CN1795267A

CN1795267A - 胁迫－诱导的启动子及其使用方法

Info

Publication number: CN1795267A
Application number: CNA2004800143175A
Authority: CN
Inventors: 筱崎和子; 桂幸次; 伊藤裕介
Original assignee: INTERNATIONAL FARM FOREST AND AQUASTIC PRODUCTS RESEARCH CENTER; National Agriculture and Food Research Organization
Current assignee: Japan International Research Center for Agricultural Sciences JIRCAS; National Agriculture and Food Research Organization
Priority date: 2003-03-24
Filing date: 2004-03-02
Publication date: 2006-06-28
Anticipated expiration: 2024-03-02
Also published as: CA2519997C; JPWO2004085641A1; CN1795267B; KR100703115B1; KR20060018817A; JP4219928B2; CA2519997A1; WO2004085641A1

Abstract

该发明提供了一种在象水稻这样的单子叶植物中能有效发挥作用的胁迫－诱导的启动子，以及使用该启动子的环境胁迫耐受植物。该启动子来自水稻并由下列DNA(a)或(b)组成：(a)由如SEQ ID NO：1或10所示的核苷酸序列组成的DNA；或(b)在严谨条件下，能与由SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列组成的DNA互补的核苷酸序列组成的DNA杂交并表达胁迫－诱导的启动子活性的DNA。上述环境胁迫耐受植物具有导入其中的上述启动子。

Description

胁迫-诱导的启动子及其使用方法

发明领域

本发明涉及一种获自水稻的胁迫-诱导的启动子及其使用方法。

现有技术

植物具有耐受机制以应付自然界中不同类型的环境胁迫，例如脱水、高温、冷冻或盐胁迫。近年来，因为已在分子水平上阐明了胁迫耐受机制，因此可以利用生物技术的方法生产了胁迫耐受植物。例如，业已表明当细胞暴露于胁迫条件下，细胞中会诱导产生胁迫蛋白，例如LEA蛋白、水通道蛋白或能够作用于可混溶溶质的合酶，从而保护细胞免于上述胁迫的影响。因此，已有研究尝试过将大麦LEA蛋白的基因或烟草解毒酶的基因、作用于渗透调节物质(如，糖、脯氨酸或甜菜碱)的合酶的基因等导入到宿主植物中。也有尝试过利用编码拟南芥(Arabidopsis thaliana)w-3脂肪酸脱氢酶的基因、蓝绿藻D9-脱氢酶的基因，或类似的细胞膜脂类修饰酶的基因的研究。在上述研究中，一个基因与花椰菜花叶病毒的35S启动子连接并导入植物中。但是，重组植物的胁迫耐受水平不稳定，并且导入基因的表达水平也很低。因此，这些都无法应用于实际应用中。

另一方面，研究发现，胁迫耐受机制与几种基因关系错综复杂(Shinozaki K，Yamaguchi-Shinozaki K.Plant Physiol.1997年10月；115(2)327-334页)。相应地，已有研究尝试了将编码转录因子并且同时激活上述几种基因表达的基因连接到一个组成型启动子上并导入植物中，从而增强植物的胁迫耐受力(Liu等，The Plant Cell，1998，10：1391-1406)。但是，当几种基因同时激活时，宿主植物的能量被导向于基因产物的合成或由基因产物产生的胞内代谢。相应地，植物自身生长变得延缓或生长矮小。

相反地，本发明人从拟南芥中分离出编码与胁迫应答元件结合并且特异性激活该元件下游基因转录的转录因子的基因DREB1A、DREB1B、DREB1C、DREB2A和DREB2B(JP专利公开(未审查申请)No.2000-60558)。他们报道在一个植物中导入与一个胁迫诱导的rd-29A启动子连接的基因能够产生不影响植物生长的胁迫耐受植物(JP专利公开(未审查申请)No.2000-116260)。

所述rd-29A启动子获自双子叶植物拟南芥。其也能够在单子叶植物中起作用，但是活性水平较低。相应地，在单子叶植物中具有高水平活性的胁迫-诱导的启动子已经成为很多研究的目标。

发明内容

本发明的目的是发现一种在象水稻这样的单子叶植物中能有效发挥作用的胁迫-诱导的启动子并提供一种利用该启动子的新的环境胁迫耐受植物。

本发明人进行了集中的研究以求达到上述目的。结果，他们从水稻基因组中已成功地分离了一种强胁迫-诱导的启动子。他们还发现单子叶植物的环境胁迫耐受力通过使用该启动子可得到显著提高。从而完成了本发明。

具体而言，本发明涉及一种获自水稻的胁迫-诱导的启动子。更具体地，该启动子由DNA(a)或(b)组成：

(a)由SEQ ID NO：1或10所示的核苷酸序列组成的DNA；或

(b)在严谨条件下，与能与由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列组成的DNA互补的核苷酸序列组成的DNA杂交、并表达胁迫-诱导的启动子活性的DNA。

于此所用的术语“胁迫”是指脱水胁迫、低温胁迫或盐胁迫。

本发明提供了一种包含上述启动子的重组载体。在根据本发明的启动子的控制下，该载体可包含其它结构基因或者调节基因。特别优选的是，该载体包含用于增强胁迫耐受性的结构基因和/或调节基因。

用于增强胁迫耐受性的优选的结构基因的实例包括，P5CS基因，其是一种脯氨酸合成的关键酶(Yoshiba Y.等.，1999，BBRC 261)，和用于肌醇半乳糖苷合成的AtGol S3基因(Taji T.等.，2002，Plant J，29：417-426)。

用于增强胁迫耐受性的优选的调节基因的例子包括，拟南芥来源的DREB转录因子基因(JP专利公开(未审查的申请)No.2000-60558)，水稻来源的OsDREB转录因子基因(JP专利申请No.2001-358268，Dubouzet等.，Plant J.出版中)，以及NCED基因，其是一种植物激素ABA生物合成的关键酶(Iuchi S.等.，2001，Plant J.27：325-333)。

特别优选拟南芥来源的DREB转录因子基因和水稻来源的OsDREB转录因子基因。最优选水稻来源的OsDREB转录因子基因。

本发明提供了一种转基因植物，其通过将本发明的载体导入到合适的宿主中而获得。根据本发明的一个实施方案，所述转基因植物通过将本发明的载体导入到一种宿主植物中而获得。在这种情况下，该宿主植物优选是单子叶植物，该单子叶植物优选是水稻。

通过将本发明的启动子导入到植物中，本发明进一步提供了一种用于增强植物胁迫耐受力的方法。本发明的启动子表现出强的胁迫-诱导的启动子活性，该活性从未在单子叶植物中被观察到，因此本发明的启动子更适于增强单子叶植物的胁迫耐受力。

附图简述

图1表示当实施各种胁迫时，对a0022(LIP9)Northern分析的结果。

图2表示a0022(LIP9)其启动子区的核苷酸序列。

图3表示GUS表达构建体的结构，其中Tg7代表g7终止子，HPT代表潮霉素磷酸转移酶，P_nos代表Nos启动子，以及T_nos代表Nos终止子。

图4是一个显示当实施脱水胁迫时，通过导入不同的连接到GUS基因的启动子制备的转基因烟草或水稻的GUS活性的图。

图5是一个显示当实施盐胁迫时，通过导入一种连接到GUS基因的LIP9启动子制备的转基因水稻的GUS染色结果的图。

图6显示了通过Northern方法分析导入的基因和靶基因(LIP9(a0022)，WSI724(a0066)，和salT(a2660))在转基因水稻和野生型水稻中表达水平的结果，其中“a，”“b，”和“c”各自分别代表一种转基因植物品系。

图7表示a0066(WSI724)其启动子区的核苷酸序列。

图8是一个显示当实施脱水胁迫时，通过导入一种连接到GUS基因的WSI724启动子制备的转基因水稻的GUS活性的图，其中右边的条代表当实施脱水胁迫时的GUS活性，左边的条代表对照。

图9是一个显示当实施脱水胁迫时，通过导入一种连接到GUS基因的WSI724启动子制备的转基因水稻的GUS染色结果的照片。

该说明书包括公开于日本专利申请No.2003-80847的说明书的部分或全部内容，其是本申请的优先权文件。

发明的实施方案

本发明的启动子是一种水稻来源的启动子，其特异性地由诸如低温、脱水或盐胁迫的环境胁迫所诱导。

1.本发明启动子的鉴定

本发明的启动子可鉴定如下。比较被实施胁迫和没有被实施胁迫的植物，以及首先，筛选以显著差异水平表达的基因(胁迫-诱导的基因)。随后，基于基因组信息，筛选被认定为基因启动子的序列。

以下描述了本发明启动子的鉴定过程。

1.1mRNA的制备

首先，制备用于筛选胁迫-诱导的基因的mRNA。

mRNA的来源可以是植物的局部，例如，叶子、茎、根或花朵，或者是植物整体。可选择地，可使用由播种到例如GM培养基、MS培养基或#3培养基这样的固体培养基上并无菌生长而获得的植物。其来源可以是愈伤组织或是无菌生长的植物的培养细胞。

在该筛选过程中，观察给予胁迫的植物和没有给予胁迫的植物之间基因表达水平的差异。因此，有必要为每种植物来制备mRNA。实施胁迫的适宜方法取决于所利用的植物类型。通常，脱水胁迫能够通过2-4星期不给植物浇水来实施。低温和冷冻胁迫能通过在15至-10℃下培养植物1-10天来实施。盐胁迫能通过在100-600mM NaCl中培养植物1小时-7天来实施。例如，就水稻来说，将溶液培养的水稻暴露于低温胁迫(10至-4℃)，盐胁迫(150-250mM NaCl中)和脱水胁迫(干燥的状态)中。

用液氮冻融给予胁迫和没有给予胁迫的植物，并在研臼中研磨，等等。从所产生的研磨材料中，采用乙二醛法、硫氰酸胍和氯化铯法，氯化锂和尿素法、蛋白酶K和脱氧核糖核酸酶法，或类似的方法，提取粗RNA组分。接着，从该粗RNA组分中，可以通过采用寡dT-纤维素、携带多U-琼脂糖的琼脂糖2B亲和柱的方法或类似方法，或者分批的方法，能获得poly(A)+RNA(mRNA)。如果需要，获得的mRNA可以通过蔗糖密度梯度离心或类似的方法进一步分级分离。

1.2胁迫-诱导的基因的筛选

胁迫-诱导的基因的筛选是基于被给予胁迫和没有被给予胁迫的植物基因表达水平差异的比较。用于基因表达水平比较的方法没有特别的限制，且可使用方法的具体例子包括传统方法，例如RT-PCR、实时PCR、扣除、差异显示、示差杂交以及交叉杂交。

利用诸如基因芯片以及cDNA微阵列的固相样品的方法特别适用于实施筛选过程，因为该方法能够同时定性并定量检测几千到几万个基因的表达。

(1)cDNA微阵的制备

在筛选过程中使用的cDNA微阵列没有特殊的限制，只要将单子叶植物(如水稻)的cDNA，即启动子的检测靶点，点在其上即可。可以利用现有的微阵列，或可使用常规方法制备点阵(如，The Plant Cell(2001)13：61-72，Seki等)。

当制备cDNA微阵列时，首先应制备目的植物的cDNA文库。可通过常规方法构建cDNA文库，使用方法(1)制备的mRNA作为模板。要被点加的cDNA无特殊限制，只要其来源于单子叶植物。从随后基因组数据库分析简化的观点考虑，来源于像水稻这样具有高级基因组分析的单子叶植物是优选的。植物可在正常状态下(未处理)。然而，优选暴露于像脱水、盐或低温这样的胁迫下的植物。

当建立cDNA文库时，首先利用一个商售的试剂盒(如，ZAP-cDNA合成试剂盒，Stratagene)进行mRNA的反转录和单链cDNA的合成。然后，利用合成的单链cDNA作为模板合成双链cDNA。随后，将一个含有合适限制酶切位点的连接物添加到所合成的双链cDNA上，然后将该双链cDNA插入到λ噬菌体载体的克隆位点上。利用商售试剂盒(如，Gigapack III Gold包装提取物(Stratagene))在体外对合成的DNA进行包装，使之感染E.coll宿主，再进行扩增。因此可获得目的cDNA文库。

一旦制备了cDNA文库，就用PCR扩增该cDNA或其具有高度特异性的区域(如，在3’端的不包含重复序列的UTR区)以产生要被固定在微阵列上的探针。当通过重复该过程获得所有目的基因的探针时，可利用商售点样器(如，由Amersham制造的)将这些探针点加到载玻片上。这样就获得了目的cDNA微阵列。

(2)基因表达水平的检测

当标记有合适试剂的样品mRNA(或cDNA)在微阵列上与cDNA探针杂交时，可通过cDNA微阵列获得的信号强度检测基因表达水平。一般而言，基因的表达水平优选确定为与合适的对照可比较的一个值，或是考虑到微阵列上点加的cDNA探针数量上的差异，在两个要被比较的样品之间的表达水平的比率。就本发明筛选过程而言，来自未实施胁迫(没有处理)的植物的mRNA作为对照，则获自实施胁迫的植物的mRNA的相对表达水平可通过它们的比例关系而得到测定。

检测按如下进行。对照和样品的mRNAs(或其cDNA)用不同的荧光染料(如Cy3和Cy5)进行标记，并与阵列上的cDNA探针杂交。例如，从实施胁迫的植物中提取mRNA并在Cy5标记的dCTP存在下进行反转录以制备Cy5标记的cDNA。随后，从未实施胁迫(未被处理)的植物中提取mRNA，并用同样的方法制备Cy3标记的cDNA。将相等数量的Cy5标记的cDNA(样品)和Cy3标记的cDNA(对照)混合，然后将产物与阵列上的cDNA杂交。Cy3可用于标记样品，Cy5可用于标记对照物。可选择地，也可使用其它合适的标记反应物。

利用荧光信号探测器读取所获得的荧光强度并随后转化为数值。该数值等同于样品的基因表达水平相对于对照的比率。任选地，对于每个样品将扫描仪读取的荧光强度进行误差调整或方差归一化。在每种样品中都普遍表达的基因如管家基因的基础上，可进行归一化。此外，确定用于可靠性的阈值界限以除去低相关性数据。

(3)胁迫诱导基因的筛选

基于阵列分析结果，胁迫诱导基因被指定为在实施胁迫和未实施胁迫的植物中以显著差异水平表达的基因。于此所用的术语“显著差异”是指，例如，在1000或者更高的强度水平上，两种植物之间的差异在3倍或3倍以上。

(4)通过Northern印迹法分析表达

对如上所选择的基因进一步进行Northern分析及类似的分析。因此，证实了基因表达水平增加与胁迫耐受水平增强相关。例如，将植物暴露于以如上所描述的方式进行的如盐、脱水、温度的不同水平的胁迫下。然后，从植物中提取RNA并通过电泳分离。将所分离的RNA转移到硝酸纤维素膜上，并与特异于该基因的标记的cDNA探针杂交。如此，其表达水平可得到检测。

如果所选基因表达水平以胁迫依赖方式增加，可确定该基因是胁迫诱导的。从水稻cDNA文库筛选的胁迫诱导基因的例子包括本发明的a0022(LIP9：SEQ ID NO：2)和a0066(WSI724：SEQ ID NO：8)。a0022和a0066是固定在微阵列上的cDNA的标识号。

1.3启动子序列的筛选

(1)基因数据库的筛选

随后，利用检测软件(如Blast)，在现有的基因数据库(如，DDBJ数据库)中寻找胁迫-诱导的基因的启动子序列。至于像水稻这样的植物，其基因组大部分已被破译，可利用现有的数据库寻找所有控制特异性胁迫诱导基因的启动子序列。来自高度同源于胁迫-诱导的基因(cDNA)的基因组基因的上游区域中被认作启动子的区域选择作为启动子序列。例如，基于胁迫诱导基因的基因组信息，将假定为这些基因的一个起始密码子位点的上游大约1到2kb区域推测为一个启动子区域。

在一些常用的胁迫-诱导的启动子的序列中，所含有的顺式(cis)元件与启动子活性相关，例如脱水应答元件(DRE)、脱落酸应答元件(ABRE)以及低温胁迫应答元件。当一个胁迫-诱导的转录因子结合至顺式元件时，激活了前述启动子，在启动子控制下的胁迫-耐受-给予基因被允许得到表达。相应地，如果寻找到包含在上游区域的顺式元件，该区域很有可能是胁迫-诱导的启动子。

因此，获得了高度同源于前述a0022(LIP9：SEQ ID NO：2)的基因的基因组信息，并从该基因的上游1.1kb区域中筛选到一个推测的LIP9启动子序列(SEQ ID NO：1)。类似地，从高度同源于a0066(WSI724：SEQ ID NO：8)的基因的上游区域中筛选到一个推测的WSI724启动子序列(SEQ ID NO：10)。

(2)胁迫-诱导的启动子功能的确定

随后，通过胁迫实施时启动子活性的改变来确定所推测的启动子序列的功能。

最初，基于上文所推测的启动子序列制备引物。使用基因组DNA作为模板进行PCR，克隆启动子。随后，将一个报告基因连接到启动子下游以产生一个报告质粒。然后，将所产生的报告质粒导入到植物中，接着研究对植物(优选其T2代)实施胁迫时报告基因的表达。报告基因的例子包括β-葡糖醛酸糖苷酶(如，GUS：pBI121，Clontech)、荧光素酶基因以及绿荧光蛋白基因。优选GUS，因为其活性可通过数值来显示且其表达可通过染色进行肉眼观察。

1.4本发明的启动子

基于上述，发现水稻基因组来源的LIP9启动子序列(SEQ ID NO：1)是一种胁迫-诱导的启动子，它们以脱水-、低温-或盐胁迫-依赖方式得到高表达。

如上所述，LIP9启动子为所有类型的胁迫所特异性诱导。其结构和功能特征描述如下。

1)LIP9启动子在其结构中包含与脱水胁迫诱导相关的2个DRE顺式元件(图2)。

2)在允许OsDREB1基因(日本专利申请号2001-358268)过表达的植物中，LIP9的表达水平是高的，所述OsDREB1基因是一种水稻来源的转录因子，其结合DRE顺式元件并激活位于其下游基因的转录。

3)LIP9启动子包含与OsDREB1蛋白结合的DRE序列。因此，推测对于OsDREB基因的过表达而言，LIP9启动子是最适合的。

此外，WSI724基因是OsDREB基因的靶点。该推测是基于WSI724启动子在其结构中包含2个DRE序列这样的事实所作出，也是基于当实施胁迫时a0066的表达谱而作出的(该表达谱是通过脱水、盐以及低温胁迫所诱导的，以及低温的诱导速率是低于脱水和盐的)。

本发明的启动子并不限于由如SEQ ID NO：1或10所示的核苷酸序列组成的DNA。本发明的胁迫-诱导的启动子包括，在严谨条件下，能与由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列组成的DNA互补的核苷酸序列组成的DNA杂交的DNA，只要该DNA具有胁迫诱导启动子的活性。在“严谨条件”下，是指杂交在30-50％甲酰胺中，于37℃至50℃，在6xSSC中进行，优选在50％甲酰胺，于42℃，在6xSSC中进行。

2.重组载体

本发明的重组载体包括本发明的启动子。该载体可包括其它功能性结构基因或本发明的启动子下游的调节基因。优选的基因实例包括用于增强胁迫耐受性的结构基因和/或调节基因。术语“功能性”指在本发明启动子控制下，其它结构基因或调节基因适宜表达的一种状态。

由增强胁迫耐受性的结构基因编码一种蛋白，该蛋白在增强植物对于像脱水、低温或盐胁迫的环境胁迫耐受中发挥作用。这些蛋白的实例包括：LEA蛋白；水通道蛋白；作用于可混溶溶质的合酶；烟草解毒酶；作用于渗透调节物质(如，糖、脯氨酸或甜菜碱)的合酶；编码拟南芥w-3脂肪酸脱氢酶和蓝绿藻D9-脱氢酶的基因，它们是细胞膜脂类修饰酶；P5CS，其是一种脯氨酸合成的关键酶；以及用于肌醇半乳糖苷合成的AtGolS3基因。

用增强胁迫耐受性的调节基因调节胁迫-诱导的启动子活性以及用于产生胁迫耐受性的基因的表达，从而增强植物中的胁迫耐受性。这样的调节基因例子包括拟南芥来源的转录因子，例如DREB1A、DREB2A、DREB1B和DREB1C基因(JP专利公开(未审查的申请)号.2000-60558)；水稻来源的转录因子，例如OsDREB1A、OsDREB1B、OsDREB1C、OsDREB1D和OsDREB2A基因转录因子(日本专利申请号2001-358268)；以及NCED基因，其是植物激素ABA生物合成的关键酶。

当本发明的启动子包含一个特异性顺式元件时，结合该顺式元件并增强其启动子活性的转录因子的基因特别优选地连接于该启动子的下游。

如上所述，本发明的LIP9启动子其结构中包含2个DRE序列。因此，优选将DREB或OsDREB基因(例如，OsDREB1A、OsDREB1B、OsDREB1C、OsDREB1D、OsDREB2A或OsDREB2B基因)连接到LIP9启动子下游。最优选OsDREB基因。

因为WSI724启动子也包含2个DRE序列，因此推测其是OsDREB的靶点，优选将DREB或OsDREB基因(例如，OsDREB1A、OsDREB1B、OsDREB1C、OsDREB1D、OsDREB2A或OsDREB2B基因)连接到WSI724启动子下游。最优选OsDREB基因。

通过连接(插入)本发明的启动子或启动子和其它调节基因或结构基因到(至)合适的载体上，构建得到本发明载体以致其具有功能性。要被插入启动子的载体没有特殊限制，只要其能够在宿主中复制即可。例如，质粒DNA、噬菌体DNA或类似可被使用的。质粒DNA包括：用于大肠杆菌(E.coli)宿主的质粒，例如，pBR322、pBR325、pUC118和pUC119；用于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)宿主的质粒，例如pUB110和pTP5；用于酵母宿主的质粒，例如，YEp13、YEp24和YCp50；以及用于植物细胞宿主的质粒，例如，pBI221和pBI121。噬菌体DNA包括λ噬菌体和类似的噬菌体。此外，也可使用动物病毒载体，例如，逆转录病毒或牛痘病毒载体，或也可使用昆虫病毒载体，例如杆状病毒载体。

通过用合适的限制酶切割纯化的DNA并接着插入到用于连接的合适载体的限制性酶切位点或多克隆位点，可将本发明的启动子插入到载体中。

如果需要，本发明的重组载体可包含一个剪接信号、poly(A)添加信号、选择标记、核糖体结合序列(SD序列)等等。选择性标记的实例为二氢叶酸还原酶基因、氨苄青霉素耐受基因，新霉素耐受基因等等。

3.转基因植物

可通过将本发明的重组载体导入宿主中以便启动子活性能够表达来制备本发明的转基因植物。宿主并无具体限制，只要本发明的启动子能在其中起作用即可。宿主优选为植物，特别优选为象水稻这样的单子叶植物体。

当植物或植物细胞用作为宿主时，例如，使用从水稻、玉米、小麦、拟南芥，烟草或胡萝卜确立的细胞或制备自这些植物的原生质体。用于将重组载体导入植物的方法包括Abel等的方法，该方法利用了聚乙二醇(Abel，H.等，Plant J.5：421-427，1994)，以及电穿孔。

4.胁迫耐受性转基因植物

(1)制备转基因植物

将用于增强耐受胁迫性的结构基因和/或调节基因导入植物，使之置于本发明的启动子的控制之下。从而，能够制备得到对环境胁迫耐受性增强了的功能性转基因植物，所述环境胁迫是例如低温、冷冻或脱水的胁迫。特别优选的宿主植物的实例是单子叶植物。

用于将本发明的启动子等导入宿主植物的方法包括：间接导入法例如农杆菌感染法以及直接导入法例如粒子枪法、聚乙二醇法、脂质体法和显微注射法。迄今为止，使用农杆菌感染法从象水稻这样的单子叶植物制备得到转基因植物是很困难的。但是，加入乙酰丁香酮可使农杆菌感染水稻。因此，使得农杆菌感染法可用于单子叶植物。

本发明下文中将描述用农杆菌制备转基因植物。

要被导入植物的重组载体可通过下述方法制备而成：用合适的限制性酶对包含本发明的启动子和用于增强胁迫耐受的结构基因和/或调节基因的DNA进行切割，如有必要，在切割后的DNA上连接一合适的接头，然后将该DNA插入可用于植物细胞宿主的克隆载体中。二元载体型质粒，如pBI2113Not、pBI2113、pBI101、pBI121、pGA482、pGAH和pBIG，或中间载体型质粒如pLGV23Neo、pNCAT和pMON200可用作为克隆载体。

当使用二元载体型质粒时，目的基因要插入到二元载体的两邻接序列(LB、RB)之间。所得到的重组载体在大肠杆菌中扩增。然后通过冻融、电穿孔等方法将扩增后的重组载体导入根癌农杆菌C58(Agrobacterium rumefaciens C58)、LBA4404、EHA101、C58C1RifR、EHA105等中。将所得到的农杆菌用用于转化植物。

在本发明中，除上述方法外，还可用三元偶联法(Nucleic AcidsResearch，12：8711，1984)来制备要导入植物中的农杆菌。具体而言，将包括目的基因的含质粒大肠杆菌、辅助性含质粒大肠杆菌(如pRK2013)以及农杆菌混合并在含利福平和卡那霉素的培养基上培养。因此，可得到待感染到植物体中的结合子农杆菌。

对于在植物体内表达外源基因等而言，应该将植物终止子等置于结构基因的下游。可用于本发明的终止子序列的具体实例包括花椰菜花叶病毒来源的和胭脂氨酸合成酶基因来源的终止子。终止子不限于上述的终止子，只要已知它们在植物体中能够发挥作用即可。

为了有效地筛选目的转基因细胞，优选使用可有效筛选的标记基因。可用选自下列基因的一个或多个基因作为筛选标记：卡那霉素耐受(NPTII)基因、可赋予植物对抗生素潮霉素耐受性的潮霉素磷酸转移酶(htp)基因、可赋予双丙氨膦耐受性的膦丝菌素酰基转移酶(bar)基因等。本发明的启动子和筛选标记基因可一起插入到同一载体中。可选择地，它们可各自插入不同的载体中。

如果用上述方法制备的农杆菌感染植物，那么就可制得目的转基因植物。

将该转基因植物播种在含足量抗生素的培养基上，然后筛选获得含目的启动子和基因的植物。将筛选得到的植物转移到含BonsolNo.1、黑土或类似成分的罐中，并进行进一步的培养。通常来说，基因都是以类似的方式导入宿主植物的基因组中。但是，由于导入的基因在基因组上的位置不同，会使得导入基因的表达情况随之变化。这种现象称之为“位置效应”。通过使用来自导入基因的DNA片段作为探针通过Northern印迹法对转基因植物进行分析，有可能筛选出那些其中导入基因更高表达的转基因植物。

(2)胁迫耐受性的确认

转基因植物及其后代中是否整合了本发明所述启动子或结构基因和/或用于增强胁迫耐受性的调节基因，可以采用下述方法对其确认：从这些植物的细胞及组织中提取DNA，并用本领域常规方法PCR或Southern分析对导入的基因进行检测。

基因在转基因植物中的表达水平及表达器官可以通过下述方法分析：从植物细胞及组织中提取RNA，通过本领域常规方法RT-PCR或Northern分析检测导入的基因的mRNA。可选择地，导入基因的转录产物可通过使用抗该产物的抗体或类似物经Western印迹法进行直接分析。

已经导入了本发明所述启动子的转基因植物对于环境胁迫的耐受性可以通过下述方法评估：将该转基因植物栽培在一装有土壤的罐中，所述土壤中含有蛭石、珍珠岩、Bonsol等或用溶液培养植物，将该植物暴露于不同类型的环境胁迫下，然后检测植物的存活情况。环境胁迫包括低温、脱水及盐胁迫。例如，对脱水胁迫的耐受性可通过让植株无水生长2-4周，然后检测其存活情况来评价。对低温和冷冻胁迫的耐受性可以通过让植物在15至-10℃下生长1-10天，在20-35℃下生长2天-3周，然后测定其存活比率来评价。对盐胁迫的耐受性可通过，例如，让植物在100-600mM NaCl中生长1小时-7天，在20-35℃下生长1-3周，然后测定存活比率来评价。因此，使用本发明的启动子能显著增强胁迫耐受性而不阻碍植物的生长(特别是单子叶植物)。

(3)优选的转基因植物的实例

本发明优选的转基因植物的实例是通过将包含连接LIP9或WSI724启动子下游的功能性OsDREB基因的载体导入象水稻或小麦这样的单子叶植物中所制备的一种植物。因为LIP9启动子包含2个DRE区域，因此OsDREB基因可通过与顺式元件结合以有效地发挥胁迫耐受的作用。同样地，WSI724启动子包含2个DRE区域，因此，可增加OsDREB基因的表达水平并增强植物的胁迫耐受性。

实施例

根据下列实施例，本发明得到更详细的描述，但是，本发明的技术范围不为此所限。

[实施例1]胁迫-诱导的水稻基因的鉴定

使用cDNA微阵列及Northern分析搜索胁迫-诱导的水稻基因。

1.水稻cDNA微阵列的制备

将在培养液中生长2-3周的水稻种子(Nihonbare)经受脱水、盐或低温胁迫。通过室温下空气干燥来实施脱水胁迫，通过在250mMNaCl溶液中培养实施盐胁迫，通过在4℃下培养实施低温胁迫。将已用每一种胁迫处理过的水稻用液氮冷冻。通过硫氰酸胍及氯化铯法从冷冻样品中提取总RNA，并用寡聚(dt)-纤维素柱制备mRNA。利用所得到的mRNA作模板用HybriZAP-2.1双杂交cDNA Gigapack克隆试剂盒(Stratagene)合成cDNA，并将得到的cDNA插入并克隆到HybriZAP-2.1噬菌粒载体的EcoRI-XhoI切割位点上。使用GigapackIII Gold包装提取物(Stratagene)包装该噬菌粒DNA。所得到的含cDNA的λ噬菌体颗粒被用于感染宿主大肠杆菌，然后扩增这些噬菌体颗粒，并随后以噬菌体悬液方式回收这些噬菌体。

对cDNA克隆的核苷酸序列进行测序以筛选出约1500个单独的克隆。通过PCR扩增所筛选的克隆并用GTMASS系统(Nippon Laserand Electronic Laboratory)将其印在聚-L-赖氨酸-包被的显微载玻片(型号S7444，Matsunami)上。然后，通过UV交联将克隆固定以制备水稻cDNA微阵列(The Plant Cell，2001，13：61-72Seki等)。

2.微阵列分析

以与上文相同的方法对水稻植株实施脱水、盐或低温胁迫或用100μM脱落酸处理(5小时或10小时)，分别从这些植株以及未受胁迫的水稻植株(未经处理)中提取mRNA。以来自未经处理水稻植株的mRNA作为对照，并用来自已经各种胁迫或脱落酸处理的水稻植株的mRNA作为样品。通过用Cy3和Cy5双重荧光标记的方法进行cDNA微阵列分析。作为微阵列分析的结果，强度为1000或更高的基因以及具有表达水平比对照高3倍的基因被选作为侯选的胁迫-诱导的基因。因此，a0022(LIP9：SEQ ID NO：2)和a0066(WSI724：SEQ ID NO：8)被选作为胁迫-诱导的基因。

3.通过Northern杂交进行表达分析

通过Northern杂交分析上文中所选择的基因的特征性表达。首先，将水稻植株暴露于脱落酸、脱水、低温、盐或水胁迫，然后每隔0、1、2、5和10小时从施加了胁迫的水稻中完成取样。脱落酸、脱水、低温或盐胁迫分别以与1中相同的方法施加，用将植株浸没于纯水中的方法施加水胁迫。从每一样本中制备总RNA，进行电泳，并通过Northern方法观察每一基因的表达。结果见图1。

由图1清楚可见，a0022基因的表达受脱落酸、脱水、低温、或盐胁迫诱导。具体而言，其表达为脱落酸、脱水或盐胁迫所快速诱导。相反地，其表达为低温胁迫所缓慢诱导。基于施加胁迫时的表达谱(该表达谱是通过脱水、盐和低温胁迫所诱导的，低温诱导速率较脱水和盐诱导为慢)，a0066基因是OsDREB的靶点。

[实施例2]启动子序列的筛选

1.水稻基因组数据库的筛选

使用Blast，从DDBJ水稻基因组数据库中搜索实施例1中被选作为胁迫-诱导基因的a0022(LIP9：SEQ ID NO：2)的cDNA的同源位点。结果，在观察到同一性的基因中，位于该基因从起始密码子上游向5’端方向的1.1kb序列选作为启动子序列(SEQ ID NO：1)。对a0066(WSI724：SEQ ID NO：8)也进行了类似的搜索，筛选到其启动子序列(SEQ ID NO：10)。

图2显示了LIP9启动子区域的结构。由图2清楚可见，LIP9其结构中包含2个DRE顺式元件((A/G)CCGAC)。图7显示了WSI724启动子区域的结构。也发现该WSI724启动子其结构中包含2个DRE顺式元件((A/G)CCGAC)。

2.克隆

以所筛选到的启动子序列为基础，设计引物，利用水稻基因组DNA作为模板进行PCR，并进行克隆。引物序列和PCR所使用的条件如下：

用于LIP9启动子的引物序列：

正向引物：5’-CACGAAGCTTTCATCAGCTATTCATCAA-3’(SEQ ID NO：3)

反向引物：5’-CCGGATCCTCGATCGATGGATTCAGCTA-3’(SEQ ID NO：4)

用于WSI724启动子的引物序列：

正向引物：5’-CCATTGGATCCAGCCGTGGAAGTCCAAC-3’(SEQ ID NO：11)

反向引物：5’-GCCGGGGATCCTTGGCGCCTCTCTCTCT-3’(SEQ ID NO：12)

PCR条件：95℃持续1分钟，55℃持续1分钟，68℃持续2分钟，30个循环。

[实施例3]LIP9启动子抗胁迫活性

(1)制备转基因植物

用玉米的泛蛋白启动子取代pBIG29APHSNot的启动子位点以制备G-ubi质粒。用BamHI-HindIII切割G-ubi质粒并连接到以同样方式切割的LIP9启动子的片段上。将已整合入LIP9启动子的质粒用BamHI-EcoRI切割并连接到从pBI221(Clontech)中用BamHI-EcoRI以同样方式切割得到的Gus基因上，以制备GUS-表达构建体G-LIP9：GUS(图3)。通过电穿孔将质粒G-LIP9：GUS导入农杆菌EHA105中，培养后用10％甘油洗涤，从而制备得到农杆菌EHA105(G-LIP9：GUS)。以下列方式用该农杆菌EHA105(G-LIP9：GUS)感染水稻来制备目的转基因植物。

将水稻种子浸没在70％乙醇中1分钟，然后浸没在2％次氯酸钠中1小时消毒。接着用无菌水洗涤消毒后的种子，每种种子各取9粒播种在N6D固体培养基(每升中含：3.98g CHU[N₆]基础盐混合物(Basal Salt Mixture)(Sigma)、30g蔗糖、100mg肌醇、300mg酪蛋白氨基酸、2，878mg L-脯氨酸、2mg甘氨酸、0.5mg烟酸、0.5mg盐酸吡哆醇、1mg盐酸硫胺素、2mg 2，4-D以及4g Gellite，pH5.8)平板上，然后培养24天。如此，愈伤组织得到诱导。将大约20颗种子所形成的愈伤组织转移到新的N6D固体培养基上，然后再培养3天。

将农杆菌EHA105(G-LIP9：GUS)分别在含100mg/l利福平和含20mg/l卡那霉素的5ml YEP培养基(每升中含：细菌培养用蛋白胨10g、细菌培养用酵母提取物10g、NaCl 5g、MgCl₂·6H₂O 406mg，pH7.2)中在28℃下培养24小时。用含20mg/l乙酰丁香酮的AAM培养基(每升中含：10mg MnSO₄·5H₂O、3mg H₃BO₃、2mg ZnSO₄·7H₂O、250μgNa₂MoO₄·2H₂O、25μg CuSO₄·5H₂O、25μg CoCl₂·6H₂O、750μg KI、150mg CaCl₂·2H₂O、250mg MgSO₄·7H₂O、40mg Fe-EDTA、150mgNaH₂PO₄·2H₂O、1mg烟酸、10mg盐酸硫胺素、1mg盐酸吡哆醇、100mg肌醇、176.7mg L-精氨酸、7.5mg甘氨酸、900mg L-谷酰胺、300mg天冬氨酸和3g KCl，pH5.2)稀释该农杆菌至O.D.₆₆₀值为0.1。由此，制备得到20ml农杆菌悬液。

随后，将农杆菌悬液加入培养了3天后的愈伤组织，然后混合1分钟。接着，将该愈伤组织放置在消毒后的纸巾上以去除多余的农杆菌悬液，然后在其上已放置了消毒后的滤纸的2N6-AS固体培养基(每升中含：3.98g CHU[N₆]基础盐混合物、30g蔗糖、10g葡萄糖、100mg肌醇、300mg酪蛋白氨基酸、2mg甘氨酸、0.5mg烟酸、0.5mg盐酸吡哆醇、1mg盐酸硫胺素、2mg 2，4-D、10mg乙酰丁香酮以及4gGellite，pH5.2)上培养，于黑暗处在25℃下培养3天。培养3天后，用含有500mg/l羧苄青霉素的3％蔗糖水溶液彻底洗涤该培养产物直至该产物无污斑。将洗涤后的培养产物在含500mg/l羧苄青霉素和10mg/l潮霉素的N6D培养基上再培养1周。然后，将所得到的培养产物转移到含500mg/l羧苄青霉素和50mg/l潮霉素的N6D固体培养基上再培养18天。然后，把该愈伤组织转移到再分化培养基(每升含：4.6g Murashige和Skoog植物盐混合物(Plant Salt Mixture)(NihonPharmaceutical Co.，Ltd)、30g蔗糖、30g山梨醇、2g酪蛋白氨基酸、100mg肌醇、2mg甘氨酸、0.5mg烟酸、0.5mg盐酸吡哆醇、0.1mg盐酸硫胺素、2mg NAA、2mg激动素、250mg羧苄青霉素、50mg潮霉素以及8g琼脂糖，pH5.8)。每隔一周将产物转移到新的培养基上进行再分化。将那些芽体长到约1cm长的产物转移到无激素培养基(每升含：4.6g Murashige和Skoog植物盐混合物(Nihon PharmaceuticalCo.，Ltd)、30g蔗糖、2mg甘氨酸、0.5mg烟酸、0.5mg盐酸吡哆醇、0.1mg盐酸硫胺素、50mg潮霉素以及2.5g Gellite，pH5.8)。将那些在无激素培养基上生长到约8cm的植物体转移到装有合成颗粒状盆用土壤(Bonsol No.1，Sumitomo Chemical Co.，Ltd.)的盆中让转基因植物产生种子。

类似地，将rd29A启动子(Nature Biotechnology：1999，17：287-291)、35S启动子或salT启动子(SEQ ID NO：5)连接到GUS基因上游以得到构建体。将所得到的构建体导入水稻和/或烟草中。

该salT启动子是一种通过以与LIP9启动子相同的方法进行筛选，分离自水稻基因组的胁迫诱导启动子。固定在微阵列上salT启动子cDNA的ID号为a2660。尽管salT启动子在其结构中并不包含特定的顺式序列，但证实了其表达是受脱落酸、脱水、低温或盐胁迫所诱导的(日本专利申请号2002-377316)。

(2)启动子抗脱水胁迫活性

将所获得的GUS-表达转基因水稻的T2代用溶液培养2周，并以与实施例1相同方式暴露于脱水胁迫。

就表达GUS的转基因烟草而言，让从T1代植株再生得到的植株在植物生长锥体中生长3-5周，将生长的叶片一分为二。其中一半作为对照测定，另一半在室温下空气干燥，然后暴露于脱水胁迫下。

4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷酸降解导致荧光强度的变化，据此来分析转基因水稻和烟草的GUS活性。图4显示了在施加脱水胁迫时导入不同启动子的转基因植株的GUS活性。

由图4清楚可见，胁迫-诱导的salT或LIP9启动子在单子叶植物，即水稻，中的活性水平比rd29A启动子要高。具体而言，LIP9启动子的活性大约比salT启动子高两倍。虽然，LIP9启动子也在双子叶植物烟草中表现出胁迫-诱导的启动子活性，但是其活性较水稻为弱。

(3)启动子抗盐胁迫活性

随后，将其中已导入LIP9启动子-GUS构建体的水稻整个植株浸没入盐水中，接着进行GUS染色。结果，整个植株都被染色(图5)。在此基础上，发现LIP9启动子在施加了盐胁迫的植株的所有部位中都能够发挥作用。

[实施例4]WSI724启动子抗胁迫活性

以与实施例3相同的方式使用WSI724启动子制备转基因水稻，并研究其胁迫应答。

(1)制备转基因植物

用玉米的泛蛋白启动子取代pBIG29APHSNot的启动子位点以制备G-ubi质粒。用BamHI-HindIII切割G-ubi质粒并连接到以同样方式切割的WSI724启动子的片段上。用BamHI切下WSI724启动子的PCR片段并平端化，连接到pBIG载体位点上，用SamI切割该载体以制备GUS-表达构建体(WSI724：GUS)。随后，通过电穿孔将WSI724：GUS导入农杆菌EHA105中，培养后用10％甘油洗涤，从而制备得到农杆菌EHA105(WSI724：GUS)。用该农杆菌EHA105(WSI724：GUS)感染水稻来制备目的转基因植物。

(2)启动子抗脱水胁迫活性

基于4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷酸降解所导致荧光强度的改变，以与实施例3相同的方式将GUS-表达转基因水稻暴露于脱水胁迫中以测试其GUS活性。结果，在已施加脱水胁迫的转基因水稻叶子中观察到的GUS活性(在这里叶子已被切下并允许放置24小时)高于在对照的叶子中所观察到那些(在这里上述叶子已被切下并接着马上冷冻)。对已施加脱水胁迫(持续24小时)的转基因水稻进行GUS染色，在根和叶子中都观察到了GUS活性。

[实施例5]导入转基因水稻的基因的表达，LIP9基因和WSI724基因

以与实施例3相同的方式制备转基因植物。通过在玉米泛蛋白启动子或35S启动子的控制下，将OsDREB1A基因(SEQ ID NO：6)或DREB1C基因(SEQ ID NO：8)导入水稻中以制备转基因植物。通过Northern方法分析已导入转基因植物的REB1C基因的mRNA水平以及LIP9(a0022)、WSI724(a0066)和salT(a2660)的mRNA水平，认为其表达为导入的基因所改变。

OsDREB1A基因(SEQ ID NO：6)、DREB1C基因(SEQ ID NO：8)、LIP9基因(a0022，SEQ ID NO：2)、WSI724基因(a0066，SEQ IDNO：8)以及salT基因(a2660，SEQ ID NO：9)被作为探针(将涉及序列表中SEQ ID NOs：6和7的编码区序列作为探针)。作为对照，其中仅转化了载体的水稻以相同的方式进行分析。

在含有30mg/ml潮霉素的0.1％苯菌灵(Benlate)溶液中筛选转基因植物5天。然后，将植物转移至含有Bonsol No.1的罐中并培养12天。以相同方法培养野生型水稻。提取每一植物的总RNA并进行电泳。以与实施例1相同的方式通过Northern方法分析每一基因的表达。结果示于图6中，其中“a”、“b”和“c”分别代表一种转基因植物品系。

在已导入OsDREB1A和DREB1C基因的转基因水稻中，在启动子区域具有DRE序列的LIP9基因的表达被发现得到诱导。相反，发现在启动子区域没有DRE序列的salT基因的表达与导入的基因(OsDREB1A或DREB1C)的表达不一致。同样，在启动子区域包含DRE序列并被推测是OsDREB靶点的WSI724基因的表达与为这些转基因植物所诱导的LIP9一样。

LIP9或WSI724启动子包含DRE序列，且观察到在OsDREB1A基因过表达的转基因植物中LIP9或WSI724基因的表达水平是高的。LIP9和WSI724被认为是包括OsDREB1A的OsDREB基因的靶基因。因此，推测对于OsDREB基因过表达而言，LIP9和WSI724启动子是最适合的。

[参考实施例1]pBE35S：OsDREB1A、G-ubi：OsDREB1A和G35S-ShΔ：OsDREB1A的制备

按下述方法制备G-ubi和G35S-ShΔ。首先，用BamHI切割pBIG质粒(Nucleic Acids Research 18：203，1990)，平端化，并连接，从而删除该BamHI切割位点。然后，用HindIII和EcoRI切割该质粒。将得到的片段和一个通过相同方式切割pBE2113Not质粒得到的长约1.2kb的片段连接，从而制备得到pBIG2113Not质粒。

随后，用HindIII和BamHI切割pBIG2113Not，并与以相同方式切割rd29A启动子得到的一个片段(约0.9kb，Nature Biotechnology17：287-291，1999)连接，从而制备出pBIG29APHSNot质粒。接着，用HindIII和SalI切割该pBIG29APHSNot质粒，然后与玉米的泛蛋白基因(Ubi-1)启动子的一个片段(约2.0.kb，Plant Molecular Biology18：675-689，1992)或者一个其中含有p35S-shΔ-stop的CaMV 35S启动子和玉米蔗糖合成酶基因(Sh1)一部分内含子的片段(约1.6kb，Proceeding National Academy of Science USA 96：15348-15353，1999)连接，这些片段是以同一方式切割得到的。从而，制得G-ubi质粒和G35S-ShΔ质粒。

用BamHI切割上述的pBE2113Not、G-ubi和G35S-ShΔ，并用Ligation High(Toyobo Co.，Ltd.)与同样切割得到的编码水稻转录因子的OsDREB1A基因片段连接。用以此得到的连接产物转化大肠杆菌DH5α。培养转基因大肠杆菌后，从中纯化出质粒pBE35S：OsDREB1A、G-ubi：OsDREB1A和G35S-ShΔ：OsDREB1A。随后，测定它们的核苷酸序列，并筛选具有结合至有义方向的OsDREB1A基因的那些。

将含有质粒pBE35S：OsDREB1A的大肠杆菌DH5α、含有辅助质粒pRK2013的大肠杆菌HB101和农杆菌C58混合并在LB琼脂培养基上于28℃培养24小时。刮下所产生的克隆并悬于1ml LB培养基中。将该悬液(10μl)加到含100mg/l利福平和20mg/l卡那霉素的LB琼脂培养基中，并于28℃培养2天，从而获得接合子农杆菌C58(pBE35S：OsDREB1A)。通过电穿孔，将G-ubi：OsDREB1A质粒和G35S-ShΔ：OsDREB1A质粒分别导入农杆菌EHA105中，并在培养后用10％甘油洗涤。因此，获得了农杆菌EHA105(G-ubi：OsDREB1A)和农杆菌EHA105(G35S-ShΔ：OsDREB1A).

于此引证的所有出版物、专利和专利申请其全文并入本文作为参考。

工业实用性

本发明提供了一种胁迫-诱导的启动子，该启动子可以在单子叶植物中发挥功效。该启动子包含DRE序列。如果OsDREB基因或类似基因被连接以致其在该启动子控制之下并导入植物中，因此，可制备得到具有潜在的胁迫耐受性的转基因单子叶植物，如水稻。

序列表的独立文本

SEQ ID NO：3-人工序列描述：引物

SEQ ID NO：4-人工序列描述：引物

SEQ ID NO：11-人工序列描述：引物

SEQ ID NO：12-人工序列描述：引物

序列表

<110>Japan International Research Center for Agricultural SciencesIncorporated Administrative Agency，National Agriculture and Bio-orientedResearch Organization

<120>胁迫-诱导的启动子及其使用方法

<130>PH-2004-PCT

<140>

<141>

<150>JP 2003-80847

<151>2003-03-24

<160>12

<170>Patent In 2.1版

<210>1

<211>1066

<212>DNA

<213>水稻

<220>

<223>发明人：Shinozaki，Kazuko；Katsura，Koji；Ito，Yusuke

<400>1

tcatcagcta tcatcaaagc gaaggaaaga aagaaaaata aaaggaaaag aactggctgg 60

aaattagaga agccccggac gactcgatct gggggtggca aattaatcag tgtgatcaac 120

agggataact tatcccgtcc gaccaaatcc accaaccaaa ccaagacccg atttgttagg 180

ctgtgaaaga cggatcagtg ggaccctgat ctacggaccc catatgtcac cgtccaggtc 240

tctggatctc tcccgtcgtc ctaatcagac accgcgcgcg cggtgccgtc gctctcgagc 300

cgtgtcccgc tcccaactcg tcacaaaagc gatcacagac tcttccttcc tctgctggga 360

gagaagaaaa attggccgcg atgatgccga taaagaggaa aaagggatga gaatccgatg 420

gaaaaaaact gatgttaatc tatcgctact gctgcgcact aagacgaatc gtatccgaac 480

aagaaacgct tacgttactg ttcctaaatg gatcgctccg ctcatcactt aaccaaaaat 540

cgattaggaa attgacggac agcgacgccc gaagccaagt gtctcgtcgc gtaggcgtcg 600

aggcctcgaa gcagagggag cggagaggcg gacgcgccgc ccacgcctcc tctccctcgg 660

tgacacggcc gtctggctcc acatggcgcc gacctctccc gatgcgtcca cccgtcccga 720

ggcaccgcca cgtcggaacc agccggccgc cccacgcgat tgccgacacg cgtcgcggcg 780

ccactggctc acccgctgcc tgcctctgcc tgccccccat ctcgtcgcca tttcccgccc 840

acgcttcttg tcctcgcgtc gcctacgcgt acgtacgata caaacgccgc acctttcgat 900

cccctccgct atataaggag ggcatctgcc tcgccacctt cttcatccga aagcaaaagc 960

gactcgtcac agctcaaaca agtcaagagc gaatagttct tgctgatctg ttgtttgatt 1020

actttagttc tcgagaggct ttagctgaat ccatcgatcg aggatg 1066

<210>2

<211>1245

<212>DNA

<213>水稻

<400>2

gctagcagag ctcgtcacag ctcaaacaag tcaagagcga atagttcttg ctgatctgtt 60

gtttgattac tttagttctc gagaggcttt agctgaatcc atcgatcgat catggaggat 120

gagaggaaca cggagagcca ccagggtggc gaggctgcag agcaggtgga ggtgaaggac 180

aggggcctct tcgacaacct ccttggcagg aagaaggacg atcagccgga ggagaagaag 240

catgaggagg agcttgtcac cggcatggag aaggtctccg tggaagagcc aaagaaggag 300

gagcaccacg ccgagggcga gaagaaggag agcctcctct ccaagctgca ccgatccagc 360

tccagctcca gctcgtcgag tgatgaggaa gaggaggtga tcgatgacaa cggcgaggtg 420

gtcaagagga agaagaagaa ggggctcaag gagaagatca aggagaagct gcccggccac 480

aaggaccatg ccggtgagca tgctcctccg cccgcggcga cgggcttccc gcgccggctc 540

cgctgcatcc gtggtgacgg ccgcgcccac gccactcctg ctcccgtggt gactcacggc 600

gatcaccacc acgacaccgc cgtccccgtg gaaaagatcg agggtgatca cgccagacgg 660

aggcgaccct gccacgtgca cccgaggagg aaaaaagggc ttcctcgaca agatcaagga 720

gaagctgccc ggcggccaca agaagccgga agacgcaact gctgtgccgc cgccggccgc 780

ctcaccggct gctcctgcca ctactccggc gccagcacac ccaccgccgg ctacagagga 840

agtgagcagc ccggatggga aggagaagaa gggtatactg ggcaagatca tggagaaact 900

gcccggttac cacaagggct ccggcgagga agacaagacc gccgccgccg ccaccggcga 960

gcacaagagc agcgcttaat tggggcgtgt gtgagaccag gccatggttg gaatttggaa 1020

gtgtttggcg tgtgttagtt tggtgctttt tctgcactgc agctttgtta agttcgtgtc 1080

aagattggtc aaggcctggt cagcgaagcc cgatcagtga tcgaagtttg tgtttcgtgt 1140

ggggtacggg cttcagtttg ctatagtcaa gtactagatg ttgagtttgt ttaattatta 1200

ttggcactct tgtattggtt ttgggctggg cattctgcct tggta 1245

<210>3

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>3

cacgaagctt tcatcagcta ttcatcaa 28

<210>4

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>4

ccggatcctc gatcgatgga ttcagcta 28

<210>5

<211>1608

<212>DNA

<213>水稻

<400>5

caacaaccac tactgaacac ggctaagtgt gtttcctctc ctcgaagatg tcgttattgc 60

gttcttttct gctattccat acatatcaat ctctagagga acaccttact ctagctttca 120

gacaagggac ggtggtaaat cacgtcgtat cctccatggg gtgtgctccg aaaaaccttc 180

cctcatgcat tagagatcat gggtggaatt tagcgatggc acaccttatt tataatttag 240

ttactctccg gcggtaccat ctgcttccgt ttgttgatcg atgctggcga tgatgtgtgt 300

gagtatcgat caacagaatg atcggacgct atttttgggg tcgttttttt tcagcattga 360

ggagggatga ggattgcttg caacatgcag gtgctgctca aaacaacggt taagcagata 420

tccgtcaatt tgatagtaag atctgtaacg cgtggtcttt cgagctgaaa actatggact 480

ctttgaaaca aagataatat tatattaaat tctattattc aaagatatct aaatatttag 540

aaagatatta ataatgttat taaactttga cttacttaaa acaagtccaa aactgcatgt 600

ccctaaatcg ccagaagata aggaacacct gtacccgtga taacagaggg gtatgaaatt 660

tggacacgag gcttctttgg cagacgtggc gctgagtgag cttggctcgc ttggtcaaac 720

tccgtgcagg gacattcagt tagctagcta gcagcattgt cgacaataag atagccttta 780

aatgttagca ctcaccagct tgtcaaaaac caaggcttgg tgacggcggc ttcagaatga 840

aggatagatg gataaatgtc tagaatatta taaagtccaa caaaagatgg agcacatgca 900

tgaaagatta cgtacacgaa tgcagttgat acagtggatg ttaggcataa gaagcactat 960

aaatagaggg tgcaatcccc attgccctac acaactacac aagtcgacta tcattacaag 1020

gaaatttaag cgaccacgaa ggtatgaaag catagcagta ctctgcattt tttttttttg 1080

atgttgttct agctagctct gcttaaggtt ttcctttctt tcgttctttg tttttttttt 1140

gtaagctcaa ctagttgcat gcaatttaga ttttatcctt ttacagttgg aaaaacatcc 1200

ctataaatat taccatgaat gcatagagat tcgaggaagc tacaaattgg acgactgatt 1260

ccaaaaaaaa aaaaaaaatc agatggtcac atcattgcta ttgttttgtg aaagtacaaa 1320

agcactcgtt cggattcaaa ttacttgtgc aaattaatta aaaaccatag aaatgatcat 1380

gttaccccta cacatttcgg aaacaatacc atatatgtta gtgtgcgatc attcaaattg 1440

atttatatct gaacaaaact gagtgggaat acggtgagca aacttgacga ttccaaaata 1500

atttatattt aggcaaaatt ttacaacttc aaagttcaaa caagctaacc tgaaaaatca 1560

tgtttgaatt tactaagatg tgcttttgta tttactaaac agagtatg 1608

<210>6

<211>927

<212>DNA

<213>水稻

<220>

<221>CDS

<222>(69)..(782)

<400>6

CACACTCGAG CAGAGCAAAT ACAGTTCAGG AATCAGGAGC AAGCAGAAAC ACACACACAA 60

ATCCGAAG ATG TGC GGG ATC AAG CAG GAG ATG AGC GGC GAG TCG TCG GGG 110

Met Cys Gly Ile Lys Gln Glu Met Ser Gly Glu Ser Ser Gly

1 5 10

TCG CCG TGC AGC TCG GCG TCG GCG GAG CGG CAG CAC CAG ACG GTG TGG 158

Ser Pro Cys Ser Ser Ala Ser Ala Glu Arg Gln His Gln Thr Val Trp

15 20 25 30

ACG GCG CCG CCG AAG AGG CCG GCG GGG CGG ACC AAG TTC AGG GAG ACG 206

Thr Ala Pro Pro Lys Arg Pro Ala Gly Arg Thr Lys Phe Arg Glu Thr

35 40 45

AGG CAC CCG GTG TTC CGC GGC GTG CGG CGG AGG GGC AAT GCC GGG AGG 254

Arg His Pro Val Phe Arg Gly Val Arg Arg Arg Gly Asn Ala Gly Arg

50 55 60

TGG GTG TGC GAG GTG CGG GTG CCC GGG CGG CGC GGC TGC AGG CTC TGG 302

Trp Val Cys Glu Val Arg Val Pro Gly Arg Arg Gly Cys Arg Leu Trp

65 70 75

CTC GGC ACG TTC GAC ACC GCC GAG GGC GCG GCG CGC GCG CAC GAC GCC 350

Leu Gly Thr Phe Asp Thr Ala Glu Gly Ala Ala Arg Ala His Asp Ala

80 85 90

GCC ATG CTC GCC ATC AAC GCC GGC GGC GGC GGC GGC GGG GGA GCA TGC 398

Ala Met Leu Ala Ile Asn Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Cys

95 100 105 110

TGC CTC AAC TTC GCC GAC TCC GCG TGG CTC CTC GCC GTG CCG CGC TCC 446

Cys Leu Asn Phe Ala Asp Ser Ala Trp Leu Leu Ala Val Pro Arg Ser

115 120 125

TAC CGC ACC CTT CGC CGA CGT CCG CCA CGC CGT GCC GAG GCC GTC GAG 494

Tyr Arg Thr Leu Arg Arg Arg Pro Pro Arg Arg Ala Glu Ala Val Glu

130 135 140

GAC TTC TTC CGG CGC CGC CTC GCC GAC GAC GCG CTG TCC GCC ACG TCG 542

Asp Phe Phe Arg Arg Arg Leu Ala Asp Asp Ala Leu Ser Ala Thr Ser

145 150 155

TCG TCC TCG ACG ACG CCG TCC ACC CCA CGC ACC GAC GAC GAC GAG GAG 590

Ser Ser Ser Thr Thr Pro Ser Thr Pro Arg Thr Asp Asp Asp Glu Glu

160 165 170

TCC GCC GCC ACC GAC GGC GAC GAG TCC TCC TCC CCG GCC AGC GAC CTG 638

Ser Ala Ala Thr Asp Gly Asp Glu Ser Ser Ser Pro Ala Ser Asp Leu

175 180 185 190

GCG TTC GAA CTG GAC GTC CTG AGT GAC ATG GGC TGG GAC CTG TAC TAC 686

Ala Phe Glu Leu Asp Val Leu Ser Asp Met Gly Trp Asp Leu Tyr Tyr

195 200 205

GCG AGC TTG GCG CAG GGG ATG CTC ATG GAG CCA CCA TCG GCG GCG CTC 734

Ala Ser Leu Ala Gln Gly Met Leu Met Glu Pro Pro Ser Ala Ala Leu

210 215 220

GGC GAC GAC GGT GAC GCC ATC CTC GCC GAC GTC CCA CTC TGG AGC TAC 782

Gly Asp Asp Gly Asp Ala Ile Leu Ala Asp Val Pro Leu Trp Ser Tyr

225 230 235

TAGAGCTCAA TCAACTGTAC AATTTTGCCT CTTTTTTCTC TCTTTTCTGG CTTCCGATGC 842

CAAAATTTTG GTACTGTACG GACACTACTT TCGGTAATGT GATGGAACAA GTTGCAAAAC 902

AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAA 927

<210>7

<211>1437

<212>DNA

<213>拟南芥

<220>

<221>CDS

<222>(167)..(1171)

<400>7

gctgtctgat aaaaagaaga ggaaaactcg aaaaagctac acacaagaag aagaagaaaa 60

gatacgagca agaagactaa acacgaaagc gatttatcaa ctcgaaggaa gagactttga 120

ttttcaaatt tcgtccccta tagattgtgt tgtttctggg aaggag atg gca gtt 175

Met Ala Val

1

tat gat cag agt gga gat aga aac aga aca caa att gat aca tcg agg 223

Tyr Asp Gln Ser Gly Asp Arg Asn Arg Thr Gln Ile Asp Thr Ser Arg

5 10 15

aaa agg aaa tct aga agt aga ggt gac ggt act act gtg gct gag aga 271

Lys Arg Lys Ser Arg Ser Arg Gly Asp Gly Thr Thr Val Ala Glu Arg

20 25 30 35

tta aag aga tgg aaa gag tat aac gag acc gta gaa gaa gtt tct acc 319

Leu Lys Arg Trp Lys Glu Tyr Asn Glu Thr Val Glu Glu Val Ser Thr

40 45 50

aag aag agg aaa gta cct gcg aaa ggg tcg aag aag ggt tgt atg aaa 367

Lys Lys Arg Lys Val Pro Ala Lys Gly Ser Lys Lys Gly Cys Met Lys

55 60 65

ggt aaa gga gga cca gag aat agc cga tgt agt ttc aga gga gtt agg 415

Gly Lys Gly Gly Pro Glu Asn Ser Arg Cys Ser Phe Arg Gly Val Arg

70 75 80

caa agg att tgg ggt aaa tgg gtt gct gag atc aga gag cct aat cga 463

Gln Arg Ile Trp Gly Lys Trp Val Ala Glu Ile Arg Glu Pro Asn Arg

85 90 95

ggt agc agg ctt tgg ctt ggt act ttc cct act gct caa gaa gct gct 511

Gly Ser Arg Leu Trp Leu Gly Thr Phe Pro Thr Ala Gln Glu Ala Ala

100 105 110 115

tct gct tat gat gag gct gct aaa gct atg tat ggt cct ttg gct cgt 559

Ser Ala Tyr Asp Glu Ala Ala Lys Ala Met Tyr Gly Pro Leu Ala Arg

120 125 130

ctt aat ttc cct cgg tct gat gcg tct gag gtt acg agt acc tca agt 607

Leu Asn Phe Pro Arg Ser Asp Ala Ser Glu Val Thr Ser Thr Ser Ser

135 140 145

cag tct gag gtg tgt act gtt gag act cct ggt tgt gtt cat gtg aaa 655

Gln Ser Glu Val Cys Thr Val Glu Thr Pro Gly Cys Val His Val Lys

150 155 160

aca gag gat cca gat tgt gaa tct aaa ccc ttc tcc ggt gga gtg gag 703

Thr Glu Asp Pro Asp Cys Glu Ser Lys Pro Phe Ser Gly Gly Val Glu

165 170 175

ccg atg tat tgt ctg gag aat ggt gcg gaa gag atg aag aga ggt gtt 751

Pro Met Tyr Cys Leu Glu Asn Gly Ala Glu Glu Met Lys Arg Gly Val

180 185 190 195

aaa gcg gat aag cat tgg ctg agc gag ttt gaa cat aac tat tgg agt 799

Lys Ala Asp Lys His Trp Leu Ser Glu Phe Glu His Asn Tyr Trp Ser

200 205 210

gat att ctg aaa gag aaa gag aaa cag aag gag caa ggg att gta gaa 847

Asp Ile Leu Lys Glu Lys Glu Lys Gln Lys Glu Gln Gly Ile Val Glu

215 220 225

acc tgt cag caa caa cag cag gat tcg cta tct gtt gca gac tat ggt 895

Thr Cys Gln Gln Gln Gln Gln Asp Ser Leu Ser Val Ala Asp Tyr Gly

230 235 240

tgg ccc aat gat gtg gat cag agt cac ttg gat tct tca gac atg ttt 943

Trp Pro Asn Asp Val Asp Gln Ser His Leu Asp Ser Ser Asp Met Phe

245 250 255

gat gtc gat gag ctt cta cgt gac cta aat ggc gac gat gtg ttt gca 991

Asp Val Asp Glu Leu Leu Arg Asp Leu Asn Gly Asp Asp Val Phe Ala

260 265 270 275

ggc tta aat cag gac cgg tac ccg ggg aac agt gtt gcc aac ggt tca 1039

Gly Leu Asn Gln Asp Arg Tyr Pro Gly Asn Ser Val Ala Asn Gly Ser

280 285 290

tac agg ccc gag agt caa caa agt ggt ttt gat ccg cta caa agc ctc 1087

Tyr Arg Pro Glu Ser Gln Gln Ser Gly Phe Asp Pro Leu Gln Ser Leu

295 300 305

aac tac gga ata cct ccg ttt cag ctc gag gga aag gat ggt aat gga 1135

Asn Tyr Gly Ile Pro Pro Phe Gln Leu Glu Gly Lys Asp Gly Asn Gly

310 315 320

ttc ttc gac gac ttg agt tac ttg gat ctg gag aac taaacaaaac 1181

Phe Phe Asp Asp Leu Ser Tyr Leu Asp Leu Glu Asn

325 330 335

aatatgaagc tttttggatt tgatatttgc cttaatccca caacgactgt tgattctcta 1241

tccgagtttt agtgatatag agaactacag aacacgtttt ttcttgttat aaaggtgaac 1301

tgtatatatc gaaacagtga tatgacaata gagaagacaa ctatagtttg ttagtctgct 1361

tctcttaagt tgttctttag atatgtttta tgttttgtaa caacaggaat gaataataca 1421

cacttgtaaa aaaaaa

<210>8

<211>353

<212>DNA

<213>水稻

<400>8

gctagcagag tagcaatcca ttccgatcca tcaaatttct cttgagaccg tagagagaga 60

gagaggcgcc aaccatggcc ggcatcatcc acaagatcga ggagaagctc cacatgggcg 120

gaggcgagca caagaaggaa gacgagcaca agaaggaggg ggagcaccac aagaaggacg 180

gggagcacaa ggaaggcgtg gtggagaaga tcaaggacaa gatcaccggc gaccacggcg 240

acggcggcga gcacaaggag aagaaggaca agaagaagaa gaaggagaag aagcacggcg 300

aggagggcca ccaccacgac ggccacagca gcagcagcag cgacagcgac tgg 353

<210>9

<211>545

<212>DNA

<213>水稻

<400>9

cgactatcat tacaaggaaa tttaagcgac cacgaagagt atgacgctgg tgaagattgg 60

tccgtggggc ggaaatggag ggtcagctca ggacatcagt gtgccaccca agaagctgtt 120

aggcgtgaca atctacagct cagatgcaat cagatccatt gccttcaact acatcggtgt 180

ggatggacag gaatatgcca ttggtccatg gggtgggggc gaaggcacct ctacagagat 240

taaactgggc tcctctgagc agatcaagga gatttctgga acccatggcc cagtctatga 300

tctggctgac attgtcacct atcttaagat tgtgacaagt gctaataata catacgaggc 360

tggagtccca aatggaaagg aattcagcat tccactgcaa gactctggcc atgtcgttgg 420

attctttgga aggtctggaa cgcttatcga cgcaattggc atctacgtcc acccttgatt 480

cccagtggtc aaagaattac tacctactac catatctacg aaataatgtt ccatggtgtt 540

gttgt 545

<210>10

<211>1357

<212>DNA

<213>水稻

<400>10

agccgtggaa gtccaacctg caggctcagg ctgcagatcg cccaaggcgc acttgcctcc 60

acgatggctt gtcctcaacc gctcggaagg cgagatccaa ttggcaattt gttcaacgca 120

gggagagagg aggagactgg aacgggatca ttggacattg gttgatgaat tgcaatttgg 180

atgacgaggc cgcgagggtc agaccgtcgg agagtgagat gatggttata caagtgtact 240

agtaggacgg acggtggcac cggccagaag cagcagattt tgtgcaaacg ttgagcccgc 300

aacacgtggc cggcatcgac ccgctacacg gacgcagcgc cccccccccc cccccccccg 360

cggacccacg cgggccggcc gcgctgtcgc cgtgctgccg actacgccgt cgaaatcaac 420

gcgtccgcct cgatcctccc ctgccgacgc tgtacaagtg gcgaccagaa aacaccatgt 480

agtatttgat ctcgtctaag agcaagttta atactatagt ccactattag ctccaattta 540

tttataactg atctaatagc caattcacac aataattgct tactatacta ttaatatatg 600

gtctcacatg tcatacacat attccgtctt ggagttcgtg ctgcagctgg ctacagatct 660

gtagcccgct gctcttctct ctcagagcga gtataatagt acaaactgga ctggcgatag 720

gagaaacacg tcagctacag tgttgagctg gatgagtgag aagaggagag agagtgagag 780

tgggcgacaa ttttatcgcc ggctctagca ccagcttcga gagaaaagtg gtgagcgcag 840

aggttgtgag ctgcatgtgt gagacgaagc ttaagttatt ttattatgat gtgaagttga 900

tgggtccagc gttgcaggtc atttattgta ttcacaagat gcaaagagag ctactagctg 960

agttggatgg aattaacgcc ggctgtctac gctactatta accttgctct catcttttat 1020

ctcatcaaaa tatatttata gctggctaat agtctgctat cgtacctgct ctaatgcata 1080

cgttttttct ctctgtggca aaacggttgg tgcgttacac ggggtgcacg aagccatgca 1140

tcaccctgct caacccgtct ccttttttag cctaatcttt tcctccttat ccgatgggcc 1200

ttccgtttct caagacaccc ccacaccgcc ccggccctct ataaatacca accacgacga 1260

gccaagcgaa catcaccaca gctagatcat tagcaatcca ttccgatcca tcaaatttct 1320

cttgagaccg tagagagaga gagaggcgcc aaccatg 1357

<210>11

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>11

ccattggatc cagccgtgga agtccaac 28

<210>12

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>12

gccggggatc cttggcgcct ctctctct 28

Claims

1、一种水稻来源的启动子，由下列DNA(a)或(b)组成：

(a)由如SEQ ID NO：1或10所示的核苷酸序列组成的DNA；或

(b)在严谨条件下，与能与由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列组成的DNA互补的核苷酸序列组成的DNA杂交并表达胁迫-诱导的启动子活性的DNA。

2、根据权利要求1的启动子，其中所述胁迫是脱水胁迫、低温胁迫或盐胁迫。

3、一种包含根据权利要求1或2的启动子的重组载体。

4、根据权利要求3的载体，其中含有用于增强胁迫耐受性的结构基因和/或调节基因，以致在根据权利要求1或2的启动子控制下其具有功能性。

5、根据权利要求4的载体，其中所述用于增强胁迫耐受性的结构基因和/或调节基因选自：一种脯氨酸合成的关键酶P5CS基因，用于肌醇半乳糖苷合成的AtGolS3基因，拟南芥来源的转录因子DREB基因，水稻来源的转录因子OsDREB基因和，一种参与ABA合成的酶NCED基因。

6、根据权利要求5的载体，其中所述用于增强胁迫耐受性的结构基因和/或调节基因是水稻来源的OsDREB转录因子基因。

7、一种转基因植物，其通过将根据权利要求3至6任一的载体导入宿主中而获得。

8、根据权利要求7的转基因植物，其中所述宿主是一种植物。

9、根据权利要求8的转基因植物，其中所述宿主是一种单子叶植物。

10、一种通过将权利要求1或2的启动子导入植物中以增强植物胁迫耐受性的方法。