CN102311493A

CN102311493A - 一种抑制端粒酶活性的肽及其制备方法和应用

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Publication number: CN102311493A
Application number: CN2011101846019A
Authority: CN
Inventors: 赵慕钧; 冯剑; 陈国元; 赵静; 陈光明; 答亮; 李载平
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Huzhou Tailewek Biopharmaceutical Co ltd
Priority date: 2010-07-02
Filing date: 2011-07-01
Publication date: 2012-01-11
Anticipated expiration: 2031-07-01
Also published as: US20130108654A1; CN102311493B; WO2012000458A1; EP2589605B1; EP2589605A4; EP2589605A1; US8968727B2

Abstract

本发明涉及一种抑制端粒酶活性的肽及其制备方法和应用。本发明的肽具有显著抑制肿瘤细胞的端粒酶活性的功能。在肿瘤细胞内表达本发明的肽可以抑制肿瘤细胞的生长，并导致细胞死亡。本发明的肽能够专一性抑制端粒酶，在肿瘤的靶向治疗中具有重要的应用前景。

Description

一种抑制端粒酶活性的肽及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术和分子生物学研究领域。发明涉及一种高效抑制端粒酶活性的蛋白肽段及其制备和应用。

背景技术

端粒酶(Telomerase)是一种合成和延伸细胞染色体端粒的核糖核蛋白，它包含两种基本成分：逆转录酶催化亚基hTERT和RNA组分hTR。端粒酶能以自身RNA为模板，反转录合成端粒重复列，加到染色体的末端，以弥补细胞分裂时端粒DNA的丢失，维持端粒的长度。研究表明在正常人体细胞内端粒酶活性几乎检测不到，因此，人正常体细胞分裂次数是有限的，细胞每分裂一次，端粒便丢失50-200bp，当端粒缩短到一定程度时细胞生长受到抑制，即称为细胞衰老，并走向死亡。然而，在绝大多数恶性肿瘤细胞(85％)中普遍可以检测到端粒酶活性且活性较强，端粒酶对端粒的重新合成补偿了它在细胞繁殖过程中的持续丢失，从而使得细胞可以不断的分裂，这是细胞永生化和癌变的一个重要机制。

Kim等分析总结了大量研究结果，检测了100多种恶性肿瘤标本，指出端粒酶诊断肿瘤的敏感性为85％，特异性为91％，阳性预测值为91％，阴性预测值为81％，充分表明端粒酶在肿瘤诊断中的价值(Kim NW，Piatyszek MA，Prowse KR，et al.Specific association of human telomerase activity with immortalcells and cancer.Science.1994 Dec 23；266(5193)：2011-5.)。端粒酶的激活被认为是发生恶性肿瘤的主要因素之一，其激活及表达程度与肿瘤的发生和转移密切相关，抑制端粒酶并使端粒缩短被认为是抑制癌细胞的一种机制，因此端粒酶成为肿瘤靶向治疗的理想靶点。有许多公司正在开发端粒酶抑制剂治疗肿瘤，其中GRN163L已经开始了临床2期实验，几个端粒酶疫苗也即将完成临床试验进入市场。

LPTS(Liver Putative Tumor Suppressor)是本发明人利用定位克隆的方法从人的正常肝cDNA文库中得到的一个肝相关的候选抑癌新基因[C.Liao，M.J.Zhao，H.Song，K.Uchida，K.K.Yokoyama，T.P.Li，Identification of the genefor a novel liver-related putative tumor suppressor at a high-frequency loss ofheterozygosity region of chromosome 8p23 in human hepatocellular carcinoma.Hepatology 2000，32721-727]。LPTS基因定位于人第8号染色体8p23区段，该区段在多种恶性肿瘤细胞中高频缺失。研究表明LPTS在肝癌组织及肝癌细胞系中表达量极低或检测不到，将LPTS基因导入肝癌细胞，能抑制肝癌细胞的生长、增殖、最后引起死亡[Liao C，Zhao MJ；Mutation analysis of novel humanliver-related putative tumor suppressor gene in hepatocellular carcinoma.World JGastroenterol，2003，9：89-93]]。LPTS基因于2004年已获得中国发明专利授权(赵慕钧等：“一种肝癌相关基因及其应用”，专利号：ZL 00115395.1，专利权人：中国科学院上海生物化学研究所；授权公告日：2004年10月13日)。2001年Lu博士的实验室报导了LPTS基因的另一个全长转录本PinX1，发现PinX1编码的蛋白可以结合端粒酶催化亚基hTERT并抑制端粒酶活性[ZhouX.Z.，Lu K.P；The Pin2/TRF1-interacting protein PinX1 is a potent telomeraseinhibitor.Cell，2001，107，347-359]，从机制上第一次证明了LPTS/PinX1作为一种天然的端粒酶抑制蛋白可抑制肿瘤细胞的增殖，为肿瘤的靶向治疗提供了新的途径。本发明人在2005年申请了一项有关制备LPTS蛋白的发明专利(赵慕钧等：“端粒酶活性抑制蛋白的制备和纯化”，专利申请号：200510030526.5，申请日：2005年10月14日；专利权人：中国科学院上海生命科学研究院)。在该专利中提供了LPTS蛋白(LPGENE1)和LPTS抑制端粒酶的活性片段LPTS133-328(LPGENE2)的制备方法，并提供了LPTS抑制端粒酶的活性片段位于其C端的133-328氨基酸残基。本发明人在2008年申请的专利揭示了TAT与LPTS133-328的融合蛋白(专利申请号：200810041324.4)，经证实该融合蛋白可穿透细胞膜的且具有极其优异的抑制肿瘤细胞生长的效果。

鉴于LPTS蛋白是一种与肿瘤细胞生长密切相关的重要的蛋白，因此非常需要对其进行进一步地深入研究，以开发出更为有效的肿瘤抑制药物，满足临床应用所需。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效抑制端粒酶活性的蛋白肽段及其制备和应用。

在本发明的第一方面，提供一种分离的多肽(蛋白)，所述多肽是：

(a)包含SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的多肽；

(b)SEQ ID NO：1氨基酸序列经过一个或多个(如1-10个；较佳地1-5个；更佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；或

(c)与(a)限定的多肽序列有90％(较佳地95％，更佳地98％，最佳地99％)以上相同性且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽。

在另一优选例中，所述的多肽不具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列(LPTS全长序列)，SEQ ID NO：2中第133-328位所示氨基酸序列(LPTS_133-328)和SEQID NO：2中第254-328位所示氨基酸序列。

在另一优选例中，所述的多肽包含SEQ ID NO：2中第255～328位所示氨基酸序列，或

包含SEQ ID NO：2中第256～328位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO：2中第257～328位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO：2中第258～328位所示氨基酸序列，或

包含SEQ ID NO：2中第259～328位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO：2中第260～328位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO：2中第261～328位所示氨基酸序列，或

包含SEQ ID NO：2中第262～328位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO：2中第263～328位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO：2中第264～328位所示氨基酸序列，或

包含SEQ ID NO：2中第265～328位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO：2中第266～328位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO：2中第267～328位所示氨基酸序列，或

包含SEQ ID NO：2中第268～328位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO：2中第269～328位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO：2中第270～328位所示氨基酸序列，或

包含SEQ ID NO：2中第271～328位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO：2中第272～328位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO：2中第273～328位所示氨基酸序列，或

包含SEQ ID NO：2中第274～328位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO：2中第275～328位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO：2中第276～328位所示氨基酸序列，或

包含SEQ ID NO：2中第277～328位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO：2中第278～328位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO：2中第279～328位所示氨基酸序列，或

包含SEQ ID NO：2中第280～328位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO：2中第281～328位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO：2中第282～328位所示氨基酸序列，或

包含SEQ ID NO：2中第283～328位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO：2中第284～328位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO：2中第285～328位所示氨基酸序列，或

包含SEQ ID NO：2中第286～328位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO：2中第287～328位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO：2中第288～328位所示氨基酸序列，或

包含SEQ ID NO：2中第289～328位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO：2中第290～328位所示氨基酸序列。

在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，它含有一核苷酸序列，该核苷酸序列编码所述的多肽。

在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体。

在本发明的另一方面，提供一种所述的多肽的制备方法，该方法包括：

(a)在适合表达的条件下，培养所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出所述的多肽。

在本发明的另一方面，提供所述的多肽的用途，用于制备抑制细胞内端粒酶活性的组合物。

在另一优选例中，所述的组合物用于防治端粒酶异常激活相关疾病。

在另一优选例中，所述的端粒酶异常激活相关疾病是肿瘤。

在本发明的另一方面，提供一种复合物，所述的复合物包含所述的多肽，以及与该多肽相容的物质。

在另一优选例中，所述的复合物是融合蛋白，所述的多肽与至少一条功能性蛋白相连接(较佳地通过肽键连接)，所述的功能性蛋白有5-500个(较佳地5-300个；更佳地10-250个)氨基酸。

在另一优选例中，所述的功能性蛋白选自：穿膜蛋白(如反式激活蛋白TAT)，标签蛋白(如GST蛋白)，报告蛋白(如GFP蛋白)，人血清白蛋白(延长半衰期)，人IgG1：Fc片段(延长半衰期)。

在另一优选例中，所述的多肽与所述的功能性蛋白直接相连，或通过连接肽连接。所述连接肽的长度为1-20个氨基酸，更佳为2-10个氨基酸。如所述连接肽的氨基酸序列为：GGS。

在另一优选例中，所述的融合蛋白不具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列(LPTS全长序列)，SEQ ID NO：2中第133-328位所示氨基酸序列(LPTS_133-328)和SEQ ID NO：2中第254-328位所示氨基酸序列。

在另一优选例中，所述的复合物包含选自以下的物质：蛋白活性促进剂、蛋白活性稳定剂、延长蛋白半衰期的制剂(如PEG，PEG-脂质体)。

在本发明的另一方面，提供一种组合物，它含有安全有效量的所述的多肽或所述的复合物，以及药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的组合物用于抑制细胞内端粒酶活性。

在另一优选例中，所述的组合物用于防治端粒酶活性增高肿瘤。

在本发明的另一方面，提供一种制备组合物的方法，所述组合物抑制细胞内端粒酶活性，所述方法包括：将安全有效量的所述的多肽或所述的复合物与药学上可接受的载体混合。

在本发明的另一方面，提供一种药盒，所述药盒中含有所述的多肽；或含有所述的复合物；或含有所述的组合物。

在另一优选例中，所述的药盒用于抑制细胞内端粒酶活性。

在另一优选例中，所述的药盒用于防治端粒酶活性增高肿瘤。

在本发明的另一方面，提供一种(优选体外，优选非治疗性地)抑制细胞内端粒酶活性的方法，包括给予受试者有效量的所述的多肽；或所述的复合物；或所述的组合物。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、SDS-PAGE显示GST-LPTS_290-328融合蛋白的诱导表达及纯化。

泳道1为IPTG诱导前的GST-LPTS_290-328基因工程菌表达的蛋白；泳道2为IPTG诱导后该工程菌表达的蛋白；泳道3-5为纯化后收集到的3管GST-LPTS_290-328蛋白。

图2、GST-LPTS_290-328，GST-LPTS_133-328以及GST-LPTS抑制端粒酶活性的检测与比较。

A、GST-LPTS_290-328，GST-LPTS_133-328以及GST-LPTS融合蛋白结构示意图；

B、TRAP法检测GST-LPTS_290-328，GST-LPTS_133-328以及GST-LPTS蛋白抑制端粒酶的活性。蛋白的用量分别为5、10、25、50、100、200、250nM，如图所示。GST蛋白作为对照。检测样品经10％PAGE非变性胶电泳后银染结果。

图3、LPTS_290-328对肝癌BEL7404细胞生长的影响。

A、Western Blot检测GFP、GFP-LPTS、GFP-LPTS_290-328在其稳定转染细胞株GFP/7404，GFP-LPTS/7404和GFP-LPTS_290-328/7404中的表达。兔源anti-GFP抗体作为杂交探针；

B、MTT法绘制各稳定细胞株的生长曲线图；

C、GFP/7404，GFP-LPTS/7404和GFP-LPTS_290-328/7404等细胞培养过程中细胞状态图。图中箭头所指为处于危机期、衰老症状的细胞，

D、为脱壁死亡后的GFP-LPTS_290-328/7404细胞。

图4、Southern Blot实验检测LPTS和LPTS_290-328对肝癌BEL7404细胞端粒长度的影响。

A、转染GFP或GFP-LPTS的BEL7404细胞经FACS分选后持续培养，选取不同的培养代数(PD)细胞如图所示，抽取其基因组DNA，经Hinf I和Afa I内切酶消化后与单链端粒重复序列³²p-(TTAGGG)₆探针杂交；

B、转染GFP或GFP-LPTS_290-328的BEL7404细胞经FACS流式细胞仪分选后倍增8代，抽取其基因组DNA，经Hinf I和Afa I内切酶消化后与单链端粒重复序列³²p-(TTAGGG)₆探针杂交。本图为放射自显影后的结果。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，首次分离到LPTS蛋白(全长序列如SEQ ID NO：2)的抑制端粒酶的活性区域，该活性区域位于LPTS蛋白的第290-328位(LPTS_290-328)。该活性区域的活性超过全长LPTS蛋白及LPTS上的其它片段，并能更快地诱导肿瘤细胞死亡。本发明为肿瘤的靶向治疗提供了更为有效的抑制端粒酶活性的蛋白。

术语

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“对象”、“个体”、或“患者”指需要进行诊断或治疗的任何目标，尤其是哺乳动物对象，特别是人，其它对象包括牛、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马等。特别受关注的是那些端粒酶异常激活的对象。

如本文所用，“核酸”和“核酸序列”指聚合形式的任意长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)。它包括(但不限于)单链、双链的DNA或RNA，基因组DNA和cDNA。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂或稀释剂。

如本文所用，“有效量”或“安全有效量”指以单剂或连续剂一部分给予个体的量对治疗或预防是有效的。该用量根据所治疗个体的健康状况和生理状况、所治疗个体的类别(如非人灵长类等)、治疗医师对医疗状况的评估、及其它的相关因素而定。预计该用量将在相对较宽的范围内，可通过常规实验来确定。

如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......构成”、“基本上由......构成”、和“由......构成”；“主要由......构成”、“基本上由......构成”和“由......构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

本发明的多肽及其编码基因

LPTS是第一个被发现可以直接和人端粒酶催化亚基hTERT结合并抑制端粒酶催化活性的蛋白。本发明人以全长的LPTS蛋白为基础，预测并筛选了多种LPTS序列片段，经过反复研究比较，发现LPTS蛋白抑制端粒酶的活性区域可以缩小到该蛋白的第290-328位氨基酸序列区域内，该位置才是抑制端粒酶催化活性的最关键区域，其足以发挥抑制端粒酶催化活性的作用，从而获得了本发明的多肽。

为了验证所述的多肽的功能，本发明人在体外通过基因工程技术表达了GST-LPTS_290-328融合蛋白。在本发明的一个实施例中，采用测定端粒酶活性的TRAP(telomeric repeat amplification protocol)实验技术，检测了GST-LPTS_290-328融合蛋白在体外抑制肿瘤细胞端粒酶的活性。该方法是一种基于PCR技术的端粒酶活性检测方法，端粒酶来源于一种肝癌细胞裂解液。检测结果发现GST-LPTS_290-328有很强的抑制端粒酶的活性。为此，本发明人进一步比较了GST-LPTS_290-328与GST-LPTS和GST-LPTS_133-328蛋白的活性。检测结果表明GST-LPTS和GST-LPTS_133-328蛋白在50nM的时候显示有抑制端粒酶的活性，100nM的时候抑制活性较强，但不能完全抑制反应体系中的端粒酶；而LPTS_290-328在50nM的时候抑制活性已很强，在100nM的时候可完全抑制体系中的端粒酶活性。以上结果说明LPTS_290-328具有比全长LPTS和LPTS_133-328更强的端粒酶抑制活性，是LPTS蛋白抑制端粒酶活性的功能域。

为了检测LPTS_290-328在体内抑制肿瘤细胞的活性，在本发明的一个实施例中，构建了LPTS_290-328、LPTS与绿色荧光蛋白GFP融合的真核表达质粒，GFP-LPTS_290-328和GFP-LPTS。在肝癌BEL7404细胞中分别转染GFP-LPTS_290-328，GFP-LPTS以及对照GFP表达质粒，经2周的G418筛选之后，分别采用流式细胞仪FACS分选出有绿色荧光蛋白表达的细胞，然后进行传代培养。分选得到的GFP-LPTS_290-328/7404，GFP-LPTS/7404，GFP/7404细胞，利用兔源anti-GFP多克隆抗体进行western blot检测，发现都可以稳定表达相应的蛋白。在细胞传代培养的过程中，GFP-LPTS_290-328/7404细胞的生长较GFP-LPTS/7404和GFP/7404的要慢。本发明人选取FACS分选后倍增5代的上述稳定细胞株，进行了MTT试验，并绘制生长曲线。结果证明，与对照GFP/7404细胞相比较，GFP-LPTS_290-328/7404细胞生长最慢，GFP-LPTS/7404渐次。说明LPTS_290-328抑制肿瘤细胞的生长能力较其全长蛋白LPTS要强。在肿瘤细胞中过表达LPTS蛋白，可以导致细胞生长变慢、变扁平、进入危机期，最终死亡。但这是一个较长期的效应，一般需要培养6周后出现。细胞在转染LPTS_290-328后，很快发生死亡，经2周的G418筛选之后只能获得少量细胞进行FACS分选，分选获得的LPTS_290-328/7404细胞继续培养10天左右，就相继出现衰老症状，并且很快就全部变圆后脱壁死亡。结果说明过表达LPTS_290-328导致肿瘤细胞死亡的能力很强，可能比LPTS全长蛋白抑制肿瘤的效率要高，更有应用价值。

为了证明LPTS_290-328抑制肿瘤细胞是靶向抑制细胞端粒的合成，在本发明的一个实施例中，采用Southern Blot方法检测了GFP-LPTS_290-328/7404，GFP-LPTS/7404，GFP/7404细胞端粒的长度。实验结果表明，对照GFP/7404细胞传代过程中端粒保持稳定，长度在4.5kb左右；GFP-LPTS/7404细胞在传代过程中端粒逐渐缩段，在培养第5代时端粒缩短至3.8kb左右，第25代的时候端粒缩短到2.8kb左右；GFP-LPTS_290-328/7404细胞传代时间短，培养过程中细胞死亡多，在第8代时端粒已经缩短至2.5kb左右了。结果说明，LPTS_290-328有着非常强的端粒酶抑制活性，其在细胞体内能抑制端粒的合成和延伸，是一种靶向抑制端粒酶的肿瘤抑制肽。

由于本发明揭示了抑制端粒酶催化活性的最关键区域，因此可以理解，一些蛋白(比如一些包含有本发明的多肽的融合蛋白)，只要它们包含有该最关键区域、且不包含影响该关键区域结构或活性的因素(可通过有限次实验方便地验证)，也将具有抑制端粒酶催化活性的作用，这些蛋白也被包含在本发明中。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括所述多肽的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明所述多肽相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

本发明还包括具有与所述多肽相同功能的、SEQ ID NO：1序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-10个，较佳地1-5个，更佳地1-3个，最佳地1-2个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为10个以内，较佳地为5个以内，更佳地为3个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括所述多肽的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与所述多肽杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗所述多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含所述多肽或其片段的融合蛋白。

发明还提供所述多肽或多肽的类似物。这些类似物与天然所述多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“所述多肽保守性变异多肽”指与SEQ ID NO：1的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多5个，更佳地至多3个，最佳地至多2个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明所述多肽的用途包括(但不限于)：直接做为药物治疗端粒酶异常激活相关的疾病(如肿瘤)。

含有或偶联有所述多肽的融合分子也包括在本发明中。例如，可构建本发明的多肽与靶向分子的融合分子；该种融合分子由于包含了靶向于特定组织或器官的分子而可实现在局部区域增加药物的浓度，而不影响其它区域；所述的靶向分子例如是：抗体、配体等。又例如，可构建本发明的多肽与多聚分子的融合分子；该融合分子的半衰期增长；所述的多聚分子例如是IgG Fc。

含有所述多肽的编码序列的融合基因也包括在本发明中。例如，可构建含有所述多肽的编码序列以及组织或器官特异性启动子(两者操作性连接)的融合基因，所述基因当施加于体内后，被启动子驱动在特定的组织或器官内表达。

本发明还包含一些复合物，该复合物含有本发明的多肽，以及与本发明的多肽相连接或偶联的其它功能性蛋白或分子。这些功能性蛋白(有5-500个；较佳地5-300个；更佳地10-250个氨基酸)包括但不限于：穿膜蛋白，GST蛋白(纯化标签)，GFP蛋白(报告蛋白)，人血清白蛋白(延长半衰期)，人IgG1：Fc片段(延长半衰期)等。其它分子还可以是选自以下的物质：蛋白活性促进剂、蛋白活性稳定剂、延长蛋白半衰期的制剂。所述的延长蛋白半衰期的制剂例如是PEG(可用于与本发明的多肽的氨基端或羧基端联接)，PEG-脂质体(可用于包埋本发明的多肽)，所述的PEG的分子量可以是1000-50000；较佳地20000-40000。

作为本发明的一种实施方式，所述的多肽可与一些对于穿透细胞膜有效的分子融合或偶联，从而更方便地进入到细胞内发挥作用。已知的穿膜蛋白有许多种，包括：反式激活蛋白TAT、Penetratin、基于信号序列的肽、pVEC、Transportan、Amphiphilic model peptide和Arg9等等。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％ SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％ Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO：2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码本发明所述多肽的多聚核苷酸。

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；230：1350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

载体和细胞

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的本发明的多肽。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码所述多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，本发明的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明的多核苷酸序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

作为本发明的一个具体实施方式，主要通过PCR扩增获得LPTS_290-328基因序列，通过特异设计引物从模板pT-LPTS质粒扩增。将LPTS_290-328基因片段，插入pGEX-4T-1质粒，该质粒可表达GST荧光蛋白，得到pGEX-LPTS_290-328重组质粒。将pGEX-LPTS_290-328重组质粒转化表达宿主菌E.coli BL-21(DE3)，从而得到GST-LPTS_290-328融合蛋白表达工程菌。GST-LPTS_290-328在大肠肝菌中通过IPTG进行诱导表达，使用商品化的亲和纯化柱GS-4B进行GST-LPTS_290-328融合蛋白的纯化制备。

组合物

本发明还提供了包含本发明的多肽的各种组合物，特别是药物组合物。该组合物可用于预防或治疗端粒酶异常激活相关疾病，所述疾病包括(但不限于)：肿瘤。

包含本发明的多肽的各种组合物可以包含按多肽的实际用途所选用的缓冲剂；还可包含适用于预定用途的其它物质。本领域技术人员都善于选择合适的缓冲剂，本领域已知有多种缓冲剂适用于预定用途。在有些实例中，该组合物可含有药学上可接受的赋形剂，本领域已知有多种而无需在此详细讨论。药学上可接受的各种赋形剂在多种出版物已有详述，包括如“Remington’sPharmaceutical Sciences”(《雷明顿药物科学》，第19版(1995)Mack PublishingCo.)。

可将本发明的组合物制备成各种剂型，如注射剂、粒剂、片剂、丸剂、栓剂、胶囊、悬浮液、喷雾、栓剂、透皮药物(如贴片等)、油膏、洗剂等。适用于口服或局部使用的药用级别的有机或无机载体和/或稀释剂，可用于配制包含治疗活性化合物的各种组合物。本领域已知的稀释剂包括水性介质、植物性和动物性油和脂肪。还可用稳定剂、润湿剂和乳化剂、改变渗透压的盐类或维持合适pH值的各种缓冲剂和皮肤渗透增强剂等作为辅助性材料。

给予本发明组合物的常规和药学上可接受的途径包括：肌内、皮下、皮内、肺内、静脉内、瘤内、经鼻、经口服或其它肠胃外给药途径。如果需要可以组合给药途径，或按疾病情况进行调节。可以单剂量或多剂量给予。

所选用的多肽的量，是按可产生抑制端粒酶活性的效果而无明显的副作用的量而定。通常，给予约0.01μg-10mg多肽/kg体重，优选0.1μg-1mg多肽/kg体重，更优选0.1μg-100μg多肽/kg体重。

药盒

本发明还提供了一种防治端粒酶异常激活相关疾病的药盒，其中含有本发明的多肽或含有该多肽的组合物。此外，为了方便给药，所述的药盒中还可含有注射用的针，和/或药学上可接受的载体，和/或使用说明书。

本发明的优点：

1、首次发现LPTS_290-328在体外具有非常显著的端粒酶抑制活性，而且是LPTS中已知的具有端粒酶抑制能力最强的区域。

2、首次发现异源表达LPTS_290-328可以抑制肿瘤细胞生长，导致细胞端粒缩短并最终死亡。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1、LPTS_290-328基因片段的制备

pT-LPTS质粒的构建：设计引物L1：5’-AGGAATTCATGTCTATGCTGGCTGAACG-3’(SEQ ID NO：3)；和L2：5’-ACGCTCGAGCTTTGGAATCTTTCTTCTTCT-3’(SEQ ID NO：4)。利用该对引物从正常人肝组织中反转录PCR扩增获得LPTS全长cDNA片段。PCR产物装入pMD-18T载体(购自TaKaRa公司)，从而获得pT-LPTS质粒。

LPTS_290-328基因片段通过PCR方法从pT-LPTS质粒扩增(该质粒含有LPTS基因全长cDNA片段)。设计PCR引物P1：5’-AGGAATTCACCCTGAAGCCCAAAAAGAGG-3’(SEQ ID NO：5)和P2：5’-ACGCTCGAGCTTTGGAATCTTTCTTCTTCTTCT-3’(SEQ ID NO：6)。以pT-LPTS质粒为模板，用引物P1和P2进行PCR反应。PCR反应条件为：94℃ 30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，共扩增30个循环。PCR扩增后得到的DNA产物经DNA测序确定无误后，即获得LPTS_290-328基因片段，用于后续GST融合蛋白和真核表达质粒的构建。该LPTS_290-328基因序列所编码的氨基酸序列见SEQ ID NO：1。

作为对照用的LPTS_133-328基因片段通过上述相同方法获得，PCR引物为P3：5’-ACGCTCGAGAAGGATCTGTCATCTCGG-3’(SEQ ID NO：7)和P2。LPTS基因序列从质粒pT-LPTS中通过EcoR I和Xho I双酶切后得到，该基因片段编码的蛋白对应于LPTS蛋白的全长。

实施例2、GST-LPTS_290-328融合蛋白表达工程菌的构建和诱导

实施例1中得到的LPTS_290-328基因片段和LPTS_133-328基因片段均经EcoR I和Xho I双酶切，然后插入pGEX-4T-1质粒(购自Amersham Pharmacia公司)，该质粒能表达GST蛋白。实施例1中得到的LPTS基因片段可直接插入pGEX-4T-1质粒，获得pGEX-LPTS_290-328、pGEX-LPTS_133-328和pGEX-LPTS重组质粒。将这三种重组质粒分别转化宿主菌E.coli DH5α，再从E.coli DH5α转化菌株中抽取质粒，测序验证无误后再转化蛋白表达宿主菌E.coli BL-21(DE3)，从而得到GST-LPTS_290-328、GST-LPTS_133-328和GST-LPTS融合蛋白表达工程菌株。

GST-LPTS_290-328在大肠肝菌BL-21(DE3)中的诱导表达。含pGEX-LPTS_290-328质粒的融合蛋白表达工程菌先37℃过夜扩增培养，第二天按照1∶100比例接种于400毫升含Amp^r抗生素的LB培养基中，37℃继续培养至OD600约等于0.6时加入IPTG至终浓度0.5mM，37℃诱导表达3-4小时。5000rpm，10分钟离心收集菌体，弃上清，剩下的菌体保存于-80℃备用。该菌体含有目标GST-LPTS_290-328融合蛋白(见图1)。采用同样的方法，本发明人诱导表达了GST-LPTS_133-328和GST-LPTS融合蛋白。GST以及上述融合蛋白的结构示意图见图2A。

图1是10％ SDS-PAGE胶电泳后考马斯亮蓝染色后的结果，泳道1为IPTG诱导前的工程菌，泳道2为IPTG诱导后的工程菌，在40kD处有特异条带被诱导出，为GST-LPTS_290-328蛋白。

实施例3、GST-LPTS_290-328融合蛋白的纯化制备

GST-LPTS_290-328融合蛋白的纯化制备使用商品化的亲和纯化柱GS-4B(购自Sigma公司)进行。该亲和纯化柱为还原性谷胱苷肽GSH和Sepharose 4B耦合而成，上样前先按照厂商说明装填至终体积2毫升左右，并用20～30ml溶液A(20mM Tris-HCl pH7.4，0.2mM EDTA，1mM DTT，0.5mM PMSF，1MNaCl)平衡。实施例2中最终获得的菌体用10ml溶液A重悬，超声波破碎细菌(超声仪为宁波新芝制造)，超声条件如下：工作时间7秒，间隙时间25秒，工作功率400W，工作次数20-30次)。超声后的菌体液加入TritonX-100至终浓度1％，冰上放置30分钟；然后12000rpm，4℃下离心10分钟，离心后的上清转移到新的离心管继续重复离心一次；再次离心后得到的含融合蛋白的上清液，连到平衡好的GS-4B纯化柱，在压力差下过柱；样品过柱完后，用20～30ml溶液A洗柱子；然后继续用20～30ml溶液B(20mM Tris-HCl pH7.4，0.2mMEDTA，0.1M NaCl)洗柱子；最终用5ml溶液C(15mM还原型谷胱苷肽GSH，20mM Tris-HCl pH7.4，0.2mM EDTA，0.1M NaCl)洗脱蛋白，共收集3管，每管约1.5毫升，收集的纯化后蛋白可于-80℃保存备用。采用同样的方法，本发明人纯化获得了GST-LPTS_133-328和GST-LPTS蛋白备用。

图1中泳道3，4，5为洗脱收集到的3管蛋白。可以看到，纯化后得到的GST-LPTS_290-328蛋白条带单一，纯度可以达到95％以上，可以用来做进一步的应用。收集到的GST-LPTS_290-328蛋白经Bradford法测定浓度。

实施例4、GST-LPTS_290-328融合蛋白抑制端粒酶活性的检测以及与GST-LPTS，GST-LPTS_133-328蛋白抑制活性的比较

为了检测GST-LPTS_290-328融合蛋白抑制端粒酶的活性，本发明人采用了体外TRAP实验。TRAP(telomeric repeat amplification protocol)是一种基于PCR技术的端粒酶活性检测方法。首先制备含有端粒酶的肝癌BEL7404细胞裂解液，将处于对数生长旺盛期的BEL7404细胞(购自中国科学院上海细胞库)用Washing Buffer(10mM Hepes-KOH pH7.5，1.5mM MgCl₂，10mM KCl，1mMDTT)洗2遍；每10⁶个细胞用1毫升冰预冷的Lysis Buffer(10mM Tris-HCl pH7.5，1mM MgCl₂，1mM EGTA，0.1mM PMSF，5mM巯基乙醇，0.5％ CHAPS，10％ glycerol)重悬，置冰上裂解30分钟；然后15000rpm，4℃高速离心30分钟，得到的上清即为含有端粒酶的肝癌BEL7404细胞裂解液。该细胞裂解液可保存在-80℃冰箱。

TRAP反应先取1μL细胞裂解液，加入GST-LPTS_290-328蛋白或者其他待测定蛋白，冰上混合10分钟；然后再加入1μL Ts引物(0.1μg/μL，序列为5’-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3’)，0.25μL 10mM dNTP，42μL反应缓冲液(20mM Tris-HCl pH8.3，1.5mM MgCl₂，63mM KCl，0.005％ Tween-20，1mMEGTA，0.1mg/ml BSA)，以上总体积一共为50μL；然后在25℃下延伸反应30分钟，90℃灭活3分钟；再加入1μL Cx引物(序列为5’-GCGCGG(CCCTTA)3CCCTAA-3’)，0.5μL(2U)Taq酶，进行PCR反应(94℃ 40秒，50℃退火40秒，72℃延伸1分钟，扩增30个循环)；PCR产物进行10％ PAGE非变性胶分离后银染显色。显色结果中条带越多说明体系中的端粒酶活性越高，反之说明体系中的端粒酶活性被抑制的越多。

图2B为TRAP实验结果，从图中可以看出GST-LPTS和GST-LPTS_133-328蛋白在50nM的时候显示有抑制端粒酶的活性，100nM的时候抑制活性较强，但不能完全抑制反应体系中的端粒酶；而GST-LPTS_290-328在50nM的时候抑制活性已很强，在100nM的时候可完全抑制体系中的端粒酶活性。

以上结果说明，LPTS_290-328具有比全长LPTS和LPTS_133-328更强的端粒酶抑制活性，是LPTS蛋白抑制端粒酶活性的功能域。

实施例5、LPTS_290-328抑制肝癌细胞BEL7404的生长并导致其死亡

为了检测LPTS_290-328在体内抑制肿瘤细胞的活性，本发明人构建了LPTS_290-328、LPTS与绿色荧光蛋白GFP融合的真核表达质粒。具体操作如下：将实施例1中得到的LPTS_290-328基因片段，经EcoR I和Xho I双酶切后插入pEGFP-C2质粒(购自Clontech)，得到pEGFP-LPTS_290-328表达质粒。利用EcoRI和Xho I双酶切pT-LPTS质粒得到LPTS基因cDNA片段，同样插入pEGFP-C2质粒，得到pEGFP-LPTS表达质粒。pEGFP-C2可表达GFP蛋白作为对照。上述质粒转染BEL7404细胞后可以表达相应的蛋白。

在肝癌BEL7404细胞中分别转染GFP-LPTS_290-328，GFP-LPTS以及对照GFP表达质粒，经2周的G418筛选之后，分别采用流式细胞仪FACS分选出有绿色荧光蛋白表达的细胞，然后进行传代培养。分选得到的GFP-LPTS_290-328/7404，GFP-LPTS/7404，GFP/7404细胞，利用兔源anti-GFP多克隆抗体进行Western Blot检测，发现都可以稳定表达相应的蛋白，如图3A中所显示。

在细胞传代培养的过程中，GFP-LPTS_290-328/7404细胞的生长较GFP-LPTS/7404和GFP/7404的要慢。本发明人选取FACS分选后倍增5代的上述稳定细胞株，进行了MTT试验，并绘制生长曲线。结果证明，与对照GFP/7404细胞相比较，GFP-LPTS_290-328/7404细胞生长最慢，GFP-LPTS/7404渐次，见图3B。

说明LPTS_290-328抑制肿瘤细胞的生长能力较其全长蛋白LPTS要强。

在肿瘤细胞中过表达LPTS蛋白，可以导致细胞生长变慢、变扁平、进入危机期，最终死亡。这是由于LPTS蛋白抑制了肿瘤细胞的端粒酶活性，使细胞的端粒不能延伸而变短，导致细胞衰老而死亡。但这是一个较长期的效应，一般需要培养6周后出现。但细胞在转染LPTS_290-328后，很快发生死亡，经2周的G418筛选之后只能获得少量细胞进行FACS分选，分选获得的LPTS_290-328/7404细胞继续培养10天左右，就相继出现衰老症状，并且很快就全部变圆后脱壁死亡，见图3C。

以上结果说明，过表达LPTS_290-328导致肿瘤细胞死亡的能力很强，比LPTS全长蛋白抑制肿瘤的效率要高，更有应用价值。

实施例6、LPTS_290-328缩短肝癌BEL7404细胞端粒长度

为了证明LPTS_290-328抑制肿瘤细胞是靶向抑制细胞端粒的合成，本发明人采用Southern Blot方法检测了GFP-LPTS_290-328/7404，GFP-LPTS/7404，GFP/7404细胞端粒的长度。采用FACS分选后后的细胞，按图4A所示的培养代数收集细胞，抽取细胞的基因组DNA，用Hinf I和Afa I内切酶消化后，与同位素标记的³²P-(TTAGGG)₆探针杂交，该探针为端粒单链DNA重复序列(TTAGGG)，分析细胞的端粒长度。端粒长短视放射自显影后的条带灰度以及处于的位置综合判断，条带离上端加样孔的位置越近，对应细胞的端粒越长。从图4A中可以看到，对照GFP/7404细胞传代过程中端粒保持稳定，长度在4.5kb左右；GFP-LPTS/7404细胞在传代过程中端粒逐渐缩短，在培养第5代时端粒缩短至3.8kb左右，第25代的时候端粒缩短到2.8kb左右；GFP-LPTS_290-328/7404细胞传代时间短，培养过程中细胞死亡多，在第8代时端粒已经缩短至2.5kb左右了(图4B)。

结果说明，LPTS_290-328有着非常强的端粒酶抑制活性，其在细胞体内能靶向抑制端粒的合成和延伸。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种分离的多肽，其特征在于，所述多肽是：

(a)包含SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的多肽；

(b)SEQ ID NO：1氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；或

(c)与(a)限定的多肽序列有90％以上相同性且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽。

2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它含有一核苷酸序列，该核苷酸序列编码权利要求1所述的多肽。

3.一种载体，其特征在于，它含有权利要求2所述的多核苷酸。

4.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求3所述的载体。

5.一种权利要求1的多肽的制备方法，其特征在于，该方法包括：

(a)在适合表达的条件下，培养权利要求4所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出权利要求1的多肽。

6.权利要求1所述的多肽的用途，用于制备抑制细胞内端粒酶活性的组合物。

7.如权利要求6所述的多肽的用途，所述的组合物用于防治端粒酶异常激活相关疾病。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的端粒酶异常激活相关疾病是肿瘤。

9.一种复合物，所述的复合物包含权利要求1所述的多肽，以及与该多肽相容的物质。

10.如权利要求9所述的复合物，其特征在于，所述的复合物是融合蛋白，权利要求1所述的多肽与至少一条功能性蛋白相连接，所述的功能性蛋白有5-500个氨基酸。

11.如权利要求9所述的复合物，其特征在于，所述的复合物包含选自以下的物质：蛋白活性促进剂、蛋白活性稳定剂、延长蛋白半衰期的制剂。

12.一种组合物，其特征在于，它含有安全有效量的权利要求1所述的多肽或权利要求9所述的复合物，以及药学上可接受的载体。

13.一种制备组合物的方法，所述组合物抑制细胞内端粒酶活性，所述方法包括：将安全有效量的权利要求1所述的多肽或权利要求9所述的复合物与药学上可接受的载体混合。

14.一种药盒，其特征在于，所述药盒中含有权利要求1所述的多肽；或含有权利要求9所述的复合物；或含有权利要求12所述的组合物。