CN1254484C - 醋酸奥曲肽的固相合成方法 - Google Patents

Abstract

本发明的醋酸奥曲肽的固相合成方法属多肽合成领域。首先将缩醛化产物与高分子树脂键合；将键合后的产物按顺序与保护氨基酸残基依次键合并脱保护得到八肽树脂；将八肽从树脂上切落后制成水溶液，并在空气中自然氧化后制成奥曲肽；向奥曲肽水溶液中加入冰醋酸后冻干，制成醋酸奥曲肽。本发明合成工艺简单，容易操作，工艺时间缩短，反应配比小，节约原料，降低了成本，而且产率和纯度提高，副反应和副产物少，便于纯化，有益于大批量生产。

Description

醋酸奥曲肽的固相合成方法

技术领域

本发明涉及一种多肽的合成领域，尤其是一种醋酸奥曲肽的固相合成方法。

背景技术

醋酸奥曲肽的结构是一含有7个氨基酸残基和1个苏氨醇的多肽。醋酸奥曲肽(Octreotide Acetate)主要临床应用于以下疾病的治疗：肝硬化所致食道-胃静脉曲张出血的紧急治疗，与特殊治疗(如内窥镜硬化剂治疗)合用、消化性溃疡及应急性溃疡、急性胰腺炎、急性胰腺炎、预防胰腺术后并发症、经手术、放射治疗或多巴胺受体激动剂治疗失败的肢端肥大症患者，可控制症状、降低生长激素及生长素介质C的浓度。亦适用于不能或不愿手术的肢端肥大症患者，以及放射治疗尚未生效的间歇期患者。

在最近醋酸奥曲肽及其类似物的合成专利文献里，主要采用液相合成方法。2002年6月26日公开的中国发明专利(CN1355173A)就是醋酸奥曲肽的液相合成方法，其片段分为N-端三肽和N-端五肽，保护策略为BOC(叔丁氧羰基)/BZL(苄基)策略，其接肽方法主要采用HOBt-DCC方法。

综合参考国内外关于奥曲肽的合成方法特点，我们系统的探索了有关报道的固相奥曲肽合成方法和国内文献关于奥曲肽液相合成方法，得出技术中的方法存在着一些不足，主要表现为：1.液相合成中制备时间长，每一步产品需要进一步纯化，并且在最后的转盐过程耗时且浪费有机溶剂。2.Boc-HF脱保护系统反应条件剧烈，而且HF具有强腐蚀性污染环境。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种合成工艺简单、反应条件温和、反应时间短、配比小、成本低、产率高、设备简单、便于操作、环境污染小、有益于大批量生产的合成方法，该方法克服了现有制备醋酸奥曲肽技术中的不足。

本发明中醋酸奥曲肽的固相合成方法步骤如下：

将把柄化合物Fmoc-Thr-ol与树脂键合成如下式：

将其与保护氨基酸残疾按顺序依次反应，连接后生成带保护八肽树脂

然后与TFA溶液反应，脱保护得到直链八肽

D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol

将所得八肽制成水溶液后经过空气氧化，得到奥曲肽。

将奥曲肽水溶液加入适量冰醋酸，得到醋酸奥曲肽，将所得醋酸奥曲肽经冷冻干燥，制得醋酸奥曲肽干粉。

本发明的醋酸奥曲肽的固相合成方法简述为，过程包括：合成八肽；将八肽制成水溶液在空气中自然氧化后制成奥曲肽；向奥曲肽水溶液中加入冰醋酸后冻干，制成醋酸奥曲肽冻干粉。所说的合成八肽的过程是：将芴甲氧羰基苏胺醇与对羧基苯甲醛反应生成芴甲氧羰基苏胺醇对羧基苯缩醛，将其键合在高分子树脂载体上，然后按顺序与保护氨基酸残基依次键合后得到八肽树脂，将八肽从树脂上切落。

所说的树脂，是高分子树脂载体，可以是氨基AM树脂(Rink Amide-AMResin)或氨基MBHA树脂(Rink Amide-MBHA Resin)。

在本发明中使用的缩写具有下面的含义：

Phe：苯丙氨酸

Cys：半胱氨酸

Trp：色氨酸

Lys：赖氨酸

DCM：二氯甲烷

DMF：N，N-二甲基甲酰胺

DCC：二环己基碳二亚胺

HOBt：1-羟基苯骈三唑

Boc：叔丁氧羰基

Fmoc：芴甲氧羰基

Trt：三苯甲基

tBu：叔丁基

2-Cl-Z：2-氯苄基

Acm：乙酰胺甲基

HPO₃Bzl：偏磷酸苄基

Acetal：缩醛

NMP：N-甲基吡咯烷酮

TFA：三氟乙酸

THF：四氢呋喃

TsOH：对甲苯磺酸

HBTU：O-(Benzotriazol-1-yl)-N，N，N，N-tetramethyl uroniumhexafluorophosphate

Lys：赖氨酸

Thr：苏氨酸

Fmoc-Thr-OH：芴甲氧羰基苏胺酸

Fmoc-Thr-ol：芴甲氧羰基苏胺醇

Fmoc-Thr-ol-Acetal：芴甲氧羰基苏胺醇对羧基苯缩醛

根据本发明更具体地讲，本发明醋酸奥曲肽制备方法中的合成路线如下：

制备缩醛化产物：将Fmoc-Thr-ol、对羧基苯甲醛和对甲苯磺酸(摩尔比为1∶1.0～2.0∶0.1～0.5)溶于无水氯仿，于油浴中加热回流反应，用TLC监测反应，待反应完全后将反应液减压浓缩去除溶剂，得到把柄化合物。

其中Fmoc-Thr-ol可以直接使用，也可以通过合成制得。

缩醛化反应中使用的对甲苯磺酸是催化剂。

接树脂：将氨基树脂、缩醛化产物、DCC、HOBt(摩尔比为1∶1.0～2.2∶1.0～2.2∶1.0～2.2)溶于NMP中于固相反应器中搅拌反应60～90分钟，然后洗涤，脱掉保护，通气充分搅拌反应6～10小时。

采用DCC/HOBt法，反应速度快、产率高、效果好。

按顺序逐步接肽；将HOBt、HBTU分别和保护氨基酸残基(摩尔比为1∶1.0～22∶1.0～2.2∶1.1～1.8)依次加入到固相反应器内，有所不同的是：二肽保护氨基酸残基为Fmoc-Cys(Trt、Acm、OtBu、tBu)；三肽所用的保护氨基酸残基为Fmoc-Thr(tBu、Trt、HPO₃Bzl)-OH；四肽所用的保护氨基酸残基为Fmoc-Lys(Boc、Ac、2-Cl-Z)-0H；五肽所用的保护氨基酸残基为Fmoc-D-Trp(Boc)-OH；六肽所用的保护氨基酸残基为Fmoc-Phe-OH；七肽所用的保护氨基酸残基为Fmoc-Cys(Trt、Acm、OtBu、tBu)-OH；八肽所用的保护氨基酸残基为Fmoc-D-Phe-OH。

这里的保护氨基酸均为芴甲氧羰基保护。

切肽：向装有完成八肽合成树脂的固相反应器中加入上述三氟乙酸溶液，通入氮气室温反应2小时，将反应液旋转蒸发仪浓缩后，经过重结晶后即可制成八肽。

氧化八肽：将八肽溶解于水中，浓度配成0.1～10mmoL/mL，用氨水调节pH＝7.0～7.5，电磁搅拌器搅拌、室温反应24～72小时，即可保证反应充分完全。

冻干：向奥曲肽溶液中加入一定量的冰醋酸，使冰醋酸在奥曲肽水溶液中的浓度是1～10％，然后经过冷冻干燥，制成醋酸臭曲肽。

与已有的醋酸奥曲肽合成方法相比，本发明中醋酸奥曲肽固相合成策略具有以下优点：

1)在缩醛化产物与树脂键合时，采用DCC/HOBT为催化缩合剂，该方法反应速率快、产率高、副反应少。

2)在接肽过程中，采用HOBt、HBTU为催化缩合剂进行接肽反应，该方法结合率高、副产物少、反应时间短、以及减少消旋等特点，此方法达到最小保护策略，可以放大量合成。

3)本发明固相合成中加入的各保护氨基酸残基摩尔配比为1.0～1.8，节约原料，且收率稳定；

4)氧化过程中采用水溶液，并且浓度为0.1～1mmol/ml，这样避免了液相合成中体积过大。

5)奥曲肽的转盐采用在经过HPLC分纯后直接加入冰醋酸的方法，这样节省溶剂且省时。

因此我们认为开发新的制备醋酸奥曲肽的方法是必要的。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明中醋酸奥曲肽的固相合成方法做进一步说明。

实施例1：Fmoc-Thr-ol-Acetal的合成

将Fmoc-Thr-ol(3.28g)加入四口烧瓶中，用无水氯仿(200ml)溶解，加入对羧基苯甲醛1.90g，并加入对甲苯磺酸100mg，然后于60℃水浴加热回流反应，TLC监测，反应完全后，于旋转蒸发仪上减压浓缩去除溶剂，得到淡黄色粘稠物。将粘稠物稀释后，上硅胶层析，用展开液二氯甲烷∶乙酸乙脂(3∶1)，收集溶液，蒸馏后得产物3.0g。

其中Fmoc-Thr-ol可以直接使用，也可以通过下面实施例方法制得：

Fmoc-Thr-OH(7.5g)加入到100ml THF中溶解，然后加入氯甲酸乙酯3.1mL、NMM3.5mL，并于0℃下反应10min，然后加入NaBH₁1.50g，反应10min后于0℃下搅拌反应3h，加入1N HCl(230ml)，然后用DCM萃取二次(每次150ml)，合并有机相，用无水Na₂SO₄干燥，旋转蒸除溶剂，重结晶得白色粉末4.8g。

实施例2第一肽的合成

1)将缩醛化产物(3.4g)、DCC(1.2g)、HOBt(1.6g)于冰浴下加入NMP(30ml)，电磁搅拌，室温反应1小时。

2)将树脂(5.00g)置于固相反应器中，加入二氯甲烷/二甲基甲酰胺＝1/1 30ml溶剂，并通入高纯氮气搅拌60分钟。

3)将缩醛化产物的反应液加入到固相反应器中，通气搅拌，室温反应16小时。

实施例3：第二肽的合成

1)将反应溶液用气体通过废液出口压出，用二氯甲烷清洗，然后向固相反应器内树脂中加入二氯甲烷30mL、乙酸酐1.5mL吡啶1.5mL，搅拌室温反应2小时。

2)将反应溶液用气体通过废液出口压出，用二氯甲烷清洗，然后加入六氢吡啶、二甲基甲酰胺各15mL，室温反应1小时。

3)将反应溶液用气体通过废液出口压出，用二氯甲烷清洗，然后将Fmoc-Cys(Trt)-OH(4.34g)、HOBt(1.10g)、HBTU(3.10g)加入到装有上步反应树脂的固相反应器中，向其中加入NMP(30ml)，同时通入氮气，室温过夜反应16小时。

实施例4：第三～八肽的合成：

反应步骤同实施例3，所不同的是：

三肽所用的保护氨基酸残基为Fmoc-Thr(tBu)-OH(2.94g)。

四肽所用的保护氨基酸残基为Fmoc-Lys(Boc)-OH(3.47g)。

五肽所用的保护氨基酸残基为Fmoc-D-Trp(Boc)-OH(3.90g)。

六肽所用的保护氨基酸残基为Fmoc-Phe-OH(2.87g)。

七肽所用的保护氨基酸残基为Fmoc-Cys(Trt)-OH(4.34g)。

八肽所用的保护氨基酸残基为Fmoc-D-Phe-OH(2.87g)。

实施例5：直链八肽的制备

1)反应溶液用气体通过废液出口压出，用二氯甲烷清洗，然后向固相反应器内树脂中加入二氯甲烷30mL、乙酸酐1.5mL吡啶1.5mL，搅拌室温反应2小时。

2)反应溶液用气体通过废液出口压出，用二氯甲烷清洗，然后加入六氢吡啶、二甲基甲酰胺各15mL，室温反应1小时。

3)苯酚(8.0g)、茴香硫醚(6.0ml)、乙二硫醇(6.0ml)、三氟乙酸(70ml)，加入到三角瓶中，充分震荡后，放入冰浴中保存1小时。然后将其加入装有完成八肽合成树脂的固相反应器中，通入氮气，室温反应2小时。使用气体将反应液体压出。

4)液用旋转蒸发仪浓缩后，加入冰乙醚(200ml)，有白色沉淀产生，过滤收集沉淀，真空干燥10小时以上。收集干燥后白色沉淀(3.1克)，装于棕色玻璃瓶中密闭于-20℃条件下保存。

实施例6：奥曲肽的氧化：

将实施例6所得到的含有杂质的还原型奥曲肽溶解于水中，使还原型奥曲肽的终浓度达到0.1～10mmol/ml，使用1M氨水调节pH＝7.0～7.5，电磁搅拌器搅拌、室温反应24～72小时，用分析型HPLC监测氧化反应是否完全。

实施例7：奥曲肽的分离纯化

将氧化后的溶液，使用0.8um膜过滤。

流动相A：0.1％TFA/水

流动相B：0.1％TFA/65％乙腈/水

流速20ml/min

分离纯化梯度条件：

流动相A	开始时间min	开始浓度％	结束时间min	结束浓度％
					流动相A	0.00	60	35	20
流动相A	35	20	40	60
					流动相A	40	60	60	100

收集主产物峰(保留时间为18分钟左右)。

实施例8：醋酸奥曲肽的制备

将收集的奥曲肽产物溶液，使用旋转蒸发仪于40℃进行浓缩。去除乙腈，旋蒸至无液体流出，得到纯奥曲肽溶液。准确量出体积后，加入冰乙酸使其浓度达到1-10％，电磁搅拌30分钟，进行冻干。得到奥曲肽的醋酸盐1.13g，产率33.3％。总收率：23.44％。

经鉴定：

FAB-MS(M⁺+H)：1019.8(理论分子量为1019.3)

氨基酸顺序分析：从N-端到C-端7个氨基酸残基依次分别为：Phe、Cys、Phe、Trp、Lys、Thr、Cys。

氨基酸组分分析：

	理论值	实际值
			苯丙氨酸赖氨酸苏氨酸色氨酸比旋度：	2(1.5～2.2)1(0.4～1.1)1(0.5～1.1)1(0.4～1.1)-40°～50°	1.590.980.690.61-42.3°

由此方法合成产物经过分析确认为醋酸奥曲肽。

Claims (4)

1.一种醋酸奥曲肽的固相合成方法，过程是：合成八肽；将八肽制成水溶液在空气中自然氧化后制成奥曲肽；向奥曲肽水溶液中加入冰醋酸后冻干，制成醋酸奥曲肽冻干粉；其特征在于，所说的合成八肽的过程是：将芴甲氧羰基苏胺醇与对羧基苯甲醛反应生成芴甲氧羰基苏胺醇对羧基苯缩醛，将其键合在高分子树脂载体上，然后按顺序与保护氨基酸残基依次键合后得到八肽树脂，将八肽从树脂上切落；所说的高分子树脂载体是氨基AM树脂或氨基MBHA树脂。

2.按照权利要求1所述的醋酸奥曲肽的固相合成方法，其特征在于，缩醛化反应中使用的催化剂是对甲苯磺酸。

3.按照权利要求1或2所述的醋酸奥曲肽的固相合成方法，其特征在于，制成八肽水溶液浓度是0.1～10mmoL/mL。

4.按照权利要求1或2所述的醋酸奥曲肽的固相合成方法，其特征在于，制成醋酸奥曲肽冻干粉过程中，冰醋酸在奥曲肽水溶液中的浓度是1～10％。