CN112899251A - 一种定法端粒酶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种定法端粒酶的制备方法，涉及酶的提取技术领域，为解决现有技术中，端粒酶提取方法存在的提取效率低的技术问题，本发明的技术方案如下：包括如下步骤：步骤S1，对含有LPTS蛋白或其活性片段的发酵液样品，进行阳离子交换层析，获得含LPTS蛋白或其活性片段的初提纯液，其中所述的活性片段具有全长LPTS的80％以上的端粒酶；步骤S2，对步骤S1中的初提纯液，进行葡聚糖凝胶层析，从而获得纯化的LPTS蛋白或其活性片段。
Description
技术领域
本发明涉及酶的提取技术领域，尤其涉及一种定法端粒酶的制备方法。
背景技术
端粒是存在于真核细胞线状染色体末端的一种特殊结构，与端粒结合蛋白一起构成了特殊的“帽状”结构，维持染色体的完整和细胞活性，其实质为一小段DNA-蛋白质复合体。端粒与有丝分裂有着密切的联系，细胞每分裂一次，端粒就缩短30～200bp，当缩短到2～4kb，会导致细胞复制功能衰退，引起细胞衰老或死亡，被科学家称为“有丝分裂时钟”和“生命时钟”。
端粒的延长和重组机制都是通过端粒酶来催化和介导的，端粒酶在保持端粒稳定、基因组完整、细胞活性和潜在的增殖能力等方面发挥重要作用。端粒酶活性的高低将会影响端粒长度的变化，继而影响到细胞的寿命。在衰老的细胞中，端粒梅的数量及活性下降，如何提高衰老细胞中端粒酶的数量或活性，对于延长细胞寿命、延缓机体衰老具有重大意义。
传统的端粒酶提取方法采用超声等物理破碎的方法，在造血干细胞及癌细胞中进行提取，但是提取效率并不高，无法满足大规模医药品的加工需求。
发明内容
为解决现有技术中，端粒酶提取方法存在的提取效率低的技术问题，本发明的技术方案如下：
本发明中的一种定法端粒酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤S1，对含有LPTS蛋白或其活性片段的发酵液样品，进行阳离子交换层析，获得含LPTS蛋白或其活性片段的初提纯液，其中所述的活性片段具有全长LPTS的80％以上的端粒酶；
步骤S2，对步骤S1中的初提纯液，进行葡聚糖凝胶层析，从而获得纯化的 LPTS蛋白或其活性片段。
进一步，步骤S1中使用的阳离子交换介质是SP-Sepharose。
进一步，步骤S1中的条件是，阳离子交换介质是SP-Sepharose，以pH7.8 ±0.2，30±5mmol/L的KH2PO4-NaOH缓冲液为平衡液，收集在0.5±0.05mol/L NaCl溶液段的洗脱峰作为初提纯液。
进一步，步骤S2中所用的葡聚糖凝胶是Sephadex G100。
进一步，步骤S2中的条件是，葡聚糖凝胶是Sephadex G100，以30± 10mmol/LNH4HCO3为平衡液和洗脱液，收集主洗脱峰，用SDS-PAGE电泳验证，即为纯化的LPTS蛋白或其活性片段。
进一步，在步骤S1和S2之间还包括步骤：将步骤S1中的初提纯液的体积浓缩至初提纯液原体积的1/3-1/50。
进一步，所述的纯化的LPTS蛋白的纯度大于80％，其活性片段的纯度大于90％。
进一步，所述的活性片段是具有至少80％全长LPTS的端粒酶的活性片段，较佳地选自下组：LPTS的C末端的197个氨基酸构成的多肽；6His与LPTS的 C末端的197个氨基酸构成的融合蛋白。
进一步，其中端粒酶是LPTS蛋白的活性片段，并且所述的活性片段选自下组：LPTS的C末端的197个氨基酸构成的多肽；6His与LPTS的C末端的197 个氨基酸构成的融合蛋白。
进一步，所述端粒酶是具有SEQ ID NO：5或6所示氨基酸序列的多肽。
本发明中的一种定法端粒酶的制备方法，与现有技术相比，其有益效果为：
本发明中的一种定法端粒酶的制备方法，可以从成分较为复杂的LPTS蛋白培养液或肿瘤中提取端粒酶，提取过程简单高效，工艺流程短且成本较低，相比较传统的超声等物理破碎的方法，本发明可有效保证端粒酶的活性，提取率也高于传统方式，在医药品工业中具有较高的推广价值。
具体实施方式
下面对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明中的一种定法端粒酶的制备方法，包括如下步骤：
步骤S1，对含有LPTS蛋白或其活性片段的发酵液样品，进行阳离子交换层析，获得含LPTS蛋白或其活性片段的初提纯液，其中所述的活性片段具有全长LPTS的80％以上的端粒酶。阳离子交换介质是SP-Sepharose，以pH7.8±0.2， 30±5mmol/L的KH2PO4-NaOH缓冲液为平衡液，收集在0.5±0.05mol/L NaCl 溶液段的洗脱峰作为初提纯液。
步骤S2，对步骤S1中的初提纯液，进行葡聚糖凝胶层析，从而获得纯化的 LPTS蛋白或其活性片段。葡聚糖凝胶是Sephadex G100，以30±10mmol/L NH4HCO3为平衡液和洗脱液，收集主洗脱峰，用SDS-PAGE电泳验证，即为纯化的LPTS蛋白或其活性片段。
实施例2
本发明中的一种定法端粒酶的制备方法，包括如下步骤：
步骤S1，对含有LPTS蛋白或其活性片段的发酵液样品，进行阳离子交换层析，获得含LPTS蛋白或其活性片段的初提纯液，其中所述的活性片段具有全长LPTS的80％以上的端粒酶。阳离子交换介质是SP-Sepharose，以pH7.8±0.2， 30±5mmol/L的KH2PO4-NaOH缓冲液为平衡液，收集在0.5±0.05mol/L NaCl 溶液段的洗脱峰作为初提纯液。
将步骤S1中的初提纯液的体积浓缩至初提纯液原体积的1/3。
步骤S2，对步骤S1中的初提纯液，进行葡聚糖凝胶层析，从而获得纯化的 LPTS蛋白或其活性片段。葡聚糖凝胶是Sephadex G100，以30±10mmol/L NH4HCO3为平衡液和洗脱液，收集主洗脱峰，用SDS-PAGE电泳验证，即为纯化的LPTS蛋白或其活性片段。其中，纯化的LPTS蛋白的纯度大于80％，其活性片段的纯度大于90％。
实施例3
本发明中的一种定法端粒酶的制备方法，包括如下步骤：
步骤S1，对含有LPTS蛋白或其活性片段的发酵液样品，进行阳离子交换层析，获得含LPTS蛋白或其活性片段的初提纯液，其中所述的活性片段具有全长LPTS的80％以上的端粒酶。阳离子交换介质是SP-Sepharose，以pH7.8±0.2， 30±5mmol/L的KH2PO4-NaOH缓冲液为平衡液，收集在0.5±0.05mol/L NaCl 溶液段的洗脱峰作为初提纯液。
将步骤S1中的初提纯液的体积浓缩至初提纯液原体积的1/50。
步骤S2，对步骤S1中的初提纯液，进行葡聚糖凝胶层析，从而获得纯化的 LPTS蛋白或其活性片段。葡聚糖凝胶是Sephadex G100，以30±10mmol/L NH4HCO3为平衡液和洗脱液，收集主洗脱峰，用SDS-PAGE电泳验证，即为纯化的LPTS蛋白或其活性片段。其中，纯化的LPTS蛋白的纯度大于80％，其活性片段的纯度大于90％。
其中，活性片段是具有至少80％全长LPTS的端粒酶的活性片段，较佳地选自下组：LPTS的C末端的197个氨基酸构成的多肽；6His与LPTS的C末端的197个氨基酸构成的融合蛋白。
实施例4
本发明中的一种定法端粒酶的制备方法，包括如下步骤：
步骤S1，对含有LPTS蛋白或其活性片段的发酵液样品，进行阳离子交换层析，获得含LPTS蛋白或其活性片段的初提纯液，其中所述的活性片段具有全长LPTS的80％以上的端粒酶。阳离子交换介质是SP-Sepharose，以pH7.8±0.2， 30±5mmol/L的KH2PO4-NaOH缓冲液为平衡液，收集在0.5±0.05mol/L NaCl 溶液段的洗脱峰作为初提纯液。
将步骤S1中的初提纯液的体积浓缩至初提纯液原体积的1/20。
步骤S2，对步骤S1中的初提纯液，进行葡聚糖凝胶层析，从而获得纯化的 LPTS蛋白或其活性片段。葡聚糖凝胶是Sephadex G100，以30±10mmol/L NH4HCO3为平衡液和洗脱液，收集主洗脱峰，用SDS-PAGE电泳验证，即为纯化的LPTS蛋白或其活性片段。其中，纯化的LPTS蛋白的纯度大于80％，其活性片段的纯度大于90％。
其中，端粒酶是LPTS蛋白的活性片段，并且所述的活性片段选自下组： LPTS的C末端的197个氨基酸构成的多肽；6His与LPTS的C末端的197个氨基酸构成的融合蛋白。端粒酶是具有SEQ ID NO：5或6所示氨基酸序列的多肽。
实施例5
本发明中的一种定法端粒酶的制备方法，包括如下步骤：
步骤S1，对含有LPTS蛋白或其活性片段的发酵液样品，进行阳离子交换层析，获得含LPTS蛋白或其活性片段的初提纯液，其中所述的活性片段具有全长LPTS的80％以上的端粒酶。阳离子交换介质是SP-Sepharose，以pH7.8， 30mmol/L的KH2PO4-NaOH缓冲液为平衡液，收集在0.5mol/L NaCl溶液段的洗脱峰作为初提纯液。
步骤S2，对步骤S1中的初提纯液，进行葡聚糖凝胶层析，从而获得纯化的 LPTS蛋白或其活性片段。葡聚糖凝胶是Sephadex G100，以30mmol/L NH4HCO3为平衡液和洗脱液，收集主洗脱峰，用SDS-PAGE电泳验证，即为纯化的LPTS 蛋白或其活性片段。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种定法端粒酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤S1，对含有LPTS蛋白或其活性片段的发酵液样品，进行阳离子交换层析，获得含LPTS蛋白或其活性片段的初提纯液，其中所述的活性片段具有全长LPTS的80％以上的端粒酶；
步骤S2，对步骤S1中的初提纯液，进行葡聚糖凝胶层析，从而获得纯化的LPTS蛋白或其活性片段。
2.根据权利要求1所述的一种定法端粒酶的制备方法，其特征在于，步骤S1中使用的阳离子交换介质是SP-Sepharose。
3.根据权利要求1所述的一种定法端粒酶的制备方法，其特征在于，步骤S1中的条件是，阳离子交换介质是SP-Sepharose，以pH7.8±0.2，30±5mmol/L的KH2PO4-NaOH缓冲液为平衡液，收集在0.5±0.05mol/LNaCl溶液段的洗脱峰作为初提纯液。
4.根据权利要求1所述的一种定法端粒酶的制备方法，其特征在于，步骤S2中所用的葡聚糖凝胶是Sephadex G100。
5.根据权利要求1所述的一种定法端粒酶的制备方法，其特征在于，步骤S2中的条件是，葡聚糖凝胶是Sephadex G100，以30±10mmol/L NH4HCO3为平衡液和洗脱液，收集主洗脱峰，用SDS-PAGE电泳验证，即为纯化的LPTS蛋白或其活性片段。
6.根据权利要求1所述的一种定法端粒酶的制备方法，其特征在于，在步骤S1和S2之间还包括步骤：将步骤S1中的初提纯液的体积浓缩至初提纯液原体积的1/3-1/50。
7.根据权利要求1所述的一种定法端粒酶的制备方法，其特征在于，所述的纯化的LPTS蛋白的纯度大于80％，其活性片段的纯度大于90％。
8.根据权利要求1所述的一种定法端粒酶的制备方法，其特征在于，所述的活性片段是具有至少80％全长LPTS的端粒酶的活性片段，较佳地选自下组：LPTS的C末端的197个氨基酸构成的多肽；6His与LPTS的C末端的197个氨基酸构成的融合蛋白。
9.根据权利要求1所述的一种定法端粒酶的制备方法，其特征在于，其中端粒酶是LPTS蛋白的活性片段，并且所述的活性片段选自下组：LPTS的C末端的197个氨基酸构成的多肽；6His与LPTS的C末端的197个氨基酸构成的融合蛋白。
10.根据权利要求1所述的一种定法端粒酶的制备方法，其特征在于，所述端粒酶是具有SEQ ID NO：5或6所示氨基酸序列的多肽。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210604 |