CN1289524C - 一种人端粒酶活性抑制蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种新的端粒酶活性抑制蛋白-MCRS2蛋白，编码MCRS2蛋白的多核苷酸和经重组技术产生这种MCRS2蛋白的方法。本发明还公开了MCRS2蛋白及其编码序列的用途。MCRS2蛋白具有使肝癌细胞SMMC-7721的染色体端粒变短、抑制端粒酶活性的功能。

Description

一种人端粒酶活性抑制蛋白及其应用

技术领域

本发明属于生物技术和医学领域，具体地说，本发明涉及新的人端粒酶活性抑制蛋白MCRS2(microspherule protein 2)及其编码序列。本发明还涉及MCRS2多核苷酸和多肽的用途和制备。

背景技术

已有的研究表明80％的肿瘤细胞具有端粒酶活性，抑制端粒酶活性可以使肿瘤细胞衰老并走向死亡。

LPTS是一种已知的人端粒酶抑制蛋白。LPTS基因定位于人第8号染色体8p23区段，该区段在多种恶性肿瘤细胞中高频缺失。研究表明LPTS在肝癌组织及肝癌细胞系中表达量极低或检测不到，因此LPTS与肝癌相关[C.Liao，M.J.Zhao，H.Song，K.Uchida，K.K.Yokoyama，T.P.Li，Identification of the gene for a novelliver-related putative tumor suppressor at a high-frequency loss of heterozygosityregion of chromosome 8p23 in human hepatocellular carcinoma.Hepatology 32(2000)721-727]。

进一步的研究表明LPTS基因可抑制肿瘤细胞的生长，并可以抑制端粒酶活力。在肿瘤细胞中表达LPTS，引起细胞端粒变短，进而导致细胞衰老，凋亡[C.Liao，M.J.Zhao，J.Zhao，D.Jia，H.Song，Z.P.Li，Over-expression of LPTS-L inhepatocellular carcinoma cell line SMMC-7721 induces crisis.World J Gastroenterol.8(2002)1050-1052.；X.Z.Zhou，K.P.Lu，The Pin2/TRF1-interacting protein PinX1 is apotent telomerase inhibitor.Cell 107(2001)347-359.]。因此，LPTS是一个非常重要的端粒酶抑制蛋白，寻找与LPTS相互结合的蛋白有利于了解LPTS作用机理，发现新的作用于端粒酶活性抑制途径的蛋白，并可协同LPTS在肿瘤治疗中发挥作用。然而，迄今为止本领域已发现的与端粒酶抑制蛋白相关的蛋白极为有限，更没有发现与LPTS相互作用且具有端粒酶抑制活性的蛋白。

因此，本领域迫切需要开发新的端粒酶活性抑制蛋白。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的端粒酶活性抑制蛋白MCRS2以及其片段、类似物和衍生物。

本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。

本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途。

在本发明的第一方面，提供新颖的分离出的MCRS2多肽，它包括：具有SEQ IDNO：2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。

较佳地，该多肽选自下组：

(a)具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑制端粒酶活性的功能的由(a)衍生的多肽。

更佳地，该多肽是具有SEQ ID NO：2中1-475位或1-162位氨基酸序列的多肽。

在本发明的第二方面，提供编码分离的这些多肽的多核苷酸，该多核苷酸含有一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少70％相同性：(a)编码上述人MCRS2多肽的多核苷酸；和(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO：2中1-475位或1-162位所示氨基酸序列的多肽。更佳地，该多核苷酸的序列是选自下组的一种：(a)具有SEQ ID NO：1中173-1597位的序列；(b)具有SEQ ID NO：1中1-1953位的序列；或(c)具有SEQ ID NO：1中173-658位的序列。

在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。

在本发明的第四方面，提供了制备具有人MCRS2蛋白活性的多肽的方法，该方法含有：(a)在适合表达人MCRS2蛋白的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有人MCRS2蛋白活性的多肽。

在本发明的第五方面，提供了与上述的人MCRS2多肽特异性结合的抗体。

在本发明的第六方面，提供了模拟、促进、拮抗人MCRS2多肽活性的化合物，以及抑制人MCRS2多肽的表达的化合物。还提供了筛选和/或制备这些化合物的方法。较佳地，该化合物是人MCRS2多肽的编码序列或其片段的反义序列。

在本发明的第七方面，提供了检测样品中是否存在MCRS2蛋白的方法，它包括：将样品与MCRS2蛋白的特异性抗体接触，观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在MCRS2蛋白。

在本发明的第八方面，提供了一种检测与人MCRS2多肽异常表达相关的疾病或疾病易感性的方法，该方法包括：检测编码所述多肽的核酸序列中是否存在突变。

在本发明的第九方面，提供了本发明多肽和编码序列的用途。例如，本发明多肽可被用于制备用于治疗肿瘤的药物、用于制备抑制端粒酶活性的组合物，用于筛选促进人MCRS2多肽活性的激动剂，或者筛选抑制人MCRS2多肽活性的拮抗剂、或者被用于肽指纹图谱鉴定。本发明的人MCRS2蛋白的编码序列或其片段，可被作为引物用于PCR扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列。

在本发明的第十方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明的人MCRS2多肽或其激动剂、拮抗剂以及药学上可接受的载体。这些药物组合物可治疗与端粒酶活性过高有关的疾病，例如癌症等病症。还提供了抑制端粒酶活性的组合物。

本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1是10％SDS-PAGE电泳显示MCRS2重组表达蛋白。其中，6×His-MCRS2，GST-MCRS2-N和GST分别为大肠杆菌表达的重组蛋白，并经亲和柱层析。电泳后胶经考马斯亮蓝染色液染色。

图2显示了对抗MCRS2专一性抗体的检测。其中，293T细胞表达的FLAG-MCRS2蛋白作为阳性对照，转染空载体的293T细胞的蛋白提取液作为阴性对照。

图3显示了MCRS2蛋白与LPTS蛋白的相互结合。A.MCRS2与LPTS免疫共沉淀实验。293T细胞瞬时转染FLAG-MCRS2表达质粒，细胞裂解液用LPTS抗体免疫沉淀，用FLAG抗体检测免疫沉淀复合物，其中，“input”表示阳性对照，即显示LPTS免疫共沉淀前细胞裂解液中的FLAG-MCRS2蛋白。B，C.GST-pulldown检测MCRS2与LPTS在体外的结合。D.考马斯亮蓝染色GST，GST-LPTS蛋白。E.免疫共沉淀及GST pulldown检测MCRS2与hTERT的体内结合。

图4显示了转染MCSR2或MCRS2-N使SMMC-7721细胞的端粒变短。其中，A，稳定表达MCRS2的细胞.B.稳定表达MCRS2-N的细胞。

图5显示了MCRS2或者MCRS2的N端在体外抑制端粒酶的活性。其中，TRAP方法分析显示6His-MCRS2及GST-MCRS2-N具有体外抑制端粒酶的活性。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，利用酵母双杂交筛选方法首次获得的与人端粒酶抑制蛋白LPTS结合的蛋白MCRS2。MCRS2与LPTS在体内与体外都有结合活性，并表达定位在细胞核仁和端粒上。MCRS2可以使肝癌细胞SMMC-7721的染色体端粒变短，并且体外实验证明了MCRS2蛋白具有端粒酶抑制活性。在此基础上完成了本发明。

在本发明中，术语“MCRS2蛋白”、“MCRS2多肽”或“端粒酶活性抑制蛋白MCRS2”可互换使用，都指具有人端粒酶活性抑制蛋白MCRS2氨基酸序列(SEQ IDNO：2)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的端粒酶活性抑制蛋白MCRS2。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的MCRS2蛋白或多肽”是指MCRS2多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化MCRS2蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。MCRS2多肽的纯度能用氨基酸序列分析。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括人MCRS2蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然人MCRS2蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“人MCRS2多肽”指具有人MCRS2蛋白活性的SEQ ID NO：2序列的多肽。该术语还包括具有与人MCRS2蛋白相同功能的、SEQ ID NO：2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能，尤其是添加6His或GST等便于分离纯化的元件而形成的融合蛋白。该术语还包括人MCRS2蛋白的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与人MCRS2 DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗人MCRS2多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如含有人MCRS2多肽或其片段的融合蛋白。

除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了人MCRS2多肽的可溶性片段。通常，该片段具有人MCRS2多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。尤其是含有MCRS2的N端至少162个氨基酸的活性片段。

发明还提供人MCRS2蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人MCRS2多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“人MCRS2蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

                      表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQID NO：2的蛋白质，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO：2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO：2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码MCRS2蛋白的多聚核苷酸。

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明的人MCRS2核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；230：1350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及含有本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或MCRS2蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的MCRS2多肽。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码人MCRS2多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，人MCRS2多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的基于T7的表达载体(Rosenberg，et al.Gene，1987，56：125)；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee and Nathans，J Bio Chem.263：3521，1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含人MCRS2编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体P_L启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地含有一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

含有上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使MgCl₂用。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

重组的人MCRS2蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)：直接做为药物治疗MCRS2蛋白功能低下或丧失所致的疾病，和用于筛选促进或对抗MCRS2蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组人MCRS2蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激人MCRS2蛋白功能的多肽分子。此外，MCRS2可用于抑制端粒酶的活性，进而用于治疗各种与端粒酶活性过高有关的疾病，如各种肿瘤。

另一方面，本发明还包括对人MCRS2 DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人MCRS2基因产物或片段。较佳地，指那些能与人MCRS2基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人MCRS2蛋白的分子，也包括那些并不影响人MCRS2蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人MCRS2基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人MCRS2基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人MCRS2蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人， Nature 256；495，1975；Kohler等人， Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人， Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人， In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断人MCRS2蛋白功能的抗体以及不影响人MCRS2蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人MCRS2基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人MCRS2基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

抗人MCRS2蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的人MCRS2蛋白。

本发明中的抗体可用于治疗或预防与人MCRS2蛋白相关的疾病。给予适当剂量的抗体可以刺激或阻断人MCRS2蛋白的产生或活性。

抗体也可用于设计成针对体内某一特殊部位的免疫毒素。如人MCRS2蛋白高亲和性的单克隆抗体可与细菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，红豆碱等)共价结合。一种通常的方法是用巯基交联剂如SPDP，攻击抗体的氨基，通过二硫键的交换，将毒素结合于抗体上。

多克隆抗体的生产可用人MCRS2蛋白或多肽免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。

利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与MCRS2蛋白发生相互作用的物质，如受体、抑制剂、激动剂或拮抗剂等。

本发明蛋白及其抗体、抑制剂、激动剂、拮抗剂或受体等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。

本发明的多肽可直接用于疾病治疗，例如，用于与端粒酶活性过高有关的疾病，例如癌症方面的治疗。在使用本发明MCRS2蛋白时，还可同时使用其他肿瘤治疗剂，如顺铂、TNF等。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明MCRS2多肽以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的MCRS2蛋白施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

人MCRS2蛋白的多聚核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于MCRS2蛋白的无表达或异常/无活性的MCRS2蛋白的表达所致的细胞增殖、发育或代谢异常。重组的基因治疗载体(如病毒载体)可设计成表达变异的MCRS2蛋白，以抑制内源性的MCRS2蛋白活性。来源于病毒的表达载体如逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒、细小病毒等可用于将MCRS2基因转移至细胞内。构建携带MCRS2基因的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook，et al.)。另外重组人MCRS2基因可包装到脂质体中，然后再转移至细胞内。

抑制人MCRS2 mRNA的寡聚核苷酸(包括反义RNA和DNA)以及核酶也在本发明的范围之内。核酶是一种能特异性分解特定RNA的酶样RNA分子，其作用机制是核酶分子与互补的靶RNA特异性杂交后进行核酸内切作用。反义的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技术获得，如固相磷酸酰胺化学合成法合成寡核苷酸的技术已广泛应用。反义RNA分子可通过编码该RNA的DNA序列在体外或体内转录获得。这种DNA序列已整合到载体的RNA聚合酶启动子的下游。为了增加核酸分子的稳定性，可用多种方法对其进行修饰，如增加两侧的序列长度，核糖核苷之间的连接应用磷酸硫酯键或肽键而非磷酸二酯键。

多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法包括：将多聚核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。

能与人MCRS2蛋白结合的多肽分子可通过筛选由各种可能组合的氨基酸结合于固相物组成的随机多肽库而获得。筛选时，必须对人MCRS2蛋白分子进行标记。

本发明还涉及定量和定位检测人MCRS2蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的人MCRS2蛋白水平，可以用作解释人MCRS2蛋白在各种疾病中的重要性和用于诊断MCRS2蛋白起作用的疾病。

一种检测检测样品中是否存在MCRS2蛋白的方法是利用MCRS2蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与MCRS2蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在MCRS2蛋白。

MCRS2蛋白的多聚核苷酸可用于MCRS2蛋白相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面，MCRS2蛋白的多聚核苷酸可用于检测MCRS2蛋白的表达与否或在疾病状态下MCRS2蛋白的异常表达。如MCRS2 DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断MCRS2蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用MCRS2蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测MCRS2蛋白的转录产物。

检测MCRS2基因的突变也可用于诊断MCRS2蛋白相关的疾病。MCRS2蛋白突变的形式包括与正常野生型MCRS2 DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。

本发明的序列对染色体鉴定也是有价值的。简而言之，根据本发明MCRS2蛋白的cDNA制备PCR引物(优选15-35bp)，可以将序列定位于染色体上。然后，将这些引物用于PCR筛选含各条人染色体的体细胞杂合细胞。只有那些含有相应于引物的人基因的杂合细胞会产生扩增的片段。

一旦序列被定位到准确的染色体位置，此序列在染色体上的物理位置就可以与基因图数据相关联。这些数据可见于例如，V.Mckusick，Mendelian Inheritancein Man(可通过与Johns Hopkins University Welch Medical Library联机获得)。然后可通过连锁分析，确定基因与业已定位到染色体区域上的疾病之间的关系。

在本发明的一个实例中，提供了一种分离的多核苷酸，它编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。本发明的多核苷酸是从人肝cDNA文库中分离出的。其序列如SEQ ID NO：1所示，它含有的多核苷酸序列全长为1757个碱基，其开放读框位于173-1597位，编码全长为475个氨基酸的人MCRS2蛋白(SEQ ID NO：2)。鉴于80％的肿瘤细胞具有端粒酶活性，而抑制端粒酶活性可以使肿瘤细胞衰老并走向死亡，因此MCRS2蛋白可为治疗与端粒酶活性过高有关的疾病，例如癌症等疾病提供新的治疗途径，因而具有巨大的应用前景。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：MCRS2蛋白cDNA的克隆

应用常规的酵母双杂交技术筛选LPTS的相互作用蛋白，将编码LPTS的cDNA插入pGilda载体(购自Clontech公司)，用于筛选人脑cDNA文库(Clontech)，方法根据公司提供的操作规程。将筛选到的阳性克隆验证后测序，并将该序列与GenBank数据库比较。

根据序列信息，设计引物，进行多聚酶链式反应(PCR)，PCR反应引物为：P1(SEQ ID NO：3)，P2(SEQ ID NO：4)，以肝脏的cDNA文库质粒(GIBCO BRL公司产品)为模板，PCR扩增获得MCRS2基因cDNA。PCR反应条件为25μl体积，94℃4分钟预变性，循环反应为94℃30秒，50℃30秒，72℃2分钟，共进行35个循环。PCR产物用低熔点琼脂糖凝胶回收纯化。

经全序列测序(由博亚公司测定)，获得的cDNA全长为1953bp(SEQ ID NO：1)，包含了一个完整的蛋白编码区(第173-1597位)，编码了一个由475个氨基酸组成的蛋白质(SEQ ID NO：2)。

实施例2、MCRS2蛋白的重组表达和纯化

(a)MCRS2蛋白的重组表达

将实施例1中获得的MCRS2核苷酸序列，经EcoRI和XhoI酶切后装入相同酶切的6×His-融合表达载体pET-30((Novagen公司)，获得表达载体6×His-MCRS2。

含有MCRS2N端162个氨基酸的cDNA片段(对应于SEQ ID NO：1中173-658位)通过EcoRI和XhoI酶切位点装入GST-融合表达载体pGEX-4T1(Amersham公司)中，获得的质粒命名为GST-MCRS2-N。

然后将构建好的质粒转化大肠杆菌BL21-DE3，获得MCRS2/BL21-DE3，MCRS2-N/BL21-DE3转化菌株。对于获得的阳性转化菌株经扩增后，抽取质粒并以相应的限制性内切酶鉴定，并通过DNA测序确证。

经鉴定的MCRS2/BL21-DE3，MCRS2-N/BL21-DE3转化菌株，按照1∶20比例接种于LB培养基(每升培养基含有10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g NaCl)中，37℃培养3小时左右至OD600为0.6-0.8时，加入IPTG至终浓度0.5mM，诱导表达3～4小时，然后6000rpm，10分钟离心收集菌体，用于以下的蛋白质分离纯化。

(b)分离纯化：

6×His-MCRS2蛋白：离心收集菌体，重悬于30ml NTA-0(20mmol/L Tris-HCLpH7.9，0.5mmol/L NaCL，10％甘油)中，加入苯甲基磺酰氟(PMSF)至0.5mmol/L，超声破碎菌体后，加入Triton X-100至1％终浓度，4℃，13000rpm/min离心，20min，收集上清，转移到事先用20mlNTA-0平衡的3S NTA树脂亲和层析柱上，然后用30ml NTA-0洗层析柱，接着依次用5mlNTA-20(20mmol/L Tris-HCl pH7.9，0.5mmol/L NaCL，10％甘油，20mmol/L咪唑)，NTA-40，NTA-80，NTA-100，NTA-200洗脱，收集洗脱液，每管1ml。SDS-PAGE分析蛋白分布，Bradford法测定蛋白浓度。

GST-MCRS2-N融合蛋白：

离心收集菌体，用10mL溶液A(20mM Tris/pH 7.4，0.2mM EDTA，1mM DTT，0.5mMPMSF，1M NaCl)重悬菌体，超声波破细胞，每次15秒，间隔45秒，共超生波10次，加入TritonX-100至1％终浓度，冰上放置30分钟，9,500rpm，4℃离心10分钟，重复离心一次。用20～30mL溶液A平衡谷胱甘肽-琼脂糖装柱，将菌体离心上清上柱，20～30mL溶液A洗柱子，然后用20～30mL溶液B(20mMTris/pH 7.4，0.2mM EDTA，0.1M NaCl)洗柱子，用5mL含15mM终浓度的还原型谷胱苷肽的溶液C(15mM还原型谷胱苷肽于溶液B中)洗脱蛋白。

制备的纯化蛋白，经10％SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色液染色，结果如图1所示。

实施例3、抗MCRS2蛋白抗体的制备

取300μg纯化的6×His-MCRS2融合蛋白，溶解于0.5mL PBS中，加入等体积的弗氏完全佐剂，充分混匀，皮内多点注射于2.0kg雄性新西兰大白兔背部。第三天，再次以同样蛋白量用弗氏完全佐剂充分混匀后，皮内多点注射于背部。第28天，以同样蛋白量用弗氏不完全佐剂混匀后，背部皮内注射以加强免疫。在此一周后，颈动脉放血收集血液，37℃放置3小时，4℃放置过夜以使血清完全析出，离心收集血清，分装，-70℃保存。抗体的特异性检测方法如下：将1.5μgFLAG-MCRS2质粒用10μl Lipofectamine(GIBCOL BRL公司产品)混合后转染在60mm的细胞培养皿中培养的293T细胞。转染方法见GIBCOL BRL公司提供的实验操作规程。48小时后收集细胞，用300μl Triton X-100裂解液(10mM Tris(pH7.4)，150mM NaCl，10mM EDTA，10mM EGTA，1％Triton X-100，1mM PMSF，10mM DTT，5μg/ml aprotinin)裂解。取出50μl裂解物加入等量2×SDS上样缓冲液，沸水煮沸10分钟，细针头剪切DNA，离心去沉淀。取10μl上样于15％SDS聚丙烯酰胺(PAGE)凝胶，进行蛋白电泳。电泳结束后，将蛋白转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(NEN公司产品)。用MCRS2抗体进行免疫印迹，再用辣根过氧化物酶(HRP)交联的二抗(Santa Cruz公司产品)进行杂交。最后用化学发光试剂检测，压X光片1分钟。

结果如图2所示，在转染了FLAG-MCRS2的细胞中，检测到一条专一性的蛋白条带，而在转染了空载体的细胞中，没有检测到蛋白带，这说明得到了专一识别MCRS2的多克隆抗体。

实施例4、MCRS2与LPTS的相互作用的实验验证

将各种质粒的分别转染293T细胞，转染方法如实施例3所述，培养48小时后收集细胞。细胞用裂解缓冲液[20mM Tris-HCl，pH 7.5，150mM NaCl，1mMEDTA，0.5％Nonidet-P40，1mM苯甲基磺酰氯(phenylmethyl sulfonyl fluoride，PMSF)，1mM抑蛋白酶肽(aprotinin)和1mM亮抑蛋白酶肽(leupeptin)]在4℃裂解0.5h.，离心收集裂解液上清备用。

体外合成³⁵S-MCRS2蛋白使用兔网织红细胞裂解液系统TNT试剂盒(Promega公司)。

蛋白质相互结合实验是在上述细胞裂解液或³⁵S-Met标记的蛋白中加入相应的重组蛋白或抗体，4℃放置2h，接下来加入15μl蛋白A珠或者谷胱甘肽-琼脂糖珠(Amersham)，4℃放置2h。珠用裂解缓冲液洗涤3-4次，重悬于30μl蛋白上样缓冲液中(50mM Tris-HCl，pH 6.8，100mM DTT，2％SDS，20％甘油，0.2mg/ml溴酚兰)。10μl样品经SDS-PAGE电泳分离后，转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(NEN公司产品)，用相应的抗体检测，检测方法如实施例3所述。

(1)免疫共沉淀实验

将表达FLAG-MCRS2的质粒瞬时转染293T细胞，培养48小时后制备细胞裂解液，在细胞裂解液中加入anti-LPTS抗体，进行免疫共沉淀。在加入anti-LPTS抗体的免疫沉淀复合物中，检测到FLAG-MCRS2蛋白，加入免疫前血清作为对照的免疫沉淀复合物中没有检测到FLAG-MCRS2蛋白(图3A)，因此证明MCRS2在体内与LPTS是结合的。

(2)GST-pull down实验

该试验用于验证MCRS2与LPTS在体外的结合。方法如下：在体外合成的³⁵S-MCRS2蛋白中加入GST-LPTS重组蛋白，如图3B所示，³⁵S-MCRS2与GST-LPTS能在体外结合，与作为对照的GST蛋白不结合。因此证明MCRS2与LPTS在体外也是结合的。为了确定LPTS与MCRS2作用的区域，将GST-LPTS-N(包含LPTS蛋白N端132个氨基酸)、GST-LPTS-C(包含LPTS蛋白C端133-328氨基酸残基)，以及GST-LPTS融合蛋白加入到瞬时表达FLAG-MSCR2的细胞裂解液中，进行GST-pull down实验。结果表明LPTS的N端与C端都能与MCRS2结合(图3C)。大肠杆菌表达纯化的上述蛋白见图3D。

(3)免疫共沉淀实验

该试验用于验证MCRS2与hTRET在体外的结合。将FLAG-MCRS2和GFP-hTERT表达质粒瞬时转染到293T细胞中，用anti-FLAG抗体进行免疫共沉淀，然后用GFP抗体检测GFP-hTERT。如图3E所示，在FLAG免疫沉淀复合物中，可以检测到GFP-hTERT，这说明在体内MCRS2与端粒酶复合物是结合在一起的。

实施例5、体外细胞实验证明MCRS2可导致肿瘤细胞端粒变短。

将MCRS2基因稳定转染肝癌细胞SMMC-7721，筛选表达FLAG-MCRS2及FLAG-MCRS2-N(包含MCRS2的N端162个氨基酸残基)的稳定转染细胞株(图4A，B)。方法如下，在六孔板中，按照每孔2×10⁵细胞量接种SMMC-7721肝癌细胞于2mL完全培养基中，37℃培养过夜；制备溶液A：溶解1.5μg细胞转染级超纯DNA(FLAG-MCRS2和FLAG-MCRS2-N)于100μL无血清无抗生素的培养基中；制备溶液B：5μL LipofectAMIN(GIBCO BRL公司产品)试剂稀释于100μL无血清无抗生素的培养基中。混合溶液A、B，室温放置45分钟，形成脂质体颗粒。依次用PBS，无血清无抗生素的培养基润洗细胞。在形成脂质体颗粒的管中加入0.8mL无血清无抗生素的培养基，轻轻混匀后加到润洗过的细胞上，37℃转染5小时。在每个孔中加入含有10％新生牛血清的完全培养基。转染24小时后，换为新鲜完全培养基。然后按1∶10细胞分瓶后加入适当浓度的G418，筛选带有Neo基因抗性的细胞。获得的抗性细胞即为FLAG-MCRS2和FLAG-MCRS2-N稳定转染细胞株。然后测定细胞端粒的长度。采用TRF(terminal restrictionfragment)Southern技术分析端粒的长度。将细胞的基因组DNA抽提出来，取10μgDNA用HinfI和RsaI酶切后，经0.7％琼脂糖分离。胶在0.5M NaOH/1.5M NaCl变性30min，在0.5M Tris-HCl/3M NaCl(pH7.5)中合30min，进行Southern印迹分析。探针是³²P末端标记的单链(TTAGGG)₆DNA。

实验证明转染空载体的对照用细胞其端粒长度是一致的，没有变短。而表达FLAG-MCRS2及FLAG-MCRS2-N的稳定细胞株，随着不断的传代，它们的端粒在不断的减少(图4A和B)。说明MCRS2能在细胞体内抑制端粒的合成。

实施例6、MCRS2体外抑制端粒酶活性

用大肠杆菌表达的重组MCRS2蛋白进行体外抑制端粒酶活性测定。将6×His-MCRS2及GST-MCRS2-N加入到细胞裂解液中，4℃孵育10分钟，然后进行端粒酶活性测定。采用通常的TRAP(telomeric repeat amplification protocol)方法检测端粒酶活性。该方法是一种基于PCR技术的端粒酶活性检测方法。具体操作如下：培养细胞用PBS洗一遍，离心收集细胞；(1).用洗涤缓冲液(10mM Hepes-KOH(pH7.5)，1.5mMMgCl₂，10mM KCl，1mM DTT(二硫苏糖醇))再次洗一遍细胞；(2)用冰预冷的裂解缓冲液(10mM Tris-HCl(pH 7.5)，1mM MgCl₂，1mM EGTA，0.1mM PMSF，5mM巯基乙醇，0.5％CHAPS，10％甘油)重悬细胞，置冰上30分钟，4℃高速离心30分钟，上清细胞提取物可用来测定端粒酶活性。上清提取物可在-70℃保存，端粒酶活性可以经受多次的冻溶仍保持稳定；(3).反应管内加入：1μL Ts引物(0.1μg/μL)，1μL细胞提取物上清，0.25μL 10mM dNTP，42μL反应缓冲液(20mM Tns-HCl(pH8.3)，1.5mM MgCl₂，63mM KCl，0.005％Tween-20，1mM EGTA，0.1mg/mL BSA)。25℃延伸反应30分钟，90℃灭活3分钟；(4)加入1μL Cx primer，0.5μL(2U)Taq酶；进行PCR反应：94℃2min；94℃40sec，50℃40sec，72℃1min，30cycles；(5)PCR反应产物进行10％PAGE非变性胶电泳，缓冲液为0.5×TBE，电压100V，6～8小时；6.PAGE胶银染显色，拍照。

Ts引物：5′-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3′(SEQ ID NO：5)

Cx引物：5′-(CCCTTA)₃CCCTAA-3′(SEQ ID NO：6)

实验结果见图5。实验证明6×His-MCRS2及GST-MCRS2-N都具有端粒酶抑制活性，并呈现浓度依赖性，即端粒酶活性随MCRS2蛋白浓度的增加而下降。对照GST蛋白没有抑制活性。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

                           序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>一种人端粒酶活性抑制蛋白及其应用

<130>041783

<160>6

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1953

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(173)..(1597)

<223>

<400>1

cccctgggcc agcaccaccc atgtacctgt cggcagagcc acagttgact gacttgctgt     60

tgagctgctg ctctttagca cggctgcatt ttgatggcag agggagcagt tatgcccaga    120

gcccagcgtg tcggcatcac cagtctgacc tgagcaccat gtgctgcacg ac atg aca    178

                                                          Met Thr

                                                          1

cgt ggc acc ggg gga act gcc cag cgt gga agg tct ggg cca gat tct      226

Arg Gly Thr Gly Gly Thr Ala Gln Arg Gly Arg Ser Gly Pro Asp Ser

        5                   10                  15

cag ggg ctg cta gat tca tcc ctg atg gca tca ggc act gcc agc cgc      274

Gln Gly Leu Leu Asp Ser Ser Leu Met Ala Ser Gly Thr Ala Ser Arg

    20                  25                  30

tca gag gat gag gag tca ctg gca ggg cag aag cga gcc tcc tcc cag      322

Ser Glu Asp Glu Glu Ser Leu Ala Gly Gln Lys Arg Ala Ser Ser Gln

35                  40                  45                  50

gcc ttg ggc acc atc cct aaa cgg aga agc tcc tcc agg ttc atc aag      370

Ala Leu Gly Thr Ile Pro Lys Arg Arg Ser Ser Ser Arg Phe Ile Lys

                55                  60                  65

agg aag aag ttc gat gat gag ctg gtg gag agc agc ctg gca aaa tct      418

Arg Lys Lys Phe Asp Asp Glu Leu Val Glu Ser Ser Leu Ala Lys Ser

            70                  75                  80

tct acc cgg gca aag ggg gcc agt ggg gtg gaa cca ggg cgc tgt tcg    466

Ser Thr Arg Ala Lys Gly Ala Ser Gly Val Glu Pro Gly Arg Cys Ser

        85                  90                  95

ggg agt gaa ccc tcc tcc agt gag aag aag aag gta tcc aaa gcc ccc    514

Gly Ser Glu Pro Ser Ser Ser Glu Lys Lys Lys Val Ser Lys Ala Pro

    100                 105                 110

agc act cct gtg cca ccc agc cca gcc cca gcc cct gga ctc acc aag    562

Ser Thr Pro Val Pro Pro Ser Pro Ala Pro Ala Pro Gly Leu Thr Lys

115                 120                 125                 130

cgt gtg aag aag agt aaa cag cca ctt cag gtg acc aag gat ctg ggc    610

Arg Val Lys Lys Ser Lys Gln Pro Leu Gln Val Thr Lys Asp Leu Gly

                135                 140                 145

cgc tgg aag cct gca gat gac ctc ctg ctc ata aat gct gtg ttg cag    658

Arg Trp Lys Pro Ala Asp Asp Leu Leu Leu Ile Asn Ala Val Leu Gln

            150                 155                 160

acc aac gac ctg acc tcc gtc cac ctg ggc gtg aaa ttc agc tgc cgc    706

Thr Asn Asp Leu Thr Ser Val His Leu Gly Val Lys Phe Ser Cys Arg

        165                 170                 175

ttc acc ctt cgg gag gtc cag gag cgt tgg tac gcc ctg ctc tac gat    754

Phe Thr Leu Arg Glu Val Gln Glu Arg Trp Tyr Ala Leu Leu Tyr Asp

    180                 185                 190

cct gtc atc tcc aag ttg gcc tgt cag gcc atg agg cag ctg cac cca    802

Pro Val Ile Ser Lys Leu Ala Cys Gln Ala Met Arg Gln Leu His Pro

195                 200                 205                 210

gag gct att gca gcc atc cag agc aag gcc ctg ttt agc aag gct gag    850

Glu Ala Ile Ala Ala Ile Gln Ser Lys Ala Leu Phe Ser Lys Ala Glu

                215                 220                 225

gag cag ctg ctg agc aaa gtg gga tcg acc agc cag ccc acc ttg gag    898

Glu Gln Leu Leu Ser Lys Val Gly Ser Thr Ser Gln Pro Thr Leu Glu

            230                 235                 240

acc ttc cag gac ctg ctg cac aga cac cct gat gcc ttc tac ctg gcc    946

Thr Phe Gln Asp Leu Leu His Arg His Pro Asp Ala Phe Tyr Leu Ala

        245                 250                 255

cgt acc gcg aag gcc ctg cag gcc cac tgg cag ctc atg aag cag tat    994

Arg Thr Ala Lys Ala Leu Gln Ala His Trp Gln Leu Met Lys Gln Tyr

    260                 265                 270

tac ctg ctg gag gac cag aca gtg cag ccg ctg ccc aaa ggg gac caa    1042

Tyr Leu Leu Glu Asp Gln Thr Val Gln Pro Leu Pro Lys Gly Asp Gln

275                 280                 285                 290

gtg ctg aac ttc tct gat gca gag gac ctg att gat gac agt aag ctc    1090

Val Leu Asn Phe Ser Asp Ala Glu Asp Leu Ile Asp Asp Ser Lys Leu

                295                 300                 305

aag gac atg cga gat gag gtc ctg gaa cat gag ctg atg gtg gct gac    1138

Lys Asp Met Arg Asp Glu Val Leu Glu His Glu Leu Met Val Ala Asp

            310                 315                 320

cgg cgc cag aag cga gag att cgg cag ctg gaa cag gaa ctg cat aag    1186

Arg Arg Gln Lys Arg Glu Ile Arg Gln Leu Glu Gln Glu Leu His Lys

        325                 330                 335

tgg cag gtg cta gtg gac agc atc aca ggc atg agc tct ccg gac ttc    1234

Trp Gln Val Leu Val Asp Ser Ile Thr Gly Met Ser Ser Pro Asp Phe

    340                 345                 350

gac aac cag aca ctg gca gtg ctg cgg ggc cgc atg gtg cgg tac ctg    1282

Asp Asn Gln Thr Leu Ala Val Leu Arg Gly Arg Met Val Arg Tyr Leu

355                 360                 365                 370

atg cgc tcg cgt gag atc acc ctg ggc aga gca acc aag gat aac cag    1330

Met Arg Ser Arg Glu Ile Thr Leu Gly Arg Ala Thr Lys Asp Asn Gln

                375                 380                 385

att gat gtg gac ctg tct ctg gag ggt ccg gcc tgg aag ata tcc cgg    1378

Ile Asp Val Asp Leu Ser Leu Glu Gly Pro Ala Trp Lys Ile Ser Arg

            390                 395                 400

aaa caa ggt gtc atc aag ctg aag aac aac ggt gat ttc ttc att gcc    1426

Lys Gln Gly Val Ile Lys Leu Lys Asn Asn Gly Asp Phe Phe Ile Ala

        405                 410                 415

aat gag ggt cga cgg ccc atc tac atc gat gga cgg ccg gtg ctc tgt    1474

Asn Glu Gly Arg Arg Pro Ile Tyr Ile Asp Gly Arg Pro Val Leu Cys

    420                 425                 430

ggc tcc aaa tgg cgc ctc agc aac aac tct gtg gtg gag atc gcc agc    1522

Gly Ser Lys Trp Arg Leu Ser Asn Asn Ser Val Val Glu Ile Ala Ser

435                 440                 445                 450

ctg cga ttc gtc ttc ctt atc aac cag gac ctc att gcc ctc atc agg    1570

Leu Arg Phe Val Phe Leu Ile Asn Gln Asp Leu Ile Ala Leu Ile Arg

                455                 460                 465

gct gag gct gcc aag atc aca cca cag tgaggagtgg tggcaggact          1617

Ala Glu Ala Ala Lys Ile Thr Pro Gln

            470                 475

cgtgggccct ctccggcctg tttcccctgc cactccagcc cccttgagct gggaactcag   1677

gctcctggaa aaacctgggc agtgggaggc tcagctgcgg gccattgatt tgagcctttg   1737

agggaggata gggctggcct ttgtgaagcc agcagaggct gagaacctca ggcttcccta   1797

gatccagagc ccctccccat cttcctctct ctaaaaacaa ccctaccccc cattgccacc   1857

ttcactcctg tgtctccagc tgattagcct cagactcttc ttttattgtt tttcttttgt   1917

aaataaaaag caccaggttc aaaaaaaaaa aaaaaa                             1953

<210>2

<211>475

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>2

Met Thr Arg Gly Thr Gly Gly Thr Ala Gln Arg Gly Arg Ser Gly Pro

1               5                   10                  15

Asp Ser Gln Gly Leu Leu Asp Ser Ser Leu Met Ala Ser Gly Thr Ala

            20                  25                  30

Ser Arg Ser Glu Asp Glu Glu Ser Leu Ala Gly Gln Lys Arg Ala Ser

        35                  40                  45

Ser Gln Ala Leu Gly Thr Ile Pro Lys Arg Arg Ser Ser Ser Arg Phe

    50                  55                  60

Ile Lys Arg Lys Lys Phe Asp Asp Glu Leu Val Glu Ser Ser Leu Ala

65                  70                  75                  80

Lys Ser Ser Thr Arg Ala Lys Gly Ala Ser Gly Val Glu Pro Gly Arg

                85                  90                  95

Cys Ser Gly Ser Glu Pro Ser Ser Ser Glu Lys Lys Lys Val Ser Lys

            100                 105                 110

Ala Pro Ser Thr Pro Val Pro Pro Ser Pro Ala Pro Ala Pro Gly Leu

        115                 120                 125

Thr Lys Arg Val Lys Lys Ser Lys Gln Pro Leu Gln Val Thr Lys Asp

    130                 135                 140

Leu Gly Arg Trp Lys Pro Ala Asp Asp Leu Leu Leu Ile Asn Ala Val

145                 150                 155                 160

Leu Gln Thr Asn Asp Leu Thr Ser Val His Leu Gly Val Lys Phe Ser

                165                 170                 175

Cys Arg Phe Thr Leu Arg Glu Val Gln Glu Arg Trp Tyr Ala Leu Leu

            180                 185                 190

Tyr Asp Pro Val Ile Ser Lys Leu Ala Cys Gln Ala Met Arg Gln Leu

        195                 200                 205

His Pro Glu Ala Ile Ala Ala Ile Gln Ser Lys Ala Leu Phe Ser Lys

    210                 215                 220

Ala Glu Glu Gln Leu Leu Ser Lys Val Gly Ser Thr Ser Gln Pro Thr

225                 230                 235                 240

Leu Glu Thr Phe Gln Asp Leu Leu His Arg His Pro Asp Ala Phe Tyr

                245                 250                 255

Leu Ala Arg Thr Ala Lys Ala Leu Gln Ala His Trp Gln Leu Met Lys

            260                 265                 270

Gln Tyr Tyr Leu Leu Glu Asp Gln Thr Val Gln Pro Leu Pro Lys Gly

        275                 280                 285

Asp Gln Val Leu Asn Phe Ser Asp Ala Glu Asp Leu Ile Asp Asp Ser

    290                 295                 300

Lys Leu Lys Asp Met Arg Asp Glu Val Leu Glu His Glu Leu Met Val

305                 310                 315                 320

Ala Asp Arg Arg Gln Lys Arg Glu Ile Arg Gln Leu Glu Gln Glu Leu

                325                 330                 335

His Lys Trp Gln Val Leu Val Asp Ser Ile Thr Gly Met Ser Ser Pro

            340                 345                 350

Asp Phe Asp Asn Gln Thr Leu Ala Val Leu Arg Gly Arg Met Val Arg

        355                 360                 365

Tyr Leu Met Arg Ser Arg Glu Ile Thr Leu Gly Arg Ala Thr Lys Asp

    370                 375                 380

Asn Gln Ile Asp Val Asp Leu Ser Leu Glu Gly Pro Ala Trp Lys Ile

385                 390                 395                 400

Ser Arg Lys Gln Gly Val Ile Lys Leu Lys Asn Asn Gly Asp Phe Phe

                405                 410                 415

Ile Ala Asn Glu Gly Arg Arg Pro Ile Tyr Ile Asp Gly Arg Pro Val

            420                 425                 430

Leu Cys Gly Ser Lys Trp Arg Leu Ser Asn Asn Ser Val Val Glu Ile

        435                 440                 445

Ala Ser Leu Arg Phe Val Phe Leu Ile Asn Gln Asp Leu Ile Ala Leu

    450                 455                 460

Ile Arg Ala Glu Ala Ala Lys Ile Thr Pro Gln

465                 470                 475

<210>3

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>3

atgacacgtg gcaccggggg aa                                                 22

<210>4

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>4

tcactgtggt gtgatcttgg ca                                                 22

<210>5

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>5

atccgtcgag cagagtt                                                       17

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>6

cccttaccct tacccttacc ctaa                                               24

Claims (10)

1.一种分离的人MCRS2多肽，其特征在于，该多肽选自下组：

(a)具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑制端粒酶活性的功能的由(a)衍生的多肽。

2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID NO：2中1-475位或1-162位氨基酸序列的多肽。

3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸选自下组：

(a)编码如权利要求1所述多肽的多核苷酸；

(b)与多核苷酸(a)完全互补的多核苷酸。

4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO：2中1-475位或1-162位所示氨基酸序列的多肽。

5.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列选自下组的一种：

(a)具有SEQ ID NO：1中173-1597位的序列；

(b)具有SEQ ID NO：1中1-1953位的序列；

(c)具有SEQ ID NO：1中173-658位的序列。

6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。

7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的载体。

8.一种多肽的制备方法，其特征在于，该方法含有：

(a)在适合表达的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出人MCRS2蛋白多肽。

9.一种能与权利要求1所述的人MCRS2蛋白特异性结合的抗体。

10.一种用于抑制端粒酶活性或治疗肿瘤的药物组合物，其特征在于，它含有安全有效量的权利要求1所述的MCRS2多肽以及药学上可接受的载体。

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