CN1209369C

CN1209369C - 诱导细胞凋亡蛋白、其编码序列及用途

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Publication number: CN1209369C
Application number: CNB011129859A
Authority: CN
Inventors: 赵慕钧; 梁亮; 徐振华; 李载平
Original assignee: Center for Excellence in Molecular Cell Science of CAS
Current assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Priority date: 2001-05-25
Filing date: 2001-05-25
Publication date: 2005-07-06
Anticipated expiration: 2021-05-25
Also published as: CN1388132A

Abstract

本发明提供了一种新的诱导细胞凋亡蛋白，即CIDE-C(cell death-inducingDFF45-like effector C)蛋白以及编码CIDE-C蛋白的多核苷酸。CIDE-C蛋白是CIDE家族的一个新成员。本发明还公开了CIDE-C蛋白及其多核苷酸的制法和用途。本发明还公开了此CIDE-C蛋白用于治疗多种疾病(如肿瘤、老年性痴呆)的方法。本发明还提供了含CIDE-C蛋白的药物组合物。

Description

诱导细胞凋亡蛋白、其编码序列及用途

本发明属于分子生物学和医学领域，具体地说，本发明涉及新的编码诱导细胞凋亡蛋白CIDE-C(cell death-inducing DFF45-like effector C)的多核苷酸，以及此多核苷酸编码的多肽。本发明还涉及此多核苷酸和多肽的用途和制备。具体地说，本发明的多肽是CIDE家族的一个新成员。

细胞凋亡是细胞生命的基本特征之一。它在胚胎发育、机体内环境稳定、细菌与病毒感染细胞的清除过程中起重要的作用。许多疾病的发生与细胞凋亡失控有关。如肿瘤、自身免疫综合症及持续的病毒感染与细胞凋亡减少密切相关；而神经退化性疾病(如帕金森氏病、老年性痴呆等)及缺血性心肌损伤与细胞过度凋亡有关。

细胞凋亡可被多种因素诱发，凋亡细胞均表现出共同的形态学、生物化学特征，包括胞体皱缩、体积缩小、细胞核浓缩、染色体断裂等等(Tomislav，D.etal.，Oncogene，17：3207-3213，1998)。

与细胞凋亡诱发、凋控过程相关的许多蛋白因子已被发现。一条途径由线粒体途径介导，细胞色素C从线粒体中释放，与Apaf-1形成多聚体，从而招募和激活Caspase-9；另一条途径由细胞表面死亡受体介导，通过FADD与FLASH招募和激活Caspase-8。两条途径最终均激活Caspase-3，Caspase-3激活DNA片断化因子(DFF)，引起染色体断裂(Budihardjo，I.，et al.，Annual review of cell anddevelopmental biology，15：269-290，1999)。

DFF有两个亚基，核酸酶(DFF40/CAD)和它的抑制物(DFF45/ICAD)。通过与DFF45和DFF40的N端结构域同源筛选，发现了一个新的细胞凋亡诱导因子蛋白家族CIDE(cell inducing death DFF45-like effector)(Inohara，N.et al.，EMBOJ.，17：2526-2533，1998)。过量表达CIDE可以诱导细胞凋亡。目前细胞凋亡诱导因子蛋白家族有两个成员，CIDE-A和CIDE-B。

鉴于细胞凋亡与众多疾病的密切相关性，本领域迫切需要了解与凋亡有关的基因和蛋白。

本发明的目的是提供一种新的诱导细胞凋亡蛋白CIDE-C蛋白以及其片段、类似物和衍生物。

本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。

本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途。本发明的CIDE-C基因，是一个在国内外未见报道的新基因，对它的作用机理的研究将有利于加深对凋亡发生途径的分子机制的了解。

在本发明的第一方面，提供新颖的分离出的CIDE-C多肽，该多肽源自人肝组织，它包含：具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽。

在本发明的第二方面，提供编码分离的这些多肽的多核苷酸，该多核苷酸包含一个核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少75％相同性：(a)编码上述CIDE-C多肽的多核苷酸；和(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，该多核苷酸的序列是选自下组的一种：(a)具有SEQ ID NO：1中11-724位的序列；(b)具有SEQ ID NO：1中1-1191位的序列。

在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。

在本发明的第四方面，提供了制备具有CIDE-C蛋白活性的多肽的方法，该方法包含：(a)在适合表达CIDE-C蛋白的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有CIDE-C蛋白活性的多肽。

在本发明的第五方面，提供了与上述的CIDE-C多肽特异性结合的抗体。还提供了可用于检测的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中连续的15-1190个核苷酸。

在本发明的第六方面，提供了模拟、促进、拮抗CIDE-C多肽活性的化合物，以及抑制CIDE-C多肽的表达的化合物。还提供了筛选和/或制备这些化合物的方法。较佳地，该化合物是CIDE-C多肽的编码序列(或其片段)的反义序列。

在本发明的第七方面，提供了检测样品中是否存在CIDE-C蛋白的方法，它包括：将样品与CIDE-C蛋白的特异性抗体接触，观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在CIDE-C蛋白。

在本发明的第八方面，提供了一种检测与CIDE-C多肽异常表达相关的疾病或疾病易感性的方法，该方法包括：检测编码所述多肽的核酸序列中是否存在突变。

在本发明的第九方面，提供了本发明多肽和编码序列的用途。

在本发明的第十方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明的CIDE-C多肽、或其编码序列、或含该编码序列的载体，以及药学上可接受的赋形剂、稀释剂和载体。这些药物组合物可应用于治疗细胞凋亡相关病症。

本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

本发明人通过同源筛选方法克隆了一种新的人类诱导细胞凋亡基因CIDE-C。全序列测定该cDNA全长为1191bp(见SEQ ID NO：1)，编码了一个由238个氨基酸组成的CIDE-C蛋白质(见SEQ ID NO：2)。同源性分析表明CIDE-C属于CIDE基因家族。它能够诱导细胞凋亡。

本发明进行了CIDE-C基因的组织分布分析。通过与12种正常人组织mRNA的Northern杂交实验，表明CIDE-C的表达在结肠、心脏、小肠、胃中高量表达，在脑、脾脏、肝中微量表达，表达产物大小为约1.3Kb。在胎盘中表达1.1kb的产物。因此，CIDE-C基因可以应用于多种组织，具有较广的普遍性。

本发明构建了CIDE-C基因的真核表达载体，并在人的胎肾293T细胞中进行了表达，并且用抗体进行了检测。实验结果表明，在293T细胞中表达了CIDE-C基因。

本发明还进行了体外细胞实验，应用多种方法检测CIDE-C基因诱导的细胞凋亡。首先用CIDE-C基因转染了293T细胞，24小时后，收取细胞并抽提其基因组DNA。电泳鉴定表明，CIDE-C诱导了细胞凋亡。

本发明人还运用荧光显微镜检测转染了外源基因的293T细胞。在阴性对照中，转染载体pCMV-Tag2，其细胞核呈现结构样的绿色荧光；在阳性对照中，转染了CIDE-B，其细胞核呈现荧光亢进的圆珠状小体；在转染了CIDE-C的细胞中，其细胞核也呈现出荧光亢进的圆珠状小体，说明CIDE-C也诱导了细胞凋亡。

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1、Northern杂交检测CIDE-C的mRNA在人各组织中的表达。

图中：1、脑；2、结肠；3、心脏；4、肾脏；5、肝；6、肺；7、骨骼肌；8、胎盘；9、小肠；10、脾脏；11、胃；12、睾丸。

图2、免疫印记检测CIDE-C蛋白的表达。

图中：1、pCMV-Tag2；2、pCMV-Tag2-CIDE-B；3、pCMV-Tag2-CIDE-C

图3、抽取基因组DNA检测CIDE-C诱导细胞凋亡。

图中：1、分子量标准；2、pCMV-Tag2；3、pCMV-Tag2-CIDE-B；4、pCMV-Tag2-CIDE-C

图4、荧光显微镜检测CIDE-C诱导细胞凋亡。

图中：1、pCMV-Tag2；2、pCMV-Tag2-CIDE-B；3、pCMV-Tag2-CIDE-C

箭头所指的细胞为凋亡细胞。

在本发明中，术语“CIDE-C蛋白”、“CIDE-C多肽”或“诱导细胞凋亡蛋白CIDE-C”可互换使用，都指具有诱导细胞凋亡蛋白CIDE-C氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的诱导细胞凋亡蛋白CIDE-C。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的CIDE-C蛋白或多肽”是指CIDE-C多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化CIDE-C蛋白。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。

本发明还包括CIDE-C蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然CIDE-C蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

一类特殊的CIDE-C类似物是在其他哺乳动物(如牛、羊、兔、狗、猴、鼠等)中CIDE-C的同源蛋白。这些其他物种的同源蛋白的编码序列，可根据本发明公开的序列，通过杂交或扩增的方法而获得，进而通过常规重组方法获得这些同源蛋白。

在本发明中，术语“CIDE-C多肽”指具有CIDE-C蛋白活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。该术语还包括具有与CIDE-C蛋白相同功能的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括CIDE-C蛋白的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与CIDE-C DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗CIDE-C多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含CIDE-C多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了CIDE-C多肽的可溶性片段。通常，该片段具有CIDE-C多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供CIDE-C蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然CIDE-C多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“CIDE-C蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
最初的残基	代表性的取代	优选的取代	Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys	Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys	Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu	Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu	Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn	Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn	Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala	Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala	His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu	His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu	Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg	Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg	Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu	Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu	Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr	Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr	Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr	Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr	Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu	Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2的蛋白质，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO：2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列+各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)+非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少60％，较佳地至少75％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.I％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO：2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码CIDE-C蛋白的多聚核苷酸。

本发明的CIDE-C核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；230：1350-1354)被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或CIDE-C蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的CIDE-C多肽。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码CIDE-C多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，CIDE-C多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的基于T7的表达载体；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含CIDE-C编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体P_L启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS-1、293细胞等动物细胞。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

重组的CIDE-C蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)：直接做为药物治疗CIDE-C蛋白功能低下或丧失所致的疾病(例如用于诱导肿瘤细胞凋亡)，和用于筛选促进或对抗CIDE-C蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组CIDE-C蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激CIDE-C蛋白功能的多肽分子。

另一方面，本发明还包括对CIDE-C DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于CIDE-C基因产物或片段。较佳地，指那些能与CIDE-C基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制CIDE-C蛋白的分子，也包括那些并不影响CIDE-C蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的CIDE-C基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；或嵌合抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的CIDE-C基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物(如家兔，小鼠等)以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达CIDE-C蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。可使用多种佐剂增强免疫反应，其中包括(但不限于)弗氏佐剂等。

本发明的单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。本发明的各类抗体可以利用CIDE-C基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与CIDE-C基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

抗CIDE-C蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的CIDE-C蛋白。此外，与CIDE-C蛋白结合的单克隆抗体也可用放射性同位素标记，注入体内可跟踪其位置和分布。这种放射性标记的抗体可作为一种非创伤性诊断方法用于肿瘤细胞的定位和判断是否有转移。

利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与CIDE-C蛋白发生相互作用的物质，如受体、抑制剂、激动剂或拮抗剂等。

本发明蛋白及其抗体、抑制剂、激动剂、拮抗剂或受体等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。

本发明的多肽可直接用于疾病治疗，例如，用于肝脏损伤修复方面的治疗。在使用本发明CIDE-C蛋白时，还可同时使用其他治疗剂。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明CIDE-C多肽或其激动剂、拮抗剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的CIDE-C蛋白或其拮抗剂、激动剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

CIDE-C蛋白的多聚核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于CIDE-C蛋白的无表达、无活性或活性低下所致的细胞增殖、发育或代谢异常，也可用于增加CIDE-C的表达和活性(例如用于促进肝再生)。重组的基因治疗载体(如病毒载体)可设计成表达CIDE-C蛋白，以增加内源性的CIDE-C蛋白活性。来源于病毒的表达载体如逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒、细小病毒等可用于将CIDE-C基因转移至细胞内。构建携带外源基因的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook，et al.)。另外重组CIDE-C基因可包装到脂质体中，然后再转移至细胞内。

抑制CIDE-C mRNA的寡聚核苷酸(包括反义RNA和DNA)以及核酶也在本发明的范围之内。反义的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技术获得，如固相磷酸酰胺化学合成法合成寡核苷酸的技术已广泛应用。反义RNA分子可通过编码该RNA的DNA序列在体外或体内转录获得。这种DNA序列已整合到载体的RNA聚合酶启动子的下游。为了增加核酸分子的稳定性，可用多种方法对其进行修饰，如增加两侧的序列长度，核糖核苷之间的连接应用磷酸硫酯键或肽键而非磷酸二酯键。

多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法包括：将多聚核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。

能与CIDE-C蛋白结合的多肽分子可通过筛选由各种可能组合的氨基酸结合于固相物组成的随机多肽库而获得。

本发明还涉及定量和定位检测CIDE-C蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的CIDE-C蛋白水平，可以用作解释CIDE-C蛋白在各种疾病中的重要性和用于诊断CIDE-C蛋白起作用的疾病。

一种检测检测样品中是否存在CIDE-C蛋白的方法是利用CIDE-C蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与CIDE-C蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在CIDE-C蛋白。

CIDE-C蛋白的多聚核苷酸可用于CIDE-C蛋白相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面，CIDE-C蛋白的多聚核苷酸可用于检测CIDE-C蛋白的表达与否或在疾病状态下CIDE-C蛋白的异常表达。如CIDE-C DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断CIDE-C蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用CIDE-C蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测CIDE-C蛋白的转录产物。

检测CIDE-C基因的突变也可用于诊断CIDE-C蛋白相关的疾病。CIDE-C蛋白突变的形式包括与正常野生型CIDE-C DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。

本发明的优点在于：

1、提供了一个全新的人类凋亡相关基因CIDE-C。它是一个具有诱导细胞凋亡的功能基因。该发明对于加深对细胞凋亡分子机制的了解具有重要的意义。

2、本发明发现CIDE-C可以诱导细胞凋亡，表明CIDE-C参与细胞生长的负凋控，可以作为药物或作为药物的靶序列等一系列临床应用，包括凋亡相关疾病的早期诊断、基因治疗。

3、CIDE-C在正常人组织中的表达有特异性，在结肠、心脏、小肠、胃中高量表达，在其他微量表达或不表达，显示该基因在这四种组织中具有重要的功能。可应用于作为结肠、心脏、小肠和胃相关疾病的诊断制剂。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

CIDE-C全长基因克隆

根据CIDE家族的序列，与人类基因组的核酸序列进行同源序列比较，设计合成了多聚酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)引物P1：5-′gctgacaaggatggaatacg-3′(SEQ ID NO：3)，引物P2：5′-cttgtgggca ctaccagtta a-3′(SEQ IDNO：4)。以肝脏的cDNA文库质粒(GIBCO BRL公司产品)为模板，PCR扩增获得CIDE-B基因cDNA，PCR反应条件为94℃2分钟预变性，循环反应为94℃30秒，55℃30秒，68℃90秒，共进行36个循环。将约800bp的PCR产物用低熔点琼脂糖凝胶回收纯化，克隆至T载体(TaKaRa公司产品)中，方法参照《分子克隆.实验指南》(Sambrook，J.，Fritsh，E.F.，and Maniais，T.，Molecular Cloning，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)。然后进行全序列测序(由博亚公司测定)。

再以T7引物(5′-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3′)与引物P1进行PCR反应，产物直接测序得到cDNA的3′端序列。该cDNA全长为1191bp(SEQ ID NO：1)，包含了一个完整的蛋白编码区(SEQ ID NO：1中第11-724位)，编码了一个由238个氨基酸组成的蛋白质(SEQ ID NO：2)。

实施例2

CIDE-C在人正常组织中的表达分析

将固定有正常人的12种不同组织的poly(A)⁺RNA杂交膜(南京大学提供)放入杂交管中，加入5mL快速杂交液(Amersham Pharmacia生物技术公司产品)，65℃预杂交30分钟，加入变性的³²p随机标记的CIDE-C片段的探针(Random Primer DNA标记试剂盒，TaKaRa公司)，65℃杂交1.5小时。杂交膜用洗涤缓冲液I(0.3M NaCl，0.03M醋酸钠(PH7.0)，0.1％十二烷基磺酸钠)于室温20分钟；然后用洗涤缓冲液II(37.5mM NaCl，3.75mM醋酸钠(pH7.0)，0.1％十二烷基磺酸钠(SDS))于65℃洗两次，每次15分钟。然后，压X光片，-70℃放射自显影(图1)。

实验结果表明CIDE-C基因在结肠、心脏、小肠、胃中高量表达，在脑、脾脏、肝中微量表达，表达产物大小为1.3Kb。在胎盘中表达1.1kb的产物。

实施例3

CIDE-C真核表达载体的构建与蛋白产物的表达与检测。

根据CIDE-C的cDNA序列设计引物P3：5′-gctctagaat ggaatacgcc atga-3′(SEQ IDNO：5)与引物P4：5′-cggaattcac tgcagtatct tc-3′(SEQ ID NO：6)，引物的两侧分别有XbaI与EcoRI的酶切位点。以经过测序验证的CIDE-C序列为模板，进行PCR反应。PCR产物经过低熔点琼脂糖凝胶回收纯化，加入限制性内切酶XbaI与EcoRI(TaKaRa公司产品)。37℃消化一个小时后，回收纯化。同时将载体pCMV-Tag2(Stratagene公司产品)用相同的限制性内切酶XbaI与EcoRI酶切一个小时，低熔点琼脂糖凝胶回收纯化。将两种回收产物用T4 DNA连接酶(TaKaRa公司产品)16℃连接过夜，转化至DH5α菌株中。通过筛选，得到重组的CIDE-C质粒，命名为pCMV-Tag2-CIDE-C。

正常胎肾细胞293T用DMEM培养液(GIBCOL BRL公司产品)加入10％小牛血清(GIBCOL BRL公司产品)，37℃，5％CO₂培养。细胞以90,000个的接种量接种入60mm的细胞培养皿，37℃培养。24小时后用10μl Lipofectamine(GIBCOL BRL公司产品)转染293T细胞。分别加入5μg的pCMV-Tag2、pCMV-Tag2-CIDE-B、pCMV-Tag2-CIDE-C质粒。转染24小时后，收取293T细胞。300μl Triton X-100裂解液(10mMTris(pH7.4)，150mM NaCl，10mM EDTA，10mM EGTA，1％Triton X-100，1mM PMSF，10mM DTT，5μg/ml aprotinin)裂解。取出50μl裂解物加入等量2×SDS上样缓冲液，沸水煮沸10分钟，细针头剪切DNA，离心去沉淀。取10μl上样于15％SDS聚丙烯酰胺(PAGE)凝胶，进行蛋白电泳。电泳结束后，将蛋白转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(NEN公司产品)。用小鼠的抗Flag标签蛋白的单克隆抗体(Sigma)进行免疫印迹，再用辣根过氧化物酶(HRP)交联的二抗(Santa Cruz公司产品)进行杂交。最后用化学发光试剂检测，压X光片1分钟(图2)。

结果表明，在30kDa处存在表达的CIDE-C/Tag融合蛋白。

实施例4

CIDE-C可以诱导细胞凋亡

正常胎肾细胞293T用加入10％小牛血清的DMEM培养液，37℃，5％CO₂培养。细胞以9×10⁵个的接种量接种入60mm的细胞培养皿，37℃培养。24小时后用10μlLipofectamine转染293T细胞。分别加入5μg的pCMV-Tag2、pCMV-Tag2-CIDE-B、pCMV-Tag2-CIDE-C质粒。转染24小时后，收取293T细胞，抽取细胞的基因组DNA。在1.8％的琼脂糖凝胶上电泳鉴定。

结果如图3所示，可见转染了CIDE-B、CIDE-C基因的细胞基因组DNA呈现梯型。这说明CIDE-C可以诱导细胞凋亡。

实施例5

荧光显微镜检测CIDE-C诱导的细胞凋亡

将293T细胞分至六孔板，每孔分30,000个细胞。24小时后转染1μg的质粒DNA，各孔分别为pCMV-Tag2、pCMV-Tag2-CIDE-B、pCMV-Tag2-CIDE-C。转染24小时后，吖啶橙(A0)与溴化乙锭(EB)染色。荧光显微镜下检测，拍照(图3)。实验结果表明，CIDE-C诱导了293T细胞的凋亡。

实施例6

抗CIDE-C蛋白抗体的产生

取200μg实施例3中获得的纯化融合蛋白，溶于0.5毫升去离子水中，加入等体积的弗氏完全佐剂并混匀，多点注射于体重2.5Kg的雄性新西兰大白兔皮内。4周后使用同样的蛋白量以及弗氏不完全佐剂进行加强注射。过2周后进行再次加强。加强后在耳动脉取血，使用免疫双扩散方法检测抗体效价。当抗体效价达到要求时，颈动脉放血收集血液并制备抗血清，加入NaN₃至0.1％，置于-20℃保存。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国科学院上海生物化学研究所

<120>诱导细胞凋亡蛋白、其编码序列及用途

<130>012165

<160>7

<170>PatentIn version 3.0

<210>1

<211>1191

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<220>

<221>CDS

<222>(11)..(724)

<400>1

gctgacaagg atg gaa tac gcc atg aag tcc ctt agc ctt ctc tac ccc 49

Met Glu Tyr Ala Met Lys Ser Leu Ser Leu Leu Tyr Pro

1 5 10

aag tcc ctc tcc agg cat gtg tca gtg cgt acc tct gtg gtg acc cag 97

Lys Ser Leu Ser Arg His Val Ser Val Arg Thr Ser Val Val Thr G1n

15 20 25

cag ctg ctg tcg gag ccc agc ccc aag gcc ccc agg gcc cgg ccc tgc 145

Gln Leu Leu Ser Glu Pro Ser Pro Lys Ala Pro Arg Ala Arg Pro Cys

30 35 40 45

cgc gta agc acg gcg gat cga agc gtg agg aag ggc atc atg gct tac 193

Arg Val Ser Thr Ala Asp Arg Ser Val Arg Lys Gly Ile Met Ala Tyr

50 55 60

agt ctt gag gac ctc ctc ctc aag gtc cgg gac act ctg atg ctg gca 241

Ser Leu Glu Asp Leu Leu Leu Lys Val Arg Asp Thr Leu Met Leu Ala

65 70 75

gac aag ccc ttc ttc ctg gtg ctg gag gaa gat ggc aca act gta gag 289

Asp Lys Pro Phe Phe Leu Val Leu Glu Glu Asp Gly Thr Thr Val Glu

80 85 90

aca gaa gag tac ttc caa gcc ctg gca ggg gat aca gtg ttc atg gtc 337

Thr Glu Glu Tyr Phe Gln Ala Leu Ala Gly Asp Thr Val Phe Met Val

95 100 105

ctc cag aag ggg cag aaa tgg cag ccc cca tca gaa cag ggg aca agg 385

Leu Gln Lys Gly Gln Lys Trp Gln Pro Pro Ser Glu Gln Gly Thr Arg

110 115 120 125

cac cca ctg tcc ctc tcc cat aag cct gcc aag aag att gat gtg gcc 433

His Pro Leu Ser Leu Ser His Lys Pro Ala Lys Lys Ile Asp Val Ala

130 135 140

cgt gta acg ttt gat ctg tac aag ctg aac cca cag gac ttc att ggc 481

Arg Val Thr Phe Asp Leu Tyr Lys Leu Asn Pro Gln Asp Phe Ile Gly

145 150 155

tgc ctg aac gtg aag gcg act ttt tat gat aca tac tcc ctt tcc tat 529

Cys Leu Asn Val Lys Ala Thr Phe Tyr Asp Thr Tyr Ser Leu Ser Tyr

160 165 170

gat ctg cac tgc tgt ggg gcc aag cgc atc atg aag gaa gct ttc cgc 577

Asp Leu His Cys Cys Gly Ala Lys Arg Ile Met Lys Glu Ala Phe Arg

175 180 185

tgg gcc ctc ttc agc atg cag gcc aca ggc cac gta ctg ctt ggc acc 625

Trp Ala Leu Phe Ser Met Gln Ala Thr Gly His Val Leu Leu Gly Thr

190 195 200 205

tcc tgt tac ctg cag cag ctc ctc gat gct acg gag gaa ggg cag ccc 673

Ser Cys Tyr Leu Gln Gln Leu Leu Asp Ala Thr Glu Glu Gly Gln Pro

210 215 220

ccc aag ggc aag gcc tca tcc ctt atc ccg acc tgt ctg aag ata ctg 721

Pro Lys Gly Lys Ala Ser Ser Leu Ile Pro Thr Cys Leu Lys Ile Leu

225 230 235

cag tgaaagccca agtccttgga agctttcccc agtgaaggac tgactggggg 774

Gln

cctcacgctt aactggtagt gcccacaagt ggtagtggcc acaagcctgg cagctgtaga 834

gccgcgaacc tccccacacc tccctcaccg cgcaggaccc tgagtgagga ggaggagctg 894

gaaacctggg gtgggttggc caaaggagaa cctcaagctc ctggcctgat ccagctcctt 954

cctgcccaag gcagcttagc ccatccagac tggtcctgaa gtctgtccct ccattggcat 1014

gaagtctgcc ccttagcaat ccggcctcgc aggctgtact ttcatggtgc tctctacctt 1074

ctggccccca tcccggaaca ttcctgagtg aattcgcaag cgcactagca tgtgatatta 1134

gggagtttgc aataaattat tgaggctgaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 1191

<210>2

<211>238

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>2

Met Glu Tyr Ala Met Lys Ser Leu Ser Leu Leu Tyr Pro Lys Ser Leu

1 5 10 15

Ser Arg His Val Ser Val Arg Thr Ser Val Val Thr Gln Gln Leu Leu

20 25 30

Ser Glu Pro Ser Pro Lys Ala Pro Arg Ala Arg Pro Cys Arg Val Ser

35 40 45

Thr Ala Asp Arg Ser Val Arg Lys Gly Ile Met Ala Tyr Ser Leu Glu

50 55 60

Asp Leu Leu Leu Lys Val Arg Asp Thr Leu Met Leu Ala Asp Lys Pro

65 70 75 80

Phe Phe Leu Val Leu Glu Glu Asp Gly Thr Thr Val Glu Thr Glu Glu

85 90 95

Tyr Phe Gln Ala Leu Ala Gly Asp Thr Val Phe Met Val Leu Gln Lys

100 105 110

Gly Gln Lys Trp Gln Pro Pro Ser Glu Gln Gly Thr Arg His Pro Leu

115 120 125

Ser Leu Ser His Lys Pro Ala Lys Lys Ile Asp Val Ala Arg Val Thr

130 135 140

Phe Asp Leu Tyr Lys Leu Asn Pro Gln Asp Phe Ile Gly Cys Leu Asn

145 150 155 160

Val Lys Ala Thr Phe Tyr Asp Thr Tyr Ser Leu Ser Tyr Asp Leu His

165 170 175

Cys Cys Gly Ala Lys Arg Ile Met Lys Glu Ala Phe Arg Trp Ala Leu

180 185 190

Phe Ser Met Gln Ala Thr Gly His Val Leu Leu Gly Thr Ser Cys Tyr

195 200 205

Leu Gln Gln Leu Leu Asp Ala Thr Glu Glu Gly Gln Pro Pro Lys Gly

210 215 220

Lys Ala Ser Ser Leu Ile Pro Thr Cys Leu Lys Ile Leu Gln

225 230 235

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>合成的引物

<400>3

gctgacaagg atggaatacg 20

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>合成的引物

<400>4

cttgtgggca ctaccagtta a 21

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>合成的引物

<400>5

gctctagaat ggaatacgcc atga 24

<210>6

<211>22

<212>DNA

<213>合成的引物

<400>6

cggaattcac tgcagtatct tc 22

<210>7

<211>23

<212>DNA

<213>合成的引物

<400>7

taatacgact cactataggg aga 23

Claims

1.一种分离的CIDE-C多肽，其特征在于，它选自下组：

(a)具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或数个氨基酸残基的缺失、插入或取代而形成的，且具有诱导细胞调亡功能的由(a)衍生的多肽。

2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽。

3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它选自下组：

(a)编码如权利要求1或2所述多肽的多核苷酸；

(b)与多核苷酸(a)完全互补的多核苷酸。

4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。

5.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列选自下组的一种：

(a)具有SEQ ID NO：1中11-724位的序列；

(b)具有SEQ ID NO：1中1-1191位的序列。

6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。

7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的载体。

8.一种权利要求1所述的CIDE-C多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含：

(a)在适合表达CIDE-C多肽的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出CIDE-C多肽。

9.一种能与权利要求1所述的CIDE-C蛋白特异性结合的抗体。

10.一种药物组合物，其特征在于，它含有安全有效量的权利要求1所述的多肽或权利要求3所述的多核苷酸或权利要求6所述的载体，以及药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。