CN1250722C

CN1250722C - 分泌生产蛋白质的方法

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Publication number: CN1250722C
Application number: CNB028076265A
Authority: CN
Inventors: 菊池庆实; 伊达雅代; 梅泽有希子; 横山敬一; 平马晴雄; 松井裕
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2001-03-30
Filing date: 2002-03-27
Publication date: 2006-04-12
Anticipated expiration: 2022-03-27
Also published as: CA2442679A1; JP4362651B2; DK1375664T3; EP1375664A4; EP1375664B1; AU2002242986A1; BR0208136A; US7252972B2; RU2003128977A; ES2335750T3; JPWO2002081694A1; KR20030087042A; CA2442679C; DE60234247D1; EP1375664A1; BR0208136B1; WO2002081694A1; WO2002081694A8; CN1500145A; RU2264463C2

Abstract

本发明的目的在于通过使棒状杆菌生产工业上有用的蛋白质，提供制备异源蛋白质的方法。在本发明中，使用其中目标异源蛋白质基因序列连接于编码来源于棒状杆菌的信号肽区的序列下游的表达基因构建物，将该表达基因构建物引入到与野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13869相比具有至少2倍的分泌该异源蛋白质能力的棒状杆菌变异菌株中，培养转化的棒状杆菌，并回收释放到菌体外的异源蛋白质。

Description

分泌生产蛋白质的方法

发明背景

本发明涉及通过棒状杆菌有效地分泌生产异源蛋白质的方法。

到目前为止，异源蛋白质的分泌生产已有通过芽孢杆菌属(Bacillus)细菌进行分泌生产的综述[Microbiol.rev.，57，109-137(1993)]、通过嗜甲醇酵母巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)进行的分泌生产综述[Biotechnol.，11，905-910(1993)]以及通过曲霉属(Aspergillus)的霉菌进行的工业化生产的报道[Biotechnol.，6，1419-1422(1988)；Biotechnol.，9，976-981(1991)]等多个报道。

在本发明的一个实施方案中，分泌生产的转谷氨酰胺酶是催化蛋白质肽链内γ-羧基酰胺基的酰基转移反应的酶。将该酶作用于蛋白质，则发生ε-(γ-Glu)-Lys交联反应、Gln通过脱酰胺作用置换为Glu的反应。该转谷氨酰胺酶可以用于生产果冻等凝胶状食品、酸乳、乳酪或凝胶状化妆品等或改善食用肉的肉质等(特公平1-50382)。还可应用于生产热稳定的微胶囊材料、固定化酶的载体等，是工业应用性高的酶。

已知转谷氨酰胺酶有来源于动物的和来源于微生物的(微生物转谷氨酰胺酶：以下称为“MTG”)。前者是依赖于钙离子酶，分布于动物的内脏、皮肤、血液等。例如有豚鼠肝脏转谷氨酰胺酶(K.Ikura等Biochemistry 27，2898(1988))、人表皮角质细胞转谷氨酰胺酶(M.A.Phillips等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，9333(1990))、人凝血因子XIII(A.Ichinose等Biochemistry 25，6900(1990))等。

关于后者，从链轮丝菌属(Streptoverticillium)的细菌中，发现了非依钙酶。例如有灰肉色链轮丝菌(Streptoverticilllum griseocarneum)IFO12776、肉桂链轮丝菌肉桂亚种(Streptoverticillium cinnamoneum sub sp.cinnamoneum)(以下简称为肉桂链轮丝菌(S.cinnamoneum))IFO 12852、茂原链轮丝菌(Streptoverticillium mobaraense)IFO 13819等(特开昭64-27471)。通过作肽图和基因结构分析，结果表明这些微生物生产的转谷氨酰胺酶的一级结构与来源于动物的该酶完全不具同源性(欧洲专利公开公报0 481 504 A1)。

来源于微生物的转谷氨酰胺酶(MTG)由于是由上述菌类等培养物经纯化操作而制备的，因而有供应量、效率等问题。另外，也尝试了通过基因工程方法制备转谷氨酰胺酶。关于转谷氨酰胺酶蛋白质及其基因在例如Biosci.Biotechnol.Biochem.，58，82-87(1994)；Biosci.Biotechnol.Biochem.，58，88-92(1994)；Biochimie，80，313-319(1998)；Eur.J.Biochem.，257,570-576(1998)；WO 96/06931、WO 96/22366等中有报道，其中，有关于在例如浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、大肠杆菌(Escherichia coli)等宿主载体系统中表达生产的报道。除这些信息之外，还报道了下述方法：在大肠杆菌、酵母等微生物中分泌表达(特开平5-199883)的方法；使MTG作为无活性融合蛋白内含体在大肠杆菌中表达，然后用蛋白质变性剂使该内含体溶解，再经除去变性剂的处理使其重建来生产具有活性的MTG的方法(特开平6-30771)。但是，像这样的由大肠杆菌和酵母等微生物进行的分泌表达，有其表达水平非常低的问题。

另一方面，现有利用棒状杆菌来有效地分泌生产异源蛋白质的研究有：由谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)分泌核酸酶和脂酶[US4965197，J.Bacteriol.，174，1854-1861(1992)]、分泌枯草杆菌蛋白酶等蛋白酶[Appl.Environ.Microbiol.，61，1610-1613(1995)]、有关棒状杆菌的细胞表面蛋白分泌的研究[特表平6-502548]、利用上述研究的纤连蛋白结合蛋白的分泌[Appl.Environ.Microbiol.，63，4392-4400(1997)]、利用变异型分泌装置提高蛋白质的分泌的报道[特开平11-169182]等，但只是对极有限的蛋白质有极少数的报道。以蛋白质的累积量来看，在Appl.Environ.Microbiol.，61，1610-1613(1995)中，有利用来源于枯草芽孢杆菌(Bactllus subtilis)的枯草杆菌蛋白酶基因(aprE)的启动子、核糖体结合位点和信号肽的序列，使来源于节瘤偶蹄形菌(Dichelobacternodosus)的碱性蛋白酶的基因在谷氨酸棒杆菌中表达，证实累积了约2.5mg/m1的例子，但在US4965197、特表平6-502548或特开平11-169182中未记载具体的分泌累积值，另外，在纤连蛋白结合蛋白的分泌[Appl.Environ.Microbiol.，63，4392-4400(1997)]中，只不过证实最大约2.5μg/L这样非常少量的分泌累积。如上所述，尚未有可应用水平的、在培养基中有效地累积异源蛋白质的报道。

另外，关于棒状杆菌的基因操作技术在使用质粒和噬菌体的系统中发展起来，已建立了通过原生质体进行转化的方法[J.Bacteriol.，159，306-311(1984)；J.Bacteriol.，161，463-467(1985)]、开发了各种载体[Agric.Biol.Chem.，48，2901-2903(1984)；J.Bacteriol.，159，306-311(1984)；J.Gen.Microbiol.，130，2237-2246(1984)；Gene，47，301-306(1986)；Appl.Microbiol.Biotechnol.，31，65-69(1989)]、开发了基因表达调控的方法[Bio/Technology，6，428-430(1988)]以及开发了质粒[Gene，39，281-286(1985)]等。另外也报道了来源于棒状杆菌的基因克隆[Nucleic Acids Res.，14，10113-1011(1986)；J.Bacteriol.，167，695-702(1986)；Nucleic AcidsRes.，15，10598(1987)；Nucleic Acids Res.，15，3922(1987)；Nucleic AcidsRes.，16，9859(1988)；Agric.Biol.Chem.，52，525-531(1988)；Mol.Microbiol.，2，63-72(1988)；Mol.Gen.Genet.，218,330-339(1989)；Gene，77，237-251(1989)]。

还报道了来源于棒状杆菌的转座因子[WO93/18151；EP0445385；特开平6-46867；Mol.Microbiol.，11，739-746(1994)；Mol.Microbiol.，14，571-581(1994)；Mol.Gen.Genet.，245，397-405(1994)；FEMS Microbiol.Lett.，126，1-6(1995)；特开平7-107976]。

转座因子是可在染色体上转座的DNA片段，已知存在于从原核生物到真核生物的广泛的生物当中。已开发出利用转座因子的转座子[WO93/18151；特开平7-107967；Mol.Gen.Genet.，245，397-405(1994)；特开平9-70291]，也可以使用转座子表达异源基因。

发明内容

本发明的目的在于：提供通过使棒状杆菌生产工业上有用的异源蛋白质，例如转谷氨酰胺酶，并使其有效地分泌(分泌生产)到菌体外，来制备异源蛋白质的方法。

本发明人在使用棒状杆菌生产异源蛋白质时，发现了显示出比野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13869显著高的生产能力的变异菌株，从而发明了有效地分泌生产工业上有用的异源蛋白质的方法。

即，本发明涉及异源蛋白质的制备方法，其特征在于：在与野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13869相比具有至少2倍的分泌异源蛋白质的能力的棒状杆菌变异菌株中，异源蛋白质连接到来源于棒状杆菌的信号肽的下游，产生融合蛋白，并使该异源蛋白质分泌到菌体外。

更具体地说，本发明是通过下述步骤获得大量的目标异源蛋白质，例如转谷氨酰胺酶的方法：将一种表达构成物引入棒状杆菌，所述表达构成物是在编码来源于棒状杆菌的信号肽区，特别是编码细胞表面蛋白的信号肽区的序列的下游结合了目标蛋白基因序列而成；培养得到的转化棒状杆菌；使生成的蛋白质有效地分泌到菌体外；回收释放到菌体外的蛋白质。

本说明书中，蛋白质或肽的“分泌”是指蛋白质或肽的分子被转运到细菌菌体外(细胞外)，当然包括蛋白质或肽分子在培养基中最终完全以游离状态存在的情况，也包括只有部分存在于菌体外的情况以及存在于菌体表面的情况。

实施发明的最佳方式

根据本发明的方法，使用棒状杆菌作为宿主载体系统，构建在棒状杆菌细胞表面蛋白信号肽的下游连接目标蛋白质基因的表达构建物，将其引入棒状杆菌内并表达，从而获得大量的、分泌到菌体外的目标蛋白质。按照本发明的方法分泌生产的异源蛋白质是工业上有用的酶、生理活性蛋白、肽等，在本发明的一个实施方案中，分泌生产的转谷氨酰胺酶广泛地应用于食品加工和医药等领域。

已知分泌性蛋白通常首先翻译成前肽(prepeptide)或前肽原(prepropeptide)，然后成为成熟蛋白质。即，已知通常翻译为前肽或前肽原后，信号肽(“前(pre)部分”)被切除，成为成熟肽或肽原(propeptide)，肽原通过蛋白酶进一步切除原(pro)部分，成为成熟肽。本说明书中，“信号序列”是指存在于分泌性蛋白前体的N末端，且在天然成熟蛋白质中不存在的序列；“信号肽”是指从这样的蛋白质前体被切除的肽。通常，随着向菌体外分泌，信号序列由蛋白酶(通常称为信号肽酶)切除。这样的信号肽具有超越生物种类的某种共同的序列上的特征，但在某一生物种类显示分泌性能的信号肽，在其他生物种类中未必会发挥分泌功能。

本说明书中，将含有信号肽和原部分两者的蛋白质，即初级翻译产物称为“前蛋白质原”，另外，将不含有信号肽但含有原部分的蛋白质称为“蛋白质原”。蛋白质原的原部分也称为“原结构部分”或只称为“原结构”，本说明书中，蛋白质的“原结构部分/原结构”和蛋白质的“原部分”可以互换使用。在前蛋白质原或前蛋白质中，信号肽可以来源于不同的蛋白质，也可以是天然存在于目标蛋白质中的信号肽，但优选来源于所使用的宿主的分泌性蛋白质。或者，也可以根据所使用的宿主的密码子使用频率而改变，使其具有最适密码子。

可用于本发明的目的的信号肽也可以包含该信号肽的来源即天然成熟蛋白质的N末端氨基酸序列的一部分。信号肽来源于不同的蛋白质时，也特别将前蛋白质原称为“异源融合前蛋白质原”。例如，蛋白质为转谷氨酰胺酶时，分别称为“前转谷氨酰胺酶原”、“转谷氨酰胺酶原”和“异源融合前转谷氨酰胺酶原”。另外，“切除了原部分”的蛋白质是指通过切割肽键，除去了构成原部分的至少1个以上的氨基酸的蛋白质，包括：其N末端区与天然的成熟蛋白质的N末端区完全一致的蛋白质；在具有该蛋白质的活性的条件下，也包括与天然蛋白质比较，N末端还具有来源于原部分的1个以上的残余氨基酸的蛋白质；以及氨基酸序列比天然成熟蛋白质还短的蛋白质。

如背景技术中所述，目前使用棒状杆菌向菌体外分泌生产异源蛋白质的例子极少，且技术上尚未成熟。并且尚未见到棒状杆菌本身向菌体外分泌蛋白酶等蛋白质的例子，只有内源DNA酶的分泌[US4965197]以及本发明中使用的细胞表面蛋白[特表平6-502548]由细胞表面脱落，在菌体外被发现的事实。但除了细胞表面蛋白之外，尚未知棒状杆菌中涉及分泌的信号肽。目前已知的棒状杆菌的细胞表面蛋白仅知有谷氨酸棒杆菌的细胞表面蛋白即PS1和PS2的基因[特表平6-502548]和产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)的细胞表面蛋白即SlpA的基因[特开平10-108675]。在这些蛋白质中，已证实PS1和SlpA之间有若干同源性(约30％)，但在其他蛋白质中则几乎未见同源性，并且信号序列区也未见相互的同源性。以信号序列为例，谷氨酸棒杆菌的PS1和PS2的信号序列如SEQ ID NO.1和2所示，产氨棒杆菌的SlpA的信号序列如SEQ ID NO.3所示。

因此，本发明人在从谷氨酸棒杆菌(旧称乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum))ATCC13869菌株中克隆PS2蛋白质基因，测定其序列时，未见信号序列区与已知的来源于谷氨酸棒杆菌的序列(特表平6-502548)不同，但已证实到成熟细胞表面蛋白的N末端氨基酸第38号残基为止，共有2处不同(已知序列中，SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列中的第40号残基Asn变为Thr、第55号残基Glu变为Gly)。SEQ ID NO.4显示了编码包含该信号序列30个氨基酸残基和成熟细胞表面蛋白的N末端氨基酸38个残基共68个残基的核苷酸序列以及包含启动子区的其5’上游区，SEQ ID NO.5显示了其氨基酸序列。

本发明人利用包含细胞表面蛋白的启动子区和信号肽的区，进行了所述异源蛋白质的分泌研究，以便确定是否可以用棒状杆菌菌体外大量分泌生产异源蛋白质。

来源于放线菌的转谷氨酰胺酶基因的GC含量高，棒状杆菌也与其相似，并且密码子选择也近似，因此有可以直接利用放线菌的基因的优点。本发明人探讨了是否可以直接利用来源于放线菌的转谷氨酰胺酶基因，结果表明：来源于放线菌的转谷氨酰胺酶的信号肽无法在棒状杆菌中发挥作用。但是，已表明：编码与来源于棒状杆菌的细胞表面蛋白的信号肽融合的、来源于放线菌的含原结构部分的成熟蛋白的转谷氨酰胺酶基因可以直接有效地发挥作用，可以以具有原结构部分的蛋白质的形式有效地分泌到菌体外。并且，如果使用另外多含细胞表面蛋白信号肽的30个氨基酸残基和成熟细胞表面蛋白的N末端部分的38氨基酸残基，即，使用融合了成熟细胞表面蛋白N末端部分的、带原结构部分的转谷氨酰胺酶基因，则显示会进一步提高向菌体外分泌转谷氨酰胺酶原的效率。

本发明中所述的棒状杆菌是指好气性革兰氏阳性杆菌，包括原来被分类为短杆菌属(Brevibacterium)，但现在被归为棒杆菌属(Corynebacterium)的细菌(Int.J.Syst.Bacteriol.，41，255(1991))，另外还包括与棒杆菌属非常近缘的短杆菌属细菌。使用棒状杆菌的优点在于：与至今为止被认为适合分泌异源蛋白质的霉菌、酵母和芽孢杆菌属细菌相比，本身分泌到菌体外的蛋白质极少，可以简化、省略分泌生产异源蛋白质时的纯化过程，另外在糖、氨和无机盐等简单的培养基上即可良好生长，在培养基费用和培养方法、培养的生产性上具有优异之处。

本发明中，可作为宿主菌使用的棒状杆菌是从产L-谷氨酸菌的代表性的解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum)ATCC14066、Brevibacterium immariophilumATCC 14068、乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)(谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum))ATCC13869、玫瑰色短杆菌(Brevibacteriumroseum)ATCC13825、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)(谷氨酸棒杆菌)ATCC 14067、嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)ATCC13870、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032、百合花棒杆菌(Corynebacterium lilium)(谷氨酸棒杆菌)ATCC15990、产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)(产氨棒杆菌(Corynebacteriumammoniagenes))ATCC6871等的野生菌株或其变异菌株衍生的变异菌株，是与野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13869相比，具有至少2倍的分泌异源蛋白质的能力的变异菌株。

本发明的变异菌株包括例如谷氨酸生产能力缺陷型变异菌株、进一步包括赖氨酸等产氨基酸变异菌株、生产如肌苷的核酸等其他物质的变异菌株。本发明的变异菌株可通过经紫外线照射或用N-甲基-N’-亚硝基胍等化学诱变剂进行处理后，筛选蛋白质分泌生产能力高的菌株而获得。

特别是从野生菌株谷氨酸棒杆菌ATCC13869中分离的链霉素(Sm)抗性变异菌株即谷氨酸棒杆菌AJ12036(FERM BP-734)(保藏日为1985年3月13日)(现在的独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心、日本国茨城县筑波市东1-1-1中央第6、邮政编码305-8566)与其亲株(野生菌株)相比，可以推断与蛋白质分泌有关的功能基因中存在突变，在最适培养条件下异源蛋白质的分泌生产能力，其累积量可以极大地提高2-3倍，是优选的宿主菌。并且，如果对这样的菌株进行修饰，使其不生产细胞表面蛋白的改变，以经修饰的菌株作为宿主使用，则分泌到培养基中的异源蛋白质的纯化变得容易，因而特别优选。这样的改变可以通过诱变或基因重组向染色体上的细胞表面蛋白区或其表达调控区引入突变进行。

本发明使用的基因构建物通常在可以发挥功能的适当的位置具有下述序列：启动子、编码适当的信号肽的序列；编码目标蛋白质的核酸片段；和用于在棒状杆菌中表达目标蛋白质基因所必需的控制序列(操纵基因和终止子等)。目标蛋白质可在其N末端具有原结构部分。可用于该构建物的载体并无特别限定，只要是可在棒状杆菌中发挥功能即可，可以是如质粒那样在染色体外自主增殖的载体，也可以是整合到细菌染色体中的载体。特别优选来源于棒状杆菌的质粒。它们包括例如pHM1519(Agric，Biol.Chem.，48，2901-2903(1984))、pAM330(Agric，Biol.Chem.，48，2901-2903(1984))及改良的、具有抗药性基因的质粒。

另外，也可以利用人工转座子。使用转座子时，通过同源重组或其本身的的转座能力将目标基因引入染色体中。

可用于本发明的启动子并无特别限定，通常只要是可在棒状杆菌的菌体内发挥功能的都可使用，并且，也可以是来源于异源的例如tac启动子等来源于大肠杆菌的启动子。其中，更优选tac启动子等强启动子。

来源于棒状杆菌的启动子可以是：例如细胞表面蛋白的PS1、PS2，SlpA的基因的启动子；各种氨基酸生物合成系统的启动子，例如谷氨酸生物合成系统的谷氨酸脱氢酶基因，谷氨酰胺生物合成系统的谷氨酰胺合成酶基因，赖氨酸生物合成系统的天冬氨酸激酶基因，苏氨酸生物合成系统的高丝氨酸脱氢酶基因，异亮氨酸和缬氨酸生物合成系统的乙酰羟酸合成酶基因，亮氨酸生物合成系统的2-异丙基苹果酸合成酶基因，脯氨酸和精氨酸生物合成系统的谷氨酸激酶基因，组氨酸生物合成系统的磷酸核糖-ATP焦磷酸酶基因，色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等芳族氨基酸生物合成系统的脱氧阿拉伯庚糖醛酸磷酸(DAHP)合成酶基因，肌苷酸和鸟苷酸等核酸生物合成系统中的磷酸核糖焦磷酸(PRPP)转酰胺酶基因，肌苷酸脱氢酶基因和鸟苷酸合成酶基因。

本发明中使用的信号肽是棒状杆菌宿主的分泌性蛋白质的信号肽，优选为棒状杆菌的细胞表面蛋白的信号肽。棒状杆菌的细胞表面蛋白有来源于谷氨酸棒杆菌的PS1和PS2(特表平6-502548)、来源于产氨棒杆菌的SlpA(特开平10-108675)。PS1的信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，PS2的信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，SlpA的信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。另外，如美国专利4965197所述，来源于棒状杆菌的DNA酶中也有信号肽，这样的信号肽也可以用于本发明。

也可以在信号肽中添加该信号肽的来源即分泌性蛋白质的N末端氨基酸序列的一部分。在翻译产物分泌到菌体外时，由信号肽酶切除信号序列。编码信号肽的基因可以直接使用天然型，也可以根据所用宿主的密码子的使用频率加以改变，使其具有最适密码子。

使用这些信号肽时，将编码目标蛋白质的基因连接到编码信号肽的基因的3’末端一侧，且配于上述启动子的表达控制之下。

根据本发明分泌生产的有用蛋白质，实质上包括所有来源于动植物和微生物的分泌性蛋白质，并没有特别限定。例如可以根据本发明分泌生产蛋白酶、内肽酶、外肽酶、氨肽酶、羧肽酶、胶原酶和壳多糖酶等蛋白质。优选根据本发明分泌生产的蛋白质是天然的、分泌性蛋白质，也可以是添加了原结构部分的蛋白质，作为根据本发明的分泌生产的有用蛋白质，特别优选转谷氨酰胺酶。作为转谷氨酰胺酶基因，放线菌例如茂原链轮丝菌IFO 13819、肉桂链轮丝菌IFO 12852、灰肉色链轮丝菌IFO 12776、利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)[WO9606931]等或卵菌纲(Oomycetes)[WO9622366]等的霉菌等的分泌性转谷氨酰胺酶的基因可以用于本发明的目的。编码这些蛋白质的基因可以根据所使用的宿主和期望获得的活性而改变，其中包括1个以上的氨基酸的插入、缺失、取代等，如有需要，可以根据宿主的密码子的使用频率，转换为最适密码子。

根据本发明分泌生产表达为天然前肽原的蛋白质时，特别优选使用编码包含原结构部分(原部分)的蛋白质原的基因片段，但这不是必须的。使用编码蛋白质原的基因时，由该基因的表达得到的蛋白质的原结构部分可以通过适当的方法，例如用蛋白酶切除，可以使用氨肽酶、在适当的位置切割的内肽酶、或更具特异性的蛋白酶，优选在使所产生的蛋白质与天然蛋白质具有同等或以上的活性的位置进行切割的蛋白酶。或者也可以改变编码目标蛋白质或目标蛋白质的原结构部分的基因序列，设计用以表达对所需位置具有特异性的蛋白酶的识别位点的蛋白质。包括这样的改变技术、基因的克隆技术、所生产的蛋白质的检测技术的通常的分子生物学方法是本领域技术人员已知的，例如可以参照Sambrook等，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition(1989)Cold Spring Harbor Laboratory press，Cold SpringHarbor，New York；DNA cloning：A Practical Approach，Volumes I and II(D.N.Glover编著1985)；F.M.Ausubel等(编著)；Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.(1994)、PCR Technology：Principles and Application for DNA Amplification，H Erlich编著，StocktonPress等。

根据本发明最终得到的蛋白质的N末端区不一定与天然蛋白质相同，可以多插入或缺失1～数个氨基酸。使用蛋白酶时，从其蛋白质的活性的观点来看，通常优选与天然蛋白质在几乎相同的位置切割，更优选为与天然肽相同的成熟肽。从而，通常最优选在产生与天然产生的成熟蛋白质相同的蛋白质的位置切割肽的特异性蛋白酶。但是，对于特定的目的，与天然蛋白质比较N末端长或短1～数个氨基酸的肽，则具有更适当的活性。这样的蛋白酶除可以象中性蛋白酶(Dispase)(Boehringer Manheim制造)那样通过商业途径购得的蛋白酶外，也包括从微生物培养液，例如从放线菌的培养液等中获得的蛋白酶。这样的蛋白酶可以以未纯化状态使用，也可以根据需要纯化到适当的纯度后使用。

用于切除来源于放线菌的转谷氨酰胺酶原的原结构部分的其他适宜的蛋白酶有：例如白浅灰链霉菌(Streptomyces albogriseolus)产生的丝氨酸蛋白酶即SAMP45。SEQ ID NO.6和7显示了茂原链轮丝菌的转谷氨酰胺酶的基因序列和该序列编码的全长氨基酸序列(1～31号为信号序列、32～76号为原结构部分、77～407号为成熟转谷氨酰胺酶)，当为茂原链轮丝菌的转谷氨酰胺酶原时，SAMP45优先在原结构部分中第72号的Ser和第73号的Phe之间切割，因此生成了天然型成熟转谷氨酰胺酶的N末端加入了原结构部分的C末端的Phe-Arg-Ala-Pro 4个氨基酸(SEQ ID NO.60)的结构的蛋白质。本发明人证实了这样的蛋白质也具有转谷氨酰胺酶活性。SAMP45基因序列已确定，加入了原结构的蛋白质(SAMP45原)的氨基酸序列(J.Bacteriol.，179，430-438(1997))如SEQ ID NO.8所示。

并且，通过将本发明人发现的茂原链轮丝菌IFO 13819生产的脯氨酸特异性肽酶(svPEP)与SAMP45组合使用，也可除去加入在N末端的Phe-Arg-Ala-Pro的4个氨基酸，获得与天然型相同的成熟转谷氨酰胺酶。

该svPEP是在下式↓处即N末端的第3个或第4个脯氨酸残基的羧基一侧特异性切割下式(I)表示的肽或肽类似物的酶。

Y-Pro-↓-Z (I)(式中，Y是由2或3个氨基酸残基构成的寡肽，Z是氨基酸、肽、酰胺或酯。)

svPEP的基因的核苷酸序列及其编码的全长氨基酸序列如SEQ IDNO.9和10所示。以茂原链轮丝菌培养液或茂原链轮丝菌菌体的形式与蛋白酶共同作用于转谷氨酰胺酶原时，svPEP可以完全切开原结构部分，结果可获得原结构部分被完全除去的成熟转谷氨酰胺酶。或通过将引入了前svPEP原基因和前蛋白酶原基因的棒状杆菌与向菌体外分泌生产转谷氨酰胺酶原的棒状杆菌共同培养，可以同样获得完全除去了原结构部分的成熟转谷氨酰胺酶。另外，以同样的方法向引入了前转谷氨酰胺酶原的基因的棒状杆菌中引入SAMP45基因和svPEP基因，在分泌转谷氨酰胺酶原和SAMP45的同时，将svPEP分泌到菌体表面或菌体外，可以有效地生产与天然蛋白质具有相同结构的成熟转谷氨酰胺酶。

本发明可使用的向棒状杆菌中引入基因构建物的方法并无特别限定，可以使用通常使用的方法，例如原生质体法(Gene，39，281-286(1985))、电穿孔法(Bio/Technology，7，1067-1070(1989))等。可以将得到的转化体根据通常使用的方法和条件培养。例如可以将转化体在含有碳源、氮源、无机离子的通常的培养基上培养。并且，为获得高的繁殖，可以根据需要添加维生素、氨基酸等有机微量营养物。

碳源可以使用葡萄糖和蔗糖等碳水化合物、乙酸等有机酸、醇类及其他碳源。氮源可以使用氨气、氨水、铵盐及其他氮源。无机离子可以根据需要适当使用钙离子、镁离子、磷酸离子、钾离子、铁离子等。在pH5.0～8.5、15℃～37℃的适当范围内、在有氧条件下培养1～7天左右。通过在上述条件下培养转化体，目标蛋白质可以在菌体内大量生产并有效地分泌到菌体外。已知转谷氨酰胺酶在微生物细胞内大量累积，通常会使微生物致死，但根据本发明生产的转谷氨酰胺酶会释放到菌体外，因此可以不受致死的影响，连续地生产转谷氨酰胺酶。

根据本发明分泌到培养基中的蛋白质，可以根据本领域技术人员熟知的方法，从培养后的培养基中分离纯化。例如：可以通过离心将菌体除去，然后通过盐析、乙醇沉淀、超滤、凝胶过滤层析、离子交换柱层析、亲和层析、中高压液相层析、反相层析、疏水层析等已知的适当的方法、或将它们组合，进行分离纯化。根据本发明分泌到菌体表面的蛋白质也可以通过本领域技术人员已知的方法，例如通过提高盐浓度、使用表面活性剂等溶解蛋白质，然后按照与分泌到培养基中相同的方法进行分离纯化。另外，有时也可以不溶解分泌到细胞表面的蛋白质，例如作为固定化酶使用。

实施例

下面通过实施例更具体地说明本发明，但在任何意义上都不意味着限定本发明。

实施例1：来源于茂原链轮丝菌IFO13819的前转谷氨酰胺酶原在谷氨酸棒杆菌ATCC13869中的表达

(1)来源于茂原链轮丝菌IFO13819的转谷氨酰胺酶原基因的获得

来源于茂原链轮丝菌DSMZ菌株的转谷氨酰胺酶基因的序列已是确定的[Eur.J.Biochem.，257，570-576(1988)]。参考该序列，合成SEQ IDNO.11和SEQ ID NO.12所示的引物，用PCR方法从根据常规方法(齐藤、三浦的方法[Biochim.Biophys.Acta，72，619(1963)])制备的茂原链轮丝菌IFO13819的染色体DNA中，扩增编码成熟转谷氨酰胺酶序列的区。PCR反应采用Pyrobest DNA聚合酶(宝酒造公司制造)，反应条件根据制造商推荐的方案。

(SEQ ID NO.11)5’-GACTCCGACGACAGGGTCACCCCTCCCGCC-3’

(SEQ ID NO.12)5’-CGCTCACATCACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3’

<序列表独立文本>

SEQ ID NO.11、12：PCR引物

接着，根据产品说明书的方案，使用扩增的约1.0kb的DNA片段与Random Primer DNA Labeling Kit Ver.2(随机DNA标记试剂盒)(宝酒造公司制造)和[α-³²p]dCTP进行反应，制备DNA探针。按照如MolecularCloning 2nd edition[J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，Cold SpringHarbor Laboratory Press，p9.31(1989)]所记载的通常的方法，使用制备的探针和茂原链轮丝菌IFO13819的染色体DNA进行DNA印迹杂交，可以证实用限制酶SacI切出的约4kb的片段上存在转谷氨酰胺酶基因。使用EASYTRAP Ver.2(宝酒造公司制造)，将用SacI消化茂原链轮丝菌IFO13819的染色体DNA得到的约4kb的片段通过琼脂糖凝胶电泳回收，将其插入pUC18(宝酒造公司制造)的SacI位点，然后引入大肠杆菌JM109(宝酒造公司制造)的感受态细胞中，构建文库。

使用先前制备的转谷氨酰胺酶的DNA探针，通过Molecular Cloning2nd edition[J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，Cold Spring HarborLaboratory Press，p1.90(1989)]所记载的集落杂交进行文库的筛选，获得保有克隆了转谷氨酰胺酶基因片段的质粒的菌株，再从中回收质粒，命名为pUITG。在测定pUITG中被克隆的片段的核苷酸序列时，证实：茂原链轮丝菌IFO13819的转谷氨酰胺酶的基因与茂原链轮丝菌DSMZ菌株的转谷氨酰胺酶的基因具有相同的核苷酸序列。

通过测定核苷酸序列，结果发现：SacI切出的约4kb的片段是信号序列(前部分)部分缺失的不完整的DNA片段。因此又尝试了对启动子区和完整的信号序列区进行克隆。克隆采用了TAKARA LA PCR invitro Cloning Kit(宝酒造公司制造)以及SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的合成引物，按照产品说明书的方案实施。

(SEQ ID NO.13)5’-GTGACCCTGTCGTCGGAGTC-3’

(SEQ ID NO.14)5’-GGCATCCTGTCGAGCGGCTC-3’

<序列表独立文本>

SEQ ID NO.13、14：用于茂原链轮丝菌的启动子区和信号序列的PCR

引物

结果，使用SaII的盒式引物时，得到了约800bp的PCR扩增片段，测定该片段的核苷酸序列时，证实了该片段包含转谷氨酰胺酶基因的启动子区和信号序列。因此，通过将该约800bp的PCR扩增片段插入特开平9-070291记载的pVC7的SmaI位点，得到了pVITGS5。进一步用SacI消化pUITG，通过琼脂糖凝胶电泳回收包含转谷氨酰胺酶基因的约4kb的片段，将该片段插入pVITGS5的SacI位点，构建了含有全长的转谷氨酰胺酶基因的质粒pVITGC。另外，使用Dye TerminatorCycle Sequencing Kit(PE Applied Biosystems制造)和DNA测序仪373A(PE Applied Biosystems制造)进行核苷酸序列的测定。前转谷氨酰胺酶原基因的序列和所编码的全长氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，可以判断其中N末端的31个氨基酸的序列(第1～31号)为信号序列(前部分)，45个氨基酸(第32～76号)为原结构部分，331个氨基酸(第77～407号)为成熟转谷氨酰胺酶。

(2)转谷氨酰胺酶基因启动子区的转换

谷氨酸棒杆菌的细胞表面蛋白即PS2的基因序列已是确定的[Mol.Microbiol.，9，97-109(1993)]。参考该序列，合成SEQ ID NO.15和SEQ IDNO.16所示的引物，用PCR方法从按照常规方法制备的谷氨酸棒杆菌ATCC13869的染色体DNA中，扩增包含PS2蛋白质基因起始密码子的5’上游的启动子的区。

(SEQ ID NO.15)5’-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3’

(SEQ ID NO.16)5’-GAGCTCTCCGGCGTATGCGCATAGAGGCGAAGGCTCCTTGAATA-3’

<序列表独立文本>

SEQ ID NO.15、16：PCR引物

另一方面，根据实施例1(1)中测定的转谷氨酰胺酶基因序列，合成SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.17所示的引物，用PCR方法从实施例1(1)中获得的pUITG中扩增前转谷氨酰胺酶原的基因区。

(SEQ ID NO.12)5’-CGCTCACATCACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3’

(SEQ ID NO.17)5’-ATGCGCATACGCCGGAGAGCTCTCGTCTTC-3’

<序列表独立文本>

SEQ ID NO.12、17：PCR引物

接着，将已扩增的包含谷氨酸棒杆菌ATCC13869的PS2基因的启动子的区与1μl已扩增的前转谷氨酰胺酶原的基因区的PCR反应液混合，作为模板，使用SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.12进行交换PCR，来扩增与包含谷氨酸棒杆菌ATCC13859细胞表面蛋白基因的启动子的区连接的、带前原结构部分的转谷氨酰胺酶的融合基因。通过脂糖凝胶电泳检出约1.8kb的扩增片段。用EASYTRAP Ver.2(宝酒造公司制造)，从琼脂糖凝胶中回收该片段，插入特开平9-070291记载的pVC7的SmaI位点，得到pVKPTG0。按照前述方法测定插入片段的核苷酸序列，证实构建了预想的融合基因。

(3)前转谷氨酰胺酶原基因在谷氨酸棒杆菌ATCC13869中的表达

用实施例1(1)中构建的pVITGC(启动子和前转谷氨酰胺酶原基因全部来源于茂原链轮丝菌)或实施例1(2)中构建的pVKPTG0(启动子来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13869的PS2基因，前转谷氨酰胺酶原基因来源于茂原链轮丝菌)转化谷氨酸棒杆菌ATCC13869，选择在含有5mg/l氯霉素的CM2S琼脂培养基(10g酵母膏、10g胰蛋白胨、5g蔗糖、5gNaCl、15g琼脂，加水配制为1L)上生长的菌株。接着，将选择出的、具有pVITGC或pVKPTG0的谷氨酸棒杆菌ATCC13869分别在含有5mg/l氯霉素的MM液体培养基(30g葡萄糖、0.4g硫酸镁七水合物、30g硫酸铵、1g磷酸二氢钾、0.01g硫酸铁七水合物、0.01g硫酸锰五水合物、200μg盐酸硫胺素、500μg生物素、0.15g DL-甲硫氨酸、50g碳酸钙，加水配制为1L，调整为pH7.5)中，在30℃下培养48小时。培养结束后，取10μl的培养上清液进行SDS-PAGE，使用Biosci.Biotechnol.Biochem.，58，82-87(1994)记载的抗转谷氨酰胺酶抗体，按照常规方法(例如J.Sambrook等(1989)(上述)所记载的通常的程序)进行蛋白质印迹分析。

结果未检出转谷氨酰胺酶的分泌。由上述结果证实：茂原链轮丝菌的转谷氨酰胺酶的信号序列在谷氨酸棒杆菌ATCC13869中并未发挥作用。

实施例2：使用编石码来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13869的细胞表面蛋白的信号肽和来源于茂原链轮丝菌IFO13819的成熟转谷氨酰胺酶的融合基因分泌生产成熟转谷氨酰胺酶

(1)构建具有谷氨酸棒杆菌ATCC13869细胞表面蛋白的信号序列的转谷氨酰胺酶基因

谷氨酸棒杆菌细胞表面蛋白PS2的基因的序列已是确定的[Mol.Microbiol.，9，97-109(1993)]。参考该序列，合成SEQ ID NO.15和SEQ IDNO.18所示的引物，用PCR方法从按照实施例1(2)的方法制备的谷氨酸棒杆菌ATCC13869的染色体DNA中扩增下述区：编码PS2对应的蛋白质N末端一侧44个氨基酸残基(信号肽的30个氨基酸残基和成熟细胞表面蛋白的14个氨基酸残基)的区；包含启动子区的5’上游。另外，为了构建与转谷氨酰胺酶基因融合的基因，SEQ ID NO.18所示的引物包含编码成熟转谷氨酰胺酶的N末端一侧的氨基酸序列的序列。

(SEQ ID NO.15)5’-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3’

(SEQ ID NO.18)5’-GGGGTGACCCTGTCGTCGGAGTCGTTGAAGCCGTTGTTGATGTTGAA-3’

<序列表独立文本>

SEQ ID NO.15、16：PCR引物

另一方面，根据实施例1(1)中测定的转谷氨酰胺酶基因序列，合成SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的引物，用PCR方法从实施例1(1)中获得的pUITG中扩增转谷氨酰胺酶的基因区。

接着，将1μl已扩增的、编码谷氨酸棒杆菌ATCC13869的PS2对应的蛋白质的N末端一侧44个氨基酸残基的区和含有启动子区的5’上游的PCR反应液，与1μl已扩增的成熟转谷氨酰胺酶的基因区的PCR反应液混合，作为模板，使用SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.12进行交换PCR，来扩增与包含谷氨酸棒杆菌ATCC13869细胞表面蛋白基因的启动子区的5’上游和编码N末端一侧44个氨基酸残基的区连接的成熟转谷氨酰胺酶的融合基因。

通过琼脂糖凝胶电泳检出约1.7kb的扩增片段。用EASYTRAPVer.2(宝酒造公司制造)从琼脂糖凝胶中回收该片段，插入特开平9-070291记载的pVC7的SmaI位点，得到pVKTG3。按照前述方法测定插入片段的核苷酸序列，证实构建了预想的融合基因。

另外，用KpnI和XbaI消化pVKTG3，切出1.7kb的与包含谷氨酸棒杆菌ATCC13869细胞表面蛋白基因的启动子区的5’上游和编码N末端一侧44个氨基酸残基的区连接的成熟转谷氨酰胺酶的融合基因，并通过琼脂糖凝胶电泳回收。将该片段插入特开平9-322774记载的pPK4的KpnI-XbaI位点，构建了pPKTG3。

(2)使用谷氨酸棒杆菌ATCC13869细胞表面蛋白的信号序列分泌成熟转谷氨酰胺酶

使用构建的质粒pVKTG3或pPKTG3(两者的启动子和由信号肽及N末端14个氨基酸构成的基因均来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13869，成熟转谷氨酰胺酶基因来源于茂原链轮丝菌)转化谷氨酸棒杆菌ATCC13869，选择在含有5mg/l氯霉素或25mg/l卡那霉素的CM2S琼脂培养基上生长的菌株。接着，将选择出的具有pVKTG3或pPKTG3的谷氨酸棒杆菌ATCC13869在含有5mg/l氯霉素或25mg/l卡那霉素的上述MM液体培养基中、在30℃下培养48小时。培养结束后，取10μl的培养上清液进行SDS-PAGE，使用Biosci.Biotechnol.Biochem.，58，82-87(1994)记载的抗转谷氨酰胺酶抗体，按照常规方法进行蛋白质印迹分析。结果两种菌株的培养上清液中均少量检出具有与成熟转谷氨酰胺酶分子量几乎相同的、分泌的转谷氨酰胺酶。

实施例3：使用与谷氨酸棒杆菌ATCC13869细胞表面蛋白的信号肽结合的来源于茂原链轮丝菌IFO13819的转谷氨酰胺酶原的融合基因 (异源融合前转谷氨酰胺酶原基因)分泌生产转谷氨酰胺酶原

(1)构建具有谷氨酸棒杆菌ATCC13869细胞表面蛋白的信号序列、带原结构部分的转谷氨酰胺酶的基因(异源融合前转谷氨酰胺酶原基因)

参考谷氨酸棒杆菌细胞表面蛋白PS2的基因序列[Mol.Microbiol.，9，97-109(1993)]，合成SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示的引物。通过SEQ ID NO.15与SEQ ID NO.19、或SEQ ID NO.15与SEQ ID NO.20、或SEQ ID NO.15与SEQ IDNO.21、或SEQ ID NO.15与SEQ ID NO.22组合，使用PCR方法从按照实施例1(2)的方法制备的谷氨酸棒杆菌ATCC13869的染色体DNA中，分别扩增编码PS2对应的蛋白质的N末端一侧氨基酸分别为30、31、44和68个残基的区(包括信号肽的30个氨基酸残基)、以及包含启动子区的5’上游。

为了构建与带原结构部分的转谷氨酰胺酶的基因融合的基因，SEQID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示的引物包含编码转谷氨酰胺酶原的N末端一侧的氨基酸的序列。

(SEQ ID NO.15)5’-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3’

(SEQ ID NO.19)5’-CTTCGTCTCTTCCCCCGCGCCATTGTCAGCGAATGCTGGGATAGCAACGCC-3’

(SEQ ID NO.20)5’-CTTCGTCTCTTCCCCCGCGCCATTGTCCTGAGCGAATGCTGGGATAGCTAC-3’

(SEQ ID NO.21)5’-CTTCGTCTCTTCCCCCGCGCCATTGTCGTTGAAGCCGTTGTTGATGTTGAA-3’

(SEQ ID NO.22)5’-CTTCGTCTCTTCCCCCGCGCCATTGTCAGTCAGGTCGCGGAGGGTTTCCTC-3’

<序列表独立文本>

SEQ ID NO.15、19～22：PCR引物

另一方面，根据实施例1(1)中测定的转谷氨酰胺酶的基因序列，合成SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.12所示的引物，用PCR方法从实施例1(1)中获得的pUITG中扩增转谷氨酰胺酶原的基因区。

(SEQ ID NO.12)5’-CGCTCACATCACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3’

(SEQ ID NO.23)5’-GACAATGGCGCGGGGGAAGAGACGAAGTCC-3’

<序列表独立文本>

SEQ ID NO.12、23：PCR引物

接着，将各1μl已扩增的、含有谷氨酸棒杆菌ATCC13869的PS2对应的蛋白质基因的启动子区的5’上游和编码N末端一侧30、31、44和68个氨基酸残基的区的PCR反应液，与1μl已扩增的带原结构部分的转谷氨酰胺酶的基因区的PCR反应液混合，作为模板，使用SEQ IDNO.15和SEQ ID NO.12进行交换PCR，来扩增分别与包含谷氨酸棒杆菌ATCC13869的PS2对应的蛋白质基因的启动子区的5’上游和编码N末端一侧30、31、44和68个氨基酸残基的各个区连接的转谷氨酰胺酶原基因的融合基因，即与谷氨酸棒杆菌ATCC13869表面蛋白基因的启动子结合的异源融合前转谷氨酰胺酶原基因片段。

通过琼脂糖凝胶电泳分别检出约1.8kb～1.9kb的扩增片段。用EASYTRAP Ver.2(宝酒造公司制造)从琼脂糖凝胶中回收该片段，插入特开平9-070291记载的pVC7的SmaI位点，分别得到pVKPTG1、pVKPTG2、pVKPTG3和pVKPTG4。按照前述方法测定插入片段的核苷酸序列，证实构建了预想的融合基因。

另外，用KpnI和XbaI消化pVKPTG1、pVKPTG2、pVKPTG3和pVKPTG4，切出约1.8kb～1.9kb的与包含谷氨酸棒杆菌ATCC13869的PS2所对应的蛋白质基因的启动子区的5’上游和编码N末端一侧30、31、44和68个氨基酸残基的各个区连接的、带原结构部分的转谷氨酰胺酶的融合基因，并通过琼脂糖凝胶电泳回收。将这些片段插入特开平9-322774记载的pPK4的KpnI-XbaI位点，构建了pPKPTG1、pPKPTG2、pPKPTG3和pPKPTG4。

(2)使用谷氨酸棒杆菌ATCC13869细胞表面蛋白的信号序列分泌转谷氨酰胺酶原

使用构建的质粒pVKPTG1、pVKPTG2、pVKPTG3、pVKPTG4、pPKPTG1、pPKPTG2、pPKPTG3或pPKPTG4转化谷氨酸棒杆菌ATCC13869，选择在含有5mg/l氯霉素或25mg/l卡那霉素的CM2S琼脂培养基上生长的菌株。接着，分别将选择出的、具有pVKPTG1、pVKPTG2、pVKPTG3、pVKPTG4、pPKPTG1、pPKPTG2、pPKPTG3或pPKPTG4的谷氨酸棒杆菌ATCC13869，在含有5mg/l氯霉素或25mg/l卡那霉素的上述MM液体培养基中、在30℃下培养48小时。培养结束后，取10μl的培养上清液进行SDS-PAGE，使用Biosci.Biotechnol.Biochem.，58，82-87(1994)记载的抗转谷氨酰胺酶抗体，按照常规方法进行蛋白质印迹分析。结果表明，pVC7和pPK4的载体有几乎等量的带原结构部分的转谷氨酰胺酶的分泌，但根据PS2对应的蛋白质的成熟蛋白质的N末端一侧氨基酸残基的长度不同，在分泌量上有显著差异。代表性的分泌量如表1所示。

表1、使用谷氨酸棒杆菌ATCC13869细胞表面蛋白的信号序列的转谷氨酰胺酶原的分泌生产量

质粒	转谷氨酰胺酶原(mg/l)
质粒	转谷氨酰胺酶原(mg/l)	pPKPTG1	78
pPKPTG4	210	pPKPTG1	78

实施例4：使用具有编码产氨棒杆菌ATCC6872细胞表面蛋白的信号序列和来源于茂原链轮丝菌IFO13819的转谷氨酰胺酶原的序列的融合基因进行的转谷氨酰胺酶原的分泌生产

(1)具有产氨棒杆菌细胞表面蛋白的信号序列、带原结构部分的转谷氨酰胺酶基因(异源融合前转谷氨酰胺酶原基因)的构建

参考产氨棒杆菌ATCC6872细胞表面蛋白(SlpA)的基因序列[特开平10-108675]，合成SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.25所示的引物，使用PCR方法，从通过常规方法制备的产氨棒杆菌的染色体DNA中扩增包含细胞表面蛋白(SlpA)基因的启动子区的5’上游和编码N末端一侧25个氨基酸残基(信号肽)的区。另外，为了构建与转谷氨酰胺酶原的基因融合的基因，SEQ ID NO.25所示的引物包含编码转谷氨酰胺酶原的N末端一侧的氨基酸的序列。

(SEQ ID NO.24)5’-GCCCAGAAGCCCAAAATTGAGATTT-3’

(SEQ ID NO.25)5’-CTTCGTCTCTTCCCCCGCGCCATTGTCTGCCGTTGCCACAGGTGCGGCCAGC-3’

<序列表独立文本>

SEQ ID NO.24、25：PCR引物

接着，将1μl已扩增的、含有产氨棒杆菌细胞表面蛋白(SlpA)基因的启动子区的5’上游和编码N末端一侧25个氨基酸残基的区的PCR反应液与1μl在实施例3(1)中扩增的带原结构部分的转谷氨酰胺酶的基因区的PCR反应液混合，作为模板，使用SEQ ID NO.24和SEQ IDNO.12进行交换PCR，来扩增与包含产氨棒杆菌细胞表面蛋白(SlpA)基因的启动子区的5’上游和编码N末端一侧氨基酸25个残基的区连接的、带原结构部分的转谷氨酰胺酶的融合基因(异源融合前转谷氨酰胺酶原基因)。通过琼脂糖凝胶电泳检出约1.7kb的扩增片段。用EASYTRAP Ver.2(宝酒造公司制造)从琼脂糖凝胶中回收该片段，插入pVC7的SmaI位点，得到pVSPTG1。

(2)启动子区的转换：与谷氨酸棒杆菌ATCC13869细胞表面蛋白基因的启动子的结合

参考谷氨酸棒杆菌的细胞表面蛋白PS2的基因序列[Mol.Microbiol.，9，97-109(1993)]，合成SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.26所示的引物。使用PCR方法从按照实施例1(2)的方法制备的谷氨酸棒杆菌ATCC13869的染色体DNA中，扩增包含PS2对应的蛋白质的启动子区的5’上游。另外，为了构建具有产氨棒杆菌细胞表面蛋白(SlpA)的信号序列的、与带原结构部分的转谷氨酰胺酶基因融合的基因(异源融合前转谷氨酰胺酶原基因)，SEQ ID NO.26所示的引物包含编码产氨棒杆菌细胞表面蛋白(SlpA)的信号序列N末端一侧氨基酸序列的序列。

(SEQ ID NO.15)5’-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3’

(SEQ ID NO.26)5’-CGCAGCCAGCGATTTCATGCGTTTCATAGAGGCGAAGGCTCCTTGAATAGGT-3’

<序列表独立文本>

SEQ ID NO.15、26：PCR引物

另一方面，根据具有产氨棒杆菌细胞表面蛋白(SlpA)的信号序列的、与带原结构部分的转谷氨酰胺酶基因融合的基因序列，合成SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.12所示的引物，用PCR方法从实施例4(1)中获得的pVSPTG1中，扩增具有产氨棒杆菌细胞表面蛋白(SlpA)的信号序列的、带原结构部分的转谷氨酰胺酶基因区。

(SEQ ID NO.12)5’-CGCTCACATCACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3’

(SEQ ID NO.27)5’-ATGAAACGCATGAAATCGCTGGCTGCGGCG-3’

<序列表独立文本>

SEQ ID NO.12、27：PCR引物

接着，将1μl已扩增的、含有谷氨酸棒杆菌ATCC13869的PS2对应的蛋白质基因的启动子区的5’上游的PCR反应液，与1μl已扩增的、具有产氨棒杆菌细胞表面蛋白(SlpA)的信号序列的带原结构部分的转谷氨酰胺酶基因(异源融合前转谷氨酰胺酶原基因)区的PCR反应液混合，作为模板，使用SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.12进行交换PCR，来扩增与具有包含谷氨酸棒杆菌ATCC13869的PS2对应的蛋白质基因的启动子区的5’上游、编码产氨棒杆菌细胞表面蛋白(SlpA)N末端一侧25个氨基酸残基的区连接的、带原结构部分的转谷氨酰胺酶的融合基因。

通过琼脂糖凝胶电泳检出约1.8kb的扩增片段。用EASYTRAPVer.2(宝酒造公司制造)从琼脂糖凝胶中回收该片段，插入特开平9-070291记载的pVC7的SmaI位点，得到pVKSPTG1。按照前述方法测定插入片段的核苷酸序列，证实构建了预想的融合基因。

另外，用KpnI和XbaI消化pVKSPTG1，切出约1.8kb与具有包含谷氨酸棒杆菌ATCC13869的PS2对应的蛋白质基因的启动子区的5’上游、编码产氨棒杆菌细胞表面蛋白(SlpA)N末端一侧25个氨基酸残基(信号肽)的区连接的、带原结构部分的转谷氨酰胺酶的融合基因(异源融合前转谷氨酰胺酶原基因)，并通过琼脂糖凝胶电泳回收。将该片段插入特开平9-322774记载的pPK4的KpnI-XbaI位点，构建了pPKSPTG1。质粒pVKSPTG1和pPKSPTG1均由下述基因构成：启动子来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13869的PS2基因，信号肽基因来源于产氨棒杆菌的SlpA，转谷氨酰胺酶原来源于茂原链轮丝菌的基因。

(3)转变为大肠杆菌的tac启动子

参考克隆了大肠杆菌tac启动子的质粒pKK223-3(AmershamPharmacia公司制造)的序列，合成SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29所示的引物。用PCR方法从pKK223-3的DNA中扩增tac启动子对应的区。另外，为了构建具有产氨棒杆菌细胞表面蛋白(SlpA)的信号序列、与带原结构部分的转谷氨酰胺酶基因融合的基因(异源融合前转谷氨酰胺酶原基因)，SEQ ID NO.29所示的引物包含编码产氨棒杆菌细胞表面蛋白(SlpA)的信号序列的N末端一侧的氨基酸的序列。

(SEQ ID NO.28)5’-GGATCCGGAGCTTATCGACTGCACG-3’

(SEQ ID NO.29)5’-CGCAGCCAGCGATTTCATGCGTTTCATAATTCTGTTTCCTGTGTGAAATTGT-3

<序列表独立文本>

SEQ ID NO.28、29：PCR引物

接着，将1μl已扩增的tac启动子对应的区的PCR反应液，与1μl在实施例4(2)中扩增的、具有产氨棒杆菌细胞表面蛋白(SlpA)的信号序列的、带原结构部分的转谷氨酰胺酶的基因区的PCR反应液混合，作为模板，使用SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.12进行交换PCR，来扩增具有tac启动子的编码产氨棒杆菌细胞表面蛋白(SlpA)N末端一侧25个氨基酸残基的区连接的、带原结构部分的转谷氨酰胺酶的融合基因(异源融合前转谷氨酰胺酶原基因)。通过琼脂糖凝胶电泳检出约1.5kb的扩增片段。用EASYTRAP Ver.2(宝酒造公司制造)从琼脂糖凝胶中回收该片段，插入特开平9-070291记载的pVC7的SmaI位点，得到pVTSPTG1。按照前述方法测定插入片段的核苷酸序列，证实构建了预想的融合基因。

另外，用KpnI和XbaI消化pVTSPTG1，切出约1.5kb的与具有tac启动子的编码产氨棒杆菌细胞表面蛋白(SlpA)N末端一侧25个氨基酸残基的区连接的、带原结构部分的转谷氨酰胺酶的融合基因，并通过琼脂糖凝胶电泳回收。将该片段插入特开平9-322774记载的pPK4的KpnI-XbaI位点，构建了pPTSPTG1。质粒pVTSPTG1和pPTSPTG1均由来源于大肠杆菌的tac启动子、来源于产氨棒杆菌SlpA的信号肽基因、来源于茂原链轮丝菌的转谷氨酰胺酶原基因构成。

(4)使用产氨棒杆菌细胞表面蛋白的信号序列分泌转谷氨酰胺酶原

使用构建的质粒pVKSPTG1、pVTSPTG1、pPKSPTG1、pPTSPTG1转化谷氨酸棒杆菌ATCC13869，选择在含有5mg/l氯霉素或25mg/l卡那霉素的上述CM2S琼脂培养基上生长的菌株。接着，分别将选择出的、具有pVKSPTG1或pVTSPTG1、pPKSPTG1、pPTSPTG1的谷氨酸棒杆菌ATCC13869，在含有5mg/l氯霉素或25mg/l卡那霉素的上述MM液体培养基中、在30℃下培养48小时。培养结束后，取10μl的培养上清液进行SDS-PAGE，使用Biosci.Biotechnol.Biochem.，58，82-87(1994)记载的抗转谷氨酰胺酶抗体，按照常规方法进行蛋白质印迹分析。结果表明，pVC7和pPK4载体有几乎等量的转谷氨酰胺酶原的分泌。代表性的分泌量如表2所示。

表2、使用产氨棒杆菌细胞表面蛋白的信号序列进行的转谷氨酰胺酶原的分泌生产量

质粒	转谷氨酰胺酶原(mg/l)
质粒	转谷氨酰胺酶原(mg/l)	pPKSPTG1	102
pPTSPTG1	74	pPKSPTG1	102

实施例5：使用具有编码产氨棒杆菌细胞表面蛋白的信号序列和来源于肉桂链轮丝菌IFO12852的转谷氨酰胺酶原的序列的融合基因分泌生产转谷氨酰胺酶原

(1)构建具有编码产氨棒杆菌细胞表面蛋白的信号序列和来源于肉桂链轮丝菌IFO12852的转谷氨酰胺酶原的序列的融合基因

肉桂链轮丝菌IFO12852的转谷氨酰胺酶的基因序列已是确定的(特愿平11-295649)。推定氨基酸序列的第1号至第32号为前部分的序列，第33号至第86号为原部分的序列，第87号至第416号为成熟转谷氨酰胺酶的序列。该核苷酸序列和所编码的全长氨基酸序列如SEQ IDNO.30和SEQ ID NO.31所示。另外，用包含该基因的质粒pUJ-MTG转化的大肠杆菌AJ13669，于1999年10月14日保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(现在的独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心、日本国茨城县筑波市东1-1-1中央第6、邮政编码305-8566)，保藏号为FERM P-17602，于2000年8月28日，根据布达佩斯条约，转为国际保藏，保藏号为FERM BP-7287。

首先用限制酶BamHI从pUJ-MTG中切出约3.5Kb包括了前转谷氨酰胺酶原基因全长的区，将其插入pUC19的BamHI位点，构建pUCSCTG。

以pUCSCTG为模板，合成SEQ ID NO.32和SEQ ID NO.33所示的引物，与上述同样地，用PCR方法扩增包含来源于肉桂链轮丝菌IFO12852的转谷氨酰胺酶原的基因区。

(SEQ ID NO.32)5’-GGC GAT GGG GAA GAG AAG GGG-3’

(SEQ ID NO.33)5’-GGC GGA TCC TCG CGT CGA GAG GCG TGG ACT GA-3’

<序列表独立文本>

SEQ ID NO.32、33：PCR引物

接着，以在实施例4(2)中构建的pPKSPTG1为模板，通过将SEQ IDNO.34和SEQ ID NO.35组合，用PCR方法扩增包含谷氨酸棒杆菌细胞表面蛋白PS2基因的启动子区的5’上游和包含产氨棒杆菌细胞表面蛋白SlpA的信号序列的区。

为了构建与来源于肉桂链轮丝菌IFO12852的转谷氨酰胺酶原基因融合的基因，SEQ ID NO.35所示的引物包含编码来源于肉桂链轮丝菌IFO12852的转谷氨酰胺酶原N末端一侧氨基酸的序列。

(SEQ ID NO.34)5’-TAC GAA TTC GAG CTC GGT ACC-3’

(SEQ ID NO.35)5’-CCC CTT CTC TTC CCC ATC GCC TGC CGT TGC CAC AGG TGC GG

C C-3’

<序列表独立文本>

SEQ ID NO.34、35：PCR引物

接着，将1μl已扩增的、编码含有来源于肉桂链轮丝菌IFO12852的转谷氨酰胺酶原的基因的区的PCR反应液，与1μl已扩增的、含有PS2基因的启动子区的5’上游和编码产氨棒杆菌细胞表面蛋白SlpA的信号序列的区的PCR反应液混合，作为模板，使用SEQ ID NO.34和SEQ ID NO.33进行交换PCR，来扩增与含有PS2基因的启动子区的5’上游和产氨棒杆菌细胞表面蛋白SlpA的信号序列连接的异源融合前转谷氨酰胺酶原基因片段。

通过琼脂糖凝胶电泳检出约1.8kb的扩增片段。用EcoRI和BamHI消化，然后从琼脂糖凝胶中回收该片段，插入pUC19的EcoRI-BamHI位点，得到pUKSPTG2’。按照前述方法测定插入片段的核苷酸序列，证实构建了预想的融合基因。用EcoRI消化该pUKSPTG2’后，使用Blunting Kit(宝酒造公司制造)产生平端，插入具有5’末端被磷酸化的5’-CTCTAGAG-3’序列的XbaI接头(宝酒造公司制造)，再环化，构建pUKSPTG2。使用XbaI消化pUKSPTG2，切出约1.8kb的融合前转谷氨酰胺酶原基因(转谷氨酰胺酶原基因来源于肉桂链轮丝菌IFO12852)，并通过琼脂糖凝胶电泳回收。将这些片段插入上述pPK4的XbaI位点，构建了pPKSPTG2。

接着，构建其原结构部分N末端一侧的一部分被置换为茂原链轮丝菌的原结构部分的前转谷氨酰胺酶原基因的(成熟转谷氨酰胺酶基因和原结构部分的一部分来源于肉桂链轮丝菌IFO12852)。

首先，从实施例4(2)中构建的质粒pPKSPTG1(用于来源于茂原链轮丝菌IFO13819的转谷氨酰胺酶原的表达)切下包含约1.8kb的前转谷氨酰胺酶原基因的EcoRI-BamHI片段，插入pUC19的EcoRI-BamHI位点(pUKSPTG1)。用AatII消化pUKSPTG1，切出约1.2kb的片段，同时也用AatII消化pUKSPTG2’，制备除去了约1.2kb片段的约3.3kb的片段。将该约3.3kb的片段和来源于pUKSPTG1的约1.2kb的AatII片段连接，根据常规的基因操作方法，选择插入了AatII片段的克隆。为了了解AatII片段的插入方向，依次进行序列分析，从中选择按照目标方向(可编码前转谷氨酰胺酶原)插入的质粒(pUKSPTG3’)。

对pUKSPTG3’进行与之前对pUKSPTG2’所进行的同样的操作，使EcoRI位点成为平端，插入XbaI接头，构建pUKSPTG3。再从pUKSPTG3切出约1.8kb的XbaI片段，插入pPK4的XbaI位点，构建pPKSPTG3

(2)使用产氨棒杆菌细胞表面蛋白的信号序列进行的来源于肉桂链轮丝菌IFO12852的转谷氨酰胺酶原的分泌

使用构建的质粒pPKSPTG2和pPKSPTG3转化谷氨酸棒杆菌ATCC13869，选择在含有25mg/l卡那霉素的上述CM2S琼脂培养基上生长的菌株。接着，将选择出的、具有pPKSPTG2和pPKSPTG3的谷氨酸棒杆菌ATCC13869分别在含有25mg/l卡那霉素的上述MMTG液体培养基(60g葡萄糖、0.4g硫酸镁七水合物、30g硫酸铵、1g磷酸二氢钾、0.01g硫酸铁七水合物、0.01g硫酸锰五水合物、0.01g盐酸硫胺素、450μg生物素、0.15g DL-甲硫氨酸、50g碳酸钙，加水配制为1L，调整为pH7.5)中，在30℃下培养3天。培养结束后，取10μl的培养上清液进行SDS-PAGE，使用上述的抗转谷氨酰胺酶抗体，按照常规方法进行蛋白质印迹分析。该抗体是抗来源于茂原链轮丝菌的转谷氨酰胺酶的抗体，但对来源于肉桂链轮丝菌的转谷酰胺酶也显示了反应性。结果证实了有带原结构部分的来源于肉桂链轮丝菌IFO12852的转谷酰胺酶分泌(约30～50mg/L)。

实施例6：丝氨酸蛋白酶(SAMP45)基因的克隆及表达质粒的构建和评价

(1)构建具有产氨棒杆菌细胞表面蛋白的信号序列的、带原结构部分的丝氨酸蛋白酶(SAMP45)基因(异源融合前丝氨酸蛋白酶原(SAMP45)基因)

白浅灰链霉菌产生的丝氨酸蛋白酶SAMP45的基因序列已是确定的[J.Bacteriol.，179，430-438(1997)]。参考该序列，合成SEQ ID NO.36和SEQ ID NO.37所示的引物，按照与前述相同的方法，用PCR方法扩增包含SAMP45的N末端原结构、成熟SAMP45和C末端原结构的基因区。

(SEQ ID NO.36)5’-AACGGGGAGAACAGCACGGCCGCCGG-3’

(SEQ ID NO.37)5’-GGCGAATTCTCCGGCGGGCCGTCACCGGT-3’

<序列表独立文本>

SEQ ID NO.36、37：PCR引物

接着，以在实施例4(2)中构建的pPKSPTG1为模板，通过将SEQ IDNO.38和SEQ ID NO.39组合，同样用PCR方法扩增包含谷氨酸棒杆菌细胞表面蛋白PS2基因的启动子区的5’上游和包含产氨棒杆菌细胞表面蛋白SlpA基因的信号序列的区。

为了构建与带原结构部分的丝氨酸蛋白酶基因融合的基因，SEQ IDNO.39所示的引物包含编码丝氨酸蛋白酶原的N末端一侧的氨基酸的序列。

(SEQ ID NO.38)5’-GGCAAGCTTAAATTCCTGTGAATTAGCTGA-3’

(SEQ ID NO.39)5’-CGGCCGTGCTGTTCTCCCCGTTTGCCGTTGCCACAGGTGCGGCC-3’

<序列表独立文本>

SEQ ID NO.38、39：用于构建融合前丝氨酸蛋白酶原基因的PCR引物

接着，将各1μl已扩增的、编码含有SAMP45的N末端原结构、成熟SAMP45和C末端原结构的基因的区的PCR反应液，与1μl已扩增的、含有PS2基因启动子区的5’上游和产氨棒杆菌细胞表面蛋白SlpA基因的信号序列的区的PCR反应液混合，作为模板，使用SEQ ID NO.38和SEQ ID NO.37进行交换PCR，扩增与含有PS2基因启动子区的5’上游和产氨棒杆菌细胞表面蛋白SlpA的信号序列连接的异源融合前丝氨酸蛋白酶原基因片段。

通过琼脂糖凝胶电泳检出约3.9kb的扩增片段。将PCR产物用HindIII和EcoRI消化，然后进行琼脂糖凝胶电泳，从琼脂糖凝胶中回收约3.9kb的片段，插入上述pVC7的HindIII-EcoRI位点，分别得到pVSS1。按照前述方法测定插入片段的核苷酸序列，证实构建了预想的融合基因。

(2)使用产氨棒杆菌细胞表面蛋白的信号序列进行的丝氨酸蛋白酶的分泌

使用构建的质粒pVSS1转化谷氨酸棒杆菌ATCC13869，选择在含有5mg/l氯霉素的上述CM2S琼脂培养基上生长的菌株。接着，将选择出的、具有pVSS1的谷氨酸棒杆菌ATCC13869在含有5mg/l氯霉素的上述MMTG液体培养基中、在30℃下培养70小时。将1ml该培养液进行离心，使培养上清液与菌体分离。将菌体悬浮于0.1M磷酸钠缓冲溶液(pH7.0)中。按以下步骤测定丝氨酸蛋白酶的活性。向含有25mM的Bz-Phe-Val-Arg-pNA(Bachem公司制造)的20mM磷酸钠缓冲溶液(pH7.0)中加入50μl培养上清液或菌体悬浮液，使液体总量为0.6ml，在30℃下反应20分钟，然后加入0.4ml 50％的乙酸，使反应终止。通过测定410nm的吸光度，计算游离pNA(对硝基苯胺)的量，来确定活性。1个单位的酶表示1分钟内使1μmol的pNA游离的酶量。结果在培养上清液中未检出丝氨酸蛋白酶的活性，在菌体悬浮液中可以检出活性。根据检出的活性值和文献[J.Bacteriol.，179，430-438(1997)]报道的比活值(1.96u/mg)计算，结果表明多达约9mg/l的丝氨酸蛋白酶在菌体表面分泌表达。

实施例7：脯氨酸特异性肽酶(svPEP)基因的克隆及表达质粒的构建和评价

(1)茂原链轮丝菌IFO 13819生产的脯氨酸特异性肽酶(svPEP)的纯化及N末端氨基酸序列分析

将800mL的ISP2液体培养基(4g酵母膏、10g麦芽汁、4g葡萄糖、加水配制为1L，调节至pH7.3)装入5L坂口烧瓶中，接种茂原链轮丝菌IFO13819，在30℃下、120rpm振荡培养48小时。

将培养液离心，除去培养上清液，回收菌体。用含有25mg/L卡那霉素的20mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.0)洗涤后，将得到的菌体悬浮于含有25mg/L卡那霉素的0.1M磷酸钠缓冲溶液(pH7.0)中。在冰上振荡4小时后，回收离心得到的上清液。用硝化纤维素滤膜(孔径0.22μm、Sartrius公司制造)过滤除菌后，用FPLC(Amersham Pharmacia公司制造)通过经1.5M硫酸铵/50mM磷酸缓冲液(pH7.0)平衡的丁基琼脂糖凝胶(Butyl-Sepharose)4FF(Amersham Pharmacia公司制造)柱(1.6φ×10cm)，用相同缓冲液中1.5-0M硫酸铵的线性梯度洗脱。回收含有活性成分的流分，进而在相同条件下，过苯基琼脂糖凝胶(Phenyl-Sepharose)HP柱(1mL，Amersham Pharmacia公司制造)，回收活性流分，对50mM磷酸钠缓冲溶液(pH7.0)，在4℃下透析过夜。由此得到部分纯化的酶液，将部分纯化酶液进行反相层析，进一步纯化。反相层析的条件如下所示。

HPLC装置：泵：日立L-6300，检测器：L-4000H

柱：PROTEIN C4214TP5410(VYDAC公司制造)

洗脱条件：24-40％乙腈线性梯度/0.1％三氟乙酸(20分钟)在室温下洗脱

流速：1.0ml/min

检测波长：280nm

使用Membrane Cartridge(Perkin Elmer公司制造)，将在上述条件下纯化的酶的样品转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用气相蛋白质测序仪PPSQ-10(岛津制作所)分析N末端氨基酸。结果得到了SEQ IDNO.40所示的20个残基的N末端氨基酸部分序列。

(SEQ ID NO.40) Gln Ala Asp IIe Lys Asp Arg IIe leu Lys Ile Pro

1 5 10

Gly Met Lys Phe Val Glu Glu Lys

15 20

(2)来源于茂原链轮丝菌IFO13819的脯氨酸特异性肽酶(svPEP)基因的获得

在从已测定的svPEP N末端20个氨基酸序列推定的核苷酸序列中，选择简并性少的位点Lys-Ile-Pro-Gly-Met-Lys-Phe-Val-Glu-Glu-Lys(SEQ ID NO.41)制备SEQ ID NO.42所示的合成寡核苷酸。以该合成寡核苷酸作为探针，用识别6个核苷酸序列的各种限制酶消化按照常规方法制备的茂原链轮丝菌IFO13819的染色体DNA，通过DNA印迹杂交法分析，检出由SacI切出的约6kb的单一条带。用SacI消化根据前述的方法制备的茂原链轮丝菌IFO13819的染色体DNA，用EASYTRAPVer.2(宝酒造公司制造)通过琼脂糖凝胶电泳回收约6kb的片段。将回收片段插入pUC18的SacI位点，然后引入大肠杆菌JM109(宝酒造公司制造)的感受态细胞中，构建文库。以SEQ ID NO.38所示的用³²P标记的合成寡核苷酸作为探针，通过对构建的文库进行集落杂交来进行文库的筛选，筛选保有克隆了svPEP基因片段的质粒的菌株，从而获得目标基因。将从该菌株中回收的质粒命名为pUMP1。

(SEQ ID NO.42)5’-AAGATCCCCGGGATGAAGTTCGTCGAGGAGAAG-3’

<序列表独立文本>

SEQ ID NO.42：用于svPEP的探针

测定了pUMP1中克隆的片段的核苷酸序列。在推断该基因所编码的氨基酸序列时，发现了之前从纯化酶蛋白质中测定的N末端部分的氨基酸序列(20个残基)，并测定了包含SEQ ID NO.9所示的推断为svPEP的信号序列和原结构的区的全长氨基酸的一级序列。推定氨基酸序列的第1号至第25号为信号序列，第26号至第33号为原结构部分，氨基酸序列第34号至第477号为成熟svPEP。

用pUMP1转化的大肠杆菌AJ13691根据布达佩斯条约，于2000年5月15日保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(现在的独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心、日本国茨城县筑波市东1-1-1中央第6、邮政编码305-8566)，保藏号为FERMBP-7160。

(3)具有产氨棒杆菌细胞表面蛋白的信号序列、带原结构部分的脯氨酸特异性肽酶(svPEP)基因(异源融合前脯氨酸特异性肽酶(svPEP)原基因)的构建

参考实施例7(2)中测定的svPEP的序列，以实施例7(2)中构建pUMP1作为模板，合成SEQ ID NO.43和SEQ ID NO.44所示的引物，按照与前述相同的方法，用PCR方法扩增包含svPEP的原结构和成熟svPEP的基因区。

(SEQ ID NO.43)5’-GAGGCGGCGTCGATCACCGCCCC-3’

(SEQ ID NO.44)5’-GCCAAGCTTGAAGCACCGGCGGCGGCACCCGG-3’

<序列表独立文本>

SEQ ID NO.43、44：PCR引物

接着，以在实施例4(2)中构建的pPKSPTG1作为模板，通过将SEQID NO.38和SEQ ID NO.45组合，用PCR方法扩增包含谷氨酸棒杆菌细胞表面蛋白PS2基因的启动子区的5’上游以及产氨棒杆菌细胞表面蛋白SlpA基因的信号序列的区。

为了构建与带原结构部分的svPEP基因融合的基因，SEQ ID NO.45所示的引物包含编码svPEP的N末端一侧的氨基酸的序列。

(SEQ ID NO.38)5’-GGCAAGCTTAAATTCCTGTGAATTAGCTGA-3’

(SEQ ID NO.45)5’-GGGGCGGTGATCGACGCCGCCTCTGCCGTTGCCACAGGTGCGGCCA-3’

<序列表独立文本>

SEQ ID NO.38、45：PCR引物

接着，将各1μl已扩增的、编码含有svPEP的原结构和成熟svPEP的基因区的PCR反应液，与1μl含有已扩增的、PS2基因启动子区的5’上游和含有产氨棒杆菌细胞表面蛋白SlpA的基因的信号序列的区的PCR反应液混合，作为模板，使用SEQ ID NO.38和SEQ ID NO.44进行交换PCR，来扩增与含有PS2基因启动子区的5’上游和产氨棒杆菌细胞表面蛋白SlpA的信号序列连接的异源融合前svPEP原基因片段。

(SEQ ID NO.38)5’-GGCAAGCTTAAATTCCTGTGAATTAGCTGA-3’

(SEQ ID NO.44)5’-GCCAAGCTTGAAGCACCGGCGGCGGCACCCGG-3’

<序列表独立文本>

SEQ ID NO.38、44：PCR引物

通过琼脂糖凝胶电泳检出约2.1kb的扩增片段。用HindIII消化PCR产物，然后进行琼脂糖凝胶电泳，从琼脂糖凝胶中回收约2.1kb的片段，插入实施例6(1)中记载的pVSS1的HindIII位点，分别得到pVSSSP1。按照常规方法测定插入片段的核苷酸序列，证实构建了预想的融合基因。

(4)使用产氨棒杆菌细胞表面蛋白的信号序列进行的脯氨酸特异性肽酶的分泌

使用构建的质粒pVSSSP1转化谷氨酸棒杆菌ATCC13869，选择在含有5mg/l氯霉素的上述CM2S琼脂培养基上生长的菌株。接着，将选择出的具有pVSSSP1的谷氨酸棒杆菌ATCC13869在含有5mg/l氯霉素的上述MMTG液体培养基中、在30℃下培养70小时。将1ml该培养液离心，使培养上清液与菌体分离。将菌体悬浮于0.1M磷酸钠缓冲溶液(pH7.0)中。按以下步骤测定svPEP的活性。向含有0.25mM的Ala-Ala-Pro-pNA(Bachem公司制造)的20mM磷酸钠缓冲溶液(pH7.0)中加入50μl培养上清液或菌体悬浮液，使液体总量为0.6ml，在30℃下反应20分钟，然后加入0.4ml 50％的乙酸，使反应终止。通过测定410nm的吸光度，计算游离pNA的量，来确定活性。1个单位的酶表示1分钟内使1μmol的pNA游离的酶量。结果，在培养上清液中未检出svPEP的活性，在菌体悬浮液中可以检出活性。根据检出的活性值和实施例7(1)的比活值(35.5u/mg)计算，结果表明有多达约50mg/l的svPEP在菌体表面分泌表达。

(5)通过在谷氨酸棒杆菌ATCC13869中分泌表达的丝氨酸蛋白酶和脯氨酸特异性肽酶切除带原结构部分的转谷氨酰胺酶的原结构部分

使用构建的质粒pVSSSP1转化谷氨酸棒杆菌ATCC13869，所述谷氨酸棒杆菌ATCC13869具有实施例4(2)中记载的、带原结构部分的转谷氨酰胺酶的分泌表达质粒pPKSPTG1。选择在含有5mg/l氯霉素和25mg/l卡那霉素的上述CM2S琼脂培养基上生长的菌株。接着，将选择出的具有pVSSSP1和pPKSPTG1的谷氨酸棒杆菌ATCC13869，在含有5mg/l氯霉素和25mg/l卡那霉素的上述MMTG液体培养基中、在30℃下培养70小时。培养结束后，将10μl该培养上清液进行SDS-PAGE，然后用上述抗转谷氨酰胺酶抗体，按照常规方法进行蛋白质印迹分析。结果，SAMP45和svPEP正常分泌表达，所分泌的带原结构部分的转谷氨酰胺酶的原结构部分被切除，证实分泌了具有与天然型成熟转谷氨酰胺酶分子量几乎相同的转谷氨酰胺酶。

在用上述的氧肟酸法验证该培养上清液中的转谷氨酰胺酶活性时，可以证实具有与天然型几乎相同的比活(约20U/mg)。

另外，进行SDS-PAGE后，根据上述方法，半干燥转印到PVDF膜上。印迹分析后，将PVDF膜用考马斯亮蓝染色、脱色、风干。切取成熟转谷氨酰胺酶的部分，用蛋白质测序仪进行N末端氨基酸序列分析。结果证实：得到了SEQ ID NO.6所示的、来源于茂原链轮丝菌的第77号Asp开始的、具有与天然型成熟转谷氨酰胺酶相同的N末端的序列。

实施例8：使用具有编码产氨棒杆菌ATCC6872细胞表面蛋白的信号序列和人表皮细胞生长因子(hEGF)的序列的融合基因分泌生产人表皮细胞生长因子

(1)构建具有谷氨酸棒杆菌ATCC13869细胞表面蛋白的信号序列的hEGF基因

谷氨酸棒杆菌细胞表面蛋白PS2的基因序列已是确定的[Mol.Microbiol.，9，97-109(1993)]。参考该序列，合成SEQ ID NO.46和SEQ IDNO.47所示的引物，用PCR方法从根据齐藤、三浦的方法[Biochim.Biophys.Act，72，619(1963)]制备的谷氨酸棒杆菌ATCC13869的染色体DNA中，扩增PS2对应的蛋白质的5’上游和编码N末端一侧44个氨基酸残基的区。为了在5’末端插入质粒中，SEQ ID NO.46所示的引物包含必需的限制酶KpnI的识别序列。

(SEQ ID NO.46)5’-GCTCGGTACCCAAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3’

(SEQ ID NO.47)5’-GTTGAAGCCGTTGTTGATGTTGAA-3’

<序列表独立文本>

SEQ ID NO.46、47：PCR引物

另一方面，合成SEQ ID NO.48和SEQ ID NO.49所示的引物，用PCR法从包含bEGF基因序列的质粒pT13SΔhIL2-KS-hEGF(H3)(特开昭64-2583)中扩增编码hEGF的区。用包含该基因的质粒pT13SΔhIL2-KS-hEGF(H3)转化的大肠杆菌AJ12354于1987年11月20日保藏在现在的独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(日本国茨城县筑波市东1-1-1中央第6、邮政编码305-8566)，保藏号为FERMP-9719，根据布达佩斯条约，于2002年3月18日在该中心转为国际保藏，保藏号为FERMBP-7966。

为了构建与编码PS2对应的蛋白质的5’上游和N末端一侧44个氨基酸残基的区融合的基因，SEQ ID NO.48所示的引物包含编码PS2的信号序列C末端一侧的氨基酸的基因序列。

(SEQ ID NO.48)5’-AACATCAACAACGGCTTCAACAATTCCGATTCTGAGTGCCCT-3’

(SEQ ID NO.49)5’-CGGCCACGATGCGTCCGGCG-3’

<序列表独立文本>

SEQ ID NO.48、49：PCR引物

接着，将1μl已扩增的、包含谷氨酸棒杆菌PS2对应的蛋白质的5’上游和编码N末端一侧44个氨基酸残基的区的PCR反应液，与1μl已扩增的hEGF基因区的PCR反应液混合，作为模板，使用SEQ IDNO.46和SEQ ID NO.49进行交换PCR，来扩增与包含谷氨酸棒杆菌的细胞表面蛋白基因的5’上游和编码N末端一侧44个氨基酸残基的区连接的hEGF的融合基因。通过琼脂糖凝胶电泳检测出约0.9kb的扩增片段。用EASYTRAP Ver.2(宝酒造公司制造)从琼脂糖凝胶中回收该片段。将回收的DNA用限制酶KpnI和BamHI(宝酒造公司制造)切割，通过DNA Clean-UP system(Promega公司制造)纯化，插入特开平9-322774记载的pPK47的KpnI-BamHI位点，得到pPKEGF。用DyeTerminator Cycle Sequencing Kit(PE Applied Biosystems公司制造)和DNA测序仪377A(PE Applied Biosystems公司制造)测定插入片段的核苷酸序列，证实构建了预想的融合基因。

(2)构建具有产氨棒杆菌ATCC6872细胞表面蛋白的信号序列的hEGF基因

参考产氨棒杆菌ATCC6872细胞表面蛋白(SlpA)的序列[特开平10-108675]，合成SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.50所示的引物，用PCR方法从根据实施例8(1)记载的方法制备的产氨棒杆菌的染色体DNA中扩增细胞表面蛋白(SlpA)5’上游和编码N末端一侧25个氨基酸残基的区。另外，为了构建与hEGF基因融合的基因，SEQ ID NO.50所示的引物包含编码hEGF N末端一例氨基酸的序列。

(SEQ ID NO.24)5’-GCCCAGAAGCCCAAAATTGAGATTT-3’

(SEQ ID NO.50)5’-AGGGCACTCAGAATCGGAATTTGCCGTTGCCACAGGTGCGGCC-3’

<序列表独立文本>

SEQ ID NO.24、50：PCR引物

另一方面，合成SEQ ID NO.51和SEQ ID NO.49所示的引物，用PCR方法从包含hEGF基因序列的质粒pT13SΔhIL2-KS-hEGF(H3)(特开昭64-2583)中扩增编码hEGF的区。

(SEQ ID NO.49)5’-CGGCCACGATGCGTCCGGCG-3’

(SEQ ID NO.51)5’-AATTCCGATTCTGAGTGCCCT-3’

<序列表独立文本>

SEQ ID NO.49、51：PCR引物

接着，将1μl已扩增的、包含产氨棒杆菌细胞表面蛋白(SlpA)的5’上游和编码N末端一侧25个氨基酸残基的区的PCR反应液，与1μlhEGF基因区的PCR反应液混合，作为模板，使用SEQ ID NO.49和SEQID NO.24进行交换PCR，来扩增产氨棒杆菌细胞表面蛋白(SlpA)的5’上游和编码N末端一侧25个氨基酸残基的区连接的hEGF的融合基因。

再合成SEQ ID NO.52和SEQ ID NO.53所示的引物，以通过实施例8(1)构建的质粒pPKEGF为模板，用PCR方法扩增PS2对应的蛋白质的5’上游。另外，SEQ ID NO.53所示的引物包含PS2对应的蛋白质的5’上游中3’一侧的序列和编码产氨棒杆菌细胞表面蛋白(SlpA)的信号序列末端一侧氨基酸的序列。

(SEQ ID NO.52)5’-GAATTCGAGCTCGGTACCCA-3’

(SEQ ID NO.53)5’-AGCGATTTCATGCGTTTCATAGAGGCGAAGGCTCCTTGAA-3’

<序列表独立文本>

SEQ ID NO.52、53：PCR引物

另一方面，根据具有含之前经PCR扩增的产氨棒杆菌细胞表面蛋白(SlpA)的5’上游的信号序列的与hEGF基因融合的基因的序列，通过SEQ ID NO.54和SEQ ID NO.49所示的引物，用PCR方法扩增具有产氨棒杆菌细胞表面蛋白(SlpA)的信号序列的hEGF基因区。PCR反应使用Pyrobest DNA聚合酶(宝酒造公司制造)，反应条件按照该产品说明的方案。

(SEQ ID NO.49)5’-CGGCCACGATGCGTCCGGCG-3’

(SEQ ID NO.54)5’-ATGAAACGCATGAAATCGGTGGC-3’

<序列表独立文本>

SEQ ID NO.49、54：PCR引物

接着，将1μl已扩增的、谷氨酸棒杆菌PS2对应的蛋白质的5’上游的PCR反应液，与1μl扩增的、具有产氨棒杆菌细胞表面蛋白(SlpA)的信号序列的hEGF基因区的PCR反应液混合，作为模板，使用SEQ IDNO.52和SEQ ID NO.49进行交换PCR，来扩增与编码谷氨酸棒杆菌PS2对应的蛋白质的5’上游和编码产氨棒杆菌细胞表面蛋白(SlpA)的N末端一侧25个氨基酸残基的区连接的hEGF的融合基因。PCR反应使用Pyrobest DNA聚合酶(宝酒造公司制造)，反应条件按照该产品说明的方案。通过琼脂糖凝胶电泳检出约0.9kb的扩增片段。用EASYTRAPVer.2(宝酒造公司制造)从琼脂糖凝胶中回收该片段。用限制酶KpnI和BamHI(宝酒造公司制造)切割，通过DNA Clean-UP system(Promega公司制造)纯化，将其插入特开平9-322774记载的pPK47的KpnI-BamHI位点，得到pPSEGF。用Dye Terminator Cycle Sequencing Kit(PE AppliedBiosystems公司制造)和DNA测序仪377A(PE Applied Biosystems制造)测定插入片段的核苷酸序列，证实构建了预想的融合基因。

(3)产hEGF菌株的制备

使用(2)中构建的hEGF表达质粒pPSEGF，通过电穿孔转化谷氨酸棒杆菌ATCC13869，获得卡那霉素抗性菌株。分别将获得的菌株在含有25mg/l卡那霉素的MMTG液体培养基(60g葡萄糖、0.4g硫酸镁七水合物、30g硫酸铵、1g磷酸二氢钾、0.01g硫酸铁七水合物、0.01g硫酸锰五水合物、450μg盐酸硫胺素、450μg生物素、0.15g DL-甲硫氨酸、50g碳酸钙，加水配制为1L，调整为pH7.5)中，在30℃下振荡培养3天。取10μl离心除去菌体的培养上清液进行SDS-PAGE。以市售hEGF(PEPRO TECHEC LTD)作为标准品，同时进行电泳，进行考马斯亮蓝(CBB)染色，结果在相同迁移率的位置检出了条带。培养上清液中几乎未检出其他蛋白质杂质。

(4)具有质粒pPSEGF的产hEGF菌株的hEGF生产量测定

将产hEGF菌株的培养上清液通过HPLC柱(YMC-AP203Ca300A.C18，粒径5μm，直径4.6mm×长度250mm)，缓冲液为0.1％TFA/24％乙腈、0.1％TFA/44％乙腈，1％/min线性梯度，流速为1.0ml/min、用280nm检测进行分析，通过与分析hEGF标准品时的峰面积比较，进行定量，结果约为100mg/L。

(5)由具有质粒pPSEGF的产hEGF菌株分泌的hEGF的生物活性测定

测定产hEGF菌株的培养上清液中的EGF活性。将MCF-7细胞(A.V.Krishman，Journal of Bone and research，6，1099-1107，1991)置于96孔板中，每孔接种1×10⁴个原始细胞，加入产EGF菌株培养上清液的2倍连续稀释液。测定培养72小时后的胸苷的掺入量。与10⁷U/mg市售hEGF标准品(Funakoshi公司制造)比较，计算出活性值，结果为1.4×10⁹U/ml。

(6)由具有质粒pPSEGF的产hEGF菌株分泌的hEGF的N末端氨基酸序列分析

将120μl产hEGF菌株的培养上清液过HPLC柱，按照HPLC定量所记载的条件进行分离。然后收集与hEGF标准品的洗脱位置一致的峰。将该样品用于N末端氨基酸分析。使用气相氨基酸测序仪PPSQ-10(岛津制作所)进行测定。测定结果为：从N末端起第1个残基为Asn、第2个残基为Ser、第3个残基为Asp、第4个残基为Ser。该结果与SEQ ID NO.55所示的hEGF的氨基酸序列的N末端序列一致。

(7)由具有质粒pPSEGF的产hEGF菌株分泌的hEGF的分子量测定

将120μl产hEGF菌株的培养上清液过HPLC柱，HPLC定量按照(4)所记载的条件进行分离。然后收集洗出的hEGF峰。将该样品再一次通过相同的HPLC进行收集，证实HPLC中显示单峰。将该样品用于分子量分析。使用MALDI-TOFMS(基质辅助激光解离电离-飞行时间质谱仪)MALDI IV(岛津制作所)进行测定。2次测定的平均值为6176，该结果与hEGF的分子量，即根据分子内存在3个S-S键而计算出的理论值6217在误差范围内。因此证实了用上述方法制备的产EGF菌株所分泌的hEGF具有预想的氨基酸序列和结构。

实施例9：异源蛋白质分泌能力提高的谷氨酸棒杆菌AJ12036和从AJ12036制备细胞表面蛋白(PS2)的基因破坏菌株以及对使用这些变异菌株的异源蛋白质的分泌生产的评价

(1)从谷氨酸棒杆菌AJ12036制备细胞表面蛋白(PS2)基因破坏菌株

已经从谷氨酸棒杆菌ATCC13869中培育出链霉素(Sm)抗性菌株AJ12036，作为用谷氨酸棒杆菌进行基因重组的宿主之一使用(美国专利第4,822,738号)。谷氨酸棒杆菌(旧称乳发酵短杆菌)AJ12036于1984年3月26日保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(现在的独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心、日本国茨城县筑波市东1-1-1中央第6、邮政编码305-8566)，保藏号为FERMBP-734。

已知AJ12036菌株可将少量细胞表面蛋白(PS2)分泌到培养基中，因此，考虑如果进行基因破环，使其完全不生成PS2，能否进一步提高蛋白质的分泌效率。因此，如下所示，使用同源重组的方法构建了PS2基因完全缺失菌株。

合成下示的引物，用SEQ ID NO.56和57、SEQ ID NO.58和59组合，从根据齐藤、三浦的方法[Biochim.Biophys.Acta，72，619(1963)])制备的谷氨酸棒杆菌ATCC13869的染色体DNA中进行PCR。谷氨酸棒杆菌ATCC13869的PS2基因序列记载于美国专利第5,547,864号中，另外部分编码区和其5’上游的基因序列如SEQ ID NO.4所示。

接着，用SEQ ID NO.56和59的引物组合，对扩增的各个片段进行交换PCR，来扩增PS2基因的启动子区和编码区的N末端一侧缺失的ΔPS2片段。将该片段克隆到pUC19的SmaI位点，构建pUΔPS2。用KpnI和XbaI消化pUΔPS2，切下ΔPS2片段，插入来源于质粒pHM1519的温度敏感性质粒载体pHS4(美国专利第5,616,480号)的KpnI-XbaI位点，构建pHSΔPS2。用质粒pHS4转化的大肠杆菌AJ12570于1991年8月26日保藏在工业技术院生命工学工业技术研究所(现在的独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心、日本国茨城县筑波市东1-1-1中央第6、邮政编码305-8566)，保藏号为FERM BP-3523。

(SEQ ID NO.56)5’-act ggg agg cta tct cca tt-3’

(SEQ ID NO.57)5’-atc gat ctg atc acg tta ca-3’

(SEQ ID NO.58)5’-tgt aac gtg atc aga tcg att cac tgg tcg aca ccg ttg a

-3’

(SEQ ID NO.59)5’-acg gaa gct acc ttc gag gt-3’

<序列表独立文本>

SEQ ID NO.56～59：PCR引物

接着通过电穿孔将pHSΔPS2引入AJ12036菌株，根据日本特许登录2763054所记载的同源重组方法获得了PS2基因完全缺失菌株。将该菌株命名为YDK010菌株。

(2)使用谷氨酸棒杆菌AJ12036和使用来源于AJ12036的细胞表面蛋白(PS2)基因破坏菌株分泌生产异源蛋白质的评价

向AJ12036菌株和YDK010菌株中引入转谷氨酰胺酶原分泌表达质粒即实施例4(2)的pPKSPTG1，得到转化体。将pPKSPTG1引入野生菌株谷氨酸棒杆菌ATCC13869的转化体作为对照，评价上述转化体的分泌生产量。

同样，用SAMP45分泌表达质粒pVSS1、svPEP分泌表达质粒pVSSSP1和hEGF分泌表达质粒pPSEGF分别得到AJ12036菌株和YDK010菌株的转化体，评价分泌生产量。

将在30℃下、在含有25mg/l卡那霉素的上述CM2S琼脂培养基上生长一夜的菌株接种于大试管中，所述大试管预先装入了4ml添加了5％CaCO₃和25μg/ml卡那霉素的MMTG培养基(60g/L葡萄糖、1g/LMgSO₄·7H₂O、1g/L MnSO₄·4H₂O、1g/L FeSO₄·7H₂O、30g/L(NH₄)₂SO₄、1.5g/L KH₂PO₄、450μg/L VB1·HCl、450μg/L生物素、0.15g DL-Met、pH7.5)，在30℃下培养3天。

表3 变异菌株中的转谷氨酰胺酶原的分泌生产量

生产菌株	转谷氨酰胺酶原
生产菌株	转谷氨酰胺酶原	ATCC 13869/pPKSPTG1	235mg/L
AJ12036/pPKSPTG1	680	ATCC 13869/pPKSPTG1	235mg/L
AJ12036/pPKSPTG1	680	YDK010/pPKSPTG1	700

表4 变异菌株中的SAMP45的分泌生产量

生产菌株	SAMP45
生产菌株	SAMP45	ATCC13869/pVSS1	9mg/L
AJ12036/pVSS1	20	ATCC13869/pVSS1	9mg/L
AJ12036/pVSS1	20	YDK010/pVSS1	22

表5 变异菌株中的svPEP的分泌生产量

生产菌株	svPEP
生产菌株	svPEP	ATCC13869/pVSSSP1	50mg/L
AJ12036/pVSSSP1	130	ATCC13869/pVSSSP1	50mg/L
AJ12036/pVSSSP1	130	YDK010/pVSSSP1	150

表6 变异菌株中的hEGF的分泌生产量

生产菌株	hEGF
生产菌株	hEGF	ATCC13869/pPSEGF	100mg/L
AJ 12036/pPSEGF	280	ATCC13869/pPSEGF	100mg/L
AJ 12036/pPSEGF	280	YDK010/pPSEGF	290

结果如表3～6所示，通过使宿主从野生菌株转为链霉素抗性菌株AJ12036，可以大幅提高转谷氨酰胺酶原、SAMP45、svPEP和hEGF的分泌生产量。但是，来源于AJ12036的细胞表面蛋白(PS2)基因完全缺失的菌株只观察到分泌生产量略有提高的效果。该情况下，PS2的分泌对转谷氨酰胺酶原和hEGF的分泌的拮抗作用所导致的负效果并不显著。不过，在PS2基因完全缺失菌株中，由于完全没有PS2的分泌，因此可以减少培养基中不想要的污染蛋白质，在转谷氨酰胺酶原和hEGF的纯化过程中有优势。

实施例10：对于转谷氨酰胺酶原分泌培养有效的因子

使用之前用pPKSPTG1转化谷氨酸棒杆菌YDK010菌株所得的重组体进行转谷氨酰胺酶原的分泌生产中培养条件的研究。

将在30℃下、在含有25mg/l卡那霉素的上述CM2S琼脂培养基上生长一夜的菌株，接种于含有20ml CM2S培养基的500ml容量的坂口烧瓶，在30℃下培养一夜。以此做为种菌。

作为主培养，以含有25mg/l卡那霉素的MMTG液体培养基(60g/L葡萄糖、1g/L MgSO₄·7H₂O、1g/L MnSO₄·4H₂O、1g/FeSO₄·7H₂O、30g/L(NH₄)₂SO₄、1.5g/L KH₂PO₄、450μg/L VB1·HCl、450μg/L生物素、0.15g DL-Met、pH7.5)作为基本培养基，通过S型广口瓶培养探讨CaCl₂的添加效果。加入300ml上述培养基，种菌量为5％(15ml)，将溶解氧浓度控制在3％以下，在30℃下培养3天。

培养结束后，取10μl的培养上清液进行SDS-PAGE，使用上述记载的抗转谷氨酰胺酶抗体，按照常规方法进行蛋白质印迹分析。结果如表7所示，添加CaCl₂的培养组与未添加的组比较，显示约1.3倍～2倍的分泌量，证实了钙的添加效果。

表7 分泌生产转谷氨酰胺酶原的培养中钙离子的效果

CaCl₂(g/L)	转谷氨酰胺酶原累积(mg/L)	相对比率
CaCl₂(g/L)	转谷氨酰胺酶原累积(mg/L)	相对比率	00.250.51.02.0	460610790810930	11.31.71.82.0

使用上述MMTG培养基中含有2.0g/L CaCl₂的培养基，进一步探讨通气搅拌条件，结果将培养基中的溶解氧浓度控制在测定极限3％以下时，取得了良好的效果(表8)。

表8 分泌生产转谷氨酰胺酶原的培养中溶解氧浓度的效果

溶解氧浓度	转谷氨酰胺酶原累积(mg/L)	相对比率
溶解氧浓度	转谷氨酰胺酶原累积(mg/L)	相对比率	3％以下控制为3％控制为5％	930810650	1.431.251

根据本发明，可以使棒状杆菌大量生产有用蛋白质，例如转谷氨酰胺酶和人表皮细胞生长因子等异源蛋白质，且使其有效地分泌到菌体外。根据本发明生产的蛋白质可以释放到培养基中，因而可以通过已知的适当的方法，从培养基中简便且大规模地直接回收。

根据本发明，通过使棒状杆菌生产工业上有用的蛋白质，例如转谷氨酰胺酶和人表皮细胞生长因子，并使其有效地释放(分泌生产)到菌体外，可提供制备异源蛋白质的方法。

<110>味之素株式会社(Ajinomoto Co.，Inc.)

<120>分泌生产蛋白质的方法

<130>Y1J0182

<140>

<141>

<150>JP 2001-98808

<151>2001-03-30

<160>60

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>43

<212>PRT

<213>Corynebacterium glutamicum

<400>1

Met Arg Asp Thr Ala Phe Arg Ser Ile Lys Ala Lys Ala Gln Ala Lys

1 5 10 15

Arg Arg Ser Leu Trp Ile Ala Ala Gly Ala Val Pro Thr Ala Ile Ala

20 25 30

Leu Thr Met Ser Leu Ala Pro Met Ala Ser Ala

35 40

<210>2

<211>30

<212>PRT

<213>Corynebacterium glutamicum

<400>2

Met Phe Asn Asn Arg Ile Arg Thr Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ile Ala

1 5 10 15

Ile Ser Thr Ala Ala Ser Gly Val Ala Ile Pro Ala Phe Ala

20 25 30

<210>3

<211>25

<212>PRT

<213>Corynebacterium ammoniagenes

<400>3

Met Lys Arg Met Lys Ser Leu Ala Ala Ala Leu Thr Val Ala Gly Ala

1 5 10 15

Met Leu Ala Ala Pro Val Ala Thr Ala

20 25

<210>4

<211>782

<212>DNA

<213>Corynebacterium glutamicum

<220>

<221>CDS

<222>(579)..(782)

<400>4

aaattcctgt gaattagctg atttagtact tttcggaggt gtctattctt accaaatcgt 60

caagttgtgg gtagagtcac ctgaatatta attgcaccgc acgggtgata tatgcttatt 120

tgctcaagta gttcgaggtt aagtgtattt taggtgaaca aatttcagct tcgggtagaa 180

gactttcgat gcgcttcaga gcttctattg ggaaatctga caccacttga ttaaatagcc 240

tacccccgaa ttgggggatt ggtcattttt tgctgtgaag gtagttttga tgcatatgac 300

ctgcgtttat aaagaaatgt aaacgtgatc agatcgatat aaaagaaaca gtttgtactc 360

aggtttgaag cattttctcc gattcgcctg gcaaaaatct caattgtcgc ttacagtttt 420

tctcaacgac aggctgctaa gctgctagtt cggtggccta gtgagtggcg tttacttgga 480

taaaagtaat cccatgtcgt gatcagccat tttgggttgt ttccatagca atccaaaggt 540

ttcgtctttc gatacctatt caaggagcct tcgcctct atg ttt aac aac cgt atc 596

Met Phe Asn Asn Arg Ile

1 5

cgc act gca gct ctc gct ggt gca atc gca atc tcc acc gca gct tcc 644

Arg Thr Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ile Ala Ile Ser Thr Ala Ala Ser

10 15 20

ggc gta gct atc cca gca tte gct cag gag acc aac cca acc ttc aac 692

Gly Val Ala Ile Pro Ala Phe Ala Gln Glu Thr Asn Pro Thr Phe Asn

25 30 35

atc aac aac ggc ttc aac gat gct gat gga tcc acc atc cag cca gtt 740

Ile Asn Asn Gly Phe Asn Asp Ala Asp Gly Ser Thr Ile Gln Pro Val

40 45 50

gag cca gtt aac cac acc gag gaa acc ctc cgc gac ctg act 782

Glu Pro Val Asn His Thr Glu Glu Thr Leu Arg Asp Leu Thr

55 60 65

<210>5

<211>68

<212>PRT

<213>Corynebacterium glutamicum

<400>5

Met Phe Asn Asn Arg Ile Arg Thr Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ile Ala

1 5 10 15

Ile Ser Thr Ala Ala Ser Gly Val Ala Ile Pro Ala Phe Ala Gln Glu

20 25 30

Thr Asn Pro Thr Phe Asn Ile Asn Asn Gly Phe Asn Asp Ala Asp Gly

35 40 45

Ser Thr Ile Gln Pro Val Glu Pro Val Asn His Thr Glu Glu Thr Leu

50 55 60

Arg Asp Leu Thr

65

<210>6

<211>1809

<212>DNA

<213>Streptoverticillium mobaraense

<220>

<221>CDS

<222>(578)..(1798)

<400>6

gtcgacgcgg gccgggaggg ggtgcggcgg cgcccttcgg ctgtgtggac gaagcgtcgg 60

gtcggagggg cggccggata tcgtccttgg ggcggggtgg ccggaattgc cgccatggtg 120

ttgccgggga atcgacccga agacatgatc acttctcgta tccacccgat cacgtatccg 180

ggagtcgaga agtgttacgc cgtgcccctg tccgcgtcct cacccctgtc gccgtgacag 240

cgacccgcgt tcttccactc gcacggacgg ccccacagga cctttcggcc cgggctcgcc 300

ccgccgcctc ggtgacggcc tccgaataac gcggccgccg gggcctcggc cggttgaccg 360

atccgggtca cgcgccccgc cgggcgggcg gccacgtccg gtctcgcccc gcccgacatc 420

ggctgcgact gccttcgctc gcacttcttc ccgcctcccg gccgcgtttt tccgccgccg 480

aaggtgcggc gacgcgtacc gaatccccct tcatcgcgac gtgcttccgc acggccgcgt 540

tcaacgatgt tccacgacaa aggagttgca ggtttcc atg cgc ata cgc cgg aga 595

Met Arg Ile Arg Arg Arg

1 5

gct ctc gtc ttc gcc act atg agt gcg gtg tta tgc acc gcc gga ttc 643

Ala Leu Val Phe Ala Thr Met Ser Ala Val Leu Cys Thr Ala Gly Phe

10 15 20

atg ccg tcg gcc ggc gag gcc gcc gcc gac aat ggc gcg ggg gaa gag 691

Met Pro Ser Ala Gly Glu Ala Ala Ala Asp Asn Gly Ala Gly Glu Glu

25 30 35

acg aag tcc tac gcc gaa acc tac cgc ctc acg gcg gat gac gtc gcg 739

Thr Lys Ser Tyr Ala Glu Thr Tyr Arg Leu Thr Ala Asp Asp Val Ala

40 45 50

aac atc aac gcg ctc aac gaa agc gct ccg gcc gct tcg agc gcc ggc 787

Asn Ile Asn Ala Leu Asn Glu Ser Ala Pro Ala Ala Ser Ser Ala Gly

55 60 65 70

ccg tcg ttc cgg gcc ccc gac tcc gac gac agg gtc acc cct ccc gcc 835

Pro Ser Phe Arg Ala Pro Asp Ser Asp Asp Arg Val Thr Pro Pro Ala

75 80 85

gag ccg ctc gac agg atg ccc gac ccg tac cgt ccc tcg tac ggc agg 883

Glu Pro Leu Asp Arg Met Pro Asp Pro Tyr Arg Pro Ser Tyr Gly Arg

90 95 100

gcc gag acg gtc gtc aac aac tac ata cgc aag tgg cag cag gtc tac 931

Ala Glu Thr Val Val Asn Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr

105 110 115

agc cac cgc gac ggc agg aag cag cag atg acc gag gag cag cgg gag 979

Ser His Arg Asp Gly Arg Lys Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu

120 125 130

tgg ctg tcc tac ggc tgc gtc ggt gtc acc tgg gtc aat tcg ggt cag 1027

Trp Leu Ser Tyr Gly Cys Val Gly Val Thr Trp Val Asn Ser Gly Gln

135 140 145 150

tac ccg acg aac aga ctg gcc ttc gcg tcc ttc gac gag gac agg ttc 1075

Tyr Pro Thr Asn Arg Leu Ala Phe Ala Ser Phe Asp Glu Asp Arg Phe

155 160 165

aag aac gag ctg aag aac ggc agg ccc cgg tcc ggc gag acg cgg gcg 1123

Lys Asn Glu Leu Lys Asn Gly Arg Pro Arg Ser Gly Glu Thr Arg Ala

170 175 180

gag ttc gag ggc cgc gtc gcg aag gag agc ttc gac gag gag aag ggc 1171

Glu Phe Glu Gly Arg Val Ala Lys Glu Ser Phe Asp Glu Glu Lys Gly

185 190 195

ttc cag cgg gcg cgt gag gtg gcg tcc gtc atg aac agg gcc ctg gag 1219

Phe Gln Arg Ala Arg Glu Val Ala Ser Val Met Asn Arg Ala Leu Glu

200 205 210

aac gcc cac gac gag agc gct tac ctc gac aac ctc aag aag gaa ctg 1267

Asn Ala His Asp Glu Ser Ala Tyr Leu Asp Asn Leu Lys Lys Glu Leu

215 220 225 230

gcg aac ggc aac gac gcc ctg cgc aac gag gac gcc cgt tcc ccg ttc 1315

Ala Asn Gly Asn Asp Ala Leu Arg Asn Glu Asp Ala Arg Ser Pro Phe

235 240 245

tac tcg gcg ctg cgg aac acg ccg tcc ttc aag gag cgg aac gga ggc 1363

Tyr Ser Ala Leu Arg Asn Thr Pro Ser Phe Lys Glu Arg Asn Gly Gly

250 255 260

aat cac gac ccg tcc agg atg aag gcc gtc atc tac tcg aag cacttc 1411

Asn His Asp Pro Ser Arg Met Lys Ala Val Ile Tyr Ser Lys His Phe

265 270 275

tgg agc ggc cag gac cgg tcg agt tcg gcc gac aag agg aag tac ggc 1459

Trp Ser Gly Gln Asp Arg Ser Ser Ser Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Gly

280 285 290

gac ecg gac gcc ttc cgc ccc gcc ccg ggc acc ggc ctg gtc gac atg 1507

Asp Pro Asp Ala Phe Arg Pro Ala Pro Gly Thr Gly Leu Val Asp Met

295 300 305 310

tcg agg gac agg aac att ccg cgc agc ccc acc age ccc ggt gag gga 1555

Ser Arg Asp Arg Asn Ile Pro Arg Ser Pro Thr Ser Pro Gly Glu Gly

315 320 325

ttc gtc aat ttc gac tac ggc tgg ttc ggc gcc cag acg gaa gcg gac 1603

Phe Val Asn Phe Asp Tyr Gly Trp Phe Gly Ala Gln Thr Glu Ala Asp

330 335 340

gcc gac aag acc gtc tgg acc cac gga aat cac tat cac gcg ccc aat 1651

Ala Asp Lys Thr Val Trp Thr His Gly Asn His Tyr His Ala Pro Asn

345 350 355

ggc agc ctg ggt gcc atg cat gtc tac gag agc aag ttc cgc aac tgg 1699

Gly Ser Leu Gly Ala Met His Val Tyr Glu Ser Lys Phe Arg Asn Trp

360 365 370

tcc gag ggt tac tcg gac ttc gac cgc gga gcc tat gtg atc acc ttc 1747

Ser Glu Gly Tyr Ser Asp Phe Asp Arg Gly Ala Tyr Val Ile Thr Phe

375 380 385 390

atc ccc aag agc tgg aac acc gcc ccc gac aag gta aag cag ggc tgg 1795

Ile Pro Lys Ser Trp Asn Thr Ala Pro Asp Lys Val Lys Gln Gly Trp

395 400 405

ccg tgatgtgagc g 1809

Pro

<210>7

<211>407

<212>PRT

<213>Streptoverticillium mobaraense

<400>7

Met Arg Ile Arg Arg Arg Ala Leu Val Phe Ala Thr Met Ser Ala Val

1 5 10 15

Leu Cys Thr Ala Gly Phe Met Pro Ser Ala Gly Glu Ala Ala Ala Asp

20 25 30

Asn Gly Ala Gly Glu Glu Thr Lys Ser Tyr Ala Glu Thr Tyr Arg Leu

35 40 45

Thr Ala Asp Asp Val Ala Asn Ile Asn Ala Leu Asn Glu Ser Ala Pro

50 55 60

Ala Ala Ser Ser Ala Gly Pro Ser Phe Arg Ala Pro Asp Ser Asp Asp

65 70 75 80

Arg Val Thr Pro Pro Ala Glu Pro Leu Asp Arg Met Pro Asp Pro Tyr

85 90 95

Arg Pro Ser Tyr Gly Arg Ala Glu Thr Val Val Asn Asn Tyr Ile Arg

100 105 110

Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser His Arg Asp Gly Arg Lys Gln Gln Met

115 120 125

Thr Glu Glu Gln Arg Glu Trp Leu Ser Tyr Gly Cys Val Gly Val Thr

130 135 140

Trp Val Asn Ser Gly Gin Tyr Pro Thr Asn Arg Leu Ala Phe Ala Ser

145 150 155 160

Phe Asp Glu Asp Arg Phe Lys Asn Glu Leu Lys Asn Gly Arg Pro Arg

165 170 175

Ser Gly Glu Thr Arg Ala Glu Phe Glu Gly Arg Val Ala Lys Glu Ser

180 185 190

Phe Asp Glu Glu Lys Gly Phe Gln Arg Ala Arg Glu Val Ala Ser Val

195 200 205

Met Asn Arg Ala Leu Glu Asn Ala His Asp Glu Ser Ala Tyr Leu Asp

210 215 220

Asn Leu Lys Lys Glu Leu Ala Asn Gly Asn Asp Ala Leu Arg Asn Glu

225 230 235 240

Asp Ala Arg Ser Pro Phe Tyr Ser Ala Leu Arg Asn Thr Pro Ser Phe

245 250 255

Lys Glu Arg Asn Gly Gly Asn His Asp Pro Ser Arg Met Lys Ala Val

260 265 270

Ile Tyr Ser Lys His Phe Trp Ser Gly Gln Asp Arg Ser Ser Ser Ala

275 280 285

Asp Lys Arg Lys Tyr Gly Asp Pro Asp Ala Phe Arg Pro Ala Pro Gly

290 295 300

Thr Gly Leu Val Asp Met Ser Arg Asp Arg Asn Ile Pro Arg Ser Pro

305 310 315 320

Thr Ser Pro Gly Glu Gly Phe Val Asn Phe Asp Tyr Gly Trp Phe Gly

325 330 335

Ala Gln Thr Glu Ala Asp Ala Asp Lys Thr Val Trp Thr His Gly Asn

340 345 350

His Tyr His Ala Pro Asn Gly Ser Leu Gly Ala Met His Val Tyr Glu

355 360 365

Ser Lys Phe Arg Asn Trp Ser Glu Gly Tyr Ser Asp Phe Asp Arg Gly

370 375 380

Ala Tyr Val Ile Thr Phe Ile Pro Lys Ser Trp Asn Thr Ala Pro Asp

385 390 395 400

Lys Val Lys Gln Gly Trp Pro

405

<210>8

<211>1079

<212>PRT

<213>Streptomyces albogriseolus

<400>8

Asn Gly Glu Asn Ser Thr Ala Ala Gly Ser Ser Ala Ser Ala Thr Ala

1 5 10 15

Leu Lys Gly Lys His Arg Val Thr Leu Ile Thr Gly Asp Arg Val Ala

20 25 30

Leu Asp Ala Lys Gly Arg Val Val Gly Leu Glu Pro Ala Glu Gly Arg

35 40 45

Glu His Ile Pro Val Gln Ile Arg Arg Ser Asp Gly His Thr Leu Val

50 55 60

Val Pro Ala Asp Ala Ala Arg Leu Val Ala Ser Gly Lys Leu Asp Gln

65 70 75 80

Arg Leu Phe Asp Val Thr Glu Leu Asn Lys Ala Ala Thr Arg Thr Ala

85 90 95

His Arg Gly Gly Leu Lys Val Ile Val Gly Tyr Arg Gly Ala Ala Lys

100 105 110

Ala Ala Lys Ala Asp Val Arg Asp Ala Gly Thr Val Arg Arg Thr Leu

115 120 125

Thr Ser Leu Asn Ala Asp Ala Val Gln Thr Pro Gln Glu Ala Gly Ala

130 135 140

Glu Leu Trp Glu Ala Val Thr Asp Gly Asp Arg Thr Ala Ser Gly Val

145 150 155 160

Ala Arg Val Trp Leu Asp Gly Val Arg Lys Ala Ser Leu Asp Thr Ser

165 170 175

Val Gly Gln Ile Gly Thr Pro Lys Ala Trp Glu Ala Gly Tyr Asp Gly

180 185 190

Lys Gly Val Lys Ile Ala Val Leu Asp Thr Gly Val Asp Ala Thr His

195 200 205

Pro Asp Leu Lys Gly Gln Val Thr Ala Ser Lys Asn Phe Thr Ser Ala

210 215 220

Pro Thr Thr Gly Asp Val Val Gly His Gly Thr His Val Ala Ser Ile

225 230 235 240

Ala Ala Gly Thr Gly Ala Gln Ser Lys Gly Thr Tyr Lys Gly Val Ala

245 250 255

Pro Gly Ala Lys Ile Leu Asn Gly Lys Val Leu Asp Asp Ala Gly Phe

260 265 270

Gly Asp Asp Ser Gly Ile Leu Ala Gly Met Glu Trp Ala Ala Ala Gln

275 280 285

Gly Ala Asp Ile Val Asn Met Ser Leu Gly Gly Met Asp Thr Pro Glu

290 295 300

Thr Asp Pro Leu Glu Ala Ala Val Asp Lys Leu Ser Ala Glu Lys Gly

305 310 315 320

Ile Leu Phe Ala Ile Ala Ala Gly Asn Glu Gly Pro Gln Ser Ile Gly

325 330 335

Ser Pro Gly Ser Ala Asp Ser Ala Leu Thr Val Gly Ala Val Asp Asp

340 345 350

Lys Asp Lys Leu Ala Asp Phe Ser Ser Thr Gly Pro Arg Leu Gly Asp

355 360 365

Gly Ala Val Lys Pro Asp Leu Thr Ala Pro Gly Val Asp Ile Thr Ala

370 375 380

Ala Ser Ala Lys Gly Asn Asp Ile Ala Lys Glu Val Gly Glu Lys Pro

385 390 395 400

Ala Gly Tyr Met Thr Ile Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val

405 410 415

Ala Gly Ala Ala Ala Leu Leu Lys Gln Gln His Pro Glu Trp Lys Tyr

420 425 430

Ala Glu Leu Lys Gly Ala Leu Thr Ala Ser Thr Lys Asp Gly Lys Tyr

435 440 445

Thr Pro Phe Glu Gln Gly Ser Gly Arg Val Gln Val Asp Lys Ala Ile

450 455 460

Thr Gln Thr Val Ile Ala Glu Pro Val Ser Leu Ser Phe Gly Val Gln

465 470 475 480

Gln Trp Pro His Ala Asp Asp Lys Pro Val Thr Lys Lys Leu Thr Tyr

485 490 495

Arg Asn Leu Gly Thr Glu Asp Val Thr Leu Lys Leu Thr Ser Thr Ala

500 505 510

Thr Gly Pro Lys Gly Lys Ala Ala Pro Ala Gly Phe Phe Thr Leu Gly

515 520 525

Ala Ser Thr Leu Thr Val Pro Ala Asn Gly Thr Ala Ser Val Asp Val

530 535 540

Thr Ala Asp Thr Arg Leu Gly Gly Ala Val Asp Gly Thr Tyr Ser Ala

545 550 555 560

Tyr Val Val Ala Thr Gly Ala Gly Gln Ser Val Arg Thr Ala Ala Ala

565 570 575

Val Glu Arg Glu Val Glu Ser Tyr Asn Val Thr Leu Lys Val Leu Asp

580 585 590

Arg Ser Gly Lys Ala Thr Ala Asn Tyr Met Ala Tyr Leu Ser Gly Leu

595 600 605

Thr Gly Leu Gly Lys Asp Arg Ser Tyr Ala Pro Tyr Glu Ala Asp Gly

610 615 620

Ala Val Ser Val Arg Val Pro Lys Gly Gly Tyr Val Leu Asp Ala Ser

625 630 635 640

Val Leu Val Gly Ala Asp Pro Glu Thr Trp Arg Gly Ala Asp Trp Leu

645 650 655

Ala Gln Pro Lys Leu Asp Val Thr Arg Asn Thr Thr val Thr Val Asp

660 665 670

Ala Arg Lys Ala Lys Pro Val Lys Val Thr Val Pro Gly Lys Ala Ala

675 680 685

Lys Ala Gln Phe Ala Ser Ala Asp Tyr Thr Ile Glu Thr Asn Asp Ser

690 695 700

Ala Val Ser Tyr Gly Trp Trp Leu Glu Asn Tyr Ser Gly Phe Arg Ser

705 710 715 720

Ala His Leu Gly Pro Gln Ile Thr Asn Gly Thr Leu Ser Gln Gln Trp

725 730 735

Asn Thr His Phe Ser Asn Gly Ala Lys Ala Gln Tyr Thr Ala Ile Ser

740 745 750

Gly Gly Lys Val Lys Lys Leu Ala Thr Gly Tyr Thr Arg Ala Phe Lys

755 760 765

Ala Lys Glu Phe Ala Thr Val Gln Val Gly Met Gly Ala Ala Ala Ser

770 775 780

Gly Lys Lys Gly Ala Val Thr Ala Phe Gly Trp Leu Pro Gly Ser Ser

785 790 795 800

Gly Ala Ser Gly Phe Ser Gln Glu Gln Lys Leu Pro Ser Thr Arg Thr

805 810 815

Leu Tyr Leu Ser Thr Val Asn Gly Val Thr Trp Asp Leu Asp Phe Glu

820 825 830

Gln Leu Gly Gly Val Asp Asn Glu Gly Trp Pro Ile Tyr Asp Ala Val

835 840 845

Tyr Thr Ile Gly Val Gly Lys Thr Tyr Lys Gly Gly Lys Thr Tyr Lys

850 855 860

Glu Thr Val Asn Thr Ala Val Phe Gly Pro Arg Leu Thr Ser Ser Tyr

865 870 875 880

Gly Val Phe Arg Asp Gly Asn Ser Ile Tyr Gly Val Ile Pro Leu Phe

885 890 895

Ala Asp Gly Lys Gly His Ala Gly Ser Ser Glu Phe Ser Ser Ala Val

900 905 910

Thr Thr Leu Tyr Arg Asn Gly Lys Lys Val Gly Ser Asn Asn Asp Pro

915 920 925

Leu Phe Gly Glu Glu Gly Phe Thr Val Pro Ser Gly Asp Ala Ala Tyr

930 935 940

Arg Leu Thr Thr Ser Val Lys Arg Ser Ala Lys Val Ala Ala Ala Ser

945 950 955 960

Thr Arg Ile Asp Ala Ser Trp Thr Phe Arg Ser Lys Lys Thr Ser Gly

965 970 975

Glu Lys Gln Leu Pro Val Ser Ser Ala Arg Phe Ala Ala Val Thr Gly

980 985 990

Leu Asp Ser Lys Val Ala Ala Gly Lys Lys Ala Thr Phe Pro Val Val

995 1000 1005

Val Glu Gly Ala Ala Gln Gly Lys Asn Leu Lys Ser Leu Ala Val Tyr

1010 1015 1020

Val Ser Tyr Asn Gly Gly Lys Thr Trp Lys Lys Thr Thr Val Thr Lys

1025 1030 1035 1040

Gly Lys Ile Thr Val Lys Asn Pro Ala Lys Gly Lys Ala Ile Ser Phe

1045 1050 1055

Arg Ala Lys Ile Thr Asp Lys Lys Gly Asn Ala Ser Leu Ile Thr Ile

1060 1065 1070

His Asn Ala Tyr Tyr Gly Lys

1075

<210>9

<211>1751

<212>DNA

<213>Streptoverticilliummobaraense

<220>

<221>CDS

<222>(229)..(1659)

<400>9

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ggcgagcgcg tgtggctgga cgagcccggt cggcccgtgc cgctcgtgcg gccgtgaaag 120

gcccgaaaag agcccaagcc gtgtgaactg cgaggacaaa gggtctggcg caacgcatgt 180

caccccagat aagttcgccg cgacctttgc gaacccaggg gagggcgc atg cgc aag 237

Met Arg Lys

1

gct ctc aga tcg ctg ctg gcg gcg tcg atg ctc ata gga gcg atc ggc 285

Ala Leu Arg Ser Leu Leu Ala Ala Ser Met Leu Ile Gly Ala Ile Gly

5 10 15

gcc ggc agc gcc acg gcg gag gcg gcg tcg atc acc gcc ccg cag gcc 333

Ala Gly Ser Ala Thr Ala Glu Ala Ala Ser Ile Thr Ala Pro Gln Ala

20 25 30 35

gac atc aag gac cgc atc ctg aag att ccc ggg atg aag ttc gtc gag 381

Asp Ile Lys Asp Arg Ile Leu Lys Ile Pro Gly Met Lys Phe Val Glu

40 45 50

gag aag ccc tac cag ggc tac cgc tac ctc gtg atg acg tac cgg cag 429

Glu Lys Pro Tyr Gln Gly Tyr Arg Tyr Leu Val Met Thr Tyr Arg Gln

55 60 65

ccg gtg gac cac cgc aat ccc ggc aag ggg acc ttc gag cag cgc ttc 477

Pro Val Asp His Arg Asn Pro Gly Lys Gly Thr Phe Glu Gln Arg Phe

70 75 80

acc ctg ctc cac aag gac acc gac cgg ccg acc gtg ttc ttc acg tcc 525

Thr Leu Leu His Lys Asp Thr Asp Arg Pro Thr Val Phe Phe Thr Ser

85 90 95

ggc tac aac gtc tcc acc aac ccc agc cgc agc gag ccc acg cgc atc 573

Gly Tyr Asn Val Ser Thr Asn Pro Ser Arg Ser Glu Pro Thr Arg Ile

100 105 110 115

gtg gac ggc aac cag gtg tcg atg gag tac cgg ttc ttc acg ccg tcc 621

Val Asp Gly Asn Gln Val Ser Met Glu Tyr Arg Phe Phe Thr Pro Ser

120 125 130

cgg ccg cag ccc gcc gac tgg tcc aag ctg gac atc tgg cag gcg gcg 669

Arg Pro Gln Pro Ala Asp Trp Ser Lys Leu Asp Ile Trp Gln Ala Ala

135 140 145

agt gac cag cac cgc ctg tac cag gcg ctg aag ccg gtc tac ggg aag 717

Ser Asp Gln His Arg Leu Tyr Gln Ala Leu Lys Pro Val Tyr Gly Lys

150 155 160

aac tgg ctg gcc acg ggc ggc agc aag ggc ggc atg acg gcc acc tac 765

Asn Trp Leu Ala Thr Gly Gly Ser Lys Gly Gly Met Thr Ala Thr Tyr

165 170 175

ttc cgc cgc ttc tac ecg aac gac atg aac ggc acg gtc gcc tac gtc 813

Phe Arg Arg Phe Tyr Pro Asn Asp Met Asn Gly Thr Val Ala Tyr Val

180 185 190 195

gcg ccc aac gac gtg aac gac aag gaa gac tcg gcg tac gac aag ttc 861

Ala Pro Asn Asp Val Asn Asp Lys Glu Asp Ser Ala Tyr Asp Lys Phe

200 205 210

ttc cag aac gtc ggc gac aag gcg tgc cgc acg cag ctc aac tcg gtg 909

Phe Gln Asn Val Gly Asp Lys Ala Cys Arg Thr Gln Leu Asn Ser Val

215 220 225

cag cgc gag gcg ctc gtc cgc cgc gac gag atc gtc gcc cgc tac gag 957

Gln Arg Glu Ala Leu Val Arg Arg Asp Glu Ile Val Ala Arg Tyr Glu

230 235 240

aag tgg gct aag gag aac ggc aag acg ttc aag gtc gtc ggc agc gcc 1005

Lys Trp Ala Lys Glu Asn Gly Lys Thr Phe Lys Val Val Gly Ser Ala

245 250 255

gac aag gcg tac gag aac gtc gtc ctc gac ctg gtc tgg tcc ttc tgg 1053

Asp Lys Ala Tyr Glu Asn Val Val Leu Asp Leu Val Trp Ser Phe Trp

260 265 270 275

cag tac cac ctg cag agc gac tgc gcc tcc gtc ccc gcc acc aag gcg 1101

Gln Tyr His Leu Gln Ser Asp Cys Ala Ser Val Pro Ala Thr Lys Ala

280 285 290

tcc acc gac gag ctg tac aag ttc atc gac gac atc tcg ggc ttc gac 1149

Ser Thr Asp Glu Leu Tyr Lys Phe Ile Asp Asp Ile Ser Gly Phe Asp

295 300 305

ggc tac acc gac cag ggc ctg gag cgc ttc acc ccg tac tac tac cag 1197

Gly Tyr Thr Asp Gln Gly Leu Glu Arg Phe Thr Pro Tyr Tyr Tyr Gln

310 315 320

gcg ggc acc cag ctc ggc gcc cct acg gtg aag aac ccg cac ctc aag 1245

Ala Gly Thr Gln Leu Gly Ala Pro Thr Val Lys Asn Pro His Leu Lys

325 330 335

ggc gtg ctg cgg tac ccc ggc atc aac cag ccg cgc tcg tac gtc ccc 1293

Gly Val Leu Arg Tyr Pro Gly Ile Asn Gln Pro Arg Ser Tyr Val Pro

340 345 350 355

cgc gac atc ccg atg acc ttc cgc ccc ggc gcg atg gcg gac gtc gac 1341

Arg Asp Ile Pro Met Thr Phe Arg Pro Gly Ala Met Ala Asp Val Asp

360 365 370

cgc tgg gtg cgc gag gac agc cgg aac atg ctc ttc gtg tac ggg cag 1389

Arg Trp Val Arg Glu Asp Ser Arg Asn Met Leu Phe Val Tyr Gly Gln

375 380 385

aac gac ccg tgg agc ggt gaa ccg ttc cgc ctg ggc aag ggc gcc gcc 1437

Asn Asp Pro Trp Ser Gly Glu Pro Phe Arg Leu Gly Lys Gly Ala Ala

390 395 400

gcc cgg cac gac tac cgc ttc tac gcc ccg ggc ggc aac cac ggt tcc 1485

Ala Arg His Asp Tyr Arg Phe Tyr Ala Pro Gly Gly Asn His Gly Ser

405 410 415

aac atc gcc cag ttg gtg gcc gac gag cgg gcc aag gcc acg gcc gag 1533

Asn Ile Ala Gln Leu Val Ala Asp Glu Arg Ala Lys Ala Thr Ala Glu

420 425 430 435

gtc ctg aag tgg gcc ggt gtg gcg ccg cag gcc gtc cag aag gac gag 1581

Val Leu Lys Trp Ala Gly Val Ala Pro Gln Ala Val Gln Lys Asp Glu

440 445 450

aag gcc gcc aag ccg ctc gcg ccg ttc gac gcc aag ctc gac cgc gtg 1629

Lys Ala Ala Lys Pro Leu Ala Pro Phe Asp Ala Lys Leu Asp Arg Val

455 460 465

aag aac gac aag cag agc gcg ctg cgt ccg tagggaccca gtgcgtaagg 1679

Lys Asn Asp Lys Gln Ser Ala Leu Arg Pro

470 475

cggcgggcgc tcccggcgag gggcgcccgc cgtcgcgttc cggaaggccc cgggtgccgc 1739

cgccggtgct tc 1751

<210>10

<211>477

<212>PRT

<213>Streptoverticillium mobaraense

<400>10

Met Arg Lys Ala Leu Arg Ser Leu Leu Ala Ala Ser Met Leu Ile Gly

1 5 10 15

Ala Ile Gly Ala Gly Ser Ala Thr Ala Glu Ala Ala Ser Ile Thr Ala

20 25 30

Pro Gln Ala Asp Ile Lys Asp Arg Ile Leu Lys Ile Pro Gly Met Lys

35 40 45

Phe Val Glu Glu Lys Pro Tyr Gln Gly Tyr Arg Tyr Leu Val Met Thr

50 55 60

Tyr Arg Gln Pro Val Asp His Arg Asn Pro Gly Lys Gly Thr Phe Glu

65 70 75 80

Gln Arg Phe Thr Leu Leu His Lys Asp Thr Asp Arg Pro Thr Val Phe

85 90 95

Phe Thr Ser Gly Tyr Asn Val Ser Thr Asn Pro Ser Arg Ser Glu Pro

100 105 110

Thr Arg Ile Val Asp Gly Asn Gln Val Ser Met Glu Tyr Arg Phe Phe

115 120 125

Thr Pro Ser Arg Pro Gln Pro Ala Asp Trp Ser Lys Leu Asp Ile Trp

130 135 140

Gln Ala Ala Ser Asp Gln His Arg Leu Tyr Gln Ala Leu Lys Pro Val

145 150 155 160

Tyr Gly Lys Asn Trp Leu Ala Thr Gly Gly Ser Lys Gly Gly Met Thr

165 170 175

Ala Thr Tyr Phe Arg Arg Phe Tyr Pro Asn Asp Met Asn Gly Thr Val

180 185 190

Ala Tyr Val Ala Pro Asn Asp Val Asn Asp Lys Glu Asp Ser Ala Tyr

195 200 205

Asp Lys Phe Phe Gln Asn Val Gly Asp Lys Ala Cys Arg Thr Gln Leu

210 215 220

Asn Ser Val Gln Arg Glu Ala Leu Val Arg Arg Asp Glu Ile Val Ala

225 230 235 240

Arg Tyr Glu Lys Trp Ala Lys Glu Asn Gly Lys Thr Phe Lys Val Val

245 250 255

Gly Ser Ala Asp Lys Ala Tyr Glu Asn Val Val Leu Asp Leu Val Trp

260 265 270

Ser Phe Trp Gln Tyr His Leu Gln Ser Asp Cys Ala Ser Val Pro Ala

275 280 285

Thr Lys Ala Ser Thr Asp Glu Leu Tyr Lys Phe Ile Asp Asp Ile Ser

290 295 300

Gly Phe Asp Gly Tyr Thr Asp Gln Gly Leu Glu Arg Phe Thr Pro Tyr

305 310 315 320

Tyr Tyr Gln Ala Gly Thr Gln Leu Gly Ala Pro Thr Val Lys Asn Pro

325 330 335

His Leu Lys Gly Val Leu Arg Tyr Pro Gly Ile Asn Gln Pro Arg Ser

340 345 350

Tyr Val Pro Arg Asp Ile Pro Met Thr Phe Arg Pro Gly Ala Met Ala

355 360 365

Asp Val Asp Arg Trp Val Arg Glu Asp Ser Arg Asn Met Leu Phe Val

370 375 380

Tyr Gly Gln Asn Asp Pro Trp Ser Gly Glu Pro Phe Arg Leu Gly Lys

385 390 395 400

Gly Ala Ala Ala Arg His Asp Tyr Arg Phe Tyr Ala Pro Gly Gly Asn

405 410 415

His Gly Ser Asn Ile Ala Gln Leu Val Ala Asp Glu Arg Ala Lys Ala

420 425 430

Thr Ala Glu Val Leu Lys Trp Ala Gly Val Ala Pro Gln Ala Val Gln

435 440 445

Lys Asp Glu Lys Ala Ala Lys Pro Leu Ala Pro Phe Asp Ala Lys Leu

450 455 460

Asp Arg Val Lys Asn Asp Lys Gln Ser Ala Leu Arg Pro

465 470 475

<210>11

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>11

gactccgacg acagggtcac ccctcccgcc 30

<210>12

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>12

cgctcacatc acggccagcc ctgctttacc 30

<210>13

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：用于茂原链轮丝菌(S.mobaraense)启动子区和信号序列区的PCR引物

<400>13

gtgaccctgt cgtcggagtc 20

<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<400>14

ggcatcctgt cgagcggctc 20

<210>15

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>15

aaattcctgt gaattagctg atttag 26

<210>16

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>16

gagctctccg gcgtatgcgc atagaggcga aggctccttg aata 44

<210>17

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>17

atgcgcatac gccggagagc tctcgtcttc 30

<210>18

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>18

ggggtgaccc tgtcgtcgga gtcgttgaag ccgttgttga tgttgaa 47

<210>19

<211>51

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>19

cttcgtctct tcccccgcgc cattgtcagc gaatgctggg atagcaacgc c 51

<210>20

<211>51

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>20

cttcgtctct tcccccgcgc cattgtcctg agcgaatgct gggatagcta c 51

<210>21

<211>51

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>21

cttcgtctct tcccccgcgc cattgtcgtt gaagccgttg ttgatgttga a 51

<210>22

<211>51

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>22

cttcgtctct tcccccgcgc cattgtcagt caggtcgcgg agggtttcct c 51

<210>23

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>23

gacaatggcg cgggggaaga gacgaagtcc 30

<210>24

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>24

gcccagaagc ccaaaattga gattt 25

<210>25

<211>52

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>25

cttcgtctct tcccccgcgc cattgtctgc cgttgccaca ggtgcggcca gc 52

<210>26

<211>52

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>26

cgcagccagc gatttcatgc gtttcataga ggcgaaggct ccttgaatag gt 52

<210>27

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>27

atgaaacgca tgaaatcgct ggctgcggcg 30

<210>28

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>28

ggatccggag cttatcgact gcacg 25

<210>29

<211>52

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>29

cgcagccagc gatttcatgc gtttcataat tctgtttcct gtgtgaaatt gt 52

<210>30

<211>1461

<212>DNA

<213>Streptoverticillium cinnamoneum

<220>

<221>CDS

<222>(151)..(1398)

<400>30

cggcggcagc cctccttgcc gccggcgcag cgacgcagga cggcgcggcc aaggccctga 60

gcggcagctc gtcgcaaacc cctccatcgc gtcgtgctct cacatgccct cgtttcacga 120

ggcttcacca caagggagtt attgatttcc atg cac aaa cgt cgg aga ctt ctc 174

Met His Lys Arg Arg Arg Leu Leu

1 5

gcc ttc gcc act gtg ggt gcg gtc ata tgc acc gca gga ttc aca cct 222

Ala Phe Ala Thr Val Gly Ala Val Ile Cys Thr Ala Gly Phe Thr Pro

10 15 20

tcg gtc age cag gcc gcc agc agt ggc gat ggg gaa gag aag ggg tcc 270

Ser Val Ser Gln Ala Ala Ser Ser Gly Asp Gly Glu Glu Lys G1y Ser

25 30 35 40

tac gcc gaa acg cac ggc ctg acg gcg gat gac gtc gag agc atc aac 318

Tyr Ala Glu Thr His Gly Leu Thr Ala Asp Asp Val Glu Ser Ile Asn

45 50 55

gca ctg aac gaa aga gct ctg act ctg ggc caa cct ggc aag cct ccg 366

Ala Leu Asn Glu Arg Ala Leu Thr Leu Gly Gln Pro Gly Lys Pro Pro

60 65 70

aag gaa tta cct ccg agc gcc agc gcg ccc tcc cgg gcc ccc tcc gat 414

Lys Glu Leu Pro Pro Ser Ala Ser Ala Pro Ser Arg Ala Pro Ser Asp

75 80 85

gac cgg gaa act cct ccc gcc gag ccg ctc gac agg atg cct gag gcg 462

Asp Arg Glu Thr Pro Pro Ala Glu Pro Leu Asp Arg Met Pro Glu Ala

90 95 100

tac cgg gcc tac gga ggc agg gcc act acg gtc gtc aac aac tac ata 510

Tyr Arg Ala Tyr Gly Gly Arg Ala Thr Thr Val Val Asn Asn Tyr Ile

105 110 115 120

cgc aag tgg cag cag gtc tac agt cac cgc gac gga aag aaa cag caa 558

Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser His Arg Asp Gly Lys Lys Gln Gln

125 130 135

atg acc gaa gag cag cga gaa aag ctg tcc tac ggt tgc gtt ggc gtc 606

Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu Lys Leu Ser Tyr Gly Cys Val Gly Val

140 145 150

acc tgg gtc aac tcg ggc ccc tac ccg acg aac aga ttg gcg ttc gcg 654

Thr Trp Val Asn Ser Gly Pro Tyr Pro Thr Asn Arg Leu Ala Phe Ala

155 160 165

tcc ttc gac gag aac aag tac aag aac gac ctg aag aac acc agc ccc 702

Ser Phe Asp Glu Asn Lys Tyr Lys Asn Asp Leu Lys Asn Thr Ser Pro

170 175 180

cga ccc gat gaa acg cgg gcg gag ttc gag ggt cgc atc gcc aag ggc 750

Arg Pro Asp Glu Thr Arg Ala Glu Phe Glu Gly Arg Ile Ala Lys Gly

185 190 195 200

agt ttc gac gag ggg aag ggt ttc aag cgg gcg cgt gat gtg gcg tcc 798

Ser Phe Asp Glu Gly Lys Gly Phe Lys Arg Ala Arg Asp Val Ala Ser

205 210 215

gtc atg aac aag gcc etg gaa aat gcc cac gac gag ggg act tac ate 846

Val Met Asn Lys Ala Leu Glu Asn Ala His Asp Glu Gly Thr Tyr Ile

220 225 230

aac aac ctc aag acg gag ctc acg aac aac aat gac gct ctg ctc cgc 894

Asn Asn Leu Lys Thr Glu Leu Thr Asn Asn Asn Asp Ala Leu Leu Arg

235 240 245

gag gac agc cgc tcg aac ttc tac tcg gcg ctg agg aac aca ccg tcc 942

Glu Asp Ser Arg Ser Asn Phe Tyr Ser Ala Leu Arg Asn Thr Pro Ser

250 255 260

ttc aag gaa agg gac ggc ggc aac tac gac ccg tcc aag atg aag gcg 990

Phe Lys Glu Arg Asp Gly Gly Asn Tyr Asp Pro Ser Lys Met Lys Ala

265 270 275 280

gtg atc tac tcg aag cac ttc tgg agc ggg cag gac cag cgg ggc tcc 1038

Val Ile Tyr Ser Lys His Phe Trp Ser Gly Gln Asp Gln Arg Gly Ser

285 290 295

tcc gac aag agg aag tac ggc gac ccg gaa gcc ttc cgc ccc gac cag 1086

Ser Asp Lys Arg Lys Tyr Gly Asp Pro Glu Ala Phe Arg Pro Asp Gln

300 305 310

ggt acc ggc ctg gte gac atg tcg aag gac aga agc att ccg cgc agt 1134

Gly Thr Gly Leu Val Asp Met Ser Lys Asp Arg Ser Ile Pro Arg Ser

315 320 325

ccg gcc aag ccc ggc gaa ggt tgg gtc aat ttc gac tac ggt tgg ttc 1182

Pro Ala Lys Pro Gly Glu Gly Trp Val Asn Phe Asp Tyr Gly Trp Phe

330 335 340

ggg gct caa aca gaa gcg gat gcc gac aaa acc aca tgg acc cac ggc 1230

Gly Ala Gln Thr Glu Ala Asp Ala Asp Lys Thr Thr Trp Thr His Gly

345 350 355 360

gac cac tac cac gcg ccc aat agc gac ctg ggc ccc atg cac gta cac 1278

Asp His Tyr His Ala Pro Asn Ser Asp Leu Gly Pro Met His Val His

365 370 375

gag agc aag ttc cgg aag tgg tct gcc ggg tac gcg gac ttc gac cgc 1326

Glu Ser Lys Phe Arg Lys Trp Ser Ala Gly Tyr Ala Asp Phe Asp Arg

380 385 390

gga gcc tac gtg atc acg ttc ata ccc aag agc tgg aac acc gcc ccc 1374

Gly Ala Tyr Val Ile Thr Phe Ile Pro Lys Ser Trp Asn Thr Ala Pro

395 400 405

gcc aag gtg gag caa ggc tgg ccg tgacaggctg gtactacgac ctctgctgat 1428

Ala Lys Val Glu Gln Gly Trp Pro

410 415

ttctgcccgg tcagtccacg cctctcgacg cga 1461

<210>31

<211>416

<212>PRT

<213>Streptoverticillium cinnamoneum

<400>31

Met His Lys Arg Arg Arg Leu Leu Ala Phe Ala Thr Val Gly Ala Val

1 5 10 15

Ile Cys Thr Ala Gly Phe Thr Pro Ser Val Ser Gln Ala Ala Ser Ser

20 25 30

Gly Asp Gly Glu Glu Lys Gly Ser Tyr Ala Glu Thr His Gly Leu Thr

35 40 45

Ala Asp Asp Val Glu Ser Ile Asn Ala Leu Asn Glu Arg Ala Leu Thr

50 55 60

Leu Gly Gln Pro Gly Lys Pro Pro Lys Glu Leu Pro Pro Ser Ala Ser

65 70 75 80

Ala Pro Ser Arg Ala Pro Ser Asp Asp Arg Glu Thr Pro Pro Ala Glu

85 90 95

Pro Leu Asp Arg Met Pro Glu Ala Tyr Arg Ala Tyr Gly Gly Arg Ala

100 105 110

Thr Thr Val Val Asn Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser

115 120 125

His Arg Asp Gly Lys Lys Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu Lys

130 135 140

Leu Ser Tyr Gly Cys Val Gly Val Thr Trp Val Asn Ser Gly Pro Tyr

145 150 155 160

Pro Thr Asn Arg Leu Ala Phe Ala Ser Phe Asp Glu Asn Lys Tyr Lys

165 170 175

Asn Asp Leu Lys Asn Thr Ser Pro Arg Pro Asp Glu Thr Arg Ala Glu

180 185 190

Phe Glu Gly Arg Ile Ala Lys Gly Ser Phe Asp Glu Gly Lys Gly Phe

195 200 205

Lys Arg Ala Arg Asp Val Ala Ser Val Met Asn Lys Ala Leu Glu Asn

210 215 220

Ala His Asp Glu Gly Thr Tyr Ile Asn Asn Leu Lys Thr Glu Leu Thr

225 230 235 240

Asn Asn Asn Asp Ala Leu Leu Arg Glu Asp Ser Arg Ser Asn Phe Tyr

245 250 255

Ser Ala Leu Arg Asn Thr Pro Ser Phe Lys Glu Arg Asp Gly Gly Asn

260 265 270

Tyr Asp Pro Ser Lys Met Lys Ala Val Ile Tyr Ser Lys His Phe Trp

275 280 285

Ser Gly Gln Asp Gln Arg Gly Ser Ser Asp Lys Arg Lys Tyr Gly Asp

290 295 300

Pro Glu Ala Phe Arg Pro Asp Gln Gly Thr Gly Leu Val Asp Met Ser

305 310 315 320

Lys Asp Arg Ser Ile Pro Arg Ser Pro Ala Lys Pro Gly Glu Gly Trp

325 330 335

Val Asn Phe Asp Tyr Gly Trp Phe Gly Ala Gln Thr Glu Ala Asp Ala

340 345 350

Asp Lys Thr Thr Trp Thr His Gly Asp His Tyr His Ala Pro Asn Ser

355 360 365

Asp Leu Gly Pro Met His Val His Glu Ser Lys Phe Arg Lys Trp Ser

370 375 380

Ala Gly Tyr Ala Asp Phe Asp Arg Gly Ala Tyr Val Ile Thr Phe Ile

385 390 395 400

Pro Lys Ser Trp Asn Thr Ala Pro Ala Lys Val Glu Gln Gly Trp Pro

405 410 415

<210>32

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>32

ggcgatgggg aagagaaggg g 21

<210>33

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>33

ggcggatcct cgcgtcgaga ggcgtggact ga 32

<210>34

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>34

tacgaattcg agctcggtac c 21

<210>35

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>35

ccccttctct tccccatcgc ctgccgttgc cacaggtgcg gcc 43

<210>36

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>36

aacggggaga acagcacggc cgccgg 26

<210>37

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>37

ggcgaattct ccggcgggcc gtcaccggt 29

<210>38

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：用于构建融合的前丝氨酸蛋白酶原的PCR引物

<400>38

ggcaagctta aattcctgtg aattagctga 30

<210>39

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<400>39

cggccgtgct gttctccccg tttgccgttg ccacaggtgc ggcc 44

<210>40

<211>20

<212>PRT

<213>Streptoverticillium mobaraence

<400>40

Gln Ala Asp Ile Lys Asp Arg Ile Leu Lys Ile Pro Gly Met Lys Phe

1 5 10 15

Val Glu Glu Lys

20

<210>41

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：用于svPEP的探针

<400>41

Lys Ile Pro Gly Met Lys Phe Val Glu Glu Lys

1 5 10

<210>42

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：用于svPEP的探针

<400>42

aagatccccg ggatgaagtt cgtcgaggag aag 33

<210>43

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>43

gaggcggcgt cgatcaccgc ccc 23

<210>44

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>44

gccaagcttg aagcaccggc ggcggcaccc gg 32

<210>45

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>45

ggggcggtga tcgacgccgc ctctgccgtt gccacaggtg cggcca 46

<210>46

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>46

gctcggtacc caaattcctg tgaattagct gatttag 37

<210>47

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>47

gttgaagccg ttgttgatgt tgaa 24

<210>48

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>48

aacatcaaca acggcttcaa caattccgat tctgagtgcc ct 42

<210>49

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>49

cggccacgat gcgtccggcg 20

<210>50

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>50

agggcactca gaatcggaat ttgccgttgc cacaggtgcg gcc 43

<210>51

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>51

aattccgatt ctgagtgccc t 21

<210>52

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>52

gaattcgagc tcggtaccca 20

<210>53

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>53

agcgatttca tgcgtttcat agaggcgaag gctccttgaa 40

<210>54

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>54

atgaaacgca tgaaatcgct ggc 23

<210>55

<211>53

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>55

Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His

1 5 10 15

Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn

20 25 30

Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys

35 40 45

Trp Trp Glu Leu Arg

50

<210>56

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>56

actgggaggc tatctccatt 20

<210>57

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>57

atcgatctga tcacgttaca 20

<210>58

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>58

tgtaacgtga tcagatcgat tcactggtcg acaccgttga 40

<210>59

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>59

acggaagcta ccttcgaggt 20

<210>60

<211>4

<212>PRT

<213>Streptoverticillium mobaraense

<400>60

Phe Arg Ala Pro

1

Claims

1.异源蛋白质的制备方法，其特征在于：培养棒状杆菌，让其生产异源蛋白质，回收生成的异源蛋白质，其中所述棒状杆菌具有表达基因构建物，其中编码来源于棒状杆菌的信号肽区的核酸序列连接于在棒状杆菌中发挥功能的启动子序列的下游，且编码异源蛋白质的核酸序列连接于编码所述信号肽区的核酸序列的下游，其中所述棒状杆菌选自i)谷氨酸棒杆菌FERM BP-734和ii)从谷氨酸棒杆菌FERM BP-734衍生的不生产细胞表面蛋白的变异菌株。

2.权利要求1的方法，其中所述信号肽是来源于棒状杆菌的细胞表面蛋白的信号肽。

3.权利要求1的方法，其中所述信号肽是来源于谷氨酸棒杆菌的细胞表面蛋白的信号肽。

4.权利要求3的方法，其中所述信号肽具有SEQ ID NO.1或2所示的氨基酸序列。

5.权利要求1的方法，其中所述信号肽是来源于产氨棒杆菌的细胞表面蛋白的信号肽。

6.权利要求5的方法，其中所述信号肽具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

7.权利要求1～6中任一项的方法，其中所述棒状杆菌的培养在含有2.25mM以上的钙离子的培养基中进行。

8.权利要求1～6中任一项的方法，其中所述棒状杆菌的培养是将溶解氧浓度控制在3％以下来进行。