CN112679602B - 索马鲁肽的固相合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了索马鲁肽的固相合成方法。本发明通过固相片段合成技术，将索马鲁肽分为三个片段同时合成，在片段合成时，部分位置，以二肽或是三肽代替原来的单个氨基酸。本发明有效的缩短了50％的合成周期；极大的降低消旋杂质的产生，尤其是[D‑His1]‑索马鲁肽的形成，有效的避免常规逐个偶联中缺失肽或多氨肽的形成，尤其是[+Ser11]‑索马鲁肽、[+Ala19]‑索马鲁肽、[+Gly29]‑索马鲁肽杂质的产生，提高了粗肽纯度，便于下游纯化，极大的降低了物料成本，适用于工业化生产，总收率达35％。
Description
技术领域
本发明涉及多肽药物固相合成领域，特别涉及一种片段固相合成索马鲁肽的方法。
背景技术
中文名称：索马鲁肽
英文名称：Sermaglutide
肽序结构：
H-His1-Aib-Glu-Gly-Thr5-Phe-Thr-Ser-Asp-Val10-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu15-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys20-Glu-Phe-lle-Ala-Trp25-Leu-Val-Arg-Gly-Arg30-Gly-OH
CAS号：910463-68-2，分子式：C187H291N45O59，分子量：4113.64g/mol
索马鲁肽是一种新的长效胰高血糖素-1(GLP-1)类似物，由丹麦诺和诺德公司开发研制，主要用于II型糖尿病的治疗，已于2017获FDA批准上市，此外，其口服制剂临床试验也取得了很好的成效，同时具有降糖和减肥的功效，如果索马鲁肽口服制剂开发成功，必将大大改善糖尿病患者的生活质量，提高药物使用的顺应性。从结构上看，索马鲁肽N端第二位氨基酸有Ala替换为非天然氨基酸氨基异丁酸，可以有效的避免被DPP-IV酶的水解，降低肾排率，提高药物半衰期；N端第20位Lysε氨基经AEEA、Glu、十八烷二酸的修饰，可以有效的增强索马鲁肽的亲水性，提高与白蛋白的结合率，从而达到长效治疗效果，患者每周只需要注射一次。
专利CN108059666A中公开了一种固液结合制备索玛鲁肽的方法，首先将Lys以Alloc-Lys(Fmoc)-OH形式与树脂缩合，脱除侧链ε-NH2上的Fmoc保护基、进行连接侧链，经裂解得到Alloc-Lys(PEGPEG-Glu(γ-OtBu)-Monobutyl octadecanate)-OH，同时采用液相合成方法同时合成10个二肽或三肽或四肽片段；再以树脂为载体进行所合成的肽片段和单个氨基酸的缩合反应制得索马鲁肽。专利CN106749613A公开了一种采用16+6+9片段缩合制备索玛鲁肽的方法。专利CN103848910B公开了一种首先在树脂上逐个缩合31个氨基酸，随后在Lys的ε-NH2上接上侧链，制备索玛鲁肽的方法。专利CN108034004A公开了一种先固相合成索玛鲁肽序列的第1-4位氨基酸作为第一片段；固相合成索玛鲁肽序列的第5-31位氨基酸，脱除20位Lys的侧链保护基团并依次偶联，作为第二片段；片段一与片段二偶联合成全保护索玛鲁肽，经裂解沉淀，得到索玛鲁肽的方法。
索马鲁肽是一个有31个常规氨基酸构成的主链及一个较长碳链的侧链构成，所以上述方法存在以下的不足：逐个偶联的方法合成索马鲁肽，伴随着肽链的延长，偶联程度会越来越难，并且容易产生缺失肽，消旋肽使得产物纯度降低，且生产周期长，效率比较低；因Ala及Gly自身结构的特点，使得在偶联的过程中易出现[+Ala]、[+Gly]的杂质，16+6+9片段缩合制备索马鲁肽，降低了生产周期，但不能有效的控制[+Ala]、[+Gly]的杂质产生；索马鲁肽羧基端是以Gly结尾，在偶联第二个氨基酸，脱除其保护时，会部分形成DKP结构，使得肽链从树脂上脱落下来，降低目标产物的收率；N末端的His在偶联过程中极易消旋，且产生的[D-His]-索马鲁肽杂质与主峰相近，极难除去，使得产品收率低。
发明内容
本发明的目的是为了克服上述现有技术的不足，根据索马鲁肽自身的结构特点，提供一种新的索马鲁肽的合成方法，该方法能够有效的降低杂质，提高收率，缩短生产周期。
根据本发明技术方案的一方面，提供了一种索马鲁肽的固相合成方法，它包括以下步骤：
(1)固相合成索马鲁肽的第1-11位氨基酸作为第一片段；
(2)固相合成索马鲁肽的第12-18位氨基酸作为第二片段；
(3)固相合成索马鲁肽的第19-31位氨基酸作为第三片段；
(4)第一片段、第二片段、第三片段按照肽序依次偶联，得索马鲁肽第一肽树脂。脱除Lys20侧链ε氨基的保护基，依次偶联侧链得索马鲁肽肽树脂；
(5)经裂解、沉降、纯化得索马鲁肽成品。
根据本发明技术方案的一方面，还提供了一种索马鲁肽的固相合成方法，上述步骤(1)、(2)中使用的固相载体树脂为2-Cl-CTC Resin，取代度为0.5～1.2mmol/g，最优选的取代度为：1.0mmol/g。
根据本发明技术方案的一方面，还提供了一种索马鲁肽的固相合成方法，上述步骤(3)中，所使用的树脂为2-CTC Resin、Wang Resin中的一种，最优选的树脂为WangResin，取代度为0.5～1.2mmol/g，最优选的取代度为1.0mmol/g。
根据本发明技术方案的一方面，还提供了一种索马鲁肽的固相合成方法，上述步骤(1)、(2)、(3)中，所使用的缩合剂为A+B或A+C+D，其中A为HoBt、HoAt、Cl-HOBt或HOOBt中的任一种，B为DIC、DCC、EDC.HCl中的任一种，C为HATU、HBTU、HCTU、TATU、TBTU、AOP、BOP、PyBOP或PyAOP中的任一种，D为DIEA、NMM、TMP或TEA中的任一种；使用A+B缩合体系时，树脂、氨基酸与A、B的摩尔质量比为1∶1.5～3∶1.8～3.6∶1.8～3.6，使用A+C+D时，树脂、氨基酸与A、B、C的摩尔质量比为1∶1.5～3∶1.8～3.6∶1.35～2.7∶4.5～9；所使用的反应溶剂为DMF、DCM、DMSO、DMA、NMP中的一种或几种组合；所使用脱Fmoc的试剂为10％～30％WV的哌啶/DMF溶液或1％～5％V/V的DBU/DMF溶液，脱除两次，每次5min～20min。
根据本发明技术方案的一方面，还提供了一种索马鲁肽的固相合成方法，上述步骤(1)、(2)中，全保护片段的裂解试剂为15％～30％V/V TFE/DCM或0.5％～3％V/V TFA/DCM，最优选择为20％V/V TFE/DCM。
根据本发明技术方案的一方面，还提供了一种索马鲁肽的固相合成方法，上述步骤(1)中，使用Boc-His(trt)-Aib-OH或BOC-His(trt)-Aib-Glu(OtBu)-OH代替Boc-His1(trt)-OH、Fmoc-Aib2-OH或Boc-His1(trt)-OH、Fmoc-Aib2-OH、Fmoc-Glu3(OtBu)-OH来合成第一片段，最优选择Boc-His(trt)-Aib-OH代替Boc-His1(trt)-OH、Fmoc-Aib2-OH，偶联时采用的缩合剂组合为HoBt/DIC、HoAt/DIC或HooBt/DIC中任一种组合。
根据本发明技术方案的一方面，还提供了一种索马鲁肽的固相合成方法，上述步骤(3)中，使用Fmoc-Gly-Arg(pbf)-OH或Fmoc-Arg(pbf)-Gly-Arg(pbf)-OH代替Fmoc-Gly29-OH、Fmoc-Arg(pbf)30-OH或Fmoc-Arg(pbf)28-OH、Fmoc-Gly29-OH、Fmoc-Arg(pbf)30-OH来合成第三片段，最有选择Fmoc-Gly-Arg(pbf)-OH代替Fmoc-Gly29-OH、Fmoc-Arg(pbf)30-OH，偶联时采用的缩合剂组合为HoBt/DIC、HoAt/DIC或HooBt/DIC中任一种组合。
根据本发明技术方案的一方面，还提供了一种索马鲁肽的固相合成方法，上述步骤(3)中，Lys20采用Fmoc-Lys(R)-OH。
a.当第三片段使用Wang Resin时，R为Mtt、Mmt、Dde、ivDde、Alloc中的一种；
或b.当第三片段使用2-Cl-CTC Resin时，R为Dde、ivDde、Alloc中的一种；
最优选择为使用Wang Resin时，R为Alloc。
根据本发明技术方案的一方面，还提供了一种索马鲁肽的固相合成方法，上述步骤(4)中，第二片段与第三片段偶联及第一片段与第二、三片段偶联，采用的缩合剂组合为HoBt/DIC、HoAt/DIC或HooBt/DIC中任一种组合；R为Dde或ivDde时，采用1％～3％水合肼的DMF溶液处理树脂两次，每次3min～5min，R为Mtt或Mmt时，采用3％～5％TFA的DMF溶液处理树脂两次，每次10min～30min，R为Alloc时，采用10～20倍当量的吗啡啉或10～20倍当量的苯硅烷与0.05～0.3当量的四(三苯基膦)钯，以钯含量记，反应试剂为DCM。
根据本发明技术方案的一方面，还提供了一种索马鲁肽的固相合成方法，上述步骤(5)中采用的裂解试剂为TFA∶phenol∶Triisopropylsilane∶H2O＝80～90∶5～10∶2.5～5∶2.5～5，最优选的裂解试剂比例为TFA∶phenol∶Triisopropylsilane∶H2O＝85∶10∶3∶2。
根据本发明技术方案的一方面，还提供了一种索马鲁肽的固相合成方法，上述索马鲁肽的合成方法中，其进一步优选的技术方案是：
(1)Fmoc-Ser(tBu)-CTC Resin的制备：
取2-Cl-CTC树脂加入到固相反应器中，加入DMF溶胀树脂；抽干溶剂，加入Fmoc-Ser(tBu)-OH的DMF溶液、DIEA搅拌反应，抽干溶剂，加入DIEA/甲醇/DCM溶液，封闭；DCM与甲醇交替洗涤，真空干燥后，得到Fmoc-Ser(tBu)-CTC Resin；
(2)第一片段的制备：
取Fmoc-Ser(tBu)-CTC Resin，加入反应柱中，加入DMF溶胀，抽干溶剂，加入哌啶/DMF溶液反应；抽干溶剂，加入DMF洗涤；茚检阳性；取Fmoc-Val-OH、HOBt、DIC，溶解于DMF，冰浴活化；将活化液加入到反应柱中反应，茚检检测结果呈阴性后，抽干溶剂；加入DMF洗涤；重复以上步骤，按照氨基酸序列，依次加入Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Boc-His(Trt)-Aib-OH进行偶联反应；偶联结束后，DCM与甲醇交替洗涤；真空干燥，得索马鲁肽第一片段肽树脂，将肽树脂加入到TFE/DCM中，反应；收集滤液，滤液进行真空旋干；得索马鲁肽第一片段；
(3)Fmoc-Ala-CTC Resin的制备：
取2-Cl-CTC树脂加入到固相反应器中，加入DMF溶胀树脂；抽干溶剂，加入Fmoc-Ala-OH的DMF溶液、DIEA搅拌反应，抽干溶剂，加入DIEA/甲醇/DCM溶液，封闭；DCM与甲醇交替洗涤，真空干燥后，得到Fmoc-Ala-CTC Resin；
(4)第二片段的制备：
取Fmoc-Ala-CTC Resin，加入反应柱中，加入DMF溶胀，抽干溶剂，加入哌啶/DMF溶液反应；抽干溶剂，加入DMF洗涤；茚检阳性；取Fmoc-Gln(trt)-OH、HOBt、DIC，溶解于DMF，冰浴活化；将活化液加入到反应柱中反应，茚检检测结果呈阴性后，抽干溶剂；加入DMF洗涤；重复以上步骤，按照氨基酸序列，依次加入Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH进行偶联反应；偶联结束后，DCM与甲醇交替洗涤；真空干燥，得索马鲁肽第一片段肽树脂，将肽树脂加入到TFE/DCM中，反应；收集滤液，滤液进行真空旋干；得索马鲁肽第二片段；
(5)Fmoc-Gly-Wang Resin的制备：
取Wang Resin加入到固相反应器中，加入DMF溶胀树脂；抽干溶剂，加入Fmoc-Gly-OH、HoBt、DIC，加入DMF溶液、搅拌反应，缓慢加入DMAP的DMF溶剂，抽干溶剂，加入AC2O/Py溶液，封闭；DCM与甲醇交替洗涤，真空干燥后，得到Fmoc-Gly-Wang Resin；
(6)第三片段的制备：
取Fmoc-Gly-Wang Resin，加入反应柱中，加入DMF溶胀，抽干溶剂，加入哌啶/DMF溶液反应；抽干溶剂，加入DMF洗涤；茚检阳性；取Fmoc-Gly-Arg(pbf)-OH、HOBt、DIC，溶解于DMF，冰浴活化；将活化液加入到反应柱中反应，茚检检测结果呈阴性后，抽干溶剂；加入DMF洗涤；重复以上步骤，按照氨基酸序列，依次加入Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(BOC)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Alloc)-OH、Fmoc-Ala-OH进行偶联反应；偶联结束后得第三片段；
(7)索马鲁肽肽树脂制备
取第二片段、HOBt、DIC，溶解于DMF，冰浴活化；将活化液加入到反应柱中反应，茚检检测结果呈阴性后，抽干溶剂；加入DMF洗涤；重复以上步骤，偶联第三片段，完成后得索马鲁肽第一肽树脂，取四(三苯基膦)钯、苯硅烷加入反应柱中，以DCM为反应溶剂脱除Lys20侧链ε氨基的保护基。以HoBt、DIC为缩合体系，哌啶/DMF溶液脱保护，依次偶联Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-γ-Glu-OtBu、十八烷二酸单叔丁酯，干燥得索马鲁肽肽树脂。
(8)索马鲁肽制备
配制裂解液TFA∶phenol∶Triisopropylsilane∶H2O＝85∶10∶3∶2，加入肽树脂反应，完成后抽滤，取滤液，将滤液加入到异丙醚中沉降，离心干燥得索马鲁肽粗品，经纯化制备，得成品索马鲁肽。
与现有技术相比，本发明方法能够有效的缩短生产周期，降低缺失、消旋、[+Gly29]、[+Ala19]、[+Ser11]、[D-His1]、[-Arg30]杂质的产生，降低纯化难度，并且能够有效的避免因DKP反应，提高收率，极大的降低了单克物料成本，便于大规模工业化生产。
附图说明
图1：为本发明的方法的一种合成路线图；
图2：为本发明制得索马鲁肽成品HPLC图谱。
具体实施方式
下述的实施例是为了进一步说明本发明的一些优选实施例，并非全部实施例。本领域专业人员在没有进行创造性劳动的前提下做出的基于本发明的其他实施例，都属于本发明的权利保护范围。下面将结合附图对本发明作进一步的说明。
本发明所使用缩写的含义列于下表：
本发明的一种合成路线如图1所示。
实施例1
索马鲁肽第一片段全保护肽的制备：
1)树脂溶胀：称取100g替代度为1.0mmol/g的2-Cl-CTC Resin，加入800ml DCM溶胀树脂0.5h，抽干溶剂，加入500ml DMF洗涤树脂两次，抽干溶剂。
2)Fmoc-Ser(tBu)-CTC Resin的制备：按照树脂、Fmoc-Ser(tBu)-OH、DIEA摩尔质量比为1∶2∶6，称取78.7g Fmoc-Ser(tBu)-OH溶解于500ml DMF中，加入105ml DIEA，混合均匀后，将溶液加入反应柱反应2h，抽干溶剂；加入600ml DMF洗涤树脂三次，抽干洗涤溶剂；按照DCM、甲醇、DIEA体积比为17∶2∶1，配制1200ml封闭液，封闭树脂两次，每次10min；加入600ml DMF洗涤树脂三次，抽干洗涤溶剂；甲醇洗涤三次，每次10min，抽干溶剂，真空干燥后，得到Fmoc-Ser(tBu)-CTC Resin 135.2g，测得取代度0.61mmol/g。
3)索马鲁肽第一片段肽树脂制备：a)氨基酸树脂溶胀，称取98.3g Fmoc-Ser(tBu)-CTC Resin，加入800ml DCM溶胀树脂0.5h，抽干溶剂，加入600ml DMF洗涤树脂两次，抽干溶剂；b)Fmoc保护基脱除，加入600ml 20％哌啶/DMF溶液到树脂中，脱保护两次，第一次脱保护时间为5min，第二次脱保护时间为15min，脱保护完成后，加入600ml DMF洗涤树脂，抽干溶解，重复5次，茚检阳性；c)按照树脂、Fmoc-Val-OH、HOBt、DIC摩尔质量比为1∶2∶2.4∶2.4，称取40.7g Fmoc-Val-OH、19.5g HOB溶解于600ml DMF中，加入22.3ml DIC，冰水浴活化5min后，将溶液加入反应柱30℃反应2h，茚检阴性，抽干溶剂，600ml DMF洗涤树脂3次，抽干溶剂；d)肽链延伸，重复以上步骤，按照氨基酸序列，依次加入Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Boc-His(Trt)-Aib-OH进行偶联反应得索马鲁肽第一片段肽树脂201.4g。
4)索马鲁肽第一片段全保护肽的制备：配制20％TFE/DCM溶液1 600ml，加入索马鲁肽第一片段肽树脂，反应2h，收集滤液，滤液进行真空旋干；得索马鲁肽第一片段115.2g。
实施例2
索马鲁肽第二片段全保护肽的制备：
1)树脂溶胀：称取100g替代度为1.0mmol/g的2-Cl-CTC Resin，加入800ml DCM溶胀树脂0.5h，抽干溶剂，加入500ml DMF洗涤树脂两次，抽干溶剂。
2)Fmoc-Ala-CTC Resin的制备：按照树脂、Fmoc-Ala-OH、DIEA摩尔质量比为1∶2∶6，称取62.2g Fmoc-Ala-OH溶解于500ml DMF中，加入105ml DIEA，混合均匀后，将溶液加入反应柱反应2h，抽干溶剂；加入600ml DMF洗涤树脂三次，抽干洗涤溶剂；按照DCM、甲醇、DIEA体积比为17∶2∶1，配制1200ml封闭液，封闭树脂两次，每次10min；加入600ml DMF洗涤树脂三次，抽干洗涤溶剂；甲醇洗涤三次，每次10min，抽干溶剂，真空干燥后，得到Fmoc-Ser(tBu)-CTC Resin 135.2g，测得取代度0.65mmol/g。
3)索马鲁肽第二片段肽树脂制备：a)氨基酸树脂溶胀，称取92.3g Fmoc-Ala-CTCResin，加入800ml DCM溶胀树脂0.5h，抽干溶剂，加入600ml DMF洗涤树脂两次，抽干溶剂；b)Fmoc保护基脱除，加入600ml 20％哌啶/DMF溶液到树脂中，脱保护两次，第一次脱保护时间为5min，第二次脱保护时间为15min，脱保护完成后，加入600ml DMF洗涤树脂，抽干溶解，重复5次，茚检阳性；c)按照树脂、Fmoc-Gln(tre)-OH、HOBt、DIC摩尔质量比为1∶2∶2.4∶2.4，称取73.3g Fmoc-Gln(trt)-OH、19.5g HOB溶解于600ml DMF中，加入22.3ml DIC，冰水浴活化5min后，将溶液加入反应柱30℃反应2h，茚检阴性，抽干溶剂，600ml DMF洗涤树脂3次，抽干溶剂；d)肽链延伸，重复以上步骤，按照氨基酸序列，依次加入Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH进行偶联反应得索马鲁肽第一片段肽树脂168.1g。
4)索马鲁肽第二片段全保护肽的制备：配制20％TFE/DCM溶液1 400ml，加入索马鲁肽第一片段肽树脂，反应2h，收集滤液，滤液进行真空旋干；得索马鲁肽第二片段82.5g。
实施例3
索马鲁肽第三片段肽树脂的制备：
1)树脂溶胀：称取100g替代度为1.0mmol/g的Wang Resin，加入800ml DCM溶胀树脂0.5h，抽干溶剂，加入500ml DMF洗涤树脂两次，抽干溶剂。
2)Fmoc-Gly-Wang Resin的制备：按照树脂、Fmoc-Gly-OH、HoBt、DIC、DMAP摩尔质量比为1∶1∶1.2∶1.2∶0.1，称取29.7g Fmoc-Ala-OH、16.2g HoBt溶解于450ml DMF中，加入18.6ml DIC活化5min，将活化液加入树脂30℃反应10min，称取1.2g DMAP溶解于50ml DMF中，缓慢滴加入反应柱中30℃继续反应1.5h，抽干溶剂；加入600ml DMF洗涤树脂三次，抽干洗涤溶剂；按照树脂、醋酐、吡啶摩尔比为1∶20∶5，加入封闭液，反应5h；加入600ml DMF洗涤树脂三次，抽干洗涤溶剂；甲醇洗涤三次，每次10min，抽干溶剂，真空干燥后，得到Fmoc-Gly-Wang Resin 124.8g，测得取代度0.32mmol/g。
3)索马鲁肽第三片段肽树脂制备：a)氨基酸树脂溶胀，称取93.7g Fmoc-Ala-CTCResin，加入800ml DCM溶胀树脂0.5h，抽干溶剂，加入600ml DMF洗涤树脂两次，抽干溶剂；b)Fmoc保护基脱除，加入600ml 20％哌啶/DMF溶液到树脂中，脱保护两次，第一次脱保护时间为5min，第二次脱保护时间为15min，脱保护完成后，加入600ml DMF洗涤树脂，抽干溶解，重复5次，茚检阳性；c)按照树脂、Fmoc-Gly-Arg(pbf)-OH、HOBt、DIC摩尔质量比为1∶2∶2.4∶2.4，称取42.3g Fmoc-Gly-Arg(pbf)-OH、19.5g HOB溶解于600ml DMF中，加入22.3ml DIC，冰水浴活化5min后，将溶液加入反应柱30℃反应2h，茚检阴性，抽干溶剂，600ml DMF洗涤树脂3次，抽干溶剂；d)肽链延伸，重复以上步骤，按照氨基酸序列，依次加入Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(BOC)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Alloc)-OH、Fmoc-Ala-OH进行偶联反应得索马鲁肽第三片段肽树脂166.5g。
实施例4
索马鲁肽肽树脂制备：
1)索马鲁肽第三片段肽树脂溶胀：将166.5g第三片段肽树脂置于反应柱中，加入1000ml DCM溶胀0.5h，抽干溶剂，加入800ml DMF洗涤树脂两次，抽干溶剂。
2)索马鲁肽肽树脂制备：a)第二片段偶联，按照索马鲁肽第一片段肽树脂、索马鲁肽第二片段全保护、HOBt、DIC摩尔质量比为1∶2∶3∶3，称取82.5g索马鲁肽第二片段全保护、12.2g HOB溶解于600ml DMF中，加入14ml DIC，冰水浴活化5min后，将溶液加入反应柱30℃反应4h，茚检阴，性抽干溶剂，800ml DMF洗涤树脂3次，抽干溶剂；b)索马鲁肽第一肽树脂制备，按照第二片段的偶联方式偶联第一片段得索马鲁肽第一肽树脂；c)Alloc保护基的脱除，按照树脂、苯基硅烷、四(三苯基膦)钯摩尔质量比为1∶10∶0.2，在30℃条件下加入37ml和77g四(三苯基膦)钯的DCM溶液进行2次脱Alloc保护基，每次反应时间为10min，反应完成后先用800ml DCM洗涤树脂五次，再用800ml DMF洗涤树脂两次，抽干溶剂；d)Fmoc-AEEA-OH的偶联，按照树脂、Fmoc-AEEA-OH、HOBt、DIC摩尔质量比为1∶3∶3.6∶3.6，称取34.7g Fmoc-AEEA-OH、14.6g HOB溶解于600ml DMF中，加入17ml DIC，冰水浴活化5min后，将溶液加入反应柱30℃反应2h，茚检阴性，抽干溶剂，800ml DMF洗涤树脂3次，抽干溶剂；d)侧链延伸，重复以上步骤，按照侧链氨基酸序列，依次加入Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-γ-Glu-OtBu、十八烷二酸单叔丁酯，进行偶联反应得索马鲁肽肽树脂260.8g。
实施例5
索马鲁肽肽树脂裂解：
按照TFA∶phenol∶Triisopropylsilane∶H2O＝85∶10∶3∶2的比例配制2 000ml裂解液，加入实施例4中制得的索马鲁肽肽树脂，反应3h，抽滤，适量TFA洗涤树脂，合并滤液，将滤液加入8倍量体积的异丙醚中沉降、离心，再用异丙醚将沉降物洗涤三次，真空干燥，得索马鲁肽粗肽182.3g。
实施例6
用反相高效液相色潽法对粗肽进行两步纯化，一步脱盐，流速为80ml/min，紫外检测波长230nm，C18制备柱(50×250mm，10μm)，a)第一步纯化：流动相A相为0.1％TFA的水溶液，流动相B相ACN，洗脱时间40min，洗脱梯度B相35％-43％；b)第二步纯化：动相A相是pH2.3的磷酸三乙胺水溶液，流动相B相为ACN溶液，洗脱时间40min，洗脱梯度B相32％-42％；c)脱盐、冻干得索玛鲁肽纯品43.2g。经检测索玛鲁肽纯品纯度99.64％，总收率35.0％。
图2为本发明制得索马鲁肽成品HPLC图谱；纯度99.64％，最大单杂0.24％，总杂0.36％。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (1)
1.一种索马鲁肽的固相合成方法，其特征在于，其步骤具体如下：
（1）Fmoc-Ser(tBu)-CTC Resin的制备：
取2-Cl-CTC树脂加入到固相反应器中，加入DMF溶胀树脂；抽干溶剂，加入Fmoc-Ser(tBu)-OH的DMF溶液、DIEA搅拌反应，抽干溶剂，加入DIEA/甲醇/DCM溶液，封闭；DCM与甲醇交替洗涤，真空干燥后，得到Fmoc-Ser(tBu)-CTC Resin；
（2）第一片段的制备：
取Fmoc-Ser(tBu)-CTC Resin，加入反应柱中，加入DMF溶胀，抽干溶剂，加入哌啶/DMF溶液反应；抽干溶剂，加入DMF洗涤；茚检阳性；取Fmoc-Val-OH、HOBt、DIC，溶解于DMF，冰浴活化；将活化液加入到反应柱中反应，茚检检测结果呈阴性后，抽干溶剂；加入DMF洗涤；重复以上步骤，按照氨基酸序列，依次加入Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Boc-His(Trt)-Aib-OH进行偶联反应；偶联结束后，DCM与甲醇交替洗涤；真空干燥，得索马鲁肽第一片段肽树脂，将肽树脂加入到TFE/DCM中，反应；收集滤液，滤液进行真空旋干；得索马鲁肽第一片段；
（3）Fmoc-Ala-CTC Resin的制备：
取2-Cl-CTC树脂加入到固相反应器中，加入DMF溶胀树脂；抽干溶剂，加入Fmoc-Ala-OH的DMF溶液、DIEA搅拌反应，抽干溶剂，加入DIEA/甲醇/DCM溶液，封闭；DCM与甲醇交替洗涤，真空干燥后，得到Fmoc-Ala-CTC Resin；
（4）第二片段的制备：
取Fmoc-Ala-CTC Resin，加入反应柱中，加入DMF溶胀，抽干溶剂，加入哌啶/DMF溶液反应；抽干溶剂，加入DMF洗涤；茚检阳性；取Fmoc-Gln(trt)-OH、HOBt、DIC，溶解于DMF，冰浴活化；将活化液加入到反应柱中反应，茚检检测结果呈阴性后，抽干溶剂；加入DMF洗涤；重复以上步骤，按照氨基酸序列，依次加入Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH进行偶联反应；偶联结束后，DCM与甲醇交替洗涤；真空干燥，得索马鲁肽第二片段肽树脂，将肽树脂加入到TFE/DCM中，反应；收集滤液，滤液进行真空旋干；得索马鲁肽第二片段；
（5）Fmoc-Gly-Wang Resin的制备：
取Wang Resin加入到固相反应器中，加入DMF溶胀树脂；抽干溶剂，加入Fmoc-Gly-OH、HoBt、DIC，加入DMF溶液、搅拌反应，缓慢加入DMAP的DMF溶剂，抽干溶剂，加入AC2O/Py溶液，封闭；DCM与甲醇交替洗涤，真空干燥后，得到Fmoc-Gly-Wang Resin；
（6）第三片段的制备：
取Fmoc-Gly-Wang Resin，加入反应柱中，加入DMF溶胀，抽干溶剂，加入哌啶/DMF溶液反应；抽干溶剂，加入DMF洗涤；茚检阳性；取Fmoc-Gly-Arg(pbf)-OH、HOBt、DIC，溶解于DMF，冰浴活化；将活化液加入到反应柱中反应，茚检检测结果呈阴性后，抽干溶剂；加入DMF洗涤；重复以上步骤，按照氨基酸序列，依次加入Fmoc- Arg(pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(BOC)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Alloc)-OH、Fmoc-Ala-OH进行偶联反应；偶联结束后得第三片段；
（7）索马鲁肽肽树脂制备：
索马鲁肽第三片段肽树脂溶胀：将166.5g第三片段肽树脂置于反应柱中，加入1000mlDCM溶胀0.5h，抽干溶剂，加入800ml DMF洗涤树脂两次，抽干溶剂；取第二片段、HOBt、DIC，溶解于DMF，冰浴活化；将活化液加入到反应柱中反应，茚检检测结果呈阴性后，抽干溶剂；加入DMF洗涤；重复以上步骤，偶联第三片段，完成后得索马鲁肽第一肽树脂，取四（三苯基膦）钯、苯硅烷加入反应柱中，以DCM为反应溶剂脱除Lys20侧链ε氨基的保护基；以HoBt、DIC为缩合体系，哌啶/DMF溶液脱保护，依次偶联Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-γ-Glu-OtBu、十八烷二酸单叔丁酯，干燥得索马鲁肽肽树脂；
（8）索马鲁肽制备：配置裂解液TFA：phenol：Triisopropylsilane：H2O=85:10:3:2，加入肽树脂反应，完成后抽滤，取滤液，将滤液加入到异丙醚中沉降，离心干燥得索马鲁肽粗品，经纯化制备，得成品索马鲁肽。
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