JP2003235567A - 植物のエチレン応答転写コアクチベータ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】エチレン応答転写因子群（ＥＲＦｓ）の転写コ
アクチベータ（転写補助因子、ＭＢＦ）を特定し、エチ
レン応答性を示す植物遺伝子群の発現を正に制御するＥ
ＲＦに対するＭＢＦの作用の機構を解明し、更に植物の
エチレン応答を制御する手段を提供する。 【解決手段】 エチレン応答転写因子群の転写コアク
チベータを特定した。この転写コアクチベータが、エチ
レン応答性を示す植物遺伝子群の発現を正に制御するＥ
ＲＦに対する転写コアクチベータであることを確認し
た。この転写コアクチベータの遺伝子を利用して、植物
のエチレン応答を制御することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この発明は、エチレン応答転
写因子群の転写コアクチベータに関し、更にこの転写コ
アクチベータを用いて植物のエチレン応答を制御する手
段に関する。

【０００２】

【従来の技術】作物や花などの農産物の鮮度は、その商
品価値を決定付ける大きな要因である。一方、植物ホル
モンであるエチレンは、植物の発芽から老化に至る過程
で植物細胞の機能を制御している。従って、その鮮度に
エチレンという植物ホルモンが大きく影響することから
多くの注意が払われてきた。農産物の生産者・流通業者
・小売り業者にとって、このエチレンをコントロールす
ることにより、自由に鮮度をコントロールする技術は夢
の技術であり、これが可能ならば、果実の熟しすぎや、
花のいたみを抑えることが出来、経済的効果は大きい。
例えば、トマトの追熟を抑制する為にトマトのポリガラ
クチュロン酸分解酵素の遺伝子の発現を抑制した遺伝子
組換えトマトの新品種フレーバーセーバーは有名である
が、この他にも、エチレン合成酵素遺伝子の発現を抑制
して、エチレンの発生を抑制して、トマトの追熟を抑制
する試みなどがなされている。

【０００３】従来のエチレン応答制御は、エチレン応答
性遺伝子のプロモーターを刺激する転写増幅因子の遺伝
子やエチレンの標的遺伝子を組換える提案がほとんどで
ある。このエチレン応答転写因子群（ＥＲＦｓ）は、エ
チレン応答性を示す植物遺伝子群の発現を正に制御する
因子であることが知られている（Ohme-Takagi, M. and
Shinshi, H., (1995) Ethylene-inducible DNA binding
proteins that interact with an ethylene-responsiv
e element. Plant Cell 7: 173-182.; Suzuki,K., Suzu
ki, N., Ohme-Takagi, M. and Shinshi, H., (1998) Im
mediate earlyinduction of mRNAs for ethylene-respo
nsive transcription factors in tobacco leaf strips
after cutting. Plant J. 15: 657-665.）。

【０００４】例えば、科学技術庁研究開発局 新しい植
物実験系開発のための基盤技術に関する研究（II期平成
５〜７年度）成果報告書平成８年１１月「生体防御機構
解析のための実験系の開発と防御機構の解析」では、エ
チレンによって転写制御される生体防御遺伝子のエチレ
ン応答性のシスＤＮＡエレメントをトランスジェニック
植物のレポーター遺伝子実験により機能的に同定し、こ
のエレメントと相互作用する転写制御遺伝子を同定する
ことにより、植物生体制御応答の分子機構の解明を試み
ている。また、特開2000-50877では、エチレン誘導性遺
伝子を制御する転写因子を導入することによりタバコ等
の植物に環境ストレスに対する抵抗性を付与する方法が
開示されている。更に、米国特許第5,824,868号には、
改変したエチレン応答性ＤＮＡにより形質転換された植
物のエチレン応答性を低下させ、このような形質転換さ
れた核酸の発現を制御する方法が開示されている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、エチ
レン応答転写因子群（ＥＲＦｓ）の転写コアクチベータ
（転写補助因子、ＭＢＦ）を特定し、エチレン応答性を
示す植物遺伝子群の発現を正に制御するＥＲＦに対する
ＭＢＦの作用の機構を解明し、更に植物のエチレン応答
を制御する手段を提供することである。

【０００６】

【課題を解決するための手段及び発明の実施の形態】本
発明のエチレン応答をコントロールする為に用いる遺伝
子は、エチレン応答に必要な転写調節因子の１つである
マルチプロテイン・ブリッジング・ファクター１（ＭＢ
Ｆ１）をコードしている。転写調節因子は、細胞内にお
いてわずかな分子数しか存在していないが、それらが構
成する細胞内情報ネットワークをつかさどる重要な因子
で、その遺伝子発現量をわずかに変化させるだけで、様
々な生物応答に影響を与えることが出来る。そこで、も
ともと植物体内にあるＭＢＦ１遺伝子の発現量を後から
植物に導入する遺伝子を用いることによって変化させ、
植物のエチレン応答性を変化させ、作物の鮮度を制御す
る手段を提供する。

【０００７】即ち、本発明は、以下（ａ）又は（ｂ）の
タンパク質である。 （ａ）配列番号１のアミノ酸配列から成るタンパク質 （ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において１若しくは数
個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸
配列から成り、かつその発現により植物のエチレン応答
を強めるタンパク質 植物のエチレン応答を強めることは、直接植物のエチレ
ン応答を強めることを確認してもよいし、エチレン応答
性転写因子（ＥＲＦｓ）、例えば、後述のＥＲＦ２の発
現を強めることを確認してもよい。

【０００８】なお、発明者らがクローン化したイネのＭ
ＢＦ１のアミノ酸配列（配列番号１）と同様の機能を有
すると考えられる遺伝子は、他の植物にも見られ、それ
らのアミノ酸配列をイネのものと比較すると、シロイヌ
ナズナの AtMBF1a; 81.69%、AtMBF1b; 79.58%、AtMBF1
c; 47.97%、さつまいものStMBF1; 78.17%、ヒマの RcMB
F1; 82.39%、トマトの LeMBF1; 44.90%となっている。
これらの中で相同性の一番低いトマトの LeMBF1 がエチ
レンで誘導されることから、これもエチレン応答に関係
する遺伝子であることが示唆される。

【０００９】また、本発明は、以下（ａ）又は（ｂ）の
ＤＮＡから成る遺伝子である。 （ａ）配列番号２の塩基配列から成るＤＮＡ （ｂ）上記のタンパク質を指定する塩基配列を有するＤ
ＮＡ 更に本発明は、この遺伝子の一部分から成るポリヌクレ
オチドである。また、本発明は、プロモーター及び上記
の遺伝子を有するポリヌクレオチドであって、その塩基
配列が該プロモーターに対して順方向に連結されている
ポリヌクレオチドである。更に本発明は、プロモーター
及び上記の遺伝子を有するポリヌクレオチドであって、
その塩基配列が該プロモーターに対して逆方向に連結さ
れているポリヌクレオチドである。ここで用いるプロモ
ーターとしては、カリフラワーモザイクウィルスの 35S
プロモーター・熱ショックプロモーター・化学物質誘導
性プロモーター等が挙げられる。またプロモータ及び上
記遺伝子の結合方法に特に制限は無く、通常の遺伝子工
学的手法に従って適宜行うことができる。

【００１０】ＭＢＦ１等の遺伝子の一部分やｃＤＮＡを
プロモーターに対して逆に連結させたものを導入した生
物において、その標的遺伝子の発現が抑制されることが
多い（「アンチセンス RNA による抑制」と呼ばれ
る。）。また、順方向に連結してｍＲＮＡを大量に発現
させた場合にも、異物として認識されてｍＲＮＡの分解
が促進されて、結果として発現が抑制される（「コサプ
レッション技術」や「トランスウイッチ技術」と呼ばれ
ている。）。このような公知の手法を本発明の遺伝子に
用いることにより、該遺伝子の発現を抑制し、従って、
植物のエチレン応答を抑制することができる。

【００１１】また、本発明は上記ポリヌクレオチドを含
有するプラスミドである。ここで用いるプラスミドとし
て、Ｔｉプラスミド、ｐＢＩ−１２１プラスミド等のバ
イナリーベクターが挙げられる。更に、本発明は、上記
ポリヌクレオチドにより形質転換された植物である。本
発明の適用できる植物は、イネ・トウモロコシ・小麦等
の単子葉植物、トマトなどの双子葉植物等である。この
ような植物を形質転換するには、通常の遺伝子工学的手
法を用いて、本発明の遺伝子を上記プラスミドに挿入
し、上記植物を形質転換することができる。

【００１２】

【発明の効果】本発明において、エチレン応答転写因子
群の転写コアクチベータ（配列番号１及び２）を特定す
ることができた。そして、この転写コアクチベータが、
エチレン応答性を示す植物遺伝子群の発現を正に制御す
るＥＲＦに対する転写コアクチベータであることを確認
した。植物のエチレン応答を制御するために、本発明の
転写コアクチベータの遺伝子を利用することができる。
従来は、エチレン応答する標的遺伝子を変化させたり、
エチレンを合成する遺伝子を変化させたりしていたが、
本発明システムのように情報分子としての転写補助因子
をコードする遺伝子を変化させると、その標的となる遺
伝子群の発現をまとめてコントロール出来るようになる
ので、従来の方法に較べより大きな効果を発揮しうる。

【００１３】

【実施例】以下、実施例にて本発明を例証するが、本発
明を限定することを意図するものではない。参考例１ ここでは、エチレン応答性エレメント（ＥＲＥ）への精
製した組換えエチレン応答性転写因子（ＥＲＦｓ）の結
合特異性を調べた。ＥＲＥへのＥＲＦｓの結合特異性を
調べるために、下記の方法で各組換えタバコ由来ＥＲＦ
を大腸菌内で過剰発現させ、精製した。４種それぞれの
タバコのＥＲＦｓの蛋白質コード領域を発現プラスミド
ｐＥＴ１５ｂ(Novagen, Madison, WI)に挿入し、組換え
ＥＲＦ蛋白質を大腸菌（ＢＬ２１／ＤＥ３／ｐＬｙｓ
Ｓ）中で大量発現させた。４種の組換え蛋白質をＮｉを
個相化した担体(His-bind resin, Novagen)を用いて精
製した。タバコ由来の組換えＴＢＰ（ｔＴＢＰ）につい
ては、すでに報告した方法で精製した。(Biosci. Biote
ch. Biochem., 58:916-920(1994))。精製した組換え蛋
白質の精製度及び分子の大きさについては、通常のＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ（15% separationg gel;Nature227:680-68
5b(1970)）で調べた。各々のＥＲＦ蛋白の分子量をＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥで確認したところ、ｃＤＮＡ塩基配列から
予測されるアミノ酸配列をもとにして計算した分子量よ
りもやや大きかった（３０−４５ｋＤａ）。

【００１４】次に、ＥＲＦ２のＥＲＥへの結合能を下記
のゲルシフト・アッセイを用いて調べた。５３ｂｐの長
さの野生型エチレン応答エレメント（ＥＲＥ）を含むＤ
ＮＡ断片を(γ^-32P）ＡＴＰとＴ４-polynucleotide kin
ase（TAKARA shuzo No.Ltd., Kyoto, JAPAN）を用いて
放射線標識して、ＤＮＡプローブとした。一方、ＥＲＥ
（配列番号３及び４）又はｍＥＲＥ（配列番号５及び
６）断片（図１）を多コピー連結したものを、それぞれ
野生型又は突然変異型のコンペチターとして用いた。ｍ
ＥＲＥ（突然変異型）は、ＥＲＥ（野生型）と較べ、Ｇ
ＣＣボックスのＤＮＡ塩基配列に塩基置換を含む以外
は、ほぼ同様のものである。１ｎｇの放射線標識したＤ
ＮＡプローブ（１，０００から１０，０００ｃｐｍ）に
１０ｎｇの組換えＥＲＦを単独で、又は１０ｎｇの組替
えＥＲＦに１０ｎｇのコンペチターＤＮＡを混合して、
１０μｌの表１に示すbinding buffer中で２５℃にて４
５分間保温した。

【００１５】

【表１】 ２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨｐＨ８．０ ４０ｍＭ ＫＣｌ ０．１ｍＭ ＥＤＴＡ １ｍＭ ＤＴＴ ２０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ ２５０ｎｇ ｐｏｌｙ（ｄＡ−ｄＴ）::（ｄＡ−ｄＴ） ０．１％ ｔｒｉｔｏｎＸ−１００

【００１６】結合反応後のサンプルは、０．２５ＸＴＢ
buffer（２２．５ｍＭ トリス−ほう酸、ｐＨ８．
０）を含む４％ポリアクリルアミドゲル（アクリルアミ
ド：ビスアクリルアミド＝３９：１、厚さ１ｍｍ、長さ
１３ｃｍ）上にて、１００Ｖで２５℃にて３時間展開し
た。このゲルを乾燥し、フジ・イメージング・プレート
(Fuji Photo Film Co. Ltd., Kanagawa, JAPAN)に暴露
した。電気泳動パターンは、バイオ・イメージング・ア
ナライザ（(Fuji Photo Film Co. Ltd.)を用いて可視化
した。その結果を図２に示す。この図中、Ｆは何も結合
していないフリーのＤＮＡプローブを示し、ＣはＤＮＡ
−ＥＲＦ２複合体を示す。

【００１７】１ｎｇの放射線標識したＤＮＡプローブに
対して、ＥＲＦ２を１０ｎｇを作用させたところ、大き
なサイズに相当するシフトしたＤＮＡと蛋白の複合体の
バンドが確認された（図２）。このＤＮＡと蛋白の複合
体の出現は、非標識ＥＲＥ断片の添加により阻害され、
非標識ｍＥＲＥの添加で阻害されないことから、特異的
に結合していることがわかる。またさらに他の３種類の
ＥＲＦ１、ＥＲＦ３、ＥＲＦ４も同様にＥＲＥに結合し
た。

【００１８】参考例２ ここでは、ＨｅＬａ核抽出液（ＨＮＥ）中で、ＥＲＦ２
によりＥＲＥ依存的転写が増幅されることを調べた。こ
こで用いた試験管内転写用プラスミドＤＮＡ鋳型は次の
ように構築した。図３のプラスミドＤＮＡ鋳型（ｐＥＲ
Ｅ）を構築する為に、既報のプラスミドｐＵ３５(Pro.
Natl. Acad. Sci. USA 87:7035-7039(1990))のＢｇｌII
部位に２コピーのＥＲＥ ＤＮＡ断片（図１）を挿入し
た。ｐｍＥＲＥプラスミドＤＮＡ鋳型については、上記
と同様の方法で、ＥＲＥのかわりにｍＥＲＥを２コピー
挿入した。コントロール・プラスミドＤＮＡ鋳型である
ｐＨＳＥ２００ＴＡ，ｐＨＳＥ２００ＧＡについては既
報のとおりである(Plant Mol. Biol. 34:69-79(199
7))。

【００１９】また、試験管内転写反応は下記の手順で調
べた。試験管内転写に用いたＨｅＬａ核抽出液は既報(M
eth. Enzymol. 101:582-598(1983))に従って調整した。
標準的試験管内転写の反応液組成を表２に示す。

【表２】試験管内転写反応液（１２．５μｌ） １８．４ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨｐＨ７．９ ５１．２ｍＭ ＫＣｌ ４．５ｍＭ Ｍｇ（ＣＨ_３ＣＯＯ）_２ ０．０８ｍＭ ＥＤＴＡ １．１２ｍＭ ＤＴＴ １６％（ｗ／ｖ） ｇｌｙｃｅｒｏｌ ０．０４８％ ｔｒｉｔｏｎＸ−１００ ０．１ｍＭ ＡＴＰ ０．１ｍＭ ＣＴＰ ０．０１ｍＭ ＵＴＰ ５μＣｉ ［α−^３２Ｐ］ＵＴＰ（比活性、４００−８００Ｃｉ／ｍ ｍｏｌ） ０．５μｇ プラスミドＤＮＡ鋳型 ０．０４ｍＭ ３’−０−ｍｅｔｈｙｌ−ＧＴＰ ２０ｕｎｉｔｓ ＲＮＡ分解酵素Ｔ１ １０μｇ蛋白ヒト核抽出液（ＨＮＥ） ２．反応停止液 ５％ ＳＤＳ １０ｍＭ ＥＤＴＡ ０．４ｍｇ／ｍｌ ｇｌｙｃｏｇｅｎ １５０ｍＭ 酢酸ナトリウム

【００２０】転写反応は３０℃にて６０分間行ない７５
μｌの反応停止液（表２）を加えて止めた。反応液に
は、さらに１００μｌＰＣＩＡＡ（５０％フェノール、
４８％クロロホルム、２％イソアミルアルコール）を加
えて水層を回収し、次にこの水層に１００μｌのＣＩＡ
Ａ（９６％クロロホルム、４％イソノアミルアルコー
ル）を加えて水層を回収した。次に、この液に１０μｌ
の３Ｍ酢酸ナトリウムと３００μｌのエチルアルコール
を加えて核酸を回収し、この沈殿を乾燥後、これに１０
μｌ尿素液（５Ｍ尿素、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ブ
ロモフェノールブルー）を加えて核酸を溶解した。この
サンプルは長さを分析するためにただちに、８９ｍＭ
トリス−ほう酸（ｐＨ８．３）、２ｍＭ ＥＤＴＡ、８
Ｍ尿素を含む６％ポリアクリルアミドゲル（アクリルア
ミド：ビスアクリルアミド＝１９：１、厚さ１ｍｍ、長
さ１２．５ｃｍ）上で３００Ｖにて展開した。サンプル
中に含まれるブロモフェノールブルーが、ゲルの最下端
に到達したらゲルをはずし、１リットルの５％メタノー
ル、５％酢酸を含む液に、つづいて、１リットルの５％
メタノール液にそれぞれ２０分間ずつひたした。次にゲ
ルをロ紙にはりつけて乾燥し、フジ・イメージング・プ
レートに一晩暴露し、バイオ・イメージング・アナライ
ザを用いてＲＮＡを可視化した。

【００２１】ＨＮＥ（ＨｅＬａ核抽出液）中でのプラス
ミドＤＮＡ鋳型上でのＴＡＴＡボックス依存的転写開始
を確認するために、コントロール・プラスミドＤＮＡ鋳
型としてｐＨＳＥ２００ＴＡ及びｐＨＳＡ２００ＧＡ(P
lant Mol. Biol., 34:69-79(1997))を組換えタバコＴＢ
Ｐ（ｔＴＰＢ）存在下で用いた。ｐＨＳＥ２００ＴＡは
シロイヌナズナの熱ショック蛋白質をコードする遺伝子
の上流２００ｂｐのプロモーター部分の配列および、セ
ンス鎖にグアニン残基を含まない２００ｂｐの転写領域
を含んでいる。ｐＨＳＡ２００ＧＡについてはｐＨＳＥ
２００ＴＡと構造はほとんど同じで、ｐＨＳＥ２００Ｔ
ＡのＴＡＴＡボックス（ＴＡＴＡＡＡＴ）のすべてのＴ
残基をＧに置換した（ＧＡＧＡＡＡＧ）ものである。

【００２２】図４に、これらＤＮＡ鋳型を用いて得た転
写物の電気泳動を示す。ＤＮＡ鋳型としてｐＨＳＥ２０
０ＴＡを用いたときには、特異的に合成された２００ｎ
ｔの転写物が観察された（レーン１）。一方、ｐＨＳＥ
２００ＧＡを用いた時には、ＴＡＴＡボックス非依存的
な転写物に由来する弱いシグナルが観察されただけであ
る（レーン２）。精製組換えＥＲＦ２の転写活性化因子
としての生化学的機能についてはｐＥＲＥ（図３）を転
写鋳型として用いて観察した。ｐＥＲＥを転写鋳型とし
て用いた場合、ＥＲＦ２を添加しなくても、特異的転写
物は観察されなかったので（レーン３）、基本的転写活
性を上昇させるためにタバコのｔＴＢＰを添加したとこ
ろ特異的転写物のサイズに相当する３７４ｎｔのシグナ
ルが観察された（レーン４）。そこでさらにｔＴＢＰに
加えてＥＲＦ２を添加するとレーン４で観察されたシグ
ナルは増幅した（レーン５）。データは示さないがこれ
と対象的にｐｍＥＲＥ（ｐＥＲＥの２コピーのシスエレ
メント（ＥＲＥ）を２コピーのｍＥＲＥと置換したも
の）を転写鋳型として用いた場合には、この転写増幅は
見られない。これらの観察結果は、組換えＥＲＦ２が、
ヒトの核抽出液中でＥＲＥに結合し、転写活性化因子と
して機能しうることを証明した。

【００２３】参考例３ ここでは参考例２と同様にして他のＥＲＦｓの転写活性
化能を調べた。図５に示すように、ＥＲＦ１からＥＲＦ
４の４種のＥＲＦを個々に標準的な試験管内転写系に添
加するとｐＥＲＥ上での転写開始の速度を３から５倍増
幅した。これに対し転写鋳型をｐｍＥＲＥとした場合は
全く転写開始に影響がないので、ＥＲＦｓはどれもヒト
核抽出液中でＥＲＥに依存した転写活性化因子として働
くことが証明できた。各々の転写活性化能を較べると、
それぞれの転写増幅率はＥＲＦ３で３倍、ＥＲＦ４で
３．５倍、ＥＲＦ１で４倍、ＥＲＦ２で５倍であった。

【００２４】実施例１ 本実施例においては、ＥＲＦ２存在下でエチレン応答性
プロモータからの遺伝子発現をｏＭＢＦ１が増幅するこ
とを調べた。マルチプロテイン・ブリッジング・ファク
ター１（ＭＢＦ１）のエチレン応答性プロモーターから
の転写増幅への関与の可能性を検討するために、農林水
産省が作ったイネのＥＳＴライブラリーの中から、イネ
のＭＢＦ１をコードする候補遺伝子を選び出した。図６
に、イネのＭＢＦ１（ｏＭＢＦ１）をコードするｃＤＮ
Ａの塩基配列（配列番号２）及び予想されるアミノ酸配
列（配列番号１、配列番号２の８５−５１０に相当す
る。）を示す。このアミノ酸配列（配列番号１）は、シ
ロイヌナズナのＭＢＦ１（ＡｔＭＢＦ１）の配列と８１
％の相同性があり、ヒトのＭＢＦ１（ｈＭＢＦ１）の配
列との相同性（５３％）よりかなり高い値を示した。

【００２５】転写コアクチベータとしてのＭＢＦ１の機
能を示すためにタバコ細胞内でＭＢＦ１を発現するエフ
ェクター・プラスミドＤＮＡ（ｐ３５Ｓ−ＭＢＦ１）を
下記の手順で構築した。エフェクター・プラスミドＤＮ
Ａのｐ３５Ｓ−ＥＲＦ２とｐ３５Ｓ−ＭＢＦ１の構築に
あたっては、プラスミド・ベクターｐＢＩ２２１(CLONT
ECH Laboratories Inc., CA)のＸｂａ Ｉ−Ｓａｃ Ｉ
断片であるβ−グルクロニダーゼをコードする部分をぬ
きとり、そこに、ＰＣＲによって付け加えた上流のＸｂ
ａ Ｉ部位と下流のＳａｃ Ｉ部位をあわせもつタバコ
のＥＲＦ２のｃＤＮＡ（accession No. ABO 16264）と
イネのＭＢＦ１のｃＤＮＡ断片（配列番号２）を挿入し
てつくった。レポーター・プラスミドＤＮＡのｐＥＲＥ
−ＧＵＳとｐｍＥＲＥ−ＧＵＳの構造については、すで
に報告されている論文で用いられている、２（ＧＣＣ）
Ｇｕｓ、２（ｍＧＣＣ）Ｇｕｓに対応している(Plant C
ell 7:173-182(1995))。コントロール・プラスミドとし
て用いたｐ３５Ｓ−ＬＵＣは、上記のｐＢＩ２２１のＸ
ｂａ Ｉ−Ｓａｃ Ｉ断片をＸｂａ Ｉ部位とＳａｃ
Ｉ部位ではさまれたホタルのルシフェラーゼのｃＤＮＡ
（accession No. E 08319）でおきかえたものである。

【００２６】この実施例で用いたプラスミドＤＮＡを表
３にまとめる。

【表３】 表中、ＧＵＳは大腸菌由来のβグルクロニダーゼ遺伝子
（β-D-glucronidase）、ＬＵＣはホタルや海洋性発光
細菌Vibrio菌由来のルシフェラーゼ遺伝子(luciferase)
を表す。

【００２７】このｐ３５Ｓ−ＭＢＦ１をマイクロプロジ
ェクタイル・ボンバードメント法（ＤＮＡを金の微粒子
に吸着させて、ヘリウムガスの噴射力で金微粒子ととも
にＤＮＡを植物体内に送り込む方法）を用いてタバコ葉
に導入し、一過的にｏＭＢＦ１を発現させて、その機能
を評価した。その方法を下記に示す。タバコ葉を用いた
トライジェント・アッセイは、既報(Plant Mol, Biol.
Reporter 18:101-107(2000))に従って行った。２μｇの
レポーター・プラスミドＤＮＡ（ｐＥＲＥ−ＧＵＳ）、
１μｇのコントロール・プラスミドＤＮＡ（ｐ３５Ｓ−
ＬＵＣ）および、様々に量を変えたエフェクター・プラ
スミドＤＮＡを０．５ｍｇの金微粒子（直径１．５から
３．０μｍ、Aldrich Chem. WI）と共に３０μｌのＴＥ
buffer中で混合した。次に３μｌの３Ｍ酢酸ナトリウ
ム、１００μｌのエチルアルコールをこれに加えて遠心
によって、ＤＮＡを吸着した金微粒子を回収し、１００
μｌのエチルアルコールをこれに加えて懸濁した。これ
を超音波で分散させ、このうち５μｌを用いて、２週間
生育させたタバコ葉にヘリウムガスの噴射力によりＩＤ
ＥＲＡ ＧＩＥ−III(TANAKA Co, Ltd., Sapporo, Japa
n)を用いて導入した。遺伝子導入後のタバコ葉は、光照
射下で２５℃にて１２時間保温し、液体窒素中で凍結
後、ミクロ・ディスメンブレータ(B. Brown BiotechInt
ernational, Germany)を用いて粉状にした。サンプルは
２等分し、一方は、ＧＵＳ−Ｌｉｇｈｔケミルミネッセ
ンス検出キット（ＴＲＯＰＩＸ，ＭＡ）を用いてβ−グ
ルクロニダーゼ活性を測定するのに使用した。また、も
う一方は、ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイ・シ
ステム(Promega Corp., WI)とLuminescencer-JNR lumin
ometer (ATTO Co, Ltd., Tokyo Japan)を用いて、その
ルシフェラーゼ活性を測定するのに使用した。エチレン
応答性プロモーターからの遺伝子発現をあらわす、β−
グルクロニダーゼ活性は、このルシフェラーゼ活性にも
とづいて補正された。

【００２８】まずはじめに、金微粒子の表面に様々に量
を変化させてレポーター・プラスミドＤＮＡ（ｐＥＲＥ
−ＧＵＳ）を吸着させ、タバコ葉に導入し、βグルクロ
ニダーゼ活性のダイナミックレンジを測定した。その結
果を図７〜１０に示す。この時、常に１μｇのコントロ
ール・プラスミドＤＮＡ（ｐ３５Ｓ−ＬＵＣ）を混合
し、それぞれのサンプルのルシフェラーゼ活性を測定し
ておくことにより、遺伝子の導入効率を算出し、各実験
ごとのβ−グルクロニダーゼ活性の値を補正した。この
結果、ｐＥＲＥ−ＧＵＳ添加量１μｇから４μｇまでは
β−グルクロニダーゼ活性は直線的に増大し、６μｇに
するとやや減少傾向がみられることがわかった（図
７）。従って今後のトランジェント・アッセイの実験に
おいては、すべてのＤＮＡ混合液に２μｇのｐＥＲＥ−
ＧＵＳと１μｇのｐ３５Ｓ−ＬＵＣを入れておくことに
した。

【００２９】上記の混合液に０．２μｇのエフェクター
・プラスミドＤＮＡ（ｐ３５Ｓ−ＥＲＦ２）を加えて
も、ＧＵＳ活性の増加は見られないが、それ以上、０．
７μｇくらいまで加えるとＧＵＳ活性は増大した（図８
中央）。また、エフェクター・プラスミドＤＮＡとして
ｐ３５Ｓ−ＭＢＦ１のみを量を変えて添加しても、ＧＵ
Ｓ活性には何の変動も見られなかった（図８右）。これ
に対して、０．２μｇの第一のエフェクター・プラスミ
ドＤＮＡ（ｐ３５Ｓ−ＥＲＦ２）の存在下で、第二のエ
フェクター・プラスミドＤＮＡ（ｐ３５Ｓ−ＭＢＦ１）
を量を変えて添加すると添加量に応じて、ＧＵＳ活性は
変化した（図９）。また、ＥＲＦ２とＭＢＦ１との共存
下でのみ、協同的にＧＵＳ活性が増大することが分かる
（図１０左）。このような、ＥＲＦ２とＭＢＦ１共存下
での協同的なＧＵＳ活性の増大は、レポーター・プラス
ミドＤＮＡとしてｐＥＲＥ−ＧＵＳを用いたときにのみ
観察され、ｐｍＥＲＥ−ＧＵＳを用いた時には観察され
なかった（図１０右）。これらの観察結果は、ＥＲＦ２
にとっては、ｏＭＢＦ１は転写コアクティベーターであ
ることを示している。

【００３０】実施例２ ＥＲＦ２以外のクローンである、例えば、ＥＲＦ４に対
してもｏＭＢＦ１が転写コアクチベーターとして機能す
るかどうかを調べるために、実施例１と同様の実験をｐ
３５Ｓ−ＥＲＦ２をｐ３５Ｓ−ＥＲＦ４に変えて行っ
た。その結果を図１１及び図１２に示す。ｐ３５Ｓ−Ｅ
ＲＦ４を０．５μｇ以上、１．０μｇくらいまで添加す
ると量に依存して数倍のＧＵＳ活性の変化が観察された
が、０．２μｇでは１．７倍程度の変化しかしなかった
（図１１）。そこでｐ３５Ｓ−ＥＲＦ４が０．２μｇ存
在下で、０．５μｇのｐ３５Ｓ−ＭＢＦ１をさらに添加
したところ５．５倍のＧＵＳ活性の増大が見られたのに
対し（図１２左）、レポーター・プラスミドＤＮＡをｐ
ｍＥＲＥ−ＧＵＳにとりかえた時には、全くＧＵＳ活性
の増大は見られなかった（図１２右）。これらの観察結
果は、ＥＲＦ２の時と同様にＥＲＦ４を用いた場合で
も、ｏＭＢＦ１は転写コアクチベータとして機能してい
ることを示している。

【００３１】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Japan Science and Technology Corporation <120> 植物のエチレン応答転写コアクチベータ <130> PS02-1101 <160> 6 <210> 1 <211> PRT <212> 142 <213> Oryza sativa <400> 1 Met Ala Gly Ile Gly Pro Ile Arg Gln Asp Trp Glu Pro Val Val Val 1 5 10 15 Arg Lys Lys Ala Pro Thr Ala Ala Ala Lys Lys Asp Glu Lys Ala Val 20 25 30 Asn Ala Ala Arg Arg Ser Gly Ala Glu Ile Glu Thr Met Lys Lys Tyr 35 40 45 Asn Ala Gly Thr Asn Lys Ala Ala Ser Ser Gly Thr Ser Leu Asn Thr 50 55 60 Lys Arg Leu Asp Asp Asp Thr Glu Ser Leu Ala His Glu Arg Val Ser 65 70 75 80 Ser Asp Leu Lys Lys Asn Leu Met Gln Ala Arg Leu Asp Lys Lys Met 85 90 95 Thr Gln Ala Gln Leu Ala Gln Met Ile Asn Glu Lys Pro Gln Val Ile 100 105 110 Gln Glu Tyr Glu Ser Gly Lys Ala Ile Pro Asn Gln Gln Ile Ile Gly 115 120 125 Lys Leu Glu Arg Ala Leu Gly Thr Lys Leu Arg Gly Lys Lys 130 135 140

【００３２】 <210> 2 <211> 819 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 2 cagaaccttc tcttcttcct tgttcgttca tcccctaacc ctttctttgt tcatcttgtt 60 cttcctcttg tcgtctcgtc gagatggccg ggattggtcc gatcaggcag gactgggagc 120 cggtggtggt gcggaagaag gcgcccaccg ccgccgccaa gaaggatgag aaggccgtca 180 acgccgcccg ccgctccggc gccgagatcg agaccatgaa gaagtataac gctggaacaa 240 acaaggcggc gtccagtggc acatccctca acaccaagcg gctggatgac gacaccgaga 300 gccttgccca tgagcgtgtc tcaagtgacc tgaagaaaaa cctcatgcaa gcaaggctgg 360 acaagaagat gacccaggca cagcttgcac agatgatcaa tgagaagccc caggtgatcc 420 aggagtacga gtcaggtaaa gctattccga accagcagat catcgggaag cttgaaaggg 480 ctcttggaac aaagctgcgc ggcaagaaat aatgttctac tattaggccc tgaagcatag 540 tgttggagca accaaagcca aaatgtttgc gtaacctatg ctgggtcttt tgataccatg 600 caggatgttt ctgttggtgc atgagtgaat actgaataac tattatgttg tcgcaaacct 660 tgtaatgctg ccgctctttg tgtgtcatag tccctagtgt gcaagagttg tgctggacct 720 taaaactgac ttgataacct gcgtggttta tgcatgatgt ttattaaaat atcaatgatc 780 tctttggctg tttacaactg aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 819

【００３３】 <210> 3 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 3 gatctcataa gagccgccac taaaataaga ccgatcaaat aagagccgcc atg 53 <210> 4 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 4 gatccatggc ggctcttatt tgatcggtct tattttagtg gcggctctta tga 53 <210> 5 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 5 gatctcataa gatcctccac taaaataaga ccgatcaaat aagatcctcc atg 53 <210> 6 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 6 gatccatgga ggatcttatt tgatcggtct tattttagtg gaggatctta tga 53

【図面の簡単な説明】

【図１】参考例１で用いたＤＮＡプローブの塩基配列を
示す図である。。図には野生型のＥＲＥ（上）と突然変
異型のＥＲＥ（ｍＥＲＥ、下）を示した。各々のＤＮＡ
プローブは２コピーのＧＣＣボックス（太字）又は突然
変異型ＧＣＣボックスを含む。

【図２】ゲルシフトアッセイにおけるＥＲＦ２のＥＲＥ
への特異的結合を示すゲル泳動を示す図であり、Ｆは何
も結合していないフリーのＤＮＡプローブを示し、Ｃは
ＤＮＡ−ＥＲＦ２複合体を示す。

【図３】試験管内転写に用いたプラスミドＤＮＡ鋳型
（ｐＥＲＥ）の構造を示す図である。

【図４】ｐＨＳＥ２００ＴＡ（レーン１）、ｐＨＳＥ２
００ＧＡ（レーン２）、ｐＥＲＥ（レーン３−５）の各
種ＤＮＡ鋳型を用いて得た転写物の電気泳動を示す図で
ある。レーンの上部に記入されている精製組換え蛋白質
の存在・非存在下の状態で、それぞれのプラスミドＤＮ
Ａ鋳型をもとにして、ＲＮＡ合成を行った。図中、Ｍは
一本鎖ＤＮＡの分子量マーカーを表し、＊はＴＡＴＡボ
ックスに依存しない転写産物を示す。

【図５】各レーン上部に記入されている精製組換え蛋白
質の存在下でのプラスミドＤＮＡ鋳型（ｐＥＲＥ）から
の転写物の電気泳動を示す図である。

【図６】イネのＭＢＦ１（ｏＭＢＦ１）のｃＤＮＡの塩
基配列（配列番号２）及び予想されるアミノ酸配列（配
列番号１、配列番号２の８５−５１０に相当する。）を
示す図である。アンダーラインを引いたところは、ポリ
Ａ付加シグナルを示す。

【図７】タバコ葉を用いたトランジェント・アッセイに
おける、レポータープラスミドＤＮＡ（ｐＥＲＥ−ＧＵ
Ｓ）の転写に与える影響を示す図である。縦軸は、タバ
コ葉に導入したレポーター・プラスミドＤＮＡ（ｐＥＲ
Ｅ−ＧＵＳ）の導入量に依存したＧＵＳ活性の増加を示
す。値は２回の独立した実験結果の平均値である。

【図８】タバコ葉を用いたトランジェント・アッセイに
おける、転写因子（ＥＲＦ２）や転写コアクティベータ
ー（ｏＭＢＦ１）の添加の影響を示す図である。レポー
ター・プラスミドＤＮＡの転写における、ＥＲＦ２・ｏ
ＭＢＦ１の添加量を変化させた場合の効果を示す。各々
の棒グラフの下に、実験で用いたエフェクター・プラス
ミドＤＮＡの種類と量を示す。値は２回の独立した実験
結果の平均値である。

【図９】タバコ葉を用いたトランジェント・アッセイに
おける、ｏＭＢＦ１に依存した、ＥＲＦ２の転写活性化
能の増幅を示す図である。ＥＲＦ２依存下でのレポータ
ー・プラスミドＤＮＡの転写に与えるｏＭＢＦ１添加量
の影響を示す。各々の棒グラフの下に示すように、それ
ぞれの反応液には２μｇのｐＥＲＥ−ＧＵＳ、１μｇの
ｐ３５Ｓ−ＬＵＳ、０．２μｇのｐ３５Ｓ−ＥＲＦ２に
加え、様々な量のｐ３５Ｓ−ＭＢＦ１を添加した。独立
した２回の実験結果の平均値を図に示す。

【図１０】タバコ葉を用いたトランジェント・アッセイ
における、ｏＭＢＦ１に依存した、ＥＲＦ２の転写活性
化能の増幅を示す図である。ＥＲＦ２、ｏＭＢＦ１存在
下でのＥＲＥの塩基配列に依存した転写増幅を示す。各
々の棒グラフの下に示す、レポーターやエフェクター・
プラスミドＤＮＡを混合後、タバコ葉に導入した。独立
した３回の実験結果の平均値を図に示す。

【図１１】タバコ葉を用いたトランジェント・アッセイ
における、ｏＭＢＦ１に依存した、ＥＲＦ４の転写活性
化能の増幅を示す図である。レポーター・プラスミドＤ
ＮＡの転写に与えるＥＲＦ４添加量の影響。各実験に
は、レポーター・プラスミドＤＮＡとして２μｇのｐＥ
ＲＥ−ＧＵＳを用いた。各棒グラフの下に各々の実験で
用いたエフェクター・プラスミドＤＮＡの種類と添加量
を記入した。独立した３回の実験結果の平均値を図に示
す。

【図１２】タバコ葉を用いたトランジェント・アッセイ
における、ｏＭＢＦ１に依存した、ＥＲＦ４の転写活性
化能の増幅を示す図である。ＥＲＦ４、ｏＭＢＦ１依存
下でのＥＲＥ塩基配列に依存した転写増幅。各々の棒グ
ラフに示す、レポーターやエフェクター・プラスミドＤ
ＮＡを混合後、タバコ葉に導入した。独立した３回の実
験結果の平均値を図に示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD08 CA06 CA16 CA17 CB02 4B024 AA08 CA02 DA01 EA04 FA02 4H045 AA10 AA30 BA10 CA31 EA05

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下（ａ）又は（ｂ）のタンパク質。 （ａ）配列番号１のアミノ酸配列から成るタンパク質 （ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において１若しくは数
   個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸
   配列から成り、かつその発現により植物のエチレン応答
   を強めるタンパク質
2. 【請求項２】 以下（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡから成る
   遺伝子。 （ａ）配列番号２の塩基配列から成るＤＮＡ （ｂ）請求項１のタンパク質を指定する塩基配列を有す
   るＤＮＡ
3. 【請求項３】 請求項２に記載の遺伝子の一部分から成
   るポリヌクレオチド。
4. 【請求項４】 プロモーター及び請求項２又は３に記載
   の遺伝子を有するポリヌクレオチドであって、該塩基配
   列が該プロモーターに対して順方向に連結されているポ
   リヌクレオチド。
5. 【請求項５】 プロモーター及び請求項２に記載の遺伝
   子を有するポリヌクレオチドであって、該塩基配列が該
   プロモーターに対して逆方向に連結されているポリヌク
   レオチド。
6. 【請求項６】 請求項４又は５のポリヌクレオチドを含
   有するプラスミド。
7. 【請求項７】 請求項４又は５のポリヌクレオチドによ
   り形質転換された植物。