CN100341892C

CN100341892C - 一种识别反应性星型胶质细胞的标记分子及其应用

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Publication number: CN100341892C
Application number: CNB2003101078556A
Authority: CN
Inventors: 周嘉伟; 盛建松; 杨硕; 许蕾
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Priority date: 2003-10-10
Filing date: 2003-10-10
Publication date: 2007-10-10
Anticipated expiration: 2023-10-10
Also published as: CN1605591A

Abstract

本发明公开了一种识别反应性星型胶质细胞的标记分子大鼠Bystin多肽、其核苷酸编码序列及其应用。大鼠Bystin多肽可用于制备诊断中枢神经系统损伤及相关疾病(如老年性痴呆症、帕金森病等)的药物。Bystin可以识别早期反应性星型胶质细胞，它可作为检测早期中枢神经系统损伤及相关疾病的有效指标之一。

Description

一种识别反应性星型胶质细胞的标记分子及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术和医学领域，具体的本发明涉及一种新的识别反应性星型胶质细胞的标记分子--大鼠Bystin多肽、其编码序列及其应用。

背景技术

中枢神经系统由两大类细胞组成，主要是神经元和胶质细胞。后者包括星型胶质细胞、寡突胶质细胞和小胶质细胞。星型胶质细胞具有很多重要的生理功能，包括对神经元的支持，离子平衡，对神经递质的释放以及免疫系统的神经调节(Kettenmann，H Ransom，BR，1995，Neuroglia.OxfordUniversity Press：New York)。星型胶质细胞的另一个重要功能就是在中枢神经系统受到损伤后形成物理屏障使病灶得到隔离，参与自身组织的愈合。参与这个过程的星型胶质细胞会被大量激活，形态上呈现过度肥大，称之为反应性星型胶质细胞(Eddleston，M，Mucke，L.，Molecular profile ofreactive astrocytes-implications for their role in neurological disease，1993，Neuroscience 54：15-36)。因此，反应性星型胶质细胞的出现和状态在很大程度上提示了大脑损伤的发生和/或炎症反应的存在，因而有助于疾病的诊断。

中枢神经损伤后，伴有大量的胶质细胞的增殖和迁移，以便迅速在病灶周围形成包围，使之局限在一个尽量小的范围之内。与此相类似，中枢神经系统的退行性疾病也伴有胶质细胞的增殖和迁移，如小胶质细胞在黑质中的激活和浸润已是目前比较确认的帕金森病的病理变化之一(Le，W-D，Rowe，Microglial activation and dopaminergic cell injury：An in vitro modelrelevant to Parkinson′s disease，2001，J.Neurosci.21：8447-55.；Orr，CF，Rowe，An inflammatory review of Parkinson′s disease，2002 Prog.Neurobiol.68：325-340)，利用影像学的方法，人们初步建立了通过在体显示激活的小胶质细胞帮助诊断老年性痴呆的方法(Banati，R Visualising microglialactivation in vivo，2002，Glia 40：206-217)，但利用反应性星型胶质细胞的特性进行中枢神经损伤和疾病的诊断还未见报道。

事实上，星型胶质细胞在帕金森病人黑质也有明显的激活(Hunot，S，Dugas，N，Faucheux，B，Fcepsilon RII/CD23 is expressed in Parkinson’sdisease and induces，in vitro，production of nitric oxide and tumornecrosis factor-alpha in glial cells，1999，J.Neurosci.19：3440-3447)，而且可能比激活的小胶质细胞的出现更早。至目前为止，虽然识别非反应性星型胶质细胞的标记分子已经发现了很多，但能特异地识别损伤大脑中反应性星型胶质细胞的标记分子并不多，而能够特异地识别大脑受到损伤早期的反应性星型胶质细胞的标记分子更少，已知的仅JI-31一种(Ridet，J L，Malhotra，S K，Privat，Reactive astrocytes：cellular and molecular cues to biological function，1997，TrendsNeurosci.20：570-7)。

因此，目前迫切需要研究新的能特异地识别损伤大脑中早期反应性星型胶质细胞的标记分子，并将之应用于临床神经病理研究和诊断方面，还可以制备诊断早期帕金森病的检测试剂盒。

发明内容

本发明的目的就是提供一种能特异地识别损伤大脑中早期反应性星型胶质细胞的标记分子大鼠Bystin多肽及其编码序列。

本发明的另一目的是提供大鼠Bystin多肽在制备诊断中枢神经系统损伤及相关疾病的检测试剂盒和检测样品中是否存在反应性星型胶质细胞的方法。

本发明的第一方面提供了一种分离的大鼠Bystin多肽，其特征在于，它包含：具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。

在一优选例中，所述的多肽是具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽。

本发明的第二方面提供了一种分离的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少90％相同性：

(a)编码如上述多肽的多核苷酸；

(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。

优选的，所述多核苷酸编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。

在另一优选例中，上述多核苷酸的序列选自下组的一种：

(a)具有SEQ ID NO：1中52-1359位的序列；

(b)具有SEQ ID NO：1中1-1662位的序列。

本发明的第三方面提供了一种载体，其特征在于，它含有本发明上述多核苷酸。

本发明的第四方面提供了一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有上述载体。

本发明的第五方面提供了一种能与上述的Bystin蛋白特异性结合的抗体。优选的，所述抗体为单克隆抗体。

本发明的第六方面提供了上述Bystin多肽的应用，其特征在于所述多肽在制备诊断中枢神经系统损伤及相关疾病的药物中的应用。

本发明的第七方面提供了一种检测试剂盒，其特征在于，它含有上述Bystin多肽、上述的抗体或其组合。

在一优选例中，上述检测试剂盒用于检测反应性星型胶质细胞。

本发明的第八方面提供了一种检测样品中是否存在反应性星型胶质细胞的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)将样品与选自下组的物质接触：本发明上述的Bystin多肽、上述抗体或其组合。

(b)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在反应性星型胶质细胞。

在一优选例中，上述检测样品为损伤组织。

本发明的第九方面提供了一种具有活性的大鼠Bystin多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含：

(a)在适合表达大鼠Bystin多肽的条件下，培养上述宿主细胞；

(b)从培养物中分离出具有大鼠Bystin蛋白活性的多肽。

本发明的其他方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

如本文所用，“大鼠Bystin蛋白”、“蛋白Bystin”或“Bystin蛋白”指具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽。该术语还包括将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或多个(如1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有Bystin蛋白活性的多肽。

本发明还包括Bystin蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然Bystin蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“Bystin多肽”或“大鼠Bystin多肽”指具有Bystin蛋白活性的SEQ ID NO：2序列的多肽。该术语还包括具有与Bystin蛋白相同功能的、SEQ ID NO：2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括Bystin蛋白的活性片段和活性衍生物。

在本发明中，“Bystin蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
最初的残基	代表性的取代	优选的取代	Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys	Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys	Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu	Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu	Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn	Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn	Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala	Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala	His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu	His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu	Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg	Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg	Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu	Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu	Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr	Pro(P)	Ala	Ala

Thr(T)	Ser	Ser
Thr(T)	Ser	Ser	Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe	Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe	Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明还涉及编码Bystin蛋白的多核苷酸。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2的蛋白质，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

本发明的Bystin核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明的Bystin蛋白可用于免疫兔、鼠等动物，从而获得抗本发明蛋白Bystin的抗体(“本发明抗体”)。本发明抗体包括特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于Bystin基因、基因产物或片段。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段(如Fab’或(Fab)₂片段)、抗体重链、抗体轻链、嵌合抗体、人源化抗体等。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的本发明蛋白Bystin，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。对于单克隆抗体，可利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人，In MonoclonalAntibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。

本发明的Bystin蛋白、免疫原性片段(短肽)和抗体都可用于检测样品中是否存在反应性星型胶质细胞，从而作为检测早期中枢神经系统损伤及相关疾病的有效指标之一，所述疾病包括神经退行性疾病、早期帕金森病等。

本发明的Bystin蛋白抗体还可用于制备治疗性的药物组合物或预防性的疫苗组合物。

因此，另一方面，本发明还提供了一种组合物，它含有(a)安全有效量的本发明蛋白Bystin的抗体；以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐剂、及其组合。本发明的组合物可通过常规方法进行制备。以Bystin蛋白计，其用量例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的抗体还可与其他治疗剂一起使用。

发明人发现Bystin能够用于早期识别反应性星型胶质细胞，这不仅为基础研究提供了识别此类细胞的新手段，而且还可能将它作为一种早期反应性星型胶质细胞的识别分子应用于临床病理研究，因而在临床神经病理诊断方面具有很大的应用价值。譬如，Bystin多肽、抗体或其组合可用于构建检测试剂盒，而目前尚无有效手段早期诊断此类中枢神经系统退行性疾病。

发明人发现，Bystin是一类反应性星型胶质细胞的较为特异的标记分子。Bystin曾被报道作为一个在胚胎着床过程中起重要作用的分子。它通过与trophinin、tastin形成一个复合物介导滋养层细胞与子宫内膜细胞的粘附，并且它与trophinin、tastin的结合可以在细胞角蛋白-8，-18(Cyrokeratins-8，18)的存在下得到加强(Suzuki，N，Nakayama，Expression oftrophinin，tastin，and Bystin by trophoblast and endometrial cells in humanplacenta.，1999，Biol.Reprod.60：621-7；Suzuki，N，Zara，J，A cytoplasmicprotein，Bystin，interacts with trophinin，tastin，and cytokeratin and may beinvolved in trophinin-mediated cell adhesion between trophoblast andendometrial epithelial cells，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：5027-32)。在正常发育时期和成年期的中枢神经系统中，Bystin表达水平较低或缺如，而在帕金森病(Parkinson’s Disease，PD)大鼠模型和机械(刀片)损伤大脑皮层的大鼠中，其表达水平明显增高，采用免疫组织化学、Western blot以及半定量RT-PCR等方法，发明人证明了Bystin是一个可用来识别损伤大脑中反应性星型胶质细胞的标记分子。

发明人克隆了大鼠Bystin的全长基因(SEQ NO：1)，并且在体外实验证明了已有的针对人Bystin的抗体对大鼠Bystin蛋白也有交叉反应(见图1)。随后我们用免疫组织化学的方法发现，在正常大鼠黑质中，Bystin阳性的细胞主要为神经元(包括多巴胺能神经元)，而星型胶质细胞极少；在正常大鼠纹状体中，仅有很少量的Bystin阳性星型胶质细胞，但没有Bystin阳性的神经元。在帕金森病大鼠动物模型黑质和纹状体中，6-羟基多巴胺(6-OHDA)注射后一周，损伤侧黑质即出现大量Bystin阳性的星型胶质细胞(GFAP阳性)，而在损伤对侧则Bystin阳性的星型胶质细胞未见有明显增加；在纹状体中，损伤侧与损伤对侧均未出现星型胶质细胞的明显增加。在损伤后两周，损伤侧黑质与损伤对侧黑质Bystin阳性星型胶质细胞的数量与手术后一周时相比都分别增加了大约两倍。同样，纹状体的损伤侧与损伤对侧的Bystin阳性星型胶质细胞分别增加了约五倍和两倍。至手术后五周，黑质和纹状体中Bystin阳性星型胶质细胞数量与两周时相比均有很显著的下降。因此，在6-OHDA损伤内侧前脑束后诱发的帕金森病大鼠模型(PD大鼠模型)中，Bystin在黑质和纹状体中的表达具有明显的时空特点(见图2、3)。半定量RT-PCR与Western blot等也证实上述结果(见图4)。形态学上，Bystin阳性的细胞胞体肥大，突起粗壮，多为星型胶质细胞，未见NG2(少突胶质细胞前体细胞)或integrinαM(小胶质细胞)或RIP(少突胶质细胞)阳性的细胞表达Bystin(见图5)。此外，我们还观察到由于机械损伤(该类损伤常见于日常生活中)，如吸取大脑皮质以及在大脑皮层中插入刀片，造成的大脑外伤均激活大量的表达Bystin的星型胶质细胞，这些Bystin阳性的星型胶质细胞在形态学上同样具有激活的星型胶质细胞的特征(见图6)。上述结果提示，Bystin可能是在神经系统发生退行性病变后激活的星型胶质细胞的标志物之一，它为研究神经退变以及促进中枢神经再生的机制提供了崭新的资料。

附图说明

图1.Western blot分析针对人Bystin的抗体与大鼠Bystin的交叉反应性以及在大鼠帕金森病模型手术1周后损伤侧与损伤对侧黑质中Bystin的表达。

泳道1、转染pcDNA3.1的COS-1细胞裂解液；

泳道2、转染pcDNA3.1-Bystin的COS-1裂解液；

泳道3、大鼠帕金森病模型手术1周后损伤对侧组织裂解液；

泳道4、大鼠帕金森病模型手术1周后损伤侧组织裂解液。

图2.大鼠6-OHDA损毁内侧前脑束后1周，2周和5周黑质以及正常大鼠的大脑冠状切片。A-B为正常大鼠，C-D手术后1周，E-F手术后2周，G-H手术后5周。

I为大鼠6-OHDA损毁内侧前脑束后1周，2周和5周黑质损伤侧和损伤对侧Bystin阳性细胞数的时程变化。

图3.大鼠6-OHDA损毁内侧前脑束后损伤侧纹状体(D)相比损伤对侧(C)Bystin阳性的细胞有明显的增多。

A、正常大鼠；

B、大鼠6-OHDA损毁内侧前脑束后1周，2周和5周黑质损伤侧和损伤对侧Bystin阳性细胞数的时程变化。

图4.Bystin mRNA在6-OHDA损毁内侧前脑束后1周，2周和5周大鼠黑质损伤侧和损伤对侧的差异表达。

图5. 6-OHDA损毁内侧前脑束后黑质中Bystin与一些特异细胞类型标记分子的免疫荧光双标。

图6.在刀片损伤大脑皮层造成外伤的模型大鼠中，Bystin阳性的星型胶质细胞大量出现。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1 大鼠Bystin基因的克隆

总RNA从成年大鼠脑内抽取出，经过反转录成cDNA，94℃变性4分钟后，PCR扩增24个循环(94℃ 0.5分钟，60℃ 0.5分钟，72℃ 1.5分钟)。PCR产物测序并与人和小鼠Bystin进行同源性比较。经分析比对，我们克隆的大鼠Bystin基因与人源Bystin有86％的同源性。大鼠Bystin基因序列如SEQ NO：1所示。

所用上游引物(SEQ NO：3)为：

5’-CGTGAATTCTTTTCGACAAAAATGCCCAAA-3’；

下游引物(SEQ NO：4)为：

5’-ATTGATATCTGGTGACAACAACATCTTCCAC-3’，

实施例2 制作实验动物模型

将180-220克Sprague-Dawley大鼠(中国科学院上海实验动物中心，上海松江九亭)固定在小动物立体定位仪上。将4微升6-羟基多巴胺(2.5μg/μl溶于0.2mg/ml抗坏血酸)注射如大鼠右侧内侧前脑束(相对于前囟的定位坐标：AP-4.4，ML+1.2，DV+7.8)，注射速度为0.4微升/分钟，注射完停针10分钟后再将注射器缓慢退出。手术后一周腹腔注射阿朴吗啡(0.05毫克/公斤体重)，测试大鼠旋转，一般需要旋转6圈/分钟以上作为成功的帕金森病大鼠模型。

大鼠机械(刀片)损伤大脑皮层模型是在180-220克Sprague-Dawley大鼠皮层中竖直插入5毫米长，2毫米深，1毫米宽的刀片，一周后灌注并固定。

实施例3 Bystin蛋白的表达和Western blot分析

首先将全长大鼠Bystin基因(SEQ NO：1)插入载体pcDNA3.1(Invitrogen)，转化入大肠杆菌DH5α(GIBCO BRL)后大量抽提质粒，然后将质粒转染入COS-1细胞，在细胞中表达得到大鼠Bystin-c-myc的融合蛋白，两天后收集细胞。用磷酸盐缓冲液(PBS)洗3遍，加入裂解缓冲液(1XPBS，1％ Nonidet P-40，0.5％ sodium deoxycholate，0.1％SDS，蛋白酶抑制剂cocktail)，用细胞刮将细胞刮下，(对于大鼠脑组织，则是加入裂解缓冲液，用电动匀浆器匀浆)冰上放置30分钟，然后用细注射器抽吸裂解液，冰上放置30分钟。4℃ 10,000g离心10分钟。取上清。加入上样缓冲液，95℃水浴5分钟。然后SDS-PAGE电泳，然后电转至硝酸纤维素膜，用TBST(1XTBS，0.05％Tween 20)漂洗，然后用含有5％脱脂奶粉的TBST孵育45分钟，再在小鼠抗bystin抗体(IgM)中孵育45分钟，TBST漂洗后再在辣根过氧化物酶耦联的羊抗小鼠IgG中孵育45分钟，漂洗后按照SuperSignalWest Pico ECL system操作曝光，显影。Western blot分析表明，抗人Bystin的抗体与大鼠Bystin存在交叉反应性以及在大鼠帕金森病模型手术1周后损伤侧与损伤对侧黑质中Bystin的表达。如图1所示，转染pcDNA3.1-Bystin的COS-1裂解液及大鼠帕金森病模型手术1周后损伤侧组织裂解液中均有大鼠Bystin蛋白的表达。

实施例4 免疫组织化学和细胞计数

脑片经常规方法固定，用PBST(PBS含0.01％tritonX-100)漂洗后用4％羊血清(GIBCO公司)孵育30分钟，再用含1％羊血清的一抗在4℃孵育48小时，再用PBST漂洗。然后在生物素化二抗中孵育1.5小时，然后进行常规ABC法反应，再行DAB显色反应。用光学显微镜下经放大200倍进行细胞计数。实验结果表明，手术后1、2、5周，损伤侧黑质和损伤侧纹状体的Bystin阳性细胞数与损伤对侧相比均有明显的增多。而在手术后2周的损伤侧，Bystin阳性细胞最多(见图2、图3)。图2实验结果显示在损伤侧黑质(D、F、H)相比损伤对侧(C、E、G)Bystin阳性的细胞有明显的增多。J-K表明手术后2周6-OHDA单侧损毁内侧前脑束导致了损伤侧黑质致密带酪氨酸羟化酶阳性神经元数量的急剧减少。

实施例5 免疫荧光双色标记

脑片经常规方法固定，用PBST(PBS含0.01％ tritonX-100)漂洗后用4％羊血清孵育30分钟，再用含1％羊血清的Bystin抗体在4℃孵育48小时，再用PBST漂洗，将脑片与生物素结合的二抗孵育1.5小时，漂洗，再与结合有卵白素的荧光素孵育1小时，漂洗。然后4％多聚甲醛固定20分钟，漂洗，用4％羊血清孵育30分钟，然后与各类细胞标记分子的抗体孵育，漂洗，然后与荧光素标记的二抗孵育，漂洗。用荧光封片剂封片，荧光显微镜下观察，照相(见图5)。实验结果显示，Bystin与TH，GFAP、PCNA有共定位，而与vimentin或NG2没有共定位。

实施例4、5使用的一抗、二抗列表：

一抗蛋白英文名称	对应使用的二抗	一抗的用途
一抗蛋白英文名称	对应使用的二抗	一抗的用途	Bystin(美国Burnham研究所Dr.M.N.Fukuda惠赠)	抗小鼠IgM(Sigma，St.Louis，MO)	识别反应性星型胶质细胞
GFAP(Sigma，St.Louis，MO)	抗小鼠IgG(Sigma，St.Louis，MO)	识别星型胶质细胞	Bystin(美国Burnham研究所Dr.M.N.Fukuda惠赠)	抗小鼠IgM(Sigma，St.Louis，MO)	识别反应性星型胶质细胞
GFAP(Sigma，St.Louis，MO)	抗小鼠IgG(Sigma，St.Louis，MO)	识别星型胶质细胞	TH(Sigma，St.Louis，MO)	抗小鼠IgG(Sigma，St.Louis，MO)	识别多巴胺能神经元
Vimentin(Sigma，St.Louis，MO)	抗羊IgG(Sigma，St.Louis，MO)	识别未成熟胶质细胞	TH(Sigma，St.Louis，MO)	抗小鼠IgG(Sigma，St.Louis，MO)	识别多巴胺能神经元
Vimentin(Sigma，St.Louis，MO)	抗羊IgG(Sigma，St.Louis，MO)	识别未成熟胶质细胞	IntegrinαM(Chemicon，Temecula，CA)	抗小鼠IgG(Sigma，St.Louis，MO)	识别小胶质细胞
NG2(美国Burnham研究所Dr.WB Stallcup惠赠)	抗兔IgG(Sigma，St.Louis，MO)	识别寡突胶质细胞前体细胞	IntegrinαM(Chemicon，Temecula，CA)	抗小鼠IgG(Sigma，St.Louis，MO)	识别小胶质细胞
NG2(美国Burnham研究所Dr.WB Stallcup惠赠)	抗兔IgG(Sigma，St.Louis，MO)	识别寡突胶质细胞前体细胞	PCNA(Santa CruzeBiotechology，SantaCruze，CA	抗小鼠IgG(Sigma，St.Louis，MO)	识别正在分裂的细胞
β-tubulin(Sigma，St.Louis，MO)	抗小鼠IgG(Sigma，St.Louis，MO)	Western blot时作为内参照使用	PCNA(Santa CruzeBiotechology，SantaCruze，CA	抗小鼠IgG(Sigma，St.Louis，MO)	识别正在分裂的细胞

实施例6 半定量RT-PCR

手术后在不同时间点处死动物并取出黑质，组织取出后匀浆并用Trizol试剂抽提总RNA。取1微克总RNA合成单链cDNA，反应体系为20微升，其中含有50mM随机引物，50mM Tris-HCL，pH 8.3，75mM KCl，3mMMgCl₂，50mM DTT，0.75U RNasin，0.2mM dNTP，200U MMLV反转录酶。反应在37℃进行了一小时，然后于95℃加热5分钟终止反应。特异于Bystin的引物能扩增376碱基长的DNA片段。

正向引物(SEQ NO：5)为：

5’-GCACTCTGAAGCTCACGCCTGATTTC-3’，

反向引物(SEQ NO：6)为：

5’-ACCTGTACCCTCCGAGAAGCCATCA-3’

以水作模板的阴性PCR没有扩出条带，说明反应过程中没有交叉污染。

PCR反应在Mastercycler Gradient PCR仪里进行，反应体系为20微升，含有1-3微升模板，25pmol引物，1.25U Taq聚合酶，和lxPCR反应缓冲液(0.2mM dNTP，1.5mM MgCl₂，0.5μCi[α-³²P]-dATP)。在PCR反应之前每个模板的GAPDH被调节成均一浓度。取7微升PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳。胶用6％三氯乙酸固定30分钟，真空抽干，然后在-80℃曝光5小时。所有PCR产物用自动PCR测序仪测序。结果表明，在损伤侧黑质，Bystin mRNA在损伤后的各个时间点表达水平均有提高，但是在术后一周达到最高(见图4)。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>一种识别反应性星型胶质细胞的标记分子及其应用

<130>030928

<160>6

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1662

<212>DNA

<213>Bystin

<220>

<221>CDS

<222>(52)..(1359)

<223>

<400>1

tcttagccgg cttcacacgt gtaaactttg tgggcaagtt tttcgacaaa a atg ccc 57

Met Pro

1

aaa tta aag gtg aca cgt ggg gcc aga aat caa gag aga cat gca cct 105

Lys Leu Lys Val Thr Arg Gly Ala Arg Asn Gln Glu Arg His Ala Pro

5 10 15

ctg gcg gag cag att ctg gct ggg gac gca gtg cgt gcg ggg acc cga 153

Leu Ala Glu Gln Ile Leu Ala Gly Asp Ala Val Arg Ala Gly Thr Arg

20 25 30

gaa aaa cgg cgg aga cac ggg gtc gaa gag gag gaa gag tat gtg gga 201

Glu Lys Arg Arg Arg His Gly Val Glu Glu Glu Glu Glu Tyr Val Gly

35 40 45 50

ccc cgg ttg agc aga cgg att ttg caa caa gcc cgg cag cag cag gag 249

Pro Arg Leu Ser Arg Arg Ile Leu Gln Gln Ala Arg Gln Gln Gln Glu

55 60 65

gag ctc gag act gaa cac gcg act gga gat cgg ccg gca aaa ccg cga 297

Glu Leu Glu Thr Glu His Ala Thr Gly Asp Arg Pro Ala Lys Pro Arg

70 75 80

gag cgc gcc acg cgg ctg ggg cca gga gtg cca cag gat gga tcg gat 345

Glu Arg Ala Thr Arg Leu Gly Pro Gly Val Pro Gln Asp Gly Ser Asp

85 9 95

gag gag gat gag gaa tgg cct acc ctg gag aag gca gcc aaa atg acc 393

Glu Glu Asp Glu Glu Trp Pro Thr Leu Glu Lys Ala Ala Lys Met Thr

100 105 110

gtg gtg aac cac cag gca gag gta gtg gtg gac cct gaa gat gaa cgc 441

Val Val Asn His Gln Ala Glu Val Val Val Asp Pro Glu Asp Glu Arg

115 120 125 130

gcc att gaa atg ttc atg aac aag aac cct cct gtc agg cgc acc ctg 489

Ala Ile Glu Met Phe Met Asn Lys Asn Pro Pro Val Arg Arg Thr Leu

135 140 145

gct gac atc atc atg gag aag ctg act gag aag cag aca gag gtg gag 537

Ala Asp Ile Ile Met Glu Lys Leu Thr Glu Lys Gln Thr Glu Val Glu

150 155 160

act gtc atg tca gaa gta tcg ggc ttc cct atg cct cag ctg gat ccc 585

Thr Val Met Ser Glu Val Ser Gly Phe Pro Met Pro Gln Leu Asp Pro

165 170 175

cgg gtc cta gaa gtc tac aga gga gtc cgg gag gtg tta tgt aaa tat 633

Arg Val Leu Glu Val Tyr Arg Gly Val Arg Glu Val Leu Cys Lys Tyr

180 185 190

cgc agt ggg ata ctg ccc aag gct ttt aag atc atc cct gcc cta tcc 681

Arg Ser Gly Ile Leu Pro Lys Ala Phe Lys Ile Ile Pro Ala Leu Ser

195 200 205 210

aac tgg gag cag atc ctc tat gtc acg gag ccc gag gcc tgg act gca 729

Asn Trp Glu Gln Ile Leu Tyr Val Thr Glu Pro Glu Ala Trp Thr Ala

215 220 225

gct gcc atg tat caa gcc acc agg att ttt gcc tct aac ctg aag gag 777

Ala Ala Met Tyr Gln Ala Thr Arg Ile Phe Ala Ser Asn Leu Lys Glu

230 235 240

cgc atg gct cag cgc ttc tac aac ctt gtc ctg ctt ccc cga gta cga 825

Arg Met Ala Gln Arg Phe Tyr Asn Leu Val Leu Leu Pro Arg Val Arg

245 250 255

gat gac att gct gaa tac aaa cga ctc aac ttc cac ctg tac atg gca 873

Asp Asp Ile Ala Glu Tyr Lys Arg Leu Asn Phe His Leu Tyr Met Ala

260 265 270

ctc aag aag gcc ctg ttc aaa cct gga gcc tgg ttc aaa gga atc ctg 921

Leu Lys Lys Ala Leu Phe Lys Pro Gly Ala Trp Phe Lys Gly Ile Leu

275 280 285 290

atc ccg ctg tgt gag tct ggc acc tgt acc ctc cga gaa gcc atc atc 969

Ile Pro Leu Cys Glu Ser Gly Thr Cys Thr Leu Arg Glu Ala Ile Ile

295 300 305

gtg ggc agc atc atc agc aag tgc tcc atc cct gtg ttg cac tcc agt 1017

Val Gly Ser Ile Ile Ser Lys Cys Ser Ile Pro Val Leu His Ser Ser

310 315 320

gcg gcc atg ctg aag atc gcg gag atg gag tac agt ggt gcc agc agc 1065

Ala Ala Met Leu Lys Ile Ala Glu Met Glu Tyr Ser Gly Ala Ser Ser

325 330 335

atc ttc ctg cgc ctg ctg ctc gat aag aag tat gca ctg ccc tac cgg 1113

Ile Phe Leu Arg Leu Leu Leu Asp Lys Lys Tyr Ala Leu Pro Tyr Arg

340 345 350

gtg ctc gac gct ctg gtc ttc cat ttt ctg gcc ttc cgg aca gag aag 1161

Val Leu Asp Ala Leu Val Phe His Phe Leu Ala Phe Arg Thr Glu Lys

355 360 365 370

cgc cag ctg ccc gtg ctt tgg cac cag tgc cta ctg aca cta gca cag 1209

Arg Gln Leu Pro Val Leu Trp His Gln Cys Leu Leu Thr Leu Ala Gln

375 380 385

cgc tac aag gct gac ctg gcc acg gag cag aag gag gcc ctc cta gaa 1257

Arg Tyr Lys Ala Asp Leu Ala Thr Glu Gln Lys Glu Ala Leu Leu Glu

390 395 400

ctg ctt cgg ctg cag ccc cac cca cag cta tcc ccg gaa atc agg cgt 1305

Leu Leu Arg Leu Gln Pro His Pro Gln Leu Ser Pro Glu Ile Arg Arg

405 410 415

gag ctt cag agt gca gtc ccc aga gat gtg gaa gat gtt gtt gtc acc 1353

Glu Leu Gln Ser Ala Val Pro Arg Asp Val Glu Asp Val Val Val Thr

420 425 430

atg gaa tgaggacagt cacctgtgtt agtccagggg atgtgggagg accccagctg 1409

Met Glu

435

gtgtagttaa agacctagtc aggacactga aaggttaccg tggcatctgt ggctccagtc 1469

ttgggcaggg aggactgcat ctggttggct ttctcgccag tccctgctca cttctggaac 1529

ctaactggag tcaccccggt tcagtacccc acagcccacc tggcacctgg tatgagggcc 1589

gctctctcca ggtactgtgt aagctcactg ggtctcggat aatccagatt cagttataaa 1649

aaaaaaaaaa aaa 1662

<210>2

<211>436

<212>PRT

<213>Bystin

<400>2

Met Pro Lys Leu Lys Val Thr Arg Gly Ala Arg Asn Gln Glu Arg His

1 5 10 15

Ala Pro Leu Ala Glu Gln Ile Leu Ala Gly Asp Ala Val Arg Ala Gly

20 25 30

Thr Arg Glu Lys Arg Arg Arg His Gly Val Glu Glu Glu Glu Glu Tyr

35 40 45

Val Gly Pro Arg Leu Ser Arg Arg Ile Leu Gln Gln Ala Arg Gln Gln

50 55 60

Gln Glu Glu Leu Glu Thr Glu His Ala Thr Gly Asp Arg Pro Ala Lys

65 70 75 80

Pro Arg Glu Arg Ala Thr Arg Leu Gly Pro Gly Val Pro Gln Asp Gly

85 90 95

Ser Asp Glu Glu Asp Glu Glu Trp Pro Thr Leu Glu Lys Ala Ala Lys

100 105 110

Met Thr Val Val Asn His Gln Ala Glu Val Val Val Asp Pro Glu Asp

115 120 125

Glu Arg Ala Ile Glu Met Phe Met Asn Lys Asn Pro Pro Val Arg Arg

130 135 140

Thr Leu Ala Asp Ile Ile Met Glu Lys Leu Thr Glu Lys Gln Thr Glu

145 150 155 160

Val Glu Thr Val Met Ser Glu Val Ser Gly Phe Pro Met Pro Gln Leu

165 170 175

Asp Pro Arg Val Leu Glu Val Tyr Arg Gly Val Arg Glu Val Leu Cys

180 185 190

Lys Tyr Arg Ser Gly Ile Leu Pro Lys Ala Phe Lys Ile Ile Pro Ala

195 200 205

Leu Ser Asn Trp Glu Gln Ile Leu Tyr Val Thr Glu Pro Glu Ala Trp

210 215 220

Thr Ala Ala Ala Met Tyr Gln Ala Thr Arg Ile Phe Ala Ser Asn Leu

225 230 235 240

Lys Glu Arg Met Ala Gln Arg Phe Tyr Asn Leu Val Leu Leu Pro Arg

245 250 255

Val Arg Asp Asp Ile Ala Glu Tyr Lys Arg Leu Asn Phe His Leu Tyr

260 265 270

Met Ala Leu Lys Lys Ala Leu Phe Lys Pro Gly Ala Trp Phe Lys Gly

275 280 285

Ile Leu Ile Pro Leu Cys Glu Ser Gly Thr Cys Thr Leu Arg Glu Ala

290 295 300

Ile lle Val Gly Ser lle lle Ser Lys Cys Ser Ile Pro Val Leu His

305 310 315 320

Ser Ser Ala Ala Met Leu Lys Ile Ala Glu Met Glu Tyr Ser Gly Ala

325 330 335

Ser Ser Ile Phe Leu Arg Leu Leu Leu Asp Lys Lys Tyr Ala Leu Pro

340 345 350

Tyr Arg Val Leu Asp Ala Leu Val Phe His Phe Leu Ala Phe Arg Thr

355 360 365

Glu Lys Arg Gln Leu Pro Val Leu Trp His Gln Cys Leu Leu Thr Leu

370 375 380

Ala Gln Arg Tyr Lys Ala Asp Leu Ala Thr Glu Gln Lys Glu Ala Leu

385 390 395 400

Leu Glu Leu Leu Arg Leu Gln Pro His Pro Gln Leu Ser Pro Glu Ile

405 410 415

Arg Arg Glu Leu Gln Ser Ala Val Pro Arg Asp Val Glu Asp Val Val

420 425 430

Val Thr Met Glu

435

<210>3

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(30)

<223>引物

<400>3

cgtgaattct tttcgacaaa aatgcccaaa 30

<210>4

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(31)

<223>引物

<400>4

attgatatct ggtgacaaca acatcttcca c 31

<210>5

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(26)

<223>引物

<400>5

gcactctgaa gctcacgcct gatttc 26

<210>6

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(25)

<223>引物

<400>6

acctgtaccc tccgagaagc catca 25

Claims

1.一种分离的大鼠Bystin多肽，其特征在于，它是由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的多肽。

2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸序列为选自下组的一种核苷酸序列：

(a)编码如权利要求1所述多肽的多核苷酸：

(b)与多核苷酸(a)完全互补的多核苷酸。

3.如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码如SEQ IDNO：2所示氨基酸序列的多肽。

4.如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列选自下组的一种：

(a)如SEQ ID NO：1中52-1359位所示的序列；

(b)如SEQ ID NO：1中1-1662位所示的序列。

5.一种载体，其特征在于，它含有权利要求2所述的多核苷酸。

6.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求5所述的载体。

7.一种能与权利要求1所述的大鼠Bystin多肽特异性结合的抗体。

8.如权利要求1所述的大鼠Bystin多肽的应用，其特征在于所述多肽在制备诊断中枢神经系统损伤及中枢神经系统退行性疾病的药物中的应用。

9.一种检测样品中是否存在反应性星型胶质细胞的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)将样品与选自下组的物质接触：权利要求1所述的大鼠Bystin多肽、权利要求7所述的抗体或其组合。

(b)检测是否形成抗原一抗体复合物，其中形成复合物并结合细胞形态学检查结果就表示样品中存在反应性星型胶质细胞。

10.一种具有活性的大鼠Bystin多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含：

(a)在适合表达大鼠Bystin多肽的条件下，培养权利要求6所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出大鼠Bystin多肽。