JP3848173B2 - 植物のエチレン応答転写コアクチベータ - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、エチレン応答転写因子群の転写コアクチベータに関し、更にこの転写コアクチベータを用いて植物のエチレン応答を制御する手段に関する。
【０００２】
【従来の技術】
作物や花などの農産物の鮮度は、その商品価値を決定付ける大きな要因である。一方、植物ホルモンであるエチレンは、植物の発芽から老化に至る過程で植物細胞の機能を制御している。従って、その鮮度にエチレンという植物ホルモンが大きく影響することから多くの注意が払われてきた。農産物の生産者・流通業者・小売り業者にとって、このエチレンをコントロールすることにより、自由に鮮度をコントロールする技術は夢の技術であり、これが可能ならば、果実の熟しすぎや、花のいたみを抑えることが出来、経済的効果は大きい。
例えば、トマトの追熟を抑制する為にトマトのポリガラクチュロン酸分解酵素の遺伝子の発現を抑制した遺伝子組換えトマトの新品種フレーバーセーバーは有名であるが、この他にも、エチレン合成酵素遺伝子の発現を抑制して、エチレンの発生を抑制して、トマトの追熟を抑制する試みなどがなされている。
【０００３】
従来のエチレン応答制御は、エチレン応答性遺伝子のプロモーターを刺激する転写増幅因子の遺伝子やエチレンの標的遺伝子を組換える提案がほとんどである。このエチレン応答転写因子群（ＥＲＦｓ）は、エチレン応答性を示す植物遺伝子群の発現を正に制御する因子であることが知られている（Ohme-Takagi, M. and Shinshi, H., (1995) Ethylene-inducible DNA binding proteins that interact with an ethylene-responsive element. Plant Cell 7: 173-182.; Suzuki, K., Suzuki, N., Ohme-Takagi, M. and Shinshi, H., (1998) Immediate early induction of mRNAs for ethylene-responsive transcription factors in tobacco leaf strips after cutting. Plant J. 15: 657-665.）。
【０００４】
例えば、科学技術庁研究開発局 新しい植物実験系開発のための基盤技術に関する研究（II期平成５〜７年度）成果報告書平成８年１１月「生体防御機構解析のための実験系の開発と防御機構の解析」では、エチレンによって転写制御される生体防御遺伝子のエチレン応答性のシスＤＮＡエレメントをトランスジェニック植物のレポーター遺伝子実験により機能的に同定し、このエレメントと相互作用する転写制御遺伝子を同定することにより、植物生体制御応答の分子機構の解明を試みている。
また、特開2000-50877では、エチレン誘導性遺伝子を制御する転写因子を導入することによりタバコ等の植物に環境ストレスに対する抵抗性を付与する方法が開示されている。
更に、米国特許第5,824,868号には、改変したエチレン応答性ＤＮＡにより形質転換された植物のエチレン応答性を低下させ、このような形質転換された核酸の発現を制御する方法が開示されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、エチレン応答転写因子群（ＥＲＦｓ）の転写コアクチベータ（転写補助因子、ＭＢＦ）を特定し、エチレン応答性を示す植物遺伝子群の発現を正に制御するＥＲＦに対するＭＢＦの作用の機構を解明し、更に植物のエチレン応答を制御する手段を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段及び発明の実施の形態】
本発明のエチレン応答をコントロールする為に用いる遺伝子は、エチレン応答に必要な転写調節因子の１つであるマルチプロテイン・ブリッジング・ファクター１（ＭＢＦ１）をコードしている。転写調節因子は、細胞内においてわずかな分子数しか存在していないが、それらが構成する細胞内情報ネットワークをつかさどる重要な因子で、その遺伝子発現量をわずかに変化させるだけで、様々な生物応答に影響を与えることが出来る。そこで、もともと植物体内にあるＭＢＦ１遺伝子の発現量を後から植物に導入する遺伝子を用いることによって変化させ、植物のエチレン応答性を変化させ、作物の鮮度を制御する手段を提供する。
【０００７】
即ち、本発明は、以下（ａ）又は（ｂ）のタンパク質である。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列から成るタンパク質
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列から成り、かつその発現により植物のエチレン応答を強めるタンパク質
植物のエチレン応答を強めることは、直接植物のエチレン応答を強めることを確認してもよいし、エチレン応答性転写因子（ＥＲＦｓ）、例えば、後述のＥＲＦ２の発現を強めることを確認してもよい。
【０００８】
なお、発明者らがクローン化したイネのＭＢＦ１のアミノ酸配列（配列番号１）と同様の機能を有すると考えられる遺伝子は、他の植物にも見られ、それらのアミノ酸配列をイネのものと比較すると、シロイヌナズナの AtMBF1a; 81.69%、AtMBF1b; 79.58%、AtMBF1c; 47.97%、さつまいものStMBF1; 78.17%、ヒマの RcMBF1; 82.39%、トマトの LeMBF1; 44.90%となっている。これらの中で相同性の一番低いトマトの LeMBF1 がエチレンで誘導されることから、これもエチレン応答に関係する遺伝子であることが示唆される。
【０００９】
また、本発明は、以下（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡから成る遺伝子である。
（ａ）配列番号２の塩基配列から成るＤＮＡ
（ｂ）上記のタンパク質を指定する塩基配列から成るＤＮＡ
更に本発明は、この遺伝子の一部分から成るポリヌクレオチドである。
また、本発明は、プロモーター及び上記の遺伝子から成るポリヌクレオチドであって、その塩基配列が該プロモーターに対して順方向に連結されているポリヌクレオチドである。更に本発明は、プロモーター及び上記の遺伝子から成るポリヌクレオチドであって、その塩基配列が該プロモーターに対して逆方向に連結されているポリヌクレオチドである。
ここで用いるプロモーターとしては、カリフラワーモザイクウィルスの 35S プロモーター・熱ショックプロモーター・化学物質誘導性プロモーター等が挙げられる。
またプロモータ及び上記遺伝子の結合方法に特に制限は無く、通常の遺伝子工学的手法に従って適宜行うことができる。
【００１０】
ＭＢＦ１等の遺伝子やｃＤＮＡをプロモーターに対して逆に連結させたものを導入した生物において、その標的遺伝子の発現が抑制されることが多い（「アンチセンス RNA による抑制」と呼ばれる。）。また、順方向に連結してｍＲＮＡを大量に発現させた場合にも、異物として認識されてｍＲＮＡの分解が促進されて、結果として発現が抑制される（「コサプレッション技術」や「トランスウイッチ技術」と呼ばれている。）。このような公知の手法を本発明の遺伝子に用いることにより、該遺伝子の発現を抑制し、従って、植物のエチレン応答を抑制することができる。
【００１１】
また、本発明は上記ポリヌクレオチドを含有するプラスミドである。ここで用いるプラスミドとして、Ｔｉプラスミド、ｐＢＩ−１２１プラスミド等のバイナリーベクターが挙げられる。
上記ポリヌクレオチドにより形質転換される植物として、本発明の適用できる植物は、イネ・トウモロコシ・小麦等の単子葉植物、トマトなどの双子葉植物等である。
このような植物を形質転換するには、通常の遺伝子工学的手法を用いて、本発明の遺伝子を上記プラスミドに挿入し、上記植物を形質転換することができる。
【００１２】
【発明の効果】
本発明において、エチレン応答転写因子群の転写コアクチベータ（配列番号１及び２）を特定することができた。そして、この転写コアクチベータが、エチレン応答性を示す植物遺伝子群の発現を正に制御するＥＲＦに対する転写コアクチベータであることを確認した。
植物のエチレン応答を制御するために、本発明の転写コアクチベータの遺伝子を利用することができる。従来は、エチレン応答する標的遺伝子を変化させたり、エチレンを合成する遺伝子を変化させたりしていたが、本発明システムのように情報分子としての転写補助因子をコードする遺伝子を変化させると、その標的となる遺伝子群の発現をまとめてコントロール出来るようになるので、従来の方法に較べより大きな効果を発揮しうる。
【００１３】
【実施例】
以下、実施例にて本発明を例証するが、本発明を限定することを意図するものではない。
参考例１
ここでは、エチレン応答性エレメント（ＥＲＥ）への精製した組換えエチレン応答性転写因子（ＥＲＦｓ）の結合特異性を調べた。
ＥＲＥへのＥＲＦｓの結合特異性を調べるために、下記の方法で各組換えタバコ由来ＥＲＦを大腸菌内で過剰発現させ、精製した。
４種それぞれのタバコのＥＲＦｓの蛋白質コード領域を発現プラスミドｐＥＴ１５ｂ(Novagen, Madison, WI)に挿入し、組換えＥＲＦ蛋白質を大腸菌（ＢＬ２１／ＤＥ３／ｐＬｙｓＳ）中で大量発現させた。４種の組換え蛋白質をＮｉを個相化した担体(His-bind resin, Novagen)を用いて精製した。タバコ由来の組換えＴＢＰ（ｔＴＢＰ）については、すでに報告した方法で精製した。(Biosci. Biotech. Biochem., 58:916-920(1994))。精製した組換え蛋白質の精製度及び分子の大きさについては、通常のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（15% separationg gel;Nature
227:680-685b(1970)）で調べた。
各々のＥＲＦ蛋白の分子量をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認したところ、ｃＤＮＡ塩基配列から予測されるアミノ酸配列をもとにして計算した分子量よりもやや大きかった（３０−４５ｋＤａ）。
【００１４】
次に、ＥＲＦ２のＥＲＥへの結合能を下記のゲルシフト・アッセイを用いて調べた。
５３ｂｐの長さの野生型エチレン応答エレメント（ＥＲＥ）を含むＤＮＡ断片を(γ-32P）ＡＴＰとＴ４-polynucleotide kinase（TAKARA shuzo No.Ltd., Kyoto, JAPAN）を用いて放射線標識して、ＤＮＡプローブとした。一方、ＥＲＥ（配列番号３及び４）又はｍＥＲＥ（配列番号５及び６）断片（図１）を多コピー連結したものを、それぞれ野生型又は突然変異型のコンペチターとして用いた。ｍＥＲＥ（突然変異型）は、ＥＲＥ（野生型）と較べ、ＧＣＣボックスのＤＮＡ塩基配列に塩基置換を含む以外は、ほぼ同様のものである。１ｎｇの放射線標識したＤＮＡプローブ（１，０００から１０，０００ｃｐｍ）に１０ｎｇの組換えＥＲＦを単独で、又は１０ｎｇの組替えＥＲＦに１０ｎｇのコンペチターＤＮＡを混合して、１０μｌの表１に示すbinding buffer中で２５℃にて４５分間保温した。
【００１５】
【表１】
２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨｐＨ８．０
４０ｍＭ ＫＣｌ
０．１ｍＭ ＥＤＴＡ
１ｍＭ ＤＴＴ
２０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ
２５０ｎｇ ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）::（ｄＡ−ｄＴ）
０．１％ ｔｒｉｔｏｎＸ−１００
【００１６】
結合反応後のサンプルは、０．２５ＸＴＢ buffer（２２．５ｍＭ トリス−ほう酸、ｐＨ８．０）を含む４％ポリアクリルアミドゲル（アクリルアミド：ビスアクリルアミド＝３９：１、厚さ１ｍｍ、長さ１３ｃｍ）上にて、１００Ｖで２５℃にて３時間展開した。このゲルを乾燥し、フジ・イメージング・プレート(Fuji Photo Film Co. Ltd., Kanagawa, JAPAN)に暴露した。電気泳動パターンは、バイオ・イメージング・アナライザ（(Fuji Photo Film Co. Ltd.)を用いて可視化した。その結果を図２に示す。この図中、Ｆは何も結合していないフリーのＤＮＡプローブを示し、ＣはＤＮＡ−ＥＲＦ２複合体を示す。
【００１７】
１ｎｇの放射線標識したＤＮＡプローブに対して、ＥＲＦ２を１０ｎｇを作用させたところ、大きなサイズに相当するシフトしたＤＮＡと蛋白の複合体のバンドが確認された（図２）。このＤＮＡと蛋白の複合体の出現は、非標識ＥＲＥ断片の添加により阻害され、非標識ｍＥＲＥの添加で阻害されないことから、特異的に結合していることがわかる。またさらに他の３種類のＥＲＦ１、ＥＲＦ３、ＥＲＦ４も同様にＥＲＥに結合した。
【００１８】
参考例２
ここでは、ＨｅＬａ核抽出液（ＨＮＥ）中で、ＥＲＦ２によりＥＲＥ依存的転写が増幅されることを調べた。
ここで用いた試験管内転写用プラスミドＤＮＡ鋳型は次のように構築した。図３のプラスミドＤＮＡ鋳型（ｐＥＲＥ）を構築する為に、既報のプラスミドｐＵ３５(Pro. Natl. Acad. Sci. USA 87:7035-7039(1990))のＢｇｌII部位に２コピーのＥＲＥ ＤＮＡ断片（図１）を挿入した。ｐｍＥＲＥプラスミドＤＮＡ鋳型については、上記と同様の方法で、ＥＲＥのかわりにｍＥＲＥを２コピー挿入した。コントロール・プラスミドＤＮＡ鋳型であるｐＨＳＥ２００ＴＡ，ｐＨＳＥ２００ＧＡについては既報のとおりである(Plant Mol. Biol. 34:69-79(1997))。
【００１９】
また、試験管内転写反応は下記の手順で調べた。
試験管内転写に用いたＨｅＬａ核抽出液は既報(Meth. Enzymol. 101:582-598(1983))に従って調整した。標準的試験管内転写の反応液組成を表２に示す。
【表２】
１．試験管内転写反応液（１２．５μｌ）
１８．４ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨｐＨ７．９
５１．２ｍＭ ＫＣｌ
４．５ｍＭ Ｍｇ（ＣＨ３ＣＯＯ）２
０．０８ｍＭ ＥＤＴＡ
１．１２ｍＭ ＤＴＴ
１６％（ｗ／ｖ） ｇｌｙｃｅｒｏｌ
０．０４８％ ｔｒｉｔｏｎＸ−１００
０．１ｍＭ ＡＴＰ
０．１ｍＭ ＣＴＰ
０．０１ｍＭ ＵＴＰ
５μＣｉ ［α−３２Ｐ］ＵＴＰ（比活性、４００−８００Ｃｉ／ｍ ｍｏｌ）
０．５μｇ プラスミドＤＮＡ鋳型
０．０４ｍＭ ３’−０−ｍｅｔｈｙｌ−ＧＴＰ
２０ｕｎｉｔｓ ＲＮＡ分解酵素Ｔ１
１０μｇ 蛋白ヒト核抽出液（ＨＮＥ）
２．反応停止液
５％ ＳＤＳ
１０ｍＭ ＥＤＴＡ
０．４ｍｇ／ｍｌ ｇｌｙｃｏｇｅｎ
１５０ｍＭ 酢酸ナトリウム
【００２０】
転写反応は３０℃にて６０分間行ない７５μｌの反応停止液（表２）を加えて止めた。反応液には、さらに１００μｌＰＣＩＡＡ（５０％フェノール、４８％クロロホルム、２％イソアミルアルコール）を加えて水層を回収し、次にこの水層に１００μｌのＣＩＡＡ（９６％クロロホルム、４％イソノアミルアルコール）を加えて水層を回収した。次に、この液に１０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムと３００μｌのエチルアルコールを加えて核酸を回収し、この沈殿を乾燥後、これに１０μｌ尿素液（５Ｍ尿素、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ブロモフェノールブルー）を加えて核酸を溶解した。このサンプルは長さを分析するためにただちに、８９ｍＭ トリス−ほう酸（ｐＨ８．３）、２ｍＭ ＥＤＴＡ、８Ｍ尿素を含む６％ポリアクリルアミドゲル（アクリルアミド：ビスアクリルアミド＝１９：１、厚さ１ｍｍ、長さ１２．５ｃｍ）上で３００Ｖにて展開した。サンプル中に含まれるブロモフェノールブルーが、ゲルの最下端に到達したらゲルをはずし、１リットルの５％メタノール、５％酢酸を含む液に、つづいて、１リットルの５％メタノール液にそれぞれ２０分間ずつひたした。次にゲルをロ紙にはりつけて乾燥し、フジ・イメージング・プレートに一晩暴露し、バイオ・イメージング・アナライザを用いてＲＮＡを可視化した。
【００２１】
ＨＮＥ（ＨｅＬａ核抽出液）中でのプラスミドＤＮＡ鋳型上でのＴＡＴＡボックス依存的転写開始を確認するために、コントロール・プラスミドＤＮＡ鋳型としてｐＨＳＥ２００ＴＡ及びｐＨＳＡ２００ＧＡ(Plant Mol. Biol., 34:69-79(1997))を組換えタバコＴＢＰ（ｔＴＰＢ）存在下で用いた。ｐＨＳＥ２００ＴＡはシロイヌナズナの熱ショック蛋白質をコードする遺伝子の上流２００ｂｐのプロモーター部分の配列および、センス鎖にグアニン残基を含まない２００ｂｐの転写領域を含んでいる。ｐＨＳＡ２００ＧＡについてはｐＨＳＥ２００ＴＡと構造はほとんど同じで、ｐＨＳＥ２００ＴＡのＴＡＴＡボックス（ＴＡＴＡＡＡＴ）のすべてのＴ残基をＧに置換した（ＧＡＧＡＡＡＧ）ものである。
【００２２】
図４に、これらＤＮＡ鋳型を用いて得た転写物の電気泳動を示す。
ＤＮＡ鋳型としてｐＨＳＥ２００ＴＡを用いたときには、特異的に合成された２００ｎｔの転写物が観察された（レーン１）。一方、ｐＨＳＥ２００ＧＡを用いた時には、ＴＡＴＡボックス非依存的な転写物に由来する弱いシグナルが観察されただけである（レーン２）。
精製組換えＥＲＦ２の転写活性化因子としての生化学的機能についてはｐＥＲＥ（図３）を転写鋳型として用いて観察した。ｐＥＲＥを転写鋳型として用いた場合、ＥＲＦ２を添加しなくても、特異的転写物は観察されなかったので（レーン３）、基本的転写活性を上昇させるためにタバコのｔＴＢＰを添加したところ特異的転写物のサイズに相当する３７４ｎｔのシグナルが観察された（レーン４）。そこでさらにｔＴＢＰに加えてＥＲＦ２を添加するとレーン４で観察されたシグナルは増幅した（レーン５）。
データは示さないがこれと対象的にｐｍＥＲＥ（ｐＥＲＥの２コピーのシスエレメント（ＥＲＥ）を２コピーのｍＥＲＥと置換したもの）を転写鋳型として用いた場合には、この転写増幅は見られない。
これらの観察結果は、組換えＥＲＦ２が、ヒトの核抽出液中でＥＲＥに結合し、転写活性化因子として機能しうることを証明した。
【００２３】
参考例３
ここでは参考例２と同様にして他のＥＲＦｓの転写活性化能を調べた。
図５に示すように、ＥＲＦ１からＥＲＦ４の４種のＥＲＦを個々に標準的な試験管内転写系に添加するとｐＥＲＥ上での転写開始の速度を３から５倍増幅した。これに対し転写鋳型をｐｍＥＲＥとした場合は全く転写開始に影響がないので、ＥＲＦｓはどれもヒト核抽出液中でＥＲＥに依存した転写活性化因子として働くことが証明できた。各々の転写活性化能を較べると、それぞれの転写増幅率はＥＲＦ３で３倍、ＥＲＦ４で３．５倍、ＥＲＦ１で４倍、ＥＲＦ２で５倍であった。
【００２４】
実施例１
本実施例においては、ＥＲＦ２存在下でエチレン応答性プロモータからの遺伝子発現をｏＭＢＦ１が増幅することを調べた。
マルチプロテイン・ブリッジング・ファクター１（ＭＢＦ１）のエチレン応答性プロモーターからの転写増幅への関与の可能性を検討するために、農林水産省が作ったイネのＥＳＴライブラリーの中から、イネのＭＢＦ１をコードする候補遺伝子を選び出した。図６に、イネのＭＢＦ１（ｏＭＢＦ１）をコードするｃＤＮＡの塩基配列（配列番号２）及び予想されるアミノ酸配列（配列番号１、配列番号２の８５−５１０に相当する。）を示す。このアミノ酸配列（配列番号１）は、シロイヌナズナのＭＢＦ１（ＡｔＭＢＦ１）の配列と８１％の相同性があり、ヒトのＭＢＦ１（ｈＭＢＦ１）の配列との相同性（５３％）よりかなり高い値を示した。
【００２５】
転写コアクチベータとしてのＭＢＦ１の機能を示すためにタバコ細胞内でＭＢＦ１を発現するエフェクター・プラスミドＤＮＡ（ｐ３５Ｓ−ＭＢＦ１）を下記の手順で構築した。
エフェクター・プラスミドＤＮＡのｐ３５Ｓ−ＥＲＦ２とｐ３５Ｓ−ＭＢＦ１の構築にあたっては、プラスミド・ベクターｐＢＩ２２１(CLONTECH Laboratories Inc., CA)のＸｂａ Ｉ−Ｓａｃ Ｉ断片であるβ−グルクロニダーゼをコードする部分をぬきとり、そこに、ＰＣＲによって付け加えた上流のＸｂａ Ｉ部位と下流のＳａｃ Ｉ部位をあわせもつタバコのＥＲＦ２のｃＤＮＡ（accession No. ABO 16264）とイネのＭＢＦ１のｃＤＮＡ断片（配列番号２）を挿入してつくった。レポーター・プラスミドＤＮＡのｐＥＲＥ−ＧＵＳとｐｍＥＲＥ−ＧＵＳの構造については、すでに報告されている論文で用いられている、２（ＧＣＣ）Ｇｕｓ、２（ｍＧＣＣ）Ｇｕｓに対応している(Plant Cell 7:173-182(1995))。コントロール・プラスミドとして用いたｐ３５Ｓ−ＬＵＣは、上記のｐＢＩ２２１のＸｂａ Ｉ−Ｓａｃ Ｉ断片をＸｂａ Ｉ部位とＳａｃ Ｉ部位ではさまれたホタルのルシフェラーゼのｃＤＮＡ（accession No. E 08319）でおきかえたものである。
【００２６】
この実施例で用いたプラスミドＤＮＡを表３にまとめる。
【表３】
表中、ＧＵＳは大腸菌由来のβグルクロニダーゼ遺伝子（β-D-glucronidase）、ＬＵＣはホタルや海洋性発光細菌Vibrio菌由来のルシフェラーゼ遺伝子(luciferase)を表す。
【００２７】
このｐ３５Ｓ−ＭＢＦ１をマイクロプロジェクタイル・ボンバードメント法（ＤＮＡを金の微粒子に吸着させて、ヘリウムガスの噴射力で金微粒子とともにＤＮＡを植物体内に送り込む方法）を用いてタバコ葉に導入し、一過的にｏＭＢＦ１を発現させて、その機能を評価した。その方法を下記に示す。
タバコ葉を用いたトライジェント・アッセイは、既報(Plant Mol, Biol. Reporter 18:101-107(2000))に従って行った。２μｇのレポーター・プラスミドＤＮＡ（ｐＥＲＥ−ＧＵＳ）、１μｇのコントロール・プラスミドＤＮＡ（ｐ３５Ｓ−ＬＵＣ）および、様々に量を変えたエフェクター・プラスミドＤＮＡを０．５ｍｇの金微粒子（直径１．５から３．０μｍ、Aldrich Chem. WI）と共に３０μｌのＴＥ buffer中で混合した。次に３μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム、１００μｌのエチルアルコールをこれに加えて遠心によって、ＤＮＡを吸着した金微粒子を回収し、１００μｌのエチルアルコールをこれに加えて懸濁した。これを超音波で分散させ、このうち５μｌを用いて、２週間生育させたタバコ葉にヘリウムガスの噴射力によりＩＤＥＲＡ ＧＩＥ−III(TANAKA Co, Ltd., Sapporo, Japan)を用いて導入した。遺伝子導入後のタバコ葉は、光照射下で２５℃にて１２時間保温し、液体窒素中で凍結後、ミクロ・ディスメンブレータ(B. Brown Biotech International, Germany)を用いて粉状にした。サンプルは２等分し、一方は、ＧＵＳ−Ｌｉｇｈｔケミルミネッセンス検出キット（ＴＲＯＰＩＸ，ＭＡ）を用いてβ−グルクロニダーゼ活性を測定するのに使用した。また、もう一方は、ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイ・システム(Promega Corp., WI)とLuminescencer-JNR luminometer (ATTO Co, Ltd., Tokyo Japan)を用いて、そのルシフェラーゼ活性を測定するのに使用した。エチレン応答性プロモーターからの遺伝子発現をあらわす、β−グルクロニダーゼ活性は、このルシフェラーゼ活性にもとづいて補正された。
【００２８】
まずはじめに、金微粒子の表面に様々に量を変化させてレポーター・プラスミドＤＮＡ（ｐＥＲＥ−ＧＵＳ）を吸着させ、タバコ葉に導入し、βグルクロニダーゼ活性のダイナミックレンジを測定した。その結果を図７〜１０に示す。
この時、常に１μｇのコントロール・プラスミドＤＮＡ（ｐ３５Ｓ−ＬＵＣ）を混合し、それぞれのサンプルのルシフェラーゼ活性を測定しておくことにより、遺伝子の導入効率を算出し、各実験ごとのβ−グルクロニダーゼ活性の値を補正した。
この結果、ｐＥＲＥ−ＧＵＳ添加量１μｇから４μｇまではβ−グルクロニダーゼ活性は直線的に増大し、６μｇにするとやや減少傾向がみられることがわかった（図７）。従って今後のトランジェント・アッセイの実験においては、すべてのＤＮＡ混合液に２μｇのｐＥＲＥ−ＧＵＳと１μｇのｐ３５Ｓ−ＬＵＣを入れておくことにした。
【００２９】
上記の混合液に０．２μｇのエフェクター・プラスミドＤＮＡ（ｐ３５Ｓ−ＥＲＦ２）を加えても、ＧＵＳ活性の増加は見られないが、それ以上、０．７μｇくらいまで加えるとＧＵＳ活性は増大した（図８中央）。また、エフェクター・プラスミドＤＮＡとしてｐ３５Ｓ−ＭＢＦ１のみを量を変えて添加しても、ＧＵＳ活性には何の変動も見られなかった（図８右）。
これに対して、０．２μｇの第一のエフェクター・プラスミドＤＮＡ（ｐ３５Ｓ−ＥＲＦ２）の存在下で、第二のエフェクター・プラスミドＤＮＡ（ｐ３５Ｓ−ＭＢＦ１）を量を変えて添加すると添加量に応じて、ＧＵＳ活性は変化した（図９）。また、ＥＲＦ２とＭＢＦ１との共存下でのみ、協同的にＧＵＳ活性が増大することが分かる（図１０左）。
このような、ＥＲＦ２とＭＢＦ１共存下での協同的なＧＵＳ活性の増大は、レポーター・プラスミドＤＮＡとしてｐＥＲＥ−ＧＵＳを用いたときにのみ観察され、ｐｍＥＲＥ−ＧＵＳを用いた時には観察されなかった（図１０右）。
これらの観察結果は、ＥＲＦ２にとっては、ｏＭＢＦ１は転写コアクティベーターであることを示している。
【００３０】
実施例２
ＥＲＦ２以外のクローンである、例えば、ＥＲＦ４に対してもｏＭＢＦ１が転写コアクチベーターとして機能するかどうかを調べるために、実施例１と同様の実験をｐ３５Ｓ−ＥＲＦ２をｐ３５Ｓ−ＥＲＦ４に変えて行った。その結果を図１１及び図１２に示す。
ｐ３５Ｓ−ＥＲＦ４を０．５μｇ以上、１．０μｇくらいまで添加すると量に依存して数倍のＧＵＳ活性の変化が観察されたが、０．２μｇでは１．７倍程度の変化しかしなかった（図１１）。
そこでｐ３５Ｓ−ＥＲＦ４が０．２μｇ存在下で、０．５μｇのｐ３５Ｓ−ＭＢＦ１をさらに添加したところ５．５倍のＧＵＳ活性の増大が見られたのに対し（図１２左）、レポーター・プラスミドＤＮＡをｐｍＥＲＥ−ＧＵＳにとりかえた時には、全くＧＵＳ活性の増大は見られなかった（図１２右）。
これらの観察結果は、ＥＲＦ２の時と同様にＥＲＦ４を用いた場合でも、ｏＭＢＦ１は転写コアクチベータとして機能していることを示している。
【００３１】
【配列表】
【００３３】
【図面の簡単な説明】
【図１】参考例１で用いたＤＮＡプローブの塩基配列を示す図である。。図には野生型のＥＲＥ（上）と突然変異型のＥＲＥ（ｍＥＲＥ、下）を示した。各々のＤＮＡプローブは２コピーのＧＣＣボックス（太字）又は突然変異型ＧＣＣボックスを含む。
【図２】ゲルシフトアッセイにおけるＥＲＦ２のＥＲＥへの特異的結合を示すゲル泳動を示す図であり、Ｆは何も結合していないフリーのＤＮＡプローブを示し、ＣはＤＮＡ−ＥＲＦ２複合体を示す。
【図３】試験管内転写に用いたプラスミドＤＮＡ鋳型（ｐＥＲＥ）の構造を示す図である。
【図４】ｐＨＳＥ２００ＴＡ（レーン１）、ｐＨＳＥ２００ＧＡ（レーン２）、ｐＥＲＥ（レーン３−５）の各種ＤＮＡ鋳型を用いて得た転写物の電気泳動を示す図である。レーンの上部に記入されている精製組換え蛋白質の存在・非存在下の状態で、それぞれのプラスミドＤＮＡ鋳型をもとにして、ＲＮＡ合成を行った。図中、Ｍは一本鎖ＤＮＡの分子量マーカーを表し、＊はＴＡＴＡボックスに依存しない転写産物を示す。
【図５】各レーン上部に記入されている精製組換え蛋白質の存在下でのプラスミドＤＮＡ鋳型（ｐＥＲＥ）からの転写物の電気泳動を示す図である。
【図６】イネのＭＢＦ１（ｏＭＢＦ１）のｃＤＮＡの塩基配列（配列番号２）及び予想されるアミノ酸配列（配列番号１、配列番号２の８５−５１０に相当する。）を示す図である。アンダーラインを引いたところは、ポリＡ付加シグナルを示す。
【図７】タバコ葉を用いたトランジェント・アッセイにおける、レポータープラスミドＤＮＡ（ｐＥＲＥ−ＧＵＳ）の転写に与える影響を示す図である。縦軸は、タバコ葉に導入したレポーター・プラスミドＤＮＡ（ｐＥＲＥ−ＧＵＳ）の導入量に依存したＧＵＳ活性の増加を示す。値は２回の独立した実験結果の平均値である。
【図８】タバコ葉を用いたトランジェント・アッセイにおける、転写因子（ＥＲＦ２）や転写コアクティベーター（ｏＭＢＦ１）の添加の影響を示す図である。レポーター・プラスミドＤＮＡの転写における、ＥＲＦ２・ｏＭＢＦ１の添加量を変化させた場合の効果を示す。各々の棒グラフの下に、実験で用いたエフェクター・プラスミドＤＮＡの種類と量を示す。値は２回の独立した実験結果の平均値である。
【図９】タバコ葉を用いたトランジェント・アッセイにおける、ｏＭＢＦ１に依存した、ＥＲＦ２の転写活性化能の増幅を示す図である。ＥＲＦ２依存下でのレポーター・プラスミドＤＮＡの転写に与えるｏＭＢＦ１添加量の影響を示す。各々の棒グラフの下に示すように、それぞれの反応液には２μｇのｐＥＲＥ−ＧＵＳ、１μｇのｐ３５Ｓ−ＬＵＳ、０．２μｇのｐ３５Ｓ−ＥＲＦ２に加え、様々な量のｐ３５Ｓ−ＭＢＦ１を添加した。独立した２回の実験結果の平均値を図に示す。
【図１０】タバコ葉を用いたトランジェント・アッセイにおける、ｏＭＢＦ１に依存した、ＥＲＦ２の転写活性化能の増幅を示す図である。ＥＲＦ２、ｏＭＢＦ１存在下でのＥＲＥの塩基配列に依存した転写増幅を示す。各々の棒グラフの下に示す、レポーターやエフェクター・プラスミドＤＮＡを混合後、タバコ葉に導入した。独立した３回の実験結果の平均値を図に示す。
【図１１】タバコ葉を用いたトランジェント・アッセイにおける、ｏＭＢＦ１に依存した、ＥＲＦ４の転写活性化能の増幅を示す図である。レポーター・プラスミドＤＮＡの転写に与えるＥＲＦ４添加量の影響。各実験には、レポーター・プラスミドＤＮＡとして２μｇのｐＥＲＥ−ＧＵＳを用いた。各棒グラフの下に各々の実験で用いたエフェクター・プラスミドＤＮＡの種類と添加量を記入した。独立した３回の実験結果の平均値を図に示す。
【図１２】タバコ葉を用いたトランジェント・アッセイにおける、ｏＭＢＦ１に依存した、ＥＲＦ４の転写活性化能の増幅を示す図である。ＥＲＦ４、ｏＭＢＦ１依存下でのＥＲＥ塩基配列に依存した転写増幅。各々の棒グラフに示す、レポーターやエフェクター・プラスミドＤＮＡを混合後、タバコ葉に導入した。独立した３回の実験結果の平均値を図に示す。
【発明の属する技術分野】
この発明は、エチレン応答転写因子群の転写コアクチベータに関し、更にこの転写コアクチベータを用いて植物のエチレン応答を制御する手段に関する。
【０００２】
【従来の技術】
作物や花などの農産物の鮮度は、その商品価値を決定付ける大きな要因である。一方、植物ホルモンであるエチレンは、植物の発芽から老化に至る過程で植物細胞の機能を制御している。従って、その鮮度にエチレンという植物ホルモンが大きく影響することから多くの注意が払われてきた。農産物の生産者・流通業者・小売り業者にとって、このエチレンをコントロールすることにより、自由に鮮度をコントロールする技術は夢の技術であり、これが可能ならば、果実の熟しすぎや、花のいたみを抑えることが出来、経済的効果は大きい。
例えば、トマトの追熟を抑制する為にトマトのポリガラクチュロン酸分解酵素の遺伝子の発現を抑制した遺伝子組換えトマトの新品種フレーバーセーバーは有名であるが、この他にも、エチレン合成酵素遺伝子の発現を抑制して、エチレンの発生を抑制して、トマトの追熟を抑制する試みなどがなされている。
【０００３】
従来のエチレン応答制御は、エチレン応答性遺伝子のプロモーターを刺激する転写増幅因子の遺伝子やエチレンの標的遺伝子を組換える提案がほとんどである。このエチレン応答転写因子群（ＥＲＦｓ）は、エチレン応答性を示す植物遺伝子群の発現を正に制御する因子であることが知られている（Ohme-Takagi, M. and Shinshi, H., (1995) Ethylene-inducible DNA binding proteins that interact with an ethylene-responsive element. Plant Cell 7: 173-182.; Suzuki, K., Suzuki, N., Ohme-Takagi, M. and Shinshi, H., (1998) Immediate early induction of mRNAs for ethylene-responsive transcription factors in tobacco leaf strips after cutting. Plant J. 15: 657-665.）。
【０００４】
例えば、科学技術庁研究開発局 新しい植物実験系開発のための基盤技術に関する研究（II期平成５〜７年度）成果報告書平成８年１１月「生体防御機構解析のための実験系の開発と防御機構の解析」では、エチレンによって転写制御される生体防御遺伝子のエチレン応答性のシスＤＮＡエレメントをトランスジェニック植物のレポーター遺伝子実験により機能的に同定し、このエレメントと相互作用する転写制御遺伝子を同定することにより、植物生体制御応答の分子機構の解明を試みている。
また、特開2000-50877では、エチレン誘導性遺伝子を制御する転写因子を導入することによりタバコ等の植物に環境ストレスに対する抵抗性を付与する方法が開示されている。
更に、米国特許第5,824,868号には、改変したエチレン応答性ＤＮＡにより形質転換された植物のエチレン応答性を低下させ、このような形質転換された核酸の発現を制御する方法が開示されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、エチレン応答転写因子群（ＥＲＦｓ）の転写コアクチベータ（転写補助因子、ＭＢＦ）を特定し、エチレン応答性を示す植物遺伝子群の発現を正に制御するＥＲＦに対するＭＢＦの作用の機構を解明し、更に植物のエチレン応答を制御する手段を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段及び発明の実施の形態】
本発明のエチレン応答をコントロールする為に用いる遺伝子は、エチレン応答に必要な転写調節因子の１つであるマルチプロテイン・ブリッジング・ファクター１（ＭＢＦ１）をコードしている。転写調節因子は、細胞内においてわずかな分子数しか存在していないが、それらが構成する細胞内情報ネットワークをつかさどる重要な因子で、その遺伝子発現量をわずかに変化させるだけで、様々な生物応答に影響を与えることが出来る。そこで、もともと植物体内にあるＭＢＦ１遺伝子の発現量を後から植物に導入する遺伝子を用いることによって変化させ、植物のエチレン応答性を変化させ、作物の鮮度を制御する手段を提供する。
【０００７】
即ち、本発明は、以下（ａ）又は（ｂ）のタンパク質である。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列から成るタンパク質
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列から成り、かつその発現により植物のエチレン応答を強めるタンパク質
植物のエチレン応答を強めることは、直接植物のエチレン応答を強めることを確認してもよいし、エチレン応答性転写因子（ＥＲＦｓ）、例えば、後述のＥＲＦ２の発現を強めることを確認してもよい。
【０００８】
なお、発明者らがクローン化したイネのＭＢＦ１のアミノ酸配列（配列番号１）と同様の機能を有すると考えられる遺伝子は、他の植物にも見られ、それらのアミノ酸配列をイネのものと比較すると、シロイヌナズナの AtMBF1a; 81.69%、AtMBF1b; 79.58%、AtMBF1c; 47.97%、さつまいものStMBF1; 78.17%、ヒマの RcMBF1; 82.39%、トマトの LeMBF1; 44.90%となっている。これらの中で相同性の一番低いトマトの LeMBF1 がエチレンで誘導されることから、これもエチレン応答に関係する遺伝子であることが示唆される。
【０００９】
また、本発明は、以下（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡから成る遺伝子である。
（ａ）配列番号２の塩基配列から成るＤＮＡ
（ｂ）上記のタンパク質を指定する塩基配列から成るＤＮＡ
更に本発明は、この遺伝子の一部分から成るポリヌクレオチドである。
また、本発明は、プロモーター及び上記の遺伝子から成るポリヌクレオチドであって、その塩基配列が該プロモーターに対して順方向に連結されているポリヌクレオチドである。更に本発明は、プロモーター及び上記の遺伝子から成るポリヌクレオチドであって、その塩基配列が該プロモーターに対して逆方向に連結されているポリヌクレオチドである。
ここで用いるプロモーターとしては、カリフラワーモザイクウィルスの 35S プロモーター・熱ショックプロモーター・化学物質誘導性プロモーター等が挙げられる。
またプロモータ及び上記遺伝子の結合方法に特に制限は無く、通常の遺伝子工学的手法に従って適宜行うことができる。
【００１０】
ＭＢＦ１等の遺伝子やｃＤＮＡをプロモーターに対して逆に連結させたものを導入した生物において、その標的遺伝子の発現が抑制されることが多い（「アンチセンス RNA による抑制」と呼ばれる。）。また、順方向に連結してｍＲＮＡを大量に発現させた場合にも、異物として認識されてｍＲＮＡの分解が促進されて、結果として発現が抑制される（「コサプレッション技術」や「トランスウイッチ技術」と呼ばれている。）。このような公知の手法を本発明の遺伝子に用いることにより、該遺伝子の発現を抑制し、従って、植物のエチレン応答を抑制することができる。
【００１１】
また、本発明は上記ポリヌクレオチドを含有するプラスミドである。ここで用いるプラスミドとして、Ｔｉプラスミド、ｐＢＩ−１２１プラスミド等のバイナリーベクターが挙げられる。
上記ポリヌクレオチドにより形質転換される植物として、本発明の適用できる植物は、イネ・トウモロコシ・小麦等の単子葉植物、トマトなどの双子葉植物等である。
このような植物を形質転換するには、通常の遺伝子工学的手法を用いて、本発明の遺伝子を上記プラスミドに挿入し、上記植物を形質転換することができる。
【００１２】
【発明の効果】
本発明において、エチレン応答転写因子群の転写コアクチベータ（配列番号１及び２）を特定することができた。そして、この転写コアクチベータが、エチレン応答性を示す植物遺伝子群の発現を正に制御するＥＲＦに対する転写コアクチベータであることを確認した。
植物のエチレン応答を制御するために、本発明の転写コアクチベータの遺伝子を利用することができる。従来は、エチレン応答する標的遺伝子を変化させたり、エチレンを合成する遺伝子を変化させたりしていたが、本発明システムのように情報分子としての転写補助因子をコードする遺伝子を変化させると、その標的となる遺伝子群の発現をまとめてコントロール出来るようになるので、従来の方法に較べより大きな効果を発揮しうる。
【００１３】
【実施例】
以下、実施例にて本発明を例証するが、本発明を限定することを意図するものではない。
参考例１
ここでは、エチレン応答性エレメント（ＥＲＥ）への精製した組換えエチレン応答性転写因子（ＥＲＦｓ）の結合特異性を調べた。
ＥＲＥへのＥＲＦｓの結合特異性を調べるために、下記の方法で各組換えタバコ由来ＥＲＦを大腸菌内で過剰発現させ、精製した。
４種それぞれのタバコのＥＲＦｓの蛋白質コード領域を発現プラスミドｐＥＴ１５ｂ(Novagen, Madison, WI)に挿入し、組換えＥＲＦ蛋白質を大腸菌（ＢＬ２１／ＤＥ３／ｐＬｙｓＳ）中で大量発現させた。４種の組換え蛋白質をＮｉを個相化した担体(His-bind resin, Novagen)を用いて精製した。タバコ由来の組換えＴＢＰ（ｔＴＢＰ）については、すでに報告した方法で精製した。(Biosci. Biotech. Biochem., 58:916-920(1994))。精製した組換え蛋白質の精製度及び分子の大きさについては、通常のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（15% separationg gel;Nature
227:680-685b(1970)）で調べた。
各々のＥＲＦ蛋白の分子量をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認したところ、ｃＤＮＡ塩基配列から予測されるアミノ酸配列をもとにして計算した分子量よりもやや大きかった（３０−４５ｋＤａ）。
【００１４】
次に、ＥＲＦ２のＥＲＥへの結合能を下記のゲルシフト・アッセイを用いて調べた。
５３ｂｐの長さの野生型エチレン応答エレメント（ＥＲＥ）を含むＤＮＡ断片を(γ-32P）ＡＴＰとＴ４-polynucleotide kinase（TAKARA shuzo No.Ltd., Kyoto, JAPAN）を用いて放射線標識して、ＤＮＡプローブとした。一方、ＥＲＥ（配列番号３及び４）又はｍＥＲＥ（配列番号５及び６）断片（図１）を多コピー連結したものを、それぞれ野生型又は突然変異型のコンペチターとして用いた。ｍＥＲＥ（突然変異型）は、ＥＲＥ（野生型）と較べ、ＧＣＣボックスのＤＮＡ塩基配列に塩基置換を含む以外は、ほぼ同様のものである。１ｎｇの放射線標識したＤＮＡプローブ（１，０００から１０，０００ｃｐｍ）に１０ｎｇの組換えＥＲＦを単独で、又は１０ｎｇの組替えＥＲＦに１０ｎｇのコンペチターＤＮＡを混合して、１０μｌの表１に示すbinding buffer中で２５℃にて４５分間保温した。
【００１５】
【表１】
２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨｐＨ８．０
４０ｍＭ ＫＣｌ
０．１ｍＭ ＥＤＴＡ
１ｍＭ ＤＴＴ
２０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ
２５０ｎｇ ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）::（ｄＡ−ｄＴ）
０．１％ ｔｒｉｔｏｎＸ−１００
【００１６】
結合反応後のサンプルは、０．２５ＸＴＢ buffer（２２．５ｍＭ トリス−ほう酸、ｐＨ８．０）を含む４％ポリアクリルアミドゲル（アクリルアミド：ビスアクリルアミド＝３９：１、厚さ１ｍｍ、長さ１３ｃｍ）上にて、１００Ｖで２５℃にて３時間展開した。このゲルを乾燥し、フジ・イメージング・プレート(Fuji Photo Film Co. Ltd., Kanagawa, JAPAN)に暴露した。電気泳動パターンは、バイオ・イメージング・アナライザ（(Fuji Photo Film Co. Ltd.)を用いて可視化した。その結果を図２に示す。この図中、Ｆは何も結合していないフリーのＤＮＡプローブを示し、ＣはＤＮＡ−ＥＲＦ２複合体を示す。
【００１７】
１ｎｇの放射線標識したＤＮＡプローブに対して、ＥＲＦ２を１０ｎｇを作用させたところ、大きなサイズに相当するシフトしたＤＮＡと蛋白の複合体のバンドが確認された（図２）。このＤＮＡと蛋白の複合体の出現は、非標識ＥＲＥ断片の添加により阻害され、非標識ｍＥＲＥの添加で阻害されないことから、特異的に結合していることがわかる。またさらに他の３種類のＥＲＦ１、ＥＲＦ３、ＥＲＦ４も同様にＥＲＥに結合した。
【００１８】
参考例２
ここでは、ＨｅＬａ核抽出液（ＨＮＥ）中で、ＥＲＦ２によりＥＲＥ依存的転写が増幅されることを調べた。
ここで用いた試験管内転写用プラスミドＤＮＡ鋳型は次のように構築した。図３のプラスミドＤＮＡ鋳型（ｐＥＲＥ）を構築する為に、既報のプラスミドｐＵ３５(Pro. Natl. Acad. Sci. USA 87:7035-7039(1990))のＢｇｌII部位に２コピーのＥＲＥ ＤＮＡ断片（図１）を挿入した。ｐｍＥＲＥプラスミドＤＮＡ鋳型については、上記と同様の方法で、ＥＲＥのかわりにｍＥＲＥを２コピー挿入した。コントロール・プラスミドＤＮＡ鋳型であるｐＨＳＥ２００ＴＡ，ｐＨＳＥ２００ＧＡについては既報のとおりである(Plant Mol. Biol. 34:69-79(1997))。
【００１９】
また、試験管内転写反応は下記の手順で調べた。
試験管内転写に用いたＨｅＬａ核抽出液は既報(Meth. Enzymol. 101:582-598(1983))に従って調整した。標準的試験管内転写の反応液組成を表２に示す。
【表２】
１．試験管内転写反応液（１２．５μｌ）
１８．４ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨｐＨ７．９
５１．２ｍＭ ＫＣｌ
４．５ｍＭ Ｍｇ（ＣＨ３ＣＯＯ）２
０．０８ｍＭ ＥＤＴＡ
１．１２ｍＭ ＤＴＴ
１６％（ｗ／ｖ） ｇｌｙｃｅｒｏｌ
０．０４８％ ｔｒｉｔｏｎＸ−１００
０．１ｍＭ ＡＴＰ
０．１ｍＭ ＣＴＰ
０．０１ｍＭ ＵＴＰ
５μＣｉ ［α−３２Ｐ］ＵＴＰ（比活性、４００−８００Ｃｉ／ｍ ｍｏｌ）
０．５μｇ プラスミドＤＮＡ鋳型
０．０４ｍＭ ３’−０−ｍｅｔｈｙｌ−ＧＴＰ
２０ｕｎｉｔｓ ＲＮＡ分解酵素Ｔ１
１０μｇ 蛋白ヒト核抽出液（ＨＮＥ）
２．反応停止液
５％ ＳＤＳ
１０ｍＭ ＥＤＴＡ
０．４ｍｇ／ｍｌ ｇｌｙｃｏｇｅｎ
１５０ｍＭ 酢酸ナトリウム
【００２０】
転写反応は３０℃にて６０分間行ない７５μｌの反応停止液（表２）を加えて止めた。反応液には、さらに１００μｌＰＣＩＡＡ（５０％フェノール、４８％クロロホルム、２％イソアミルアルコール）を加えて水層を回収し、次にこの水層に１００μｌのＣＩＡＡ（９６％クロロホルム、４％イソノアミルアルコール）を加えて水層を回収した。次に、この液に１０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムと３００μｌのエチルアルコールを加えて核酸を回収し、この沈殿を乾燥後、これに１０μｌ尿素液（５Ｍ尿素、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ブロモフェノールブルー）を加えて核酸を溶解した。このサンプルは長さを分析するためにただちに、８９ｍＭ トリス−ほう酸（ｐＨ８．３）、２ｍＭ ＥＤＴＡ、８Ｍ尿素を含む６％ポリアクリルアミドゲル（アクリルアミド：ビスアクリルアミド＝１９：１、厚さ１ｍｍ、長さ１２．５ｃｍ）上で３００Ｖにて展開した。サンプル中に含まれるブロモフェノールブルーが、ゲルの最下端に到達したらゲルをはずし、１リットルの５％メタノール、５％酢酸を含む液に、つづいて、１リットルの５％メタノール液にそれぞれ２０分間ずつひたした。次にゲルをロ紙にはりつけて乾燥し、フジ・イメージング・プレートに一晩暴露し、バイオ・イメージング・アナライザを用いてＲＮＡを可視化した。
【００２１】
ＨＮＥ（ＨｅＬａ核抽出液）中でのプラスミドＤＮＡ鋳型上でのＴＡＴＡボックス依存的転写開始を確認するために、コントロール・プラスミドＤＮＡ鋳型としてｐＨＳＥ２００ＴＡ及びｐＨＳＡ２００ＧＡ(Plant Mol. Biol., 34:69-79(1997))を組換えタバコＴＢＰ（ｔＴＰＢ）存在下で用いた。ｐＨＳＥ２００ＴＡはシロイヌナズナの熱ショック蛋白質をコードする遺伝子の上流２００ｂｐのプロモーター部分の配列および、センス鎖にグアニン残基を含まない２００ｂｐの転写領域を含んでいる。ｐＨＳＡ２００ＧＡについてはｐＨＳＥ２００ＴＡと構造はほとんど同じで、ｐＨＳＥ２００ＴＡのＴＡＴＡボックス（ＴＡＴＡＡＡＴ）のすべてのＴ残基をＧに置換した（ＧＡＧＡＡＡＧ）ものである。
【００２２】
図４に、これらＤＮＡ鋳型を用いて得た転写物の電気泳動を示す。
ＤＮＡ鋳型としてｐＨＳＥ２００ＴＡを用いたときには、特異的に合成された２００ｎｔの転写物が観察された（レーン１）。一方、ｐＨＳＥ２００ＧＡを用いた時には、ＴＡＴＡボックス非依存的な転写物に由来する弱いシグナルが観察されただけである（レーン２）。
精製組換えＥＲＦ２の転写活性化因子としての生化学的機能についてはｐＥＲＥ（図３）を転写鋳型として用いて観察した。ｐＥＲＥを転写鋳型として用いた場合、ＥＲＦ２を添加しなくても、特異的転写物は観察されなかったので（レーン３）、基本的転写活性を上昇させるためにタバコのｔＴＢＰを添加したところ特異的転写物のサイズに相当する３７４ｎｔのシグナルが観察された（レーン４）。そこでさらにｔＴＢＰに加えてＥＲＦ２を添加するとレーン４で観察されたシグナルは増幅した（レーン５）。
データは示さないがこれと対象的にｐｍＥＲＥ（ｐＥＲＥの２コピーのシスエレメント（ＥＲＥ）を２コピーのｍＥＲＥと置換したもの）を転写鋳型として用いた場合には、この転写増幅は見られない。
これらの観察結果は、組換えＥＲＦ２が、ヒトの核抽出液中でＥＲＥに結合し、転写活性化因子として機能しうることを証明した。
【００２３】
参考例３
ここでは参考例２と同様にして他のＥＲＦｓの転写活性化能を調べた。
図５に示すように、ＥＲＦ１からＥＲＦ４の４種のＥＲＦを個々に標準的な試験管内転写系に添加するとｐＥＲＥ上での転写開始の速度を３から５倍増幅した。これに対し転写鋳型をｐｍＥＲＥとした場合は全く転写開始に影響がないので、ＥＲＦｓはどれもヒト核抽出液中でＥＲＥに依存した転写活性化因子として働くことが証明できた。各々の転写活性化能を較べると、それぞれの転写増幅率はＥＲＦ３で３倍、ＥＲＦ４で３．５倍、ＥＲＦ１で４倍、ＥＲＦ２で５倍であった。
【００２４】
実施例１
本実施例においては、ＥＲＦ２存在下でエチレン応答性プロモータからの遺伝子発現をｏＭＢＦ１が増幅することを調べた。
マルチプロテイン・ブリッジング・ファクター１（ＭＢＦ１）のエチレン応答性プロモーターからの転写増幅への関与の可能性を検討するために、農林水産省が作ったイネのＥＳＴライブラリーの中から、イネのＭＢＦ１をコードする候補遺伝子を選び出した。図６に、イネのＭＢＦ１（ｏＭＢＦ１）をコードするｃＤＮＡの塩基配列（配列番号２）及び予想されるアミノ酸配列（配列番号１、配列番号２の８５−５１０に相当する。）を示す。このアミノ酸配列（配列番号１）は、シロイヌナズナのＭＢＦ１（ＡｔＭＢＦ１）の配列と８１％の相同性があり、ヒトのＭＢＦ１（ｈＭＢＦ１）の配列との相同性（５３％）よりかなり高い値を示した。
【００２５】
転写コアクチベータとしてのＭＢＦ１の機能を示すためにタバコ細胞内でＭＢＦ１を発現するエフェクター・プラスミドＤＮＡ（ｐ３５Ｓ−ＭＢＦ１）を下記の手順で構築した。
エフェクター・プラスミドＤＮＡのｐ３５Ｓ−ＥＲＦ２とｐ３５Ｓ−ＭＢＦ１の構築にあたっては、プラスミド・ベクターｐＢＩ２２１(CLONTECH Laboratories Inc., CA)のＸｂａ Ｉ−Ｓａｃ Ｉ断片であるβ−グルクロニダーゼをコードする部分をぬきとり、そこに、ＰＣＲによって付け加えた上流のＸｂａ Ｉ部位と下流のＳａｃ Ｉ部位をあわせもつタバコのＥＲＦ２のｃＤＮＡ（accession No. ABO 16264）とイネのＭＢＦ１のｃＤＮＡ断片（配列番号２）を挿入してつくった。レポーター・プラスミドＤＮＡのｐＥＲＥ−ＧＵＳとｐｍＥＲＥ−ＧＵＳの構造については、すでに報告されている論文で用いられている、２（ＧＣＣ）Ｇｕｓ、２（ｍＧＣＣ）Ｇｕｓに対応している(Plant Cell 7:173-182(1995))。コントロール・プラスミドとして用いたｐ３５Ｓ−ＬＵＣは、上記のｐＢＩ２２１のＸｂａ Ｉ−Ｓａｃ Ｉ断片をＸｂａ Ｉ部位とＳａｃ Ｉ部位ではさまれたホタルのルシフェラーゼのｃＤＮＡ（accession No. E 08319）でおきかえたものである。
【００２６】
この実施例で用いたプラスミドＤＮＡを表３にまとめる。
【表３】
【００２７】
このｐ３５Ｓ−ＭＢＦ１をマイクロプロジェクタイル・ボンバードメント法（ＤＮＡを金の微粒子に吸着させて、ヘリウムガスの噴射力で金微粒子とともにＤＮＡを植物体内に送り込む方法）を用いてタバコ葉に導入し、一過的にｏＭＢＦ１を発現させて、その機能を評価した。その方法を下記に示す。
タバコ葉を用いたトライジェント・アッセイは、既報(Plant Mol, Biol. Reporter 18:101-107(2000))に従って行った。２μｇのレポーター・プラスミドＤＮＡ（ｐＥＲＥ−ＧＵＳ）、１μｇのコントロール・プラスミドＤＮＡ（ｐ３５Ｓ−ＬＵＣ）および、様々に量を変えたエフェクター・プラスミドＤＮＡを０．５ｍｇの金微粒子（直径１．５から３．０μｍ、Aldrich Chem. WI）と共に３０μｌのＴＥ buffer中で混合した。次に３μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム、１００μｌのエチルアルコールをこれに加えて遠心によって、ＤＮＡを吸着した金微粒子を回収し、１００μｌのエチルアルコールをこれに加えて懸濁した。これを超音波で分散させ、このうち５μｌを用いて、２週間生育させたタバコ葉にヘリウムガスの噴射力によりＩＤＥＲＡ ＧＩＥ−III(TANAKA Co, Ltd., Sapporo, Japan)を用いて導入した。遺伝子導入後のタバコ葉は、光照射下で２５℃にて１２時間保温し、液体窒素中で凍結後、ミクロ・ディスメンブレータ(B. Brown Biotech International, Germany)を用いて粉状にした。サンプルは２等分し、一方は、ＧＵＳ−Ｌｉｇｈｔケミルミネッセンス検出キット（ＴＲＯＰＩＸ，ＭＡ）を用いてβ−グルクロニダーゼ活性を測定するのに使用した。また、もう一方は、ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイ・システム(Promega Corp., WI)とLuminescencer-JNR luminometer (ATTO Co, Ltd., Tokyo Japan)を用いて、そのルシフェラーゼ活性を測定するのに使用した。エチレン応答性プロモーターからの遺伝子発現をあらわす、β−グルクロニダーゼ活性は、このルシフェラーゼ活性にもとづいて補正された。
【００２８】
まずはじめに、金微粒子の表面に様々に量を変化させてレポーター・プラスミドＤＮＡ（ｐＥＲＥ−ＧＵＳ）を吸着させ、タバコ葉に導入し、βグルクロニダーゼ活性のダイナミックレンジを測定した。その結果を図７〜１０に示す。
この時、常に１μｇのコントロール・プラスミドＤＮＡ（ｐ３５Ｓ−ＬＵＣ）を混合し、それぞれのサンプルのルシフェラーゼ活性を測定しておくことにより、遺伝子の導入効率を算出し、各実験ごとのβ−グルクロニダーゼ活性の値を補正した。
この結果、ｐＥＲＥ−ＧＵＳ添加量１μｇから４μｇまではβ−グルクロニダーゼ活性は直線的に増大し、６μｇにするとやや減少傾向がみられることがわかった（図７）。従って今後のトランジェント・アッセイの実験においては、すべてのＤＮＡ混合液に２μｇのｐＥＲＥ−ＧＵＳと１μｇのｐ３５Ｓ−ＬＵＣを入れておくことにした。
【００２９】
上記の混合液に０．２μｇのエフェクター・プラスミドＤＮＡ（ｐ３５Ｓ−ＥＲＦ２）を加えても、ＧＵＳ活性の増加は見られないが、それ以上、０．７μｇくらいまで加えるとＧＵＳ活性は増大した（図８中央）。また、エフェクター・プラスミドＤＮＡとしてｐ３５Ｓ−ＭＢＦ１のみを量を変えて添加しても、ＧＵＳ活性には何の変動も見られなかった（図８右）。
これに対して、０．２μｇの第一のエフェクター・プラスミドＤＮＡ（ｐ３５Ｓ−ＥＲＦ２）の存在下で、第二のエフェクター・プラスミドＤＮＡ（ｐ３５Ｓ−ＭＢＦ１）を量を変えて添加すると添加量に応じて、ＧＵＳ活性は変化した（図９）。また、ＥＲＦ２とＭＢＦ１との共存下でのみ、協同的にＧＵＳ活性が増大することが分かる（図１０左）。
このような、ＥＲＦ２とＭＢＦ１共存下での協同的なＧＵＳ活性の増大は、レポーター・プラスミドＤＮＡとしてｐＥＲＥ−ＧＵＳを用いたときにのみ観察され、ｐｍＥＲＥ−ＧＵＳを用いた時には観察されなかった（図１０右）。
これらの観察結果は、ＥＲＦ２にとっては、ｏＭＢＦ１は転写コアクティベーターであることを示している。
【００３０】
実施例２
ＥＲＦ２以外のクローンである、例えば、ＥＲＦ４に対してもｏＭＢＦ１が転写コアクチベーターとして機能するかどうかを調べるために、実施例１と同様の実験をｐ３５Ｓ−ＥＲＦ２をｐ３５Ｓ−ＥＲＦ４に変えて行った。その結果を図１１及び図１２に示す。
ｐ３５Ｓ−ＥＲＦ４を０．５μｇ以上、１．０μｇくらいまで添加すると量に依存して数倍のＧＵＳ活性の変化が観察されたが、０．２μｇでは１．７倍程度の変化しかしなかった（図１１）。
そこでｐ３５Ｓ−ＥＲＦ４が０．２μｇ存在下で、０．５μｇのｐ３５Ｓ−ＭＢＦ１をさらに添加したところ５．５倍のＧＵＳ活性の増大が見られたのに対し（図１２左）、レポーター・プラスミドＤＮＡをｐｍＥＲＥ−ＧＵＳにとりかえた時には、全くＧＵＳ活性の増大は見られなかった（図１２右）。
これらの観察結果は、ＥＲＦ２の時と同様にＥＲＦ４を用いた場合でも、ｏＭＢＦ１は転写コアクチベータとして機能していることを示している。
【００３１】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】参考例１で用いたＤＮＡプローブの塩基配列を示す図である。。図には野生型のＥＲＥ（上）と突然変異型のＥＲＥ（ｍＥＲＥ、下）を示した。各々のＤＮＡプローブは２コピーのＧＣＣボックス（太字）又は突然変異型ＧＣＣボックスを含む。
【図２】ゲルシフトアッセイにおけるＥＲＦ２のＥＲＥへの特異的結合を示すゲル泳動を示す図であり、Ｆは何も結合していないフリーのＤＮＡプローブを示し、ＣはＤＮＡ−ＥＲＦ２複合体を示す。
【図３】試験管内転写に用いたプラスミドＤＮＡ鋳型（ｐＥＲＥ）の構造を示す図である。
【図４】ｐＨＳＥ２００ＴＡ（レーン１）、ｐＨＳＥ２００ＧＡ（レーン２）、ｐＥＲＥ（レーン３−５）の各種ＤＮＡ鋳型を用いて得た転写物の電気泳動を示す図である。レーンの上部に記入されている精製組換え蛋白質の存在・非存在下の状態で、それぞれのプラスミドＤＮＡ鋳型をもとにして、ＲＮＡ合成を行った。図中、Ｍは一本鎖ＤＮＡの分子量マーカーを表し、＊はＴＡＴＡボックスに依存しない転写産物を示す。
【図５】各レーン上部に記入されている精製組換え蛋白質の存在下でのプラスミドＤＮＡ鋳型（ｐＥＲＥ）からの転写物の電気泳動を示す図である。
【図６】イネのＭＢＦ１（ｏＭＢＦ１）のｃＤＮＡの塩基配列（配列番号２）及び予想されるアミノ酸配列（配列番号１、配列番号２の８５−５１０に相当する。）を示す図である。アンダーラインを引いたところは、ポリＡ付加シグナルを示す。
【図７】タバコ葉を用いたトランジェント・アッセイにおける、レポータープラスミドＤＮＡ（ｐＥＲＥ−ＧＵＳ）の転写に与える影響を示す図である。縦軸は、タバコ葉に導入したレポーター・プラスミドＤＮＡ（ｐＥＲＥ−ＧＵＳ）の導入量に依存したＧＵＳ活性の増加を示す。値は２回の独立した実験結果の平均値である。
【図８】タバコ葉を用いたトランジェント・アッセイにおける、転写因子（ＥＲＦ２）や転写コアクティベーター（ｏＭＢＦ１）の添加の影響を示す図である。レポーター・プラスミドＤＮＡの転写における、ＥＲＦ２・ｏＭＢＦ１の添加量を変化させた場合の効果を示す。各々の棒グラフの下に、実験で用いたエフェクター・プラスミドＤＮＡの種類と量を示す。値は２回の独立した実験結果の平均値である。
【図９】タバコ葉を用いたトランジェント・アッセイにおける、ｏＭＢＦ１に依存した、ＥＲＦ２の転写活性化能の増幅を示す図である。ＥＲＦ２依存下でのレポーター・プラスミドＤＮＡの転写に与えるｏＭＢＦ１添加量の影響を示す。各々の棒グラフの下に示すように、それぞれの反応液には２μｇのｐＥＲＥ−ＧＵＳ、１μｇのｐ３５Ｓ−ＬＵＳ、０．２μｇのｐ３５Ｓ−ＥＲＦ２に加え、様々な量のｐ３５Ｓ−ＭＢＦ１を添加した。独立した２回の実験結果の平均値を図に示す。
【図１０】タバコ葉を用いたトランジェント・アッセイにおける、ｏＭＢＦ１に依存した、ＥＲＦ２の転写活性化能の増幅を示す図である。ＥＲＦ２、ｏＭＢＦ１存在下でのＥＲＥの塩基配列に依存した転写増幅を示す。各々の棒グラフの下に示す、レポーターやエフェクター・プラスミドＤＮＡを混合後、タバコ葉に導入した。独立した３回の実験結果の平均値を図に示す。
【図１１】タバコ葉を用いたトランジェント・アッセイにおける、ｏＭＢＦ１に依存した、ＥＲＦ４の転写活性化能の増幅を示す図である。レポーター・プラスミドＤＮＡの転写に与えるＥＲＦ４添加量の影響。各実験には、レポーター・プラスミドＤＮＡとして２μｇのｐＥＲＥ−ＧＵＳを用いた。各棒グラフの下に各々の実験で用いたエフェクター・プラスミドＤＮＡの種類と添加量を記入した。独立した３回の実験結果の平均値を図に示す。
【図１２】タバコ葉を用いたトランジェント・アッセイにおける、ｏＭＢＦ１に依存した、ＥＲＦ４の転写活性化能の増幅を示す図である。ＥＲＦ４、ｏＭＢＦ１依存下でのＥＲＥ塩基配列に依存した転写増幅。各々の棒グラフに示す、レポーターやエフェクター・プラスミドＤＮＡを混合後、タバコ葉に導入した。独立した３回の実験結果の平均値を図に示す。
Claims (5)
- 以下（ａ）又は（ｂ）のタンパク質。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列から成るタンパク質
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列から成り、かつその発現により植物のエチレン応答を強めるタンパク質 - 以下（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡから成る遺伝子。
（ａ）配列番号２の塩基配列から成るＤＮＡ
（ｂ）請求項１のタンパク質を指定する塩基配列から成るＤＮＡ - プロモーター及び請求項２に記載の遺伝子から成るポリヌクレオチドであって、該塩基配列が該プロモーターに対して順方向に連結されているポリヌクレオチド。
- プロモーター及び請求項２に記載の遺伝子から成るポリヌクレオチドであって、該塩基配列が該プロモーターに対して逆方向に連結されているポリヌクレオチド。
- 請求項３又は４のポリヌクレオチドを含有するプラスミド。
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