CN102492698B

CN102492698B - 南极拟三列真藓BpMBF1基因及其应用

Info

Publication number: CN102492698B
Application number: CN 201110416330
Authority: CN
Inventors: 刘庆信; 吴萍; 刘训理; 赵晓; 周启升
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2011-12-14
Filing date: 2011-12-14
Publication date: 2013-03-06
Anticipated expiration: 2031-12-14
Also published as: CN102492698A

Abstract

本发明涉及一种南极拟三列真藓BpMBF1基因及其应用，具体涉及南极拟三列真藓的BpMBF1基因的克隆、抗低温机制的研究及转基因植物抗低温能力的分析和应用；本发明提供的南极拟三列真藓的BpMBF1基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，其编码149个氨基酸，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。南极拟三列真藓的BpMBF1基因与多种类型的基因有互作关系，可用于动植物抗寒机制的研究，遗传转化获得BpMBF1转基因植株具有较强的抗寒性能，表明该基因在植物抗寒过程中发挥重要的作用，在动植物转基因抗寒育种中具有十分重要的理论和实际意义。

Description

南极拟三列真藓BpMBF1基因及其应用

一、技术领域

本发明涉及南极拟三列真藓BpMBF1基因及其应用，具体涉及南极拟三列真藓BpMBF1基因的克隆、抗低温机制的研究及转基因植物抗低温能力的分析和应用，属于分子生物学和生物技术领域。

二、背景技术

在自然界中，生物的生长处于一个开放的体系中，在其整个生活周期中，受其所处生长环境的影响，造就了其所处环境的耐受性，进而生成与之相关的适应性品种。南极是属世界最寒冷地区，南极拟三列真藓Bryum pseudotrique常年生存在低温寒冷的逆境中，造就了其较强的抗寒性能，因此，通过对南极拟三列真藓抗寒机制的研究在动植物抗寒育种中具有十分重要的理论和实际意义。

目前，转录因子及其调控机理已经逐渐成为基因分子生物学研究领域的重点，与转录因子活力有密切关联的是辅助活化因子，他能增强转录因子和顺式作用原件的结合，目前已经从真菌，多细胞动物和植物中分离出多种此类基因。Multiprotein Bridging Factor 1（MBF1）便是其中的一个辅助活化因子，它的基本表达能够导致许多编码逆境反应转录因子和信号转导基因的转录产物的积累，如WRKY 转录因子、类CBF转录因子、MAPK3/11和钙结合蛋白等。MBF1因子的基因序列从古细菌到人都是相当保守的，最早是在果蝇、蚕等动物体中被发现，在果蝇中过量表达该基因可以延长果蝇的寿命，因此也被称为长寿因子。诸多研究表明MBF1是一个高度保守的，关于内皮细胞分化、激素调节、脂类代谢，中枢神经系统发育和组氨酸新陈代谢等不同过程的调控转录辅激活蛋白，而转录辅激活蛋白在真核的基因表达中扮演决定性的角色，不同有机体的MBF1 蛋白是通过其N末端与C-Jun, GCN4, ATF1 或其它核受体相互作用的。MBF1首次被提纯是从蚕的后部丝腺抽提物中。在酵母、人和果蝇中MBF1增强转录激活主要是通过N末端的一个的区域和特异性转录因子结合及C末端的保守区域和TATA盒结合蛋白TBP结合，起到一个架桥作用。拟南芥的MBF1在转基因酵母中作为转录辅助激活蛋白也起着重要的作用，在拟南芥中 MBF1 基因的超表达能增强其抵抗逆境胁迫的能力。在其他植物中， MBF1 基因也和不同胁迫环境的适应性有关。例如，土豆 MBF1 基因的表达能被真菌侵害、创伤、乙烯和乙烯利诱导增强；在金钗石斛黄草石斛中高温刺激导致 MBF1 基因的 mRNA 增加；在烟草中，高温和干旱同时处理可以使MBF1基因诱导表达, 高温也可使拟南芥MBF1基因表达增强，拟南芥被高温、干旱或者两者同时处理时，MBF1 基因的表达增强。转基因MBF1c拟南芥体植株置于各种生物与非生物的压力环境之下发现比对照植物大 20％，并产出更多种子，同时抗细菌感染、耐热、耐渗透压的能力都有提高。研究成果表明，MBF1 基因在胁迫应激下扮演了一个很重要的角色。

动物MBFl参与多种生物进程的调节，为深入了解动物的抗逆性提供了新思路。而环境胁迫特别是低温条件下严重影响植物的生长和产量。目前，随着植物转基因技术在农业上的广泛应用，大量抗寒相关基因被转入植物以提高植物的抗逆性，然而单个逆境相关基因的作用是有限的。而植物MBFl参与多种胁迫反应，在农作物中超表达MBF1可以调节多种信号转导途径和激活多种防御因子的表达，这就比单纯的转入一个抗性基因更能增强农作物的抵抗力。MBFl为培育新的高抗性的转基因作物提供了新的路径，但是目前对MBF1的抗寒作用机制和功能还不是特别清楚，因此加强对MBFl的研究，揭示它在基因表达中的具体作用和调节机制具有重要的意义，本发明的主要内容是从南极拟三列真藓中克隆MBF1基因，并利用酵母双杂交方法鉴定出与MBF1相互作用的基因，探明MBF1的抗寒机制，为抗寒转基因动植物的制作和抗寒性动植物品种的选育提供理论依据和材料。

三、发明内容

本发明利用南极探险队从南极带回的拟三列真藓Bryum pseudotrique为材料，提取南极拟三列真藓总RNA，再从该总RNA中提取南极拟三列真藓mRNA，利用mRNA合成南极拟三列真藓cDNA，并构建南极拟三列真藓cDNA文库用于南极拟三列真藓MBF1基因的克隆。利用同源基因的保存序列设计3’PCR引物，利用5’载体引物进行常规聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction, PCR）获取5′端序列。将PCR产物与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选重组子，进行序列分析。然后设计5′末端特异性引物和3′载体引物进行PCR获得3’序列，并拼接成完整的cDNA序列。根据cDNA的3′和5′端序列设计特异引物，以南极拟三列真藓的cDNA为模板进行PCR扩增，得到cDNA全长序列，将该cDNA命名为BpMBF1。

该基因的全长cDNA为870bp，其中开放阅读框部分为447bp。由此推得，该基因具有149个氨基酸，将其所编码的氨基酸命名为BpMBF1。将该氨基酸BpMBF1序列在GenBank中检索，发现与已发表的其他生物的MBF1氨基酸序列具有较高的同源性。由此表明，经过上述克隆步骤得到了南极拟三列真藓的BpMBF1基因,其核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示;该核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示。

本发明利用blast进行同源检测，筛选出24个与南极拟三列真藓BpMBF1基因互作关系的基因，鉴定南极拟三列真藓BpMBF1基因的互作基因，这些基因编码蛋白中多个和糖和蛋白质的代谢有关，说明BpMBF1通过调节这些基因的作用而影响植物的抗寒性。

本发明还提供了南极拟三列真藓BpMBF1基因抗寒机制以及在植物中的应用方法，可提高作物的抗寒能力。步骤为：

（a）利用酵母双杂交技术，鉴定了BpMBF1的相互作用蛋白，并以此阐明BpMBF1基因的抗寒机制。

（b）将BpMBF1转化拟南芥，得到转基因植株。

本发明从南极拟三列真藓中分离出一种编码转录激活因子BpMBF1的基因（BpMBF1)，将该cDNA序列构建在由组成型CaMV 35S强启动子控制的真核转化载体pBI121上，构建了BpMBF1的正义表达载体，采用农杆菌介导的方法转化拟南芥。对获得的转基因植株进行抗寒能力分析，结果表明转基因拟南芥中BpMBF1的过量表达能提高其抗寒能力，转基因植株在16℃可正常生长，而非转基因植株发育迟缓。相对于非转基因植株，转基因植株具有明显的抗寒能力。如果将该基因转化水稻、小麦、玉米等农作物，可望能提高其抗寒能力，提高其产量和品质，将产生巨大的经济价值和社会价值。

四、附图说明

图1 南极拟三列真藓（藓丛褐绿色或绿色，具分生嫩枝条，茎高3-8厘米。叶于茎基部小，渐上变大，顶端密生丛状，长约3-4.5毫米，宽约1.4毫米，长卵形，少数卵形，基部略收缩，下延，先端渐尖；叶缘平直或略内卷，由2-5列长狭形细胞构成分化边缘，全缘平滑或仅尖部具齿突；中肋粗壮，达于叶尖部，多数突出成刺状小尖，基部红色；叶片上部细胞厚壁，六边菱形，基部短长方形，带红色）；

图2为合成的南极拟三列真藓cDNA琼脂糖凝胶电泳鉴定。7~12泳道为可用cDNA， M：λ-Hind Ш digest；

图3 BpMBF1基因引物设计原理图。采用不同物种MBF1氨基酸序列进行比对，寻找保守区段（KKM、INE、API、GTK）进行混合引物的设计；

图4 为本发明BpMBF1基因的琼脂糖凝胶电泳鉴定结果L：7-8泳道为PCR产物，M：low DNA Mass ladder；

图5 BpMBF1因子的蛋白质结构图。N末端为转录因子相互作用区，C末端为TBP相互作用区。

五、具体实施方式

实施方式（－）南极拟三列真藓cDNA文库的构建

1. 南极拟三列真藓总RNA的提取

南极拟三列真藓是南极探险队带回，存放在零下80℃的冰箱，见图1。利用QIANGEN公司的RNeasy Plant Mini Kit进行总RNA的提取。秤取200 mg南极拟三列真藓样品，放入乳钵内，加入液体氮研磨细，转移到1.5mL离心管，加入450 ul RLT buffer，Vortex混匀1分钟，转移到放在2ml离心管上的离心柱中，室温下，15000 rpm离心2 min，滤夜加入200 ul 100%乙醇，转移到RNeasy柱上，10000 rpm离心15 s，再加入700 ul RW1，10000 rpm离心15 s，加入500 ul RPE，10000 rpm离心15s，将柱子转移到一个新的1.5mL离心管，加入50 ul RNase Free的水，10000 rpm离心5 min。获得南极拟三列真藓的总RNA，用于mRNA的提取及纯化。

南极拟三列真藓mRNA的提取及纯化

利用TAKARA的Ploy(A) mRNA Selection/Oligotex-dT30(super) 从总RNA中进行mRNA的提取。具体操作如下：将200 ul南极拟三列真藓的总RNA加入2 ul 10％SDS至最终浓度0.1% SDS，加入200 ul Oligotex-dT30 super，混匀，在37℃，放10 min，15000 rpm，4℃离心3min，弃掉上清液，加入500 ul wash Buffer（TE+0.1%SDS+0.5MNaCl)，15000 rpm离心3min，弃掉上清液，加入200 ul TE，在65℃，放5min，在冰上放3min，15000 rpm离心3min，取上清液。进一步进行氯仿酚抽提和酒精沉淀，最后获得纯的南极拟三列真藓mRNA。

文库构建

利用STRATAGENE公司的ZAP-cDNA Synthesis Kit进行。具体操作如下：

（a）合成First-strand cDNA

在0.25ml离心管中加入下列试剂：

10x First-strand buffer	5 μL
		First-strand methyl nucleotied mixture	3 μL
Linker-primer (1.4μg/μL)	2 μL
		RNase Block Ribonuclease Inhibitor (40μg/μL)	1 μL
南极拟三列真藓mRNA (2μg)	20 μL
		DEPC-water	17.5 μL
Total	48.5 μL

吸打混匀后室温放置10 min, 加入1.5 ul Strata Script RT (50U/μL), 轻轻敲打混匀，稍离心后，42℃保温1 h，然后-20℃保存备用。

（b）合成Second-strand cDNA

在0.25 mL离心管中加入下列试剂：

10x Second-strand buffer	20 μL
		Second-strand mixture	6 μL
ddH₂O	116 μL
		RNaseH (1.5 U/μL)	2 μL
DNA Polymerase I (90 U/μL)	11 μL
		Total	200 μL

轻轻敲打混匀，稍离心后，42℃保温1 h, 然后放置冰上。

(c) Blunting cDNA 末端化处理

在第二链cDNA的反应体系中，加入下列试剂：

Blunting dNTP mixture	23 μL
		Clond pfu DNA Polymerase (2.5 U/μL )	2 μL

混匀，稍离心后，72℃保温30 min, 然后加入200 ul phenol-chloroform(1:1),混匀2 min，15000 rpm离心2 min，取上清液放入一个新的离心管，加入20 ul 3 M sodium acetate，400 μL 100%乙醇，放置在零下80℃ 20 min，15000 rpm 离心60 min，弃上清液，沉淀加入70％乙醇，15000 rpm离心5 min，沉淀干燥10 min.

(d) 连接EcoRI adapter

末端化处理的Blunting cDNA用9ul EcoRI adapter 溶解后，加入下列试剂：

10x ligase buffer	1 μL
		10um rATP	1 μL
T4 DNA ligase	1 μL

轻轻敲打混匀，稍离心后，4℃保温3 d, 70℃保温30 min，稍离心后，室温放置5 min。

(e) EcoRI 末端磷酸化处理

在以上反应体系中加入下列试剂：

10x ligase buffer	1 μL
		10um rATP	2 μL
ddH₂O	5 μL
		T4 DNA polynucleotide Kinase (5 U/μL)	1 μL

混匀后，37℃保温30 min，70℃保温30 min，稍离心后，室温放置5 min.

(f) 用XhoI处理

在以上的反应体系中加入以下试剂：

XhoI buffer supplement	28 μL
		XhoI (40 U/μL)	3 μL

混匀后，37℃保温1.5 h，再加入以下试剂：

10x STE	5 μL
		100%乙醇	125 μL

零下20℃放置24 h，15000 rpm在4℃下，离心20 min，除去上清液，再加入100 ul 95％乙醇，15000 rpm离心5 min，除去上清液，干燥10 min，加入100 μL TEN buffer。

(g) cDNA Size Fractionan

利用Invitrogen公司的cDNA Size Fractionan columns除去小于500 bp cDNA,利用大于500 bp的cDNA，结果见图2, 用7－12泳道的样品进行以下连接。

(h) 连接Uni-ZAP XR Vector，反应体系如下：

cDNA (100ng)	干燥
		10x ligase buffer	0.5 μL
10mM rATP (PH7.5)	0.5 μL
		Xni-ZAP XR vector (1μg)	1 μL
ddH₂O	2.5 μL
		T4 DNA ligase (4 U/μL)	0.5 μL
Total	5 μL

混匀后，在4℃下，放置2 d。

(i) 将连接产物包装

将Packaging extracts溶解后，加入2 μL DNA (ligation rection)，22℃培养2 h，加入SM buffer 500 μL，20 μL chloroform，捎混匀后，离心，将上清液转移到一个新的离心管。

(j) 测定cDNA文库效率

通过上述方法获得南极拟三列真藓文库的效率为3.97×10⁵pfu/mL，表明文库构建成功，可以用于南极拟三列真藓BpMBF1基因的克隆和BpMBF1互作基因的鉴定。

实施方式（二）南极拟三列真藓BpMBF1基因的克隆

1．用兼并引物进行PCR反应获得5′端序列

(a) 根据国际基因库中已发布的其它生物中MBF1基因的保守氨基酸序列，设计兼并引物，方法见图3，引物序列如下：

GTK: 5’TTIGYDCCVAGIRCICKYTC 3’ 如SEQ ID NO. 3 所示；

AIP: 5’GGRATHSCYYKICCISHYTCRTA 3’ 如SEQ ID NO. 4 所示；

INE: 5’ACIAYYTGIGGYTTYCRTTDAT 3’ 如SEQ ID NO. 5 所示；

KKM: 5’TGIKHYTGIGTMADIYYYTT 3’ 如SEQ ID NO. 6 所示；

SK: 5’AATTAACCCTCACTAAAGGG 3’ 如SEQ ID NO. 7 所示；

(H=A, C, or T; N=A, C, G, or T; R=A or G; V=A, C, or G; Y=C or T)

(b) 第一次PCR：先使用5’载体序列引物SK和最外侧的GTK引物进行PCR。

PCR反应体系如下：

10×ExTaq buffer	5 μL
		dNTP mixture (10 mM)	4 μL
GTK (10 μM)	8 μL
		SK (10 μM)	2 μL
cDNA	5 μL
		ExTaq	0.25 μL
ddH₂O Up to	25.75 μL

反应程序为：

(c) 第二次PCR: 利用第一次PCR引物为模板，分别利用内侧引物AIP,INE,KKM和载体引物SK进行PCR,反应体系如下：

（I）

10×ExTaq buffer	5 μL
		dNTP mixture (10 mM)	4 μL
AIP (10 μM)	8 μL
		SK (10 μM)	2 μL
100倍稀释的第一次PCR产物	1 μL
		ExTaq	0.25 μL
ddH₂O Up to	29.75 μL

（II）

10×ExTaq buffer	5 μL
		dNTP mixture (10 mM)	4 μL
INE (10 μM)	8 μL
		SK (10 μM)	2 μL
100倍稀释的第一次PCR产物	1 μL
		ExTaq	0.25 μL
ddH₂O Up to	29.75 μL

（III）

10×ExTaq buffer	5 μL
		dNTP mixture (10 mM)	4 μL
KKM (10 μM)	8 μL
		SK (10 μM)	2 μL
100倍稀释的第一次PCR产物	1 μL
		ExTaq	0.25 μL
ddH₂O Up to	29.75 μL

反应程序为：

反应完毕后，电泳检测结果并回收PCR产物。将所得PCR产物连入pMD18-T载体。然后，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有IPTG/X-gal/氨苄青霉素（100 mg/L）的LB固体培养基上培养过夜。挑取白色菌落至LB液体培养基中培养3 h，进行菌液PCR鉴定。将正确的菌样在含有氨苄青霉素（100 mg/L）的LB液体培养基中培养过夜。碱法小量提取质粒DNA，酶切鉴定后进行序列测定。获得BpMBF1的5’端序列。

获得3′端序列

（a) 根据获得的5′端序列设计引物5MBFP，序列如下：

5MBFP: 5’GACTCGGTTACCGTGCTG 3’ 如SEQ ID NO. 8所示；

M13：5’CAGGAAACAGCTATGACC 3’ 如SEQ ID NO. 9所示；

利用5MBFP引物和M13引物进行PCR, 反应体系如下：

10×ExTaq buffer	5 μL
		dNTP mixture (10 mM)	4 μL
5MBFP (10 μM)	2 μL
		M13 (10 μM)	2 μL
cDNA	5 μL
		ExTaq	0.25 μL
ddH₂O Up to	31.75μL

(b) 反应程序为：

(c) 将所得片段连入pMD18-T，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，对生长的菌落进行PCR鉴定和质粒DNA的酶切鉴定，然后进行序列测定。获得BpmBF1的3’端序列。

全长序列的获得

根据已测定序列及其重叠区域，拼出目的基因的全长cDNA，设计引物MP1和引物MP2，序列如下：

MP1: 5’ATGTCAAAAGGTGGCGCAC 3’ 如SEQ ID NO. 10 所示

MP2: 5’TTAGCCTAACGGTTTGCCAGC3’ 如SEQ ID NO. 11 所示

利用引物MP1和MP2进行PCR, 扩增全长编码序列。

(a) 反应体系：

10×ExTaq buffer	5 μL
		dNTP mixture (10 mM)	4 μL
MP1 (10 μM)	2 μL
		MP2 (10 μM)	2 μL
cDNA	5 μL
		ExTaq	0.25 μL
ddH₂O Up to	31.75 μL

(b) 反应程序：

(c) 连接转化

将所得片段连入pMD18-T，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，对生长的菌落进行PCR鉴定和质粒DNA的酶切鉴定，然后进行序列测定，获得BpMBF1基因的编码序列。

同源检索

利用BLAST软件将分离出的全长cDNA序列与GenBank中的序列进行比较。南极拟三列真藓BpMBF1基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列见SEQ. ID. NO. 1和SEQ. ID. NO. 2。

实施方式（三）南极拟三列真藓BpMBF1基因相互作用基因的鉴定

1. MBF1 bait载体的构建

利用PCR技术扩增N末端和全长MBF1序列，连接到pLexA载体上。并将质粒DNA扩增和纯化。进行bait活性检验。

（a) PCR引物：

5LexAN-kpnI：5’CAAGCTTGGACCATGTCAAAAGGTGGCGCACC 3’

如SEQ ID NO. 12 所示；

3LexAN-SalI：5’CAAGCTTGGTCGACTTAACGGTTCGAGGAAGCTGTGA 3’ 如SEQ ID NO. 13 所示；

3LexAN-Fmbf1：5’CAAGCTTGTCGACTTAGCCTAACGGTTTGCCAGC 3’

如SEQ ID NO. 14 所示；

(b) PCR反应体系如下：

扩增BpMBF1 N末端序列

10×ExTaq buffer	5 μL
		dNTP mixture (10 mM)	4 μL
5LexAN-kpnI (10 μM)	2 μL
		3LexAN-salI (10 μM)	2 μL
cDNA	1 μL
		ExTaq	0.25 μL
ddH₂O Up to	35.75 μL

扩增BpMBF1全长序列

10×ExTaq buffer	5 μL
		dNTP mixture (10 mM)	4 μL
5LexAN-kpnI (10 μM)	2 μL
		3LexAN-Fmbf1 (10 μM)	2 μL
cDNA	1 μL
		ExTaq	0.25 μL
ddH₂O Up to	35.75 μL

反应程序为：

(c) 连接转化

将所得片段连入pMD18-T，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，对生长的菌落进行PCR鉴定和质粒DNA的酶切鉴定，然后进行序列测定。选择序列和BpMBF1基因序列完全相同的质粒进行酵母双杂交实验。

南极拟三列真藓酵母双杂交文库的构建

将ZAP-cDNA文库的cDNA用BamHI和XhoI限制性内切酶处理并纯化，再和酵母双杂交载体pGAD-HA Library Vector 连接，

连接体系：

南极拟三列真藓cDNA	126 μL (4.71μg)
		pGAD-HA vector	63 μL ( 5.1 μg)
Ligation solution I	189 μL

混匀后，在16℃下，连接16 h，转化XL10-Gold感受态细胞，对生长的菌落收集，并纯化质粒。

文库质粒的酵母转化

在50 μL新的XL10-Gold酵母感受态细胞中，加入2 μg南极拟三列真藓酵母双杂交文库质粒（pGAD-HA-BpcDNA），加入50 μL solutionIII并混匀，30℃培养1 h，涂SD-TLH平板，放在30℃，2-4 d，长出克隆。

4．DNA测序和MBF1互作基因鉴定

从酵母克隆扩增和纯化质粒，并进行测序。利用blast进行同源检测，鉴定BpMBF1基因的互作基因。

根据上述方法鉴定出24个与BpMBF1基因互作的基因，这些基因的编码蛋白分别为：组蛋白H3 （Histone H3）、组蛋白H3.3 (Histone H3.3) 、6-磷酸葡萄糖脱氢酶（6-phosphogluconate dehydrogenase）、磷酸丙糖异构酶（triosephosphate isomerase）、蛋白酶类抑制剂蛋白（protease inhibitor-like protein）、氨基酸透性酶（Amino acid permease）、β-葡糖磷酸变位水解酶（β-phosphoglucomutase hydrolase）、氧化还原酶域蛋白（oxidoreductase domain protein）、α-甘露糖苷酶(Alpha-mannosidase) 、逆转录酶（Reverse transcriptase）、ABC转运ATP结合蛋白（ABC transporter ATP binding protein）、L -丝氨酸解氨酶（L-serine ammonia-lyase ）、Zn依赖型氧化还原酶（Zn-dependent oxidoreductase）、酰基辅酶A合成酶（Acyl-CoA synthetase）、糖苷水解酶（Glycoside hydrolase）、转甲基酶（Methyltransferase）、糖磷酸通透酶（Sugar phosphate permease）、酰基辅酶A脱氢酶（Acyl-CoA dehydrogenase）、酪氨酸- tRNA合成酶（Tyrosyl-tRNA synthetase）、核激素受体（RxRg nuclear hormone receptor RxRg）、水解酶（Hydrolase）、脱氢酶（Dehydrogenase）、反转录酶（Reverse gyrase）、RNA解旋酶（RNA helicase）。以上基因编码蛋白中多个和糖和蛋白质的代谢有关，说明BpMBF1通过调节这些基因的作用而影响植物的抗寒性。

实施方式（四）南极拟三列真藓BpMBF1转基因植株的制作

1. 表达载体的构建

（1）根据分离出的南极拟三列真藓MBF1基因的核苷酸序列，设计引物：

正向引物：5′-TCTAGAATGTCAAAAGGTGGCGCACC-3′ 如SEQ ID NO. 15 所示；

划横线部分为XbaⅠ酶切位点

反向引物：5′-GTCGACTTAGCCTAACGGTTTGCCAGC-3′ 如SEQ ID NO. 16 所示；

划横线部分为SalⅠ酶切位点

以南极拟三列真藓BpMBF1cDNA为模板，进行PCR反应。

（2）取PCR产物4 μl与pMD18-T Simple载体连接，操作步骤按照TaKaRa公司产品pMD18-T Simple Vector说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有IPTG/X-gal/氨苄青霉素（100 mg/L）的LB固体培养基上培养过夜。挑取白色菌落至LB液体培养基中培养3 h，进行菌液PCR鉴定。将正确的菌样在含有卡那霉素（50 mg/L）的LB液体培养基中培养过夜。碱法小量提取质粒DNA，酶切鉴定后进行序列测定。

（3）将PCR扩增得到的目的片段用XbaⅠ和SalⅠ酶切，与用相同的限制性内切酶酶切的pBI121表达载体连接。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，然后在含卡那霉素（50 mg/L）的LB固体培养基上培养，对生长的菌落进行PCR鉴定和质粒DNA的酶切鉴定。

（4）将构建好的表达载体转化农杆菌LBA4404感受态细胞，本发明采用的是电击法转化农杆菌。

（a）-70℃冰箱里拿出农杆菌感受态细胞放在冰里融化，预冷电转化杯；

（b）加入1-2 μL质粒DNA，将混合液加入到电转杯中，擦干壁上的水，放入电转仪内，电压2.5 KV下，电击5.8-6.0 ms；

（c）将混合液再转移至离心管中，加入1 mL无抗生素的液体YEP培养基，28℃ 200 rpm荡培养3 h左右；

（d）12000 rpm离心1 min，用100 μL液体YEP培养基悬浮菌体；

（e）将悬浮后的菌液涂于附加50 mg/L卡那霉素和50 mg/L利福平的固体YEP培养基上，置于28℃下培养2-3d；

（f）进行菌落PCR筛选阳性克隆。

2. 转基因植物的获得

（1）将拟南芥的主花序的顶端剪掉以促进侧生花序的产生，且侧花序同时开花，便于转化。转化前用营养液将材料浇透。转化后要控制浇水或营养液；

（2）在50 mL三角瓶中加入5 mL含相应抗生素的YEP液体培养基，挑取适量的阳性克隆的农杆菌的菌体放入其中，28℃ 200 rpm振荡培养过夜。取1-3 mL的菌液加到装有100 mL的含有相应抗生素的液体培养基的250 mL的三角瓶中，28℃ 200 rpm振荡培养约6 h，收集菌体可用于转化拟南芥；

（3）浸染转化

（a) 拟南芥浸染液配方：

蔗糖	0.75g
		Silwet L-77	3 μL
ddH₂O	15 mL
		总体积	15 mL

(b) 收集菌体，5500 rpm离心5-8 min，倒掉上清液；

(c) 用浸染液悬浮菌体；

(d) 将拟南芥的花序浸到浸染液中10 s左右。然后将浸染后的拟南芥平放到箱子里，覆上薄膜，暗培养一天后取出置于到光下。根据植株的长势，隔5-7d再浸染一次。

（4）收获拟南芥种子，28℃烘箱内干燥适当时间。收获的种子进行相应抗生素的筛选。

（5）将转基因植株移到营养钵里，收获种子为下一步的抗寒性分析使用。

实施方式（五）：转基因拟南芥抗寒性分析

将转基因拟南芥植株和正常植株分别在16℃, 20℃，25℃培养，观察其生长情况。结果表明在16℃低温环境下转基因拟南芥植株生长明显好于非转基因拟南芥植株，转基因拟南芥植株具有明显的抗寒能力。

Claims

1.一种南极拟三列真藓BpMBFl基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的一种南极拟三列真藓BpMBFl基因，其特征在于该核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的一种南极拟三列真藓的BpMBFl基因的应用，其特征在于该基因在植物中的过量表达，可提高植物的抗寒能力。