CN100335497C - 一种奥曲肽的固相合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种奥曲肽的合成工艺，特别涉及一种奥曲肽的固相合成工艺。解决现有连接剂在还原切除法中需进行消旋的技术问题。本发明的技术方案为：一种奥曲肽的固相合成工艺，其合成工艺步骤如下：使用氯甲基树脂作载体，首先用氢化钠溶液及2-羟甲基-3，4-二氢吡喃在二甲乙酰胺中室温与氯甲基树脂反应，得到3，4-二氢吡喃羟甲基树脂(DHP HM Resin)，再在对甲苯磺酸吡啶盐作用下将芴甲氧羰基-(O-叔丁醚)苏氨醇(Fmoc-Thr(tBu)-ol)连到DHP HMResin上去，然后按照Fmoc/tBu固相多肽合成的方法将氨基酸逐个连上，最后用三氟醋酸∶水∶苯甲硫醚∶乙二硫醇的混合溶液将肽从树脂上切下，得到的粗品，粗品采用空气氧化法氧化形成硫硫键，经制备HPLC纯化冷冻得到奥曲肽。本发明提供了一种简单易行可规模合成奥曲肽的工艺。
Description
技术领域：本发明涉及一种奥曲肽的合成工艺，特别涉及一种奥曲肽的固相合成方法。
背景技术：1973年，Guillemin从下丘脑分离得到一种抑制生长激素(GH)分泌的物质somatostatin(STT)，它用于治疗存在许多缺陷与困难，它的半衰期短，缺乏选择性，而且注射给药也只有几分钟作用时间，所以瑞士的科研人员对其进行了结构修饰及选择，从1974年开始人工合成，经过5年后，环八肽SMS201-995—奥曲肽问世，药品名为Sandostatin，中文名为善得定。它及其类似物被广泛地应用于各种肿瘤的治疗，具有抑制作用，它还可以抑制各种消化液和消化道激素的分泌，也适用于肢端肥大症的治疗。另外，奥曲肽与DTPA偶合，并用mIn标记后，在诊断中还是一种非常有用的肿瘤造影剂，所以对于奥曲肽的人工合成也一直是个热点。
奥曲肽的结构如式1所示，是C端为羟基，含有一对硫硫键的环八肽，作为一个肽醇，奥曲肽首先被提出运用液相片断缩合法合成，Neugebauer，W.；Escher，E.Helv.Chim.Acta 1989，72，1319-1323介绍了这种液相合成法，液相合成存在制备时间长，每一步产品均需要进一步纯化并且在最后转盐过程耗时且浪费有机溶剂以及容易污染环境等缺陷，而后主要采用固相合成。固相法一般采用连接剂及还原切除的方法来获得肽醇，采用连接剂方法见Mergler，M.；Nyfeler，R.Inpeptides 1992：Schneider C.H.Eberle.A.N.，Eds.；Escom：Leiden.TheNethertands 1993；PP 177-178以及Edwards，W.B.，Fields，C.G，Anderson，C.J.，Pajeau，T.S.，Welch，M.J.，and Fields，G.B.(1994)J.Med.Chem.37，3749-3757。还原切除的方法见Wu.Y-T.；Hsieh，H.-P.；Yu，H.-M.；Chen，S.-T.；Wang，K.-T.Tetrahedron Lett.1998，39，1783-1784。麻省理工学院的Wu.Y-T.；Hsieh，H.-P.；Chen，S.-T.；Wang，K.-T.Bioorg.Med.Chem.1999，7，1797-1803，先通过SPPS合成前面带保护的七肽，而后再与苏氨醇组合，最后成形等。但是根据文献显示，合成都比较复杂而且分离产率比较低，分别为3.1％、8％、14％。近几年，随着组合化学技术的不断发展，更多树脂及连接剂的涌现与应用，为奥曲肽的合成能简单、方便、高产率提供了可能性。而在寻求比较理想的合成方法中，Yasush、Arano等人使用2-chlorotrityl chloride Resin来合成奥曲肽(合成路线见式2)，见Bauer，W.，Briner，U.，Donepfner，W.，Haller，R.，Huguenin，R.，Marbach，P.，Petcher，T.J.& Pless，J.(1982)Life Sci，31，1133-1140。更有意思的是台湾学者吴英泰等人设计的方案，Wu.Y-T.；Hsieh，H.-P.；Chen，S.-T.；Wang，K.-T.Bioorg.Med.Chem.1999，7，1797-1803和Lorin A.Thompson；Jonathan A.EllmanTetrahedron Lett.1994，35，9333-9336，使用对甲酸苯甲醛作为连接剂，灵巧的利用苏氨醇特有的双羟基形成缩醛，再缩合到Rink Amide AM resin上去(式3)。但是式2和式3的固相合成法在其还原切除法中存在消旋问题。
式1
式2
式3
发明内容：本发明的目的是提供一种奥曲肽的固相合成工艺。本发明需要解决的技术问题是：选择一种连接剂，使其满足：(1)在多肽合成中具有稳定性；(2)既可以方便地与载体连接，也可以方便地与氨基酸单体缩合；(3)同时，肽链可以在比较温和的条件下从连接剂树脂上切除。解决现有连接剂在还原切除法中会发生消旋的技术问题。本发明的技术方案为：一种奥曲肽的固相合成工艺，其合成工艺步骤如下：使用氯甲基树脂作载体，首先用氢化钠溶液及2-羟甲基-3，4-二氢吡喃在二甲乙酰胺中室温与氯甲基树脂反应，得到3，4-二氢吡喃羟甲基树脂(DHP HM Resin)，再在对甲苯磺酸吡啶盐作用下将芴甲氧羰基-(O-叔丁醚)苏氨醇(Fmoc-Thr(tBu)-ol)连到DHP HM Resin上去，然后按照Fmoc/tBu固相多肽合成的方法将氨基酸逐个连上，最后用三氟醋酸∶水∶苯甲硫醚∶乙二硫醇的混合溶液将肽从树脂上切下，得到的粗品，粗品采用空气氧化法氧化形成硫硫键，经制备HPLC纯化冷冻得到奥曲肽。
本发明中一些常用的缩写具有以下含义：
Fmoc：芴甲氧羰基
TBu：叔丁基
HOBt：1-羟基苯骈三唑
Phe：苯丙氨酸
Cys：半胱氨酸
Trp：色氨酸
Thr：苏氨酸
Lys：赖氨酸
Trt：三苯甲基
THP：四氢吡喃羟甲基
DMF：N，N-二甲基酰胺
Piperidine：六氢吡啶
Boc：叔丁氧羰基
DHP HM Resin：3，4-二氢吡喃羟甲基树脂
PPTS：对甲苯磺酸吡啶盐
THF：四氢呋喃
DCC：二环己基碳二亚胺
TFA：三氟醋酸
EDT：乙二硫醇
合成路线如下：
在DHP HM Resin加保护基反应中需将DHP HM Resin加入到新蒸的THF中浸湿20-40分钟，加Fmoc-Thr(tBu)-ol及PPTS，在惰性气体保护下，50-70℃反应12-18小时，冷却过滤，用CH2Cl2，DMF/H2O(1∶1)，DMF，CH2Cl2，Et2O洗涤，干燥。
在接氨基酸过程中，用Fmoc-AA/BOP/HOBt/DIPEA(1∶1∶1∶2)，Fmoc-AA缩合过量2-5倍，每一步缩合都经过凯撒试验(kaiser test)检测，如颜色呈阳性则重复接氨基酸，然后用20％DMF溶液脱Fmoc，最后用6-10ml/克的三氟醋酸∶水∶苯甲硫醚∶乙二硫醇(92.5∶2.5∶2.5∶2.5)的混合液将肽从树脂上切下，得到的粗品(7)产率为91.7％，HPLC为57.1％，粗品采用空气氧化法氧化形成硫硫键，其水溶液的HPLC为87.5％。从上可以看出用此方法合成奥曲肽，产率及纯度都比较理想。我们还在小试的基础上，进行了大规模的合成实验，同样取得了良好的结果。另外，此法对合成其它氨基酸类的肽醇也具有一定的意义。
本发明的有益效果是：我们选择四氢吡喃羟甲基THP作为连接剂，一方面，它在碱性条件下是稳定的，可以运用到固相Fmoc/tBu的方法中去，另一方面，氨基醇与DHP很容易连接形成THP键，而且最为重要的一点是，在用三氟醋酸切除时，可以保持醇的立体构型，避免了还原切除法中容易发生消旋的问题。
具体实施方式：实施例1，
实施工艺中仪器和试剂的选用：
HPLC：PE200-785A
ESI：PE Mariner API-TOF
IR：BIO-RAO FTS-185
元素分析仪：Heraeus CHN-O
恒温摇床：HZQ-C空气浴振荡器(哈尔滨东明医疗仪器厂)
其它试剂均为市售分析试剂
CF3COOH：中国医药(集团)上海化学试剂公司
苯甲硫醚：购于Acros
乙二硫醇：购于TCI
NaH：60％购于Aldrich
THF：用CaH2干燥重蒸
接肽中所用试剂全部经过MgSO4干燥处理
1、芴甲氧羰基-(O-叔丁醚)苏氨醇DHP HM Resin(5)的制备
1.1.DHP HM resin(2)的合成
60％的氢化钠及2-羟甲基-3，4-二氢吡喃在二甲乙酰胺中室温与氯甲基树脂反应16小时，重复反应一次，测得氯含量＜0.5％，取代度为1.49mmol/g。
1.2.Fmoc-Thr(tBu)-ol的合成
参照文献Mergler，M.；Hellstern，H.；Wirth，W.；Langer，W.；Gysi，P.；Prikoszovich.W.A.In Abstracts of the Twelfth American Peptide Symposium，June 16-21，1991.Boston.MA：Massachusetts Institute of Technology：Cambridge.1991，P-292.See also：Sandoz AG.Peptide Derivatives.International Patent Publication WO88/02756，1988，进行合成，产率为76％。，测试数值与文献值相等。HPLC＞99％。
1.3.对甲苯磺酸吡啶盐(PPTS)的合成
对甲苯磺酸22.8g加吡啶50ml，室温反应2hr，在60℃下浓缩，加乙醚，
浓缩至干，加丙酮，得白色晶体。
1.4.芴甲氧羰基-(O-叔丁醚)苏氨醇DHP HM Resin(5)的合成
将0.346g(2)加入到新蒸的THF5ml中浸湿半小时，加0.984gFmoc-Thr(tBu)-ol及0.258gPPTS，在N2保护下，70℃反应过夜，冷却过滤，用CH2Cl2，DMF/H2O(1∶1)，DMF，CH2Cl2，Et2O洗涤，干燥，取代度为0.47mmol/g。
2.合成带保护的八肽树脂，即合成路线中式(6)
取0.5g(5)放入接肽瓶中，加8ml 20％piperidine(DMF)振荡5min，抽干。再加8ml 20％DMF振荡15min，然后抽干，用DMF洗3次，MeOH洗3次，CH2Cl2洗3次，然后依次接Fmoc-Cys(trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Cys(trt)-OH、Fmoc-D-Phe-OH，用1.175mmol的Fmoc-AA/BOP/HOBt/DIPEA(1∶1∶1∶2)缩合，脱Fmoc用20％DMF，脱2次，第一次5分钟，第二次15分钟。
3.合成直链八肽，即合成路线中式(7)
将步骤2得到的树脂(6)加入到10ml的三氟醋酸∶水∶苯甲硫醚∶乙二硫醇(92.5∶2.5∶2.5∶2.5)，室温振荡2hr，过滤，用三氟醋酸洗树脂二次，滤液浓缩，加无水乙醚，得白色或微黄固体。反复用无水乙醚洗涤，得到粗品0.22g。ESI：1020(M+)，HPLC：57.1％。
4.氧化
称取粗品633mg，加入到500ml 5％乙酸铵溶液(pH＝7)中，搅拌二天。溶液测ESI：1018(M+)，HPLC：87.5％。最后冷冻干燥得成品奥曲肽。
大规模合成：
Fmoc-Thr(tBu)-ol DHP HM Resin 30g
放入接肽瓶中，加20％DMF振荡5分钟，抽干。再加20％DMF振荡15min，然后抽干，用DMF洗3次，MeOH洗3次，CH2Cl2洗3次，然后依次接Fmoc-Cys(trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Cys(trt)-OH、Fmoc-D-Phe-OH，用Fmoc-AA/BOP/HOBt/DIPEA(1∶1∶1∶2)缩合过量2.5倍，脱Fmoc用20％DMF，脱2次，第一次5分钟，第二次15分钟。
将树脂加入到6-10ml/克三氟醋酸∶水∶苯甲硫醚∶乙二硫醇(92.5∶2.5∶2.5∶2.5)，室温振荡2hr，过滤，用三氟醋酸洗树脂二次，滤液浓缩，加无水乙醚，得白色或微黄固体。反复用无水乙醚洗涤，得到粗品13.2克。
氧化：
10克粗品10000ml 5％乙酸铵溶液(pH＝7)中，搅拌二天。上制备HPLC脱盐，纯化，冷冻干燥得到成品奥曲肽。
实施例2：3，4-二氢吡喃羟甲基树脂加保护基反应中需将3，4-二氢吡喃羟甲基树脂加入到新蒸的THF中浸湿20分钟，然后加芴甲氧羰基-O-叔丁醚苏氨醇及对甲苯磺酸吡啶盐，在惰性气体保护下，60℃反应18小时。
在氨基酸过程中，用Fmoc-AA/BOP/HOBt/DIPEA(1∶1∶1∶2)，Fmoc-AA缩合过量3倍。
将肽从树脂上切下用6ml/克的三氟醋酸∶水∶苯甲硫醚∶乙二硫醇(92.5∶2.5∶2.5∶2.5)的混合液。其余与实施例1相同。
实施例3：3，4-二氢吡喃羟甲基树脂加保护基反应中需将3，4-二氢吡喃羟甲基树脂加入到新蒸的THF中浸湿40分钟，然后加芴甲氧羰基-O-叔丁醚苏氨醇及对甲苯磺酸吡啶盐，在惰性气体保护下，50℃反应13小时。
在氨基酸过程中，用Fmoc-AA/BOP/HOBt/DIPEA(1∶1∶1∶2)，Fmoc-AA缩合过量4倍。
将肽从树脂上切下用8ml/克的三氟醋酸∶水∶苯甲硫醚∶乙二硫醇(92.5∶2.5∶2.5∶2.5)的混合液。其余与实施例1相同。
Claims (5)
1、一种奥曲肽的固相合成方法，首先使用氯甲基树脂作载体，再用氢化钠溶液及2-羟甲基-3，4-二氢吡喃在二甲乙酰胺中室温与氯甲基树脂反应，得到3，4-二氢吡喃羟甲基树脂，然后进一步合成八肽，其特征是：合成八肽过程中首先将3，4-二氢吡喃羟甲基树脂加保护基，即在对甲苯磺酸吡啶盐作用下将芴甲氧羰基-O-叔丁醚苏氨醇连到3，4-二氢吡喃羟甲基树脂上去，这时需将3，4-二氢吡喃羟甲基树脂加入到新蒸的THF中浸湿，然后按照Fmoc/tBu固相多肽合成的方法将氨基酸逐个连上，最后用三氟醋酸∶水∶苯甲硫醚∶乙二硫醇的混合溶液将肽从树脂上切下，得到的粗品，粗品采用空气氧化法氧化形成硫硫键，经制备HPLC纯化冷冻得到奥曲肽。
2、根据权利要求1所述的一种奥曲肽的固相合成方法，其特征是：3，4-二氢吡喃羟甲基树脂在新蒸的THF中浸湿时间为20-40分钟，然后加芴甲氧羰基-O-叔丁醚苏氨醇及对甲苯磺酸吡啶盐，在惰性气体保护下，50-70℃反应12-18小时。
3、根据权利要求1所述的一种奥曲肽的固相合成方法，其特征是：在接氨基酸过程中，用Fmoc-AA/BOP/HOBt/DIPEA(1∶1∶1∶2)，Fmoc-AA缩合过量2-5倍。
4、根据权利要求1或3所述的一种奥曲肽的固相合成方法，其特征是：在接氨基酸过程中每一步缩合都经过kaiser test检测，如颜色呈阳性则重复接氨基酸。
5、根据权利要求1所述的一种奥曲肽的固相合成方法，其特征是：将肽从树脂上切下，用6-10ml/克的三氟醋酸∶水∶苯甲硫醚∶乙二硫醇(92.5∶2.5∶2.5∶2.5)的混合液。
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