链重组核酸分子是由三种核酸分子产生的，包括含有启动子的核苷酸序列、含有编码序列的核苷酸序列和含有聚腺苷酸化信号的核苷酸序列。在将要连接的双链核苷酸序列末端掺入互补的5’和/或3’突出序列有利于核酸分子的产生。表达型双链重组核酸分子如下产生：在第一末端的5’端含有IA型拓扑异构酶、在第二末端的3’端含有IB型拓扑异构酶的第一种核酸分子接触第二种核酸分子和第三种双链核苷酸序列。该表达型双链重组核酸分子用第一种引物和第二种引物扩增，第一种引物可与启动子上游的第二种双链重组核酸分子杂交，第二种引物可与聚腺苷酸化信号下游的第三种双链重组核酸分子杂交。
图14显示制备双链核酸分子的方法的一个实例，该分子含有与分子一端的5’端结合的拓扑异构酶(例如IA型拓扑异构酶)，其中该分子的同一端还包含3’突出端(见该图的(4))。
图15显示本发明的两个实施方案，其中单链或双链DNA核苷酸序列与单链RNA核苷酸序列连接。
图16是证明利用TOPO-GatewayTM或标准GatewayTM克隆方法进行PCR克隆的进入点的柔性的示意图。
图17是利用GatewayTM系统和定向TOPO-GatewayTM表达载体生产表达克隆的示意图。
图18是质粒pcDNAGW-DT(sc)和pENTR-DT(sc)中多克隆位点的图谱。
图19是质粒pcDNAGW-DT的物理图谱。
图20是质粒pcDNA-DEST41的物理图谱。
图21是质粒pENTR-DT的物理图谱。
图22显示质粒pENTR/D-TOPO中TOPO克隆位点的物理图谱(图22A)和核苷酸序列(图22B)。物理图谱显示改造的超螺旋形式的载体，而核苷酸序列显示含有一个起始密码子和开放阅读框(atgnnnnnn...)的载体。限制酶切位点加以标记，显示实际酶切位点。框出的区域代表进入克隆中的attL序列，它将在重组后转移到目标载体内。图22B所示的pENTR/D-TOPO的序列也可从InvitrogenCorporation                网                    站http：//www.invitrogen.com./content/vectors/pentr_dtopo_seq.txt下载。
图23显示质粒pENTR/SD/D-TOPO中TOPO克隆位点的物理图谱(图23A)和核苷酸序列(图23B)。物理图谱显示改造的超螺旋形式的载体，而核苷酸序列显示含有一个起始密码子和开放阅读框(atgnnnnnn...)的载体。限制酶切位点加以标记，显示实际酶切位点。框出的区域代表进入克隆中的attL序列，它将在重组后转移到目标载体内。图23B所示的pENTR/SD/D-TOPO的核苷酸序列也可从Invitrogen       Corporation         网         站http：//www.invitrogen.com./content/vectors/pentrsd_dtopo_seq.txt下载。
图24显示质粒pcDNA3.2/V5/GWD-TOPO的物理图谱(图24A)和核苷酸序列(图24B-C)。物理图谱显示改造的超螺旋形式的载体，而核苷酸序列显示含有一个起始密码子和开放阅读框(atgnnnnnn...)的载体。
图25显示质粒pcDNA6.2/V5/GWD-TOPO的物理图谱(图25A)和核苷酸序列(图25B-C)。物理图谱显示改造的超螺旋形式的载体，而核苷酸序列显示含有一个起始密码子和开放阅读框(atgnnnnnn...)的载体。
图26显示pENTR/SD-dTopo、pENTR-dTopo和pcDNAGW-dTopo的一种典型改造策略。
图27是在COS细胞中表达的HLA和CAT的Western印迹分析的照片。PCR扩增编码CAT(26kDa)和HLA(41kDa)的基因，Topo克隆到pENTR-dTopo内，转移到pcDNA-DEST40内(分别为第2道和第5道)或直接克隆到pcDNAGW-dTopo内(分别为第3道和第6道)。这些构建体用来转染COS细胞，裂解液通过Western印迹利用V5-HRP抗体偶联物探查重组V5标记的蛋白质。第1道和第4道代表只含细胞的对照。
图28是显示HLA和CAT在大肠杆菌中表达的凝胶照片。PCR扩增编码HLA(41kDa)和CAT(26kDa)的基因，Topo克隆到pENTR/SD-dTopo内，转移到pET-DEST42内(分别为第3道和第6道)，或直接克隆到pET101-dTopo内(分别为第4道和第7道)。这些构建体用来转化BL21(DE3)细胞，添加IPTG至1mM在37℃下3小时诱导表达。细胞裂解液在NuPage上电泳，用SafeStainTM染色。第2道和第5道代表来自各自的pET-DEST42培养液的未诱导的细胞裂解液。
图29是一种拓扑异构酶与靠近靶核酸分子3’端的识别位点结合的示意图。在拓扑异构酶结合后，下游序列(酶切位点的3’)能够分离，保留一种核酸分子，其含有与新生成的3’端共价结合的拓扑异构酶。
图30显示哺乳动物表达盒的蛋白质表达结果(Western blot)，该表达盒如下构建：PCR扩增表达元件和目的基因(CAT或V5)，然后用或不用第二次PCR进行TOPO连接反应。蛋白质表达数据来自转染悬浮TRex-CHO细胞(图30A)、粘附TRex-CHO细胞(图30B)和粘附TRex-293细胞(图30C)的表达盒。对于Western blot，检测中使用抗-V5或抗-CAT抗体。箭头所指为对应于V5或CAT蛋白的条带的位置。
图31是溴化乙锭染色的含PCR产物的琼脂糖凝胶的照片，显示Gateway相容的表达盒含有预期大小的插入片段。Gateway相容的表达盒如下构建：首先通过PCR产生CAT插入片段，然后利用TOPO连接反应导入attB1和attB2连接体。利用BP反应将纯化的DNA产物插入pDONR 222中。在转化大肠杆菌后，对菌落进行PCR，并在溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶上检查PCR产物。
图32是说明制备携带拓扑异构酶的pENTR载体的示意图，包括使pDONR载体携带拓扑异构酶，并根据本发明的方法进行BxPGATEWAY克隆反应。
图33是说明制备携带拓扑异构酶的pEXP载体的示意图，包括使pDEST载体携带拓扑异构酶，并根据本发明的方法进行LxRGATEWAY克隆反应，然后向pEXP载体的酶切末端添加TOPO连接体。
图34显示本发明的方法的示意图。第一步，例如通过PCR产生将要装配的核酸分子。第二步，利用本发明的方法(例如，包括利用拓扑异构酶将一种核酸片段的至少一条链与另一种核酸片段共价连接的方法)装配第一步的核酸分子。第三步，第二步产生的装配的核酸分子可以直接使用或者可以扩增后使用。本文其它部分描述了装配分子的用途的实例。
图35显示一种方法的示意图，该方法用拓扑异构酶连接两种核酸片段，然后通过单点重组使连接的核酸片段与另一种核酸片段重组。第一步，利用此处所述的连接核酸分子的任何拓扑异构酶介导的方法，将拓扑异构酶改造的含有attL1重组位点的核酸片段与另一种核酸片段连接，在此称为插入片段(标记为“I”)。然后在允许在两个重组位点之间进行重组的条件下，在LR CLONASETM的存在下，拓扑异构酶装配的核酸片段接触含有一个启动子(标记为“P”)和一个attR1重组位点的另一种核酸片段。重组导致形成含有与启动子有效连接的插入核酸片段的核酸分子。此外，一个attB1重组位点位于终产物的启动子与插入片段之间。该图所示的重组位点是attL和attB位点，但是也能使用任何合适的重组位点。
图36显示利用拓扑异构酶和重组方法重组和/或连接5种不同核酸片段并环化产物的方法的示意图。第一步，利用此处所述的拓扑异构酶介导的任何连接核酸分子的方法，拓扑异构酶改造的含有attL1和attL2重组位点和负选择性标记(标记为“NM”)的核酸片段与另一种核酸片段连接，在此称为插入片段(标记为“I”)。在允许在多个重组位点之间进行重组的条件下，在LR CLONASETM(InvitrogenCorporation，Carlsbad，CA)的存在下，拓扑异构酶装配的核酸片段然后接触另外两种核酸片段，它们均含有至少一个attR重组位点。在一些这样的方法中，例如，TOPO改造的载体与一种或多种核酸片段(例如一种或多种PCR产物)在室温(例如约20-25℃)下温育大约5-30(优选地约10)分钟；然后在大约80℃下温育大约20分钟热处理该反应液，然后按照使用说明书(Invitrogen Corporation)在标准LR反应中使用该反应混合液，不同之处在于LR反应的温育时间延长到约3个小时。重组反应导致产物分子的形成，其中启动子连接于(1)插入分子和(2)复制起点(标记为“ori”)。该产物分子然后与一种核酸片段连接，后者在两个末端经拓扑异构酶改造，含有一种正选择性标记(标记为“PM”)。此外，最后的拓扑异构酶连接步骤导致形成环状核酸分子。图中所示的重组位点是attL和attB位点，但也能使用任何合适的重组位点。
图37显示一种制备用于进行同源重组的核酸分子的方法的示意图。在此情况中，利用包括拓扑异构酶介导地共价连接各种片段的核酸链的方法，使三种核酸片段彼此连接。这些核酸片段中的两种均含有一个正选择标记，和位于负选择标记侧翼的两个attL位点。因此，第一步产生的核酸分子含有一种核酸片段，此处被称为插入片段。插入片段的每一端含有(1)正选择标记和(2)位于负选择标记侧翼的两个重组位点。在两种核酸片段(含有与染色体座位具有同源性的区域，其中设计核酸终产物用于整合(标记为“HR1”和“HR2”))存在下，LR CLONASETM催化的重组导致形成所示的终产物核酸分子。本领域技术人员应当知道，在该图所示的方法中能够使用任何合适的重组位点。
图38显示利用拓扑异构酶连接4种核酸片段，产生一种在靠近末端处含有重组位点(标记为“L1”和“L2”)的线性核酸分子的示意图。在拓扑异构酶介导的核酸链连接后，连接点处没有切口。第二步，在允许在重组位点之间进行重组的条件下，在LR CLONASETM的存在下，拓扑异构酶装配的核酸片段接触另一种核酸片段，后者含有一个复制起点(标记为“ori”)、一个正选择标记(标记为“PM”)、一个attR1重组位点和一个attR2重组位点。重组导致形成如图所示的一种环状核酸分子。该图所示的重组位点是attL和attB位点，但也能够使用任何合适的重组位点。
图39显示利用拓扑异构酶和重组位点一步连接两种核酸片段产生一种环状核酸分子的示意图。核酸片段之一含有一个attL1重组位点(标记为“L1”)、一个启动子(标记为“P”)和与一端共价连接的拓扑异构酶分子。另一条核酸片段含有一个attR1重组位点(标记为“R1”)、一个开放阅读框(标记为“ORF”)、一个复制起点(标记为“ORI”)、一个正选择标记(标记为“PM”)和与一端共价连接的拓扑异构酶分子。因此，当在允许在attL与attR重组位点之间进行重组及核酸链拓扑异构酶介导的核酸链连接的条件下，在LR CLONASETM的存在下，这两种核酸片段彼此连接，形成具有所示结构的一种环状分子。该图所示的重组位点是attL和attB位点，但也能够使用任何合适的重组位点。
图40显示利用拓扑异构酶介导的方法连接两种核酸片段产生一种环状核酸分子的示意图。该环状分子在attL1与attL2重组位点(标记为“L1”和“L2”)之间含有一个开放阅读框(标记为“ORF”)。拓扑异构酶装配的产物然后与含有attR1和attR2重组位点的另一种环状分子重组，产生第三种环状核酸分子，其在attB1与attB2重组位点之间含有开放阅读框。此外，开放阅读框也可与启动子有效连接。该图所示的重组位点是attL和attB位点，但也能够使用任何合适的重组位点。
发明详述
定义
在下面的描述中，广泛使用在重组核酸技术中应用的大量术语。为了清楚且更加一致地理解本说明书和权利要求书，包括这些术语定义的范围，给出下列定义。
基因：如此处所用的，基因是一种核酸序列，它含有多肽、蛋白质或功能RNA(例如核酶、tRNA、rRNA、mRNA等)表达所需的信息。它包含启动子和结构基因开放阅读框序列(orf)以及与蛋白质表达有关的其它序列。
结构基因：如此处所用的，结构基因是指一种核酸序列，它可被转录为信使RNA，然后翻译为特定多肽所特有的氨基酸序列。
宿主，如此处所用的，宿主是任何原核或真核生物，它是复制型表达载体、克隆载体或任何核酸分子的受体。核酸分子可含有、但是不限于：结构基因、转录调节序列(如启动子、增强子、阻抑物等)和/或复制起点。如此处所用的术语“宿主”、“宿主细胞”、“重组宿主”和“重组宿主细胞”可以互换使用。关于这些宿主的例子，见Maniatis等人，《分子克隆：实验室手册》，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，New York(1982)。
转录调节序列：如此处所用的，转录调节序列是核酸分子上所含的一种功能核苷酸片段，它可以是任何构型或几何形状，用来调节一种或多种结构基因转录为信使RNA。转录调节序列的例子包括但不限于：启动子、操纵基因、增强子、阻抑物等。转录调节序列也可以调节编码功能RNA(例如核酶、tRNA、rRNA、mRNA等)的核酸分子的转录。
启动子：如此处所用的，启动子是转录调节序列的一个实例，具体而言是通常描述为位于起始密码子近端的基因5’区的核酸序列。相邻核酸片段的转录在启动区处启动。抑制剂使抑制型启动子的转录率降低。诱导剂使诱导型启动子的转录率提高。组成型启动子的转录率不被特异调节，虽然在普通代谢条件的影响下它可能改变。
插入片段：如此处所用的，插入片段是希望的核酸片段，它是较大核酸分子的一部分。
靶核酸分子：如此处所用的，靶核酸分子是一种目的核酸片段，优选地是本发明的化合物和方法作用的核酸。这些靶核酸分子优选地含有一种或多种基因或基因部分。
插入供体：如此处所用的，插入供体是携带插入片段的本发明的两种亲代核酸分子之一(例如RNA或DNA)。插入供体分子包含两端为重组位点的插入片段。插入供体可以是线性或环状的。在本发明的一个实施方案中，插入供体是一种环状核酸分子，任选地是超螺旋的，还包含重组信号以外的克隆载体序列(见图1)。当利用一群插入片段或一群核酸片段制备插入供体时，产生一群插入供体，并且可以根据本发明使用。
产物：如此处所用的，产物是希望的子分子，其包含在重组克隆过程中在第二次重组事件后产生的A和D序列(见图1)。产物含有待克隆或亚克隆的核酸。根据本发明，当使用一群插入供体时，产生的产物分子群体将含有插入供体的插入片段群体的全部或一部分，优选地含有插入供体的一群典型原始分子。
识别序列：如此处所用的，识别序列(另外，且相当地，在此也称作“识别位点”)是一种特定的序列，蛋白质、化学化合物、DNA或RNA分子(例如限制性内切核酸酶、拓扑异构酶、修饰甲基化酶或重组酶)可识别并与之结合。在本发明中，识别序列通常是指重组位点(另外还可称为重组酶识别位点)或拓扑异构酶识别位点。例如，Cre重组酶的识别序列是loxP，它是一种34碱基对的序列，由位于8碱基对核心序列侧翼的两个13碱基对的反向重复序列(作为重组酶结合位点)组成。参见Sauer，B.，Current Opinion in Biotechnology 5：521-527(1994)的图1。这类识别序列的其它例子有可被重组酶(整合酶)识别的attB、attP、attL和attR序列。attB是一种约25个碱基对的序列，含有两个9碱基对的核心型Int结合位点和7碱基对的重叠区。attP是一种约240个碱基对的序列，含有核心型Int结合位点和臂型Int结合位点，以及辅助蛋白整合宿主因子(IHF)、FIS和切除酶(Xis)位点。参见Landy，Current Opinion in Biotechnology 3：699-707(1993)。这些位点也可以根据本发明改造，以提高本发明的方法的产物产量。当这些工程位点缺乏P1或H1域而使重组反应不可逆时(例如attR或attP)，这些位点可以被称为attR’或attP’，表示这些位点的结构域以某种方式修饰。拓扑异构酶识别位点的例子包括但不限于：序列5’-GCAACTT-3’，可被大肠杆菌拓扑异构酶III(I型拓扑异构酶)识别；序列5’-(C/T)CCTT-3’，是一种可被大多数痘病毒拓扑异构酶(包括痘苗病毒DNA拓扑异构酶I)特异结合的拓扑异构酶识别位点；以及如本文其它部分所述的、本领域公知的其它序列。
重组蛋白：如此处所用的，重组蛋白包括切除或整合的蛋白质、酶、辅因子或参与涉及一个或多个重组位点的重组反应的相关蛋白质，它们可以是野生型蛋白质(参见Landy，Current Opinion inBiotechnology 3：699-707(1993))，或其突变体、衍生物(例如含有重组蛋白序列或其片段的融合蛋白)、片段和变体。
重组位点：如此处所用的，重组位点是参与重组蛋白引起的整合/重组反应的核酸分子上的一种识别序列。重组位点是有关核酸分子上的不连续核酸部分或片段，在整合或重组的最初阶段可被位点特异的重组蛋白识别并结合。例如，Cre重组酶的重组位点是loxP，它是34碱基对的序列，由位于8碱基对核心序列侧翼的两个13碱基对的反向重复序列(作为重组酶结合位点)组成。参见Sauer，B.，CurrentOpinion in Biotechnology 5：521-527(1994)的图1。识别序列的其它例子包括此处所述的attB、attP、attL和attR序列，及其突变体、片段、变体和衍生物，它们可被重组蛋白(Int)和辅助蛋白整合宿主因子(IHF)、FIS和切除酶(Xis)识别。参见Landy，Current Opinion inBiotechnology 3：699-707(1993)。
重组克隆：如此处所用的，重组克隆是一种方法，如美国专利号5,888,732、6,143,557、6,171,861、6,270,969和6,277,608所述(其内容在此完全引用作为参考)，也如此处所述，由此核酸分子的片段或这些分子的群体在体外或体内交换、插入、替换、置换或修饰。优选地，这种克隆方法是一种体外方法。
抑制盒：如此处所用的，抑制盒是一种核酸片段，其含有阻抑基因或亚克隆载体中所含的选择性标记。
选择性标记：如此处所用的，选择性标记是一种核酸片段，它可使人们通常在特定条件下选择一种分子(例如复制子)或含有它的细胞。这些标记可能编码一种活性，例如，但不限于：RNA、肽或蛋白质的产生，或者能为RNA、肽、蛋白质、无机和有机化合物或组合物等提供结合位点。选择性标记的例子包括但不限于：(1)编码提供有毒化合物(例如抗生素)抗性的产物的核酸片段；(2)编码在受体细胞中缺乏的产物(例如tRNA基因、营养缺陷标记)的核酸片段；(3)编码可抑制基因产物活性的产物的核酸片段；(4)编码易于鉴定的产物(例如表型标记物，如β-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白(GFP)和细胞表面蛋白)的核酸片段；(5)可结合不利于细胞存活和/或功能的产物的核酸片段；(6)可抑制以上1-5所述任一种核酸片段的活性的核酸片段；(7)可结合可修饰一种底物的产物(例如限制性内切核酸酶)的核酸片段；(8)能用来分离或鉴定希望的分子(例如特异蛋白质结合位点)的核酸片段；(9)编码一种可能无功能(例如对于分子亚群的PCR扩增)的特异核苷酸序列的核酸片段；(10)核酸片段，当缺乏时，直接或间接地提供对特定化合物的抗性或敏感性；和/或(11)编码在受体细胞中有毒的产物的核酸片段。
筛选方案：如此处所用的，筛选方案是允许从含有进入克隆或载体、目标载体、供体载体、表达克隆或载体、任何中间物(例如共整合体和复制子)和/或副产物的混合物中筛选、富集或鉴定希望的产物的任何方法。一个优选实施方案的筛选方案包括在重组克隆过程中连接或不连接的至少两种成分。一种成分是选择性标记。另一种成分控制选择性标记在体外或体内的表达，或携带含选择性标记的质粒的细胞(或核酸分子，例如复制子)的存活。一般而言，这种控制元件是选择性标记的阻抑物或诱导物，但是也能使用控制选择性标记表达或活性的其它方法。是使用阻抑制还是激活物取决于标记是用于正选择还是用于负选择，和不同核酸片段的确切排列，本领域技术人员周知。在一些优选实施方案中，筛选方案导致只选择或富集一种或多种希望的产物。如此处定义的，核酸分子的选择包括：(a)选择或富集存在希望的核酸分子的，和(b)不选择或富集存在不是希望的核酸分子的核酸分子的。
在一个实施方案中，筛选方案(能反过来进行)将采用三种形式之一，将用图1来说明。此处用选择性标记和阻抑物说明，第一选择含有片段D而缺乏片段C的分子。第二不选择含有片段C的分子而选择含有片段D的分子。第二种形式的可能的实施方案包括一种携带一种基因的核酸片段，该基因对将导入体外反应产物的细胞有毒。毒性基因可以是表达为毒性基因产物(毒性蛋白质或RNA)的核酸，或者可能其本身具有毒性。(在后一种情况中，毒性基因可理解为包括经典定义“遗传性状”)。
这类毒性基因产物的例子在本领域众所周知，包括但不限于：限制性内切核酸酶(例如DpnI)、凋亡相关基因(例如ASK1或bcl-2/ced-9家族的成员)、逆转录病毒基因，包括人类免疫缺陷病毒(HIV)基因、防卫素，如NP-1、反向重复序列或配对回文核酸序列、噬菌体裂解基因，如来自φX174或噬菌体T4；抗生素敏感性基因，如rpsL、抗微生物敏感性基因，如pheS、质粒杀伤基因、产生细菌毒性基因产物的真核生物转录载体基因，如GATA-1，和在没有抑制功能的情况下杀伤宿主的基因，例如kicB、ccdB、φX174E(Liu，Q等人，Curr.Biol.8：1300-1309(1998))，和对复制子稳定性和/或复制有负面影响的其它基因。此外，毒性基因也可在体外选择，例如，一种限制酶切位点。
与诱导型启动子有效连接的编码限制性内切核酸酶的多种基因众所周知，可以在本发明中使用。参见，例如美国专利号4,960,707(DpnI和DpnII)；5,000,333、5,082,784和5,192,675(KpnI)；5,147,800(NgoAIII和NgoAI)；5,179,015(FspI和HaeIII)；5,200,333(HaeII和TaqI)；5,248,605(HpaII)；5,312,746(ClaI)；5,231,021和5,304,480(XhoI和XhoII)；5,334,526(AluI)；5,470,740(NsiI)；5,534,428(SstI/SacI)；5,202,248(NcoI)；5,139,942(NdeI)；5,098,839(PacI)。参见Wilson，G.G.，Nucl.Acids Res.19：2539-2566(1991)；和Lunnen，K.D.等人，Gene 74：25-32(1988)。
第二种形式，片段D携带一种选择性标记。毒性基因可清除带有载体供体、共整合体和副产物分子的转化子，而选择性标记能用来选择含有产物的细胞而不选择只含插入供体的细胞。
第三种形式选择在同一分子上顺式含有片段A和D的细胞，但不选择在不同分子上反式含有这两种片段的细胞。例如一种选择性标记，它分裂为两种无活性的片段，分别在片段A和D上。
这些片段相对于重组位点的排列使得当这些片段通过重组事件集合在一起时，它们构成一种功能性选择性标记。例如，重组事件能连接一种启动子与一种结构核酸分子(例如一种基因)，能连接结构核酸分子的两种片段，或者能连接编码存活所需的异二聚基因产物的核酸分子，或者能连接一种复制子的部分。
位点特异性重组酶：如此处所用的，位点特异性重组酶是一类重组酶，一般具有至少下列4种活性(或其组合)：(1)识别一种或两种特定核酸序列；(2)切割该序列；(3)与链交换有关的拓扑异构酶活性；(4)将切割的核酸链重新封闭的连接酶活性。参见Sauer，B.，Current Opinions in Biotechnology 5：521-527(1994)。保守性位点特异性重组与同源重组和转座的不同在于对两种配偶体的高度特异性。链交换机制包括在不发生DNA合成的情况下，特定核酸序列的切割和再连接(Landy，A.(1989)Ann.Rev.Biochem.58：913-949)。
载体：如此处所用的，载体是一种为插入片段提供有用的生物学或生物化学性质的核酸分子(优选地DNA)。例子包括：质粒、噬菌体、自主复制序列(ARS)、着丝粒和能够复制或在体外或在宿主细胞内复制的其它序列，或能够将希望的核酸片段转运到宿主细胞内希望的位置的序列。载体可含有一个或多个限制性内切核酸酶识别位点，在该位点处序列能够以一种可测定的方式酶切，而不丧失载体的基本生物学功能，并且为了发生复制和克隆，一种核酸片段能够剪接入该位点内。载体还能提供引物位点，例如用于PCR，转录和/或翻译起始和/或调节位点、重组信号、复制子、选择性标记等。显然，为了将一种片段克隆入根据本发明使用的克隆载体内，也能应用不需要使用重组、转座或限制性酶的插入希望的核酸片段的方法(例如，但不限于：PCR片段的UDG克隆(美国专利号5,334,575，在此完整引用作为参考)、TA克隆PCR克隆(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)(也称为直接连接克隆)等)。克隆载体还能含有一种或多种适于鉴定克隆载体转化的细胞的选择性标记。
亚克隆载体：如此处所用的，亚克隆载体是一种克隆载体，包含一种环状或线性核酸分子，该分子优选地包含一种合适的复制子。在本发明中，亚克隆载体(图1中的片段D)也能含有功能和/或调节元件，希望将这些元件掺入终产物内，以作用于或者含有克隆的核酸插入片段(图1中的片段A)。亚克隆载体也能含有一种选择性标记(优选地DNA)。
载体供体：如此处所用的，载体供体是本发明的两种亲本核酸分子(例如RNA或DNA)之一，其携带包含将成为希望的产物的一部分的核酸载体的核酸片段。载体供体包含亚克隆载体D(或者，如果插入片段供体已经不含克隆载体，它也能被称为克隆载体)和侧翼为重组位点的片段C(见图1)。片段C和/或D能够含有有利于选择希望的产物子分子的元件，如上对于筛选方案所述。重组信号可以是相同或不同的，能够受到相同或不同的重组酶的作用。另外，载体供体也可以是线性或环状的。
引物：如此处所用的，引物是一种单链或双链寡核苷酸，在一种核酸分子(例如一种DNA分子)的扩增或聚合过程中通过核苷酸单体的共价键合延伸。一方面，引物可以是测序引物(例如，通用测序引物)。另一方面，引物可包含重组位点或其部分。
模板：如此处所用的，模板是一种将要扩增、合成或测序的双链或单链核酸分子。对于双链DNA分子，优选地在这些分子扩增、合成或测序之前进行链变性形成第一链和第二链，或者双链分子可以直接作为模板。对于单链模板，与模板的至少一部分互补的引物在适当条件下杂交，一种或多种具有聚合酶活性的多肽(例如DNA聚合酶和/或逆转录酶)然后可以合成与模板的全部或一部分互补的一种分子。此外，对于双链模板，一种或多种转录调节序列(例如一种或多种启动子)可以与一种或多种聚合酶联合应用，产生与模板的全部或一部分互补的核酸分子。根据本发明新合成的分子可以与原始模板长度相同或更短。新合成分子的合成或延伸过程中的错配掺入或链滑移可产生一个或多个错配碱基对。因此，合成的分子不需要与模板严格互补。另外，在合成或扩增过程中也可以使用一群核酸模板，产生一般是原始模板群体的一群核酸分子。
掺入：如此处所用的，掺入的意思是成为核酸(例如DNA)分子或引物的一部分。
文库：如此处所用的，文库是核酸分子(环状或线性的)的集合。在一个实施方案中，文库可包含多种(即两种或多种)核酸分子，它们可能或者可能不来自于普通来源的生物、器官、组织或细胞。在另一个实施方案中，文库代表一种生物的核酸内容物的全部或一部分或重要部分(“基因组”文库)，或者是代表在细胞、组织、器官或生物中表达的核酸分子的全部或一部分或重要部分的一组核酸分子(cDNA文库或衍生的片段)。文库也可包含通过一种或多种序列的从头合成、诱变等制备的随机序列。这些文库可能或者可能不包含于一种或多种载体中。
扩增：如此处所用的，扩增是利用一种或多种具有聚合酶活性的多肽(例如一种或多种核酸聚合酶或一种或多种逆转录酶)提高核苷酸序列拷贝数的任何体外方法。核酸扩增使核苷酸掺入DNA和/或RNA分子或引物中，从而形成与模板互补的一种新的核酸分子。形成的核酸分子及其模板能用作合成其它核酸分子的模板。如此处所用的，一个扩增反应可由多轮核酸复制组成。DNA扩增反应包括，例如，聚合酶链反应(PCR)。一个PCR反应可由5-100个循环的DNA分子变性和合成组成。
核苷酸：如此处所用的，核苷酸是碱基-糖-磷酸的组合。核苷酸是核酸分子(DNA和RNA)的单体单位。术语核苷酸包括核糖核苷三磷酸ATP、UTP、CTP、GTP和脱氧核糖核苷三磷酸如dATP、dCTP、dITP、dUTP、dGTP、dTTP或其衍生物。这些衍生物包括，例如：[(S]dATP、7-脱氮-dGTP和7-脱氮-dATP。如此处所用的术语核苷酸也指双脱氧核糖核苷三磷酸(ddNTPs)及其衍生物。双脱氧核糖核苷三磷酸的说明性实例包括但不限于：ddATP、ddCTP、ddGTP和ddTTP。根据本发明，“核苷酸”可以不标记或用众所周知的技术可检测地标记。可标记标记物包括，例如：放射性同位素、荧光标记物、化学发光标记物、生物发光标记物和酶标记物。
核酸分子：如此处所用的，核酸分子是任意长度的相邻核苷酸序列(riboNTPs、dNTPs或ddNTPs，或其组合)，它可编码全长多肽或其任意长度的片段，或者可以是非编码的。如此处所用的术语“核酸分子”和“多核苷酸”可以互换使用。
寡核苷酸：如此处所用的，寡核苷酸是一种合成或天然的分子，包含共价连接的核苷酸序列，一个核苷酸的戊糖的3’位置与相邻核苷酸的戊糖的5’位置之间通过一个磷酸二酯键连接。
多肽：如此处所用的，多肽是任意长度的相邻氨基酸序列。如此处所用的术语“肽”、“寡肽”或“蛋白质”可以与术语“多肽”互换使用。
杂交：如此处所用的术语杂交是指两种互补单链核酸分子(RNA和/或DNA)的碱基配对，产生一种双链分子。如此处所用的，即使两种核酸分子的碱基配对不完全互补，也可以杂交。因此，只要使用本领域众所周知的适当条件，错配的碱基不会阻止两种核酸分子的杂交。在某些方面，可以在“严格条件”下杂交。如此处所用的“严格条件”是指在包含下列成分的溶液中42℃温育过夜：50％甲酰胺、5×SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5×Denhardt’s溶液、10％硫酸葡聚糖和20mg/ml变性剪切鲑精DNA，随后在约65℃下用0.1×SSC洗涤滤纸。
如此处所用的，在重组核酸技术和分子和细胞生物学领域使用的其它术语，本领域技术人员应当周知。
概述
本发明涉及用于重组和/或拓扑异构酶介导地连接两种或多种核酸片段或分子或其它分子和/或化合物(或其组合)的方法、组合物和试剂盒。本发明也涉及优选地通过重组位点(可包括重组蛋白识别序列、拓扑异构酶识别序列等)或其部分将这些连接的核酸或其它分子和/或化合物与一种或多种载体或结构连接。因此，本发明一般涉及通过包含一个或多个拓扑异构酶识别位点和/或一个或多个重组位点或其部分的氨基酸接头连接多种核酸或其它分子和/或化合物。根据原始材料，本发明产生的连接产物可包含多种相同或不同的核酸或其它分子和/或化合物。这些原始材料包括但不限于：包含一个或多个重组位点或其部分的任何核酸(或其衍生物，如肽核酸(PNAs))、化学化合物、可检测标记分子(如荧光分子和化学发光分子)、药物、肽或蛋白质、脂类、碳水化合物和其它分子和/或化合物。通过这些重组位点的重组和/或根据本发明的拓扑异构酶介导的连接反应，任何数量或任何组合的这些原始分子和/或化合物能够连接，形成本发明的连接产物。另外，本发明的连接产物的某些部分或成分的缺失或置换也能通过重组实现。
在一些实施方案中，例如通过本发明的重组克隆方法和/或拓扑异构酶介导的连接方法，连接的片段可以插入不同核酸分子如载体中。因此，在一些实施方案中，本发明涉及核酸分子(RNA或DNA)的构建，方法包括：通过重组反应和/或拓扑异构酶介导的连接反应结合两种或多种核酸片段，并通过重组克隆将连接的两种或多种片段插入一种载体内。在连接的核酸分子将通过重组反应与另一种核酸分子进一步结合的实施方案中，两次重组事件(即片段的连接和片段向载体内的插入)的时间选择并不重要。也就是说，对于本发明而言，两种或多种核酸片段是在插入载体之前连接在一起，还是例如每个片段上的一个重组位点首先与载体上的重组位点反应，然后核酸片段上的重组位点再彼此反应连接这些片段，这些并不重要。而且，核酸片段能够克隆到载体内的任何一个或多个位置，并且不需要彼此相邻地插入，虽然在一些实施方案中，载体内的两种或多种片段的连接是优选的。根据本发明，重组克隆允许有效地选择和鉴定含有结合核酸片段的分子(特别是载体)。因此，两种或多种目的核酸片段能够结合，并且任选地插入适于进一步操作结合核酸分子的一种载体中。
在其它实施方案中，均包含至少一个(例如1、2、3、4、5、6、7、8个等)重组位点和任选地包含至少一个(例如1、2、3、4、5、6、7、8个等)拓扑异构酶识别位点的至少两种(例如2、3、4、5、6、7、8种等)核酸片段，与合适的重组蛋白和/或拓扑异构酶接触，以实现两种分子的全部或一部分的连接，这取决于分子内重组位点的位置。在一些这样的实施方案中，如在包含至少两个重组位点的核酸分子中，至少两个重组位点中之一位于分子中拓扑异构酶识别位点的每一端的侧翼。位于另一个识别位点(例如另一个重组位点或拓扑异构酶识别位点)“侧翼”的重组位点(或拓扑异构酶识别位点)是指，两个位点彼此相距约20个核苷酸以内，或者彼此相距约20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0个核苷酸以内。每种核酸片段可包含多种序列，包括但不限于：适于作为引物位点的序列(例如，引物如测序引物或扩增引物可以杂交，从而起始核酸合成、扩增或测序的序列)、转录或翻译信号或调节序列，如启动子、核糖体结合位点、Kozak序列和起始密码子、终止信号，如终止密码子、复制起点、重组位点(或其部分)、拓扑异构酶识别位点(或其部分)、选择性标记，和产生融合蛋白的基因或基因部分(例如N端或羧基端)，如GST、GUS、GFP、6组氨酸、表位半抗原等，及其组合。用于克隆这些片段的载体也可包含这些功能序列(例如启动子、引物位点等)。在包含这些序列的片段结合后，最好在这些序列克隆入一种或多种载体内之后，可以用多种方法操作这些分子，包括靶序列的测序或扩增(即，使用通过整合序列引入的至少一个引物位点)、靶序列的突变(即，靶序列之内或之上的插入、缺失或置换)和由靶序列或其部分表达蛋白质(即，片段和/或载体所含的翻译和/或转录信号的表达)。
本发明也涉及利用公开的重组克隆方法生产组合文库。因此，连接的一种或多种核酸片段可包含一种核酸文库。这种文库可包含，例如，对应于编码一种肽、多肽或蛋白质序列的序列排列的核酸序列。这种排列能与由一种序列组成的另一种核酸片段连接，或者，第二种核酸片段也可以是对应于另一种肽、多肽或蛋白质序列的排列的文库，使得两种片段的连接可产生一种文库，其代表两种肽、多肽或蛋白质序列的所有排列的所有可能的组合。本领域公知组合文库的用途的大量实例。参见，例如，Waterhouse等人，Nucleic Acids Research，1993，Vol.21，No.9，2265-2266，Tsurushita等人，Gene，1996，Vol.172 No.1，59-63，Persson，Int Rev Immunol 1993 10：2-3 153-63，Chanock等人，Infect Agents Dis 1993 Jun 2：3 118-31，Burioni等人，Res Virol 1997Mar-Apr 148：2 161-4，Leung，Thromb Haemost 1995 Jul 74：1373-6，Sandhu，Crit Rev Biotechnol 1992 12：5-6 437-62和美国专利5,733,743、5,871,907和5,858,657，均在此引用作为参考。
重组位点
用于本发明的重组位点可以是能作为重组反应的底物的任何核酸序列。这些重组位点可以是野生型或天然存在的重组位点或修饰或突变的重组位点。用于本发明的重组位点的例子包括但不限于：噬菌体λ重组位点(如attP、attB、attL和attR及其突变体或衍生物)和来自其它噬菌体如phi80、P22、P2、186、P4和P1的重组位点(包括lox位点，如loxP和loxP511)。新的突变att位点(例如attB 1-10、attP 1-10、attR 1-10和attL 1-10)在1999年5月28日提交的专利申请系列号60/136,744中有描述，在此引用作为参考。具有独特特异性的其它重组位点(即第一种位点可与其相应位点重组，而不与具有不同特异性的第二种位点重组)本领域技术人员周知，并且可以用来实施本发明。
用于这些系统的相应重组蛋白可以根据本发明使用，它们含有指定的重组位点。提供可用于本发明的重组位点和重组蛋白的其它系统包括来自酿酒酵母的FLP/FRT系统、解离酶家族(例如Tn3解离酶、Hin、Gin和Cin)和IS231和其它苏云金杆菌转座因子。适用于本发明的其它重组系统包括XerC和XerD重组酶和大肠杆菌中的psi、dif和cer重组位点。其它合适的重组位点可见于颁布给Elledge和Liu的美国专利号5,851,808，在此引用作为参考。用于本发明的优选重组蛋白和突变体或修饰重组位点包括美国专利号5,888,732、6,171,861、6,143,557、6,270,969和6,277,608所述，和共有的、共同未决的美国专利号09/438,358(11/12/99提交)、09/517,466(03/02/00提交)、09/695,065(10/25/00提交)和09/732,914(12/11/00提交)所述，其公开内容均在此完整引用作为参考，以及与从Invitrogen Corporation(Carlsbad，CA)获得的GATEWAYTM克隆技术有关的。
拓扑异构酶克隆
本发明也涉及利用一种或多种拓扑异构酶由两种或多种核苷酸序列生产重组核酸分子的方法。第一方面，本发明提供一种生产一条链共价连接的双链重组核酸分子的方法。该方法旨在用至少一种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种等)拓扑异构酶(例如IA型、IB型和/或II型拓扑异构酶)连接第一种与至少一种第二种核苷酸序列，使得一条链而不是两条链共价连接(参见，例如图11)。第二方面，本发明提供一种生产两条链共价连接的双链重组核酸分子的方法。该方法旨在用至少一种拓扑异构酶连接第一种与至少一种第二种核苷酸序列，使得两条链中连接的末端共价连接(即，双链重组核酸分子在末端连接位置处不含切口；见，例如图5)。第三方面，本发明提供一种生产一条链共价连接的重组核酸分子的方法，其中根据本发明连接的底物核苷酸序列包含至少一种单链核苷酸序列，它能与第二种(或更多)单链核苷酸序列或与一种核酸分子共价连接(见，例如图15)。
一种生产一条链共价连接的双链重组核酸分子的方法能够如下进行：在5’或3’端含有位点特异性拓扑异构酶识别位点或其切割产物的第一种核酸分子(例如IA型或II型拓扑异构酶识别位点)与第二种(或其它)核酸分子接触，任选地与一种拓扑异构酶(例如IA型、IB型和/或II型拓扑异构酶)接触，使得第二种核苷酸序列能与第一种核苷酸序列共价连接。如此处公开的，本发明的方法能用多种核苷酸序列、一般是核酸分子进行，其中至少一种核苷酸序列在一个或两个5’端含有位点特异性拓扑异构酶识别位点(例如IA型或II型拓扑异构酶)或其切割产物(例如，见图11A-11F)。
例如，一种生产两条链共价连接的双链重组核酸分子的方法能够如下进行：在所有成分能够接触并且拓扑异构酶能够达到其活性的条件下，接触下列成分：具有第一端和第二端的第一种核酸分子，其中在第一端或第二端或这两个末端处，第一种核酸分子在3’端处或附近含有一个拓扑异构酶识别位点(或其切割产物)；具有第一端和第二端的至少一种第二种核酸分子，其中在第一端或第二端或这两个末端处，至少第二种双链核苷酸序列在3’端处或附近含有一个拓扑异构酶识别位点(或其切割产物)；和至少一种位点特异性拓扑异构酶(例如IA型和/或IB型拓扑异构酶)。根据本发明该方面的方法生产的共价连接的双链重组核酸，其特征部分在于在每条链的核酸分子连接位置处不含切口。在一个实施方案中，该方法如下进行：第一种核酸分子与第二种(或其它)核酸分子接触，它们在将要共价连接的两个末端的3’端或5’端处含有一个拓扑异构酶识别位点或其切割产物。在另一个实施方案中，该方法如下进行：在至少一个末端的5’端和3’端处含有一个拓扑异构酶识别位点或其切割产物的第一种核酸分子与第二种(或其它)核酸分子接触，后者在将要与含有识别位点的第一种核酸分子末端连接的末端处含有一个3’羟基和5’羟基。如此处公开的，该方法能用含有多种末端组合的多种核酸分子进行(例如，见图12A-12D)。
拓扑异构酶分类为：I型，包括IA型和IB型拓扑异构酶，它切割双链核酸分子的一条链，和II型拓扑异构酶(促旋酶)，它切割核酸分子的两条链。IA型和IB型拓扑异构酶切割核酸分子的一条链。IA型拓扑异构酶切割核酸分子在酶切位点处产生5’磷酸和3’羟基，IA型拓扑异构酶与切割链的5’端共价结合。与之相比，IB型拓扑异构酶切割核酸分子在酶切位点处产生3’磷酸和5’羟基，IB型拓扑异构酶与切割链的3’端共价结合。如此处公开的，I型和II型拓扑异构酶及其催化域和突变形式可用于根据本发明的方法生产两条链共价连接的双链重组核酸分子。
IA型拓扑异构酶包括：大肠杆菌拓扑异构酶I、大肠杆菌拓扑异构酶III、真核生物拓扑异构酶II、archeal逆促旋酶、酵母拓扑异构酶III、果蝇拓扑异构酶III、人拓扑异构酶III、肺炎链球菌拓扑异构酶III等，包括其它IA型拓扑异构酶(参见Berger，Biochim.Biophys.Acta 1400：3-18，1998；DiGate和Marians，J.Biol.Chem.264：17924-17930，1989；Kim和Wang，J.Biol.Chem.267：17178-17185，1992；Wilson等人，J.Biol.Chem.275：1533-1540，2000；Hanai等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：3653-3657，1996，美国专利号6,277,620，均在此引用作为参考)。大肠杆菌拓扑异构酶III是一种IA型拓扑异构酶，可识别、结合并切割序列5’-GCAACTT-3’，尤其能可在本发明的方法中使用(Zhang等人，J.Biol.Chem.270：23700-23705，1995，在此引用作为参考)。Li等人，J.Biol.Chem.272：19582-19587(1997)描述的一种类似物，质粒RP4的traE蛋白，也能在本发明的实施中使用。一种DNA-蛋白质加合物用与5’-胸苷残基共价结合的酶形成，切割在两个胸苷残基之间发生。
IB型拓扑异构酶包括：存在于所有真核细胞中的核I型拓扑异构酶，和痘苗病毒和其它细胞痘病毒编码的拓扑异构酶(参见Cheng等人，Cell 92：841-850，1998，在此引用作为参考)。真核生物IB型拓扑异构酶的例子包括：在酵母、果蝇和哺乳动物细胞(包括人类细胞)中表达的(参见Caron和Wang，Ady.Pharmacol.29B：271-297，1994；Gupta等人，Biochim.Biophys.Acta 1262：1-14，1995，均在此引用作为参考；参见Berger，同上文，1998)。病毒IB型拓扑异构酶的例子包括：脊椎动物痘病毒(牛痘、兔纤维瘤病毒、ORF病毒、禽痘病毒和触染性软疣病毒)和昆虫痘病毒(桑缘灯蛾昆虫痘病毒)产生的(参见Shuman，Biochim.Biophys.Acta 1400：321-337，1998；Petersen等人，Virology 230：197-206，1997；Shuman和Prescott，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：7478-7482，1987；Shuman，J.Biol.Chem.269：32678-32684，1994；美国专利号5,766,891；PCT/US95/16099；PCT/US98/12372，均在此引用作为参考；参见Cheng等人，同上文，1998)。
II型拓扑异构酶包括，例如：细菌促旋酶、细菌DNA拓扑异构酶IV、真核生物DNA拓扑异构酶II和T偶数噬菌体编码的DNA拓扑异构酶(Roca和Wang，Cell 71：833-840，1992；Wang，J.Biol.Chem.266：6659-6662，1991，均在此引用作为参考；Berger，同上文，1998)。类似于IB型拓扑异构酶，II型拓扑异构酶具有切割和连接活性。另外，类似于IB型拓扑异构酶，能够制备底物核酸分子，使得II型拓扑异构酶在切割位点处能够与一条链形成共价连接。例如，小牛胸腺II型拓扑异构酶能够切割一种含有距5’端三个核苷酸的5’凹陷拓扑异构酶识别位点的底物核酸分子，导致切割位点5’侧的三核苷酸序列解离，拓扑异构酶与核酸分子的5’端共价结合(Andersen等人，同上文，1991)。此外，在这种携带II型拓扑异构酶的核酸分子与含有3’羟基的第二种核苷酸序列接触后，II型拓扑异构酶能将这些序列连接在一起，然后从重组核酸分子上释放。这样，II型拓扑异构酶也可用于进行本发明的方法。
拓扑异构酶的结构分析表明，每个特定拓扑异构酶家族的成员，包括IA型、IB型和II型拓扑异构酶，与该家族的其它成员有共同的结构特征(Berger，同上文，1998)。另外，不同IB型拓扑异构酶的序列分析表明，它们的结构高度保守，特别是催化域(Shuman，同上文，1998；Cheng等人，同上文，1998；Petersen等人，同上文，1997)。例如，包含314个氨基酸的牛痘拓扑异构酶的氨基酸81-134的域与其它IB型拓扑异构酶有相当的同源性，分离的域与全长拓扑异构酶有基本相同的活性，虽然分离的域转化率较低，与识别位点的结合亲和力较低(见Shuman，同上文，1998；Cheng等人，同上文，1998)。另外，氨基端域(氨基酸残基70和72)突变的突变牛痘拓扑异构酶显示与全长拓扑异构酶相同的性质(Cheng等人，同上文，1998)。实际上，牛痘IB型拓扑异构酶的突变分析显示了能够突变而不影响拓扑异构酶活性的大量氨基酸残基，并且含有活性所需的确定的几个氨基酸(Shuman，同上文，1998)。由于牛痘拓扑异构酶催化域与其它IB型拓扑异构酶之间共有高同源性，应当认识到，分离的IB型拓扑异构酶的催化域和含有不同氨基酸突变的IB拓扑异构酶能够在本发明的方法中使用。
不同的拓扑异构酶显示不同的序列特异性。例如，II型拓扑异构酶能结合多种序列，但是在高度特异的识别位点处切割(参见Adersen等人，J.Biol.Chem.266：9203-9210，1991，在此引用作为参考)。与之相比，IB型拓扑异构酶包括位点特异性拓扑异构酶，它们结合并切割特定核苷酸序列(“拓扑异构酶识别位点”)。在一种核酸分子被拓扑异构酶(例如IB型拓扑异构酶)切割后，通过在拓扑异构酶的特定酪氨酸残基与拓扑异构酶识别位点的3’核苷酸之间形成磷酸酪氨酰键，磷酸二酯键的能量得以保留。在拓扑异构酶切割位点靠近核酸分子的3’端时，下游序列(切割位点的3’)能够解离，产生含有与新产生的3’端共价结合的拓扑异构酶的核酸分子(见图29)。
一种生产一条链共价连接的双链重组核酸分子的方法能够如下进行：在所有成分可以接触并且至少一种拓扑异构酶能够达到其活性的条件下，接触下列成分：1)具有第一端和第二端的第一种核酸分子，其中第一种核酸分子在第一端或第二端或这两个末端的5’端处或附近含有一个位点特异性拓扑异构酶识别位点(例如IA型或II型拓扑异构酶识别位点)，任选地含有一个或多个重组位点；2)至少一种第二种核酸分子，其含有或者能够使之含有第一端和第二端；和3)至少一种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种等)位点特异性拓扑异构酶(例如IA型或IB型拓扑异构酶识别位点)。例如，拓扑异构酶可以是IA型拓扑异构酶，如大肠杆菌拓扑异构酶I、大肠杆菌拓扑异构酶III，或真核生物拓扑异构酶III。在一种核酸分子切割后，拓扑异构酶优选地与5’端稳定结合。在用拓扑异构酶切割后，切割后的核酸分子通常可包含3’突出序列。一旦核酸分子通过上述方法连接，产生的分子即可用于重组反应，如本文其它部分所述。
能够进行本发明的一种生产一条链共价连接的双链重组核酸分子的方法，使得末端的任意组合连接，其中一条链在连接的末端处共价连接，另一条链非共价连接，但是含有一个切口。例如，第一种核酸分子能包含一种编码序列，其中ATG起始密码子位于或靠近第一末端，poly A信号在第二末端处或附近编码；第二种核酸分子能包含一种启动子元件，它在位于编码序列下游时起作用，第一末端位于第二全末端的上游，能够进行该方法，其中位点特异性拓扑异构酶识别位点(例如IA型或II型拓扑异构酶识别位点)位于或靠近第一种核酸分子的第一末端的5’端，其中在拓扑异构酶(例如IA型或II型拓扑异构酶)能够共价连接第一种核酸分子第一末端的5’端与第二种核酸分子第一末端的3’端的条件下进行这种接触，从而产生一种双链重组核酸分子，其中能够从该编码序列表达一种多肽。此外，也能够进行该方法，其中拓扑异构酶识别位点(例如IA型或II型拓扑异构酶识别位点)位于或靠近第一种核酸分子的第二末端的5’端，其中在拓扑异构酶(例如IA型或II型拓扑异构酶识别位点)能够连接第一种核酸分子第二末端的5’端与第二种核酸分子第一末端的3’端的条件下进行这种接触，从而产生能够表达反义分子的一种双链重组核酸分子。一旦核酸分子通过上述方法连接，产生的分子即可用于重组反应，如本文其它部分所述。
应用上述第一种核酸分子和第二种核酸分子的另一个实例是，能够进行该方法，其中拓扑异构酶识别位点(例如IA型或II型拓扑异构酶识别位点)位于或靠近第一种核酸分子的第一末端和第二末端的5’端，其中在IA型拓扑异构酶能够共价连接第一种核酸分子第一末端的5’端与第二种核酸分子第一末端的3’端，第一种核酸分子第二末端的5’端与第二种核酸分子第二末端的3’端的条件下进行这种接触。这样，该方法产生的双链重组核酸分子环化，在每条链上相对于通过拓扑异构酶(例如IA型或II型拓扑异构酶)共价连接一条链的位置处含有一个切口。此外，第二种核酸分子的启动子能够启动第一种核酸分子的表达。在一个实施方案中，环化的双链重组核酸分子包含一种载体。一旦核酸分子通过上述方法连接，产生的分子即可用于重组反应，如本文其它部分所述。
应用上述第一种核酸分子和第二种核酸分子的另一个实例是，能够进行该方法，其中拓扑异构酶识别位点(例如IA型或II型拓扑异构酶识别位点)位于或靠近第一种核酸分子的第一末端和第二末端的5’端，其中在拓扑异构酶(例如IA型或II型拓扑异构酶)能够共价连接第一种核酸分子第一末端的5’端与第二种核酸分子第二末端的3’端，第一种核酸分子第二末端的5’端与第二种核酸分子第一末端的3’端的条件下进行这种接触。这样，该方法产生的双链重组核酸分子环化，在每条链上相对于通过拓扑异构酶(例如IA型或II型拓扑异构酶)共价连接一条链的位置处含有一个切口。此外，第二种核酸分子的启动子能启动反义序列的表达。在一个实施方案中，环化的双链重组核酸分子包含一种载体。一旦核酸分子通过上述方法连接，产生的分子即可用于重组反应，如本文其它部分所述。
如此处公开的，一种生产一条链共价连接的双链重组核酸分子的方法，包括第一种核酸分子和至少一种第二种核酸分子，还能包括扩增一条链共价连接的双链重组核酸分子的步骤。扩增反应能够如下进行：双链重组核酸分子与一种扩增反应引物对接触，其中该引物对的第一条引物能够在第一种或第二种核酸分子的一端处或附近结合共价连接的链，并引发向另一种核酸分子的扩增反应，产生核苷酸序列与该双链重组核酸分子的含切口链相同的第一种延伸产物；该引物对的第二条引物一般在3’端处或附近能够结合第一种延伸产物，在第一条引物存在下，用共价连接的链和延伸产物(或由此产生的延伸产物)作为模板能够产生一种扩增产物。例如，能够进行该方法，使得IA型拓扑异构酶识别位点位于或靠近第一种核酸分子的第一末端，该方法还包括双链重组核酸分子与一种扩增反应引物对接触，其中正向引物能够在第一种核酸分子的第二末端处或附近结合，反向引物能够结合与第二种核酸分子第二末端的至少一部分互补的核苷酸序列；并扩增该双链重组核酸分子。第一种核酸分子能包含一个编码区，第二种核酸分子能包含一种调节元件。一旦核酸分子通过上述方法连接，产生的分子即可用于重组反应，如本文其它部分所述。
一种生产一条链共价连接的双链重组核酸分子的方法也能如下进行：在所有成分可以接触并且至少一种拓扑异构酶能够达到其活性的条件下，接触下列成分：1)具有第一端和第二端的第一种核酸分子，其中第一种核酸分子在第一端或第二端或这两个末端的5’端处或附近含有一个位点特异性拓扑异构酶识别位点(例如IA型或II型拓扑异构酶识别位点)；2)至少一种第二种核酸分子，其含有或者能使之含有第一端和第二端；3)至少一种第三种核酸分子，其含有或能够使之含有第一端和第二端，每一端还包含5’端和3’端；和4)至少一种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种等)位点特异性拓扑异构酶(例如IA型或IB型拓扑异构酶识别位点)。例如，拓扑异构酶可以是一种IA型拓扑异构酶，如大肠杆菌拓扑异构酶I、大肠杆菌拓扑异构酶III或真核生物拓扑异构酶III。在一种核酸分子被切割后，拓扑异构酶优选地与5’端稳定结合。在用拓扑异构酶切割后，切割后的核酸分子优选地包含3’突出序列。一旦核酸分子通过上述方法连接，产生的分子即可用于重组反应，如本文其它部分所述。
能够进行本发明的一种生产一条链共价连接的双链重组核酸分子的方法，其包括含有位点特异性拓扑异构酶识别位点(例如IA型或IB型拓扑异构酶识别位点)或其切割产物的第一种核酸分子，至少一种第二种核酸分子和至少一种第三种核酸分子，使得任何末端组合连接，而连接的末端处的一条链共价连接，一条链含有切口。根据该实施方案，任何末端都能含有IA型、II型或IB型拓扑异构酶识别位点，或者能够包含其切割产物，只要第一种双链重组核酸分子在5’端处或附近含有拓扑异构酶识别位点(例如IA型或II型拓扑异构酶识别位点)，或其切割产物，而在将要连接的末端处只有一个拓扑异构酶或拓扑异构酶识别位点。例如，如果第一种核酸分子在第一端和第二端处或附近包含一个位点特异性IA型拓扑异构酶识别位点，该方法还能包括：在拓扑异构酶(例如IA型或II型拓扑异构酶)能够共价连接第一种核酸分子的第一末端的5’端与与第二种核苷酸序列的第一末端的3’端、第一种核酸分子的第二末端的5’端与第三种核苷酸序列的第一末端的3’端的条件下，将第一种核酸分子和第二种核酸分子与至少一种第三种核酸分子接触，后者含有或者能够使之含有第一端和第二端，每一端还包含5’端和3’端。应当认识到，能够用末端和拓扑异构酶识别位点或其切割产物的其它组合进行本发明的这种方法。一旦核酸分子通过上述方法连接，产生的分子即可用于重组反应，如本文其它部分所述。
本发明的一种方法也能够如下进行：在IB型拓扑异构酶能够共价连接第三种核酸分子的第一末端或第二末端的3’端与第二种核酸分子的第一末端或第二末端的5’端的条件下，接触下列成分：第一种核酸分子和第二种核酸分子与至少一种第三种核酸分子，后者含有第一端和第二端，每一端还包含5’端和3’端，其中第三种核酸分子在第一末端或第二末端或第一末端和第二末端的3’端处或附近含有一个IB型拓扑异构酶识别位点；和至少一种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种等)IB型拓扑异构酶。在这种方法中，如果第三种核酸分子在第一末端的3’端处或附近包含一个IB型拓扑异构酶识别位点，能够在IB型拓扑异构酶能共价连接第三种核酸分子的第一末端的3’端与第二种核酸分子的第一末端的5’端的条件下进行这种接触。应当认识到，也能用末端和拓扑异构酶识别位点或其切割产物的其它组合进行本发明的这种方法。一旦核酸分子通过上述方法连接，产生的分子即可用于重组反应，如本文其它部分所述。
在另一个实施方案中，一种生产一条链共价连接的双链重组核酸分子的方法能够如下进行：在所有成分可以接触并且至少一种拓扑异构酶能够达到其活性的条件下，接触下列成分：1)有第一端和第二端的第一种核酸分子，其中第一种核酸分子在一个末端的5’端处或附近含有一个位点特异性拓扑异构酶识别位点(例如IA型或II型拓扑异构酶识别位点)，在另一末端的3’端处或附近含有一个IB型拓扑异构酶识别位点；2)至少一种第二种核酸分子，其含有或者能使之含有第一端和第二端；3)至少一种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种等)位点特异性拓扑异构酶(例如IA型或II型拓扑异构酶)；和4)至少一种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种等)IB型拓扑异构酶。例如，识别位点位于或靠近5’端的拓扑异构酶可以是一种IA型拓扑异构酶，如大肠杆菌拓扑异构酶I、大肠杆菌拓扑异构酶III或真核生物拓扑异构酶III。在一种核酸分子切割后，IA型拓扑异构酶优选地与5’端稳定结合，而IB型拓扑异构酶优选地与3’端稳定结合。在用拓扑异构酶切割后，切割后的核酸分子优选地包含3’突出序列和5’突出序列。该方法能还能包括接触双链重组核酸分子与一种DNA连接酶，从而产生一条链共价连接的双链重组核酸分子。一旦核酸分子通过上述方法连接，产生的分子即可用于重组反应，如本文其它部分所述。
通过接触第一种核酸分子、第二种核酸分子和至少一种第三种核酸分子，生产一条链共价连接的双链重组核酸分子的一种方法，还能包括扩增特别是共价连接的双链重组核酸分子的步骤。这种扩增能够如下进行：双链重组核酸分子与一种扩增反应引物对接触，其中该引物对的第一条引物能在第一种或第二种核酸分子的一个末端处或附近选择性结合共价连接的链，并引发向另一种核酸分子的扩增反应，产生与共价连接的链互补的第一种延伸产物；该引物对的第二条引物一般在3’端处或附近能选择性结合第一种延伸产物，在第一条引物存在下，用共价连接的链和延伸产物(或由此产生的延伸产物)作为模板能够产生一种扩增产物。能够进行该方法，使得拓扑异构酶识别位点(例如IA型或IB型拓扑异构酶识别位点)位于或靠近第一种核酸分子的第一末端，还可包括接触双链重组核酸分子与一种扩增反应引物对，其中正向引物能够在第一种核酸分子的第二末端处或附近结合一种核苷酸序列，反向引物能够结合与第三种核酸分子的至少一部分互补的核苷酸序列；并扩增该双链重组核酸分子。第一种核酸分子能包含一个编码区，第三种核酸分子能包含一种调节元件。此外，连接的末端也能含有互补突出序列。一旦核酸分子通过上述方法连接，产生的分子即可用于重组反应，如本文其它部分所述。
图11A-11F说明了生产一条链共价连接并且任选地包含一个或多个重组位点的双链重组核酸分子的公开方法的典型实施方案。在图11A中，核酸分子之一含有附着于一个末端的5’端的拓扑异构酶，当含有3’突出端的该分子在适当条件下与含有基本互补的3’突出端的第二种核酸分子接触时，含有3’突出端的核苷酸能够杂交，而拓扑异构酶能够催化连接。图11B显示第一种核酸分子，其含有与一种核苷酸序列的两个不同末端的5’端和3’端连接的拓扑异构酶分子，进一步显示第一种核酸分子与其它两种核苷酸序列的连接，产生一种核酸分子，其中一条链不含任何切口，而另一条链含有两个切口。图11C显示含有与一个末端的5’端连接的拓扑异构酶分子的第一种核酸分子和含有与一个末端的5’端连接的拓扑异构酶分子的第二种核酸分子，进一步显示第一种和第二种核酸分子与另一种核苷酸序列的连接，产生一种核酸分子，其中一条链不含任何切口，而另一条链含有两个切口。在图11D中，将要连接的核酸分子之一含有附着于两个末端的5’端的位点特异性IA型拓扑异构酶，使得当接触核苷酸序列时，互补3’突出端能够杂交，拓扑异构酶催化连接。图11E显示将三种核酸分子连接在一起的另一个实例，其中使用一种在5’端含有IA型拓扑异构酶的携带拓扑异构酶的核酸分子，和另一种携带拓扑异构酶的核酸分子，其在将要连接的相对链的3’端含有IB型拓扑异构酶，使得当接触核苷酸序列时，互补3’突出端能够杂交，拓扑异构酶催化连接。图11F显示将三种核酸分子连接在一起的另一个实例，在该情况中使用一种携带拓扑异构酶的核酸分子，其在5’端含有拓扑异构酶(例如IA型或II型拓扑异构酶)，在相对链的3’端含有IB型拓扑异构酶，使得当在合适条件下接触核苷酸序列时，互补3’突出端能够杂交，拓扑异构酶催化连接。一旦核酸分子通过上述方法连接，产生的分子即可用于重组反应，如本文其它部分所述。
图11A-11F所示的实例显示与连接后含有平端的核酸分子相反的核酸分子的末端，并显示含有3’突出序列的连接。然而，底物核酸分子能够如希望的含有任何末端和突出端，包括平端和/或互补端，或其组合，使得末端能够彼此连接，例如，形成环状分子，或者与含有适当末端的其它核酸分子连接。因此，如图11A-11F所示的一种或多种平端能够被置换为含有5’突出端或3’突出端的一种核苷酸序列，它们均可以是一个核苷酸，如胸苷残基，或多个核苷酸(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个等)，它们可以是相同的或是不同的。在公开方法的某些实施方案中，第一种核酸分子含有一个将要连接的平端，第二种核酸分子在将要通过位点特异性拓扑异构酶(例如IA型或IB型拓扑异构酶)连接的末端处含有一个突出端，其中突出端包含与含有平端的序列互补的序列，从而有利于链的侵入，作为一种为连接反应适当定位末端的方法。
如图11A-11C所示，利用本发明该方面的方法产生的双链重组核酸分子包括一条链(不是两条链)在将要连接的末端共价连接的核酸分子(即，利用这些方法生产的双链重组核酸分子在两个末端连接的每一个位置处含有一个切口)。这些实施方案特别有利，因为能用聚合酶通过开始时复制共价连接的链复制双链重组核酸分子。例如，热稳定的聚合酶，如可用于进行扩增反应如PCR的聚合酶，能用来复制共价链，而含有切口的链不能提供合适的复制模板。
本发明也提供共价连接两种不同核酸分子的末端或同一核酸分子的两个末端的方法，使得产物两条链连接，因此，不含切口。图12显示了本发明该方面的典型实施方案。例如，在图12A中，一种核酸分子含有附着于一个末端的3’端和5’端的拓扑异构酶分子，使得当含有5’突出端的该分子在适当条件下接触含有基本互补的5’突出端的第二种核酸分子时，含有5’突出端的核苷酸能够杂交，而拓扑异构酶能够催化该核酸分子的两条链的连接。在图12B中，将要连接的核酸分子的每一末端都含有附着于3’端的拓扑异构酶分子，使得当在适当条件下接触核苷酸序列时，含有5’突出端的核苷酸能够杂交，而拓扑异构酶催化连接(对比图12C，其中将要连接的每种核酸分子都含有一个附着于将要连接的末端的5’端的拓扑异构酶)。图12D说明通过一种在两个末端的两端含有拓扑异构酶的核酸分子将三种核酸分子连接在一起。类似于图11，图12A-12D所示的实例显示不会连接为平端的核酸分子的末端。然而，如对于图11所述，如图12所示的方法中使用的底物核酸分子能够如希望的含有任何末端，包括携带拓扑异构酶的末端，使得这些末端能够彼此连接，例如，形成环状分子，或如希望的与含有适当的末端、平端、5’突出端、3’突出端等的其它核酸分子连接。一旦核酸分子通过上述方法连接，产生的分子即可用于重组反应，如本文其它部分所述。
除了催化连接反应之外，一种共价结合的拓扑异构酶也能催化逆反应，例如，识别序列的3’核苷酸的再连接，IB型拓扑异构酶通过磷酸酪氨酰键与之连接，在切割之前，核苷酸序列包含核酸分子的5’端，在切割后含有游离5’羟基。于是，发展了利用IB型拓扑异构酶生产重组核酸分子的方法。例如，含有已结合的IB型拓扑异构酶的克隆载体已经发展，并且能够获得商品(Invitrogen Corp.，La Jolla CA)。这类克隆载体在线性化后在每个3’端含有一个共价结合的IB型拓扑异构酶(“携带拓扑异构酶”)。将要克隆到这种载体内的核苷酸序列，如包含cDNA文库的核苷酸序列，或限制酶切片段，或剪切的基因组DNA序列，例如用一种磷酸酶处理，产生5’羟基端，然后在拓扑异构酶可在含有羟基的5’端和含有共价结合的拓扑异构酶的载体3’端处连接核苷酸序列的条件下，添加到线性化的携带拓扑异构酶的载体中。产生的含有5’羟基端的一种核苷酸序列，如一种PCR扩增产物，能够在快速连接反应中(在室温下约5分钟)克隆到携带拓扑异构酶的载体内。拓扑异构酶连接反应所固有的快速连接和宽温度范围使得携带拓扑异构酶的载体理想地用于高通量用途，这一般用自动系统进行。
II型拓扑异构酶一般不用于生产重组核酸分子或克隆方法，而IB型拓扑异构酶，如上所述，在多种方法中使用。如此处公开的，IA型拓扑异构酶能够在多种方法中使用，类似于IB型拓扑异构酶所述。然而，以前描述的利用IB型拓扑异构酶连接两种或多种核苷酸序列的方法具有下列缺点：结合的拓扑异构酶只能实现附着的链的3’端与含有5’羟基的第二条链的连接。由于拓扑异构酶不能连接互补链，产生的核酸分子含有切口。这些切口的存在不会妨碍重组分子用来转染宿主细胞，因为切口通常在细胞内溶解，但是双链核酸分子内存在这些切口明显限制了重组分子的直接应用。例如，含有切口的核酸分子的一条链不能PCR扩增，因为引物延伸反应在切口处终止。因此，根据前述方法用一种拓扑异构酶制备的核酸构建体通常必须进一步处理，例如，用DNA连接酶处理，以获得一种两条链共价连接的双链重组核酸分子，因此可用于随后的操作，如PCR。
前述制备核酸构建体的方法通常也需要多个步骤，特别是在连接两种以上的核苷酸序列时，在序列必须以预定的方向连接时更是如此。例如，将要连接的核苷酸序列通常依次连接，产生中间构建体，它们均必须克隆、在宿主细胞中扩增、分离并表征。含有正确序列的构建体然后必须以适当形式足量分离，使得下一种核苷酸序列能够连接，并再次进行克隆、扩增、分离和表征程序，以鉴定正确的构建体。显然，由于将要连接的不同核苷酸序列的数量增加，必须进行的基本重复步骤的数量也增加，于是导致昂贵、繁琐、冗长的过程。
如此处公开的，生产两条链共价连接的双链重组核酸分子的本发明的一种方法的一个优点是，为了获得两条链共价连接的功能性双链重组核酸分子，不需要进行分开的连接反应(见图8和图12)。另外，也能够进行本发明该方面的一种方法，使得在多种不同核酸分子将要以预定的方向共价连接时，在进行下一步之前不需要克隆、表征和分离中间构建体(参见实施例1B)。因此，本发明该方面的方法提供一种方法，它能比已知方法更快且成本大大降低地生产两条链共价连接的双链重组核酸分子。
另一个优点是，产生的两条链共价连接的双链重组核酸分子是一种能在下一步直接应用的形式，例如，包括延伸或引物的特殊程序，如PCR扩增程序，或其它转录或翻译程序，因为产生的构建体在双链核苷酸序列连接的位点处不含切口。如此处公开的，在某些实施方案中，生产一条链共价连接的双链重组核酸分子的本发明的一种方法也是有利的，因为产生的双链重组核酸分子是一种能在下一步直接应用的形式，例如，包括延伸或引物的特殊程序，如PCR扩增程序，或其它转录或翻译程序，因为在某些实施方案中，产生的双链重组核酸分子含有一条链，该链在双链核苷酸序列连接的位点处不含切口。
术语“核苷酸序列”或“核酸分子”在此用来指不连续的核酸分子。当这样使用时，术语“核苷酸序列”仅仅方便地用来能够清楚地区别本发明的组合物中或在本发明的方法中使用的成分。因此，例如，“核酸分子”在本发明的方法中对应于用来生产重组“核酸分子”产物的反应物(底物)。
在此通常用IB型拓扑异构酶如牛痘拓扑异构酶或IA型拓扑异构酶说明本发明的某些方法。然而，应当理解，这些方法也能用所例举的之外的拓扑异构酶进行，仅需要调节其成分。例如，如下文更详细描述的，公开了利用一种PCR引物在线性核酸分子的一个或两个3’端掺入一种IB型拓扑异构酶识别位点的方法，该引物至少部分包含与拓扑异构酶识别位点互补的核苷酸序列。与之相比，能够利用含有识别位点的PCR引物，向一种核酸分子中掺入IA型(或者希望时，II型)的拓扑异构酶识别位点。
位点特异性IB型拓扑异构酶切割核酸分子导致在与含有共价结合的拓扑异构酶的链互补的链中、在与之相同的末端处产生5’突出序列。此外，如此处所公开的，PCR引物能够设计为能向一种核酸分子内掺入IB型拓扑异构酶识别位点，并且能够在拓扑异构酶切割该核酸分子后，在含有确定和预定序列的互补链中产生5’突出序列。这样，这些方法适于生产含有以预定方向有效连接的成分核酸分子的双链重组核酸分子。根据此公开内容，应当理解，PCR引物也能设计为能向一种核酸分子(包括多样化序列文库)内引入一个IA型拓扑异构酶识别位点，希望时，在用位点特异性拓扑异构酶切割后产生3’突出序列。
生产两条链共价连接的双链重组核酸分子的一种方法，如此处公开的，通过在将要共价连接的每种核酸分子的末端处或附近产生拓扑异构酶，扩展了以前已知的方法。例如，对于IB型拓扑异构酶，该方法在将要连接的每种线性核酸分子的3’端处或附近产生一个拓扑异构酶识别位点或其切割产物(即，共价结合的IB型拓扑异构酶)。如此处所用的术语“拓扑异构酶识别位点”是指可被一种位点特异性拓扑异构酶识别并结合的确定的核苷酸序列。例如，核苷酸序列5’-(C/T)CCTT-3’是一种拓扑异构酶识别位点，可被大多数痘病毒拓扑异构酶，包括痘苗病毒DNA拓扑异构酶I特异结合，然后能在识别位点的3’胸苷之后切割该链，产生包含5’-(C/T)CCTT-PO4-TOPO的核苷酸序列，即通过拓扑异构酶中的酪氨酸残基与3’磷酸共价结合的拓扑异构酶复合物(参见Shuman，J.Biol.Chem.266：11372-11379，1991；Sekiguchi和Shuman，Nucl.Acids.Res.22：5360-5365，1994；均在此引用作为参考；参见美国专利号5,766,891；PCT/US95/16099；PCT/US98/12372)。与之相比，核苷酸序列5’-GCAACTT-3’是IA型大肠杆菌拓扑异构酶III的拓扑异构酶识别位点。
携带拓扑异构酶的核酸分子，包括含有与核酸分子一个或两个末端的5’端或3’端或此两端共价连接的拓扑异构酶的核酸分子，能够通过多种方法之一产生。在某些情况下，在适当条件下，I型拓扑异构酶能够切割单链核苷酸序列。例如，包含大肠杆菌拓扑异构酶I(它是一种IA型拓扑异构酶)的氨基端67kDa域的结构域，能够切割含有拓扑异构酶识别位点的单链核苷酸序列。在拓扑异构酶能够切割单链核酸分子的条件下，能够平行进行在核酸分子一个末端的5’端和3’端含有拓扑异构酶识别位点的核酸分子的切割。此外，当一种或两种拓扑异构酶的识别和切割需要一种核酸分子时，连续进行反应，其中首先切割拓扑异构酶识别位点的远端(末端)，然后切割双链中保留的内部(近端)位点。例如，一种核酸分子在一个末端的5’端处或附近含有一个大肠杆菌拓扑异构酶III识别位点，在同一末端的3’端处或附近含有一个牛痘IB型拓扑异构酶识别位点，其中IB型拓扑异构酶识别位点比IA型识别位点更靠近该末端，该核酸分子能与牛痘拓扑异构酶一起温育，产生一种携带IB型拓扑异构酶的核酸分子，然后与大肠杆菌拓扑异构酶温育，产生一种含有与5’端结合的IA型拓扑异构酶和与3’端结合的IB型拓扑异构酶的核酸分子。因此，本发明包括生产包含附着于至少一个末端的一个或两个末端的拓扑异构酶的核酸分子的方法，并进一步提供这种携带拓扑异构酶的核酸分子。
如此处所用的术语“切割产物”，当用于拓扑异构酶识别位点时，是指一种可被拓扑异构酶通常在其识别位点切割的核苷酸序列，对于IA型或II型拓扑异构酶，包括与拓扑异构酶识别位点5’端核苷酸的5’磷酸基团共价结合的拓扑异构酶复合物，或者对于IB型拓扑异构酶，包括与拓扑异构酶识别位点3’端核苷酸的3’磷酸基团共价结合的拓扑异构酶复合物。这种复合物包含拓扑异构酶切割的含有与之共价结合的拓扑异构酶的核酸分子，在此被称为“拓扑异构酶激活的”或“携带拓扑异构酶的”核苷酸序列。拓扑异构酶激活的核酸分子能在本发明的方法中使用，也能使用含有未切割拓扑异构酶识别位点和拓扑异构酶的核酸分子，其中拓扑异构酶能在识别位点切割该核酸分子，并与之共价结合。
在生产一条链共价连接的双链重组核酸分子的一种方法的一个实施方案中，拓扑异构酶识别位点位于或靠近将要连接的每种核苷酸序列末端的3’端，使得在IB型拓扑异构酶存在下，每种核苷酸序列被切割后产生3’端，其含有与之共价结合的拓扑异构酶(见图8)。将要共价连接的核苷酸序列也能在与含有拓扑异构酶识别位点的末端相同的末端含有5’羟基，或者能用一种磷酸酶产生5’羟基。在接触这些核苷酸序列后，位点特异性拓扑异构酶能够将含有3’磷酸的每条链与各自的5’羟基连接，产生一种两条链共价连接的双链重组核酸分子，它能生产为线性、环状或正或负超螺旋的核酸分子。
优选地，将要根据本发明特定方面的方法用IB型拓扑异构酶连接的核苷酸序列的末端的5’端含有互补5’突出序列，该序列能有利于核苷酸序列的最初结合，包括，希望时以预定的方向结合。此外，将要根据本发明特定方面的方法用IB型拓扑异构酶连接的核苷酸序列的末端的5’端也含有互补5’序列，其中序列之一含有5’突出序列，而另一种核苷酸序列在5’端的平端含有一种互补序列，以帮助核苷酸序列最初通过链侵入结合，包括，希望时以预定的方向结合。术语“5’突出端”或“5’突出序列”在此用来指核酸分子的一条链，它以5’方向延伸出该核酸分子的互补链的末端。方便地，能够用IB型拓扑异构酶位点特异切割一种核酸分子，产生5’突出端(见实施例1)。
优选地，将要根据本发明特定方面的方法用IA型拓扑异构酶连接的核苷酸序列的末端的3’端含有互补3’突出序列，该序列能有利于核苷酸序列的最初的结合，包括，希望时以预定的方向结合。此外，将要根据本发明特定方面的方法用拓扑异构酶(例如IA型或II型拓扑异构酶)连接的核苷酸序列的末端的3’端也含有互补3’序列，其中序列之一含有3’突出序列，而另一种核苷酸序列在3’端的平端含有一种互补序列，以帮助核苷酸序列最初通过链侵入结合，包括，希望时以预定的方向结合。术语“3’突出端”或“3’突出序列”在此用来指核酸分子的一条链，它以5’方向延伸出该核酸分子的互补链的末端。方便地，能够在IA型或II型拓扑异构酶切割后产生3’突出端。
3’或5’突出序列能含有任何序列，虽然通常选择允许根据本发明的方法连接一种核酸分子的预定末端与第二种核苷酸序列的预定末端的序列(图9C，参见实施例1B)。虽然3’或5’突出端可以是回文序列，但它们通常不是，因为含有回文突出端的核酸分子能够彼此结合，从而降低了以预定方向包含两种或多种核酸分子的两条链共价连接的双链重组核酸分子的产量。例如，图9A所示核酸分子的5’突出序列是回文序列，因此，例如，第一种CMV元件与第二种CMV元件通过AGCT突出端的结合如同CMV元件与GFP元件通过AGCT突出端的结合一样可能。一种构建体包括一种有效共价连接的构建体，其以5’-3’顺序含有一个CMV元件、一个GFP元件和一个BGH元件，该构建体的生产效率将低于用图9C所示元件生产这种构建体的效率。图9B所示元件在GFP元件的一端和所示BGH元件的末端含有回文突出端，因此生产希望的构建体的效率低于图9C的元件，但比图9A所示更有效。
本发明的方法和试剂盒中使用的一种核苷酸序列能够设计为含有一个桥联的硫代磷酸酯，以防止拓扑异构酶切割后的再连接。例如，当拓扑异构酶是大肠杆菌拓扑异构酶III时，桥联的硫代磷酸酯能掺入GCAACTT切割/识别序列的两个胸苷之间。切割后，剪下的序列含有3’-SH而不是3’-OH，从而阻止再连接(参见Burgin等人，Nucl.Acids Res.23：2973-2979，1995)。
可用于本发明该方面的方法或试剂盒的核酸分子能够通过一种扩增方法如PCR扩增，使之在一个末端的3’或5’端含有拓扑异构酶识别位点。此外，也能够设计用于PCR的一条或两条引物，使得在扩增的核酸分子被切割后，切割后的核酸分子在一个或两个末端含有5’或3’突出端。在一个实施方案中，设计PCR引物，使得第一种核酸分子上的5’突出序列与第二种(或其它)核酸分子上的5’突出序列互补，从而有利于核苷酸序列优选地以预定的方向结合，于是它们能根据本发明的方法共价连接。根据本发明，通过为将要连接的不同核酸分子设计独特的突出序列，多种核酸分子能以希望的顺序和/或方向连接。
应当理解，对于本发明的方法而言，PCR以两种方式应用。一方面，PCR引物设计为能使希望的核酸分子具有特定特征，例如，编码一种转录或翻译调节元件或目的编码序列如表位标记或细胞区室化域的核酸分子。在这方面，PCR引物能设计为，在扩增后，如希望的，核酸分子在一个或两个末端含有拓扑异构酶识别位点。如此处公开的，PCR引物也能包含另一种序列，使得用位点特异性拓扑异构酶切割扩增产物后，切割后的核酸分子在拓扑异构酶切割端含有5’或3’突出序列。在涉及能结合并切割5’端的拓扑异构酶的本发明的一个实施方案中(例如涉及IA型拓扑异构酶的一个实施方案)，PCR引物能设计为含有一个桥联的硫代磷酸键(见上)，它能阻断拓扑异构酶切割后的再连接，并且能参与携带拓扑异构酶的扩增产物的产生。
PCR产生的突出序列能包含一个单核苷酸突出端，它是PCR反应产生的一种伪迹(artifact)。例如，通常使用聚合酶，如Taq，它没有校读功能，而具有固有的末端转移酶活性，产生在每一末端含有一个非模板衍生的3’A突出端的PCR产物。能够利用本发明的方法，将这些扩增产物与携带拓扑异构酶的核酸分子连接，后者在一或两个末端含有一个3’T突出端或一个3’dU突出端，对于T/A克隆反应，可以是一种载体(参见美国专利号5,487,993和5,856,144，均在此引用作为参考)。
PCR也用来扩增通过本发明的方法产生的、一条或两条链共价连接的双链重组核酸分子。例如，如图13所示，本发明的一种方法能够由三种底物核酸分子生产一种表达型双链重组核酸分子，这三种核酸分子包括：含有启动子的核苷酸序列、含有编码序列的核苷酸序列和含有聚腺苷酸化信号的核苷酸序列。在将要连接的双链核苷酸序列末端掺入互补的3’(或5’)突出序列有利于双链重组核酸分子的产生。例如，表达型双链重组核酸分子能够如下产生：在第一末端的5’端含有IA型拓扑异构酶、在第二末端的3’端含有IB型拓扑异构酶的第一种核酸分子与第二种核酸分子和第三种双链核苷酸序列接触。设计一种PCR引物对，包括对于包含启动子的核苷酸序列的一部分(位于该启动子的上游)特异的第一条引物，和对于包含聚腺苷酸化信号的核苷酸序列的一部分(位于该信号的下游)特异的第二条引物，将只能扩增以正确(预定的)方向含有启动子、编码序列和聚腺苷酸化信号的全长功能性双链重组核酸分子。特别是，部分反应产物，例如只含与编码序列连接的启动子的反应产物，和含有切口的反应产物不被扩增。因此，也能用PCR特异设计一种核酸分子，使其可用于本发明的方法，并且只选择性扩增那些含有希望的成分和特征的反应产物。
如此处所用的术语“共价连接的”，当用于双链重组核酸分子时，是指该核酸分子通过拓扑异构酶介导的连接由两条链连接在一起的至少两种核酸分子产生。应当理解，例如，与将要共价连接的核酸分子之一共价结合的拓扑异构酶与共价结合另一种核酸分子的拓扑异构酶可能相同或不同。因此，牛痘拓扑异构酶能与一种核酸分子共价结合，而另一种痘病毒或真核生物核IB型拓扑异构酶能与另一条链结合。然而，当拓扑异构酶不同时，它们一般是同一家族的成员，例如，IA型或IB型或II型，尽管当拓扑异构酶例如与5’磷酸共价结合并产生互补3’突出端时，拓扑异构酶可能来自不同的家族，例如IA型和II型。
术语“共价连接的”在此也用于由一条链连接在一起的至少两种核苷酸序列产生的单链或双链核酸分子。例如，在拓扑异构酶能够共价连接结合的第一种核酸分子的5’端与第二种核酸分子的3’端的条件下，在5’端处或附近结合有一个拓扑异构酶的携带拓扑异构酶的第一种核酸分子与第二种双链核苷酸序列接触时，产生的双链重组核酸分子能产生一种一条链共价连接的双链重组核酸分子。
在一个实施方案中，根据本发明的方法产生的一种两条链共价连接的双链重组核酸分子在任一条链中两种核苷酸序列连接的位点处不含切口，尽管在该分子的其它部分可能含有切口。在生产一条链共价连接的双链重组核酸分子的一种方法中，产生一种双链重组核酸分子，其至少在互补链末端连接的位置处含有一个切口。通过将带有切口的双链重组核酸分子导入细胞中，或者使双链重组核酸分子进行连接反应，如利用连接酶进行，如本领域众所周知的，这种缺口双链重组核酸分子能够转化为两条链共价连接的一种双链重组核酸分子。
术语“重组子”在此用来指通过本发明的方法连接至少两种核苷酸序列产生的一种核酸分子。本发明包括的双链重组核酸分子与自然(例如在减数分裂中)产生的核酸分子不同。例如，根据本发明该方面的一种方法产生的一种两条链共价连接的双链重组核酸分子能够根据存在两个拓扑异构酶识别位点来鉴定，每条互补链含有一个，位于或靠近核酸分子连接的位点。
本发明的一种方法能够如下进行：在这些成分能够接触并且拓扑异构酶能够达到其活性的条件下，接触下列成分：含有第一端和第二端的第一种核酸分子，其中在第一端或第二端或这两个末端，第一种核酸分子在3’端处或附近含有一个拓扑异构酶识别位点或其切割产物，并且在同一末端的5’端含有(或者例如通过与一种磷酸酶接触，使之能够含有)一个羟基；含有第一端和第二端的至少一种第二种核酸分子，其中在第一端或第二端或这两个末端，至少第二种核酸分子在3’端处或附近含有一个拓扑异构酶识别位点或其切割产物，并且在同一末端的5’端含有(或者能够使之含有)一个羟基；一种拓扑异构酶。在拓扑异构酶与第一种和第二种(或其它)核酸分子接触并切割后，必要时，每种核苷酸序列在切割位点包含一个在3’端共价结合的拓扑异构酶，并且在5’端含有羟基，使得接触后，第一种和至少第二种核苷酸序列以两条链共价连接。因此，本发明提供通过这种方法生产的一种两条链共价连接的双链重组核酸分子。
如此处所用的术语“位于或靠近”，当在拓扑异构酶识别位点靠近一种核苷酸序列的3’(IB型)或5’(IA型或II型)端时使用时，是指该位点分别与3’或5’端相距约1-100个核苷酸以内，一般距末端约1-20个核苷酸以内，特别距各自的末端约2-12个核苷酸以内。拓扑异构酶识别位点距末端约10-15个核苷酸以内的一个优点是，在用拓扑异构酶切割后，切割位点下游的序列部分能够自发地与其余的核苷酸序列分离，其含有共价结合的拓扑异构酶(一般称为“自杀切割”；参见，例如，Shuman，同上文，1991；Andersen等人，同上文，1991)。当拓扑异构酶识别位点距末端大于约12-15个核苷酸时，通过修改反应条件，例如，在高于包含拓扑异构酶识别位点的双链体部分的解链温度的温度下进行温育步骤，能够诱导切割位点上游或下游的核苷酸序列与序列的剩余部分分离。
构建第一种或第二种(或其它)核酸分子，使之含有例如距一个或两个末端约2-15个核苷酸的IB型拓扑异构酶识别位点的另一个优点是，位点特异性拓扑异构酶切割该核酸分子后产生一个5’突出端。利用如此处公开的PCR方法，能够设计分别含有2-15个核苷酸的这种5’突出序列，含有希望的任何序列。因此，在根据本发明的一种方法将切割后的第一种核酸分子与选择的第二种(或其它)核酸分子共价连接时，并且在选择的序列含有5’突出序列时，能够设计第一种核酸分子上的5’突出端，与选择的第二种(或其它)双链序列上的5’突出端互补，使得两种(或多种)序列由于5’突出端的互补性以预定的方向共价连接。如上所述，对于例如用IA型或II型拓扑异构酶切割后产生的3’突出序列，能够使用类似的方法。
如此处所用的，含有“第一端”和“第二端”的核苷酸序列是指，该核苷酸序列是线性的。一种底物核酸分子可能是线性或环状的，包括超螺旋的，尽管用一种或多种拓扑异构酶切割后通常产生一种携带拓扑异构酶的线性核酸分子。例如，一种环状核酸分子，其含有彼此并在互补链上相距约100个核苷酸以内、优选地彼此并在互补链上相距约20个核苷酸以内的两个IB型拓扑异构酶识别位点，该分子能够与一种位点特异性IB型拓扑异构酶接触，使得每条链均被切割，并且间插序列解离，从而产生一种含有与每一端共价结合的拓扑异构酶的线性核酸分子。
应当知道，核酸分子的第一端或第二端不是旨在表示核苷酸序列的任何特定方向，并且不是旨在表示这些末端彼此的相对重要性。当含有第一端和第二端的核苷酸序列是一种双链核苷酸序列时，每一末端含有一个5’端和一个3’端。因此，例如此处提到在3’端含有一个拓扑异构酶识别位点、在同一末端的5’端含有一个羟基的核苷酸序列，它可能是第一端或第二端。
本发明的一种方法能够只用第一种核酸分子和第二种核酸分子进行，或者如希望的能够另外包含第三种、第四种或更多种核酸分子。每种核苷酸序列通常在至少一个3’端或5’端处或附近含有一个拓扑异构酶识别位点或其切割产物，并且能在同一末端的5’端含有一个羟基，或者能用一种磷酸酶产生羟基。当一种核苷酸序列在将要与第二种核苷酸序列连接的末端处或附近不含拓扑异构酶识别位点时，能够利用如此处公开的方法，例如，用含有拓扑异构酶识别位点互补体的引物PCR扩增该序列，向该核苷酸序列内引入一个拓扑异构酶识别位点。
术语“第一种核苷酸序列”、“第二种核苷酸序列”、“第三种核苷酸序列”等，在此只是用来表明是指几种核苷酸序列中的哪一种。因此，没有任何关于特定核苷酸序列的特殊定义的特征，术语“第一种”、“第二种”、“第三种”等当用于一种核苷酸序列或一群或多种核苷酸序列时，不是要表示关于核苷酸序列的任何特定顺序、重要性或其它信息。因此，例如在所述方法涉及用PCR扩增第一种核酸分子，使得扩增产物在一个或两个末端含有一个拓扑异构酶识别位点时，应当理解，类似地，第二种(或其它)核酸分子也能这样扩增。
术语“至少第二种核酸分子”在此用来指除第一种核苷酸序列之外的一种或多种核苷酸序列。因此，该术语可能只是指第二种核苷酸序列，或者指第二种核苷酸序列和第三种核苷酸序列(或更多)。因此，术语“第二种(或其它)核苷酸序列”或“第二种(和其它)核苷酸序列”在此用于区别以下事实：术语“至少第二种核苷酸序列”能指第二种、第三种或更多种核苷酸序列。应当理解，除非另外指出，术语“至少第二种核苷酸序列”的含义所包含的核苷酸序列与第一种核苷酸序列可能相同或基本相同。例如，第一种和第二种核酸分子可能相同，不同之处在于含有拓扑异构酶切割产生的互补5’突出序列，使得第一种和第二种核酸分子能够用本发明的方法共价连接。这样，能够利用本发明的方法产生第一种和第二种核酸分子的多联体，任选地，能够散布有例如第三种核酸分子，如一种调节元件，并且能够以预定的方向，例如均以5’-3’方向，含有共价连接的序列。
如此处公开的，本发明的方法提供一种以预定方向共价连接两种或多种双链核苷酸的方法。术语“方向”或“预定方向”在此用来指两种或多种核苷酸序列以特定顺序共价连接。因此，本发明的方法提供一种方法，例如，用于共价连接编码序列上游的启动子调节元件，共价连接编码区下游的聚腺苷酸化信号，产生一种可表达的功能性双链重组核酸分子；或者共价连接两种编码序列，使得它们能够在框内转录和翻译，产生一种融合多肽。
本发明的方法也能通过接触下列成分进行：含有第一端和第二端的第一种核酸分子，其中在第一端或第二端或这两个末端，第一种核酸分子含有结合于3’端的IB型拓扑异构酶(携带拓扑异构酶的)，在同一末端的5’端处含有(或者能够使之含有)羟基；和至少一种携带IB型拓扑异构酶的第二种核酸分子，其在同一末端的5’端处含有(或者能使之含有)羟基。在拓扑异构酶激活的第一种序列与末端含有拓扑异构酶和5’羟基的至少第二种核苷酸序列接触后，在每条链中形成磷酸二酯键，从而产生一种两条链共价连接的双链重组核酸分子。
本发明还提供连接两种或多种(例如2、3、4、5、6、7种等)核苷酸序列的方法，其中连接的双链重组核酸分子以一条链而不是两条链共价连接(即，双链重组核酸分子在一条链中两个末端连接产生双链重组核酸分子的每个位置处含有一个切口)。此外，一种或多种核苷酸序列也可包含一个或多个重组位点。用图11A所示的示意图作为说明，本发明包括连接至少两种核苷酸序列的方法，包括接触下列成分：含有第一端和第二端的第一种核酸分子，其中在第一端或第二端或这两个末端，第一种核酸分子含有与5’端共价结合的位点特异性IA型拓扑异构酶；和第二种核酸分子，其不含与至少一个末端的任一端共价结合的拓扑异构酶。此外，第二种核酸分子一般在与第一种核酸分子连接的末端的3’端含有羟基。在许多情况中，为了进行杂交，将要连接的两种核苷酸序列含有具有充分序列互补性的3’或5’突出端。在有关实施方案中，上述第一种和第二种核酸分子可以是同一核酸分子的第一端和第二端。因此，这两个末端的连接导致环化分子的形成。一旦核酸分子通过上述方法连接，产生的分子即可用于重组反应，如本文其它部分所述。本发明还包括通过本发明的方法制备的核酸分子，包含这些核酸分子的组合物，和应用这些核酸分子的方法。
用图11B所示的示意图作为说明，本发明包括连接三种或多种核苷酸序列的方法。虽然本发明的多种变化是可能的，但三种核苷酸序列可以利用一种接头分子连接，该接头分子在一个末端的5’和3’端处或附近含有拓扑异构酶，任选地含有一个或多个重组位点。因此，在三种核苷酸序列连接后，形成一种核苷酸序列，其包含在连接点处不含切口的第一条链，和在连接点处含有切口的第二条链。该方法具有使用一种拓扑异构酶修饰的分子将三种核苷酸序列连接在一起的优点。一旦核酸分子通过上述方法连接，产生的分子即可用于重组反应，如本文其它部分所述。本发明还包括通过本发明的方法制备的核酸分子，包含这些核酸分子的组合物，和应用这些核酸分子的方法。
本发明还提供共价连接两种或多种(例如2、3、4、5、6、7种等)核酸分子的两条链的方法。用图12A所示的示意图作为说明，本发明包括连接至少两种核苷酸序列的方法，包括接触下列成分：含有第一端和第二端的第一种核酸分子，其中在第一端或第二端或这两个末端，第一种核酸分子含有两个拓扑异构酶(例如，IA型和IB型拓扑异构酶)，一个与3’端一个与5’端共价结合；和第二种核酸分子，其不含与至少一个末端的任一端共价结合的拓扑异构酶。此外，第二种核酸分子通常在与第一种核酸分子连接的末端的5’和3’端含有羟基。在许多情况中，为了进行杂交，将要连接的两种核苷酸序列含有具有充分序列互补性的3’或5’突出端，任选地含有一个或多个重组位点。在有关实施方案中，如上所述的第一种和第二种核酸分子可以是同一核酸分子的第一末端和第二末端。因此，这两个末端的连接导致环化分子的形成。一旦核酸分子通过上述方法连接，产生的分子即可用于重组反应，如本文其它部分所述。本发明还包括通过本发明的方法制备的核酸分子，包含这些核酸分子的组合物，和应用这些核酸分子的方法。
用图5D所示的示意图作为说明，本发明包括连接三种或多种核苷酸序列的方法。虽然本发明的多种变化是可能的，但三种核苷酸序列可以利用一种接头分子连接，该接头分子在每个末端的5’和3’端处或附近含有拓扑异构酶，任选地含有一个或多个重组位点。因此，在三种核苷酸序列连接后，形成在连接点处不含切口的一种核苷酸序列。该方法具有使用一种拓扑异构酶修饰的分子将三种核苷酸序列连接在一起的优点。一旦核酸分子通过上述方法连接，产生的分子即可用于重组反应，如本文其它部分所述。本发明还包括通过本发明的方法制备的核酸分子，包含这些核酸分子的组合物，和应用这些核酸分子的方法。
本发明还提供进行拓扑异构酶介导的连接反应和重组反应的方法，这些反应能在一个试管或多个试管中进行。例如，进行拓扑异构酶介导的连接反应和重组反应所需的所有成分能够在一个试管中结合，两种反应能够基本同时地发生。图35-40显示了能在一个试管或多个试管中进行的拓扑异构酶/重组反应的例子。因此，在特定实施方案中，本发明提供单管反应，其中(1)一种或多种核酸分子或一种核酸分子的两个末端通过拓扑异构酶介导的反应彼此连接，(2)一个或多个重组位点与另外一个或多个重组位点进行重组。在本发明的方法中可以发生许多拓扑异构酶介导的连接反应和/或重组反应。此外，这些反应也可以以任何顺序发生。在特定实施方案中，本发明的反应混合物中的一种或多种核酸分子可含有(1)一个或多个重组位点和(2)一个或多个拓扑异构酶或一个或多个拓扑异构酶识别位点。
如以下实施例9所述，在某些情况中，发现拓扑异构酶能抑制特定重组反应。在这些情况中，进行拓扑异构酶介导的连接反应的核酸分子可以与反应混合物中存在的拓扑异构酶分离，然后可用作重组反应的底物。在这些情况中，拓扑异构酶介导的连接反应和重组反应通常在不同的试管中进行。可将拓扑异构酶介导的连接反应产物与拓扑异构酶分离的方法的例子包括但不限于：酚/氯仿抽提，一般随后为核酸沉淀(例如乙醇沉淀)和层析(例如柱层析)。
此外，反应混合物中存在的拓扑异构酶例如可以通过加热灭活(例如加热到约65℃约60min，约70℃约60min，约75℃约60min，约70℃约40min，约75℃约40min，约80℃约40min，约80℃约30min，约85℃约20min，约90℃约15min，约95℃约5min，或者约99℃约1min)或者利用蛋白酶(例如蛋白酶K)灭活。在这种情况下，在同一试管中进行拓扑异构酶介导的连接反应和重组反应通常是可能的。
在单管反应的特定实施方案中，利用拓扑异构酶介导的连接反应使两种或多种核酸片段彼此连接，它们均包含一个或多个拓扑异构酶或拓扑异构酶识别位点。之后，将试管加热到约85℃约20min，加入一种或多种重组酶。此外，如果两种或多种核酸片段中的一种或多种不含重组位点，或者如果希望与其它核酸片段重组，则可以添加包含一个或多个重组位点的核酸片段。试管中存在的重组位点一般是能够彼此重组的位点。
在单管反应的其它特定实施方案中，两种或多种核酸片段经历一种或多种重组酶催化的重组。发生重组后，向试管中添加拓扑异构酶，以促进拓扑异构酶介导的核酸片段的连接。如上所述，任选地可以与拓扑异构酶一起向反应混合物中添加其它核酸片段。此外，当向反应混合物中添加附着有一个或多个拓扑异构酶的核酸片段时，通常不必添加其它拓扑异构酶。因此，在特定实施方案中，可以向上述反应混合物中添加拓扑异构酶修饰的核酸片段，根据特定反应条件，可添加或不添加其它拓扑异构酶。
本发明也提供制备含有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6个等)多克隆位点的核酸分子的方法。例如，本发明的方法中使用的一种或多种核酸片段可以包含一个或多个多克隆位点。一个实施例是，通过含有一个或多个多克隆位点的接头的附着，可以向用来根据本发明的方法制备核酸分子的核酸片段中或向根据本发明的方法制备的核酸分子中添加多克隆位点。在有关方面，本发明包括通过本发明的方法制备的、含有一个或多个多克隆位点的核酸分子，以及一种或多种这样的多克隆位点在修饰通过本发明的方法制备的核酸分子中的用途。本发明也提供通过上述方法产生的核酸分子，以及这些分子和包含这些分子的组合物的用途。
病毒载体
本发明还提供制备含有病毒核酸区的核酸分子的方法，以及通过这些方法制备的核酸分子，和包含这些核酸分子的组合物。
腺病毒是能够在例如基因治疗中使用的病毒载体。腺病毒是用于向呼吸道上皮输送基因的特别有吸引力的载体，本发明的范围内包括这些载体的应用。腺病毒自然感染呼吸道上皮，在感染处引起轻微的疾病。基于腺病毒的输送系统的其它靶标是肝脏、中枢神经系统、内皮细胞和肌肉。腺病毒具有能够感染不分裂的细胞的优点。Kozarsky和Wilson，Current Opinion in Genetics and Development 3：499-503(1993)提供了基于腺病毒的基因治疗的一篇综述。Bout等人，HumanGene Therapy 5：3-10(1994)证实了腺病毒载体向恒河猴呼吸道上皮转移基因的用途。腺病毒在基因治疗中的应用的其它例子可见Rosenfeld等人，Science 252：431-434(1991)；Rosenfeld等人，Cell 68：143-155(1992)；Mastrangeli等人，J.Clin.Invest.91：225-234(1993)；PCT公开号WO94/12649和WO96/17053；美国专利号5,998,205；Wang等人，Gene Therapy 2：775-783(1995)，其公开内容均在此完整引用作为参考。
腺伴随病毒(AAV)和疱疹病毒以及由这些病毒制备的载体也曾计划用于基因治疗(Walsh等人，1993，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204：289-300；美国专利号5,436,146；Wagstaff等人，Gene Ther.5：1566-70(1998))。疱疹病毒载体尤其可用于希望在神经细胞中进行基因表达的用途。
本发明因此包括制备具有病毒载体(例如腺病毒载体、甲病毒载体、疱疹病毒载体、腺伴随病毒载体等)的一种或多种功能特性的核酸分子的方法。在特定实施方案中，本发明的方法包括核酸片段的连接，其中一种或多种核酸片段含有可使产物核酸分子具有作为病毒载体的能力(例如，在特定宿主细胞中复制的能力，包装成病毒颗粒的能力，等)的区域。
在特定实施方案中，本发明包括通过将至少一种(例如1、2、3、4种等)包含腺病毒序列的核酸片段与一种或多种其它核酸片段连接，制备腺病毒载体的方法。腺病毒载体和能用来制备腺病毒载体的核酸片段的具体例子在美国专利号5,932,210、6,136,594和6,303,362中公开，其完整公开内容在此引用作为参考。通过本发明的方法制备的腺病毒载体可以是复制型或复制缺陷型。
腺病毒载体的一个例子可以通过将一种包含腺病毒核酸的核酸片段与一种或多种其它核酸片段连接而制备。例如，当希望是复制缺陷型腺病毒载体时，腺病毒核酸可含有下列一个或多个区域的全部或部分缺失：E1a区、E1b区和/或E3区。这些区中含有缺失的腺病毒载体例如在美国专利号6,136,594中描述。本发明还包括通过本发明的方法制备的腺病毒载体，以及这些载体和包含这些载体的组合物的应用。通过本发明的方法制备的腺病毒载体的用途的例子包括向哺乳动物(例如人)细胞中输送核酸片段。因此，本发明提供制备适用于基因治疗方案的载体的方法。这些载体一般是复制缺陷型的。
在特定实施方案中，本发明的腺病毒载体包含基本上整个腺病毒基因组，不同之处在于下列一个或多个区域的全部或部分缺失：E1a区、E1b区和/或E3区。在其它特定实施方案中，在E1a区、E1b区和/或E3区之一或其多个中可存在非腺病毒核酸。
在特定实施方案中，通过本发明的方法制备的腺病毒载体含有至少一个复制起点和/或一个选择性标记，这可使载体在原核细胞如大肠杆菌中扩增。
腺伴随病毒载体和疱疹病毒载体可以用与上述方法类似的本发明的方法制备。因此，本发明还提供制备这些载体的方法，以及用这些方法生产的载体，这些载体的用途，和包含这些载体的组合物。
本发明还提供制备甲病毒载体(例如辛德毕斯病毒载体、塞姆利基森林病毒载体、罗斯河病毒载体、委内瑞拉马脑炎病毒载体、西方马脑炎病毒载体、东方马脑炎病毒载体等)的方法，以及通过这些方法制备的甲病毒载体，应用这些甲病毒载体的方法，和包含这些甲病毒载体的组合物。
在特定实施方案中，本发明包括通过将至少一种包含甲病毒序列的核酸片段与一种或多种其它核酸片段连接，制备甲病毒载体的方法。甲病毒载体和能用来制备甲病毒载体的核酸的具体例子在美国专利号5,739,026和6,224,879、Gibco BRL使用手册10179-018“SFV基因表达系统”和Invitrogen的辛德毕斯表达系统手册目录号K750-01(版本E)中有描述，其完整公开内容在此引用作为参考。
在特定实施方案中，在本发明的方法中用来制备甲病毒载体的甲病毒载体序列可包含一种或多种下列成分：一种或多种包装信号(可能是或者可能不是甲病毒来源的)、一种或多种亚基因组启动子和/或编码一种或多种非结构蛋白的核酸(例如nsp1、nsp2、nsp3、nsp4等)。
本发明的甲病毒载体可以作为DNA或RNA分子导入细胞中。当向细胞中导入DNA形式的这些载体时，可以用表达控制序列(例如诱导型、表达型或组成型控制序列)生产RNA分子，该分子可以翻译为一种或多种非结构蛋白。在特定实施方案中，这些非结构蛋白将形成一种依赖RNA的RNA聚合酶，其可扩增对应于甲病毒载体DNA形式产生的转录物的全部或一部分的RNA分子。因此，这些非结构蛋白可催化由RNA模板产生其它拷贝的RNA分子，导致RNA扩增。此外，希望高水平表达的一种核酸片段可以与一种亚基因组启动子有效连接，从而产生对应于该核酸片段的高水平RNA。
在一个典型实施方案中，通过本发明的方法制备的甲病毒载体包含DNA，其中一种诱导型启动子指导编码辛德毕斯病毒nsp1、nsp2、nsp3和nsp4的RNA分子的转录，和与非辛德毕斯病毒来源的一种核酸片段有效连接的辛德毕斯亚基因组启动子。本发明也提供通过本发明的方法制备的甲病毒载体，应用这些甲病毒载体的方法，和包含这些甲病毒载体的组合物。
本发明还提供连接核酸片段的方法，其中一种或多种核酸片段含有一种或多种(例如1、2、3、4种等)病毒包装信号(例如来源于上述病毒的一种或多种包装信号)。这些包装信号能用来指导通过本发明的方法制备的核酸分子的包装。一种制备包装核酸分子的方法是向表达适于生产病毒样颗粒的蛋白质的包装细胞系中导入或表达本发明的核酸分子。本发明还包括包装的本发明的核酸分子，制备包装的本发明的核酸分子的方法，和包含包装的本发明的核酸分子的组合物。
本发明也提供组合物和含有这些组合物的试剂盒，包括含有可用于进行本发明的方法的成分的试剂盒。一方面，本发明的一种组合物包含本发明的方法中的一个步聚所特有的分离成分。例如，本发明的一种组合物能包含两种或多种相同或不同的携带拓扑异构酶的核酸分子。如此处所用的术语“不同的”，当用于本发明的组合物的核酸分子时，是指当最佳比对时，核酸分子具有低于95％的序列同一性、一般低于90％的序列同一性、通常低于70％的序列同一性。因此，对于本发明的组合物而言，例如只是彼此为多形变体的不同的核酸分子，或只是含有不同的5’或3’突出序列的核酸分子，不认为是“不同的”。与之相比，不同的核酸分子的例子有：编码一种多肽的第一种序列和包含一种调节元件的第二种序列，或编码第一种多肽的第一种序列和编码一种非同源多肽的第二种序列。
当本发明的组合物包含两种以上的分离的不同核酸分子或两种以上的携带拓扑异构酶的不同核酸分子时，这些核酸分子都彼此不同，即它们全都不同于彼此。然而，应当理解，每一种核酸分子，例如被称为第一种核酸分子的序列，通常包含彼此相同或基本相同的一群这样的核苷酸序列。因此，应当清楚，术语“不同的”用于比较如第一种核酸分子(或其群体)与第二种(或其它)核酸分子。包含两种或多种携带拓扑异构酶的不同核酸分子的组合物还能包含一种拓扑异构酶。在此公开了包含本发明的组合物的成分的这些核酸分子的例子，包括，例如：编码序列、转录调节元件、翻译调节元件、编码可检测或选择性标记如表位标记或抗生素抗性基因的元件、编码多肽域如细胞区室化域或信号肽的元件，等等。
如此处所用的术语“分离的”是指，所述分子的形式不同于自然存在的形式。例如，分离的核苷酸序列通常可以是不是细胞基因组一部分的任何核苷酸序列，或者从通常含有该核苷酸序列的细胞中物理分离。应当理解，本发明的不同组合物包含分离的核酸分子的混合物。因此应当理解，术语“分离的”只是用于从自然状态分离分子，而不是指该分子只是一种成分。
本发明的组合物能包含两种不同的核酸分子，均在一个或两个末端处或附近含有拓扑异构酶识别位点，和位点特异性拓扑异构酶，该酶能在拓扑异构酶识别位点处结合并切割该核酸分子。任选地，不同核酸分子中有至少一种可能是携带拓扑异构酶的核酸分子。优选地，与携带拓扑异构酶的核酸分子共价结合的拓扑异构酶与该组合物中的拓扑异构酶属于同一家族。
在本发明的方法中能够使用不同的成分组合。例如，该方法能够通过接触如下成分进行：拓扑异构酶激活的第一种核酸分子，其任选地包含一个或多个重组位点；含有第一端和第二端的第二种核酸分子，其中在第一端或第二端或这两个末端，第二种核苷酸序列在3’端处或附近含有一个拓扑异构酶识别位点，在同一末端的5’端处含有一个羟基；和一种拓扑异构酶。在将要连接的一个或两个末端的5’端含有5’磷酸基团时，一种磷酸酶也能与反应混合物的成分接触。接触后，拓扑异构酶能够切割第二种核苷酸序列，产生一种拓扑异构酶激活的第二种核酸分子，必要时，磷酸酶能够在同一端产生一个5’羟基，然后第二种核酸分子能与拓扑异构酶激活的第一种核酸分子共价连接。因此，应当理解，本发明的组合物能包含可用于进行本发明的方法的任何不同的成分组合。一旦核酸分子通过上述方法连接，产生的分子即可用于重组反应，如本文其它部分所述。本发明还包括通过本发明的方法制备的核酸分子，包含这些核酸分子的组合物，和应用这些核酸分子的方法。
生产两条链共价连接的双链重组核酸分子的本发明的方法通常基于以下判断：两条链共价连接的双链重组核酸分子能够通过接触第一种核酸分子与第二种核酸分子产生，其中第一种和第二种序列在将要连接的末端均含有拓扑异构酶识别位点，例如5’-(C/T)CCTT-3’(Shuman，同上文，1991；美国专利号5,766,891)。切割后，位点特异性拓扑异构酶共价结合于3’端。切割后的核苷酸序列在与结合拓扑异构酶相同的末端也含有一个5’羟基时，两种核苷酸序列的末端结合，每个3’端上的拓扑异构酶能够将该端与结合的核苷酸序列上的5’羟基共价连接(见图1)。
如此处所用的，“在所有成分能够接触的条件下”接触第一种核苷酸序列与至少一种第二种核苷酸序列是指，该反应条件适于拓扑异构酶切割的核苷酸序列末端充分靠近，使得拓扑异构酶能够达到其酶活性，并将第一种核苷酸序列的3’或5’端分别与第二种核苷酸序列的5’或3’端共价连接。此处公开了这些条件的实例，包括反应温度、离心强度、pH等，例如拓扑异构酶切割后产生的末端的特定5’突出序列所需要的其它适当条件，能够根据经验确定，或者用预测核苷酸序列特异杂交的条件的通式确定，如本领域众所周知(参见，例如Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册》(Cold Spring Harbor Laboratory Press1989)；Ausubel等人，《现代分子生物学方法》，John Wiley and Sons，Baltimore，MD(1987，和1995年增刊)，均在此引用作为参考)。
在一个实施方案中，本发明的方法提供一种方法，用来通过有效连接一种或多种调节元件与推断的编码序列，使得cDNA的开放阅读框或分离的基因组DNA序列能够表达。因此，包含一种开放阅读框的第一种核酸分子能够用一种引物对PCR扩增，产生扩增的第一种核酸分子，其在一个或两个末端含有拓扑异构酶识别位点，任选地，如希望的含有一个或多个重组位点，使得在用位点特异性拓扑异构酶切割后，一个或两个末端含有确定的5’或3’突出端或是平端。当这样构建扩增的第一种核酸分子的两个末端时，5’或3’突出序列通常但不是必须彼此不同。在有利于重组的条件下，扩增的第一种核酸分子能接触第二种核酸分子，后者含有希望的调节元件，如启动子，在某些实施方案中，(a)一个或多个拓扑异构酶识别位点，与一种拓扑异构酶和/或(b)一个或多个重组位点，以利用本发明的方法将第二种核苷酸序列与编码序列的5’端有效共价连接。
在这种方法中，第二种(或其它)核酸分子也能包含两种或多种调节元件，例如启动子、内部核糖体进入位点和ATG起始甲硫氨酸密码子等，或其它目的序列，例如编码一种表位标记的序列，它们彼此共价连接，并且能与包含编码序列的第一种核酸分子的5’端有效共价连接。这种方法还能包括接触第三种核酸分子，后者包含例如聚腺苷酸化信号，能够根据本发明的方法与编码序列的3’端有效共价连接，从而产生一种表达型双链重组核酸分子。因此，本发明的方法提供一种生产功能性双链重组核酸分子的方法，该分子能够作为功能单元转录、翻译或转录并翻译。如此处公开的，在将要通过位点特异性拓扑异构酶连接在一起的核酸分子末端含有拓扑异构酶切割产生的互补5’或3’突出序列，有利于生产在构建体中含有希望方向的核苷酸序列的双链重组核酸分子。
在另一个实施方案中，进行本发明的方法，使得第一种核酸分子或第二种(或其它)核酸分子或其组合是一群核苷酸序列之一。如此处所用的术语“群体(plurality)”当用于第一种或至少第二种核苷酸序列时，是指核苷酸序列相关但不相同。对于本发明而言，一群核苷酸序列“相关”，因为该群体中的每一种核苷酸序列在一个或更多末端至少含有一个拓扑异构酶识别位点或其切割产物和/或至少一个重组位点。此外，一种群体中的核苷酸序列是“不同”的，它们能包括例如cDNA文库、核苷酸序列组合文库、多样化核苷酸序列群体等。制备cDNA文库、组合文库、含有多样化核苷酸序列群体的文库等的方法在本领域众所周知(参见，例如：美国专利号5,837,500；美国专利号5,622,699；美国专利号5,206,347；Scott和Smith，Science 249：386-390，1992；Markland等人，Gene 109：13-19，1991；O’Connell等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：5883-5887，1996；Tuerk和Gold，Science249：505-510，1990；Gold等人，Ann.Rev.Biochem.64：763-797，1995；均在此引用作为参考)。
本发明还提供生产双链重组核酸分子的一种方法，包括：用一种PCR引物对扩增第一种核酸分子的一部分，其中该引物对的至少一条引物编码拓扑异构酶识别位点或其切割产物，和任选地一个或多个重组位点，从而产生含有第一端和第二端的第一种核酸分子，其中第一端或第二端或这两个末端在3’端和/或5’端处含有一个拓扑异构酶识别位点；然后接触第一种核酸分子；含有第一端和第二端的至少第二种核酸分子，其中第一端或第二端或这两个末端在3’端和/或5’端处含有拓扑异构酶识别位点或其切割产物；和拓扑异构酶(见图1)。当在含有拓扑异构酶识别位点的第一种核酸分子的一个末端与含有拓扑异构酶识别位点的至少第二种核酸分子的一个末端能够结合的条件下接触时，产生两条链共价连接的双链重组核酸分子。一旦核酸分子通过上述方法连接，产生的分子即可用于重组反应，如本文其它部分所述。本发明还包括通过本发明的方法制备的核酸分子，包含这些核酸分子的组合物，和应用这些核酸分子的方法。
如此处公开的，一种PCR方法利用引物在扩增核酸分子的一个或两个末端掺入一个或多个拓扑异构酶识别位点和任选地一个或多个重组位点，该方法提供生产可用于本发明的方法的一种便利方法。在一些实施方案中，引物对的至少一条引物设计为以5’-3’方向包含与拓扑异构酶识别位点互补的核苷酸序列，和与将要扩增的靶核酸分子3’端互补的核苷酸序列(即靶特异区)。另外，该引物也能在拓扑异构酶识别位点互补体的5’处含有任意长度(一般约1-100个核苷酸，通常约2-20个核苷酸，尤其是约4-12个核苷酸)的一种希望的核苷酸序列，在扩增产物被位点特异性拓扑异构酶切割后，形成希望的5’突出端。PCR引物对的第二条引物可能与将要扩增的核苷酸序列的希望的序列互补，并且能包含拓扑异构酶识别位点的互补体，在被位点特异性拓扑异构酶切割后将产生5’突出端的序列，或希望的任何其它序列。
这种引物可包含或编码其它任何目的序列，包括，例如，位点特异性整合识别位点，如att位点、lox位点等，或者如上所述，能够只用来向包含这种目的序列的核酸分子内导入拓扑异构酶识别位点。根据本发明的方法生产的、含有位点特异性整合识别位点如att位点或lox位点的双链重组核酸分子，能被特异整合到含有需要的整合位点(分别如att位点或lox位点)的希望的基因座内，如一种载体、一种基因座内等，并接触位点特异事件所需的适当酶，分别如λInt和IHF蛋白质或Cre重组酶。例如，根据本发明的方法向两条链共价连接的双链重组核酸分子内掺入attB或attP序列，允许利用GATEWAYTM克隆系统(Invitrogen Corp.，La Jolla CA)方便地操作该核酸分子。
在一个实施方案中，通过PCR反应或其它扩增反应进一步扩增根据本发明的方法生产的一种构建体。对根据本发明的方法生产的双链重组核酸分子直接进行PCR是可能的，因为该构建体至少一条链共价连接。因此，能用PCR生产大量构建体。更重要的是，如上所述，PCR提供一种体外筛选方法，用来只获得根据本发明的方法生产的希望的产物，而不获得部分反应产物。例如，能用本发明的方法生产一种两条链共价连接的双链重组核酸分子，其以5’-3’方向有效连接地包含：含有启动子的第一种核酸分子、含有编码区的第二种核酸分子和含有聚腺苷酸化信号的第三种核酸分子。
如此处公开的，在将要连接的核酸分子的末端上包含互补5’突出序列能够产生具有预定方向的构建体。通过选择一种PCR引物对，能够产生包含启动子、编码区和聚腺苷酸化信号的功能性扩增产物，该引物对包含与第一种核酸分子互补的、位于启动子序列上游的第一条引物，和与第三种核酸分子互补的、位于聚腺苷酸化信号下游的第二条引物。相反，缺乏第一种核酸分子或第三种双链核苷酸的部分反应产物不扩增，因为第一条或第二条引物分别不与部分产物杂交。另外，由于第一种和第三种核酸分子的5’突出序列缺乏互补性，不能产生缺乏第二种核酸分子的构建体。因此，本发明的方法提供一种获得希望的两条链共价连接的功能性双链重组核酸分子的方法。
以这种方式应用PCR进一步提供了一种方法，其为了鉴定目的构建体，筛选根据本发明的方法生产的大量核酸分子。由于在自动高通量分析中应用PCR的方法是常规，并且众所周知，应当知道，本发明的方法能够容易地加以修改以在高通量系统中使用。利用这种系统，能够平行筛选大量构建体，并且能够鉴定并处理部分或不完全的反应产物，从而防止浪费时间和经费，另外还需要用进一步的实验来表征这些构建体或者检查这些构建体的功能性。
本发明的方法在分子生物学领域具有广泛用途。如下文详述，例如，能够利用本发明的方法标记DNA或RNA探针，进行定向克隆(见实施例1B)，产生有义或反义RNA分子(见实施例2A)、制备用于进行双杂交测定的诱饵(bait)或猎物(prey)构建体(见实施例2C)、制备线性表达元件(见实施例2A和2B)、制备可用于偶联体外转录/翻译测定的构建体(见实施例2B)。例如，生产两条链共价连接的双链重组核酸分子的一种方法提供了一种生产线性表达元件(LEE)的方法，该元件由一种线性核酸分子组成，该分子包含两种或多种核苷酸序列，如启动子或与一种开放阅读框连接的其它调节元件(见实施例1)。据报道LEE能有效转染细胞，从而不需要在载体中克隆表达元件(Sykes和Jonhston，Nat.Biotechnol.17：355-359，1999)。LEE的成分可能非共价连接，或者可能通过连接反应共价连接。非共价连接的LEE的制备需要利用含有脱氧尿苷残基的PCR引物扩增每一种核苷酸序列成分，然后用尿嘧啶-DNA糖基化酶处理PCR产物，产生能够杂交的突出端。然而，使用这种非共价连接的LEE的转染率是可变的，有时，远低于共价连接的LEE的效率(Sykes和Jonhson，同上文，1999)。此外，这些LEE不适于用作PCR扩增的模板，因为引物延伸反应不能跨过模板上的切口，因此终止，产生不完全的反应产物。
本发明的一种方法提供一种直接、简单的生产共价连接的LEE的方法，从而避免了以前对于制备LEE所述的不便和其它步骤，并且降低了如用非共价连接的LEE存在的转染率的变化性。例如，编码目的开放阅读框的第一种核酸分子能够如此处公开的PCR扩增，以在一个或两个末端获得拓扑异构酶识别位点或其切割产物。此外，PCR引物也能设计为在用位点特异性拓扑异构酶切割扩增的第一种核酸分子后，切割产物含有预定的且希望的5’突出序列。第二种核苷酸序列(和第三种或更多，如希望的)除了含有拓扑异构酶识别位点或其切割产物外，还能包含或编码一种调节元件，例如启动子、增强子、沉默子、剪接受体位点、翻译起始位点、核糖体识别位点或内部核糖体进入位点、聚腺苷化信号、起始甲硫氨酸密码子或终止密码子，或者能编码其它任何希望的序列，如表位标记或细胞区室化域。优选地，将与第一种核酸分子共价连接的第二种(或其它)核酸分子在将要连接的第一种核酸分子的末端含有与5’突出端互补的5’突出序列。在拓扑异构酶存在下接触这种核苷酸序列后，例如，启动子能够与开放阅读框的5’端有效共价连接，聚腺苷酸化信号能够与开放阅读框的3’端有效共价连接，从而产生一种共价连接的功能性LEE(参见实施例1)。
可用于本发明的调节元件的例子在此公开，包括转录调节元件、翻译调节元件、有利于细胞中(或之外)核苷酸序列或多肽转运或定位的元件、提供可检测表型的元件等。转录调节元件包括，例如：启动子，如来自巨细胞病毒、莫洛尼白血病病毒和疱疹病毒的启动子，以及来自编码金属硫蛋白、骨骼肌动蛋白、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、磷酸甘油酯、二氢叶酸还原酶和胸苷激酶的基因的启动子，以及来自病毒长末端重复序列(LTR)如劳斯肉瘤病毒LTR的启动子，和操纵基因；增强子，可以是组成型活性的，如免疫球蛋白增强子，或是诱导型的，如SV40增强子；等等。例如，金属硫蛋白启动子是一种组成型活性启动子，在暴露于金属离子如铜、镍或镉离子后也能诱导高水平表达。与之相比，四环素(tet)诱导型启动子是在暴露于四环素或四环素类似物后诱导的启动子的一个实例，但是没有活性。转录调节元件也可能是组织特异的调节元件，例如肌细胞特异的调节元件，使得编码产物的表达只限于一个个体中的肌细胞，或者培养细胞混合群体(例如器官培养物)中的肌细胞。肌细胞特异的调节元件在本领众所周知，包括例如肌肉肌酸激酶启动子(Sternberg等人，Mol.Cell.Biol.8：2896-2909，1988，在此引用作为参考)和肌球蛋白轻链增强子/启动子(Donoghue等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：5847-5851，1991，在此引用作为参考)。其它组织特异的启动子，以及只在细胞或生物的特定发育阶段表达的调节元件，在本领域中也众所周知。
在其它实施方案中，在实施本发明中应用的或其产生的核苷酸序列中所含的调节元件可能是一种或多种操纵基因。本领域公知多种操纵基因。适用于本发明的操纵基因的一个例子是大肠杆菌色氨酸操纵子的色氨酸操纵基因。当色氨酸阻抑蛋白与两个色氨酸分子结合时，结合大肠杆菌操纵基因，当位于相对于启动子的适当位置时，阻断转录。适用于本发明的操纵基因的另一个例子是大肠杆菌四环素操纵子的操纵基因。也发现大肠杆菌的四环素抗性系统的成分在真核细胞中起作用，已经用来调节基因表达。例如，在不含四环素时能够结合四环素操纵基因并抑制基因转录的四环素阻抑蛋白已经在植物细胞中表达，其浓度足以抑制从含有四环素操纵基因序列的启动子开始转录(Gatz等人，Plants 2：397-404(1992))。例如，美国专利号5,789,156描述了四环素调节的表达系统，其完整公开内容在此引用作为参考。能用于本发明的操纵基因的其它例子包括Lac操纵基因和大肠杆菌钼盐转运操纵基因/启动子系统的操纵基因(参见，例如Cronin等人，GenesDev.15：1461-1467(2001)和Grunden等人，J.Biol.Chem.，274：24308-24315(1999))。
因此，在特定实施方案中，本发明提供制备核酸分子的方法，该分子含有能用来调节原核或真核细胞中表达的一种或多种操纵基因。本领域技术人员应当理解，当含有一种操纵基因的核酸分子置于存在体内或体外转录机制的条件下时，通常通过使该核酸分子接触一种阻抑蛋白或一种或多种有利于适当阻抑蛋白与操纵基因结合的代谢物，进行表达的调节。因此，本发明还提供制备编码可调节操纵基因功能的阻抑蛋白的核酸分子的方法，以及通过本发明的方法制备的核酸分子，包含这些核酸分子的组合物，和这些分子和组合物的用途。
在根据本发明的方法生产构建体中有用的调节或其它元件能用多种方法获得。具体而言，多种元件包含于市售载体中，能够从中分离，并且能够用如此处公开的PCR方法修饰，以在一个或两个末端含有拓扑异构酶识别位点。另外，此处有用的元件的序列或编码它的序列一般众所周知，并且在出版物中公开。许多情况下，这些元件，例如多种转录和翻译调节元件，以及细胞区室化域，是相对较短的序列，因此，适于元件或编码该元件的核苷酸序列的化学合成。因此，在一个实施方案中，能够化学合成包含本发明的组合物的一种元件，其可用于通过本发明的方法生产双链重组核酸分子，或者包含于本发明的试剂盒中，希望时能够合成，使之在该元件的一个或两个末端含有拓扑异构酶识别位点，在位点特异性拓扑异构酶切割后进一步含有一种突出序列。
一种携带拓扑异构酶的载体能够用下列方法产生(Genome Res.9：383-392，1999)：用可产生“粘端”的限制性内切酶线性化一种载体。利用连接酶如T4 DNA连接酶，将连接寡核苷酸与线性化DNA的两个末端和两条链连接。该连接寡核苷酸含有并定位一种5’-CCCTT-3’牛痘拓扑异构酶I型识别序列，使其能被拓扑异构酶切割，并在该载体的每个3’端捕获共价拓扑异构酶-DNA复合物。然后连接载体与纯化的牛痘拓扑异构酶和退火的寡核苷酸一起温育，在该载体的每个末端组成“拓扑异构酶位点”。退火的寡核苷酸用来在“底”链中产生断裂或切口，与含有5’-CCCTT-3’的寡核苷酸的最后一个T相对。位于拓扑异构酶切割位点“下游”的寡核苷酸连接片段(“离去基团”)在拓扑异构酶切割后释放，在拓扑异构酶-载体纯化过程中被除去。在“离去基团”不含5’羟基时，拓扑异构酶包含于与DNA末端的共价复合物中，产生一种携带拓扑异构酶的载体。
在根据本发明的方法共价连接核酸分子时，核苷酸序列通常有效连接，使得产生的重组核酸分子具有希望的结构，并行使希望的功能或编码一种希望的表达产物。如此处所用的术语“有效连接的”是指，两种或多种核苷酸序列彼此相对的位置使得它们能作为一种单元获得可归因于一种或两种序列或其组合的功能。术语“有效共价连接的”在此用来指有效连接的核苷酸序列，它是根据用于生产一条或两条链共价连接的双链重组核酸分子的本发明的方法生产的。例如，含有一种开放阅读框的核苷酸序列能够与一种启动子有效连接，使得该启动子能够对开放阅读框施加调节作用，其调节方式类似于影响通常与细胞基因组有关的开放阅读框表达的方式。类似地，包含开放阅读框的两种或多种核苷酸序列能够在框内有效连接，使得转录并翻译后产生一种嵌合融合多肽。
尽管根据本发明的方法生产的一条链或两条链共价连接的双链重组核酸分子是线性的，但是产生的构建体也可能是环化的双链重组核酸分子。此外，也能产生一种环状双链重组核酸分子，使其具有载体的特征，并且含有例如在原核宿主细胞、真核宿主细胞或这两种细胞中复制所需的调节元件，并且能含有一种编码提供抗生素抗性的多肽的核苷酸序列，等等。该方法的一个优点是，根据本发明的方法环化的产生的双链重组核酸分子能够转化或转染适当的宿主细胞，该构建体在其中得到扩增。因此，除了体外方法如PCR外——它能用来生产根据本发明的方法产生的大量线性双链重组核酸分子，也能利用应用宿主细胞的一种体外方法获得根据本发明的方法生产的大量环化产物。这些元件包括细胞复制起点、抗生素抗性基因等，它们含有根据本发明的拓扑异构酶识别位点，可能是如此处公开的本发明的试剂盒中所含的有用成分。
应当理解，一条链或两条链共价连接的线性双链重组核酸分子也能克隆到一种载体内，可以是一种质粒载体或病毒载体，如噬菌体、杆状病毒、逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、痘苗病毒、塞姆利基森林病毒和腺伴随病毒载体，它们均众所周知，能购自供应商(Promega，Madison WI；Stratagene，La Jolla CA；GIBCO/BRL，GaithersburgMD)。希望时，能够根据本发明的方法，例如应用PCR法，线性化并修饰载体，使其在一个或两个3’端含有拓扑异构酶识别位点或其切割产物，或者可由本领域技术人员构建(通常见Meth.Enzymol.Vol.185，Goeddel编著(Academic Press，Inc.，1990)；Jolly，Canc.GeneTher.1：51-64，1994；Flotte，J.Bioenerg.Biomemb.25：37-42，1993；Kirshenbaum等人，J.Clin.Invest.92：381-387，1993；均在此引用作为参考)。
在用本发明的方法生产一条或两条链共价连接的双链重组核酸分子时，即向细胞中特别是患者细胞中导入时，病毒表达载体是特别有用的。病毒载体具有能够以相对较高的效率感染宿主细胞并且能感染特定细胞型或者能够修饰后感染宿主中的特定细胞的优点。
已经发展了用于特定宿主系统的病毒载体，包括，例如：感染昆虫细胞的杆状病毒载体；逆转录病毒载体，其它慢病毒载体，如基于人类免疫缺陷病毒(HIV)的载体、腺病毒载体、腺伴随病毒(AAV)载体、疱疹病毒载体、痘苗病毒载体等，它们感染哺乳动物细胞(参见Miller和Rosman，BioTechniques 7：980-990，1992；Anderson等人，Nature 392：25-30 Suppl.，1998；Verma和Somia，Nature 389：239-242，1997；Wilson，New Engl.J.Med.334：1185-1187(1996)，均在此引用作为参考)。例如，能用一种基于HIV的病毒载体感染T细胞，例如，能用一种基于腺病毒的病毒载体感染呼吸道上皮细胞，能用一种基于疱疹病毒的病毒载体感染神经元细胞。其它载体，如AAV载体，可能具有更大的宿主细胞范围，因此，能用来感染多种细胞型，尽管也能用特异受体或配体修饰病毒或非病毒载体，以通过受体介导的事件改变靶特异性。
能用本发明的一种方法有效共价连接含有一个开放阅读框的第一种核酸分子与含有一个开放阅读框的第二种(和其它)核酸分子，产生一种编码嵌合多肽的核酸分子。嵌合多肽包括一种融合多肽，其中两种(或多种)编码肽(或多肽)被翻译为一种产物，即，肽通过肽键共价连接。例如，第一种核酸分子能够编码一种细胞区室化域，如质膜定位域、核定位信号、线粒体膜定位信号、内质网定位信号等，或一种蛋白质转导域，如人类免疫缺陷病毒TAT蛋白转导域，它有利于与之连接的肽向细胞内的转移(参见Schwarze等人，Science285：1569-1572，1999；Derossi等人，J.Biol.Chem.271：18188，1996；Hancock等人，EMBO J.10：4033-4039，1991；Buss等人，Mol.Cell.Biol.8：3960-3963，1988；美国专利号5,776,689，均在此引用作为参考)。这种域能用来靶向包含该域的融合多肽和第二种核酸分子编码的多肽，它根据本发明的方法与细胞中的特定区室共价连接，或从细胞分泌或进入细胞。因此，本发明提供一种生产编码嵌合多肽的两条链共价连接的双链重组核酸分子的方法。
由根据本发明的方法生产的核酸分子表达的一种融合蛋白也能包含一种具有可检测标记或标签的特征的肽，使得能够检测、分离表达的融合多肽等。例如，如此处公开的，含有拓扑异构酶识别位点或其切割产物的核酸分子能够编码一种酶，如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、萤光素酶或其它酶；或者能编码一种肽标记，如聚组氨酸序列(例如六组氨酸)、V5表位、c-myc表位；血凝素A表位、FLAG表位等。包含可检测标记的融合多肽的表达能够用适当的试剂检测，例如，在向包含萤光素酶的融合多肽中添加萤光素后检测光辐射，或者检测镍离子与包含聚组氨酸标记的融合多肽的结合。类似地，能够进行包含一种标记的融合多肽的分离，例如，使包含myc表位的融合多肽通过含有与之结合的抗-c-myc表位抗体的柱，然后洗脱结合的融合多肽，或者使包含聚组氨酸标记的融合多肽通过镍离子或钴离子亲和柱，洗脱结合的融合多肽。检测或分离这些融合多肽的方法在本领域众所周知，基于选择的选择性标记或标签(参见，例如，Hopp等人，BioTechnology 6：1204，1988；美国专利号5,011,912；均在此引用作为参考)。
本发明的方法也能用来可检测地标记一种含有化学或有机或无机小部分的核苷酸序列，使得该核苷酸序列可用作探针。例如，在3’端含有拓扑异构酶识别位点或其切割产物的核酸分子能含有与之结合的可检测部分，如能用亲和素或链霉亲和素检测的生物素、荧光化合物(例如Cy3、Cy5、Fam、荧光素或罗丹明)、放射性核素(例如硫-35、锝-99、磷-32或氚)、顺磁旋转标记(例如碳-13)、化学发光化合物等，使得在根据本发明的方法生产共价连接的双链重组核酸分子后，产生的核酸分子被标记。可检测地标记含有该部分的核苷酸序列的方法在本领域众所周知(参见，例如，Hermanson，《生物偶联技术》(AcademicPress 1996)，在此引用作为参考)。此外，也能用一种可检测标记捕获通过本发明生产的双链核酸分子。最后，能用可检测标记，例如生物素，阻断第一种核酸分子的含拓扑异构酶末端与第二种核酸分子的标记末端连接，从而提供了一种直接连接第二种核酸分子的未标记末端的方法。应当理解，如此处公开的或本领域周知的这些元件，包括编码细胞区室化域、可检测标记或标签或包含转录或翻译调节元件的核苷酸序列，可能是如此处公开的试剂盒的有用成分。
本发明的方法提供一种方便地生产双链重组核酸分子的方法，该分子编码例如可用于进行双杂交测定的嵌合多肽。在这种方法中，第一种核酸分子编码一种多肽，或其相关域，怀疑已经或正在检查与一种或多种其它多肽特异相互作用的能力。第一种核酸分子如此处公开地修饰，使之在一个或两个末端含有一个拓扑异构酶识别位点，希望时，含有5’突出序列。将要根据本发明的方法与第一种核酸分子共价连接的第二种核酸分子，能编码一种转录激活域或DNA结合域(实施例2C)，并含有一个拓扑异构酶识别位点或其切割产物，和与将要连接的第一种核酸分子的末端互补的5’突出序列。在接触一种拓扑异构酶后，如果该核苷酸序列不含拓扑异构酶，则产生第一种杂合体，其可用于进行双杂交测定(参见，例如Fields和Song，Nature 340：245-246，1989；美国专利号5,283,173；Fearon等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：7958-7962，1992；Chien等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：9578-9582，1991；Young，Biol.Reprod.58：302-311(1998)，均在此引用作为参考)，或双杂交测定的变型，如反向双杂交测定(Leanna和Hannink，Nucl.Acids Res.24：3341-3347，1996，在此引用作为参考)、抑制的反式激活系统(美国专利号5,885,779，在此引用作为参考)、蛋白质补充系统(美国专利号5,776,689，在此引用作为参考)等。用类似的方法生产第二种杂种蛋白，它能包含多种多肽，将要检测它与第一种杂种蛋白的多肽或其结构域相互作用的能力。
类似地，生产嵌合蛋白的这种方法能够按照本发明生产一条链共价连接的双链重组核酸分子的方法进行，其中使用在将要连接的末端的至少一个5’端包含位点特异性拓扑异构酶识别位点(例如IA型或II型拓扑异构酶识别位点)或其切割产物的第一种和第二种核酸分子，其中该核酸分子在用拓扑异构酶切割后还能包含互补的3’突出端。
类似地，生产嵌合蛋白的这种方法能够按照本发明生产两条链共价连接的双链重组核酸分子的方法进行，其中使用至少在将要连接的末端的5’端包含位点特异性拓扑异构酶识别位点或其切割产物的第一种和第二种核酸分子，其中该核酸分子在用拓扑异构酶切割后还能包含互补的3’突出端；或第一种或第二种核酸分子之一，其在至少一个末端的5’端和3’端包含拓扑异构酶识别位点或其切割产物，其它核酸分子在将要连接的末端含有一个3’羟基和5’羟基，其中在拓扑异构酶切割后，含有拓扑异构酶的核酸分子在将要连接的其它核酸分子的末端含有5’或3’突出端，该突出端互补于并且有利于分别与5’或3’突出端或平端的杂交。
在一个备选实施方案中，本发明也提供一种向克隆或表达载体内定向插入DNA片段的方法，其具有拓扑异构酶介导的克隆的易行性和效率。本发明也优于当前的克隆系统，因为它降低了鉴定以希望的方向克隆的插入片段所需的繁琐的筛选过程。本发明该方面的最简单形式由在两个3’端都含有共价连接的拓扑异构酶分子的线性表达载体组成。线性化载体的至少一个末端含有5’单链突出端，而相对的末端可能是平端，具有一个可用于T/A克隆的3’T延伸，或者其本身可含有第二个5’单链突出序列。这些单链序列突出端在此也被称为“SSS”，可由任何合适的序列组成。
根据本发明该方面构建携带拓扑异构酶的克隆载体可如下进行：例如，内切核酸酶消化载体(可以是pDONR载体(见图32)或pDEST载体(见图33))，随后互补退火合成的寡核苷酸，并用牛痘拓扑异构酶I位点特异地切割异源双链体。用任何合适的内切核酸酶消化载体产生特异的粘端。定制的寡核苷酸可与这些粘端退火，并且具有在拓扑异构酶I修饰后可形成该载体的定制末端的序列(见图32和33)。根据使用目的，SSS的序列和长度将不同。
在本发明该方面提供的TOPO SSS载体的一个用途中，将要插入载体内的DNA片段是一种PCR产物。用定制引物PCR扩增后，产物能定向插入在插入位点的一个或两个末端含有SSS的携带拓扑异构酶I的克隆载体中。定制引物可以设计为，引物对的至少一条引物在其5’端含有另一种序列。添加的序列可以设计为与载体中的单链突出端序列互补。载体中的5’单链突出端与PCR产物5’端之间的互补性介导PCR产物向拓扑异构酶介导的载体内的定向插入。特别是，由于只有载体的一端和PCR产物的一端具有互补的SSS区，该产物的插入是定向的。拓扑异构酶I催化PCR产物与载体的连接。
本发明该方面也提供一种修饰的克隆载体，其含有突出的单链DNA片段(SSS)，携带拓扑异构酶，或“TOPO SSS载体”。修饰的载体允许定向插入PCR扩增的或适于随后表达的开放阅读框(ORF)，并且具有拓扑异构酶介导的克隆的效率。
如上所述，拓扑异构酶是通过DNA链的断裂和再连接修饰DNA的拓扑学状态的一类酶(Shuman等人，美国专利号5,766,891，在此引用作为参考)。痘苗病毒编码一种314氨基酸的I型拓扑异构酶，该酶能位点特异地单链切割双链DNA，以及5’羟基引导的再连接。位点特异的I型拓扑异构酶包括但不限于病毒拓扑异构酶，如痘病毒拓扑异构酶。痘病毒拓扑异构酶的例子包括兔纤维瘤病毒和ORF病毒。本领域技术人员周知其它位点特异性拓扑异构酶，也能用来实施本发明。
Shuman称，牛痘拓扑异构酶结合双链DNA并切割一条链的磷酸二酯骨架，显示有高水平的序列特异性。切割发生在易裂链中的共有五嘧啶元件5’-(C/T)CCTT-3’或相关序列处。在一个实施方案中，易裂键距双链DNA 3’端2-12bp。在另一个实施方案中，可被牛痘拓扑异构酶切割的复合物的形成需要切割位点上游的6个双链核苷酸和下游的2个核苷酸。牛痘拓扑异构酶可切割的序列的例子包括但不限于：+6/-6双链体G CCCTTATTCCC、+8/-4双链体TCG CCCTTATTC、+10/-2双链体TGTCG CCCTTAT、+11/-1双链体GTGTCG CCCTTA。
其它位点特异性I型拓扑异构酶的例子在本领域众所周知。这些酶由多种生物编码，包括但不限于酿酒酵母、粟酒酵母和四膜虫属(Tetrahymena)，然而这些种的拓扑异构酶I对共有序列的特异性低于牛痘拓扑异构酶(Lynn，R.M.，Bjornsti，M.，Caron，P.R.和Wang，J.C.，(1989)“肽测序和定点诱变鉴定酪氨酸-727是酿酒酵母DNA拓扑异构酶I的活性位点酪氨酸”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：3559-3563)(Eng，W.，Pandit，S.D.和Sternglanz，R.，(1989)“真核DNA拓扑异构酶I的活性位点酪氨酸的作图”J.Biol.Chem.，264：13373-13376)和(Busk，H.，Thomsen，B.，Bonven，B.J.，Nielsen，O.F.和Westergaard，O.(1987)“含有拓扑异构酶I十六体识别位点的超螺旋DNA的优先松弛”，Nature，327：638-640)。
如此处本发明该方面所用的，术语供体是指一种在3’端附近含有5’-CCCTT切割位点的双链DNA，术语受体是指一种含有5’-OH端的双链DNA。一旦被拓扑异构酶共价激活，供体即被转移给这些与SSS互补的受体。
根据本发明该方面，为了有利于DNA片段的定向插入，进一步改造拓扑异构酶修饰的载体，使之含有至少一种5’单链突出序列。在一个优选实施方案，将要克隆的片段是一种PCR产物，它组成由产生的重组载体表达的开放阅读框(ORF)。设计用于扩增ORF的引物，使引物对的至少一条引物在其5’端含有另外一种序列。该序列设计为与本发明的拓扑异构酶修饰的载体所含的5’单链突出端序列互补。
在以下的实施例5-8中详述了根据本发明该方面的某些优选的、但不是仅有的实施方案。
利用本发明的方法装配的核酸分子可以直接使用，或者可以扩增后用于多种目的。根据图34，利用本发明的方法装配的核酸片段可以用多种方法产生。例如，这些片段可以用本领域周知的任何方法获得。在核酸片段不含适于利用本发明的方法装配的一个或多个(例如1、2、3、4个等)末端和/或区域的情况中，可以添加这种末端和/或区域。例如，可以通过PCR扩增核酸，或者添加一种或多种(例如1、2、3、4种等)接头(例如含有一个或多个拓扑异构酶识别位点的接头)，添加合适的末端和/或区域。然后可以利用本文其它部分所述的本发明的方法装配含有适当末端和/或区域的核酸片段。
如图34所示，装配后，可以扩增(例如在体外或体内)连接的核酸片段，然后在多种方法或程序中使用，其中许多在本文其它部分描述。此外，装配的核酸片段可以直接使用，如用于体外转录/翻译、重组克隆，或用于转化或转染细胞。本发明因此提供用于操作核酸的通用组合物和方法。
本发明提供利用拓扑异构酶和重组连接核酸分子的组合物和方法。在本发明的特定实施方案中，核酸分子经历一次或多次(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次等)重组反应，然后利用包括一种或多种(例如1、2、3、4种等)拓扑异构酶催化的链共价连接的方法与一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种等)其它核酸分子连接。在其它实施方案中，通过包括一种或多种(例如1、2、3、4种等)拓扑异构酶催化的链共价连接的方法将核酸分子与其它核酸分子连接，然后进行一次或多次(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次等)重组反应。本领域技术人员应当理解，本发明不依赖拓扑异构酶介导的核酸分子连接或重组反应的任何顺序。因此，本发明通常涉及用于进行重组反应和利用拓扑异构酶连接核酸片段的组合物和方法。
本发明也提供根据本发明的方法和组合物使用的接头分子。本发明提供的并且可以与本发明一起使用的接头能含有拓扑异构酶位点和重组位点。本发明的方法的一个实例在图35中图示说明。图35显示了一种方法，包括拓扑异构酶改造的含有一个重组位点的核酸片段(“接头”)与另一种核酸片段(称为插入片段)的连接。这两种核酸片段可以通过此处所述的任何拓扑异构酶介导的方法连接。
本发明的接头可包含(1)一个或多个重组位点和/或(2)一个或多个拓扑异构酶识别位点或一个或多个拓扑异构酶。在特定实施方案中，接头的一个或多个重组位点中的至少一个与一个或多个拓扑异构酶识别位点或一个或多个拓扑异构酶中的至少一个相距0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个核苷酸之内。在特定实施方案中，本发明的接头所含的重组位点是attL、attB、attP或attL重组位点。在其它特定实施方案中，拓扑异构酶识别位点是IB型拓扑异构酶、IA型拓扑异构酶或II型拓扑异构酶的识别位点，或者拓扑异构酶是IB型拓扑异构酶、IA型拓扑异构酶或II型拓扑异构酶。另外，在本发明的接头中，拓扑异构酶识别位点或拓扑异构酶与重组位点的相对位置可以使得重组后，特定重组位点与产物分子结合。例如，拓扑异构酶识别位点可位于接头中attL位点的任一末端，使得当该接头与核酸分子附着并发生重组后，在接头将要附着的核酸分子上产生attB或attP位点。因此，接头可含有拓扑异构酶识别位点和/或拓扑异构酶，其相对于重组位点的位置使得与核酸分子连接并重组后，产物核酸分子上有重组位点的多种变化。这些重组位点的例子包括attL、attB、attP和attR重组位点。
本发明还提供利用含有相同或不同特异性的重组位点的接头连接多种核酸片段的方法，以及含有具有相同或不同特异性的重组位点的接头，和含有这些接头的试剂盒。例如，三种不同的PCR产物，被称为片段A、B和C，可以与接头连接，使得attL1和attL3位点位于片段A的末端，attR3和attR4位点位于片段B的末端，attL4和attL2位点位于片段C的末端。因此，与在末端处或附近含有attR1和attR2重组位点的线性化载体重组后，所有三种PCR产物彼此连接，并插入载体中，产生一种环化核酸分子。上述多种变化是可能的，并且包括于本发明的范围内。
本发明还包括几组两种或多种(例如2、3、4、5、6、7、8、9种等)接头，它们含有(1)一种或多种具有相同或不同特异性的重组位点，和/或(2)一种或多种拓扑异构酶或拓扑异构酶识别位点，以及利用这几组接头生产含有一个或多个重组位点的核酸分子的方法，包含这些接头组或这些组的个别成员的组合物，用这些组的一种或多种接头改造的核酸分子，和使用这些核酸分子的方法。
在拓扑异构酶介导的装配后，装配的核酸分子可以与含有一个或多个(例如1、2、3、4个等)适当重组位点的另一种核酸片段重组。图35所示的重组位点是attL1和attR1位点，但是也可以使用任何合适的重组位点(例如lox位点、attR位点、attL位点、attB位点、attP位点等)。其它合适的重组位点在本文其它部分描述。
本发明包括利用拓扑异构酶识别位点和重组位点彼此重组生产核酸分子的方法。本发明也包括通过本发明的方法制备并在本发明的方法中使用的核酸分子，以及使用通过此处所述的方法生产的核酸分子的方法。
本发明还包括利用多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10个等)重组位点和拓扑异构酶识别位点生产核酸分子的方法，以及用这些方法制备的并在这些方法中使用的核酸分子。此外，这些重组位点也可能具有多种(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10种等)特异性。另外，可以设计拓扑异构酶识别位点，以生产可使这些末端与不同核酸片段连接的末端。例如，可以设计这些末端，用来在拓扑异构酶切割后产生不同的“粘端”。
上述方法的另一个实例在图36中显示。图36显示一种方法，其中利用包括拓扑异构酶介导的核酸片段末端链共价连接的方法连接两种核酸片段。产生的核酸分子然后进行重组，导致(1)拓扑异构酶装配的核酸分子与含有复制起点的核酸片段连接，和(2)负选择性标记(例如ccdB基因)被替换为一种启动子。重组的核酸分子然后与一种核酸片段连接，后者在两端用拓扑异构酶改造，并且含有一种正选择性标记。最后一步产生环化的核酸分子。
图36显示的环化核酸末端产生可以导入宿主细胞中，该细胞可以是原核(例如细菌)或真核(例如酵母、植物、动物(包括哺乳动物，如人))细胞，如本文其它部分所述。此外，也能够利用正选择和负选择筛选含有这种末端产物的细胞。因此，例如，不选择已获得一种核酸分子的细胞，该分子中负选择性标记不被启动子替换。本发明还包括类似于图35和36所示的方法和组合物，其中多个步骤和成分不同。可能不同的步骤与成分的例子在本文其它部分描述。本发明还包括使用通过上述方法生产的核酸分子的方法。
本领域技术人员应当理解，如图35和36所示方法中使用的核酸片段能含有多种不同的元件。例如，能用一种正选择标记替换图36所示的启动子。此外，图35所示的插入片段也可含有具有多种功能性的核酸。特别是，当插入片段含有转录区域时，转录物可能是在未翻译时行使功能的mRNA或RNA。在未翻译时行使功能的RNA的例子包括转移RNA(例如抑制tRNA)、反义RNA、核糖体RNA和核酶。另外，利用本发明的方法连接和/或重组的一种以上的核酸片段可含有一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7种等)开放阅读框的全部或一部分。在这些情况中，核酸片段可以彼此连接，使得转录和翻译产生一种或多种融合蛋白。能在本发明的方法中使用的其它核酸元件在本文其它部分描述。
利用本发明的方法生产一种核酸分子，如图35所示方法的终产物，之后，该核酸分子任选地可以与一种或多种(例如1、2、3、4种等)其它核酸分子连接，或者可通过末端彼此连接环化。此外，当利用本发明的方法使三种或多种核酸分子彼此连接时，不同中间分子或终产物的末端可以彼此连接，从而环化这些分子。
本发明还提供用于同源重组和生产转基因动物的组合物和方法。通过外源DNA构建体与同源染色体序列之间的同源重组进行的基因打靶可在基因组中的预定位点进行精确修饰。例如，已经在小鼠胚胎干(ES)细胞中建立了基因打靶，并且已经在大量鼠基因中实现了修饰(参见，例如Brandon等人，Curr.Biol.5：625-634，758-765,873-881(1995))。基因打靶也能在体细胞中进行(参见，例如Itzhaki等人，Nat.Genet.15：258-265(1997))。然后能用本领域周知的方法操作通过同源重组用基因打靶修饰的细胞，以建立转基因动物。
能用于同源重组用途的本发明的组合物的一个例子是图37所示的终产物核酸分子。图37进一步显示了制备这些组合物的方法的一个例子。特别是，图37显示了拓扑异构酶改造的核酸片段与一种非拓扑异构酶改造的核酸片段的连接。在这种情况中，核酸终产物的设计者试图整合到染色体内的核酸片段——在此称为插入片段，其侧翼为在两个重组位点之间含有(1)一个正选择性标记和(2)一个负选择性标记的区域。然后可利用重组将两个负选择性标记替换为与终产物整合到的染色体区同源的核酸(在图37中标记为“HR1”和“HR2”)。
在本发明的实施中使用的同源区随核酸分子将要整合到的细胞染色体而不同。在许多情况中，选择有利于向特定生物细胞内整合的同源区。这种生物可以是单细胞生物(例如酵母、原生动物等)或多细胞生物(例如植物、动物等)。
本发明因此提供用于进行同源重组的核酸分子和组合物，和通过涉及这些分子和组合物的同源重组产生的细胞。本发明的方法能用于连接多种核酸片段。例如，图38显示了用拓扑异构酶连接4种核酸片段，产生一种在末端附近含有重组位点(标记为“L1”和“L2”)的线性核酸分子的示意图。第一步，利用拓扑异构酶将拓扑异构酶改造的含有attL1重组位点和attL2重组位点的核酸片段与其它两种核酸片段连接。在这种特殊情况中，彼此连接的末端的每条链与一种拓扑异构酶分子共价连接。因此，在共价连接介导的核酸链的连接后，连接点处不含切口。第二步，在允许在attL与attR重组位点之间进行重组的条件下，在LR CLONASETM的存在下，拓扑异构酶装配的核酸片段接触含有复制起点(标记为“ori”)、正选择性标记(标记为“PM”)、attR1重组位点和attR2重组位点的另一种核酸片段。在该方法中，例如，TOPO改造的载体与一种或多种核酸片段(例如一种或多种PCR产物)在室温(例如约20-25℃)下温育大约5-30(优选地约10)分钟；然后在大约80℃下温育大约20分钟热处理该反应液，然后按照使用说明书(Invitrogen Corporation)在标准LR反应中使用该反应混合液，不同之处在于LR反应的温育时间延长到约3个小时。重组导致环状核酸分子的形成，其含有与起点和选择性标记以attB1和attB2重组位点隔开的不同起始核酸片段。本领域技术人员应当知道，能够用任何合适的重组位点代替图中所示的att重组位点。本发明因此也提供包含这些核酸的组合物，用于生产这些核酸的组合物，和这些核酸和组合物在本文其它部分描述的本发明的重组和拓扑异构酶介导的连接方法中的用途。
本发明还提供适于进行克隆反应的核酸分子，其中利用与第二种核酸分子具有一个或多个同源区的第一种核酸分子向第一种核酸分子内插入来自第二种核酸分子的核酸。本发明还提供用于进行这些克隆反应的组合物和方法。
上述方法的一个例子是RecE/T克隆，它在PCT公开文本WO01/04288中描述，其完整公开内容在此引用作为参考。一般而言，在RecE/T克隆中，将一种线性第一种核酸分子(例如一种载体)导入一种细胞中，其含有(1)与细胞中所含核酸分子(例如质粒、细菌人工染色体、天然染色体等)(在此称为“第二种核酸分子”)的两种分开的邻近区域具有同源性的末端区域(例如长度为约20-约30、约20-约40、约20-约50、约30-约40、约40-约50、约40-约60、约40-约80、约50-约90个核苷酸等)，(2)选择性标记，和(3)复制起点。线性第一种核酸分子通常只在环化后复制。此外，第一种核酸分子一般在与第二种核酸分子重组并获得插入同源区之间的来自第二种核酸分子的核酸时才环化。在这些实施方案中，第一种核酸分子中的同源区一般与第二种核酸分子反向。发生重组的细胞是表达一种重组酶如RecE/T或RedAlpha/Beta的细胞。因此，本发明部分提供进行RecE/T克隆的方法，通过这些方法制备的核酸分子，包含这些核酸分子的组合物，和使用这些核酸分子和组合物的方法。
可以利用RecE/T方法的变型生产大量不同的终产物。例如，当同源区以不同方式排列时，第一种核酸分子能设计为(1)插入第二种核酸分子内，或(2)删除来自第二种核酸分子的核酸。一般而言，当希望向第二种核酸分子内插入第二种核酸分子时，第一种核酸分子的同源区将与第二种核酸分子的同源区同向。此外，当希望删除来自第二种核酸分子的核酸时，第一种核酸分子的同源区通常与第二种核酸分子的同源区反向。同样，当希望向第二种核酸分子内插入第一种核酸分子时，第一种核酸分子一般不含复制起点。本发明提供进行上述过程的方法。本发明也提供用于上述方法的核酸分子和组合物。
本发明也能利用拓扑异构酶和重组位点一步连接两种核酸片段，产生一种环状核酸分子。图39显示了该实施方案的一个实例，其中核酸片段之一含有一个attL1重组位点(标记为“L1”)、一个启动子(标记为“P”)和与一端共价连接的拓扑异构酶分子。其它核酸片段含有一个attR1重组位点(标记为“R1”)、一个开放阅读框(标记为“ORF”)、一个复制起点(标记为“ORI”)、一个正选择性标记(标记为“PM”)和与一端共价连接的拓扑异构酶分子。因此，当在允许在attL与attR重组位点之间重组和拓扑异构酶介导的核酸链连接的条件下，在LRCLONASETM存在下，这两种核酸片段彼此接触时，形成一种具有所述结构的环状分子。在一些这样的方法中，例如，TOPO改造的载体与一种或多种核酸片段(例如一种或多种PCR产物)在室温(例如约20-25℃)下温育大约5-30(优选地约10)分钟；然后在大约80℃下温育大约20分钟热处理该反应液，然后按照使用说明书(InvitrogenCorporation)在标准LR反应中使用该反应混合液，不同之处在于LR反应的温育时间延长到约3个小时。本领域技术人员应当知道，能用任何合适的重组位点代替图中所示的att重组位点。
本发明也能利用拓扑异构酶介导的方法连接两种核酸片段，产生一种环状核酸分子。图40说明了本发明该方面的一个实施方案的示意图。如图40所示，该环状分子在attL1与attL2重组位点(标记为“L1”和“L2”)之间含有一个开放阅读框(标记为“ORF”)。拓扑异构酶装配的产物然后与含有attR1和attR2重组位点的另一种环状分子重组，产生在attB1与attB2重组位点之间含有该开放阅读框的第三种环状核酸分子。此外，该开放阅读框也可与一种启动子有效连接。因此，利用该方法生产的终核酸分子是一种表达构建体。本领域技术人员应当知道，能用任何合适的重组位点代替图中所示的att重组位点。
如此处公开的，第一种核酸分子可能是一群核苷酸序列之一，例如cDNA文库、核苷酸序列组合文库或多样化核苷酸序列群体。因此，本发明的方法的一个特别有用的实施方案是生产编码嵌合多肽的重组多核苷酸，该嵌合多肽用于进行高通量双杂交测定，鉴定在多肽群体之间发生的蛋白质-蛋白质相互作用(参见美国专利号6,057,101和美国专利号6,083,693，均在此引用作为参考)。在这种方法中，检测了编码多肽的两个核苷酸序列群体，每个群体具有从少量相关但不同的核苷酸序列到可达上万个这种序列的复杂性。通过进行本发明的方法，例如，利用PCR引物对扩增群体中的每个核苷酸序列，其中该PCR引物对的至少一条引物包含(a)至少一个拓扑异构酶识别位点或其互补体，或(b)至少一个重组位点，能产生编码一群嵌合诱饵多肽和一群嵌合猎物多肽的共价连接的重组多核苷酸，其产生方法是：扩增的核苷酸序列群体，均包含(a)至少一个拓扑异构酶识别位点，接触至少一种拓扑异构酶和一种核苷酸序列，后者含有至少一个拓扑异构酶识别位点并编码一个转录激活域或DNA结合域，或者(b)至少一个重组位点，接触至少一种拓扑异构酶和一种核苷酸序列，后者含有至少一个重组位点并编码一个转录激活域或DNA结合域。
在实施本发明的方法中，第一种核酸分子也能编码一种核糖核酸(RNA)分子，例如，它能作为核酸探针、反义核苷酸序列、核酶或三股螺旋核苷酸序列，或者能在体外翻译反应中使用，第二种核酸分子也能编码一种可用于表达来自第一种核苷酸序列的RNA的调节元件(见实施例2A)。例如，当希望生产大量RNA时，用于进行本发明的方法的第二种核酸分子成分能包含一种RNA聚合酶启动子，如T7、T3或SP6 RNA聚合酶启动子。当RNA分子在细胞中表达时，例如，在哺乳动物细胞中表达一种反义分子时，第二种(或其它)核酸分子能够包含一种在哺乳动物细胞中有活性的启动子，特别是一种组织特异性启动子，它只在靶细胞中有活性。此外，当RNA分子要翻译时，例如，在偶联的体外转录/翻译反应中，第一种核苷酸序列或第二种(或其它)核苷酸序列能含有合适的翻译调节元件(见实施例2B)。
本发明的方法也能用来生产可使基因体内沉默的构建体。沉默基因的一种方法包括产生双链RNA，称为RNA干涉(RNAi)(参见，例如Mette等人，EMBO J.，19：5194-5201(2000))。认为起作用的RNAi机制，在Fjose等人，Biotechnol.Annu.Rev.7：31-57(2001)中综述，似乎是基于双链RNA诱导特定RNA分子降解的能力。据报道该机制包括双链RNA转化为短RNA，后者将核糖核酸酶导向同源RNA靶标(例如mRNA靶标)。本发明的方法能够以多种方式生产分子如RNAi。因此，本发明的核酸分子的表达产物能够用来沉默基因表达。
用来生产RNAi的核酸分子的一个实例是这样一种分子，其中核酸片段与一个或多个启动子连接，使得对应于两条链的RNA产生为两种不同的转录物或者作为同一转录物的部分。例如，能够用本发明的方法制备一种核酸分子，其中两个拷贝的开放阅读框通过间插核酸片段与两个以不同方向引导转录的启动子连接。因此，该启动子之一引导有义链mRNA的转录，另一种启动子引导反义mRNA的转录。能用来生产RNAi的核酸分子的另一个例子是，其中开放阅读框每一末端的侧翼为引导开放阅读框以相反方向转录的启动子。第三个例子是，能由编码在一端含有“折返”区(例如，长度为6、7、8、9、10个核苷酸等的区域)的RNA的核酸分子产生双链RNA。因此，这种类型的RNA转录物将在一端处或附近形成发夹折叠。在适当条件下在一种依赖RNA的RNA聚合酶存在下温育这种RNA分子时，能用发夹形成的双链区引发第二链合成，形成双链RNA分子。
用来生产RNAi的核酸片段，如上述核酸分子，不需要对应于全长基因或开放阅读框。例如，当核酸片段对应于ORF的全部或一部分或编码不对应于ORF的全部或一部分的RNA分子时，该片段可能只对应于ORF的一部分(例如ORF的5’或3’端处的约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约40、约50、约60个核苷酸等)。
因此，在特定实施方案中，本发明提供制备包含至少三个片段的核酸分子的方法。在某些实施方案中，这些片段中的至少两个共有至少一个序列相同区(例如，长度至少约15、至少约16、至少约17、至少约18、至少约19、至少约20、至少约21、至少约22、至少约23、至少约24、至少约25、至少约26、至少约27、至少约28、至少约29、至少约30、至少约40、至少约50、至少约60、至少约70、至少约80、至少约90、至少约100个核苷酸等的区域)。在其它实施方案中，一个核酸片段的侧翼为能使分子内部以相反方向转录(例如产生有义和反义转录物)的区域。本发明还提供通过本发明的方法制备的核酸分子，和这些分子抑制基因表达或促进特定RNA分子降解的用途。
本发明也提供制备用来表达反义RNA(例如反义mRNA)的核酸分子的方法。可以使用与上述能用于RNAi的核酸分子的生产方法相类似的方法；然而，在通过可用来生产反义RNA的本发明的方法制备的分子中，一般只有反义链转录。
在有关实施方案中，引导有义RNA或反义RNA转录的启动子可以是组成型(例如CMV启动子、SV40启动子等)、诱导型(例如金属硫蛋白启动子等)或抑制型的。因此，例如，能够用两种不同的诱导型启动子引导有义RNA和反义RNA的转录。在这种情况下，能够利用启动子激活诱导有义RNA、反义RNA或有义RNA和反义RNA两者的产生。此外，例如利用渐进诱导和/或启动子去抑制，能够联系产生的有义RNA和/或反义RNA的量。
包括使用化合物如RNAi和反义RNA的基因沉默方法，例如，特别可用于鉴定基因功能。更具体而言，基因沉默方法能用来减少或阻止一种或多种基因在细胞或生物中的表达。然后能用与基因功能的选择性抑制有关的表型表现将作用归因于“沉默的”基因。一个例子是，Chuang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)97：4985-4990(2000)证实，RNAi的体内产生能够改变Arabidopsis thaliana中的基因活性。因此，本发明提供调节细胞和组织中核酸分子表达(包括RNAi和反义RNA的表达)的方法。本发明还提供制备核酸分子的方法，该分子能用来生产对应于一种DNA分子的一条或两条链的RNA。
本发明因此提供调节核酸分子体内(例如在细胞和组织中)和/或体外表达(包括有义RNA和/或反义RNA的表达)的方法。本发明还提供制备核酸分子的方法，能用来生产对应于一种核酸分子(例如一种DNA分子)的一条或两条链的RNA。本发明也提供用于进行上述方法的组合物和通过上述方法生产的核酸分子(例如RNA和DNA分子)。
本发明也涉及用于与核酶有关的基因沉默的化合物和方法。特别是，本发明提供反义RNA/核酶融合体，其包含：1)对应于一种靶基因的反义RNA，和2)可切割RNA的一种或多种核酶(例如锤头状核酶、发夹状核酶、delta核酶、四膜虫L-21核酶等)。本发明还提供表达这些融合体的载体，生产这些载体的方法，和用这些载体抑制基因表达的方法。
例如，能够利用与核酶融合的反义分子的表达切割细胞中的特异RNA分子，因为转录物的反义RNA部分能够设计为与特定mRNA分子杂交。此外，转录物的核酶部分也能设计为可切割与之杂交的RNA分子。例如，该核酶可能是可切割双链RNA的核酶(例如四膜虫L-21核酶)。
本发明的一种方法尤其可用于生产一种表达型双链重组核酸分子，该分子能以位点特异的方式插入靶DNA序列中。靶DNA序列可以是任何DNA序列，特别是基因组DNA序列，优选的是部分或全部核苷酸序列已知的基因。该方法能用第一种核酸分子进行，该分子含有第一端和第二端，编码一种多肽，例如一种选择性标记，其中第一种核酸分子在每一末端的3’端处包含至少一个拓扑异构酶识别位点和/或至少一个重组位点或其切割产物，任选地在每一末端的5’端处含有一个羟基，其中优选地，5’端包含5’突出序列，它们彼此不同；并根据本发明的方法共价连接第一种核酸分子与第一种和第二种PCR扩增产物。第一种和第二种扩增产物由构建体插入位点上游和下游的序列产生，每种扩增产物含有至少一个拓扑异构酶识别位点和任选地至少一个重组位点，优选地，一个5’突出序列，它是在与位点特异性拓扑异构酶接触后产生的。优选地，第一种或第二种扩增产物含有不同的5’突出序列，使得每一个都能与第一种核酸分子的预定末端连接。该方法类似地能用一种双链扩增产物进行，它在一个或两个末端的5’端包含至少一个拓扑异构酶识别位点和任选地至少一个重组位点或其切割产物，其中，在用拓扑异构酶切割后，携带拓扑异构酶的分子能在含有拓扑异构酶的一个或两个末端包含3’突出端。另外，该方法也能用一种双链扩增产物进行，它在一个或两个末端的5’端和3’端处或附近包含拓扑异构酶识别位点和任选地重组位点或其切割产物，其中，在用拓扑异构酶切割后，携带拓扑异构酶的核酸分子优选地在含有拓扑异构酶的一个或两个末端含有5’或3’突出端。一旦核酸分子通过上述方法连接，产生的分子即可用于重组反应，如本文其它部分所述。
第一种和第二种扩增产物可以用两组PCR引物对产生。可以选择两组PCR引物对，使得在适当聚合酶如Taq聚合酶和包含待扩增序列的模板存在下，该引物扩增位于选择性标记插入位点上游并相邻和下游并相邻的靶DNA序列的一部分。另外，也可以设计几组PCR引物对，使得扩增产物在将与选择性标记共价连接的末端处含有拓扑异构酶识别位点，并在被位点特异性拓扑异构酶切割后，含有5’突出序列。第一种PCR引物对包含：1)第一条引物，其以5’-3’方向包含与扩增产物将共价连接的选择性标记末端的5’突出序列互补的核苷酸序列，与拓扑异构酶识别位点互补的核苷酸序列，和与插入位点上游靶DNA序列的3’序列互补的核苷酸序列；和2)第二条引物，其包含与第一条引物互补的3’序列上游、即插入位点下游的靶基因组DNA的核苷酸序列。第二种引物对包含：1)第一条引物，其从5’-3’包含与将要共价连接的选择性标记末端5’突出序列互补的核苷酸序列，与拓扑异构酶识别位点互补的核苷酸序列，和靶DNA序列的5’序列的核苷酸序列，其中靶基因组DNA的5’序列位于与第一种PCR引物对的第一条引物互补的靶DNA序列的3’序列下游；和2)第二种引物对的第二条引物，其包含与靶DNA序列的3’序列互补的核苷酸序列，该靶DNA序列位于第一条引物所含靶基因组DNA的5’序列的下游。技术人员应当知道，与靶基因组DNA互补的引物序列根据靶DNA序列选择。这些引物对还可包含一个或多个重组位点。
在接触包含选择性标记的核酸分子、第一种和第二种扩增产物和一种拓扑异构酶(如果该分子不含拓扑异构酶的话)后，根据本发明的方法生产一种两条链共价连接的双链重组核酸分子。希望时，能够利用靶基因组DNA的上游和下游序列特异的PCR引物，进一步扩增产生的双链重组核酸分子，从而确保只扩增功能性构建体。产生的双链重组核酸分子可用于进行基因组的同源重组，例如，敲除细胞中的基因功能，或使含有产生的重组核酸分子的细胞具有新表型。该方法还能用来生产在基因组中稳定保留产生的双链重组核酸分子的转基因非人类生物。
本发明的一种方法也可用于共价连接一种连接体或接头序列与目的核酸分子的一个或两个末端，包括一群核酸分子的末端。例如，在希望将接头置于第一种核酸分子的两个末端时，该方法能通过接触下列成分进行：一种拓扑异构酶，与第一种核酸分子，其在3’或5’端之一或这两端含有拓扑异构酶识别位点或其切割产物，在两个5’端能包含羟基和一个或多个重组位点；和第二种核酸分子和至少一种第三种双链核苷酸序列，它们均能在适当的3’或5’端包含拓扑异构酶识别位点或其切割产物，并且希望时，也能在同一端包含5’羟基和一个或多个重组位点。合适的末端是至少一条链中的接头将要与第一种核苷酸序列共价连接的末端。在一个实施方案中，一种或两种接头序列含有一种突出序列，该突出序列与将要共价连接接头的第一种核酸分子末端的5’端的序列互补，从而有利于核苷酸序列最初以正确(预定)方向结合(参见，例如图2和实施例1B)。在进行这种方法中，包含第二种和至少第三种核苷酸序列的接头序列可以相同或不同。
图14显示一种制备核酸分子的方法的一个实例，该分子含有与序列一个末端的5’端结合的拓扑异构酶(例如IA型拓扑异构酶)，其中同一末端还包含一个3’突出端(见图14中的(4))。在步骤A中，将用拓扑异构酶修饰的核苷酸序列用可产生“粘”端的限制性内切酶消化。在步骤B中，限制酶切的核苷酸序列与含有附着于拓扑异构酶的5’端的线性单链核苷酸序列和一种连接酶(例如DNA连接酶，如T4DNA连接酶)接触。该线性单链核苷酸序列在3’端也含有一个区域，它与限制性内切酶产生的“粘”端有充分的序列互补性，使这两种分子能够杂交。因此，在步骤B中，两种核苷酸序列彼此连接。在步骤C中，第二步的产物与第三种核苷酸序列和一种连接酶接触，第三种核苷酸序列与步骤B中产生的线性单链核酸分子的一部分有序列互补性。(4)显示的步骤C的产物是含有与一个末端的5’端附着的拓扑异构酶和同一末端上的3’突出端的一种核酸分子。应当理解，所述方法的多种变化属于本发明的范围。例如，能够进行类似的方法，以制备包含与一个末端的3’端附着的拓扑异构酶或在拓扑异构酶附着的末端含有5’突出端或是平端的核酸分子。在另一个实施例中，在图14中标记为3号的核苷酸序列能够用下列方法产生：能用限制性内切酶消化一种核酸分子，产生一种含有单链5’突出端的核酸分子，其包含一个IA型拓扑异构酶识别位点。含有单链突出端的核酸分子然后能与IA型拓扑异构酶接触，产生一种携带IA型拓扑异构酶的核酸分子。
图15显示本发明的两个实施方案，其中单链或双链DNA与单链RNA共价连接。当单链DNA与单链RNA连接时，核糖核苷酸序列的3’端与脱氧核糖核苷酸序列的5’端共价连接。当双链DNA与单链RNA连接时，核糖核苷酸序列的3’端与脱氧核糖核苷酸序列的3’突出端有充分的序列互补性，使这两种分子可以杂交。如上所述，核糖核苷酸序列的3’端也与脱氧核糖核苷酸序列的5’端共价连接。应当知道，上述多种变化在本发明的范围内。例如，RNA分子可能是双链的。在另一个实施例中，所有核苷酸序列都可以是脱氧核糖核苷酸序列，和/或能包含一个或多个重组位点。
本发明提供含有或者能使之含有第一端和第二端的双链重组核酸分子，每个末端包含一个5’端和一个3’端，其中该载体在第一端、第二端或第一端和第二端的5’端处或附近包含一个位点特异性IA型拓扑异构酶识别位点。该双链重组核酸分子还能在一个末端的3’端处或附近包含一个IB型拓扑异构酶识别位点，而不包含IA型拓扑异构酶识别位点。该双链重组核酸分子可以是一种载体。
本发明还提供一种携带拓扑异构酶的双链重组核酸分子，其含有第一末端和第二末端，每个末端具有一个5’端和一个3’端，其中位点特异性IA型拓扑异构酶在第一末端、第二末端或第一个或第二末端的5’端结合。例如，携带拓扑异构酶的双链重组核酸分子能包含在第一和第二末端的5’端结合的IA型拓扑异构酶。携带拓扑异构酶的核酸双链重组核酸分子能包含在一个末端的3’端结合的IB型拓扑异构酶，该末端不结合IA型拓扑异构酶。携带拓扑异构酶的双链重组核酸分子可以是一种载体。
试剂盒
本发明还提供试剂盒，其中含有可用于方便地实施本发明的方法的成分。在一个实施方案中，本发明的试剂盒包含第一种核酸分子，它编码一种多肽，特别是一种选择性标记，并在每一末端包含一个拓扑异构酶识别位点。优选地，第一种核酸序列包含一种拓扑异构酶激活的核苷酸序列。更优选地，携带拓扑异构酶的第一种核苷酸序列在每一末端包含一个5’突出序列，最优选地，5’突出序列各不相同。优选地，每一个5’末端包含一个5’羟基。
另外，试剂盒还可包含至少一种包含一种调节元件的核苷酸序列(或其互补序列)，该元件可为上游或下游调节元件，或其它元件，在一个或两个末端包含一个拓扑异构酶识别位点。优选地，试剂盒包含多种核酸分子，每种分子包含不同的调节元件或其它元件，例如，编码一种标记或其它可检测分子或细胞区室化域的序列。不同元件可以是一种特定调节元件的不同类型，例如组成型启动子、诱导型启动子和组织特异性启动子，或者可能是不同类型的元件，包括，如转录和翻译调节元件、表位标记等。这些核酸分子可以是拓扑异构酶激活的，可包含有助于以预定方位共价连接该元件的5’突出端和3’突出端，特别是，使一个多肽如选择性标记可在体外或在一种或多种细胞型中表达。
试剂盒还可包含引物，包括第一种和第二种引物，使得能够选择包含第一种和第二种引物的引物对，并用于扩增希望的一条或两条链共价连接的双链重组核酸分子，它用试剂盒的成分产生。例如引物可包括第一种引物，它与一般位于产生的双链重组核酸分子的5’端的元件互补，例如包含启动子元件的核酸分子的一部分，和第二种引物，它与一般位于产生的双链重组核酸分子的3’端的元件互补，例如包含转录终止位点或编码一种表位标记的核酸分子的一部分。根据选自用于产生两条链共价连接的双链重组核酸分子的试剂盒的元件，能选择合适的第一种和第二种引物，用来扩增全长功能构建体。
在另一个实施方案中，本发明的试剂盒包含多种不同元件，每种元件可包含一个或多个重组位点和/或在一个或两个末端是拓扑异构酶激活的，每种元件可包含一个5’突出序列或一个3’突出序列或其组合。5’或3’突出序列可能是特定元件特有的，或者是多种相关元件所共有的，例如，多种不同的启动子元件共有的。更优选地，这些元件的5’突出序列被设计为一种或多种元件能够有效共价连接，以提供有用的功能，例如，包含Kozak序列的元件和包含翻译起始位点的元件能具有互补的5’突出端，使得这些元件能够根据本发明的方法有效共价连接。
试剂盒中的多种元件可包含任何元件，包括转录或翻译调节元件；细菌、昆虫、酵母、哺乳动物宿主细胞中核苷酸序列复制所需的元件；包含位点特异性核酸结合蛋白(如限制性内切核酸酶或重组酶)的识别序列的元件；编码可表达产物(如表位标记或抗药性基因)的元件；等等。因此，本发明的试剂盒提供不同元件的方便来源，例如，能够根据通过本发明的方法产生的构建体将要导入或表达的特定细胞选择这些元件。试剂盒还可包含PCR引物，包括第一种或第二种引物，它们能如上所述结合，以扩增一种一条或两条链共价连接的双链重组核酸分子，它是用试剂盒的元件产生的。优选地，试剂盒还包含一定数量的位点特异性拓扑异构酶，可用于在至少一条链中共价连接含有拓扑异构酶识别位点的第一种核酸分子与第二种(或其它)核酸分子，任选地可以是拓扑异构酶激活的核酸分子或含有拓扑异构酶识别位点的核苷酸序列。
在另一个实施方案中，本发明的试剂盒包含：第一种核酸分子，它编码一种选择性标记，在每一末端包含一个拓扑异构酶识别位点和/或一个重组位点；第一种和第二种PCR引物对，能根据本发明的方法产生在一条或两条链中以预定方向共价连接第一种核酸分子的第一种和第二种扩增产物。如此产生的构建体可通过位点特异性同源重组导入细胞内，并掺入细胞基因组内，在此可稳定保存，并能在细胞中表达一种异源多肽，或者能敲除一种靶基因功能。例如，将要敲除的靶基因可以是至少一部分序列已知或者易于测定并且希望破坏其功能的任何一种基因，例如，癌基因、与凋亡有关的基因、编码丝氨酸/苏氨酸或酪氨酸激酶的基因或其它任何基因。
本发明的试剂盒中，可用于生产两条链共价连接的双链重组核酸分子的第一种PCR引物对包含第一种引物，它从5’到3’方向包含：与将要共价连接的核酸分子的5’突出序列(例如，编码选择性标记的核酸分子的一个末端)互补的核苷酸序列，与拓扑异构酶识别位点和/或重组位点互补的核苷酸序列，与靶DNA序列的3’序列互补的核苷酸序列。第一种PCR引物对还包含第二种引物，其包含位于与第一种引物互补的3’序列上游的靶DNA序列的核苷酸序列。
试剂盒中用于生产两条链共价连接的双链重组核酸分子的第二种PCR引物对包括第一种引物，它从5’到3’方向包含：与将要共价连接的核酸分子的5’突出序列互补的核苷酸序列，与拓扑异构酶识别位点和/或重组位点互补的核苷酸序列，和靶DNA序列的5’序列的核苷酸序列，其中靶DNA序列的5’序列位于与第一种引物对的第一种引物互补的靶DNA序列的3’序列下游。第二种PCR引物对还包含第二种引物，该引物包含的核苷酸序列与位于第一种引物所含靶DNA序列的5’序列下游的靶基因的3’序列于互补。
在另一个实施方案中，用于生产两条链共价连接的双链重组核酸分子的本发明的试剂盒包含：第一种核酸分子，它编码一种转录激活域，在3’末端包含一个拓扑异构酶识别位点或其切割产物；和第二种核酸分子，它编码一种DNA结合域，在3’末端包含一个拓扑异构酶识别位点和/或一个重组位点，或其切割产物。经过位点特异性拓扑异构酶的切割，第一种或第二种核酸分子可含有一个5’突出端，或者这两种序列都可含有5’突出端，它们彼此相同或不同。在核酸分子含有5’突出端时，该突出端通常互补于将要根据本发明的方法与第一种或第二种核酸分子共价连接的核酸分子。该试剂盒还可包括一种或一对连接体、接头等，它们在一个或两个3’端可包含拓扑异构酶识别位点或其切割产物，任选地在同一端可包含一个羟基。选择这些连接体、接头等，使它们包含与上述和试剂盒部分所述两种核酸分子中的一种或另一种互补的5’突出端。
相似的，本发明的试剂盒可包含一种或一对连接体、接头等，它在一个或两个5’端包含一个拓扑异构酶识别位点和/或一个重组位点或其切割产物，任选地，在同一末端含有一个羟基。选择这类连接体，接头等，使之含有与上述和试剂盒部分所述的两种核酸分子中的一种或另一种互补的3’突出端。另外，该试剂盒也能包含一种或一对连接体、接头等，其在在一个或两个5’端和/或3’端包含一个拓扑异构酶识别位点或其切割产物，并且，任选地，在同一末端含有一个羟基。
通常选择连接体、接头等，使其包含与上述和试剂盒部分所述的两种核酸分子中的一种或另一种互补的5’和/或3’突出端。这类连接体、接头等可以连接于将与试剂盒所含第一种或第二种核酸分子中之一或另一共价连接的核酸分子的末端，从而有助于编码在双杂交测定中有用的诱饵和猎物多肽的嵌合聚核苷酸的构建。
本发明的试剂盒中的一种PCR引物对，它能用于生产一条链共价连接的双链重组核酸分子，可包括第一种引物，它以5’-3’方向包含：将要连接的核酸分子的5’突出序列的核苷酸序列(例如，编码选择性标记的核酸分子的末端)，一个拓扑异构酶识别位点(例如IA型或II型拓扑异构酶识别位点)和优选地一个重组位点，和与靶DNA序列的5’序列互补的核苷酸序列。该PCR引物对还包含第二种引物，该引物包含位于与第一种引物互补的5’序列下游的靶DNA序列的核苷酸序列。
在另一个实施方案中，本发明的试剂盒包含：第一种核酸分子，它编码一种转录激活域，并在5’端包含一个位点特异性拓扑异构酶识别位点(即IA型II型拓扑异构酶识别位点)和优选地一个重组位点，或其切割产物；和第二种核酸分子，它编码一种DNA结合域，在5’端包含一个位点特异性拓扑异构酶识别位点(即IA型或II拓扑异构酶识别位点)或其切割产物。经位点特异性拓扑异构酶切割，第一种或第二种核酸分子可含有一个3’突出端，或者这两种序列都含有3’突出端，它们彼此相同或不同。在核酸分子含有一个3’突出端时，该突出端通常与根据本发明的方法与第一种或第二种核酸分子连接的一种核酸分子互补。该试剂盒还可包含一种或一对连接体、接头等，它们在一个或两个5’端包含一个位点特异性拓扑异构酶识别位点(即IA型或II拓扑异构酶识别位点)和优选地一个重组位点，或其切割产物，并且可包含与该试剂盒的两种核酸分子之一或另一互补的5’突出端。
根据本发明的方法生产的，一条或两条链共价连接的双链重组核酸分子，可用于不同目的，包括例如：在细胞中表达一种多肽，诊断或治疗一种疾病等。因此，本发明提供一种药物，通过在一种或多种细胞中表达一种多肽或表达一种反义分子等，能用于治疗疾病。通过离体接触细胞，这种双链重组核酸分子能够提供给细胞，然后对患者施用该细胞，该方法也允许在施用前筛选和/或扩增含有这种双链重组核酸分子的细胞，或者能够直接供给患者。为了对活的对象施用，一条或两条链共价连接的双链重组核酸分子通常配制为一种适于对患者施用的组合物。因此，本发明提供含有根据本发明的方法生产的，一条或两条链共价连接的双链重组核酸分子的组合物。如此处公开的，这种核酸分子可作为治疗该病患者的药物。
用于施用的组合物通常用本领域众所周知的一种或多种药学可接受的载体配制，包括，例如：水溶液，如水或生理盐水，或其它溶剂或载体，如乙二醇、甘油，油，如橄榄油，或注射用有机酯。药学可接受的载体可包含生理学可接受的化合物，例如用来稳定或提高偶联物的吸收。这种生理学可接受的化合物包括，例如碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖，抗氧化剂，如抗坏血酸或谷胱甘肽，螯合剂，低分子量蛋白质，或其它稳定剂或赋形剂。本领域技术人员应当知道，药学可接受的载体，包括生理学可接受的化合物的选择，例如，取决于组合物的施用途径，例如可能是经口或肠胃外，如静脉内给药，注射、插管，或本领域公知的其它方法。本发明的组合物也能含有第二种试剂，如诊断试剂、营养物质、毒素或治疗剂，例如，癌症化疗剂。
一条链或两条链共价连接的双链重组核酸分子能够掺入包封材料中，如水包油乳剂、微乳剂、微团、混合微团、脂质体、微球体或其它聚合物基质中(见，例如，Gregoriadis，《脂质体技术》第1卷，(CRCPress，Boca Raton，FL 1984)；Fraley等人，Trends Biochem.Sci.6：77(1981)，均在此引用作为参考)。例如，由磷或其它脂类组成的脂质体是无毒的、生理学可接受的和可代谢的载体，它能相对简单地制备和施用。“Stealth”脂质体(参见，例如美国专利号5,882,679；5,395,619；5,225,212，均在此引用作为参考)是这种包封材料的一个例子，尤其可用于制备药用组合物，类似地能够使用其它“伪装”脂质体，这些脂质体延长了核酸分子在循环中保持的时间。例如，阳离子脂质体也能用特定受体或配体修饰(Morishita等人，J.Clin.Invest.，91：2580-2585(1993)，在此引用作为参考)。核酸分子也能通过与腺病毒-聚赖氨酸复合物复合导入细胞中(参见，例如，Michael等人，J.Biol.Chem.268：6866-6869(1993)，在此引用作为参考)。这些组合物尤其可用于在体外或体内，包括来自体内地向细胞内导入一种核酸分子，其中含有该核酸分子的细胞回输给患者(参见美国专利号5,399,346，在此引用作为参考)。根据本发明的方法生产的一种核酸分子也能利用biolistic法导入细胞中(参见，例如，Sykes和Johnson，同上文，1999)。
宿主细胞
本发明也涉及包含一种或多种本发明的核酸分子或载体，特别是此处详述的核酸分子和载体的宿主细胞。可以根据本发明该方面使用的代表性宿主细胞包括但不限于：细菌细胞、酵母细胞、植物细胞和动物细胞。优选的细菌宿主细胞包括：埃希氏菌属的种的细胞(特别是大肠杆菌细胞，最特别的是大肠杆菌DH10B、Stb12、DH5α、DB3、DB3.1(更优选的是大肠杆菌LIBRARY EFFICIENCYDB3.1TM感受态细胞；Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)、DB4和DB5株(见2000年3月2日提交的美国申请号09/518,118，其公开内容在此引用作为参考)、芽孢杆菌属的种的细胞(特别是枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和巨大芽孢杆菌(B.megaterium)细胞)、链霉菌属的种的细胞、欧文菌属(Erwinia)的种的细胞、克雷伯氏菌属的种的细胞、沙雷氏菌属的种的细胞。(特别是粘质沙雷氏菌(S.marcessans)细胞)、假单胞菌属的种的细胞(特别是铜绿假单胞菌细胞)，和沙门氏菌属的种的细胞(特别是鼠伤寒沙门菌(S.typhimurium)和伤寒沙门菌(S.typhi)细胞)。优选的动物宿主细胞包括：昆虫细胞(最特别的是黑尾果蝇(Drosophila melanogaster)细胞、草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)Sf9细胞和粉纹夜蛾(Trichoplusa)High-Five细胞)，线虫细胞(主要为C.elegans细胞)、鸟类细胞、两栖动物细胞(特别是Xenopus laevis细胞)、爬行动物细胞和哺乳动物细胞(最特别的是NIH3T3、CHO、COS、VERO、BHK和人类细胞)。优选的酵母宿主细胞包括酿酒酵母细胞和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞。这些和其它的宿主细胞可通过商业途径获得，例如购自Invitrogen Corporation(Carlsbad，Califormia)、美国模式培养物保藏中心(Manassas，Virginia)和农业研究培养物保藏中心(NRRL；Peoria，Illinois)。
为了产生包含一种或多种本发明的核酸分子和/或载体的宿主细胞，将本发明的核酸分子和/或载体导入此处所述宿主细胞的方法，本领域技术人员熟知。例如，利用众所周知的感染、转导、电穿孔、转染和转化技术，可将本发明的核酸分子和/或载体导入宿主细胞内。本发明的核酸分子和/或载体可以单独导入或与其它核酸分子和/或载体和/或蛋白质、多肽或RNAs一起导入。此外，本发明的核酸分子和/或载体也可作为一种沉淀，如磷酸钙沉淀，或与脂类的复合物导入宿主细胞内。也可利用电穿孔将本发明的核酸分子和/或载体导入宿主细胞内。同样，这类分子也可导入化学感受态细胞如大肠杆菌内。如果该载体是一种病毒，它可以在体外包装或导入一种包装细胞中，并且可用包装病毒转导细胞。因此，适用于将本发明的核酸分子和/或载体导入根据本发明该方面的细胞内的多种技术众所周知，对于本领域技术人员而言是常规技术。这类技术在下列文献中详细综述，例如：Sambrook，J.等人，《分子克隆：实验室手册》第二版，Cold SpringHarbor，NY：Cold Spring Harbor Laboratory Press，16.30-16.55(1989)，Watson，J.D.等人，《重组DNA》第二版，New York：W.H.Freeman and Co.pp.213-234(1992)，Winnacker，E.-L.，《从基因到克隆》，New York：VCH Publisher(1987)，它们是详述这些技术的实验室手册，在此引用其相关公开内容作为参考。
聚合酶
用于本发明的聚合酶包括但不限于聚合酶(DNA和RNA聚合酶)和逆转录酶。DNA聚合酶包括但不限于：嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)(Tth)DNA聚合酶、水生栖热菌(Thermus aquaticus)(Taq)DNA聚合酶、那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neopolitana)(Tne)DNA聚合酶、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)(Tma)DNA聚合酶、Thermococcus litoralis(Tli或VENTTM)DNA聚合酶、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)(Pfu)DNA聚合酶、DEEPVENTTMDNA聚合酶、沃氏火球菌(Pyrococcus woosii)(Pwo)DNA聚合酶、火球菌属的种的KOD2(KOD)DNA聚合酶、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus sterothermophilus)(Bst)DNA聚合酶、Bacillus caldophilus(Bca)DNA聚合酶、嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)(Sac)DNA聚合酶、嗜酸热原体(Thermoplasma acidophilum)(Tac)DNA聚合酶、黄栖热菌(Thermus flavus)(Tfl/Tub)DNA聚合酶、红栖热菌(Thermus ruber)(Tru)DNA聚合酶、布氏栖热菌(Thermusbrockianus)(DYNAZYMETM)DNA聚合酶、热自养甲烷杆菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)(Mth)DNA聚合酶、分枝杆菌DNA聚合酶(Mtb，Mlep)、大肠杆菌pol I DNA聚合酶、T5 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶，和通常的pol I型DNA聚合酶，及其突变体、变体和衍生物。RNA聚合酶如T3、T5、T7和SP6及其突变体、变体和衍生物也可以根据本发明使用。
在本发明中使用的核酸聚合酶可以是嗜温和嗜热的，优选地是嗜热的。优选的嗜温DNA聚合酶包括Pol I家族的DNA聚合酶(及其各自的Klenow片段)，它们都可分离自生物，如大肠杆菌、流感嗜血菌(H.influenzae)、耐放射异常球菌(D.radiodurans)、幽门螺杆菌(H.pylori)、橙色绿屈挠菌(C.aurantiacus)、普氏立克次体(R.prowazekii)、梅毒螺旋体(T.pallidum)、集胞蓝细胞菌(Synechocystis)的种、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、乳酸乳球菌(L.lactis)、肺炎链球菌(S.pneumoniae)、结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、麻风分枝杆菌(M.leprae)、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)、噬菌体L5、phi-C31、T7、T3、T5、SP01、SP02、来自酿酒酵母MIP-1的线粒体，和真核生物C.elegans和黑尾果蝇(Astatke，M.等人，1998，J.Mol.Biol.278，147-165)，自任何来源分离的pol III型DNA聚合酶，及其突变体、衍生物或变体，等等。可在本发明的方法和组合物中使用的优选的热稳定DNA聚合酶包括：Taq、Tne、Tma、Pfu、KOD、Tfl、Tth、Stoffel片段、VENTTM和DEEPVENTTM DNA聚合酶，及其突变体、变体和衍生物(美国专利号5,436,149；美国专利4,889,818；美国专利4,965,188；美国专利5,709,352；美国专利5,614,365；美国专利5,374,553；美国专利5,270,179；美国专利5,047,342；美国专利号5,512,462；WO 92/06188；WO 92/06200；WO 96/10640；WO 97/09451；Barnes，W.M.，Gene 112：29-35(1992)；Lawyer，F.C.等人，PCR Meth.Appl.2：275-287(1993)；Flaman，J.-M.等人，Nucl.Acids Res.22(15)：3259-3260(1994))。
用于本发明的逆转录酶包括具有逆转录酶活性的任何酶。这类酶包括但不限于：逆转录病毒逆转录酶、反转录转座子逆转录酶、乙型肝炎逆转录酶、花椰菜花叶病毒逆转录酶、细菌逆转录酶、Tth DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶(Saiki，R.K.等人，Science 239：487-491(1988)；美国专利号4,889,818和4,965,188)、Tne DNA聚合酶(WO96/10640和WO 97/09451)、Tma DNA聚合酶(美国专利号5,374,553)及其突变体、变体或衍生物(参见，例如WO 97/09451和WO98/47912)。用于本发明的优选酶包括那些RNase H活性降低、基本降低或消失的酶。“RNase H活性基本降低的”酶是指，相对于野生型或RNase H+酶，如莫洛尼鼠白血病病毒(M-MLV)、鸟髓母细胞过多症病毒(AMV)或劳斯肉瘤病毒(RSV)逆转录酶，该酶的RNaseH活性低于约20％，更优选地低于约15％、10％或5％，最优选地低于约2％。任何酶的RNase H活性可以用多种试验测定，如美国专利号5,244,797、Kotewicz，M.L.等人，Nucl.Acids Res.16：265(1988)和Gerard，G.F.等人，FOCUS 14(5)：91(1992)所述，其公开内容在此完整引用作为参考。用于本发明的特别优选的多肽包括但不限于：M-MLVH-逆转录酶、RSV H-逆转录酶、AMV H-逆转录酶、RAV(劳斯肉瘤病毒)H-逆转录酶、MAV(成髓细胞血症相关病毒)H-逆转录酶和HIV H-逆转录酶(参见美国专利号5,244,797和WO 98/47912)。然而，本领域技术人员应当理解，能够从核糖核酸分子产生DNA分子的任何酶(即具有逆转录酶活性)都可以在本发明的组合物、方法和试剂盒中同样地使用。
用于本发明的具有聚合酶活性的酶可从商业途径获得，例如，购自Invitrogen Corporation(Carlsbad，California)、Perkin-Elmer(Branchburg，New Jersey)、New England Biolabs(Beverly，Massachusetts)或Boehringer Mannheim Biochemicals(Indianapolis，Indiana)。用于本发明的具有逆转录酶活性的酶可从商业途径获得，例如购自InVitrogen Corporation(Carlsbad，California)、Pharmacia(Piscataway，New Jersey)、Sigma(Saint Louis，Missouri)或Boehringer Mannheim Biochemicals(Indianapolis，Indiana)。此外，也可以按照本领域技术人员周知的分离、纯化天然蛋白质的标准方法，从天然病毒或细菌来源中分离具有聚合酶活性的聚合酶或逆转录酶(参见，例如Houts，G.E.等人，J.Virol.29：517(1979))。另外，这些聚合酶/逆转录酶也可以通过本领域技术人员熟知的重组DNA技术制备(参见，例如Kotewicz，M.L.等人，Nucl.Acids Res.16：265(1988)；美国专利号5,244,797；WO 98/47912；Soltis，D.A.和Skalka，A.M.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：3372-3376(1988))。具有聚合酶活性和逆转录酶活性的酶的例子可包括本申请书所述的任何酶。
核酸合成、扩增和测序方法
本发明可以与包括核酸分子(如DNA(包括cDNA)和RNA分子)合成的任何方法联合应用。这些方法包括但不限于：核酸合成方法、核酸扩增方法和核酸测序方法。这些方法可以用来制备本发明中使用的分子(例如起始分子)或进一步操作本发明生产的分子或载体。
根据本发明该方面的核酸合成方法可以包括一个或多个步骤。例如，本发明提供一种合成核酸分子的方法，包括：(a)混合一种核酸模板(例如本发明的核酸分子或载体)与一种或多种引物和一种或多种具有聚合酶或逆转录酶活性的酶，形成混合物；和(b)在足以使第一种核酸分子与模板的全部或一部分互补的条件下，温育该混合物。根据本发明该方面，核酸模板可以是一种DNA分子，如cDNA分子或文库，或一种RNA分子，如mRNA分子。足以引起合成的条件，如pH、温度、离子强度和温育时间，可以由本领域技术人员优化。希望时，可以在合成过程期间或之后，向这些合成的分子上添加重组位点(参见，例如，1998年10月23日提交的美国专利申请号09/177,387，其基于1997年10月24日提交的美国临时专利申请号60/065,930)。
根据本发明，靶或模板核酸分子或文库可以由从天然来源(如多种细胞、组织、器官或生物)获得的核酸分子制备。可以用作核酸分子来源的细胞可以是原核(细菌细胞，包括埃希氏菌属、芽孢杆菌属、沙雷氏菌属(Serratia)、沙门氏菌属(Salmonella)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、梭菌属(Clostridium)、衣原体属(Chlamydia)、奈瑟菌属(Neisseria)、密螺旋体属(Treponema)、支原体属(Mycoplasma)、疏螺旋体属(Borrelia)、军团菌属(Legionella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、缠绕杆菌属(Helicobacter)、欧文菌属(Erwinia)、农杆菌属(Agrobacterium)、根瘤菌属(Rhizobium)和链霉菌属(Streptomyces)的种的细胞)，或真核(包括真菌(特别是酵母)、植物、原生动物和其它寄生虫，和动物，包括昆虫(特别是果蝇属的种的细胞)、线虫(特别是Caenorhabditis elegans细胞)，和哺乳动物(特别是人类细胞))的细胞。
当然，本领域技术人员周知可方便使用的其它核酸合成技术。
在本发明的其它方面，本发明可以与扩增或测序核酸分子的方法联合应用。根据本发明该方面的核酸扩增方法，在本领域公知的作为一步(例如一步RT-PCR)或两步(例如两步RT-PCR)逆转录酶扩增反应的方法中，可包括使用一种或多种具有逆转录酶活性的多肽。为了扩增长核酸分子(即长度大于约3-5Kb)，可以使用DNA聚合酶的组合，如WO 98/06736和WO 95/16028所述。
根据本发明的扩增方法可包括一个或多个步骤。例如，本发明提供一种扩增核酸分子的方法，包括：(a)混合一种或多种具有聚合酶活性的酶与一种或多种核酸模板；和(b)在足以使具有聚合酶活性的酶扩增一种或多种与模板全部或一部分互补的核酸分子的条件下，温育该混合物。本发明也提供这些方法扩增的核酸分子。希望时，可以在扩增步骤过程期间或之后向这些扩增的分子上添加重组位点(参见，例如1998年10月23日提交的美国专利申请号09/177,387，其基于1997年10月24日提交的美国临时专利申请号60/065,930)。
本领域技术人员周知扩增和分析核酸分子或片段的一般方法(参见，例如，美国专利号4,683,195；4,683,202；4,800,159；Innis,M.A.等人编著的《PCR方法：方法与应用指南》，San Diego，California：Academic Press，Inc.(1990)；Griffin，H.G.和Griffin，A.M.编著的《PCR技术：创新》，Boca Raton，Florida：CRC Press(1994))。例如，可以根据本发明使用的扩增方法包括PCR(美国专利号4,683,195和4,683,202)、链置换扩增(SDA；美国专利号5,455,166；EP 0 684 315)和基于核酸序列的扩增(NASBA；美国专利号5,409,818；EP 0 329822)。
这些扩增方法一般包括：(a)在一种或多种引物序列存在下，将一种或多种具有聚合酶活性的酶与核酸样品混合；(b)优选地通过PCR或相当的自动扩增技术扩增核酸样品，产生一组扩增的核酸片段。
在利用本发明的方法扩增或合成后，可以分离扩增或合成的核酸片段进一步应用或表征。该步骤通常如下完成：根据大小或通过任何物理或生物化学方法分离扩增或合成的核酸片段，包括凝胶电泳、毛细管电泳、层析(包括大小层析、亲和层析和免疫层析)、密度梯度离心和免疫吸附。特别优选通过凝胶电泳分离核酸片段，因为它是一种快速、灵敏、高度可重复的分离多种核酸片段的方法，并且可以直接地同时比较几种核酸样品中的片段。在另一个优选实施方案中，人们能够扩展这种方法，用来分离并表征这些片段或通过本发明的方法扩增或合成的任何核酸片段。因此，本发明也涉及通过本发明的扩增或合成方法产生的分离的核酸分子。
在该实施方案中，利用标准技术，如电洗脱或物理切割，从用于鉴定的凝胶中取出一种或多种扩增或合成的核酸片段(见上)。分离的核酸片段然后可以插入适于转染或转化多种原核(细菌)或真核(酵母，植物或动物，包括人类或其它哺乳动物)细胞的标准载体内，包括表达载体。此外，由本发明的方法制备的核酸分子可以进一步表征，例如通过测序(即测定核酸片段的核酸序列)，通过下文描述的方法和本领域的其它标准技术(参见，例美国专利号4,962,022和5,498,523，关于DNA测序方法)。
根据本发明的核酸测序方法可包括一个或多个步骤。例如，本发明可与一种核酸分子测序方法联合，包括：(a)将具有聚合酶活性的一种酶与一种待测序的核酸分子、一种或多种引物、一种或多种核苷酸和一种或多种终止剂(如双脱氧核苷酸)混合，形成一种混合物；(b)在足以合成与待测序分子的全部或一部分互补的一群分子的条件下，温育该混合物；(c)分离该群体，测定待测序分子的全部或一部分的核苷酸序列。
可以使用的核酸测序技术包括如美国专利号4,962,022和5,498,523公开的双脱氧测序法。
试剂盒
另一方面，本发明提供可与本发明联合应用的试剂盒。本发明的试剂盒可包含多种成分，但是一般包含少两种成分。根据本发明该方面的试剂盒可包含一种或多种容器，其中可含有一种或多种选自下列的成分：本发明的一种或多种核酸分子或载体、一种或多种引物、本发明的分子和/或混合物、本发明的载体、一种或多种聚合酶、一种或多种反转录酶、一种或多种重组蛋白(或用于实施本发明的方法的其它酶)、一种或多种拓扑异构酶、一种或多种缓冲剂、一种或多种去污剂、一种或多种限制性内切核酸酶、一种或多种核苷酸、一种或多种终止剂(例如ddNTPs)、一种或多种转染剂、焦磷酸酶等。本发明的试剂盒还可包含用于实施本发明的方法的说明书。
例如，本发明的试剂盒可以包含：(1)第一种核酸分子，它包含一个或多个(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个等)重组位点和/或拓扑异构酶识别位点，和(2)利用此处所述方法共价连接第一种核酸分子与另一种核酸分子的说明书。在特定实施方案中，这种说明书描述在一条或两条链中连接两种或多种核酸分子的方法。在一个相关实施方案中，第一种核酸分子在包含于试剂盒之前用拓扑异构酶改造。
本发明的其它试剂盒可以包含，例如：一种或多种携带拓扑异构酶的核酸分子底物，可包含一种或多种例如可用于检测试剂盒成分的精确性或保真性的控制核酸序列；一种或多种拓扑异构酶；一种或多种包含一种或多种拓扑异构酶的组合物；一种或多种重组酶(或重组蛋白)；一种或多种包含一种或多种重组酶(或重组蛋白)的组合物；一种或多种引物，其可包含至少一个拓扑异构酶识别位点和/或至少一个重组位点、与至少一种拓扑异构酶识别位点和/或至少一种结合位点互补的一种核苷酸序列，或至少一种拓扑异构酶识别位点和与至少一种拓扑异构酶识别位点互补的至少一种核苷酸序列；一种或多种细胞，它能含有或可用于含有该试剂盒的核酸分子或用该试剂盒产生的核酸分子；一种或多种试剂、聚合物、缓冲液等，用于利用该试剂盒实施一种方法；利用该试剂盒实施一种方法的说明书；等等。
另一方面，本发明的试剂盒可以包含一种核酸分子，其具有第一末端和第二末端，并且编码一种将要表达的多肽，例如一种选择性标记，其中该核酸分子在一个或两个末端的3’端处包含一种拓扑异构酶识别位点或其切割产物。任选地，该核酸分子在一个或两个其它末端的5’端处，即在不含拓扑异构酶识别位点或携带拓扑异构酶的末端，含有一个羟基。此外，一个或两个5’端可包含彼此不同的突出序列。本发明的试剂盒还可包含具一种核酸分子，其具有第一末端和第二末端，并且编码一种将要表达的多肽，例如一种选择性标记，其中该核酸分子在一个或两个末端的5’端包含一种拓扑异构酶识别位点或其切割产物。任选地，该核酸分子在一个或两个末端的3’端处含有一个羟基，优选地，一个或两个3’端包含彼此不同的突出序列。另外本发明的试剂盒还可包含一种核酸分子，其具有第一末端和第二末端，并且编码一种将要表达的多肽，例如一种选择性标记，其中该核酸分子在一个或两个末端的5’端和3’端包含一种拓扑异构酶识别位点或其切割产物。因此，应当知道，本发明的试剂盒可以包含含一种或多种拓扑异构酶识别位点的核酸分子或携带拓扑异构酶的核酸分子的任何不同组合。
本发明的试剂盒也能包含一种核酸分子，该分子在至少第一末端的3’端包含一种调节元件或其它核苷酸序列，例如，一种编码序列，和一种拓扑异构酶识别位点和/或结合位点，或其切割产物，任选地，在包含该识别位点的末端的5’端含有一个羟基；或者在至少第一末端的5’端包含一种拓扑异构酶识别位点或其切割产物，任选地，在含有该识别位点的末端的3’端含有一个羟基；或者在至少第一末端的5’端和3’端包含一种拓扑异构酶识别位点。在某些实施方案中，该试剂盒可以包含多种上游调节元件、多种下游调节元件、多种可用于检测或鉴定包含该元件的分子的元件，及其组合。例如，该试剂盒可以包含多种基因启动子元件，它们在少数或多种不同类型细胞中组成型或诱导型地具有活性，允许核糖体结合的元件，如内部核糖体进入位点，编码Kozak序列的元件或起始甲硫氨酸等。另外，该试剂盒可以包含多种下游调节元件，如聚腺苷酸化信号序列、终止转录或翻译的序列等。类似地，该试剂盒可以包含编码可检测标记如表位标记的元件等。在本发明的这些方面，试剂盒包含多种这样的元件，每种含有至少一个拓扑异构酶识别位点和/或至少一个结合位点。在其它这些方面，这些元件可包含一种突出序列，使得它们能够根据本发明的方法彼此有效共价相连或与编码一种多肽如选择性标记的核酸分子共价连接。
任选地，该试剂盒包括元件特异性引物，它们能扩增含有试剂盒所含多种元件之一的一种构建体。当试剂盒中包含这些引物时，包含调节元件或其它元件的核酸分子含有一种能被引物特异识别的核苷酸序列，其导致引物通过并包含调节序列延伸。具体而言，试剂盒可包括元件特异的正向和反向引物，它们能结合产生一种引物对，该引物对扩增例如一种包含试剂盒的特定5’调节元件和特定3’调节元件的构建体。该引物对可选择性扩增根据本发明的方法产生的一种希望的共价连接的功能性双链核酸分子，但是不能扩增部分反应产物。
在另一个实施方案中，本发明的试剂盒包含：第一种核酸分子，它含有第一末端和第二末端，在一个或两个3’端处或附近包含一个拓扑异构酶识别位点或其切割产物和/或一个重组位点，并编码一种转录激活域；和第二种核酸分子，它含有第一末端和第二末端，在一个或两个3’端处或附近包含一个拓扑异构酶识别位点或其切割产物，并编码一种DNA结合域；或包含第一种核酸分子，它含有第一末端和第二末端，在一个或两个5’端处或附近包含一个拓扑异构酶识别位点或其切割产物和/或一个重组位点，并编码一种转录激活域；和第二种核酸分子，它含有第一末端和第二末端，在一个或两个5’端处或附近包含一个拓扑异构酶识别位点或其切割产物和/或一个重组位点，并编码一种DNA结合域。本发明的试剂盒还能包含：第一种核酸分子，它含有第一末端和第二末端，并编码一种DNA结合域，和第二种核酸分子，它含有第一末端和第二末端，并编码一种DNA结合域，其中至少第一种核酸分子或第二种核酸分子在至少一个末端的5’端处或附近和3’端处或附近含有一个拓扑异构酶识别位点或其切割产物，其中另一种双链核苷酸在将要与包含该识别位点的核酸分子的末端共价连接的末端有含一个3’羟基和一个5’羟基。例如，这种试剂盒可用于生产共价连接的双链重组核酸分子，该分子编码可用于进行双杂交测定的嵌合多肽。这种试剂盒可进一步包含一种引物对，它可扩增与第一种或第二种核酸分子有效连接的一种核酸序列，其中，该引物对的至少一种引物包含拓扑异构酶识别位点、拓扑异构酶识别位点互补体，或二者兼有。优选地，用这种引物对产生的扩增产物，在用位点特异性拓扑异构酶切割后，含有一种3’或5’突出序列，该序列与共价连接的第一种或第二种核酸分子互补。这种试剂盒有利于产生包含该试剂盒的第一种或第二种核苷酸序列，并编码可用于进行双杂交测定的嵌合多肽的多核苷酸。
本发明也涉及用于实施本发明的方法，特别是用于生产本发明的产物核酸分子的其它试剂盒。本发明也涉及根据本发明的方法进行同源重组(特别是基因打靶)的试剂盒。本发明的这类试剂盒也可包含其它成分，以进一步操作本发明的方法产生的含重组位点的分子和/或化合物。本发明的试剂盒可包含一种或多种本发明的核酸分子(特别是包含一种或多种重组位点和任选地包含一种或多种反应功能部分的起始分子)、一种或多种本发明的分子和/或化合物、一种或多种本发明的支持物和/或一种或多种本发明的载体。这类试剂盒任选地可包含一种或多种其它成分，其选自：一种或多种宿主细胞、一种或多种核苷酸、一种或多种聚合酶和/或反转录酶、一种或多种合适的缓冲剂、一种或多种引物、一种或多种终止剂、一种或多种用于生产组合文库的分子群体和一种或多种组合文库。
在另一个实施方案中，本发明的试剂盒包含：第一种核酸分子，它编码一种多肽，特别是一种选择性标记，并在每个末端包含一个拓扑异构酶识别位点。在这样一些优选实施方案，第一种核酸分子是一种环状分子(例如质粒、载体等)，包含至少一个重组位点，更优选地至少两个重组位点，位于分子上一个或多个、更优选两个或多个拓扑异构酶识别位点的侧翼。优选地，第一种核苷酸序列包含一种拓扑异构酶激活的核苷酸序列。更优选地，携带拓扑异构酶的第一种核苷酸序列在每个末端均包含一个5’突出序列，最优选地，这些5’突出序列互不相同。优选地，每个5’末端包含一个5’羟基。
根据本发明这方面的试剂盒还包括至少一种核苷酸序列，该序列包含一种调节元件，可以是上游或下游调节元件，或其它元件，在一个或两个末端包含一个或多个拓扑异构酶识别位点，并且任选地，包含一个或更多重组位点。优选地，试剂盒包含多种核酸分子，每个核酸分子均包含不同的调节元件或其它元件，例如，编码一种标记或其它可检测分子或细胞区室化域的序列。不同元件可以是不同类型的特定调节元件，例如，组成型或诱导型启动子或组织特异性启动子，或者可以是不同类型的元件，包括，例如：转录和翻译调节元件、表位标记等。这类核酸分子可以是拓扑异构酶激活的，可以包含5’突出序列，该序列有利于以预定方向有效共价连接这些元件，特别是使得一种多肽选择性标记可在体外或在一种或多种细胞型中表达。
这类试剂盒也可包含引物，包括第一种和第二种引物，使得能够选择包含第一种和第二种引物的一种引物对，用来扩增利用该试剂盒的成分产生的希望的共价连接的双链重组核酸分子。例如，该引物可包含：第一种引物，它与通常位于产生的双链重组核酸分子的5’端的元件互补，例如，包含启动子元件的核酸分子的一部分；和第二种引物，它与通常位于产生的双链重组核酸分子的3’端的元件互补，例如，包含转录终止位点或编码一种表位标记的核酸分子的一部分。根据选自用于生产共价连接的双链重组核酸分子的试剂盒的元件，能够选择合适的第一种和第二种引物，用来扩增全长功能构建体。
在另一个实施方案中，本发明的试剂盒包含多种不同元件，每种在一个或两个末端都是拓扑异构酶激活的，都可包含一个5’突出序列。该5’突出序列可能是特定元件所特有的，或者可能是多种相关元件，例如多种不同的启动子元件所共有的。优选地，设计这些元件的5’突出序列，使得一种或多种元件能够有效共价连接，产生一种有用的功能，例如，包含Kozak序列的元件和包含翻译起始位点的元件能含有互补的5’突出端，使得这些元件能够根据本发明的方法有效共价连接。
试剂盒中的多种元件可包含任何元件，包括转录或翻译调节元件；细菌、昆虫、酵母或哺乳动物宿主细胞中核苷酸序列复制所需的元件；包含位点特异性核酸结合蛋白(如限制性内切核酸酶或重组酶)识别序列的元件；编码可表达产物(如表位标记或抗药性基因)的元件；等等。因此，本发明的试剂盒提供不同元件的方便来源，例如，能够根据通过本发明的方法产生的构建体将要导入或表达的特定细胞选择这些元件。该试剂盒还可包含PCR引物，包括第一种或第二种引物，它们能如上所述结合，以扩增利用该试剂盒的元件产生的共价连接的双链重组核酸分子，它是用试剂盒的元件产生的。任选地，该试剂盒还包含一定数量的一种或多种拓扑异构酶(例如一种或多种位点特异性拓扑异构酶)和/或一种或多种重组酶(或重组蛋白)，可用于共价连接含有拓扑异构酶识别位点的第一种核酸分子与第二种(或其它)核酸分子，后者可以是拓扑异构酶激活的核酸分子，或者可以是含有拓扑异构酶识别位点的核苷酸序列。
在另一个实施方案中，本发明的试剂盒包含：第一种核酸分子，它编码一种选择性标记，在每一末端包含一个拓扑异构酶识别位点；第一种和第二种PCR引物对，它能生产第一种和第二种扩增产物，该产物能根据本发明的方法以预定方向与第一种核酸分子共价连接。产生的这种构建体可通过位点特异性同源重组导入细胞内，并可掺入细胞基因组内，在此可稳定保存，并能在细胞中表达一种异源多肽，或者能敲除一种靶基因功能。例如，欲敲除的靶基因可以是至少一部分序列已知或者易于测定并且希望破坏其功能的任何一种基因，例如，癌基因、与凋亡有关的基因、编码丝氨酸/苏氨酸或酪氨酸激酶的基因或其它任何基因。
本发明的试剂盒中的第一种PCR引物对包含第一种引物，它以5’-3’方向包含：与将要连接的核酸分子的5’突出序列(例如，编码选择性标记的核酸分子的末端)互补的核苷酸序列，与拓扑异构酶识别位点和/或重组位点互补的核苷酸序列，和与靶DNA序列的3’序列互补的核苷酸序列。该第一种PCR引物对还包含第二种引物，该引物包含位于与第一种引物互补的3’序列下游的靶DNA序列的核苷酸序列。
本发明的试剂盒中的第二种PCR引物对包含第一种引物，它以5’-3’方向包含：与将要连接的核酸分子的5’突出序列互补的核苷酸序列，与拓扑异构酶识别位点互补的核苷酸序列，和任选地与重组位点互补的核苷酸序列，和与靶DNA序列的5’序列互补的核苷酸序列，其中靶基因的5’序列位于与第一种引物对的第一种引物互补的靶DNA序列的3’序列的下游。该第二种PCR引物对还包含第二种引物，其包含一种核苷酸序列，与位于与第一种引物所含靶DNA序列的5’序列下游的靶基因3’序列互补。
在另一个实施方案中，本发明的试剂盒包含：第一种核酸分子，它编码一种转录激活域，并在3’端处或附近包含一个拓扑异构酶识别位点或其切割产物；和第二种核酸分子，它编码一种DNA结合域，在3’端处或附近包含一个拓扑异构酶识别位点和任选地一个重组位点或其切割产物。经位点特异性拓扑异构酶切割，第一种或第二种核酸分子可含有一个5’突出端，或者这两种序列都含有5’突出端，它们彼此相同或不同。在核酸分子含有一个5’突出端时，该突出端通常与根据本发明的方法与第一种或第二种核酸分子共价连接的一种核酸分子互补。
该试剂盒也能包含一种或一对连接体、接头等，它们在一个或两个5’端包含一个位点特异性拓扑异构酶识别位点和任选地一个重组位点，或其切割产物，并且任选地在同一端含有一个羟基。选择这些连接体、接头等，使其含有与上文和试剂盒部分所述两种核酸分子之一或另一互补的5’突出端。类似地，该试剂盒也能含有一种或一对连接体、接头等，它们在一个或两个5’端包含一个拓扑异构酶识别位点和任选地一个重组位点或其切割产物，任选地在同一端含有一个羟基。选择这些连接体、接头等，使其含有与上文和试剂盒部分所述两种核酸分子之一或另一互补的3’突出端。另外，该试剂盒也能含有一种或一对连接体、接头等，它们在一个或两个5’端和/或3’端处或附近包含一个拓扑异构酶识别位点或其切割产物，任选地在同一端含有一个羟基。选择这些连接体、接头等，使其含有与上文和试剂盒部分所述两种核酸分子之一或另一互补的5’和/或3’突出端。这些连接体、接头等能连接于将与试剂盒提供的一种或其它第一种或第二种核酸分子共价连接的核酸分子的末端，从而有利于构建编码可用于双杂交测定的诱饵和猎物多肽的嵌合多核苷酸。该试剂盒也能含有一种PCR引物或引物对，它们能用来制备扩增的包含拓扑异构酶识别位点或其切割产物的核苷酸序列群体。根据本发明该方面的其它试剂盒可任选地包含一种或多种其它成分，如一种或多种拓扑异构酶、一种或多种重组蛋白、一种或多种载体、一种或多种具有聚合酶活性的多肽和一种或多种宿主细胞。
相关领域技术人员应当理解，根据熟练技术人员周知的信息，根据本发明的描述，容易明白此处所述方法和用途的其它合适的修饰和改变，可以在不背离本发明或其任何实施方案的范围的情况下进行。现在已经详述了本发明，通过下列实施例可以更加清楚地理解，在此只是为了说明，并非意在限制本发明。
实施例
实施例1
共价连接的双链重组核酸分子利用拓扑异构酶的构建
该实验证实，拓扑异构酶能用来生产共价连接的双链(ds)重组核酸分子。
A.方法
除非另外说明，该实验用下列方法进行。在50μl反应体系中进行PCR，其中包含10ng质粒(模板)、100ng每种引物、2.5单位Taq DNA聚合酶(Sigma)、5μl 10×PCR缓冲液和4μl dNTPs(各200mM)。反应体系在94℃下温育4min进行最初的变性；随后94℃(45sec)变性、55℃(45sec)引物退火、72℃(每kb靶序列1min)延伸共30个PCR循环。循环后，反应体系在72℃下温育(10min)，然后置于4℃下。
拓扑异构酶连接反应在5μl体系中进行，包含50-100ng每种扩增的元件(PCR产生的或合成的)、0.5μl 500mM Tris(pH7.5)和0.5μg拓扑异构酶。反应体系在室温下温育5min，然后用1-2μlTOPO-连接的产物产生线性片段。
线性片段的产生在50μl反应体系中通过PCR进行，其中包含1-2μl TOPO-连接的产物(模板)、100ng每种引物、2.5单位Taq DNA聚合酶(Sigma)、5μl 10×PCR缓冲液和4μl dNTPs(各200mM)。PCR如上所述进行。
产生的线性片段用SNAP Miniprep试剂盒(Invitrogen)如厂商所述纯化。基本上，100μl PCR产物与300μl结合缓冲液、750μl异丙醇混合，混合物置于SNAP Miniprep柱/收集管中，以7000rpm离心30sec。用700μl洗涤缓冲液洗柱，以7000rpm离心30sec；然后用900μl 1×终洗涤液洗涤，以7000rpm离心30sec。该柱然后以7000rpm再离心30sec，除去所有残留的液体。加水(30-50μl)，该柱以7000rpm离心30sec，洗脱纯化的DNA。DNA浓度通过分光光度法测定。
B.拓扑异构酶连接的线性核酸分子的产生
设计PCR引物，检查元件向绿色荧光蛋白(GFP；见图9A-C)编码序列上的定向添加。利用图9D所示的引物，从pCMV/myc/nuc质粒模板扩增CMV启动子(约700bp)和BGH聚腺苷酸化信号序列(约380bp)，从pcDNA3.1/GFP质粒模板(Invitrogen)扩增GFP元件(约700bp)。产生的扩增产物如上所述用拓扑异构酶连接，用连接反应物的一部分作为模板，应用引物F6945(SEQ ID NO：11)和F6948(SEQ ID NO：15)进行PCR，用来扩增完整构建体(CMV+GFP+BGH；约1700bp)。另外，5μl连接混合液用蛋白酶K在37℃下处理30min，除去所有结合的拓扑异构酶，然后在3-8％NuPAGE Tris-乙酸凝胶上电泳，检查连接产物。
当用含有回文突出序列的元件生产重组核酸分子时，只观察到少量正确大小(1.7kb)的连接产物(图9A或9B)，而用含有非回文突出端的元件产生大量希望的产物(图9C)。这些结果证实，含有以预定方向有效连接的核苷酸序列的两条链共价连接的双链重组核酸分子的生产效率与突出序列的性质有关。特别是，选择缺乏回文区的突出序列导致两条链共价连接的双链重组核酸分子的高效产生，而突出端中存在回文序列导致形成预期产物之外的连接产物，从而降低了生产希望的产物的效率。
实施例2
拓扑异构酶产生的共价连接的双链重组核酸分子的功能表征
该实施例证实，本发明的方法提供一种生产两条链共价连接的功能性双链重组核酸分子的方法。
A.从Topo-连接的构建体表达有义和反义mRNA
利用含有T7或T3启动子序列的两种合成元件检查了生产一种在目的基因侧翼含有功能性上游和下游元件的双链重组核酸分子的能力。这些元件通过退火合成寡核苷酸对制备。T7接头通过混合等摩尔量的T7top(F9304；SEQ ID NO：20)和T7bottom(F9305；SEQ IDNO：21)寡核苷酸产生(图9D)。T3接头通过混合等摩尔量的T3top(F9661；SEQ ID NO：23)和T3bottom(F9662；SEQ ID NO：24)寡核苷酸产生(图9D)。混合液在沸水中加热5min，然后冷却至室温。这两种元件都设计为在一端含有一个拓扑异构酶识别位点。
GFP基因用GFP引物F8418(SEQ ID NO：17)和F8420(SEQID NO：18，图9D；参见图9C)扩增。未纯化的GFP PCR产物(2μl)与50ng T7接头和50ng T3接头混合，加入拓扑异构酶，topo-连接反应在室温下继续5min。用2μl连接反应液作为模板，用T7和T3序列的引物进行50μl PCR反应。
扩增后，用4μl等份PCR反应液作为体外转录的模板。该反应用Promega RiboProbe体外转录系统试剂盒按照使用说明书进行。应用T7或T3 RNA聚合酶在37℃下继续反应60min(终体积20μl)。体外转录反应的等份用RNase或DNase消化，未消化的和消化的样品然后在2％TBE凝胶中电泳。在未消化的样品中可见一条预测大小的显著带(有义或反义方向)。用DNase处理的样品未注意到产物带减少。样品用RNase处理后产物带消失，表明产物是RNA。这些结果证实，能够按照本发明的方法用拓扑异构酶生产两条链以预定方向共价连接的双链重组核酸分子，并且能够由这种核酸分子表达RNA转录物。
B.从Topo-连接的构建体表达翻译产物
检测了拓扑异构酶连接的聚核苷酸支持偶联体外转录/翻译的能力。根据本发明的方法，通过连接含有T7启动子(加Kozak序列)的元件与1kb、2kb或3kb的lacZ PCR产物，产生一种双链重组核酸分子。用2μl产物作为PCR扩增反应的模板(引物，SEQ ID NO：25-28；图9D)。用未纯化的扩增反应等份(3μl)作为模板，利用TNTT7 Quick for PCR DNA试剂盒按照厂商说明书(Promega)进行偶联转录/翻译。
每个反应2μl等份通过Tris-甘氨酸凝胶(Novex)电泳分离，然后通过放射自显影显示，显示以预期大小迁移的蛋白质产物。这些结果证实，本发明的方法能用来生产一种两条链共价连接的双链重组核酸分子，其可作为模板，通过偶联体外转录/翻译反应表达一种多肽。
C.用于进行双杂交测定的Topo-连接的构建体的产生
双杂交测定是一种在体内检测蛋白质-蛋白质相互作用的有效方法。该测定基于如下事实：多种真核转录激活物由两种物理和功能分离的域组成，包括可与特定DNA序列结合的DNA结合域和可与基础转录机器相互作用的转录激活域。反式激活域与DNA结合域的结合能促进功能RNA聚合酶II复合物的装配，从而使例如可检测报道基因转录激活(Field和Song，Nature 340：245-246，1998)。当第一种蛋白质X与DNA结合域如GAL4结合域融合，而可能与X相同或不同的第二种蛋白质Y与反式激活域如VP16域融合时，通过检测含有GAL4启动子的报道基因的转录能够鉴定蛋白质X与Y的相互作用。
检测了本发明的方法生产用于表达进行哺乳动物双杂交测定的融合蛋白的线性构建体的能力。用PCR产生在适当末端含有拓扑异构酶位点的GAL4(F10779和F12667引物；分别为SEQ ID NO：1和3)、VP16(F10779和F12668引物；分别为SEQ ID NO：1和5)、p53(F12669和F12505引物；分别为SEQ ID NO：8和4)、T抗原(F12670和F12505引物；分别为SEQ ID NO：9和4)和SV40pA(F12016和F561引物；分别为SEQ ID NO：6和7)元件。用拓扑异构酶产生共价连接的双链构建体GAL4+p53+SV40pA和VP16+T抗原+SV40pA，产生的连接产物作为PCR扩增的模板。
纯化的GAL4+p53+SV40pA和VP16+T抗原+SV40pA PCR构建体与lacZ报道基因(pGene/lacZ质粒；Invitrogen)共转染CHO细胞(6孔板，1×105细胞/孔)。在平行实验中，检测含有表达构建体的质粒载体的应用，以及含有未纯化的构建体的PCR反应混合物的应用。对照反应用GAL4+pA和不含插入片段的VP16+pA(阴性对照)或p53+VP16(阳性对照)进行。细胞在转染后裂解48小时，用β-半乳糖苷酶测定试剂盒测定报道基因的活性。
用阳性对照(图10，样品3)以及在用报道基因和线性GAL4+p53+SV40pA和VP16+T抗原+SV40pA构建体共转染的样品(图10，样品4)中检测到高水平的报道基因活性。使用质粒形式的构建体(图10，样品1)时检测到低水平活性(但高于阴性对照；样品5、6、8、9)。在用未纯化的、PCR产生的诱饵和猎物构建体共转染的样品(样品7)中也观察到低水平活性。这些结果证实，本发明的方法能用来制备用于进行双杂交测定的构建体。
实施例3
定向携带Topo的Gateway载体的产生和应用
引言
研制定向携带Topo的Gateway载体，它是拓扑异构酶与GATEWAYTM重组克隆技术的组合。这些工具通过减少在重组为供体载体之前向PCR扩增的ORF的任一端添加attB位点(25个碱基对)的必要性，有利于容易地进入Gateway系统。相反，向OFR的5’端添加4个碱基的标记识别序列(CACC)，然后定向TOPO-克隆PCR产物，产生一种进入或与Gateway相容的表达载体(见图8和9)。
在该实施例中，总共产生三种Topo-Gateway载体和一种目标载体。产生两种topo进入载体：(1)pENTR/D-TOPO(图22)，它可使ORF定向克隆到将要转移到所有N端融合原核和所有真核DEST载体的attL位点之间；和(2)pENTR/SD/D-TOPO(图23)，它可使ORF定向topo克隆到原核核糖体结合位点(Shine-Dalgarno)的下游。以这种方式克隆的基因能够转移到不含N端标签的原核DEST载体中，并在细菌中表达，产生含有天然N端的蛋白质。
也曾经构建了一种定向Topo Gateway哺乳动物表达载体pcDNA/GWD-TOPO(图19)。该载体可将一种ORF定向克隆到pcDNA3.1衍生物中。克隆到该载体内的ORF在哺乳动物细胞中在CMV启动子控制下表达。克隆的ORF在该载体中的侧翼为attB位点，使它们能通过BP和LR克隆酶反应在Gateway系统周围移动。该载体也编码C端V5标签、TK聚腺苷酸化信号和用于在哺乳动物细胞系中筛选稳定克隆的新霉素(G418)抗性标记。最后，通过转移ccdB和氯霉素抗性盒由pcDNA/GWD-TOPO构建Gateway目标载体。
这些Topo Gateway进入和表达载体提高了进入Gateway系统的容易程度，因为它们使研究人员能够直接克隆一种PCR扩增的基因，而不需要向引物上添加attB位点及进行BP克隆酶反应。
材料与方法
pcDNA/GWD-TOPO的构建。pcDNA/GWD-TOPO如下构建：首先替换pcDNA3.1aatB(含有BGH聚腺苷酸化信号的一种早期版本)中的多克隆位点。其实现方法是用BsrG I(它在位于MCS侧翼的每个att位点内酶切)消化亲代载体，插入编码新MCS的双链寡核苷酸(图18)。一旦正确的插入得到证实，即用V5标签替换V5/His标签和BGH聚腺苷酸化信号，之后是3个终止密码子(TAG、TGA、TAA)和来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶(TK)聚腺苷酸化信号。实现方法是用AscI和AvrII消化该载体，纯化载体片段，在三元连接中插入两种编码新序列的片段(见图19)。
pcDNA-DEST40的构建。pcDNA-DEST40由pcDNA/GWD-TOPO通过与pDONR221进行BP克隆酶反应产生。pDONR221与pcDNAGW-DT(sc)和BP克隆酶(InvitrogenCorporation；Carlsbad，CA)在适当缓冲液中结合。根据标准方案温育该反应体系，在卡那霉素平板上筛选转化子。在含有氨苄青霉素/氯霉素的培养基上筛选产物，一种含有位于ccdB、ccdA侧翼的attP位点和氯霉素抗性基因的pcDNA目标载体(见图20)。
pENTR/D-TOPO(sc)的构建。通过与pcDNA/GWD-TOPO(sc)进行BP重组在attP位点之间添加一个改造序列，修饰pDONOR221，产生pENTR/D-TOPO(sc)(图21)。pDONR221与pcDNA/GWD-TOPO(sc)和BP克隆酶在适当缓冲液中结合。除了用DH10BsbcC细胞进行pENTR/D-TOPO(sc)的转化和增殖外，按照标准方案温育该反应体系。该细胞系含有一个突变，允许保持具有密切靠近的发夹结构(例如attL位点)的质粒。该质粒不支持Top 10细胞在选择培养基中的生长。
pENTR/D-TOPO和pENTR/SD/D-TOPO的产生。通过用NotI、AscI和XhoI依次消化，然后在15℃下与定向topo连接体Topo-D71、-D72、-D75和-D76(对于pENTR/SD/D-TOPO)或Topo-D73、-D74、-D75和-D76(对于pENTR/D-TOPO)连接过夜，使载体pENTR/D-TOPO(sc)定向携带topo。通过在室温下异丙醇沉淀，将改造的载体与游离寡核苷酸分离。添加正常退火的oligo Topo D-70、T4激酶和重组牛痘拓扑异构酶I使纯化的、改造的载体携带topo。在37℃下温育15分钟后，该载体通过琼脂糖凝胶电泳(NB JC-12，2001-035，第3页)或25Q MacroPrep柱(BioRad)(NB2000-0342，第45页)层析纯化。将1ng纯化载体与5ng定向(CACC)750bp待测插入片段在室温下温育5分钟，测定定向topo克隆效率。然后用2μl克隆反应物转化Top 10化学感受态细胞，在含有卡那霉素的LB平板上生长进行抗生素选择。
Topo-Gateway克隆和基因表达。为了检测这些载体支持Topo克隆、Gateway克隆和蛋白质产生的能力，利用在ATG起始密码子直接上游5’端掺入4碱基CACC标记的引物，PCR扩增编码人I类HLA的基因(保藏号D32129)。PCR产物克隆入pENTR/D-TOPO和pENTR/SD/D-TOPO内。每个HLA反应体系10个克隆进行菌落定向PCR反应(d-PCR)。在该实验中，用T7引物(结合于attL1位点的5’)和129反向引物(HLA3’端特异)扩增这些克隆。
除了HLA基因外，类似地扩增氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因，并克隆到两种进入载体中。在小量制备及消化分析后，每个反应分离一个克隆，利用M13正向引物和M13反向引物测序。所有进入克隆均通过测序证实，并通过L/R克隆酶反应与pcDNA/GW DEST 40(pENTR-D-TOPO克隆)或pET DEST 42(pENTR/SD/D-TOPO克隆)重组。阳性克隆通过NcoI(位点位于定向改造的ORF的5’端，ca CCATGG)和NotI(数据未显示)消化证实。然后用产生的pcDNA-DEST 40(HLA和CAT)和pcDNA/GW/D-TOPO(HLA和CAT)构建体转染COS细胞。细胞用Lipofectamine 2000、8μg DNA和Optimem缓冲液转染。反应液应用细胞5小时，然后更换培养基。在37℃下温育过夜后，收获细胞，裂解，并按照标准程序进行4-20％Tris-甘氨酸凝胶电泳。电泳后，蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，封闭，用V5-HRP抗体探针杂交，进行ECL检测。
每个pET DEST 42反应一个阳性克隆转化BL21(DE3)细胞，并在LB/Amp中生长过夜。培养物用相同培养基1∶25稀释，生长至O.D.(600nm)＝0.5，此时加入IPTG至终浓度为1mM诱导重组蛋白的表达。培养液在37℃下生长3小时后，离心收集细胞。细胞沉淀等份在NuPage变性样品缓冲液中煮沸，进行4-12％NuPage聚丙烯酰胺凝胶电泳，用SafeStainTM(Invitrogen)染色。HLA和CAT基因直接topo克隆到pET100 CAT和HLA(dTopo，无attB位点)中，作为pET DEST 42载体中待测基因表达的阳性对照。用这些构建体转染BL21(DE3)大肠杆细胞细胞，生长至对数期，如上所述用IPTG诱导。
结果与讨论
HLA和CAT克隆在pENTR-dTopo和pENTR/SD-dTopo中的定向克隆效率。定向PCR反应用来确保克隆到pENTR/D-TOPO和pENTR/SD/D-TOPO内的HLA ORF具有正确的方向。每次Topo克隆转化挑取10个菌落，如“材料与方法”所述直接进行PCR反应。所检测的10个pENTR/SD-HLA克隆中的8个方向正确，而10个pENTR-HLA克隆中的9个正确。这些检测用凝胶纯化的载体进行，它们约10-15％无插入背景(数据未显示)。
此外，也对CAT克隆进行限制酶切分析。分离克隆，用NcoI和AscI消化DNA。方向正确的CAT克隆中两个NcoI位点之一存在于每个ORF的5’端，作为Kozak定向改造序列的一部分，和CAT基因的前两个密码子(caCCATGG)。AscI存在于载体中ORF的3’端。方向正确的克隆将含有两个NcoI位点(一个位于5’端一个位于内部)，并且在用AscI双消化后将产生500bp和150bp的片段。CAT ORF在其3’端编码序列CGCC，它与最佳标记序列有一个碱基对的错配。这种密切的同源性使CAT PCR产物仅以50％的效率定向克隆(8个克隆中的4个，数据未显示)。
进入克隆的测序。为重组为DEST载体并随后进行表达而选择的每种进入克隆从两端测序，证实连接体和ORF正确连接。使用M13正向和反向引物，反应物送至ResGen用ABI 3700毛细管测序仪测序。从这些反应中获得最少600个碱基的可读序列。显然由于反应通过attL位点继续，信号有一定程度的丢失，但利用该方法在该点后仍保留明显的信号(数据未显示)。
HLA和CAT在COS细胞中的表达。用HLA和CAT作为这些构建体中的待测基因转染COS细胞，检测pcDNA/GW/D-TOPO和pcDNA-DEST 40的表达。收获的裂解液通过应用V5抗体的Westernblot对V5标记的重组蛋白进行探针杂交。图27显示的数据表明，HLA和CAT基因均在这些载体中表达，无论基因是通过Topo克隆直接克隆的(图27，第3、6道)还是用LR克隆酶从pENTR/D-TOPO中转移后(图27，第2、5道)克隆的。
HLA和CAT的细菌表达。克隆到pENTR/SD/D-TOPO内的CAT和HLA基因通过LR克隆酶转移到pDEST-42(pET，C端V5/His)中。图28显示的结果提示，CAT基因无论其侧翼含有attB位点还是没有，均在细菌中表达(图28，比较第6道与第7道)。发现CAT基因从pENTR/SD/D-TOPO转移到pET DEST后在大肠杆菌中良好表达，这证实了该系统在利用Topo-Gateway系统克隆并表达ORF的用途。
有趣的是，在两个独立的实验中，克隆到pDEST 42中的HLA(侧翼为attB位点)不能在BL21(DE3)细胞中表达(图28，第3、4道)。如上所见，来自同一进入克隆的HLA基因当重组到一种哺乳动物DEST载体中后在COS细胞中良好表达。此外，pET系统不能支持侧翼为attB位点的HLA基因表达的事实提示，利用Gateway系统至少在细菌中的表达可能具有基因特异的改变。可能与这一结果有关的一个因素是，由对照载体(pET 100d-Topo)表达的HLA在凝胶中异常电泳(30kDa而不是预测的41kDa)。这种人类蛋白质在任何情况下也许都不能在细菌中良好表达，添加attB位点可能加重表达的问题。需要更多的实验来认识这一发现。
总之，我们已经描述了两种新Topo Gateway进入载体的构建和检测，一种新的Topo Gateway表达载体和由其产生的一种新的DEST载体。结合了Topo克隆的易行性和效率以及Gateway系统的多能性的这些新工具在不同方面允许以最少的费用和劳动来克隆和表达大量基因。
实施例4
拓扑异构酶克隆的备选方法
在本发明的一个优选备选实施方案中，如下构建TOPO SSS载体：首先获得市售克隆载体。一种这样的载体是A型pUni/V5-His(Invitrogen Corp，Carlsbad，CA)，是一种含有设计独特的元件的环状超螺旋载体。这些元件包括：提高mRNA在真核宿主中的稳定性的聚腺苷酸化序列、T7转录终止区、R6Kg DNA复制起点和用于抗生素抗性选择的卡那霉素抗性基因和启动子。另外，A型pUni/V5-His还含有一个多克隆位点，它是编码一系列限制性内切酶识别位点的合成DNA序列。为了向载体的特定位置克隆DNA，构建这些位点。载体的多克隆位点内也含有插入内切核酸酶识别位点5’的loxP位点，从而有利于Cre重组酶介导地融合到多种其它表达载体中(EchoTM克隆系统，Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)。为了用抗-V5抗体容易地检测表达的融合蛋白，含有一种任选的C端V5表位标记。为了能够快速纯化和检测表达的蛋白质，也含有一种任选的C端聚组氨酸(6×His)标记。位于loxP位点下游的细菌核糖体结合位点使得在大肠杆菌中的转录起始成为可能。尽管这种元件组合对于A型pUni/V5-His克隆载体是特异的，但是多种类似的克隆和表达载体可以从商业途径获得，或者可以用本领域周知的序列和方法装配。A型pUni/V5-His是一种2.2kb的双链质粒。
由A型pUni/V5-His构建携带拓扑异构酶I的克隆载体如下进行：内切核酸酶消化该载体，然后进行合成寡核苷酸的互补退火，并用牛痘拓扑异构酶I位点特异地切割异源双链体。SacI和EcoRI是A型pUni/V5-His的多克隆位点内存在的多种限制性内切酶位点中的两种。用相应的限制性内切酶SacI和EcoRI消化A型pUni/V5-His，在载体上产生粘端(5’-AGCT-3’和5’-AATT’3’)。这些酶可购自多家供应商，包括New England Biolabs(Beverly，MA，目录号RO156S，SacI和RO101S，EcoRI)。利用异丙醇沉淀可容易地从消化的片段中分离消化的A型pUni/V5-His。本领域技术人员周知消化和分离DNA的这些和其它方法(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和T.Maniatis.(1989)《分子克隆：实验室手册》第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press.5.28-5.32)。
纯化、消化的载体然后与两种特异性寡核苷酸连接体和T4 DNA连接酶一起温育。该连接体是含有与载体的SacI和EcoRI末端相容的末端的寡核苷酸双链体。本领域技术人员应当理解，能够为含有不同限制酶切位点的其它载体制备含有合适的序列的其它连接寡核苷酸。在与T4 DNA连接酶温育后，用异丙醇纯化含有连接的连接体的载体。TOPO D1与TOPO D2退火产生的连接双链体在一端含有单链EcoRI突出端，在另一端含有一个12个核苷酸的单链突出端。
第一种连接寡核苷酸(TOPO D1)与EcoRI粘端3’-TTAA-5’互补。此外，TOPO D1含有另外的24-bp，包括位于3’端上游16-bp的拓扑异构酶共有五嘧啶元件5’-CCCTT。TOPO D1连接oligo的剩余的序列和大小是可变的，可以修饰以满足研究人员的特定需要。根据本发明优选实施方案的这一方面，所用连接体的全长序列为5’- AATTGAT CCCTTCACCGACATAGTACAG-3’。
第二种连接寡核苷酸(TOPO D2)必须与TOPO D1完全互补。TOPO D2与EcoRI粘端的5’直接互补，延伸线性化载体的底链。另外，TOPO D2还含有序列3’-GTGG，它是定向克隆必需的SSS。在该实施方案中，选择与Kozak序列互补的SSS，已知它能通过提高核糖体在mRNA上的结合帮助ORF在真核细胞中的表达，然而，为了满足个体使用者的特定需要，序列和长度是高度可变的。TOPO D2的完整序列是3-CTAGGGAA GTGG-5。与上述类似，寡核苷酸TOPO D4与TOPO D5退火产生的连接双链体在一端含有单链SacI突出端，在另一端含有一个12核苷酸的单链突出端。
第三种连接寡核苷酸(TOPO D5)与SacI粘端3’-TCGA-5’互补。类似于TOPO D1，TOPO D5含有可产生一个单链突出端的其它碱基。根据使用者的需要，长度和序列可能不同。在本实施方案中，TOPO D5的序列是5’-AAGGGCG AGCT-3’。
第四种连接寡核苷酸(TOPO D4)与TOPO D5完全互补，并且与SacI粘端的5’直接互补，延伸线性化载体的顶链。TOPO D4也含有拓扑异构酶共有序列5’-CCCTT。TOPO D4连接oligo的剩余序列和大小可变，并且可以修饰以满足特定需要。在本实施方案中，TOPOD4的序列是3’-GACATGATACAG TTCCCGC-3’，其含有另一个12bp的单链突出端。
这些连接寡核苷酸能够用多种技术化学合成，包括磷酰胺(phosphoramadite)法(Caruthers，M.H.，Barone，A.D.，Beaucage，S.L.，Dodds，D.R.，Fisher，E.F.，McBride，L.J.，Matteucci，M.，Stabinsky，Z.和Tang，J.Y.，(1987)脱氧寡核苷酸的化学合成，MethodsEnzymol.154：287-313)。本领域技术人员周知用于化学合成oligos的该方法及其它方法。
纯化、消化的载体与连接寡核苷酸的互补退火通过在T4 DNA连接酶存在下温育DNA完成。典型的连接反应在连接酶和适当反应缓冲液存在下通过克隆载体与适当DNA片段的温育进行。用于连接反应的缓冲液应当含有ATP为反应提供能量，以及还原试剂，如二硫苏糖醇，和pH稳定剂，如Tris-HCl。克隆载体与DNA片段的浓度比取决于不同反应，其计算通式在文献中有大量描述(参见，例如《方法与应用指南》(1991)，Promega Corporation，Madison，WI，45页)。T4连接酶在温育过程中可催化在相邻的5’磷酸与3’羟基末端之间形成磷酸二酯键.粘端连接一般在12-15℃下进行30分钟，而平端连接需要在室温下进行4-16小时(Ausubel，F.M.，Brent，R.，Kingston，R.E.，Moore，D.D.，Seidman，J.G.，Smith，J.A.，Struhl，K.(1992)《第二版：分子生物学简明方法》，John Wiley & Sons，Inc.，New York，NY，pp3.14-3.37)，然而，每个实验的参数范围不同。在本实施方案中，纯化、消化的A型pUni/V5-His与连接体oligos在T4连接酶和适当缓冲液存在下在12.5℃下温育16小时。产生的线性化和改造的载体包含通过碱基互补和T4连接酶催化的磷酸二酯键与连接寡核苷酸连接的纯化克隆载体。
用拓扑异构酶有效修饰改造的载体需要添加退火的oligo，以在TOPO D1和TOPO D4的单链突出端上产生双链DNA。牛痘拓扑异构酶I最初与双链DNA非共价结合。然后该酶沿双链体扩散，直到位于并共价附着于共有五嘧啶序列5’-CCCTT，形成拓扑异构酶改造的复合物(参见Shuman等人，美国专利号5,766,891)。在不含DNA连接酶时发生改造载体的修饰，以防止在改造的载体与退火oligo之间形成磷酸二酯键，因为不易断裂的链中的磷酸二酯键将阻止切割后离去基团的解离。
退火的寡核苷酸(TOPO D3)必须与TOPO D1和TOPO D4的单链DNA突出端互补。在本实施方案中，该突出端共有下列序列：5’-GACATAGTACAG-3’。因此，TOPO D3含有下列序列：3-CTGTATCATGTCAAC-5，它与连接体oligo的单链突出端和另一个3bp突出端3’-AAC-5’完全互补。
在拓扑异构酶存在下，改造载体与退火oligo温育将产生双链DNA，拓扑异构酶能够与之非共价结合。结合的拓扑异构酶通过一种加强的扩散机制搜索双链DNA，直到定位于5’-CCCTT识别基序。通过亲核攻击优选的寡核苷酸切割序列5-CCCTT的3’磷原子催化该基序3’的易裂链磷酸二酯骨架的切割，使DNA与酶通过3’-磷酸酪氨酰键共价连接(参见，Shuman，S.，Kane，E.M.，Morham，S.G.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，9793-9796)。易裂链的切割产生包含位于5’-CCCTT基序下游的3’端连接oligo和退火oligo TOPO D3的双链离去基团。尽管通过5’羟基介导的磷酸酪氨酰键的攻击，离去基团能与拓扑异构酶修饰的载体末端再连接，但是当离去基团不再与载体共价连接时，不利于该反应。向切割/再连接反应中添加T4聚核苷酸激酶和ATP使平衡进一步偏向捕获的拓扑异构酶的积累，因为该激酶能磷酸化离去基团的5，羟基，防止发生再连接(Ausubel，F.M.，Brent，R.，Kingston，R.E.，Moore，D.D.，Seidman，J.G.，Smith，J.A.，Struhl，K.(1992)《第二版：分子生物学简明方法》，John Wiley & Sons，Inc.，NewYork，NY，pp3.14-3.30)。产生的线性化载体包含一个来自TOPOD4/D3离去基团的平端和一个来自TOPO D1/D3离去基团的含SSS末端。线性化克隆载体的两个末端都含有拓扑异构酶，能够快速、有效、定向地拓扑异构酶介导地插入一种受体分子。
尽管上述实施例详述了为了形成拓扑异构酶修饰的定向克隆载体修饰A型pUni/V5-His，但本领域技术人员应当理解如何对任何质粒、粘粒、病毒或其它DNA应用这些方法。也应当指出，该实施例证实了一种载体，其含有5’单链突出端，包含序列5’-GGTG-3’，然而，连接双链体和退火寡核苷酸的设计应当使本领域技术人员能够在特定载体的一个或两个末端处设计任何序列或长度的突出端。
具体而言，能够修饰任何质粒、粘粒、病毒或其它DNA，使之含有任何适宜序列和长度的SSS。基本步骤是：首先用已知线性化DNA的处理方法处理该载体。常用方法包括但不限于限制性内切酶消化和拓扑异构酶II处理。线性化后，添加一种定制的SSS。在上述实施例中，向限制性消化的粘端添加互补寡核苷酸，产生希望的SSS，然而，也能通过T4平端连接添加形成SSS的寡核苷酸。通过拓扑异构酶I介导的单链切割暴露SSS序列。随后，能用该SSS定向插入含有一种或多种互补SSS的PCR产物。
同样，也能对任何双链质粒、粘粒、病毒或其它DNA片段进行拓扑异构酶修饰。拓扑异构酶I与双链DNA的连接方法在本领域中众所周知(参见Shuman等人，美国专利号5,766,891)。拓扑异构酶在双链DNA片段上的战略位置取决于拓扑异构酶I共有序列的掺入(参见Shuman等人，美国专利号5,766,891)。拓扑异构酶I可结合双链DNA，切割易裂链，从而暴露预定的单链突出序列，并以正确的SSS介导的方向连接引入的PCR产物。
实施例5
定制拓扑异构酶I改造的载体的产生
本发明该方面另一种质粒的用途的另一个例子是，修饰pCR2.1(Invitrogen Corporation；Carlsbad，CA)，产生拓扑异构酶I改造的含有定制单链序列的载体。
质粒pCR2.1是3.9kb的T/A克隆载体。该载体的序列内有多个设计独特的元件。这些元件包括一个f1起点、一个ColE1起点、一个卡那霉素抗性基因、一个氨苄青霉素抗性基因、一个LacZ-alpha片段和位于LacZ-alpha片段内的一个多克隆序列，该序列允许蓝-白选择重组质粒。pCR2.1的多克隆序列含有多个限制酶切位点，包括但不限于：HindIII、SpeI和EcoRI；M13正向和反向引物和T7 RNA聚合酶启动子。
具有定制单链序列的含拓扑异构酶I载体的构建包括：内切核酸酶消化，随后是合成寡核苷酸的互补退火，并用牛痘拓扑异构酶I位点特异地切割异源双链体。用限制性内切酶HindIII、SpeI和EcoRI消化pCR2.1在载体上产生HindIII和EcoRI粘端。为了减小其大小，用SpeI进一步酶切位于HindIII酶切位点下游的pCR2.1的分离片段。通过减小片段大小，消化的载体易于通过异丙醇沉淀从较小的消化片段中纯化。这些酶可从多家供应商处获得，包括New England Biolabs(Beverly，MA，目录号：RO104S，HindIII；RO133S，SpeI；RO101S，EcoRI)。本领域技术人员周知消化和分离DNA的方法(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和T.Maniatis.(1989)《分子克隆：实验室手册》第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press.5.28-5.32)。
纯化、消化的载体然后与4种连接寡核苷酸和T4 DNA连接酶一起温育。这些连接寡核苷酸设计为与HindIII粘端、EcoRI粘端或彼此互补。与T4 DNA连接酶温育后，用异丙醇纯化改造的载体。
第一种连接寡核苷酸(TOPO H)与HindIII粘端3’-TCGA-5’互补。此外，TOPO H还含有另外24bp，包括位于3’端上游19bp的拓扑异构酶共有五嘧啶元件5’-CCCTT。TOPO H连接oligo的剩余的序列和大小是可变的，并且可以为了满足研究人员的特定需要而修饰。在本实施方案中，使用的连接体的全长序列是5’- AGCTCG CCCTTATTCCGATAGTG-3’。
第二种连接寡核苷酸(TOPO 16)必须与TOPO H完全互补。TOPO 16与HindIII粘端的5’直接互补，延伸线性化载体的底链。另外，TOPO 16还含有序列3’-TAAG，它是为定向克隆选择的单链序列。TOPO 16的完整序列是3’-GCGGGA ATAAG-5’。
第三种连接寡核苷酸(TOPO 1)与EcoRI粘端3’-TTAA-5’互补。类似于TOPO H，TOPO 1含有其它碱基，含有位于3’端上游12bp的拓扑异构酶I共有序列CCCTT。根据使用者的需要，TOPO 1的长度和序列可能不同。在本实施方案中，TOPO 1的序列是5’-AATTCGCCCTTATTCCGATAGTG-3’。
第四种连接寡核苷酸(TOPO 2)与TOPO 1完全互补，并且与EcoRI粘端的5’直接互补，延伸线性化载体的顶链。在本实施方案中，TOPO 2的序列是3’-GCGGGAA-5’。
纯化、消化的载体与连接寡核苷酸的互补退火通过在T4 DNA连接酶存在下温育DNA完成。T4连接酶在温育过程中可催化在相邻的5’磷酸与3’羟基末端之间形成磷酸二酯键。在本实施方案中，纯化、消化的pCR2.1与连接oligos在T4连接酶和适当缓冲液存在下在12.5℃下温育16小时。产生的线性化和改造的载体包含通过碱基互补和T4连接酶催化的磷酸二酯键与连接寡核苷酸连接的纯化克隆载体。连接技术在文献中有大量描述(参见Ausubel，F.M.等人，(1992)《第二版：分子生物学简明方法》，John Wiley & Sons，Inc.，New York，NY，pp3.14-3.37)。
使改造的载体含有拓扑异构酶需要添加退火的寡核苷酸，以在TOPO H和TOPO 1的单链突出端上产生双链DNA。在不含DNA连接酶时改造的载体发生修饰，以防止在改造的载体与退火的oligo之间形成磷酸二酯键，因为不易断裂的链中的磷酸二酯键可阻止切割后离去基团的解离。
退火的寡核苷酸(TOPO 17)必须与TOPO H的单链DNA突出端互补。在本实施方案中，突出端含有下列序列：5’-CGATAGTG-3’。因此，TOPO 17含有下列序列：3’-GCTATCAC-5’，它与连接oligo的单链突出端完全互补。
退火的寡核苷酸(TOPO 3)必须与TOPO 1的单链DNA突出端互补。在本实施方案中，突出端含有下列序列：3’-GTGATAGCCTTA-5’。因此，TOPO 3含有下列序列：5’-CAACACTATCGGAAT-3’，它与连接oligo的单链突出端和另一个3bp突出端5’-CAA-3’完全互补。
在拓扑异构酶存在下，改造的载体与退火的oligo温育将产生双链DNA，拓扑异构酶能够与之非共价结合。结合的拓扑异构酶通过一种加强的扩散机制搜索双链DNA，直到定位于5’-CCCTT识别基序。该基序3’的易裂链磷酸二酯骨架的切割将使DNA与酶通过3’-磷酸酪氨酰键共价连接(参见，Shuman，S.等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，9793-9796)。易裂链的切割产生在5’-CCCTT基序下游含有3’端连接oligo和互补退火寡核苷酸的双链离去基团。通过5’羟基对磷酸酪氨酰键的攻击，离去基团能与拓扑异构酶改造的载体再连接，这也由拓扑异构酶催化。向平衡反应中添加T4聚核苷酸激酶可通过激酶介导的离去基团5’羟基的磷酸化阻止发生逆反应(Ausubel，F.M.等人(1992)《第二版：分子生物学简明方法》，John Wiley & Sons，Inc.，NewYork，NY，pp3.14-3.30)。产生的线性化载体包含一个来自TOPO 1/3离去基团的平端和一个来自TOPO H/17离去基团的单链序列末端。线性化克隆载体的两个末端都含有拓扑异构酶，能够快速、有效、定向地拓扑异构酶介导地插入一种受体分子。
实施例6
利用拓扑异构酶的定向克隆
本发明该方面也提供一种DNA定向克隆的方法。在这些方法中，利用由A型pUni/V5-His构建的TOPO SSS载体定向插入来自GeneStorm Expression Ready克隆(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)的ORF。为了克隆这些ORF选择修饰的pUni载体，因为添加到载体中的单链与已知能提高ORF表达的Kozak序列有同源性。然而注意到，如前所述，能够修饰任何质粒、粘粒、病毒或其它DNA，使之含有必需的单链序列。同样，也能修饰任何DNA片段，使之含有与任何一种载体SSS的同源序列。重要的一点是，SSS序列能影响定向克隆效率。例如，低GC含量的SSS具有较低的退火稳定性，与待克隆DNA片段的两端高度互补的SSS也失去引导这些DNA插入片段的能力。因此，应当仔细设计SSS的序列，以避免这些和类似的问题。
本发明该方面尤其可用于向根据本发明构建的载体内定向插入PCR产物。在希望的插入片段的PCR扩增中，设计PCR引物，使之互补于将要定向克隆到TOPO SSS载体内的插入片段的确定序列。与DNA编码链上游结合的引物用另一种载体SSS互补序列在其5’端修饰。产生的PCR产物含有一种互补序列，该序列允许SSS介导的向TOPO SSS克隆载体内的定向插入，以及随后的产物表达。
一种这样的实施方案包括：通过用含有SSS的5’寡核苷酸引物PCR扩增供体双链DNA分子，向供体双链DNA底物中导入一个SSS位点。DNA区的PCR扩增用设计的寡核苷酸引物完成，该引物与希望的区域之外的已知区域互补。在一个优选实施方案中，与DNA双链区的编码链同源的引物含有与TOPO SSS克隆载体的SSS互补的另外一种核苷酸序列。
以高通量形式应用本发明，我们选择了来自GeneStorm表达系统(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)的82种已知ORF，用于向TOPO SSS载体内定向克隆，然而，使用者也可以随意选择任何DNA序列。对于每种ORF，引物设计为与编码链和非编码链同源。为了如实施例4所述以定向方式向修饰的A型pUni/V5-His TOPO SSS载体内克隆PCR产物，修饰特定引物对的一条引物，使之含有与载体所含SSS互补的核苷酸序列。在本实施例中，编码引物含有添加的序列5’-CACC-3’，它与TOPO SSS克隆载体的“SSS”3’-GTGG-5’互补。用各自引物PCR扩增上述ORF可产生双链DNA片段，它们在5’端含有SSS。我们在PCR扩增中使用pfu聚合酶，但是众所周知，能用非嗜热聚合酶如pfu或嗜热聚合酶如taq进行PCR反应，随后进行补平步骤除去非模板核苷酸。这些酶保留在PCR产物末端。
在本实施例中，0.1μg每种引物与0.05μg含有ORF的DNA在总体积为50μl的PCR反应混合液中结合。除了引物和载体外，反应混合液也含有水、PCR缓冲盐、10mM dNTPs和1.25单位pfu聚合酶。热循环温度如下：最初94℃变性；随后94℃变性、55℃引物退火、72℃延伸均1分钟重复25次；最后72℃延伸15分钟。这些参数随待扩增的DNA片段而不同，能够用本领域技术人员周知的方法对不同长度和组成的片段优化(Ausubel，F.M.，Brent，R.，Kingston，R.E.，Moore，D.D.，Seidman，J.G.，Smith，J.A.，Struhl，K.(1992)《第二版：分子生物学简明方法》，John Wiley & Sons，Inc.，New York，NY，pp15.3-15.4)。本领域技术人员也熟知将3’突出端转化为平端的技术(《方法与应用指南(1991)》，Promega Corporation，Madison，WI，pp.43-44)。
含有SSS互补序列的PCR扩增的供体双链DNA与修饰的A型pUni/V5-His TOPO SSS载体温育，导致供体DNA的定向克隆。例如，利用SSS改造的引物扩增来自GeneStorm克隆集合(InvitrogenCorporation，Carlsbad，CA)的82种ORF。用希望的修饰引物对扩增82种GeneStorm ORF，产生在5’端含有SSS互补序列的PCR产物。该ORF PCR产物与10ng TOPO SSS克隆载体在无菌水或盐溶液中结合。轻轻混合该反应液，在室温(22-23℃)下温育5分钟。5分钟后，我们将反应物置于冰上，然后进行OneShot化学转化或电穿孔(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA，目录号分别为C4040-10和C4040-50)(Invitrogen TOPO克隆方案。Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)。拓扑异构酶通过催化再连接反应连接载体与产物的相邻链(图17)。在其5’端用SSS构建的DNA片段于是高效、正确地插入TOPO SSS克隆载体内。
如对转化宿主细胞的多个菌落的测序所示，含有5’SSS的DNA片段的定向插入以大于90％的频率发生。在本实施例中，含有GeneStorm ORF的TOPO SSS克隆载体与转化感受态大肠杆菌宿主细胞一起温育。在74次转化反应中，在挑取的8个菌落的至少7个中发生ORF向TOPO SSS克隆载体内的定向克隆，在挑取的所有8个菌落中，这些克隆反应的59个是定向的。总定向克隆得分为609和656，因此，在93％以上的挑取的克隆中存在定向插入(见表1)。
表1.利用TOPO SSS克隆载体的ORF的定向克隆
    阳性菌落，dPCR反应     检测的克隆数
    8/8     59
    7/8     15
    6/8     2
    5/8     1
    4/8     3
    3/8     2
实施例7
报道基因的定向克隆
在一个类似的实施例中，利用上述修饰的pCR2.1 TOPO SSS载体，PCR产生的编码报道分子绿色荧光蛋白(GFP)的基因的ORF与载体中存在的lacZ片段框内定向克隆。用来扩增GFP基因的引物含有必需的SSS互补序列5’-ATTC-3’，和翻译起始甲硫氨酸的已知序列5’-ATG-3’。利用上述必需的克隆步骤，将PCR扩增的GFP插入该载体内，转化的细胞在固体琼脂平板上生长。生长的菌落代表正确插入的PCR产物(见表2)。
表2.GFP向修饰pCR2.1 TOPO SSS克隆载体内的框内和定向插入
   PCR产物的5’序列     正确插入片段的百分数     白色菌落总数
   5’-ATTCATG-3’(同源的)     86％     457
   5’-CAAGATG-3’(不同源的)     35％     118
   5’-ATTCGGATG-3’(移码)     0％     268
   单独的载体     0％     31
这些数据表明比现有克隆技术有较大提高，而且本发明的克隆与高通量技术高度相容。如果定向克隆效率高于90％，使用者只需要为克隆的每个DNA片段选择两个菌落。因此，在96孔板上，能为定向插入选择48个不同的克隆，这比现有的克隆技术高400％。应用本发明将使多种高通量基因表达操作流程化，并且可使其以当前成本的一小部分运行。
实施例8
平端PCR产物向进入载体内的定向拓扑异构酶克隆
概述
在其它实施方案中，本发明的组合物、试剂盒和方法将高效的5分钟克隆策略(“TOPO克隆”；Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)与向载体内定向克隆平端PCR产物结合起来，以进入本发明的重组克隆系统(例如可从Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA获得的GATEWAYTM系统)。利用本发明的这种克隆策略，平端PCR产物以90％以上的效率定向克隆，而不需要连接酶、PCR后程序或限制性内切酶。
为了在与GATEWAYTM目标载体重组后最佳表达PCR产物，可以使用任何合适的表达载体。例子包括但不限于可以从商业途径获得的pENTR定向TOPO载体(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)，它们具有许多优点，包括：
  载体 优点
  pENTR/D-topO ●在与GATEWAYTM目标载体重组后高效表达目的基因
  pENTR/SD/D-topO ●含有T7基因10翻译增强子和核糖体结合位点，以在与原核GATEWAYTM目标载体重组后最佳表达天然蛋白质●也适于在与合适的GATEWAYTM目标载体重组后，在其它宿主细胞系统(例如哺乳动物、昆虫、酵母)中高效表达目的基因
这些pENTR/D-TOPO和pENTR/SD/D-TOPO载体用来促进平端PCR产物的快速、定向TOPO克隆，以进入GATEWAYTM系统。这些载体的特征包括：
●用于进入克隆与GATEWAYTM目标载体位点特异性重组的attL1和attL2位点；
●用于平端PCR产物的快速、高效定向克隆的定向TOPO克隆位点；
●用来阻止目的PCR产物在大肠杆菌中基本表达的rrnB转录终止序列；
●用于在大肠杆菌中筛选的卡那霉素抗性基因；
●用于质粒在大肠杆菌中高拷贝复制和保持的pUC起点；和
●用于PCR产物在原核系统(单独的pENTR/SD/D-TOPO)中高效翻译的T7基因10翻译增强子和核糖体结合位点。
利用这些pENTR定向TOPO载体结合本发明的GATEWAYTM重组克隆系统，平端PCR产物所含的目的基因可以通过下列几个简单步骤表达：
1.将平端PCR产物克隆(在此处所述的“TOPO克隆”步骤中使用拓扑异构酶)入上述pENTR TOPO载体之一内，产生一种进入克隆；
2.通过在该进入克隆与选择的GATEWAYTM目标载体(如本文其它部分所述)之间进行重组反应产生一种表达构建体；和
3.将表达构建体导入合适的宿主细胞(例如细菌、哺乳动物、酵母、昆虫或其它合适的宿主细胞，其选择取决于为生产上述表达构建体而选择的特定目标载体)中，并利用适于特定宿主细胞系统的表达条件表达PCR产物上(现在包含于表达构建体上)目的基因编码的重组蛋白。
定向TOPO克隆
来自痘苗病毒的拓扑异构酶I可在特定位点(CCCTT)结合双链DNA，并切割一条链中的磷酸二酯骨架(Shuman，1991)。断裂的磷酸二酯骨架产生的能量通过在切割链的3’磷酸与拓扑异构酶I的酪氨酸残基(Tyr-274)之间形成共价键而保留。随后可用最初切割的链的5’羟基攻击DNA与酶之间的磷酸-酪氨酰键，逆转反应，释放拓扑异构酶(Shuman，1994)。TOPO克隆利用该反应高效克隆PCR产物。
通过向引入的DNA上添加一个3’单链末端(突出端)，用含有TOPO的寡核苷酸进行双链DNA的定向连接(Cheng和Shuman，2000)。这种单链突出端与含有TOPO的DNA片段的5’端相同。通过本发明，通过向含有TOPO的DNA上添加4个核苷酸的突出序列，并使之成为“完整载体”形式，改进该方法。
在该系统中，通过向正向引物中添加4个碱基(CACC)定向克隆PCR产物。克隆载体中的突出端(GTGG)侵入PCR产物的5’端，与添加的碱基退火，并以正确方向稳定PCR产物。插入片段能以等于或高于90％的效率以正确方向克隆。
方法
设计PCR引物。用来扩增目的基因的PCR引物的设计对于表达非常重要。根据使用的pENTR TOPO载体，在PCR引物的设计中必须记住几个因素，包括：
●利于定向克隆所需的序列；
●PCR产物适当翻译起始所需的序列；和
●在进入克隆与GATEWAYTM目标载体重组后，PCR产物是否与N端或C端标记框内融合。
设计正向PCR引物的原则。在设计正向PCR引物时，必须考虑下面几点。
为了能够定向克隆，正向PCR引物必须在引物的5’端含有序列CACC。在每个pENTR TOPO载体中，4个核苷酸CACC与突出序列GTGG碱基配对。
如果要在哺乳动物细胞中表达PCR产物(在进入克隆与GATEWAYTM目标载体重组后)，目的序列必须包含Kozak翻译起始序列，后者含有翻译适当起始所需的ATG起始密码子(Kozak，1987；Kozak，1991；Kozak，1990)。Kozak共有序列的一个例子是(G/A)NN ATGG。其它序列也是可能的，但是位点-3处的G或A和位点+4处的G对于功能而言是最重要的(以黑体显示)。ATG起始密码子以下划线显示。注意：如果目的序列在Kozak序列内不含起始密码子，可以设计正向PCR引物，使其在引物的5’端含有Kozak序列(见下文)。
如果要在原核细胞中表达不含N端融合标记的PCR产物(在进入克隆与GATEWAYTM目标载体重组后)，PCR产物应当TOPO克隆到pENTR/SD/D-TOPO进入载体内。如上所述，为了使PCR产物能够在大肠杆菌中高效翻译，pENTR/SD/D-TOPO含有一个T7基因10翻译增强子和一个核糖体结合位点(RBS)。为了确保适当翻译的最佳间隔，正向PCR引物应当设计为，PCR产物的ATG起始密码子直接位于定向克隆所需的CACC之后(见下文)。
正向引物设计的实例。以下为理论蛋白质的N端的DNA序列和提出的相应正向PCR引物的序列。ATG起始密码子以下划线标出。
DNA序列：5′-ATG GA TCT GAT AAA
               G
提出的正向CPR引物：
Figure A0182253901721
如果正向PCR引物如上所述设计，则(a)ATG起始密码子位于Kozak序列内(见框出的序列)，允许PCR产物在哺乳动物细胞中适当开始翻译(注意，5’CACC突出端之后的PCR产物的前三个碱基对构成一个功能密码子)；和(b)ATG起始密码子与RBS适当隔开(只在pENTR/SD/D-TOPO中)，允许PCR产物在原核细胞中适当翻译。
设计反向引物的原则。在设计反向PCR引物时，考虑以下几点。关于pENTR/D-TOPO和pENTR/SD/D-TOPO的TOPO克隆位点的图示，分别见图26和27。
为了确保PCR产物高效定向克隆，反向PCR引物必须不与5’端的突出序列互补。一个碱基对的错配能够将定向克隆效率从90％降低为50％，而提高ORF以相反方向克隆的可能性(见下文中的“实施例A”)。我们还没有发现由于两个碱基对的错配，PCR产物以相反方向克隆的证据。
如果PCR产物与C端标记框内融合(在进入克隆与GATEWAYTM目标载体重组后)，应当设计反向PCR引物，以除去目的基因中的天然终止密码子(见下文中的“实施例B”)。
如果PCR产物不与C端标记框内融合(在进入克隆与GATEWAYTM目标载体重组后)，反向引物中应当包含含有终止密码子的天然序列，或者应当确保终止密码子位于反向PCR引物结合位点的上游(见下文中的“实施例B”)。
反向引物设计的实施例A。以下是理论蛋白质的C端的序列。该蛋白质应当与C端标记框内融合(在进入克隆与GATEWAYTM目标载体重组后)。终止密码子以下划线标出。
DNA序列：AAG TCG GAG CAC TCG ACG ACG GTG  TAG-3’
一个方法是设计反向PCR引物，恰好从终止密码子上游的密码子开始，但是最后两个密码子含有GTGG(以下划线标出)，它与4bp突出序列相同。结果，反向引物将与4bp突出序列互补，从而提高了PCR产物以相反方向克隆的可能性。这种情况应当避免。
DNA序列：AAG TCG GAG CAC TCG ACG AC G GTG IAG-3’
提出的反向PCR引物序列：TG AGC TGC TG C CAC AAA-5’
另一个方案是设计反向引物，使其恰好在终止密码子下游杂交，但仍包含ORF的C末端。注意终止密码子不需要替换为一种无害氨基酸如甘氨酸、丙氨酸或赖氨酸的密码子。
反向引物设计的实施例B。以下是理论蛋白质的C末端的序列。终止密码子以下划线标出。
... GCG GTT A AG TCG GAG CAC TCG ACG ACT GCATAG-3’
为了使ORF与C端标记(重组后目标载体所含的)框内融合，从与最后一个密码子(TGC)和连续上游同源的核苷酸开始，除去终止密码子。反向引物是：
5’-TGC AGT CGT CGA GTG CTC CGA CTT-3’
这将扩增不含终止密码子的C端，并且使ORF与C端标记框内连接。如果不希望ORF与C端标记框内连接，反向引物应当简单地设计为包含终止密码子：
5’- CTA TGC AGT CGT CGA GTG CTC CGA CTT-3’
重要：必须记住，pENTR TOPO载体接受平端PCR产物。应当不向PCR引物中添加5’磷酸，因为这将阻止连接入pENTR TOPO载体内。另外，建议在使用前凝胶纯化寡核苷酸，特别是在它们较长时(＞30个核苷酸)。
生产平端PCR产物
一旦选定PCR策略并且根据上述原则合成引物，即能够生产平端PCR产物。任何热稳定的校读聚合酶都可以用于该目的，包括用于PCR的ThermalAceTM、PLATINUM、Pfx、Pfu或Vent。为了生产平端PCR产物，应当按照聚合酶生产厂商的说明和推荐。为了生产单个不连续的PCR产物，优化PCR条件是重要的。也推荐根据下文所述方法凝胶纯化PCR片段。
生产PCR产物
为了通过PCR生产扩增产物，利用下列原则建立25μl或50μlPCR反应混合物：
按照所用DNA聚合酶的使用说明书。
使用适用于引物和模板的循环参数。
为了确保所有PCR产物完全延伸，使用7-30分钟终延伸。
循环后，试管应置于冰上，或贮存于-20℃下最高达2周。
PCR产物的证实
为了证实PCR产物的质量和数量，从每个PCR反应体系中取出5μl-10μl，通过琼脂糖凝胶电泳如下分析：
正确大小的单个不连续带的百分比。如果没有单个不连续带，参考厂商推荐优化使用所选聚合酶的PCR反应。此外，也可以凝胶纯化希望的产物(见下文)。
估计PCR产物的浓度。对于TOPO克隆，推荐PCR产物与TOPO载体的摩尔比为5∶1，以获得最高克隆效率。例如，在TOPO克隆反应中可以使用20ng 500bp PCR产物或10ng 1000bp PCR产物。在进行TOPO克隆之前可能需要调节PCR产物的浓度。
注意：如果使用ThermalAceTM聚合酶生产平端PCR产物，应当注意ThermalAceTM能比其它校读聚合酶有更高的产量。当生产0.5-1.0kb的PCR产物时，我们通常在TOPO克隆反应之前用1×ThermalAceTM缓冲液1∶5稀释PCR反应体系。对于大于1.0kb的PCR产物，可能不需要稀释。
建立TOPO克隆反应
引言
一旦产生希望的PCR产物，即准备将其TOPO克隆到pENTRTOPO载体内，并用重组载体转化TOP10大肠杆菌。为了确保能够获得最佳的可能的结果，具有需要建立的和准备使用的一切是重要的。我们建议在开始前阅读题目为“建立TOPO克隆反应”(10-11页)和“转化OneShotTOP10感受态细胞”(12-14页)的部分。如果这是你第一次进行TOPO克隆，用你的样品平行进行22-24页的对照反应。
如果以HTP形式进行TOPO克隆(见下文)，你可以用BulkTOP10细胞(500反应试剂盒)或MultiShotTM TOP10细胞(480反应试剂盒)转化TOP10大肠杆菌。根据你使用哪种试剂盒，参见15-16页或17-18页的TOPO克隆和转化方法。
注意：最近的实验证实，在TOPO克隆反应中包含盐(200mMNaCl，10mM MgCl2)可使转化子数量增多。根据这些结果，我们推荐向TOPO克隆反应体系中添加盐。为此在试剂盒中包含贮存盐溶液。请注意向TOPO克隆反应体系中添加的盐的量随计划转化化学感受态细胞(提供)还是电感受态细胞(分类信息见X页)而不同。为此提供两种不同的TOPO克隆反应，以帮助你获得最佳的可能的结果。请仔细阅读下列信息。
转化化学感受态大肠杆菌
为了TOPO克隆和转化化学感受态大肠杆菌，向TOPO克隆反应体系中添加终浓度为200mM NaCl、10mM MgCl2的氯化钠和氯化镁，这可增加菌落数。用盐溶液(1.2M NaCl，0.06M MgCl2)调节TOPO克隆反应体系至推荐的NaCl和MgCl2浓度。
转化电感受态大肠杆菌
为了TOPO克隆和转化电感受态大肠杆菌，在TOPO克隆反应体系中也可包含盐，但是为了防止在电穿孔时形成电弧，盐的含量必须降低至50mM NaCl和2.5mM MgCl2。用水将盐溶液稀释4倍，制备300mM NaCl、15mM MgCl2溶液，以方便添加到TOPO克隆反应体系中。
建立TOPO克隆反应体系
下表描述了如何建立最终用于转化化学感受态OneShotTOP10大肠杆菌(提供)或电感受态大肠杆菌的TOPO克隆反应体系(6μl)。关于根据需要优化TOPO克隆反应体系的其它信息可见第21页。如果用ThermalAceTM聚合酶生产PCR产物，请注意可能需要在继续前稀释PCR反应体系(见第9页)。
注意：TOPO载体溶液的蓝色是正常的，用来显示该溶液。
表3.建立TOPO克隆反应混合物
    试剂*     化学感受态大肠杆菌     电感受态大肠杆菌
    新PCR产物     0.5-4μl     0.5-4μl
    盐溶液     1μl     --
    稀释盐溶液(1∶4)     --     1μl
    无菌水     加至终体积为5μl     加至终体积为5μl
    topO载体     1μl     1μl
*完成后所有试剂贮存于-20℃。盐溶液和水能够在室温或4℃下贮存。
进行TOPO克隆反应
轻轻混合反应体系，在室温(22-23℃)下温育5分钟。
注意：对于大多数用途而言，5分钟可产生足以用于分析的菌落。根据需要，TOP011克隆反应的时间可为30秒-30分钟。对于PCR产物的常规亚克隆，30秒可能是足够的。对于较大的PCR产物(＞1kb)，或者如果要TOPO克隆大量PCR产物，提高反应时间可以产生更多的菌落。
将反应体系置于冰上，继续转化One Shot7 TOP10感受态细胞，见下页。注意：你必须在-20℃下贮存TOPO7克隆反应体系过夜。
转化One ShotTOP10感受态细胞
引言
完成TOPO克隆反应后，用pENTR TOPO构建体转化感受态大肠杆菌。20反应试剂盒中包含One ShotTOP10化学感受态大肠杆菌(Box 2)细胞，其有利于转化，然而，你也可以转化电感受态细胞(分类信息见第X页)。本节提供了转化化学感受态或电感受态大肠杆菌的方法。
使用者提供的材料
除了普通微生物学用品(即平板、涂布器)外，还需要下列试剂和设备。
(a)42℃水浴(或带有容器的电穿孔器，任选)
(b)含有50μg/ml卡那霉素的LB平板(每次转化两个)
(c)37℃振摇和非振摇孵箱
插入片段的存在不用蓝-白筛选。大多数转化子含有重组质粒，质粒中含有以正确方向克隆的目的PCR产物。试剂盒中包含测序引物，用来测序多克隆位点中的插入片段，以证实方向和阅读框。
转化的准备
对于每次转化，需要一瓶感受态细胞和两个选择平板。
平衡水浴至42℃(用于化学转化)，或者，如果使用电感受态大肠杆菌，设置电穿孔器。
对于电穿孔，将一小部分盐溶液稀释4倍，制备稀释盐溶液(例如向150无菌水中添加5μl盐溶液)。
加温来自Box 2的SOC培养基瓶至室温。
在37℃下加温含有50μg/ml卡那霉素的LB平板30分钟。
每次转化在冰上融化一瓶来自Box 2的One ShotTOP10细胞。
重要：请注意定向TOPO克隆通常产生比传统双向TOPO TA克隆少5-10倍的菌落。当定向TOPO克隆750bp的待测插入片段时，利用第22-23页的方案，我们一般获得1800-3000个菌落。尽管获得较少的菌落总数，但是90％以上的菌落将含有以正确方向含有PCR插入片段的质粒。
One ShotTOP10化学转化方案
1.向一小瓶One ShotTOP10化学感受态大肠杆菌中添加2μl来自进行TOPO克隆反应第2步(第11页)的TOPO克隆反应液，并轻轻混合。不要通过上下移液混合。
2.在冰上温育5-30分钟。
注意：在冰上温育较长时间似乎对转化率有很小的影响。温育时间长度由使用者决定。
3.在42℃下不加振摇地热休克细胞30秒。
4.立即将试管转移到冰上。
5.添加250μl室温SOC培养基。
6.盖紧试管，在37℃下水平振摇试管(200rpm)30分钟。
7.每次转化50-200μl涂布于预温的选择平板上，在37℃下温育过夜。我们推荐用两个不同的体积涂板，以确保至少一个平板含有间隔良好的菌落。
8.高效的TOPO7克隆反应可以产生几百个菌落。挑取～5个菌落进行分析(见分析转化子，第19页)。
通过电穿孔转化
为了避免产生电弧，只使用电感受态细胞进行电穿孔。不要使用One ShotTOP10化学感受态细胞进行电穿孔。
1.向含有50μl电感受态大肠杆菌的0.1cm小杯中添加2μl来自进行TOPO克隆反应第2步(第11页)的TOPO克隆反应液，并轻轻混合。不要通过上下移液混合。避免形成气泡。
2.利用你自己的方案和电穿孔仪电穿孔样品。
注意：如果有电弧问题，见下。
3.立即添加250μl室温SOC培养基。
4.将溶液转移到15ml snap-cap管(即Falcon)中，在37℃下振摇至少1小时，使卡那霉素抗性基因表达。
5.每次转化20-100μl涂布预温的选择平板，在37℃下温育过夜。为了确保小体积的均匀涂布，添加20μl SOC。我们推荐用两个不同体积涂板，以确保至少一个平板含有间隔良好的菌落。
6.高效的TOPO7克隆反应可以产生几百个菌落。挑取～5个菌落进行分析(见分析转化子，第19页)。
在TOPO克隆反应体系中添加稀释盐溶液使TOPO克隆反应体系中的NaCl和MgCl2的终浓度分别达到50mM和2.5mM。为了防止在电穿孔中样品发生电弧，细胞体积应当为50-80μl(0.1cm小杯)或100-200μl(0.2cm小杯)。
如果在转化过程中发生电弧，尝试下列建议之一：
将通常用来为电穿孔仪充电的电压降低10％
通过将负荷电阻降低至100ohms降低脉冲长度
在电穿孔前乙醇沉淀TOPO克隆反应液，并重悬浮于水中。
高通量应用
为了生产用于高通量(HTP)用途的GATEWAYTM进入克隆，特别设计480和500反应pENTR和pENTR/SD定向TOPO克隆试剂盒。在这些试剂盒中，含有大批pENTR TOPO载体，以选择的两种形式提供化学感受态TOP10大肠杆菌：
以5ml等份大批提供细胞，以将细胞从无菌槽简单地转移到含有TOPO7克隆反应液的96孔板中(目录号K2400-500和K2420-500)。
细胞在96孔板中预等分(在12孔stripwell中)，以向细胞中添加TOPO7克隆反应液(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA；目录号K2400-480和K2420-480)。
利用大批细胞的HTP TOPO克隆和转化
描述
在该方案中，在96孔U形底聚苯乙烯平板(Costar，目录号3366，330μl/孔)中建立TOPO克隆反应体系，TOP10感受态细胞置于槽中以便于分散。
开始前
在冰上冷却96孔金属加热单元(VWR，目录号13259-260)直到该单元变冷。
使小瓶SOC达到室温。
将加热单元或含有96孔金属单元的热循环仪预加热到42℃。
注意：也能使用水浴，但是小心不要污染细胞。
●在冰上融化1试管(5ml)TOP10化学感受态大肠杆菌(30-60分钟)。
●将含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板加温到37℃。如果计划包含pUC19对照以检测细胞的转化率，需要含有50-100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板。
对照：为方便起见，提供50μl等份感受态细胞以进行测试TOPO克隆和转化反应。另外，也能够包含pUC19质粒作为内部对照(见下文的程序)。
程序
1.在每孔中如下建立6μl TOPO克隆反应体系。如果包含pUC19作为对照，使2-3孔为空。
PCR产物                  1μl
盐溶液                   1μl
无菌水                   3μl
pENTR TOPO             1μl
终体积                   6μl
2.室温温育5-10分钟。
3.将96孔板置于冷却单元上5分钟。
4.如果包含pUC19，向2-3个空孔中添加1μl(10pg)质粒。
5.将融化的TOP10大肠杆菌倾倒入无菌槽中，立即分散45μl/孔。轻轻上下移液1-2次混合。
6.用Parafilm覆盖平板，在冷却的单元上温育20分钟。
7.将平板转移到预温的加热单元上或热循环仪上，细胞在42℃下热休克30秒。
8.将平板转移回冷却单元，按压，以确保平板与冷却单元完全接触。温育1分钟。
9.移去Parafilm，添加150μl/孔SOC。
10.重新覆盖平板，平板在37℃下温育1小时。
注意：轻轻振摇(125rpm)是任选的。
11.每孔50μl涂布于含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板上。对于pUC19质粒，将10μl转化混合液加20μl SOC涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上。在37℃下温育过夜。
12.次日，选择5-10个菌落，如希望地处理。
太多菌落
如果获得太多的菌落，减少涂布的细菌培养液的量，和/或用其它SOC稀释转化液。
利用MultiShotTM细胞的HTP TOPO克隆和转化
描述
在该方案中，在96孔板中建立TOPO克隆反应，并将2μl转移到每孔含有15μl化学感受态TOP10大肠杆菌的96孔MultiShotTM平板上。
开始前
●在冰上冷却两个96孔金属加热单元(VWR，目录号13259-260)，直到单元变冷。
●使一小瓶SOC至室温。
●将含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板加温到37℃。如果计划包含pUC19对照来检测细胞的转化率，需要含有50-100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板。
●将加热单元或含有96孔金属单元的热循环仪预加热到42℃。
●注意：也能使用水浴，但是小心不要污染细胞。
●如果使用热循环仪，机器编程保持在42℃。
对照：检测平板包括一排(12孔)TOP10细胞，以进行测试TOPO克隆反应和转化。另外，也能够包含pUC19质粒作为内部对照(见下文的程序)。
程序
1.在96孔平板中，在每孔中建立下列6μl TOPO克隆反应体系。
PCR产物                 1μl
盐溶液                  1μl
无菌水                  3μl
pENTR TOPO            1μl
终体积                  6μl
2.室温温育5-10分钟。
3.将96孔板置于冷却单元上5分钟。
4.从冰箱中取出96孔MultiShotTM平板化学感受态TOP10大肠杆菌，置于第二个冷却单元中。细胞应当在30秒内融化。
5.小心除去铝箔封口。
6.使用多通道移液器向含有细胞的96孔平板中每孔添加2μl每种TOPO克隆反应液(～3.3ng)。为获得均一的结果，体积保持在约2μl。对于pUC19对照，添加1μl(10pg)DNA。
7.用提供的塑料盖覆盖细胞，在冷却单元中温育细胞和DNA 20分钟。
8.将细胞平板转移到预温的加热单元上或热循环仪上，在42℃下热休克30秒。
9.将细胞平板转移回冷却单元，将平板按压到单元内，使平板冷却1分钟。
10.移去塑料盖，向每孔中添加90μl SOC。
11.平板加盖，在37℃下温育1小时。注意：轻轻振摇(125rpm)是任选的。
12.每孔100μl涂布于含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板上。对于pUC19对照，将10μl转化混合液加20μl SOC涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上。在37℃下温育过夜。
注意：如果获得太多的菌落，可以减少平板接种的细胞量，或在向细胞中添加反应液之前用无菌水或TE缓冲液稀释TOPO克隆反应液。
分析转化子
分析阳性克隆
1.挑取5个菌落，在含有50-100μg/ml卡那霉素的LB或SOB培养基中培养过夜。
2.用选择的方法分离质粒DNA。如果需要超纯的质粒DNA进行自动或手工测序，我们推荐使用S.N.A.P.J MidiPrep试剂盒(目录号K1910-01)。
3.通过限制酶切分析分析质粒，以证实插入片段的存在和正确方向。使用限制性内切酶或酶的组合，在载体中酶切一次，在插入片段中酶切一次。
测序
你可以对你的构建体测序，以证实你的基因以正确方向克隆。试剂盒中包含M13正向引物(-20)和M13反向引物，以帮助测序插入片段。M13正向引物(-20)和M13反向引物也可分别从Invitrogen获得(分类信息见第X页)。
重要：如果你从Invitrogen Corporation的网站下载pENTR/D-TOPO或pENTR/SD/D-TOPO的序列(见此处图26和图27的描述)，注意突出序列(GTGG)显示已经与CACC杂交。没有DNA序列分析程序能使我们在没有互补序列的情况下显示突出端。
通过PCR分析转化子
你可以利用PCR分析阳性转化子。对于PCR引物，使用M13正向(-20)引物或M13反向引物和可在插入片段内杂交的引物的组合。你必须确定扩增条件。如果你是第一次使用该技术，我们推荐平行进行限制酶切分析。由于错误引发或模板污染，可能获得伪迹。
为了方便起见提供下列方案。其它方案也是合适的。
1.制备由PCR缓冲液、dNTP、引物和Taq聚合酶组成的PCR混合物。使用20μl反应体积。乘以分析的菌落数(例如5)。
2.挑取5个菌落，分别重悬浮于20μl PCR混合液中(记住制备复制平板，以保留菌落进一步分析)。
3.反应体系在94℃下温育10分钟裂解细胞，并灭活核酸酶。
4.扩增20-30个循环。
5.最后一次延伸在72℃下温育10分钟。贮存于-4℃。
6.通过琼脂糖凝胶电泳显示。
重要：如果有获得转化子或正确插入片段的问题，进行如第22-24页所述的对照反应。这些反应将帮助你解决实验中的问题。
长期保存
鉴定正确的克隆后，一定纯化菌落并制备甘油贮存液进行长期保存。我们推荐在-20℃下保存质粒DNA的贮存液。
1.将单菌落的原始菌落在含有50μg/ml卡那霉素的LB平板上划线。
2.分离单菌落，接种1-2ml含有50μg/ml卡那霉素的LB。
3.生长至培养达到稳定期。
4.混合0.85ml培养液与0.15ml无菌甘油，转移到冷藏瓶中。
5.贮存于-80℃。
重组进入构建体与目标载体
获得进入克隆后，可以重组pENTR TOPO构建体与选择的任何GATEWAYTM目标载体，产生一种表达克隆。这种“LR”重组反应由LR CLONASETM介导，后者是一种重组蛋白混合物。LR CLONASETM酶混合物可从Invitrogen Corporation(Carlsbad，CA)获得。在一些这样的方法中，例如，TOPO改造的载体与一种或多种核酸片段(例如一种或多种PCR产物)在室温(例如约20-30℃)下温育约5-30(优选地约10)分钟；通过在约80℃下温育约20分钟热处理该反应体系，然后按照厂商说明(Invitrogen Corporation)在标准LR反应中使用该反应混合物，不同之处在于LR反应的温育时间延长到约3小时。
优化TOPO克隆反应
加速克隆过程。TOPO克隆的高效率使人们能将克隆过程流程化。如果常规克隆PCR产物并希望加速该过程，考虑下列几点：
●只温育TOPO克隆反应体系30秒而不是5分钟。
你也许不能获得最高数量的菌落，但是具有较高的TOPO克隆效率，大多数转化子将含有你的插入片段。
●在向化学感受态细胞中添加3μl TOPO克隆反应液后，只在冰上温育5分钟。
温育时间延长到30分钟不会显著提高转化率。
获得更多的转化子。如果你TOPO克隆较大的PCR产物、毒性基因，或克隆一组PCR产物，你可能需要更多的转化子来获得希望的克隆。为了提高菌落数：
●温育添加盐的TOPO克隆反应液20-30分钟而不是5分钟。
延长添加盐的TOPO克隆反应的温育时间可使更多的分子连接，从而提高了转化率。添加盐似乎能防止拓扑异构酶I在连接PCR产物并从DNA上分离之后重新结合并切割DNA。
●滴定最大菌落产量时在TOPO7克隆反应中使用的PCR产物的量。
克隆稀释的PCR产物
为了克隆稀释的PCR产物，你可以：
●提高PCR产物的量
●温育TOPO克隆反应液20-30分钟
●浓缩PCR产物。
进行对照反应
引言
我们推荐进行下列对照TOPO克隆反应，首先使用20反应试剂盒帮助你评价结果。进行对照反应包括用试剂盒所含的试剂并直接使用TOPO克隆反应的产物生产一种对照PCR产物。
开始前
对于每次转化，准备两个含有50μg/ml卡那霉素的LB平板。
生产对照PCR产物
使用热稳定的、校读聚合酶和适当的缓冲液扩增对照PCR产物。根据所使用的聚合酶的厂商推荐。
1.为了生产750bp对照PCR产物，建立下列50μl PCR：
对照PCR模板(100ng)          1μl
10×PCR缓冲液(酶适当的)     5μl
dNTP混合液                         0.5μl
对照PCR引物(均为0.1μg/μl)        1μl
无菌水                             41.5μl
热稳定的聚合酶(1-2.5单位/μl)       1μl
终体积                             50μl
2.覆盖70μl(1滴)矿物油。
3.用下列循环参数扩增：
    阶段     时间     温度     循环
    最初的变性     2分钟     94℃     1×
    变性     1分钟     94℃     25×
    退火     1分钟     55℃
    延伸     1分钟     72℃
    最后的延伸     7分钟     72℃     1×
4.从反应体系中取出10μl，通过琼脂糖凝胶电泳分析。不连续的750bp带应当可见。继续对照TOPO7克隆反应，下页。
对照TOPO克隆反应
使用前页生产的对照PCR产物和pENTR TOPO载体，如下所述建立两个6μl的TOPO克隆反应。
1.建立对照TOPO克隆反应：
    试剂  “单独的载体” “载体+PCR插入片段”
    无菌水     4μl     3μl
    盐溶液或稀释盐溶液     1μl     1μl
    对照PCR产物     --     1μl
    pENTR topO载体     1μl     1μl
2.室温温育5分钟并置于冰上。
3.每次反应3μl转化不同小瓶的One ShotTOP10细胞(第13页)。
4.每次转化100-200μl混合液涂布含有50μg/ml卡那霉素的LB平板。一定用两种不同体积涂布，以确保至少一个平板含有间隔良好的菌落。
5.在37℃下温育过夜。
结果分析
载体+PCR插入反应应当产生上百个菌落。为了分析转化，分离质粒DNA，并用以下所列的适当限制性内切酶消化。下表列出了以正确方向或以反方向克隆的插入片段所见的消化模式(Jeanette：请填下表)。
  载体   限制性内切酶     预期的消化模式(bp)
  pENTR/D-topO     正确方向：反方向：空载体：
  pENTR/SD/D-topO     正确方向：反方向：空载体：
90％以上的菌落应当含有正确方向的750bp插入片段。
在仅含载体的反应中应当产生相对较少的菌落。
转化对照
为了检查One ShotTOP10感受态细胞的转化率，包含pUC19质粒。利用第13页的方案，用10pg pUC19转化一小瓶One ShotTOP10细胞。10μl转化混合液加20μl SOC涂布含有100μg/ml氨苄青霉素的LB平板。转化率应当为-1×109cfu/μg DNA。
影响克隆效率的因素
请注意下列变化将使克隆效率降低。其中大多数容易更正，但是如果克隆大的插入片段，你也许无法获得预期90％的定向克隆效率。
  变化 解决方案
  定向克隆率低 正向引物应当在5’端含有CACC
反向引物与5’端的突出端互补。为了避免与突出端碱基配对，重新设计引物。
  PCR扩增反应物pH＞9 检查PCR扩增反应的pH，并用1M Tris-HCl，pH8调节。
  PCR过程中不完全延伸 在PCR过程中务必包括最后7-30分钟的最后延伸步骤。较长的PCR产物需要较长的延伸时间。
  克隆大插入片段(＞1kb) 提高插入片段的量，或如第25-26页所述凝胶纯化。
  过量(或过度稀释)PCR产物 减少(或浓缩)PCR产物的量。
  PCR克隆伪迹(“假阳性”) topO克隆对于某些PCR反应中存在的小片段(＜100bp)非常有效。凝胶纯化PCR产物(第25-26页)或优化PCR。
凝胶纯化PCR产物
引言
成片的、多条带的、引物二聚体伪迹或大PCR产物(＞3kb)可能需要凝胶纯化。如果希望纯化PCR产物，要非常小心地除去所有核酸酶污染源。有多种分离DNA片段或除去寡核苷酸的方法。最常用的方法请参考《现代分子生物学方法》单元2.6(Ausubel等人，1994)。以下列出了3种简单方法。
注意：PCR产物的纯化(例如PCR产物过度稀释)可降低克隆效率。你可能希望优化PCR，以生产单个条带(参见生产平端PCR产物，第9页)。
使用S.N.A.P.TM凝胶纯化试剂盒
从Invitrogen获得的S.N.A.P.TM凝胶纯化试剂盒(目录号K1999-25)使你能从琼脂糖凝胶中快速纯化PCR产物。
1.在1-5％TAE琼脂糖凝胶上电泳扩增反应物。(注意：不要用TBE制备琼脂糖凝胶。硼酸盐可干扰碘化钠步骤，见下。)
2.切下含有PCR产物的凝胶片，在2倍体积的6M碘化钠溶液中65℃融化。
3.添加1.5倍体积的结合缓冲液。
4.将步骤3的溶液(一次不超过1ml)上样到S.N.A.P.TM柱上。在微量离心管中以3000×g离心1分钟，弃去上清液。
5.如果步骤3有剩余的溶液，重复步骤4。
6.添加900μl终洗涤缓冲液。
7.在微量离心管中全速离心1分钟，弃去tile流过液。
8.重复步骤7。
9.用40μl TE或无菌水洗脱纯化的PCR产物。TOPO克隆反应液使用4μl，如第11页所述继续。
快速S.N.A.P.TM法
一种更容易的方法是简单地切下含有PCR产物的凝胶片，将其置于S.N.A.P.TM柱床顶部，全速离心10秒种。在TOPO克隆反应(第11页)中使用1-2μl流过液。为获得最佳结果，一定制备尽可能小的凝胶片。
低熔点琼脂糖法
如果偏好使用低熔点琼脂糖，采用下列程序。请注意，凝胶纯化将导致PCR产物稀释和克隆效率可能降低。
1.在TAE缓冲液中在低熔点琼脂糖凝胶(0.8-1.2％)上尽电泳可能多的PCR反应液。
2.显示目的带并切下该带。
3.将凝胶片置于微量离心管中，在65℃下温育离心管直到凝胶片熔化。
4.将离心管置于37℃，使琼脂糖保持熔化状态。
5.如第11页所述，向TOPO克隆反应体系中添加4μl熔化的含PCR产物的琼脂糖。
6.TOPO克隆反应液在37℃下温育5-10分钟。使琼脂糖保持熔化状态。
7.利用第13页的方法，用2-4μl直接转化OneShotTOP10细胞。
注意：PCR产物的纯化可降低克隆效率。为了生产单个条带，你可以优化PCR。
实施例9
利用GATEWAYTM载体进行TOPO连接反应的反应条件的优化
为了与GATEWAY载体联合使用TOPO克隆方法，研究了结合反应的最佳条件。在进行这些研究时，解决了几个问题。
BP反应模板的充足，和TOPO反应成分对BP反应的抑制
为了解决这些问题，如本文其它部分所述利用TOPO工具生产attB1+CAT+attB2模板。然后进行第二次PCR，生产检测研究足够的模板，并用这些产物进行BP反应。该方法的每个步骤使用下列反应条件：
    topO连接反应：     BP反应：
    Xng PCR产物(见下文)1μl拓扑异构酶0.5μl 500mM Tris1μl 40mM NaCl37℃ 15min转化(化学)     2μl无盐缓冲液1μl topO连接产物0.5μl pDONR222(300ng/μl)2μl BP克隆酶(Invitrogen)室温25min→蛋白酶K处理
BP反应后，混合物化学转化化学感受态大肠杆菌细胞(例如TOPO10；Invitrogen Corporation)，细胞平板接种，测定重组率。
结果
    1     2     3    4     5     6
菌落     149     270     514    0     0     0
使用的模板     0.8ng     1.6ng     4ng    1.6ng     4ng     0ng
topO连接？     否     否     否    是     是     否
这些结果证实，TOPO工具产生足以以进行随后的BP反应的模板。另外，这些结果也证实TOPO连接抑制随后的BP反应。
attB1和attB2连接体的存在对BP反应的影响
在这部分研究中，检查了反应混合物中存在过量attB1和attB2连接体对随后的BP反应的影响。为了解决这一问题，向模板(attB1+CAT+attB2，20ng)中添加不同含量的attB1和attB2连接体，在标准条件下进行BP反应(室温下60分钟)。BP反应后，用混合物化学转化化学感受态大肠杆菌细胞(例如TOP10；InvitrogenCorporation)，细胞平板接种，测定重组率。
结果
  1   2   3   4   5   6
  连接体含量(ng)   20   10   5   2.5   1   0
  形成的菌落数   270   475   760   590   340   460
这些结果证实，过量attB1和attB2连接体的存在对转化效率没有显著影响，表明反应混合物中存在attB1和attB2连接体不显著影响BP反应。
TOPO连接反应体系中抑制剂的去除
为了确定在使用BP反应产物之前从TOPO连接反应体系中除去抑制剂的最佳方法，评估了多种处理方法。用下列反应混合物进行TOPO连接反应，在室温下温育5分钟：
 attB1+attB2(各20μg/μl)     2μl
 CAT(100ng/μl)     1.7μl
 attB1+CAT+attB2产物(10ng/μl)     1μl
 500mM Tris     0.5μl
 拓扑异构酶I(1μg/μl)     1μl
在TOPO连接反应后，在进行BP反应之前，在下列条件之一下处理反应混合物的7个不同样品：
(1)向一个反应中添加1μl 0.6％SDS+3mM EDTA，37℃ 15min；
(2)向4个反应中添加4μl 0.6％SDS+3mM EDTA，37℃ 15min，然后SNAP纯化至20μl水中；
(3)向4个反应中添加4μl 0.6％SDS+3mM EDTA+1μl蛋白酶K(2μg/μl)，37℃ 15min，然后SNAP纯化到20μl水中；
(4)向一个反应中添加0.8μl 2.5mM NaCl，37℃ 17min；
(5)向4个反应中添加3.2μl 2.5M NaCl，37℃ 15min，然后SNAP纯化到20μl水中；
(6)向4个反应中添加3.2μl 2.5M NaCl和1μl 2μg/μl蛋白酶K，37℃ 15min，然后SNAP纯化到20μl水中(阳性对照；使用0.8ng模板)；
(7)(阴性对照；不使用模板)。
用无盐缓冲液在室温下进行BP反应60分钟。对于未纯化的混合物，每10μl BP反应体系使用1μl TOPO连接反应混合物。对于纯化的混合物，每10μl BP反应体系使用5.5μl TOPO连接反应混合物。BP反应后，混合物化学转化化学感受态大肠杆菌细胞(例如TOPO10；Invitrogen Corporation)，细胞平板接种，测定重组率。
结果
1  2     3   4   5   6   7   8
处理 SDS  SDS     SDS   NaCl   NaCl   NaCl   (+)   (-)
蛋白酶K -  -     +   -   -   +
纯化 -  +     +   -   +   +
菌落数 6  515     400   0   550   657   179   0
这些结果证实：(1)对于有效地进行BP反应，纯化不是必需的；(2)为了使随后的BP反应达到最高效率，在TOPO连接反应后不需要用蛋白酶K处理反应混合物；(3)SDS处理和NaCl处理反应混合物产生相同的转化率(因此对BP反应有相同的影响)。
BP反应温度的优化
为了确定在TOPO连接后进行BP反应的最佳反应温度，用attB1+CAT+attB2 PCR产物作为模板，在不同温度下进行BP反应。BP反应后，混合物化学转化化学感受态大肠杆菌细胞(例如TOP10；Invitrogen Corporation)，细胞平板接种，测定重组率。
结果
  BP反应温度     42℃     37℃     室温     14℃
  菌落数(+模板)     3     337     588     195
  菌落数(无模板)     0     4     0     0
这些结果证实，室温(约20-25℃)是进行BP反应的最佳反应温度。
attB1：插入片段：attB2的摩尔比的优化
为了确定BP反应中attB1、插入片段和attB2模板的最佳摩尔比，这些模板以不同的摩尔比混合，BP反应在上述最佳条件下进行。在BP反应后，混合物化学转化化学感受态大肠杆菌细胞(例如TOP10；Invitrogen Corporation)，并平板接种，测定重组率。
结果
  attB1：插入片段：attB2比     2∶1∶2     1.5∶1∶1.5   1∶1∶1   1∶2∶1   0(对照)
  菌落数     81     93   165   154   9
这些结果证实，attB1：插入片段：attB2之比为1∶1∶1是进行BP反应最佳的。
盐对BP反应的影响的确定
为了确定BP反应溶液存在盐是否影响重组率，在无盐缓冲液中或者在含有盐的标准BP反应缓冲液中进行BP反应。
结果(形成的菌落数)
    缓冲盐     -     +
    +模板     108     109
    -模板(阴性对照)     1     0
这些结果证实，在BP反应过程中，反应缓冲液中含有或不含盐对重组效率没有影响。
TOPO连接反应的最佳次数的确定
在下一系列的实验中，检查了一次TOPO连接反应是否足以为纯化后的BP反应提供最佳重组率这一问题。用下列反应混合物进行一次TOPO连接反应：
attB1和attB2(各20ng/μl)      0.5μl
CAT(100ng/μl)                1.7μl
500mM Tris                    0.5μl
拓扑异构酶(1μg/μl)          1μl
dH2O                          足以使终体积达到5μl
反应混合物在37℃下温育15分钟，然后添加1μl 0.6％SDS+3mM EDTA；混合物在37℃下温育15分钟，然后用SNAP柱(见上文)纯化到20μl水中。然后用如下TOPO连接反应的产物进行BP反应：
标准BP反应缓冲液              2μl
pDONR222(300ng/μl)           0.5μl
TOPO连接产物(来自上面)        5.5μl
BP克隆酶                      2μl
反应混合物在室温下温育60分钟，然后添加1μl 2μg/μl蛋白酶K；混合物在37℃下温育15分钟，然后在75℃下15分钟。然后用4μl反应混合物化学转化化学感受态大肠杆菌细胞(例如TOP10；Invitrogen Corporation)，细胞平板接种，测定重组率。
结果(形成的菌落数)
    +模板     -模板(阴性对照)
    188     0
这些结果证实，一次TOPO连接反应可提供足以进行有效BP反应的模板。
纯化方法的优化
也进行实验，来确定SNAP纯化柱(Invitrogen Corporation)或CONCERT纯化系统(Invitrogen Corporation)在为TOPO连接后进行BP反应提供最佳纯化模板上是否不同。TOPO连接反应和BP反应如上所述进行，不同之处在于一些样品用SNAP柱纯化，而其它样品在进行TOPO连接反应后用CONCERT质粒纯化系统纯化。纯化的样品然后进行标准BP反应，通过化学转化或电穿孔用反应混合物进行转化。转化后，细胞平板接种，以确定重组率。
结果(形成的菌落数)
    转化方法     SNAP    CONCERT   无模板(阴性对照)
    化学     188    254   0
    电穿孔     8220    11460   672
这些结果证实，SNAP和CONCERT纯化系统都很好地为TOPO连接反应后的BP反应提供纯化的模板。
最佳条件
根据综合上述实验结果，确定组合TOPO连接-Gateway反应的最佳条件如下：
(1)TOPO连接反应
(a)attB1/插入片段摩尔比为1∶1，5μl反应体积
(b)在37℃下温育15分钟
(c)添加1μl 0.6％ SDS+3mM EDTA；在37℃下温育15分钟
(d)用SNAP柱或CONCERT系统纯化到20μl水中
(2)BP反应
(a)制备反应混合物：
(i)纯化的TOPO连接产物      5.5μl
(ii)标准BP反应缓冲液       2μl
(iii)pDONR222(30ng/μl)    0.5μl
(iv)BP克隆酶               2μl
(b)室温温育反应混合物60分钟；
(c)添加1μl 2μg/μl蛋白酶K；
(d)在37℃下温育15分钟；
(e)在75℃下温育15分钟；
(3)转化
(a)使用BP反应的2-4μl反应混合物，进行化学转化或电穿孔。
为了证实这些优化条件的效率，用经历TOPO连接及随后的BP反应的不同大小的CAT和lacZ插入片段进行实验，随后转化和平板接种。
结果
化学转化
插入片段 CAT  lacZ(1kb)  lacZ(1.5kb)  lacZ(2kb)  lacZ(3.2kb) 无
菌落数 188  180  182  177  71  3
正确大小的克隆 10/10  18/18  16/16  17/18  18/18  --
电转化
插入片段 CAT  lacZ(1kb)  lacZ(1.5kb)  lacZ(2kb)  lacZ(3.2kb) 无
菌落数 8222  7335  7320  7500  6150  510
这些结果综合起来证实，对于不同大小插入片段进行的组合TOPO连接-Gateway反应而言，上述条件是最佳的。
实施例10
不需第二次PCR方法的哺乳动物表达盒的构建
目的元件和基因的制备
目的元件和基因的PCR扩增使用下列引物组(见下表4)和模板：
(a)引物组：序列#1和#2；模板：pcDNA 4/TetO。PCR产物：5’元件。
(b)引物组：序列#3和#4；模板：pcDNA 3.2/V5。PCR产物：3’元件。
(c)引物组：序列#5和#6；模板：pcDNA 3.1/CAT。PCR产物：CAT插入片段。
表4.用于构建表达盒的引物
  序列  #1  GTTGACATTGATTATTGACTAG
  序列  #2  GTTCCGAAGGGTTAACGCTAGAGTCCGGAGGC
  序列  #3  GACTCAAAGGGAAGGTAAGCCTATCCCTAAGG
  序列  #4  GCGCAGATCTGCTATGGCAG
  序列  #5  CGGAACAAGGGACCATGGAGAAAAAAATCACTGGATA
  序列  #6  TGAGTCAAGGGCGCCCCGCCCTGCTGCCACTCATCG
  序列  #7  GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCCTTC-GGAAC
  序列  #8  GTTCCGAAGGGAAGCCTGCTTTTTTGTACAAACTTGT-CCCC
  序列  #9  GACTCAAAGGGACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGT-CCCC
  序列  #10  GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCCTTTG-AGTC
  序列  #11  CACGACGTTGTAAAACGACG
  序列  #12  ATGTAATACGACTCACTATAGG
用Platinum Taq高保真DNA聚合酶(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)进行PCR。PCR条件如下：
    成分     体积     终浓度
    dH2O     35.5μl
    10mM dNTP混合物(各2.5mM)     4μl     各0.2mM
    10×高保真PCR缓冲液     5μl     1×
    50mM MgSO4     2μl     2mM
    引物1(100ng/μl)     1μl
    引物2(100ng/μl)     1μl
    模板(10ng/μl)     1μl
    Platinum Taq高保真(5U/μl)     0.5μl
94℃ 4min(1个循环)
94℃ 30sec→55℃ 30sec→68℃ 1min(30个循环)
68℃ 10min(1个循环)
4℃(完成)
利用下列条件纯化PCR产生的片段：
试剂：SNAP MiniPrep试剂盒(Invitrogen Corporation)。
步骤
(1)混合50μl PCR产物与150μl结合缓冲液。充分混合。
(2)添加350μl异丙醇。充分混合。
(3)样品上样到SNAP MiniPrep柱上。
(4)以14000rpm离心1分钟。弃去柱流过液。
(5)添加500μl洗涤缓冲液，以14000rpm离心1min。弃去柱流过液。
(6)添加700μl 1×终洗涤缓冲液，以14000rpm离心1min。弃去柱流过液。
(7)以14000离心1分钟干燥柱。
(8)将柱转移到新离心管中。向柱中加50μl dH2O。室温温育2-5min。以14000rpm离心1min。收集流过液。
(9)根据260nm下的紫外吸光度测定DNA浓度。
TOPO连接反应
为了用第二次PCR生产表达盒，使用下列连接条件：
5’元件(700bp)          75ng
3’元件(350bp)          35ng
500mM Tris(pH7.5)       0.5μl
拓扑异构酶(1μg/μl)    0.5μl
CAT插入片段(700bp)      150ng
dH2O                   足以使终体积达到5μl
该反应在室温下进行5-15min。用一半体积的反应物作为模板，用引物组序列#1和序列#4进行第二轮PCR。除了延伸时间为2min外，PCR条件与上述相同。PCR后，如上所述纯化DNA。纯化的DNA用于转染。
为了不用第二次PCR生产表达盒，使用下列连接条件：
5’元件(700bp)          510ng
3’元件(350bp)          230ng
500mM Tris(pH7.5)       1.5μl
拓扑异构酶(1μg/μl)    3μl
CAT插入片段(700bp)      450ng
dH2O                   足以使终体积达到5μl
该反应在37℃下进行15min。添加蛋白酶K至终浓度为50μg/ml，混合物在37℃下温育10min。处理的DNA准备用于转染。
基因表达研究
用3种细胞系(悬浮TRex-CHO、附着TRex-CHO和附着TRex-293细胞系)作为检测这些表达盒的模型细胞系。使用标准细胞培养方法。使用24孔细胞培养板。用Lipofectamine 2000作为转染试剂。转染24小时后，以1μg/ml的终浓度添加四环素。对照实验不添加四环素。细胞在裂解前再温育24小时。用Western印迹转移蛋白质，用抗-V5或抗-CAT抗体进行检测。
结果与讨论
本研究的目的是证实不需第二次PCR即可产生表达盒。在本研究中，我们比较了进行二次PCR步骤产生的表达盒的表达数据与不进行二次PCR步骤产生的表达盒获得的数据。对于二次PCR产生的表达盒，用约1.2μg/孔DNA转染24孔板。对于不进行二次PCR产生的表达盒，使用一次连接反应的产物(约1.2μg/孔)。检测数据表明，利用本发明的方法，不需第二次PCR步骤即可产生功能表达盒(图30)。
实施例11
利用Topo工具方法生产Gateway相容的表达盒
连接体的制备
等量序列#7和序列#8(见上表4)在40mM NaCl中混合，混合物在95℃下变性5min，缓慢冷却至室温，形成attB1连接体。等量序列#9和序列#10(见上表4)在40mM NaCl中混合，混合物在95℃下变性5min，缓慢冷却至室温，形成attB2连接体。
TOPO连接
如实施例10所述产生CAT插入片段。连接条件如上所述优化(参见实施例9和10)：
attB1连接体(40bp)       10ng
attB2连接体(40bp)       10ng
500mM Tris(pH7.5)       0.5μl
拓扑异构酶(1μg/μl)    1μl
CAT插入片段(700bp)      170ng
dH2O                    足以使终体积达到5μl
该反应在37℃下进行15min。添加SDS和EDTA至终浓度分别为0.1％和0.5mM。混合物在37℃下温育15min。
纯化
向处理的混合物中添加水(15μl)。用SNAP MiniPrep试剂盒(Invitrogen)纯化DNA。
步骤
(1)混合处理的产物与60μl结合缓冲液。充分混合。
(2)添加140μl异丙醇。充分混合。
(3)样品上样到SNAP MiniPrep柱上。
(4)以14000rpm离心1min。弃去柱流过液。
(5)添加500μl洗涤缓冲液，以14000rpm离心1min。弃去柱流过液。
(6)添加700μl 1×终洗涤缓冲液，以14000rpm离心1min。弃去柱流过液。
(7)以14000离心1min干燥柱。
(8)将柱转移到新离心管中。向柱上添加20μl dH2O。室温温育2-5min。以14000rpm离心1min。收集流过液。
BP反应
BP反应缓冲液              2μl
纯化的产物                5.5μl
pDONR222(300ng/μl)       0.5μl
BP克隆酶                  2μl
反应混合物在室温下温育60min，然后添加1μl蛋白酶K(2μg/μl)。为了灭活酶，混合物在37℃下温育15min，随后在75℃下15min。
转化
处理的混合物转化TOP10感受态细胞(化学)或电穿孔ElectroMax感受态细胞。细胞接种于LP-卡那霉素平板上，在37℃下温育过夜。计数菌落数。为了证实这些菌落中含有插入片段，我们设计了引物组(序列#11和#12)进行菌落PCR。如果存在插入片段，PCR产物将产生一条约700bp的带；然而，如果不含插入片段，PCR产物带的大小约为2.2kb。
结果与讨论
在本研究中，我们希望证实产生的含TOPO工具粘端的PCR产物能直接与attB1和attB2连接体连接。连接的产物能够直接在BP重组反应中使用，以产生GATEWAYTM进入克隆(表5)。
表5.BP反应产生的菌落
    转化类型     attB1-Cat-attB2     单独的载体
    化学     188     0
    电穿孔     8220     672
为了进一步证实这些菌落含有插入片段，我们挑取了18个阳性菌落和2个阴性菌落进行PCR。PCR结果显示，在检查的18个菌落中都含有正确大小的产物(图31)。
为了清楚地理解，本发明已经通过说明和实施例详细描述，本领域技术人员应当明白，在不影响本发明的范围或其任何特定实施方案的情况下，在广泛和相当范围的条件、制剂和其它参数内修改或改变，能够同样进行，而这些修改或改变也包含于附加的权利要求书的范围内。
下列共有的、共同未决的美国专利申请在此完整引用作为参考：2000年12月8日提交的美国临时申请号60/254,510；2000年12月11日提交的美国申请号09/732,914；2001年5月21日提交的美国临时申请号60/291,972；2001年9月14日提交的美国临时申请号60/318,902；2001年9月28日提交的美国临时申请号60/326,092。
本说明书中提到的所有公开文本、专利和专利申请都代表本发明所属领域技术人员的水平，在此引用作为参考。

Claims (45)

1.一种分离的核酸分子，其包含：(a)一个或多个重组位点；和(b)一个或多个拓扑异构酶识别位点和/或一个或多个拓扑异构酶。
2.权利要求1的核酸分子，其中该核酸分子是一种环状分子。
3.权利要求1的核酸分子，其中该核酸分子包含两个或多个重组位点。
4.权利要求3的核酸分子，其中至少这两个或多个重组位点之一位于该分子中拓扑异构酶识别位点的每一末端的侧翼。
5.权利要求1的核酸分子，其中该重组位点选自：
(a)attB位点，
(b)attP位点，
(c)attL位点，
(d)attR位点，
(e)lox位点，
(f)psi位点，
(g)dif位点，
(h)cer位点，
(i)frt位点，
和保留重组能力的(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)或(i)的重组位点的突变体、变体和衍生物。
6.权利要求1的核酸分子，其中该拓扑异构酶识别位点由一种I型拓扑异构酶识别并结合。
7.权利要求6的核酸分子，其中该I型拓扑异构酶是一种IB型拓扑异构酶。
8.权利要求7的核酸分子，其中该IB型拓扑异构酶选自真核生物核I型拓扑异构酶和痘病毒拓扑异构酶。
9.权利要求8的核酸分子，其中该痘病毒拓扑异构酶由选自下列的病毒产生或从中分离：痘苗病毒、兔纤维瘤病毒、ORF病毒、禽痘病毒、触染性软疣病毒和桑缘灯蛾昆虫痘病毒。
10.一种包含权利要求1的核酸分子的载体。
11.权利要求10的载体，其中该载体是一种表达载体。
12.一种载体，其选自：pcDNAGW-DT(sc)、pENTR-DT(sc)、pcDNA-DEST41、pENTR/D-TOPO、pENTR/SD/D-TOPO、pcDNA3.2/V5/GWD-TOPO和pcDNA6.2/V5/GWD-TOPO。
13.一种包含权利要求1的分离的核酸分子的宿主细胞。
14.一种包含权利要求10的载体的宿主细胞。
15.一种包含权利要求12的载体的宿主细胞。
16.一种体外克隆核酸分子的方法，包括：
(a)获得待克隆的第一种核酸分子；
(b)将待体外克隆的第一种核酸分子与第二核酸分子混合，该第二种核酸分子包含侧翼为至少一个第一重组位点的至少一个第一拓扑异构酶识别位点，侧翼为至少一个第二重组位点的至少一个第二拓扑异构酶识别位点，其中第一和第二重组位点彼此不重组，以及至少一种拓扑异构酶；和
(c)在能使待克隆的第一种核酸分子插入该第二种核酸分子的第一与第二拓扑异构酶识别位点之间的条件下，温育该混合物，从而产生在第一与第二重组位点之间包含待克隆的第一种核酸分子的第一种产物分子。
17.权利要求16的方法，其中该第二种核酸分子是一种载体。
18.权利要求16的方法，其中将要克隆的该第一种核酸分子是一种线性核酸分子。
19.权利要求18的方法，其中该线性核酸分子是一种平端核酸分子。
20.权利要求16的方法，其中将要克隆的该第一种核酸分子是一种PCR产物。
21.权利要求16的方法，其中将要克隆的该第一种核酸分子包含至少一个开放阅读框。
22.权利要求16的方法，其进一步包括：在有利于在第一与第三和第二与第四重组位点之间重组的条件下，将该第一种产物分子与至少一种第三种核酸分子接触，后者包含彼此不重组的至少一种第三和第四重组位点。
23.权利要求22的方法，其中第三种核酸分子是一种载体。
24.权利要求16的方法，其进一步包括向一种宿主细胞中插入该第一种产物分子。
25.权利要求17的方法，其进一步包括向一种宿主细胞中插入该第一种产物分子。
26.权利要求22的方法，其进一步包括向一种宿主细胞中插入该第二种产物分子。
27.权利要求23的方法，其进一步包括向一种宿主细胞中插入该第二种产物分子。
28.权利要求17的方法，其中该载体是一种表达载体。
29.权利要求23的方法，其中该载体是一种表达载体。
30.权利要求16的方法，其中该第二种核酸分子包含至少另外一种核酸序列，其选自：选择性标记、克隆位点、限制酶切位点、启动子、操纵基因、操纵子、复制起点和基因或部分基因。
31.权利要求22的方法，其中该第三种核酸分子包含至少另外一种核酸序列，其选自：选择性标记、克隆位点、限制酶切位点、启动子、操纵基因、操纵子、复制起点和基因或部分基因。
32.权利要求16的方法，其中该第一种和第二种重组位点选自：
(a)attB位点，
(b)attP位点，
(c)attL位点，
(d)attR位点，
(e)lox位点，
(f)psi位点，
(g)dif位点，
(h)cer位点，
(i)frt位点，
和保留重组能力的(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)或(i)的重组位点的突变体、变体和衍生物。
33.权利要求22的方法，其中该第三种和第四种重组位点选自：
(a)attB位点，
(b)attP位点，
(c)attL位点，
(d)attR位点，
(e)lox位点，
(f)psi位点，
(g)dif位点，
(h)cer位点，
(i)frt位点，
和保留重组能力的(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)或(i)的重组位点的突变体、变体和衍生物。
34.权利要求32的方法，其中该lox位点选自loxP位点和loxP511位点。
35.权利要求33的方法，其中该lox位点选自loxP位点和loxP511位点。
36.权利要求16的方法，其中该拓扑异构酶是一种I型拓扑异构酶。
37.权利要求36的方法，其中该I型拓扑异构酶是一种IB型拓扑异构酶。
38.权利要求37的核酸分子，其中该IB型拓扑异构酶选自真核生物核I型拓扑异构酶和痘病毒拓扑异构酶。
39.权利要求38的核酸分子，其中该痘病毒拓扑异构酶由选自下列的病毒产生或从中分离：痘苗病毒、兔纤维瘤病毒、ORF病毒、禽痘病毒、触染性软疣病毒和桑缘灯蛾昆虫痘病毒。
40.权利要求22的方法，其中该产物核酸分子与第三种核酸分子在至少一种重组蛋白存在下结合。
41.权利要求40的方法，其中该重组蛋白选自：
(a)Cre；
(b)Int；
(c)IHF；
(d)Xis；
(e)Fis；
(f)Hin；
(g)Gin；
(h)Cin；
(i)Tn3解离酶；
(j)TndX；
(k)XerC；和
(l)XerD。
42.权利要求40的方法，其中该重组蛋白是Cre。
43.权利要求40的方法，其中该重组蛋白选自Int、Xis、IHF和Fis。
44.一种包含权利要求1的分离的核酸分子的试剂盒。
45.权利要求44的试剂盒，其进一步包含一种或多种成分，其选自：一种或多种拓扑异构酶、一种或多种重组蛋白、一种或多种载体、一种或多种具有聚合酶活性的多肽，和一种或多种宿主细胞。
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