CN1292067C

CN1292067C - 植物中的一种乙烯应答转录辅激活物

Info

Publication number: CN1292067C
Application number: CN03803725.4A
Authority: CN
Inventors: 山崎健一; 广濑进
Original assignee: Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2002-02-12
Filing date: 2003-02-06
Publication date: 2006-12-27
Anticipated expiration: 2023-02-06
Also published as: US7238857B2; JP3848173B2; WO2003068972A1; CN1630725A; JP2003235567A; US20050132443A1

Abstract

本发明的目的是在乙烯应答转录因子家族(ERF)中，鉴定一种转录辅激活物(转录辅因子，MBF)，以阐明MBF对ERF的作用机制，这种作用正性控制植物乙烯应答基因的表达，而且，本发明还提供了一种控制植物乙烯应答的方法。本发明鉴定了一种乙烯应答转录辅激活物(SEQ ID NO：1和2)。所述转录辅激活物被证明是正性控制植物乙烯应答基因的表达的ERF的转录辅激活物，这个转录辅激活物基因可以用于控制植物的乙烯应答。

Description

植物中的一种乙烯应答转录辅激活物

发明领域

本发明涉及乙烯应答转录因子中的一种转录辅激活物(transcription coactivator)，及使用所述转录辅激活物控制植物乙烯应答的方法。

现有技术

农产品如农作物和鲜花的新鲜度是决定其商业价值的重要因素。另一方面，乙烯作为一种植物激素，在从出芽至衰老的过程中控制着植物细胞的功能。由于乙烯这种植物激素对新鲜度具有重要影响，因此对其有密切的关注。通过控制乙烯而控制新鲜度的方法对农产品的生产商、经销商和零售商而言是一种梦想的技术。如果这种梦想可能实现，则在防止水果过熟和鲜花损毁中具有重要经济学用途。

例如，现已熟知一种新番茄品种flavor saver，其番茄的多聚半乳糖醛酸酶的表达被抑制。另外，进行了通过抑制乙烯合成酶的基因表达及乙烯的产生而防止番茄过熟的其它实验。

先前大多数控制乙烯应答的实验是通过操纵转录激活因子的基因而进行，刺激乙烯应答基因或乙烯靶基因的启动子。已知这些乙烯应答转录因子(ERF)是正性控制植物乙烯应答基因表达的调节因子(Ohme-Takagi，M.和Shinshi，H.，(1995)与乙烯应答因子相互作用的乙烯可诱导的DNA结合蛋白，Plant Cell 7：173-182；Suzuki，K.，Suzuki，N.，Ohme-Takagi，M.，和Shinshi，H.(1998)，在砍伐后番茄叶条中乙烯应答转录因子mRNA的直接早期诱导，Plant J.15：657-665)。

例如，1996年11月题目为“分析生物防御机制及分析生物防御的实验系统的开发”的一篇报告，公布了针对开发植物新实验系统的基本方法的设计方案(第二期，1993-1995)，该项目由科学技术厅研究开发局支持，试图通过从功能上鉴定生物防御基因的一个由乙烯转录控制的乙烯应答性cys-DNA元件，并通过在转基因植物中报道基因的实验，进而通过鉴别与所述元件相互作用的转录调节基因，而阐明植物的生物控制及应答的分子机制。

另外，日本特开2000-50877揭示了一种通过向如烟草等植物导入控制乙烯可诱导基因的转录因子而对于环境应激产生抗性的方法。

而且，美国专利No.5824868揭示了降低植物乙烯应答的一种方法，其中修饰的乙烯应答DNA被转导；该专利还揭示了一种控制所述DNA表达的方法。

本发明解决的问题

本发明的目的是在乙烯应答转录因子家族(ERF)中鉴定一种转录辅激活物(转录辅因子，MBF)，以阐明MBF对正性控制植物中乙烯应答基因表达的ERF的作用机制，本发明进一步提供了一种控制植物中乙烯应答的方法。

解决问题的方法

本发明中用于控制乙烯应答的基因编码多蛋白桥连因子-1(Multiprotein Bridging Factor-1，MBF-1)，它是乙烯应答所必需的转录控制因子之一。

一种转录控制因子，尽管在每个细胞中仅以几个分子存在，但却是一种非常重要的控制细胞内信号网络的因子。轻微改变该因子基因的表达数量即可导致对各种生物应答的明显作用。因此，本发明提供了通过将一个基因转导给植物而改变内源MBF-1基因表达数量，从而导致该植物乙烯应答改变的控制农作物新鲜度的方法。

更特别地，本发明是下列(a)或(b)的一种蛋白质：

(a)一种蛋白质，其具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列；

(b)一种蛋白质，其具有在SEQ ID NO：1所示氨基酸序列中缺失、取代或添加一或几个氨基酸的氨基酸序列，而且其表达增强植物的乙烯应答。

乙烯应答中的增加可以通过分析植物乙烯应答的直接增加或者ERF表达增加例如后文所述ERF2表达增加所证实。

另外，一种多肽基因，其功能与由本发明人首次克隆的具有水稻(Oryza sativa)的MBF1的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的多肽相似，可在其它植物中发现，所述植物与Oryza sativa之间氨基酸序列对比示出以下序列相同性：AtMBF1a，81.69％；AtMBF1b，79.58％；拟南芥(Arabidopsis thaliana)的AtMBF1c，47.97％；甘薯的StMBF1，78.17％；蓖麻油植物的RcMBF1，82.39％；番茄中LeMBF1，44.90％。番茄基因，其氨基酸序列相同性与水稻相比最低，仍可由乙烯诱导，因此提示这些基因与乙烯应答基因相关。

另外，本发明是一种包含以下(a)或(b)DNA的基因：

(a)具有SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的DNA；

(b)具有编码所述蛋白质的核苷酸序列的DNA。

再者，本发明是一种多核苷酸，其包含所述基因的一部分。

另外，本发明是一种多核苷酸，其包含一个启动子和所述基因或多核苷酸，其中所述基因或多核苷酸与所述启动子呈正向排列。再者，本发明是一种多核苷酸，其包含一个启动子和所述基因或多核苷酸，其中所述基因或多核苷酸与所述启动子呈反向排列。

在此所用的启动子包括花椰菜花叶病毒35S启动子，热激启动子，化学可诱导的启动子以及其它的启动子。

另外，对启动子与所述基因的连接方式无限制，所述连接可以使用常规遗传工程方法适当操纵。

通常靶基因的表达在植物中被抑制，其中所述基因的一部分或MBF1基因的cDNA或其它基因与一个启动子反向连接(称为“通过反义RNA抑制”)。另外，在所述基因正向连接及大量mRNA被表达的情况下，这些mRNA被识别为外源物质并分解。结果表达被抑制(称为“共抑制方法”或“transwich技术”)。这些本领域熟知的方法可应用于本发明的基因，抑制所述基因的表达从而抑制植物的乙烯应答。

另外，本发明是一种包含所述多核苷酸的质粒。在此所用质粒包含双元载体如Ti质粒，pBI-121质粒。

再者，本发明是一种植物，其中所述植物由所述多核苷酸转化。本发明可应用于单子叶植物如水稻，玉米，小麦等，或者用于双子叶植物如番茄等。

这些植物可以使用常规遗传工程技术进行转化，即本发明的基因可以插入所述质粒中并将所述质粒用于转化所述植物。

附图简述

图1：表示参考例1中使用的DNA探针的核苷酸序列。野生型ERE(图上方)和突变型ERE(mERE，图下方)均示于图1。每个DNA探针均包括2个拷贝的GCC框(黑体字所示)或突变型GCC框。

图2：表示电泳凝胶移位分析，示出ERF2与ERE的特异性结合。F表示一个未结合的游离的DNA探针，C表示一个DNA-ERF2结合复合物。

图3：表示体外转录中使用的质粒DNA模板(pERE)的结构。

图4：表示使用不同DNA模板的电泳转录物：pHSE200TA(泳道1)、pHSE200GA(泳道2)、pERE(泳道3-5)。如每个泳道所示，在有或无纯化的重组蛋白质的条件下，使用每个质粒DNA模板合成RNA。在图中，M表示单链DNA的分子量标记，*表示不依赖于TATA框的转录物。

图5：如每个泳道所示，给出使用质粒DNA模板(pERE)在存在各种纯化的重组蛋白质的情况下电泳转录物。

图6：示出水稻的MBF1(oMBF1)的cDNA的核苷酸序列(SEQID NO：2)及从该核苷酸序列中推出的氨基酸序列(SEQ ID NO：1，相应于SEQ ID NO：2的第85-510位)。下划线处表示poly A添加信号。

图7：表示使用烟草叶片在瞬时转录分析中报道质粒DNA(pERE-GUS)对转录的作用。纵坐标表示GUS活性的增加，其依赖于导入烟草叶片中报道质粒DNA(pERE-GUS)的量。图中数值是两次独立实验的平均值。

图8；表示加入转录因子(ERF2)或转录辅因子(oMBF1)对使用烟草叶片进行的瞬时转录分析的作用。这是使用报道质粒DNA改变ERF2和oMBF1数量对转录物数量的作用。在每个条形图下给出了使用的效应质粒DNA的类型和数量。图中数值是两次独立实验的平均值。

图9：表示使用烟草叶片在瞬时分析中通过oMBF1对转录激活物ERF2的扩增活性(amplified activity)。这是oMBF1的浓度在ERF2控制下对报道质粒DNA转录的作用。如在每个条形图下方所示，每个反应混合物除了2μg pERE-GUS、1μg p35S-LUS和0.2μgp35S-ERF2之外还加入不同量的p35S-MBF1。图中数值是两次独立实验的平均值。

图10：表示使用烟草叶片在瞬时分析中通过oMBF1对转录激活物ERF2的扩增活性。图中给出在ERF2和oMBF1控制下依赖于ERE核苷酸序列的扩增的转录。在每个条形柱表示报道和效应质粒DNA混合并转导至烟草叶片。图中数值是三次独立实验的平均值。

图11：表示使用烟草叶片在瞬时分析中通过oMBF1对转录激活物ERF4的扩增活性。图中示出ERF4的数量对报道质粒DNA转录物的作用。在每个实验中，2μg的pERE-GUS用作报道质粒DNA。在每个条形柱下给出效应质粒的类型和数量。图中数值是三次独立实验的平均值。

图12：表示使用烟草叶片在瞬时分析中通过oMBF1对转录激活物ERF4的扩增活性。图中给出了依赖于ERE核苷酸序列的转录物：ERF4和oMBF1依赖性扩增。将条形柱中所示的报道和效应质粒DNA混合并转导至烟草叶片。图中数值是三次独立实验的平均值。

本发明的效果

在本发明中，本发明人在乙烯应答转录因子家族中成功鉴定了一种转录辅激活物(SEQ ID NO：1和2)。另外，本发明人证实该转录辅激活物是针对正性控制一系列乙烯应答植物基因的表达的ERF的。

应用本发明的转录辅激活物基因控制植物乙烯应答是可能的。先前为控制植物的乙烯应答，人们试图改变乙烯应答的靶基因或者试图改变产生乙烯的基因。然而，如本发明所述改变编码作为信息分子的转录辅激活物的基因使得可以控制靶基因整体表达并因此具有比先前的方法更大的影响。

以下实施例例证了本发明，然而无限制本发明范围之意。

参考例1

在这个实施例中测试了纯化的重组乙烯应答转录因子(ERF)与乙烯应答因子(ERE)的特异性结合。

为检测ERF与ERE的特异性结合，本发明人在大肠杆菌中诱导烟草衍生的ERF过表达并将其纯化。将编码来自四种烟草的每种ERF蛋白的DNA区域插入表达质粒pET15b(Novagen，Madison，WI)中，诱导重组ERF蛋白在大肠杆菌中高水平表达(BL21/DE3/pLysS)。这四种重组蛋白使用Ni固定树脂(His-结合树脂，Novagen)纯化。烟草衍生的重组TBP(tTBP)通过先前报道的方法纯化(Biosci.Biotech.Biochem.，58：916-920(1994))。纯化的重组蛋白的纯度和大小通过顺序SDS-PAGE检测(15％分离凝胶；Nature 227：680-685b(1970))。通过SDS-PAGE证实每个ERF蛋白的分子量，发现该分子量略大于基于从cDNA核苷酸序列推定的氨基酸序列计算的大小(30-45kDa)。

然后，ERF2与ERE的结合活性使用凝胶移位分析加以研究。含有一个53bp野生型乙烯应答元件(ERE)的DNA片段在用一个使用(γ-³²P)ATP的放射性示踪物和T4多核苷酸激酶(Takara Bio INC.，Kyoto，Japan)标记之后用作DNA探针。同时，多拷贝的及连接的ERE(SEQ ID NO：3和4)或者mERE(SEQ ID NO：5和6)片段(图1)分别用作野生型和突变型竞争者。mERE(突变型)与ERE(野生型)相似，不同之处是GCC框中DNA核苷酸序列含有碱基取代。1ng放射标记的DNA探针(1000-10000cpm)与10ng重组ERF及有或无10ng竞争DNA在如表1所示的10μl结合缓冲液中混合，在25℃孵育45分钟。

表1

25mM Hepes-KOH(pH 8.0)

40mM KCl

0.1mM EDTA

1mM DTT

20％甘油

250ng 聚(dA-dT)::(dA-dT)

0.1％ triton X-100

在结合反应后，将这些样品在25℃在100V使用含有0.25×TB缓冲液(22.5mM Tris-硼酸盐，pH 8.0)的4％聚丙烯酰胺凝胶进行电泳(丙烯酰胺∶二丙烯酰胺＝39∶1，厚度1mm，长度13cm)3小时。将所述凝胶干燥并暴露于Fuji成像平板(Fuji Photo Film Co.Ltd.，Kanagawa，JAPAN)。电泳迁移模式使用生物成像分析仪(Fuji PhotoFilm Co.Ltd.，Kanagawa，JAPAN)显像。结果示于图2。在该图中，F表示未结合的游离DNA探针，C表示DNA-ERF2结合复合物。

10ng ERF2与1ng放射标记的DNA探针反应导致DNA条带移位至较大分子量，表明DNA与蛋白质复合物的形成(图2)。

由于DNA-蛋白质复合物的形成在加入冷却的ERE片段时受抑制而在加入冷却的mERE时不受抑制，因此形成依赖于特异性结合。另外，其它三种转录因子即ERF1、ERF3和ERF4与ERE类似地结合。

参考例2

在这个实施例中，本发明人揭示了ERE依赖性转录由HeLa核提取物(HNE)中的ERF2扩增。

用于体外转录的质粒DNA如下构建。为构建图3所示质粒DNA模板(pERE)，将两个拷贝的ERE DNA片段(图1)插入先前报道的质粒pU35(Pro.Natl.Acad.Sci.USA 87：7035-7039(1990))的BglII位点。在pmERE质粒DNA模板的情况中，将两个拷贝的mERE以所述方式代替ERE插入。如先前报道所述构建对照质粒DNA模板，pHSE200TE和pHSE200GA(Plant Mol.Biol.：69-79(1997))。

另外，如下进行分析体外转录反应。用于体外转录的HeLa核提取物如先前报道所述制备(Meth.Enzymol.101：582-598(1983))。体外转录的标准反应混合物的成分如表2所示。

表2

1.体外转录的反应混合物

18.4mM Hepes-KOH pH7.9

51.2mM KCl

4.5mM Mg(CH₃COO)₂

0.08mM EDTA

1.12mM DTT

16％(w/v) 甘油

0.048％ TritonX-100

0.1mM ATP

0.1mM CTP

0.01mM UTP

5μCi [α-³²P]UTP

(比活性400-800Ci/mmol)

0.5μg 质粒DNA模板

0.04mM 3’-O-甲基-GTP

20单位 RNase T1

10μg蛋白质 HeLa核提取物(HNE)

2.反应终止溶液

5％ SDS

10mM EDTA

0.4mg/ml 糖原

150mM 乙酸钠

将转录反应混合物在30℃孵育60分钟，加入75μl反应终止溶液(表2)结束反应。然后，将100μl PCIAA(50％苯酚，48％氯仿，2％ isoamilalcohol)加入反应混合物中以回收水相。之后，在所述液相中加入100μl CIAA(95％氯仿，4％ isoamilalcohol)，回收所述水相。然后向所述水相中加入10μl 3M乙酸钠和300μl乙醇以沉淀核酸。将所述核酸干燥，溶解于10μl尿素溶液中(5M尿素，1mM EDTA，0.1％溴酚蓝)。将所述核酸样品使用含有89mM Tris-硼酸盐(pH8.3)、2mMEDTA和8M尿素的6％聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺∶二丙烯酰胺＝19∶1，厚度1mm，长度12.5cm)在300V进行电泳。当样品中溴酚蓝移动至凝胶的最低边缘时，取下凝胶并浸泡在1L含有5％甲醇和5％乙酸的水中，然后浸泡在1L含有5％甲醇的水中，各浸泡20分钟。然后将所述凝胶附着于一个滤纸上，干燥，暴露于Fuji成像平板过夜。使用生物成像分析仪观测RNA。

为证实HNE(HeLa核提取物)中质粒DNA模板上TATA框依赖性转录起始，本发明人使用pHSE200TA和pHSA200GA(Plant Mol.Biol.34：69-79(1997))在存在重组烟草TBP(tTBP)的情况下作为对照质粒DNA模板。pHSE200TA含有编码Arabidopsis类植物热激蛋白基因中200bp序列的启动子区域及在有义链中不包含鸟嘌呤残基的200bp转录区。pHSA200GA具有与pHSE200TA相似结构，除了pHSE200TA中TATA框(TATAAAT)的所有T残基均取代为G(GAGAAAG)。

图4表示使用这些DNA模板的电泳结果。当pHSE200TA用作DNA模板时，观测到200nt转录物特异性合成(泳道1)。同时，pHSA200GA提供归因于TATA框非依赖性转录物的一个微弱信号(泳道2)。

使用pERE(图3)作为转录模板分析纯化的重组ERF2作为转录激活因子的生化功能。由于使用pERE作为转录模板不加入ERF2的情况下观测不到特异性转录物(泳道3)，因此加入烟草的tTBP以提高基本转录活性，此时观测到相应于特异性转录物的374nt信号(泳道4)。然后除了tTBP之外还加入ERF2，观测到泳道4的信号扩增(泳道5)。与之相反，使用pmERE(一种质粒，用2个拷贝的mERE取代pERE中2个拷贝的cis元件(ERE)形成)作为转录模板观测不到转录物的扩增(数据未示出)。

这些观测结果证明重组ERF2与HeLa核提取物中ERE结合并具有转录激活物功能。

参考例3

在与参考实施例2同样的情况中，本发明人检测了其它ERF的转录激活活性。如图5所示，将四种ERF的每一种即ERF1-ERF4加入标准体外转录分析系统中，导致pERE上转录起始速度提高3-5倍。另一方面，由于使用pmERE作为模板观测不到ERF对转录起始的作用，因此证明每种ERF是依赖于HeLa核提取物中的ERE的转录激活物。每种ERF的转录激活活性如下：由ERF3扩增3倍；由ERF4扩增3.5倍；由ERF1扩增4倍；由ERF2扩增5倍。

实施例1

在这个实施例中，本发明人揭示了依赖于乙烯应答启动子的基因表达在存在ERF2的情况下由oMBF1扩增。为检测多蛋白桥连因子1(MBF1)依赖于乙烯应答启动子参与转录扩增的可能性，本发明人选择了一种候选基因，其编码由日本农林水产省制备的水稻的EST文库中水稻的MBF1。图6示出编码水稻的MBF1(oMBF1)的cDNA核苷酸序列(SEQ ID NO：2)及从中推定的氨基酸序列(SEQ ID NO：1，相应于SEQ ID NO：2的85-510位)。这个氨基酸序列(SEQ ID NO：1)与Arabidopsis MBF1(AtMBF1)的序列81％同源，明显高于与人MBF1(hMBF1)的同源性(53％)。

为揭示MBF1作为转录辅激活物的功能，本发明人以如下方式构建了一种效应质粒DNA(p35S-MBF1)，其在烟草细胞中表达MBF1。为构建效应质粒DNAp35S-ERF2和p35S-MBF1，发明人删除了质粒载体pBI221(CLONTECH Laboratories Inc.，CA)的XbaI-SacI片段，其是β-葡糖醛酸糖苷酶编码区，并插入含有烟草ERF2的cDNA(登记号No.ABO 16264)或水稻的MBF1的cDNA(SEQ ID NO：2)的cDNA片段(SEQ ID NO：2)，所述cDNA片段包含通过PCR分别加入在上游和下游的XbaI位点和SacI位点。报道质粒DNA pERE-GUS和pmERE-GUS的结构分别相对应于2(GCC)Gus和2(mGCC)Gus，如先前的报道所使用的(Plant Cell 7：173-182(1995))。

p35S-LUC用作对照质粒，其通过用夹合萤火虫萤光素酶的cDNA的Xba I-Sac I片段(登记号No.E08319)置换所述pBI221的XbaI-Sac I片段而构建。

这个实施例中使用的质粒DNA示于表3。

表3

报道质粒DNA pERE-GUS

顺式元件TATA框

对照质粒DNA p35S-LUC

CAMV 35S启动子

效应质粒DNA

CAMV 35S启动子

在该表中，GUS表示大肠杆菌衍生的β-葡糖醛酸糖苷酶基因(β-D-glucuronidase)，LUC表示衍生自萤火虫和弧菌(海洋发光细菌)的萤光素酶基因。

通过微粒轰击方法将p35S-MBF1导入烟草叶片中(将DNA包被于金粒上，通过氦压驱动粒子流入枪(Helium pressure drivenparticles inflow gun)与金粒一起送入完整植物内部)，诱导oMBF1瞬时表达以评估其功能。评估方法如下：使用烟草叶片的瞬时分析根据先前报道所述进行(Plant Mol.Biol.Reporter 18：101-107(2000))。将2μg报道质粒DNA(pERE-GUS)，1μg对照质粒DNA(p35S-LUC)及各种数量的效应质粒DNA与0.5mg金粒(直径1.5-3.0μm，AldrichChem.WI)于30μl TE缓冲液中混合。然后，向该混合物中加入3μl 3M乙酸钠和100μl乙醇，将该混合物离心。回收用DNA包被的金粒并悬浮于100μl乙醇中。然后，将悬浮液通过超声分散，使用氦压驱动IDERA GIE-III(TANAKA Co.Ltd.，Sapporo，Japan)将5μl分散液导入已经培养2周的烟草叶片中。在基因转导后，将在25℃光照12小时下保持的烟草叶片在液氮中冷冻，使用MIKRO-DISMEMBRATOR II(B.Brown Biotech International，Germany)研成粉末。将样品分成两份，一份用于使用GUS-光化学发光试剂盒(TROPIX，MA)分析β-glucronidase活性。另一部分用于使用萤光素酶报道蛋白分析系统(Promega Corp.，WI)和Luminescencer-JNR luminometer(ATTO Co.，Ltd.，Tokyo，Japan)分析萤光素酶活性。

β-glucronidase活性是依赖于乙烯应答启动子的基因表达的指征，基于其萤光素酶活性而被校准。首先，将各种剂量的报道质粒DNA(pERE-GUS)包被在金粒表面并导入烟草叶片中。然后，分析β-glucronidase活性的动态范围。结果示于图7-10。在这些实验中，总是在每个样品中混合1μg对照质粒DNA(p35S-LUC)作为内在对照，然后通过分析每个样品的萤光素酶活性计算基因转导的产量并校准每个实验的β-glucronidase活性。

结果，随着pERE-GUS的剂量从1μg增加至4μg，β-葡糖醛酸糖苷酶活性呈线性提高，然后随着pERE-GUS的剂量增加至6μg而略降低。因此在以下瞬时分析中，将2μg pERE-GUS和1μg p35S-LUC加入所有DNA混合物中。向所述混合物中加入0.2μg效应质粒DNA(p35S-ERF2)并未证实GUS活性升高，但进一步加入效应质粒DNA(直至0.7μg)则升高GUS活性(图8中心)。另外，仅加入不同数量的p35S-MBF1作为效应质粒DNA不引起GUS活性改变(图8右侧)。

另一方面，在存在0.2μg第一种效应质粒DNA(p35S-ERF2)的情况中，加入不同数量的第二种效应质粒DNA(p35S-MBF1)，以剂量依赖性方式升高GUS活性(图9)。另外，在存在ERF2和MBF1二者的情况中，GUS活性协同增强(图10)。在存在ERF2和MBF1二者的情况下GUS活性的协同升高仅在当pERE-GUS用作报道质粒DNA时才观测到，但当使用pmERE-GUS时则观测不到。

这些观测结果表明oMBF1是ERF2的一种转录辅激活物。

实施例2

为检测oMBF1对ERF2之外的克隆例如ERF4是否具有转录辅激活物的功能，本发明人用p35S-ERF4代替p35S-ERF2进行与实施例1相似的实验。结果示于图11和12。

通过加入0.5μg-1.0μg的p35S-ERF4观测到GUS活性以剂量依赖性方式而成倍改变，然而，在加入0.2μg的p35S-ERF4观测到仅提高1.7倍(图11)。另外，在存在0.2μg的p35S-ERF4的情况下进而加入0.5μg的p35S-MBF1(图12，左侧)观测到GUS活性提高5.5倍，而用pmERE-GUS代替所述报道质粒DNA观测到GUS活性不提高(图12，右侧)。

这些观测结果表明oMBF1对于ERF4以及ERF2具有转录辅激活物功能。

序列表

<110>独立行政法人科学技术振兴机构

<120>植物中一种乙烯应答转录辅激活物

<130>PS02-1101

<160>6

<210>1

<211>PRT

<212>142

<213>Oryza sativa

<400>1

Met Ala Gly Ile Gly Pro Ile Arg Gln Asp Trp Glu Pro Val Val Val

1 5 10 15

Arg Lys Lys Ala Pro Thr Ala Ala Ala Lys Lys Asp Glu Lys Ala Val

20 25 30

Asn Ala Ala Arg Arg Ser Gly Ala Glu Ile Glu Thr Met Lys Lys Tyr

35 40 45

Asn Ala Gly Thr Asn Lys Ala Ala Ser Ser Gly Thr Ser Leu Asn Thr

50 55 60

Lys Arg Leu Asp Asp Asp Thr Glu Ser Leu Ala His Glu Arg Val Ser

65 70 75 80

Ser Asp Leu Lys Lys Asn Leu Met Gln Ala Arg Leu Asp Lys Lys Met

85 90 95

Thr Gln Ala Gln Leu Ala Gln Met Ile Asn Glu Lys Pro Gln Val Ile

100 105 110

Gln Glu Tyr Glu Ser Gly Lys Ala Ile Pro Asn Gln Gln Ile Ile Gly

115 120 125

Lys Leu Glu Arg Ala Leu Gly Thr Lys Leu Arg Gly Lys Lys

130 135 140

<210>2

<211>819

<212>DNA

<213>Oryza sativa

<400>2

cagaaccttc tcttcttcct tgttcgttca tcccctaacc ctttctttgt tcatcttgtt 60

cttcctcttg tcgtctcgtc gagatggccg ggattggtcc gatcaggcag gactgggagc 120

cggtggtggt gcggaagaag gcgcccaccg ccgccgccaa gaaggatgag aaggccgtca 180

acgccgcccg ccgctccggc gccgagatcg agaccatgaa gaagtataac gctggaacaa 240

acaaggcggc gtccagtggc acatccctca acaccaagcg gctggatgac gacaccgaga 300

gccttgccca tgagcgtgtc tcaagtgacc tgaagaaaaa cctcatgcaa gcaaggctgg 360

acaagaagat gacccaggca cagcttgcac agatgatcaa tgagaagccc caggtgatcc 420

aggagtacga gtcaggtaaa gctattccga accagcagat catcgggaag cttgaaaggg 480

ctcttggaac aaagctgcgc ggcaagaaat aatgttctac tattaggccc tgaagcatag 540

tgttggagca accaaagcca aaatgtttgc gtaacctatg ctgggtcttt tgataccatg 600

caggatgttt ctgttggtgc atgagtgaat actgaataac tattatgttg tcgcaaacct 660

tgtaatgctg ccgctctttg tgtgtcatag tccctagtgt gcaagagttg tgctggacct 720

taaaactgac ttgataacct gcgtggttta tgcatgatgt ttattaaaat atcaatgatc 780

tctttggctg tttacaactg aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 819

<210>3

<211>53

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>3

gatctcataa gagccgccac taaaataaga ccgatcaaat aagagccgcc atg 53

<210>4

<211>53

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>4

gatccatggc ggctcttatt tgatcggtct tattttagtg gcggctctta tga 53

<210>5

<211>53

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>5

gatctcataa gatcctccac taaaataaga ccgatcaaat aagatcctcc atg 53

<210>6

<211>53

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>6

gatccatgga ggatcttatt tgatcggtct tattttagtg gaggatctta tga 53

Claims

1.一种如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)一种蛋白质，其具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列；

2.一种由如下(a)或(b)的DNA组成的基因：

(a)一种DNA，其具有SEQ ID NO：2的85-510位碱基所示核苷酸序列；

(b)一种DNA，其具有编码权利要求1所述蛋白质的核苷酸序列。

3.一种多核苷酸，其包含一个启动子及权利要求2所述基因，其中所述基因与所述启动子呈正向排列。

4.一种多核苷酸，其包含一个启动子及权利要求2所述基因，其中所述基因与所述启动子呈反向排列。

5.一种质粒，其包含权利要求3或4所述多核苷酸。

6.一种抑制植物乙烯应答的方法，包括用由以下(a)或(b)DNA组成的多核苷酸转化所述植物，其中所述核苷酸序列与所述启动子以正向或反向连接，以及诱导所述启动子功能：

(a)一种DNA，其具有SEQ ID NO：2的85-510位碱基所示核苷酸序列；

(b)一种DNA，其具有编码以下蛋白质(c)或(d)的核苷酸序列；

(c)一种蛋白质，其具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列；

(d)一种蛋白质，其具有在SEQ ID NO：1所示氨基酸序列中缺失、取代或添加一或几个氨基酸的氨基酸序列，而且其表达增强植物的乙烯应答。