CN114249810B

CN114249810B - 一种索玛鲁肽的合成方法

Info

Publication number: CN114249810B
Application number: CN202111501211.XA
Authority: CN
Inventors: 唐仁锦; 尹传龙; 唐洋明; 余品香
Original assignee: Hybio Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Hybio Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2021-12-09
Filing date: 2021-12-09
Publication date: 2025-01-24
Anticipated expiration: 2041-12-09
Also published as: CN114249810A

Abstract

本发明公开了一种索玛鲁肽的合成方法，包括合成第一肽片段II，合成第二肽片段IV，一锅异睛介导第一肽片段II和第二肽片段IV连接/脱Fmoc反应。本发明方法多肽片段的连接和脱Fmoc保护在同一个容器中进行，无需纯化中间体，连接效率高。使用的第一肽片段II、第二肽片段IV是侧链未保护的肽片段，反应过程中不会导致氨基酸差向异构化、易于操作、转化迅速，并且其溶解性好，在进行多肽片段偶联前可以通过高效液相色谱进行纯化，在最终的液相色谱纯化步骤中，杂质不是缺少一个或几个氨基酸的缺损肽，而是未缩合的部分片段，大大减少最终产品消旋、氧化、水解产生的杂质，减轻最终成品纯化上的难度，节省了成本。

Description

一种索玛鲁肽的合成方法

技术领域

本发明属于多肽药物制备领域，具体涉及一种索玛鲁肽的合成方法。

背景技术

糖尿病作为全球十大慢性疾病之一，是一种以慢性高血糖为特征的代谢性疾病。糖尿病患者又以Ⅱ型患者为主，Ⅱ型糖尿病患者占比超过90％。根据国际糖尿病联盟(International Diabetes Federation，IDF)的统计，截止到2017年年底，全球已有4.25亿成年人患有糖尿病。预计到2045年，全球患病人数将达到6.29亿。我国的糖尿病患病率已超过全球平均水平，2017年统计的患糖尿病人数已达1.14亿，据全球之首，预计到2045年将进一步增加到1.5亿左右。

索玛鲁肽(Semaglutide)是由糖尿病研发巨头诺和诺德(Nove Nordisk)公司研发的每周一次皮下注射的长效GLP-1类似物，2017年12月5日获美国FDA批准索马鲁肽的0.5mg和1mg这两种规格的预充注射笔(Ozempic)用于成人II型糖尿病患者的治疗。2019年9月20日，FDA正式批准诺和诺德口服索马鲁肽(Rybelsus)的上市申请，用于结合饮食和运动以改善II型糖尿病患者的血糖控制。此外，在今年4月29日，中国国家药品监督管理局批准索马鲁肽的0.5mg和1mg这两种规格的预充注射笔诺和肽在中国上市。从结构上看，索玛鲁肽是GLP-1(7-37)链上8位的Ala替换成Aib，34位的Lys替换成Arg，26位的Lys接上十八烷酸脂肪链。PEG修饰后不但可以与白蛋白紧密结合，掩盖DPP-4酶水解位点，还能降低肾排泄，可延长生物半衰期，达到长循环的效果。

索玛鲁肽的化学名为N6,26-{18-[N-(17-carboxyheptadecanoyl)-L-γ-glutamyl]-10-oxo-3,6,12,15-tetraoxa-9,18-diazaocta decanoyl}-[8-(2-amino-2-propanoic acid),34-L-arginine]human glucagon-like peptide 1(7-37)，分子式为C₁₈₇H₂₉₁N₄₅O₅₉，分子量为4113.5775，序列为H-His-Aib-Glu-Gly-Thr⁵-Phe-Thr-Ser-Asp-Val¹⁰-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu¹⁵-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys²⁰(AEEA-AEEA-γ-Glu-Octadecanedioic Acid)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp²⁵-Leu-Val-Arg-Gly-Arg³⁰-Gly-OH。结构式如下式1。

目前报道关于索玛鲁肽的合成方法主要采用固相逐步偶联法(Fmoc-SPPS)，如专利：CN103848910B，CN106478806A，CN108359006A，CN106928343A，CN101133082A。然而，采用常规的固相逐步偶联法(Fmoc-SPPS)合成索马鲁肽具有很大的合成挑战性，主要体现在偶联过程中树脂的收缩较为严重，产生了大量的缺失肽，既明显地降低了收率，又增加了终产品的纯化难度，使得研发成本大大增加。近些年，全保护肽片段缩合法合成索玛鲁肽快速发展，如专利：CN106749613A，CN104356224A，CN108359006A，CN109456401A，CN109627317A，该策略的基本思路是：首先通过固相合成得到几个全保护的小片段多肽，再在液相中或固相载体上缩合得到全保护的长肽链，最后裂解侧链保护基得到索玛鲁肽。然而，由于所有的多肽片段是全保护的，溶解性差就成为使用此方法碰到的最棘手问题，而且每个片段的长度不宜过长且纯度不高，偶联过程中产生的杂质比较多，在最终索玛鲁肽粗肽中杂质较多，纯化需要花费大量的人力物力成本。

发明内容

为了解决现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种索玛鲁肽的合成方法。具体技术方案如下：

本发明提供一种索玛鲁肽的合成方法，包括如下步骤：

合成第一肽片段II：(1)制备Fmoc-Gly-Wang树脂；(2)通过固相合成法，依序偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，得到全保护肽片段II固相树脂；(3)经裂解脱除树脂和保护基，纯化，得到第一肽片段II，其中Lys采用五肽片段I；

所述五肽片段I为Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Oct(OtBu))-OH；

所述第一肽片段II为H-Gln-Ala-Ala-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu-Oct)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH；

合成第二肽片段IV：所述第二肽片段IV为Fmoc-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-COSH；

一锅异腈介导连接/脱Fmoc反应：第一肽片段II和第二肽片段IV在偶联剂存在下偶联反应，反应结束后，脱Fmoc保护，纯化，得到索马鲁肽。

本发明的上述技术方案中，采用液相方法合成五肽片段I，包括步骤：

1)Oct(OtBu)和HOSu在偶联剂存在下偶联得到Oct(OtBu)-OSu，然后Oct(OtBu)-OSu和H-Glu-OtBu反应得到二肽片段Oct(OtBu)-Glu-OtBu；

2)二肽片段Oct(OtBu)-Glu-OtBu和HOSu在偶联剂存在下偶联得到Oct(OtBu)-Glu(OSu)-OtBu，然后Oct(OtBu)-Glu(OSu)-OtBu和AEEA-AEEA反应得到四肽片段Oct(OtBu)-Glu(AEEA-AEEA)-OtBu；

3)四肽片段Oct(OtBu)-Glu(AEEA-AEEA)-OtBu和Fmoc-Lys-OH·HCl在偶联剂存在下偶联得到五肽片段I Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Oct(OtBu))-OH。

进一步地，1)和2)中所述偶联剂选自DCC、DIC或EDC·HCl，优选为EDC·HCl；

3)中所述偶联剂选自EDC·HCl+A、DIPEA+B、DIPEA+A+B或CDI，其中A为HOBt或HOAt，B为PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU或TBTU。

本发明的上述技术方案中，Fmoc-Gly-Wang树脂的制备方法为：在偶联剂存在下，由活化后的Wang树脂与Fmoc-Gly-OH偶联得到；

优选地，所述Wang树脂替代度为0.6～1.0mmol/g，优选为0.7～0.9mmol/g；

优选地，制备Fmoc-Gly-Wang树脂时，所述偶联剂为DIC+A+DMAP，所述A为HOBt或HOAt；

优选地，以摩尔比计，DIC：A：DMAP＝1.2：1.1：0.1；

优选地，制备Fmoc-Gly-Wang树脂时，所述偶联剂的溶剂选自NMP、THF、DCM、DMF和DMSO中的一种或几种。

本发明的上述技术方案中，所述全保护肽片段II固相树脂为H-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Oct(OtBu))-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Wang树脂；

合成全保护肽片段II固相树脂时，依序偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸为Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Trp(Boc)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Oct(OtBu))-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Ala-OH和Fmoc-Gln(Trt)-OH；

合成全保护肽片段II固相树脂时，所用的偶联剂为DIC+A或者DIPEA+A+B，其中A为HOBt或HOAt，B为PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU或TBTU；

优选地，以摩尔比计，DIC：A＝1.2：1.1；

优选地，以摩尔比计，DIPEA：A：B＝1.5：1.1：1.0；

合成全保护肽片段II固相树脂时，所述偶联剂的溶剂选自DMF、DCM、NMP、THF和DMSO中的一种或几种；

合成第一肽片段II(3)中裂解所用的裂解液为TFA、H₂O、PhOMe和PhSMe的组合物；

优选地，所述TFA、H₂O、PhOMe、PhSMe的体积比为90：5：4：1。

本发明的上述技术方案中，合成第二肽片段IV的步骤包括：(1)制备Fmoc-Gly-2CTC树脂；(2)通过固相合成法，依序偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，得到全保护肽片段III固相树脂；(3)经裂解脱除树脂，得到全保护肽片段III；(4)将全保护肽片段III与硫醇进行偶联，得到全保护肽片段IV；(5)经裂解脱除保护基，纯化，得到第二肽片段IV。

进一步地，Fmoc-Gly-2CTC树脂的制备方法为：在偶联剂存在下，活化后的2CTC树脂与Fmoc-Gly-OH偶联得到；

优选地，所述2CTC树脂替代度为0.4～1.0mmol/g，优选为0.6～0.8mmol/g；

优选地，制备Fmoc-Gly-2CTC树脂时，所述偶联剂的溶剂选自DMF、DCM、NMP、THF和DMSO中的一种或几种。

本发明的上述技术方案中，所述全保护肽片段III固相树脂为Fmoc-His(trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-2CTC树脂；

合成全保护肽片段III固相树脂时，依序偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸为Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Aib-OH和Fmoc-His(trt)-OH；

合成全保护肽片段III固相树脂时，所用的偶联剂为DIC+A或者DIPEA+A+B，其中A为HOBt或HOAt，B为PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU或TBTU；

优选地，以摩尔比计，DIC：A＝1.2：1.1，DIPEA：A：B＝1.5：1.1：1.0；

优选地，合成全保护肽片段III固相树脂时，所述偶联剂的溶剂选自DMF、DCM、NMP、THF和DMSO中的一种或几种；

合成第二肽片段IV(3)中裂解所用的裂解液为TFE与DCM的混合液或HFIP与DCM的混合液；优选为TFE和DCM的混合液，更优选地，TFE和DCM的体积比为1:4。

本发明的上述技术方案中，合成第二肽片段IV(4)中所述硫醇为2，4，6-三甲氧基苄硫醇；

合成第二肽片段IV(4)中所用偶联剂为DIC+A或DIPEA+A+B，其中A为HOBt或HOAt，B为PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU或TBTU；

优选地，以摩尔比计，DIC：A＝1.2：1.1，DIPEA：A：B＝1.5：1.1：1.0

优选地，所述偶联剂的溶剂选自DMF、DCM、NMP、THF和DMSO中的一种或几种；

合成第二肽片段IV(5)中裂解所用的试剂为TFA、H₂O、PhOMe和PhSMe的组合物，优选地TFA、H₂O、PhOMe、PhSMe的体积比为90：5：4：1。

本发明的上述技术方案中，一锅异腈介导连接/脱Fmoc反应时，所述偶联剂为tBuNC和HOBt，所述偶联剂的溶剂选自DMA、DMF、DCM、NMP、THF和DMSO中的一种或几种；

所述脱Fmoc的试剂选自DBU，二乙胺或哌啶，优选为哌啶。

本发明的有益效果为：

1、本发明提供一锅异腈介导连接/脱Fmoc方法合成索玛鲁肽，该方法多肽片段的连接和脱Fmoc保护在同一个容器中进行，无需纯化中间体，连接效率高，反应条件温和。使用的第一肽片段II、第二肽片段IV是侧链未保护的肽片段，反应过程中不会导致氨基酸差向异构化、易于操作、转化迅速，并且其溶解性好，在进行多肽片段偶联前可以通过高效液相色谱进行纯化，在最终的液相色谱纯化步骤中，杂质不是缺少一个或几个氨基酸的缺损肽，而是未缩合的部分片段，大大减少最终产品消旋、氧化、水解产生的杂质，减轻最终成品纯化上的难度，节省了成本。

2、本发明第一肽片段II固相合成时，Lys²⁰采用五肽片段Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Oct(OtBu))-OH，本发明提供的五肽片段I的合成方法，操作简单，合成路径短，只需五步反应便能得到高纯度的五肽片段。

3、本发明所使用的第一肽片段II、第二肽片段IV可以同时合成，提高了索玛鲁肽的合成效率，合成索玛鲁肽的总收率为30％以上。

附图说明

图1为五肽片段I Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Oct(OtBu))-OH的合成路线；

图2为第一肽片段II的合成路线；

图3为第二肽片段IV的合成路线；

图4为液相一锅异腈介导连接/脱Fmoc反应；

图5为五肽片段I Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Oct(OtBu))-OH的质谱图；

图6为五肽片段I Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Oct(OtBu))-OH的HPLC谱图；

图7为索玛鲁肽的质谱图；

图8为索玛鲁肽的HPLC谱图。

具体实施方式

为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。

本发明所用的缩写与含义，如下表所示：

实施例1：Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Oct(OtBu))-OH五肽片段I的合成

五肽片段I的合成，包括以下步骤：

1、Oct(OtBu)-Glu-OtBu二肽片段的合成

称取Oct(OtBu)-OH(92.7g，250mmol)和HOSu(31.7g，275mmol)溶于1000mL DMF中，加入EDC·HCl(71.9g,375mmol)，室温反应16小时。反应结束后缓慢向反应液中滴加2000mL纯化水，析出大量沉淀，过滤，再用纯化水打浆洗涤三遍，抽干，得到Oct(OtBu)-OSu活化酯。称取H-Glu-OtBu(61.0g，300mmol)溶解于400mL饱和NaHCO₃水溶液中，将所得Oct(OtBu)-OSu活化酯用1200ml THF溶解后缓慢滴加至反应液中，室温反应16h。反应结束后，旋蒸除去大部分THF，然后用15％的柠檬酸调节反应液pH＝3～4，析出大量油状物，然后用EtOAc萃取三遍，合并有机相，然后用brine洗涤三遍，无水硫酸钠干燥过夜，过滤，旋蒸除去溶剂，油泵拉干得132.1g Oct(OtBu)-Glu-OtBu二肽片段，收率为95.0％。

2、Oct(OtBu)-Glu(AEEA-AEEA)-OtBu四肽片段的合成

将Oct(OtBu)-Glu-OtBu二肽片段(132.1g，238mmol)和HOSu(30.1g，262mmol)溶于1000mL DMF中，加入EDC·HCl(68.5g,357mmol)，室温反应6小时。反应结束后缓慢向反应液中滴加2000mL纯化水，析出大量沉淀，过滤，再用纯化水打浆洗涤三遍，抽干，得到Oct(OtBu)-Glu(OSu)-OtBu活化酯。称取AEEA-AEEA(80.8g，262mmol)溶解于400mL饱和NaHCO₃水溶液中，将所得Oct(OtBu)-Glu(OSu)-OtBu活化酯用1200ml THF溶解后缓慢滴加至反应液中，室温反应16h。反应结束后，旋蒸除去大部分THF，然后用15％的柠檬酸调节反应液pH＝3～4，析出大量油状物，然后用EtOAc萃取三遍，合并有机相，然后用brine洗涤三遍，无水硫酸钠干燥过夜，过滤，旋蒸除去溶剂，油泵拉干得176.8g Oct(OtBu)-Glu(AEEA-AEEA)-OtBu四肽片段，收率为87.9％。

3、Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Oct(OtBu))-OH五肽片段I的合成

称取Fmoc-Lys-OH·HCl(12.2g，30.0mmol)用50ml DMF溶解后降温至0～5℃备用。然后称取上述实施例1中步骤1的Oct(OtBu)-Glu(AEEA-AEEA)-OtBu四肽片段(16.9g，20mmol)溶于50mL DMF中，降温至0～5℃后加入CDI(4.9g，30mmol)，继续搅拌0.5h，然后将活化液滴入Fmoc-Lys-OH·HCl DMF溶液中，滴加完毕后继续反应0.5h。反应结束后，向反应液中加入400ml纯化水，用色谱柱为100×250mm反相C18柱进行半制备纯化，检测波长为220nm，流动相为含有0.1％TFA的H₂O(A相)和MeOH(B相)，流速为200ml/min，梯度：B％:75％-95％-95％，收集目的组分，对目的组分进行浓缩后进行萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，再浓缩得到五肽片段I Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Oct(OtBu))-OH纯品22.1g，总收率为92.5％。图5为五肽片段I的质谱图，图6为五肽片段I的HPLC谱图。

实施例2：Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Oct(OtBu))-OH五肽片段I的合成

五肽片段I的合成，包括以下步骤：

1、Oct(OtBu)-Glu-OtBu二肽片段的合成，同实施列1；

2、Oct(OtBu)-Glu(AEEA-AEEA)-OtBu四肽片段的合成，同实施列1；

3、Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Oct(OtBu))-OH五肽片段I的合成

称取Fmoc-Lys-OH·HCl(12.2g，30.0mmol)用50ml DMF溶解后降温至0～5℃备用。然后称取上述实施例1中步骤1的Oct(OtBu)-Glu(AEEA-AEEA)-OtBu四肽片段(16.9g，20mmol)和PyBOP(10.4，20mmol)溶于50mL DMF中，降温至0～5℃后滴入DIPEA(6.6ml，40mmol)，滴加完后继续搅拌1h，然后将活化液滴入Fmoc-Lys-OH·HCl DMF溶液中，滴加完毕后继续反应2h。反应结束后，向反应液中加入400ml纯化水，用色谱柱为100×250mm反相C18柱进行半制备纯化，检测波长为220nm，流动相为含有0.1％TFA的H₂O(A相)和MeOH(B相)，流速为200ml/min，梯度：B％:75％-95％-95％，收集目的组分，对目的组分进行浓缩后进行萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，再浓缩得到五肽片段I Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Oct(OtBu))-OH纯品20.4g，总收率为85.4％。

实施例3：Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Oct(OtBu))-OH五肽片段I的合成

五肽片段I的合成，包括以下步骤：

1、Oct(OtBu)-Glu-OtBu二肽片段的合成，同实施列1；

2、Oct(OtBu)-Glu(AEEA-AEEA)-OtBu四肽片段的合成，同实施列1；

3、Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Oct(OtBu))-OH五肽片段I的合成

称取Fmoc-Lys-OH·HCl(12.2g，30.0mmol)用50ml DMF溶解后降温至0～5℃备用。然后称取实施例1步骤2中的Oct(OtBu)-Glu(AEEA-AEEA)-OtBu四肽片段(16.9g，20mmol)和HOAt(4.1，30mmol)溶于50mL DMF中，降温至0～5℃后加入EDC·HCl(3.8g，20mmol)，继续搅拌2h，然后将活化液滴入Fmoc-Lys-OH·HCl DMF溶液中，滴加完毕后继续反应2h。反应结束后，向反应液中加入400ml纯化水，用色谱柱为100×250mm反相C18柱进行半制备纯化，检测波长为220nm，流动相为含有0.1％TFA的H₂O(A相)和MeOH(B相)，流速为200ml/min，梯度：B％:75％-95％-95％，收集目的组分，对目的组分进行浓缩后进行萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，再浓缩得到五肽片段I Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Oct(OtBu))-OH纯品20.8g，收率为87.0％。

实施例4：索马鲁肽的合成

1、第一肽片段II的合成

(1)制备替代度为0.41mmol Fmoc-Gly-Wang树脂

称取替代度为0.83mmol/g的Wang树脂48.2g，加入到反应柱中，用DMF/DCM(1:1)溶胀30分钟。称取Fmoc-Gly-OH(59.6g,200mmol)，HOBt(32.4g,220mmol)和DMAP(2.4g,2mmol)，溶解于150mL DMF中，冰浴下加入DIC(40.6mL，240mmol)，活化5分钟后加入反应柱中。反应2.5h后，用150mL x 3DMF洗涤树脂，加入70mL醋酸酐和60mL吡啶，封闭2h。反应结束后，用150mL x5 DMF洗涤树脂，150mL x3 MeOH收缩，抽干后得到Fmoc-Gly-Wang树脂，测得替代度为0.41mmol/g。

(2)全保护肽片段II固相树脂的制备

称步骤(1)制备的替代度为0.41mmol/g的Fmoc-Gly-Wang树脂24.4g于固相反应柱中，用DMF/DCM(1:1)溶胀30分钟。用80mL x 2DBLK脱保护5min+7min，100mL x 5DMF洗涤树脂。称取Fmoc-Arg(Pbf)-OH(32.4g,50.0mmol)和HOBT(8.1g,55.0mmol)用60mL DMF溶解，冰浴下加入DIC(10.2mL,60.0mmol)活化5min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时。反应结束，用80mL x 3DMF洗涤树脂，加入80mL DBLK x 2脱保护5min+7min，80mL x 5DMF洗涤树脂。重复上述偶联操作，按照肽序继续依次偶联Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Arg(pbf)-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Trp(Boc)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Oct(OtBu))-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Ala-OH和Fmoc-Gln(Trt)-OH。反应结束后，用200mL x 5DMF洗涤树脂，200mL x 3MeOH收缩，抽干后得到全保护肽片段II固相树脂。

(3)第一肽片段II的制备

将步骤(2)得到的树脂加入到1L的圆底烧瓶中，加入预先配置好的裂解液TFA/H₂O/PhOMe/PhSMe(90:5:4:1，v/v)500mL，室温磁力搅拌2小时，减压过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液。将滤液缓慢加入5.0L冰乙醚中沉淀，离心，2.5L x 3冰乙醚洗涤，氮气吹干得到25.4g第一肽片段II粗肽。

(4)对第一肽片段II进行纯化

称取步骤(3)制得的第一肽片段II粗品20.0g，加入4L 0.6％氨水溶解，用色谱柱为100×250mm反相C18柱进行半制备纯化，检测波长为220nm，流动相为含有0.1％TFA的水(A相)和乙腈(B相)，流速为200ml/min，梯度：B％:32％-52％，60min，收集目的组分，对上述浓缩液进行冻干，得到10.7g第一肽片段II，收率为56.3％。

2、第二肽片段IV的合成

(1)制备替代度为0.36mmol Fmoc-Gly-2CTC Resin树脂

称取替代度为0.60mmol/g的2CTC Resin树脂66.7g，加入到反应柱中，用DMF/DCM(1:1)溶胀30分钟。称取Fmoc-Gly-OH(23.8g,80mmol)溶解于200mL DMF后加入反应柱中。加入DIPEA(20.8ml,80mmol)，室温反应2h，然后加入20mLMeOH和DIPEA(10.4ml,40mmol)继续反应0.5h，反应结束后，用200mL x5 DMF洗涤树脂，200mL x3甲叔醚收缩，抽干后得到Fmoc-Gly-2CTC Resin树脂，测得替代度为0.36mmol/g。

(2)全保护肽片段III的制备

称步骤(1)制备的替代度为0.36mmol/g的Fmoc-Gly-2CTC Resin树脂55.6g于固相反应柱中，用DMF/DCM(1:1)溶胀30分钟。用200mL x 2DBLK脱保护5min+7min，200mL x 5DMF洗涤。称取Fmoc-Glu(OtBu)-OH(42.5g,100.0mmol)和HOBT(16.2g,110.0mmol)用150mL DMF溶解，冰浴下加入DIC(20.4mL,120.0mmol)活化5min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时。反应结束，用200mL x 3DMF洗涤树脂，加入200mL DBLK x 2脱保护5min+7min，200mL x 5DMF洗涤树脂，按照肽序继续依次偶联，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Aib-OH和Fmoc-His(trt)-OH。反应结束后，分别用400mL x 5DMF洗涤树脂，400mL x3甲叔醚收缩树脂，抽干后加入预先配置好的裂解液TFE/DCM(1：4，v/v)500mL，室温裂解2h，过滤，收集裂解液，然后用DCM洗涤两遍树脂，合并，旋蒸除去DCM，缓慢加入1000mL纯化水，产生大量沉淀，过滤，用无水乙醚打浆洗涤两遍，抽干，干燥，得到全保护肽片段III。

(3)全保护肽片段IV的制备

称取步骤(2)得到的全保护肽片段III、2，4，6-三甲氧基苄硫醇(5.1g，24mmol)、HOBt(3.6g，26.4mmol)和HBTU(9.1g，24mmol)溶于400mL DMF中，冰浴下滴加DIPEA(5.9mL,36mmol)，滴加完毕后恢复室温继续反应2h。反应结束后缓慢向反应液中滴加1000mL纯化水，析出大量沉淀，过滤，再用纯化水打浆洗涤三遍，抽干，得到全保护肽片段IV。

(4)第二肽片段IV的制备

将步骤(3)得到的全保护肽片段IV加入到1L的圆底烧瓶中，加入预先配置好的裂解液TFA/H₂O/PhOMe/PhSMe(90:5:4:1，v/v)400mL，室温磁力搅拌2小时。反应结束后将裂解液缓慢加入4.0L冰乙醚中沉淀，离心，2.0L x 3冰乙醚洗涤，氮气吹干得到41.6g第二肽片段IV粗肽。

(5)对第二肽片段IV进行纯化

称取步骤(4)制得的第二肽片段IV粗品20g，加入4L蒸馏水溶解，用色谱柱为100×250mm反相C18柱进行半制备纯化，检测波长为220nm，流动相为含有0.1％TFA的水(A相)和乙腈(B相)，流速为200ml/min，梯度：B％:22％-42％，60min，收集目的组分。浓缩，冻干，得到11.5g第二肽片段IV，收率为61.5％。

3、一锅异腈介导连接/脱Fmoc反应

称取第一肽片段II(2.4g,1.0mmol)、第二肽片段IV(2.3g,1.2mmol)和HOBT(1.4g,10.0mmol)溶解于DMA 100mL中，加入tBuNC(0.34mL,3.0mmol)，室温反应48h。经HPLC检测反应完全之后，加入20mL哌啶，室温继续反应1h。反应结束后，加入1L纯化水，过滤，用色谱柱为50×250mm反相C18柱进行半制备纯化，检测波长为220nm，流动相为含有0.1％TFA的水(A相)和乙腈(B相)，流速为70ml/min，梯度：B％:32％-52％，60min，收集目的组分。浓缩，冻干，得到2.4g索马鲁肽精肽，收率为58.4％。图7为索玛鲁肽的质谱图；图8为索玛鲁肽的HPLC谱图。

实施例5：索马鲁肽的合成

1、第一肽片段II的合成，同实施列4；

2、第二肽片段IV的合成，同实施列4；

3、一锅异腈介导连接/脱Fmoc反应

称取第一肽片段II(2.4g,1.0mmol)、第二肽片段IV(2.3g,1.2mmol)和HOBT(1.4g,10.0mmol)溶解于DMF 100mL中，加入tBuNC(0.34mL,3.0mmol)，室温反应48h。经HPLC检测反应完全之后，加入20mL哌啶，室温继续反应1h。反应结束后，加入1L纯化水，过滤，用色谱柱为50×250mm反相C18柱进行半制备纯化，检测波长为220nm，流动相为含有0.1％TFA的水(A相)和乙腈(B相)，流速为70ml/min，梯度：B％:32％-52％，60min，收集目的组分。浓缩，冻干，得到1.8g索马鲁肽精肽，收率为43.8％。

实施例6：索马鲁肽的合成

1、第一肽片段II的合成，同实施列4；

2、第二肽片段IV的合成，同实施列4；

3、一锅异腈介导连接/脱Fmoc反应

称取第一肽片段II(2.4g,1.0mmol)、第二肽片段IV(2.3g,1.2mmol)和HOBT(1.4g,10.0mmol)溶解于NMP 100mL中，加入tBuNC(0.34mL,3.0mmol)，室温反应48h。经HPLC检测反应完全之后，加入20mL哌啶，室温继续反应1h。反应结束后，加入1L纯化水，过滤，用色谱柱为50×250mm反相C18柱进行半制备纯化，检测波长为220nm，流动相为含有0.1％TFA的水(A相)和乙腈(B相)，流速为70ml/min，梯度：B％:32％-52％，60min，收集目的组分。浓缩，冻干，得到2.1g索马鲁肽精肽，收率为51.1％。

实施例7：索马鲁肽的合成

1、第一肽片段II的合成，同实施列4；

2、第二肽片段IV的合成，同实施列4；

3、一锅异腈介导连接/脱Fmoc反应

称取肽片段第一II(2.4g,1.0mmol)、第二肽片段IV(2.3g,1.2mmol)和HOBT(1.4g,10.0mmol)溶解于DMA/NMP(1:1)100mL中，加入tBuNC(0.34mL,3.0mmol)，室温反应48h。经HPLC检测反应完全之后，加入20mL哌啶，室温继续反应1h。反应结束后，加入1L纯化水，过滤，用色谱柱为50×250mm反相C18柱进行半制备纯化，检测波长为220nm，流动相为含有0.1％TFA的水(A相)和乙腈(B相)，流速为70ml/min，梯度：B％:32％-52％，60min，收集目的组分。浓缩，冻干，得到2.5g索马鲁肽精肽，收率为60.8％。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims

1.一种索玛鲁肽的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：

合成第一肽片段II：（1）制备Fmoc-Gly-Wang树脂；（2）通过固相合成法，依序偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，其中Lys为Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Oct(OtBu))-OH，得到全保护肽片段II固相树脂；（3）经裂解脱除树脂和保护基，纯化，得到第一肽片段II；

所述全保护肽片段II固相树脂为H-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys（AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Oct(OtBu)）-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Wang树脂；

所述第一肽片段II为H-Gln-Ala-Ala-Lys（AEEA-AEEA-γ-Glu-Oct）-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH；

合成第二肽片段IV：（1）制备Fmoc-Gly-2CTC树脂；（2）通过固相合成法，依序偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，得到全保护肽片段III固相树脂；（3）经裂解脱除树脂，得到全保护肽片段III；（4）将全保护肽片段III与硫醇进行偶联，得到全保护肽片段IV；（5）经裂解脱除保护基，纯化，得到第二肽片段IV；

所述全保护肽片段III固相树脂为Fmoc-His(trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-2CTC树脂；

所述第二肽片段IV为Fmoc-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-COSH；

一锅异腈介导连接/脱Fmoc反应：第一肽片段II和第二肽片段IV在偶联剂存在下偶联反应，所述偶联剂为tBuNC和HOBt，所述偶联剂的溶剂选自DMA、DMF、NMP中的一种或几种，反应结束后，加入脱Fmoc的试剂，脱Fmoc保护，纯化，得到索马鲁肽。

2.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，采用液相方法合成Fmoc-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Oct(OtBu))-OH，包括步骤：

1）Oct（OtBu）和HOSu在偶联剂存在下偶联得到Oct（OtBu）-OSu，然后Oct（OtBu）-OSu和H-Glu-OtBu反应得到二肽片段Oct（OtBu）-Glu-OtBu；

2）二肽片段Oct（OtBu）-Glu-OtBu和HOSu在偶联剂存在下偶联得到Oct（OtBu）-Glu（OSu）-OtBu，然后Oct（OtBu）-Glu（OSu）-OtBu和AEEA-AEEA反应得到Oct（OtBu）-Glu（AEEA-AEEA）-OtBu；

3）Oct（OtBu）-Glu（AEEA-AEEA）-OtBu和Fmoc-Lys-OH·HCl在偶联剂存在下偶联得到Fmoc-Lys（AEEA-AEEA-γ-Glu（OtBu）- Oct（OtBu））-OH。

3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，1）和2）中所述偶联剂选自DCC、DIC或EDC·HCl；

3）中所述偶联剂选自EDC·HCl + A、DIPEA + B、DIPEA + A + B或CDI，其中A为HOBt或HOAt，B为PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU或TBTU。

4.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，Fmoc-Gly-Wang 树脂的制备方法为：在偶联剂存在下，由活化后的Wang 树脂与Fmoc-Gly-OH 偶联得到；

所述Wang树脂替代度为0.6 ~ 1.0 mmol/g；

制备Fmoc-Gly-Wang树脂时，所述偶联剂为DIC + A+DMAP，其中A为HOBt或HOAt。

5.根据权利要求4所述的合成方法，其特征在于，制备Fmoc-Gly-Wang树脂时，以摩尔比计，DIC：A：DMAP=1.2：1.1：0.1。

6.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，合成全保护肽片段II固相树脂时，依序偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸为Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Trp(Boc)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Lys（AEEA-AEEA-γ-Glu（OtBu）- Oct（OtBu））-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Ala-OH和Fmoc-Gln(Trt)-OH；

合成全保护肽片段II固相树脂时，所用的偶联剂为DIC + A或者DIPEA + A + B，其中A为HOBt或HOAt，B为PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU或TBTU；

合成第一肽片段II（3）中裂解所用的裂解液为TFA、H₂O、PhOMe和PhSMe的组合物。

7.根据权利要求6所述的合成方法，其特征在于，合成全保护肽片段II固相树脂时，以摩尔比计，DIC：A=1.2：1.1，DIPEA：A：B=1.5：1.1：1.0。

8.根据权利要求6所述的合成方法，其特征在于，合成第一肽片段II（3）中，所述TFA、H₂O、PhOMe、PhSMe的体积比为90：5：4：1。

9.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，Fmoc-Gly-2CTC树脂的制备方法为：在偶联剂存在下，活化后的2CTC 树脂与Fmoc-Gly-OH 偶联得到；

所述 2CTC 树脂替代度为0.4 ~ 1.0 mmol/g。

10.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，合成全保护肽片段III固相树脂时，依序偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸为Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Aib-OH和Fmoc-His(trt)-OH；

合成全保护肽片段III固相树脂时，所用的偶联剂为DIC + A或者DIPEA + A + B，其中A为HOBt或HOAt，B为PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU或TBTU；

合成第二肽片段IV（3）中裂解所用的裂解液为TFE与DCM的混合液或HFIP与DCM的混合液。

11.根据权利要求10所述的合成方法，其特征在于，合成全保护肽片段III固相树脂时，以摩尔比计，DIC：A=1.2：1.1，DIPEA：A：B=1.5：1.1：1.0。

12.根据权利要求10所述的合成方法，其特征在于，合成第二肽片段IV（3）中裂解所用的裂解液为TFE与DCM的混合液，TFE和DCM的体积比为1:4。

13.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，合成第二肽片段IV（4）中所述硫醇为2，4，6-三甲氧基苄硫醇；

合成第二肽片段IV（4）中所用偶联剂为DIC + A或DIPEA + A + B，其中A为HOBt或HOAt，B为PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU或TBTU；

合成第二肽片段IV（5）中裂解所用的试剂为TFA、H₂O、PhOMe和PhSMe的组合物。

14.根据权利要求13所述的合成方法，其特征在于，合成第二肽片段IV（4）中，以摩尔比计，DIC：A=1.2：1.1，DIPEA：A：B=1.5：1.1：1.0。

15.根据权利要求13所述的合成方法，其特征在于，合成第二肽片段IV（5）中，TFA、H₂O、PhOMe、PhSMe的体积比为90：5：4：1。

16.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，一锅异睛介导连接/脱Fmoc反应中，所述脱Fmoc的试剂选自DBU、二乙胺或哌啶。