BR0208136B1

BR0208136B1 - Método para produzir uma proteína heteróloga

Info

Publication number: BR0208136B1
Application number: BRPI0208136-9A
Authority: BR
Inventors: Yoshimi Kikuchi; Masayo Date; Yukiko Umezawa; Keiichi Yokoyama; Haruo Heima; Hiroshi Matsui
Original assignee: Ajinomoto Kk
Priority date: 2001-03-30
Filing date: 2002-03-27
Publication date: 2014-10-21
Also published as: RU2003128977A; BR0208136A; CA2442679A1; US7252972B2; EP1375664B1; RU2264463C2; CN1500145A; DE60234247D1; US20040126847A1; JP4362651B2; JPWO2002081694A1; KR20030087042A; ES2335750T3; KR100602807B1; AU2002242986A1; DK1375664T3; CA2442679C; WO2002081694A8; WO2002081694A1; EP1375664A1

Description

“MÉTODO PARA PRODUZIR UMA PROTEÍNA HETERÓLOGA” FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um método de produção eficiente de uma proteína heteróloga por uma produção secretória. Vários métodos para a produção secretória de proteínas heterólogas foram previamente registrados como os descritos no estudo sobre a produção secretória de uma proteína heteróloga por uma bactéria pertencendo ao gênero Bacillus [Microbial. Rev., 57, 109-137 (1993)], o estudo sobre a produção secretória de uma proteína heteróloga por levedura metilotrófica Pichia pastoris [Biotechnol., 11, 905-910 (1993)] e o relatório sobre a produção industrial de proteínas heterólogas pelo mofo pertencendo ao gênero Aspergillus [Biotechnol., 6, 1419-1422 (1988); Biotechnol., 9, 976- 981 (1991)]. A transglutaminase produzida pela produção secretória de acordo com uma forma de realização da presente invenção é uma enzima que catalisa a reação de transferência de acila de grupos γ-carboxilamida na cadeia peptídeo da proteína. Quando a enzima é reagida com uma proteína, a formação da reticulação ε (γ -Glu)-Lys e a substituição de Gin com Glu por desamidação pode ter ocorrido. A transglutaminase tem sido usada para fabricar produtos alimentícios geleificados como gelatina, iogurtes, queijos ou cosméticos geleificados e outros, e para melhorar a qualidade de carne e outros (Publicação JP de pedido examinado No. 1-50382). Além disso, transglutaminase é uma enzima tendo industrialmente uma alta utilidade em que tem sido usada para fabricar materiais para microcápsulas termoestáveis, veículos para enzimas imobilizadas, etc.

As transglutaminases derivadas de animais e de microorganismos (transglutaminase microbiana, referida como "MTG" abaixo) já são conhecidas. A primeira é uma enzima dependendo de íon cálcio que é distribuída em órgãos animais, pele, sangue, etc. Os exemplos incluem transglutaminase hepática de porquinho-da-índia (K. Ikura et al. Biochemistry 27, 2898 (1988)), transglutaminase de ceratinócitos epidérmico humano (M. A. Phillips et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87, 9333 (1990)), fator XIII de coagulação de sangue humano (A. Ichinose et al. Biochemistry 25, 6900 (1990)) e outros.

Para a última, as transglutaminases independentes de cálcio foram descobertas a partir de bactérias pertencendo ao gênero Streptoverticillium, que incluem, por exemplo, Streptoverticillium griseocarneum IFO 12776, Streptoverticillium cinnamoneum sub sp. cinnamoneum (a seguir abreviado como S. cinnamoneum) IFO 12852, Streptoverticillium rr^biraense (a seguir pode ser abreviado como S. mobaraense) IFO 13819 e outros (Publicação de pedido de patente JP não examinado (JP-Kokai No. 64-27471). O mapeamento de peptídeos e a análise estrutural dos genes revelaram que a estrutura primária da transglutaminase produzida por estes microorganismos não compartilha homologia com transglutaminases de animais (Publicação de pedido de patente européia No. 0 481 504 Al).

Porque as transglutaminases derivadas de microorganismos (MTG) são produzidas através da purificação de culturas de microorganismos, como descrito acima, ocorreram problemas em termos da quantidade e a eficiência e outros. A produção de transglutaminase usando procedimento geneticamente engenheirado também foi tentada. As proteínas de transglutaminase e os genes das mesmas foram relatados em, por exemplo, Biosci. Biotechnol. Biochem., 58, 82-87(1994), Biosci. Biotechnol. Biochem., 58, 88-92(1994), Biochimie, 80, 313-319(1998)., Eur. J. Biochem., 257, 570- 576(1998), WO 96/06931, WO 96/22366, etc, que regulam a expressão e produção de transglutaminase em sistemas de hospedeiro-vetor, como Streptomyces lividans, Aspergillus oryzae e Escherichia coli. Além desta informação, um método foi relatado em que uma transglutaminase é produzida por produção secretória em microorganismos como E. coli e levedura (JP-Kokai No. 5-199883) e um método foi relatado em que MTG é produzido por expressão de MTG como uma proteína fundida inativa em um corpo de inclusão dentro de E. coli e subseqüentemente solubilizando o corpo de inclusão usando agentes desnaturantes de proteína e, então, reconstituindo o mesmo através da remoção dos agentes desnaturantes (JP-Kokai No. 6- 30771). No entanto, o problema foi notado que o nível de expressão é significativamente baixo na produção secretória por microorganismos como E. coli ou levedura.

Por outro lado, existem exemplos de estudos anteriores para a produção secretória eficiente de proteínas heterólogas usando uma bactéria corineforme incluindo a secreção de nucleases e lipases [US4965197, J.

Bacteriol., 174, 1854-1861(1992)] e a secreção de proteases como subtilisina [Appl. Environ. Microbiol., 61, 1610-1613 (1995)] por Corynebacterium glutamicum (a seguir pode ser abreviado como C. glutamicum), um estudo sobre a secreção de proteínas de superfície de célula de uma bactéria corineforme [Pedido patente internacional publicado no Japão No. 6-502548], a secreção de proteína de ligação a fibronectina usando este estudo [Appl.

Environ. Microbiol., 63, 4392-4400 (1997)], um relatório em que a secreção de proteínas foi melhorada usando um maquinário secretório mudado [JP- Kokai No. 11-169182], etc. , mas se tem um número limitado de relatórios sobre proteínas limitadas. À luz da quantidade acumulada de proteínas, Appl.

Environ. Microbiol., 61, 1610-1613 (1995) descreve que cerca de 2,5 mg/ml de proteína foram acumulados por expressão de gene protease alcalina a partir de Dichelobacter nodosus em C. glutamicum usando um promotor de gene subtilisina (aprE) de Bacillus subtilis, sítio de ligação de ribosomas e a seqüência de um peptídeo sinal, mas US4965197, JP-Kokai No. 6-502548 e JP-Kokai No. 11-169182 não descrevem especificamente os valores da quantidade das proteínas secretadas e acumuladas. Além disso, no caso da proteína de ligação a fibronectina [Appl. Environ. Microbiol., 63, 4392-4400 (1997)], somente o acúmulo secretório da proteína de cerca de 2,5 pg/L é confirmado. Assim, não se tem relatórios de que as proteínas heterólogas podem ser acumuladas de modo eficiente no meio em um nível prático.

Adicionalmente, uma tecnologia de engenharia genética para uma bactéria corineforme foi desenvolvida usando plasmídeo e fagos, como o estabelecimento da transformação por protoplastos [J. Bacteriol., 159, 306- 311(1984); J. Bacteriol., 161, 463-467(1985)], o desenvolvimento de variados tipos de vetores [Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984); J. Bacteriol., 159, 306-311(1984); J. Gen. Microbiol., 130, 2237-2246(1984); Gene, 47, 301- 306(1986); Appl. Microbiol. Biotechnol., 31, 65-69(1989)], o desenvolvimento de método de regulagem da expressão de genes [Bio/Technology, 6, 428-430(1988)] e o desenvolvimento de cosmídeo [Gene, 39, 281-286(1985)]. Além disso, existem relatos sobre a clonagem de genes de uma bactéria corineforme [Nucleic Acids Res., 14, 10113- 1011(1986); J. Bacteriol., 167, 695-702(1986); Nucleic Acids Res., 15, 10598(1987); Nucleic Acids Res., 15, 3922(1987); Nucleic Acids Res., 16, 9859(1988); Agric. Biol. Chem, 52, 525-531(1988); Mol. Microbiol, 2, 63- 72(1988); Mol. Gen. Genet, 218, 330-339(1989); Gene, 77, 237-251(1989)].

Além disso, um elemento transposável derivado de uma bactéria corineforme foi também relatado [W093/18151; EP0445385; JP- Kokai No. 6-46867; Mol. Microbiol, 11, 739-746(1994); Mol. Microbiol, 14, 571-581(1994); Mol. Gen. Genet, 245, 397-405(1994); FEMS Microbiol.

Lett, 126, 1-6(1995); JP-KokaiNo. 7-107976]. O elemento transposável é um fragmento de DNA que pode ser transposto sobre o cromossomo e é conhecido como estando presente em uma ampla faixa de organismos na faixa de procariotos a eucariotos. Os transposons usando elementos transposáveis foram desenvolvidos [W093/18151; JP-Kokai No. 7-107976; Mol. Gen. Genet, 245, 397- 405(1994); JP-Kokai No. 9-70291] e um gene heterólogo se tomou capaz de ser expresso usando um transposon.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO O objeto da invenção consiste em prover um método para a produção de uma proteína heteróloga ao levar uma bactéria corineforme a produzir uma proteína heteróloga industrialmente utilizável, por exemplo, transglutaminase e secretar eficientemente o produto extracelularmente (isto é, produção secretória).

Os inventores da presente invenção encontraram um mutante que tinha uma capacidade de produção notavelmente maior na produção de proteínas heterólogas usando bactérias corineformes comparadas com Corynebacterium glutamicum ATCC13869, de tipo selvagem, o que possibilitou a realização da presente invenção Conseqüentemente, a presente invenção é um método de produção de proteínas heterólogas caracterizadas em que uma proteína de fusão é produzida e secretada (secreto-produzida) por uma bactéria corineforme mutante que tem uma capacidade de secretar a proteína heteróloga, que é conectada à parte a jusante do peptídeo sinal de uma bactéria corineforme, pelo menos 2 vezes maior do que a Corynebacterium glutamicum ATCC 13869 de tipo selvagem.

Mais especificamente, a invenção é um método para obter uma grande quantidade de uma proteína heteróloga pretendida, por exemplo, transglutaminase, por introdução de uma construção de expressão genética em uma bactéria corineforme, cultivo da bactéria corineforme assim transformada, secreção eficiente da proteína resultante extracelularmente e recuperação da proteína liberada, em que a construção de expressão genética contém uma seqüência de genes codificando uma proteína pretendida que é ligada à jusante de uma seqüência codificando o peptídeo sinal derivado de uma bactéria corineforme, especialmente o peptídeo sinal de uma proteína de superfície de célula.

Como usado aqui, "a secreção" de uma proteína ou peptídeo refere-se ao transporte da molécula de proteína ou peptídeo para fora da célula da bactéria (transporte extracelular) incluindo o caso onde a molécula de proteína ou peptídeo existe, finalmente, em uma forma completamente livre no meio, assim como o caso onde somente a parte da molécula de proteína ou peptídeo está presente fora da célula e o caso onde estão localizadas na superfície da célula.

DESCRIÇÃO DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERIDAS

De acordo com o método da invenção, uma bactéria corineforme é usada como um sistema de vetor hospedeiro, e uma grande quantidade de uma proteína secretada extracelularmente de interesse pode ser obtida por geração de uma construção de expressão em que o gene codificando a proteína de interesse é ligado à jusante do peptídeo sinal da proteína de superfície de célula de bactéria corineforme, introduzindo a construção em uma bactéria corineforme e expressando a mesma.

As proteínas que podem ser secreto-produzidas pelo método da presente invenção incluem enzimas, proteínas fisiologicamente ativas e peptídeos que são utilizáveis industrialmente. Transglutaminase, que é secreto-produzida em uma forma de realização da presente invenção, é amplamente usada no processamento de alimentos, a fabricação de fármacos e outros.

Uma proteína secretória tem sido geralmente conhecida como sendo traduzida como um prepeptídeo ou prepropeptídeo e depois formada em uma proteína madura. Isto é, geralmente, que se sabe que ela é traduzida como um prepeptídeo ou prepropeptídeo, então o peptídeo sinal ("uma pre- parte") é clivado, assim ele é convertido em um peptídeo ou propeptídeo maduro por outra divagem da pro-parte com uma protease. Como usado aqui, "uma seqüência de sinal" refere-se à seqüência que está localizada no N- terminal de um precursor de proteína secretória e que não está presente em uma proteína madura de ocorrência natural, e um "peptídeo de sinal" refere-se ao peptídeo que é clivado deste precursor de proteína. Geralmente, a sequência de sinal é clivada copulando a secreção extracelular por uma protease (geralmente referida como sinal peptidase). Apesar deste peptídeo de sinal compartilhar alguns aspectos comuns na seqüência sobre as espécies, um peptídeo de sinal que tem função secretória em uma espécie não tem necessariamente a mesma função secretória em outra espécie.

Como usado aqui, uma proteína que contém tanto um peptídeo sinal como uma pro-parte, isto é, um produção de tradução primária, pode ser referida como "uma preproproteína" e uma proteína que não contém um peptídeo sinal mas contém uma pro-parte pode ser referida como "proproteína". Uma pro-parte de uma proproteína pode ser referida como uma "parte pro-estrutura" ou uma "pro-estrutura". "Uma pro-estrutura ou parte/pro-estrutura" de uma proteína pode ser, aqui, usada de modo interpermutável com uma "pro-parte" de uma proteína. O peptídeo sinal em uma preproproteína ou preproteína pode ser derivado da proteína diferente ou pode ser um peptídeo sinal de ocorrência natural na proteína pretendida e é, preferivelmente, derivado de uma proteína secretória do hospedeiro a ser usado. Altemativamente, ele pode ser modificado para ter um códon ótimo dependendo do uso do códon do hospedeiro a ser usado.

Além disso, o peptídeo sinal que pode ser usado para o fim da invenção pode conter uma parte da seqüência de aminoácidos N-terminal de uma proteína madura de ocorrência natural da qual o peptídeo de sinal é derivado. Uma preproproteína pode ser especialmente chamada "uma preproproteína fundida de modo heterólogo" quando o peptídeo de sinal é derivado da proteína diferente. Por exemplo, quando uma proteína é transglutaminase, elas são referidas como "preprotransglutaminase", "protransglutaminase" e "preprotransglutaminase" fundida de modo heterólogo, respectivamente. Uma proteína em que a "pro-parte é clivada" é referida a uma proteína em que pelo menos um ou mais aminoácidos que constituem sua pro-parte é removida por divagem da ligação peptídeo, incluindo uma proteína tendo aminoácido N-terminal idêntico com a proteína de ocorrência natural e também inclui uma proteína tendo um ou mais aminoácidos extra no N-terminal derivando da pro-parte comparada com a proteína de ocorrência natural, e uma proteína tendo uma sequência de aminoácidos mais curta do que a de uma proteína madura de ocorrência natural, desde que a proteína tenha uma atividade da proteína pretendida.

Como descrito nos "Antecedentes da Invenção", já foram apresentados alguns ^Hos onde a produção secretória extracelular de uma proteína heteróloga foi obtida usando bactéria corineforme e o método de produção secretória não foi tecnicamente estabelecido. Também, não se sabe que uma bactéria corineforme secreta extracelularmente por si mesma uma proteína, como uma protease. Os exemplos conhecidos são DNase endógena [US4965197] e os fatos de que a proteína de superfície de célula usada na presente invenção sai da superfície da célula de modo a ser encontrada fora da célula [JP-Kokai No. 6-502548]. No entanto, qualquer peptídeo de sinal que envolve na secreção de uma proteína de bactéria corineforme não tem sido conhecido, exceto pelas proteínas de superfície de célula. A única proteína de superfície de célula conhecida de bactéria corineforme, até agora, são os Genes para PS1 e PS2, as proteínas de superfície de células de Corynebacterium glutamicum [JP-Kokai No. 6-502548], e o gene para SlpA, a proteína de superfície de célula de Corynebacterium ammoniagenes [que pode ser abreviado como C. ammoniagenes a seguir) [JP-Kokai No. 10- 108675]. Dentre estas proteínas, PS1 e SlpA compartilham alguma homologia (cerca de 30%), mas quase não foi encontrada homologia entre as outras, e ainda mais, não foi encontrada homologia no domínio de seqüência de sinal entre uma e outra. Como exemplos de seqüências de sinal, as seqüências de sinal de PS1 e PS2 de Corynebacterium glutamicum são mostradas em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO:2, e a seqüência de sinal de SlpA de Corynebacterium ammoniagenes é mostrada em SEQ ID NO: 3.

Assim, os inventores clonaram o gene de proteína PS2 de C. glutamicum (inicialmente, Brevibacterium lactofermentum) cepa ATCC13869 e determinaram a seqüência. Verificou-se que não se tem diferenças no domínio da seqüência de sinal da seqüência conhecida de C. glutamicum, mas que se tem dois diferentes aminoácidos na seqüência até o trigésimo oitavo resíduo de aminoácido N-terminal da proteína de superfície de célula madura (Asn para resíduo Thr na posição 40 e Glu para resíduo Gly na posição 55 na seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 5). A seqüência de nucleotídeos codificando sessenta e oito resíduos compreendendo trinta resíduos de aminoácidos do peptídeo de sinal e trinta e oito resíduos de aminoácidos do N-terminal da proteína de superfície de célula madura e sua região 5'- a montante contendo a região de promotor é mostrada em SEQ ID NO: 4 e a seqüência de aminoácidos é mostrada em SEQ ID NO: 5.

Então, o inventor examinou a secreção de uma proteína heteróloga usando a região contendo a região de promotor ou a região de peptídeo sinal da proteína de superfície de célula a fim de determinar se a produção secretória extracelular de uma grande quantidade de proteína heteróloga pode ser obtida em uma bactéria corineforme.

Porque um gene de transglutaminase de um actinomicete tem um elevado teor de GC e o gene de uma bactéria corineforme tem um teor de GC próximo do gene de actinomicete e também eles tem uso de códon intimamente similar, se tem uma vantagem de que o gene de actinomicete pode ser usado diretamente. Assim, o inventor investigou se um gene de transglutaminase de actinomicete pode ser diretamente usado ou não, e verificou que o peptídeo sinal de transglutaminase de actinomicete não funciona com sucesso em uma bactéria corineforme. No entanto, foi revelado que o gene de transglutaminase codificando a proteína madura contendo a parte de pro-estrutura de actinomicetes fundido com o peptídeo sinal da proteína de superfície de célula de uma bactéria corineforme funcionou efetivamente sem qualquer modificação e foi eficientemente secretado fora da célula como uma proproteína contendo a parte de pro-estrutura. Quando o gene para transglutaminase com a parte de pro-estrutura que compreende adicionalmente trinta resíduos de aminoácidos de proteína de superfície de célula e trinta e oito resíduos de aminoácidos de domínio N-terminal da proteína de superfície de célula madura, isto é, o gene para transglutaminase fundido com o domínio N-terminal da proteína de superfície de célula madura, foi usado, a eficiência da secreção extracelular da transglutaminase foi ainda aumentada.

Como usado aqui, uma bactéria corineforme é um bacilo Gram-positivo aeróbico, que inclui bactérias que foram previamente classificadas como Brevibacterium mas atualmente unificadas como Corynebacterium (Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255(1981)) incluindo Brevibacterium que está intimamente relacionado com Corynebacterium. O uso de Corynebacterium é vantajoso em que ele secreta inerentemente extremamente menos proteínas fora da célula comparado com os mofos, leveduras, ou bactérias pertencendo a Bacillus que foram previamente reconhecidos como apropriados para efetuar a secreção de uma proteína heteróloga, que permite que o processo de purificação do produto seja fácil e encurtado quando a produção secretória de uma proteína heteróloga é conduzida, e que é excelente em termos de seu custo de meio, o procedimento de cultivo e o rendimento, porque cresce bem em um meio de cultura simples como o composto de amônia, sais inorgânicos e assim em diante.

Exemplos de Corynebacterium que podem ser usados como bactéria hospedeira na presente invenção incluem os mutantes tendo a capacidade de secretar uma proteína heteróloga pelo menos 2 vezes maior do que Corynebacterium glutamicum de tipo selvagem. Estes mutantes podem ser derivados de cepas de tipo selvagem incluindo Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066, Brevibacterium immariophilum ATCC14068, Brevibacterium lactofermentum {Corynebacterium glutamicum) ATCC 13869, Brevibacterium roseum ATCC 13 825, Brevibacterium flavum {Corynebacterium glutamicum) ATCC14067, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870, Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium lilium {Corynebacterium glutamicum) ATCC 15990, Brevibacterium ammoniagenes {Corynebacterium ammoniagenes) ATCC6871 ou de mutantes das mesmas. Os mutantes da presente invenção incluem cepas mutantes defeituosas na capacidade de produzir glutamato, cepas mutantes para produção de aminoácidos como lisina e outros, e cepas mutantes para a produção de outras substâncias como ácidos nucleicos, por exemplo inosina. Os mutantes da presente invenção podem ser obtidos por seleção das cepas tendo aumentada capacidade de produção secretória de proteínas após radiação de UV ou tratamento das bactérias com um mutagene químico como N-metil-N'- nitrosoguanidina.

Particularmente, Corinebacterium glutamicum {C.glutamicum) AJ12036(FERM BP-734)(Originalmente depositado em 26 de março de 1984) (atualmente, uma Agência Administrativa Independente, National Institute of Advance Industrial Science and Technology, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566 Japão) tem a capacidade de produção secretória de proteínas heterólogas pelo menos 2-3 vezes maior do que a cepa parental (cepa de tipo selvagem) sob condição de cultura ótima, como medido como a quantidade de acúmulo, que pode ser devido à mutação em genes funcionais responsáveis pela secreção de proteína. Assim, esta cepa é apropriada como um hospedeiro. Além disso, é particularmente preferível usar uma cepa que é derivada de tal mutante e que é modificada de modo que não produz proteínas de superfície celular, devido à purificação de proteínas heterólogas secretadas pode ser tomar mais fácil.

Estas modificações podem ser conduzida por introdução de uma mutação nas regiões codificando as proteínas de superfície celular ou suas regiões de controle de expressão existentes no genoma por mutagenese ou usando técnicas de recombinação de genes. A construção genética que pode ser usada na presente invenção geralmente inclui um promotor, uma seqüência codificando um peptídeo de sinal apropriado, e uma fração de ácido nucleico codificando uma proteína pretendida, e uma seqüência regulatória (um operador ou terminador, etc), necessário para expressar o gene para a proteína pretendida em uma bactéria corineforme, em uma posição apropriada como que elas possam funcionar. A proteína pretendida pode ter uma parte de pro-estrutura no N- terminal. Os vetores que podem ser usados para esta construção não são particularmente limitados e incluem quaisquer vetores que podem funcionar em uma bactéria corineforme, e eles podem ser os que se multiplicam autonomamente como plasmídeos ou vetores, que são integrados no cromossomo da bactéria. Os plasmídeos derivados da bactérias corineformes são particularmente preferíveis. Estes incluem, por exemplo, pHM1519 (Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984)), pAM330 (Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984)), e plasmídeos obtidos por modificação dos mesmos que possuem genes resistentes a drogas.

Os transposons artificiais e outros também podem ser usados.

Quando se usa um transposon, o gene pretendido é introduzido no cromossomo através de recombinação homóloga ou por sua própria capacidade de transposon.

Os promotores que podem ser usados na invenção não são particularmente limitados. Qualquer promotor que pode funcionar na célula de uma bactéria corineforme pode ser geralmente usado. Ele pode ser também um promotor derivado de uma espécie diferente, por exemplo, um promotor derivado de E. coli, como promotor tac, etc. Dentre estes promotores, um promotor potente é mais preferível, incluindo promotor tac, etc.

Exemplos de promotores derivados de uma bactéria corineforme incluem promotores dos genes da proteínas de superfície de células PS1, PS2 e SipA, promotores dos genes em sistemas biossintéticos de diferentes aminoácidos, por exemplo, gene glutamato desidrogenase no sistema biossintético de ácido glutâmico, gene glutamina sintetase no sistema biossintético de glutamina, gene aspartoquinase no sistema biossintético de lisina, gene homoserina desidrogenase no sistema biossintético de treonina, gene acetohidroxilato sintase no sistema biossintético de isoleucina e valina, gene 2-isopropilmalato sintase gene, gene glutamato quinase no sistema biossintético prolina e arginina, gene fosforibosil-ATP pirofosforilase na síntese biossintética de histidina, gene ácido deoxiarabinohepturônico fosfato (DAHP) sintase no sistema biossintético de aminoácido aromático como triptofano, tirosina e fenilalanina, etc., gene fosforibosil pirofosfato (PRPP) amidotransferase, gene inosinato desidrogenase e gene guanilato sintase no sistema biossintético de ácido nucleico como inosinato e guanilato. O peptídeo sinal que é usado na presente invenção é o peptídeo sinal de uma proteína secretória do hospedeiro, bactéria corineforme, e preferivelmente é o peptídeo sinal de uma proteína de superfície de célula de uma bactéria corineforme. As proteínas de superfície de células incluem PS1 e PS2 derivados de C. glutamicum (JP-Kokai No. 6-502548), e SlpA derivado de C. Ammoniagenes (JP-Kokai No. 10-108675). A seqüência de aminoácidos de PS1 é mostrada em SEQ ID NO:2, a seqüência de aminoácidos de PS2 em SEQ ID NO:l e a seqüência de aminoácidos de SlpA é mostrada em SEQ ID NO:3. Adicionalmente, é registrado que Dnase de uma bactéria corineforme também tem um peptídeo de sinal, como descrito na Patente US No. 4965197, que também pode ser usada na presente invenção.

Pode-se conectar, ao peptídeo sinal, uma porção da seqüência de aminoácidos N-terminal da proteína secretória da qual o peptídeo sinal deriva. A seqüência de sinal é clivada por uma sinalpeptidase enquanto o produto traduzido é secretado extracelularmente. Além disso, o gene codificando o peptídeo sinal pode ser usado ou na forma nativa ou em uma forma modificada contendo os códons ótimos dependendo do uso de códon no hospedeiro a ser usado.

Quando se usam estes peptídeos sinal, os genes codificando para proteínas pretendidas são conectados ao terminal 3' dos genes codificando os peptídeos sinal e estão localizados de modo que são submetidos à regulagem de expressões pelos promotores descritos acima.

As pro+Anas utilizáveis que podem ser secreto-produzidas de acordo com a presente invenção incluem, essencialmente, mas não são limitadas a todas as proteínas secretórias derivadas de animais e plantas e microorganismos. Por exemplo, proteínas como por exemplo como uma protease, uma exopeptidase, uma aminopeptidase, uma carboxipeptidase, uma colagenase e uma quitinase podem ser secreto-produzidas de acordo com a presente invenção. As proteínas que são preparadas pela produção secretória de acordo com a presente invenção são preferivelmente proteínas secretórias de ocorrência natural, mais preferivelmente proteínas tendo partes pro- estrutura adicionais. A transglutaminase é particularmente preferida como uma proteína utilizável preparada pela produção secretória de acordo com a presente invenção. Como genes transglutaminase, por exemplo, genes para uma transglutaminase de tipo de secreção derivado de actinomicetes, por exemplo, S. mobaraense IFO 13819, S. cinnamoneum IFO 12852, Strepíoverticülium griseocarneum IFO 12776, Streptomyces Iydicus [WO9606931], etc e mofos como Oomicetes [W09622366], etc podem ser usados para o fim da presente invenção. Os genes codificando estas proteínas podem ser modificados dependendo do tipo do hospedeiro a ser usado e a fim de obter uma atividade desejada, eles podem compreender a adição, deleção, substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos, e opcionalmente eles podem ser convertidos para conter o códon ótimo dependendo da ffeqüência de uso de códon no hospedeiro.

Quando a proteína produzida pela produção secretória de acordo com a presente invenção é a proteína naturalmente expressa como um prepropeptídeo, é preferível usar o fragmento de gene codificando a proproteína contendo a parte de pro-estrutura (pro-parte) apesar disto não ser essencial. Quando o gene codificando uma preproproteína é usado, a pro-parte da proteína obtida como o resultado da expressão do gene pode ser clivada por um meio apropriado, por exemplo, por uma protease. Para isto, aminopeptidases, endopeptidases que podem ser clivadas em um sítio apropriado, ou proteases mais específicas podem ser usadas. É preferível usar as proteases que clivam a proteína de modo que a proteína clivada tem uma atividade equivalente ou maior atividade do que a de proteína de ocorrência natural. Altemativamente, a seqüência de genes codificando a proteína pretendida ou codificando a parte de pro-estrutura da proteína pretendida pode ser também modificada e projetada para expressar a proteína tendo o sítio de reconhecimento para protease específica para o local desejado. Os procedimentos biotecnológicos moleculares gerais incluindo estas técnicas de modificação, técnicas de clonagem de genes e técnicas de detecção para as proteínas produzidas são bem conhecidas dos versados na técnica e faz-se referência a Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a. ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I e (D. N. Glover ed. 1985), F.M. Ausubel et al.(Eds), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994), PCR Technology: Principies and Application for DNA Amplification, H. Erlich, ed., Stockton Press e etc. A região N-terminal da proteína que pode ser obtida no final de acordo com a presente invenção não é necessariamente idêntica à da proteína de ocorrência natural e, assim, um a vários aminoácidos podem ser ainda adicionados ou deletados da proteína de ocorrência natural. Quando se usa uma protease, prefere-se que a proteína produzida seja clivada a cerca da mesma posição que a da proteína de ocorrência natural em termos de sua atividade e é mais preferível que seja idêntica ao peptídeo maduro de uma proteína de ocorrência natural. Assim, as proteases específicas que clivam o propeptídeo na posição de modo que ele gera a mesma proteína que a proteína madura de ocorrência natural, são geralmente mais preferíveis. No entanto, para um fim particular, os peptídeos tendo seqüência mais longa ou mais curta do resíduo de aminoácido por um a vários resíduos no N-terminal comparado com o N-terminal da proteína de ocorrência natural podem possuir uma atividade mais apropriada. Estas proteases incluem, por exemplo, Dispase (disponível de Boehringer Manheim Co) que pode ser comercialmente disponível e proteases obtidas do meio de cultura de microorganismos, como, por exemplo, o meio de cultura de actinomicetes. Estas proteases podem ser usadas em um estado não purificado ou opcionalmente podem ser usadas após serem purificadas pela pureza apropriada.

Outros exemplos de proteases apropriadas para remover a pro- parte de protransglutaminases derivadas de Streptomyces é SAMP45, uma serina protease produzida por Streptomyces albogriseolus (a seguir pode ser abreviado como S. albogriseolus). A seqüência de genes e seqüência de aminoácido de comprimento completo codificada (1-13: seqüência de sinal, 32-76: pro-parte, 77-407: transglutaminase madura) para S. mobaraense transglutaminase é mostrada em SEQ ID:6 e SEQ ID:7, respectivamente. No caso de S. mobaraense protransglutaminase, porque SAMP45 cliva entre Ser72 e Phe73 na parte pro-estrutura, a proteína resultante tem a estrutura onde 4 aminoácidos adicionais (Phe-Arg-Ala-Pro, SEQ ID: 60) derivando de C- terminal de parte pro fixada à transglutaminase madura N-terminal de ocorrência natural. Os inventores confirmaram que estas proteínas tem a atividade de transglutaminase. A seqüência de gene SAMP45 já foi determinada e a seqüência de aminoácidos da proteína com a parte de pro- estrutura adicional (proSAMP45) é mostrada em SEQ ID NO:8 (J. Bacteriol., 179,430-438 (1997)), também.

Adicionalmente, transglutaminase madura, idêntica à transglutaminase de ocorrência natural, pode ser obtida por uso de peptidase específica para prolina produzida por S. mobaraense (svPEP), que foi verificada pelos inventores, junto com SAMP45, que resulta na remoção de quatro aminoácidos de Phe-Arg-Ala-Pro adicionados ao N-terminal.

Este svPEP é uma enzima que cliva especificamente os peptídeos ou análogos de peptídeo representados pela seguinte fórmula (I) no sítio mostrado com * na fórmula, isto é, no lado terminal carboxila do terceiro ou quarto resíduo de prolina do N-terminal (I) em que Y representa um oligopeptídeo consistindo de dois ou três resíduos de aminoácidos e Z representa um aminoácido, peptídeo, amida ou éster. A seqüência de nucleotídeos de gene svPEP e a seqüência de aminoácidos completa codificada é mostrada em SEQ ID:9 e SEQ ID:10, respectivamente. Quando svPEP é reagido em protransglutaminase junto com uma protease na forma de caldo de células de S. mobaraense ou S. mobaraense, a parte pro- estrutura pode ser clivada completamente, resultando na transglutaminase madura da qual a parte de pro- estrutura é completamente removida. Altemativamente, a transglutaminase madura da qual a parte de pro-estrutura é completamente removida pode ser similarmente obtida por cultivo de uma bactéria corineforme onde o gene pre- pro svPEP junto com o gene protease são introduzidos em uma bactéria corineforme que libera uma protransglutaminase extracelularmente por produção secretória. Além disso, uma transglutaminase madura tendo a mesma estrutura que a forma de ocorrência natural pode ser produzida de modo eficiente por introdução similarmente tanto do gene SAMP45 como do gene svPEP em uma bactéria corineforme em que o gene pre- protransglutaminase foi introduzido, mas deixando a bactéria secreto-produzir a protransglutaminase e SAM45 assim como svPEP extracelularmente ou na superfície das células. O método para introduzir as construções genéticas que podem ser usadas na presente invenção em uma bactéria corineforme não é limitado a métodos particulares e os métodos geralmente usados incluindo por exemplo o método protoplasto (Gene, 39, 281-286 (1985)), o método de eletroporação (Bio/Technology, 7, 1067-1070) (1989)), etc.. O transformante resultante pode ser cultivado de acordo com os métodos convencionais e condições . Por exemplo, o transformante pode ser cultivado com um meio convencional contendo fontes de carbono, fontes de nitrogênio e fontes inorgânicos. A quantidade de traço de nutrientes orgânicos como vitaminas e aminoácidos pode ser opcionalmente adicionada ao meio a fim de obter o crescimento em uma maior extensão.

Carboidratos como glucose e sacarose podem ser usados como fontes de carbono, e ácidos orgânicos como ácido acético, álcoois e outros podem ser usados. Amônia gasosa, amônia gasosa, sal amônio e outros podem ser usados como fontes de nitrogênio. Como íons inorgânicos, íon cálcio, íon magnésio, íon fósforo, íon potássio, íon ferroso ou férrico, e outros, são opcionalmente usados, como necessário. A cultura pode ser conduzida durante cerca de 1 a 7 dias sob a condição aeróbica na faixa apropriada de pH entre 5,0 e 8,5, e a temperatura entre 15 °C e 37 °C. Por cultivo do transformante, sob estas condições , uma grande quantidade de uma proteína pretendida é produzida intracelularmente e é eficientemente secretada extracelularmente. Transglutaminase é geralmente conhecida como sendo letal quando é muito acumulada nas células de microorganismos, mas de acordo com a presente invenção, transglutaminase é continuamente produzida sem gerar efeitos letais, porque a transglutaminase produzida intracelularmente é liberada extracelularmente.

As proteínas que foram secretadas no meio de acordo com a presente invenção podem ser isoladas e purificadas de meio de cultura incubado de acordo com os métodos bem conhecidos dos versados na técnica.

Por exemplo, as proteínas podem ser isoladas e purificadas por remoção das células do meio por centrifugação, etc. e então usando métodos apropriados conhecidos, como salificação, precipitação de etanol, ultrafiltração, cromatografia de filtragem de gel, cromatografia de coluna de troca de íons, cromatografia de afinidade, cromatografia média de líquido de alta pressão, cromatografia de fase reversa, cromatografia hidrofóbica, ou a combinação dos mesmos. As proteínas secretadas na superfície das células de acordo com a presente invenção podem ser isoladas e purificadas por uso dos métodos bem conhecidos dos versados na técnica, por exemplo, por solubilização dos mesmos com concentrações de sal aumentadas ou tensoativos, e então usando os métodos similares ao das proteínas secretadas no meio. Adicionalmente, em alguns casos, as proteínas secretadas na superfície da célula podem ser usadas sem solubilização, por exemplo, como enzimas imobilizadas.

Exemplos A presente invenção será ilustrada pelos seguintes exemplos , mas estes exemplos não devem ser construídos como uma limitação do escopo da presente invenção.

Exemplo 1 : Expressão de nrenro-transglutaminase derivada de S. mobaraense IFQ13819 em C. çdutamicum ATCC13869 (1) Aquisição de gene transglutaminase derivado de S. mobaraense IF013819 A seqüência de gene transglutaminase derivado de S. mobaraense cepa DSMZ já foi determinada [Eur. J. Biochem., 257, 570- 576(1998)]. Os iniciadores mostrados em SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12 foram sintetizados com referência à seqüência e a região codificando a seqüência de transglutaminase madura foi amplificada usando o método PCR com o DNA cromossômico de S. mobaraense IF013819 preparado pelo procedimento convencional (o método de Saito e Miura [Biochim, Biophys.

Acta, 72, 619(1963)]. Para reação PCR, kit Pyrobest DNA polymerase(Takarashuzo Co. Ltd.) foi usado e a condição de reação seguida pelo protocolo recomendado pelo fabricante. (SEQID NO: 11) 5'-GACTCCGACGACAGGGTCACCCCTCCCGCC-3' (SEQ ID NO: 12) 5'-CGCTCACATCACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3' <Texto Livre de Listagem de Seqüência>

SEQ ID NO: 11 e SEO ΤΠ NO: 12 : iniciador PCR A sonda de DNA foi então gerada por condução da reação usando fragmento de DNA amplificado de cerca de 1,0 kb com [oc-32P]dCTP e kit de rotulação Random Primer DNA Ver. 2 (Takarashuzo Co. Ltd.) de acordo com o protocolo anexo ao kit. Confirmou-se que o gene transglutaminase estava presente no fragmento de cerca de 4 kb excisado com enzima de restrição Sac I por hibridização Southern blot usando a sonda gerada e o DNA cromossômico de S. mobaraense IF013819 de acordo com o método convencional, como descrito em Molecular Cloning 2a. ed. [J.

Sambrook, E. F. Fritsch e T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p9. 31 (1989)]. Conseqüentemente, o fragmento de cerca de 4 kb que foi gerado por digestão de Saci de DNA cromossômico de S. mobaraense IF013819 foi recuperado através de eletroforese de gel agarose usando EASYTRAP Ver. 2 (Takarashuzo Co. Ltd.) e foi inserido em sítio Sac I de pUC18 (Takarashuzo Co. Ltd.) que foi introduzido em células competentes de Escherichia coli JM109 (Takarashuzo Co. Ltd.) para gerar uma biblioteca. A cepa bacteriana abrigando o plasmídeo onde o fragmento de gene transglutaminase foi clonado foi obtida, por triagem da biblioteca usando a sonda de DNA previamente gerada para sonda de DNA para transglutaminase por hibridização de colônia, como descrito em Molecular Cloning 2a. ed. [J. Sambrook, E. F. Fritsch e T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, pl. 90(1989)]. O plasmídeo foi recuperado desta cepa e designado como pUITG. A sequência do fragmento clonado em pUITG foi determinada que confirmou que o gene transglutaminase de S. mobaraense IF013819 tinha a mesma seqüência de nucleotídeos que a de transglutaminase de S. mobaraense cepa DSMZ. A determinação da seqüência de nucleotídeos revelou que o fragmento de Saci de cerca de 4 kb foi o fragmento de DNA incompleto do qual a seqüência de sinal (a pre-parte) foi parcialmente deletada.

Conseqüentemente, a clonagem da região de promotor e a região de seqüência de sinal completa foram tentadas. A clonagem foi realizada usando kit de clonagem in vitro TAKARA LA PCR (Takarashuzo Co. Ltd.) e os iniciadores sintetizados mostrados em SEQ ID NO: 13 e SEQID NO: 14 de acordo com o protocolo anexo. (SEQ ID NO: 13) 5'-GTGACCCTGTCGTCGGAGTC-3' (SEQ ID NO: 14) 5'-GGCATCCTGTCGAGCGGCTC-3' <Texto Livre de Listagem de Seqüência> SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 14: iniciadores PCR para a região de promotor e a seqüência de sinal de S. mobaraense Conseqüentemente quando um iniciador de cassete de Sall foi usado, o fragmento amplificado por PCR de cerca de 800 bp foi obtido e o sequenciamento do fragmento confirmou que o fragmento continha a região de promotor do gene transglutaminase e a região de seqüência de sinal.

Conseqüentemente, o fragmento amplificado por PCR foi de cerca de 800 bp foi inserido em sítio Smal de pVC7 descrito em JP-Kokai No. 9-070291 para obter pVITGS5. Adicionalmente plasmídeo pUITG foi digerido com Saci, o fragmento de cerca de 4kb foi recuperado através de eletroforese de agarose, e o fragmento foi inserido para sítio Saci de pVITGS5 para construir plasmídeo pVITGC que continha o gene transglutaminase de comprimento completo. A determinação da sequência de nucleotídeos foi realizada usando kit Dye Terminator Cycle Sequencing (PE Applied Biosystems) e kit DNA Sequencer 373A (PE Applied Biosystems). A seqüência de gene de prepro- transglutaminase é mostrada em SEQ ID NO: 6. Supõe-se que a seqüência N- terminal de 31 aminoácidos (No. 1-31) era a seqüência de sinal (a pre-parte), a seqüência N-terminal de 45 aminoácidos (No.32-76) era a pro-parte e a seqüência N-terminal de 331 aminoácidos (No.77-407) era a transglutaminase madura. (2) Conversão da região de promotor de gene transglutaminase A seqüência de gene para PS2 que é uma proteína de superfície de C. glutamicum já foi determinada [Mol. Microbiol., 9, 97- 109(1993)]. Os iniciadores mostrados como SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 16 foram sintetizados com referência a esta seqüência, e a região que contém o promotor localizado na região 5' a montante do códon de iniciação de gene de proteína PS2 foi amplificada usando o método PCR de DNA cromossômico de C. glutamicum ATCC13869 preparado de acordo com o método convencional. (SEQ ID NO: 15) 5'-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3' (SEQ ID NO: 16) 5'-GAGCTCTCCGGCGTATGCGCATAGAGGCGAAGGCTCCTTGAATA-3’ <Texto Livre de Listagem de Seqüência>

SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 16: iniciadores PCR

Por outro lado, os iniciadores mostrados em SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 17 foram sintetizados com base em uma seqüência de gene transglutaminase determinada no Exemplo 1(1), e a região do gene de prepro- transglutaminase foi amplificada usando o método PCR de pUITG obtido no Exemplo 1(1). (SEQID NO: 12) 5'-CGCTCACATCACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3’ (SEQ ID NO: 17) 5'-ATGCGCATACGCCGGAGAGCTCTCGTCTTC-3' <Texto Livre de Listagem de Seqüências>

SEQ ID NOs: 12 e 17: iniciador PCR

Então, o gene de fusão de transglutaminase fundido com a parte de estrutura pre-pro, que foi ligado na região compreendendo o promotor do gene de proteína de superfície de célula de C. glutamicum ATCC13869, foi amplificado por realização de um cruzamento de PCR com SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 12 usando a mistura de 1 μΐ de cada dentre a solução PCR da região amplificada compreendendo o promotor de gene PS2 de C. glutamicum ATCC13869 e da região de gene pre-protransglutaminase amplificado, como os gabaritos. O fragmento amplificado de cerca de 1,8 kb foi detectado por eletroforese de gel agarose. Este fragmento foi recuperado do gel agarose com EASYTRAP Ver. 2 (Takarashuzo Co. Ltd.) e inserido em sítio Smal de pVC7 como descrito em JP-Kokai No. 9-070291 para obter pVKPTGO. A seqüência de nucleotídeos do fragmento inserido foi determinada de acordo com o método descrito acima e foi confirmado que o gene de fusão foi construído como esperado. (3) Expressão do gene pre-protransglutaminase em C. glutamicum ATCC 13869 C. glutamicum ATCC 13869 foi transformado com o pVITGC construído no Exemplo 1(1) (tanto o promotor como o gene pre- protransglutaminase foram derivados de S. mobaraense) ou com o pVKPTGO construído no Exemplo 1(2) (o promotor foi derivado de PS2 gene de C. glutamicum ATCC 13869 e o gene pre-protransglutaminase foi derivado de S. mobaraense) e as cepas cultivadas em meio de ágar CM2S compreendendo 5 mg/1 of cloranfenicol (10 g de extrato de levedura, lOg de triptona, 5 g de sacarose, 5 g de NaCl, 5 g de agar por litro de água destilada) foram selecionados. As células selecionadas de C. glutamicum ATCC 13869 abrigando pVITGC ou pVKPTGO foram cultivadas em meio de cultura MM (30 g de glucose, 0,5 g de sulfato de magnésio heptaidratado, 30 g de sulfato de amônio, 1 g de dihidrogenofosfato de potássio, 0,01 g de sulfato ferroso heptaidratado, 0,01 g de sulfato de manganês (II) pentaidratado, 200 pg of cloridrato de tiamina, 500 pg de biotina, 0,15 g de DL-metionina, 50 g de carbonato de cálcio por litro de água destilada, ajustados a pH 7,5) compreendendo 5 mg/1 of cloranfenicol a 30 °C durante 48 horas, respectivamente. Após acabar a incubação, 10 pl do sobrenadante da cultura foram submetidos a SDS-PAGE e então a Western blot usando anticorpo anti- transglutaminase como descrito em Biosci. Biotechnol. Biochem., 58, 82- 87(1994) de acordo com o método convencional (por exemplo, o procedimento geral como descrito em J. Sambrook et al. (1989)(supra)).

Conseqüentemente, a secreção de transglutaminase não pôde ser detectada. Dos resultados acima, foi confirmado que a seqüência de sinal de transglutaminase de S. mobaraense não tinha funcionado em C. glutamicum ATCC13869.

Exemplo 2: Produção secretória de transglutaminase madura usando o gene de fusão codificando o peptídeo de sinal da proteína de superfície de célula Corvnebacterium glutamicum (C. glutamicum ATCC13869) e a transglutaminase madura derivada de S. mobaraense IFQ13819 (1) Construção do gene transglutaminase contendo a seqüência de sinal da proteína de superfície de célula de C. glutamicum ATCC13869 A seqüência de gene of PS2 que é a proteína de superfície de célula de C. glutamicum já foi determinada [ Mol. Microbiol., 9, 97- 109(1993)]. Os iniciadores mostrados como SEQ ID NO: 15 e SEQID NO: 18 foram sintetizados com referência à seqüência, e a região codificando os 44 resíduos de aminoácidos N-terminais (30 resíduos de aminoácidos do peptídeo de sinal e 14 resíduos de aminoácidos da proteína de superfície de célula madura) da proteína correspondendo a PS2 e região 5' a montante contendo a região de promotor foram amplificadas usando Método PCR com o DNA cromossômico de C. glutamicum ATCC13869 preparado de acordo com o método descrito em Exemplo 1(2). O iniciador mostrado em SEQ ID NO: 18 também compreende a seqüência codificando a seqüência de aminoácidos de região N-terminal de transglutaminase madura a fim de construir o gene de fusão fundido com a transglutaminase. (SEQ ID NO: 15) 5'- AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3' (SEQ ID NO: 18) 5'-GGGGTGACCCTGTCGTCGGAGTCGTTGAAGCCGTTGTTGATGTT GAA-3' <Texto livre de Listagem de Seqüência>

SEQ ID NOs:15 e 18: iniciador PCR

Por outro lado, iniciadores mostrados em SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12 foram sintetizados com base na seqüência de gene transglutaminase determinada no Exemplo 1(1) e a região de gene transglutaminase maduro foi amplificada usando Método PCR com pUITG obtido no Exemplo 1(1). O gene de fusão da transglutaminase madura, que foi conectado à região codificando os 44 resíduos de aminoácidos N-terminais de C. glutamicum ATCC 13869 e à região 5' a montante compreendendo o gene promotor do gene de proteína de superfície de célula, foi amplificado realizando-se um cruzamento PCR com SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 12 usando a mistura de 1 μΐ da solução PCR da região amplificada codificando os 44 resíduos N-terminais de aminoácidos da proteína correspondendo a PS2 de C. glutamicum e da região 5' amplificada a montante contendo o promotor, e 1 μΐ de solução PCR da região de gene transglutaminase maduro amplificado , como os gabaritos. O fragmento amplificado de cerca de 1,7 kb foi detectado por eletroforese de agarose. Este fragmento foi recuperado do gel agarose usando EASYTRAP Ver. 2 (Takarashuzo Co. Ltd.) e inserido em sítio Smal de pVC7 descrito em JP-Kokai No. 9-070291 para obter pVKPTG3. A seqüência de nucleotídeos do fragmento inserido foi determinada de acordo com o método descrito acima e foi confirmada a construção do gene de fusão esperado.

Além disso, o gene transglutaminase maduro de fusão, de cerca de 1,7 kb, que tinha sido ligado à região codificando os 44 resíduos N- terminais de aminoácidos de C. gluiamicum ATCC13869 e a região 5' a montante compreendendo o promotor do gene de proteína de superfície de célula, foi excisado por digestão pVKTG3 com Kpnl e Xbal e recuperado usando eletroforese d** "garose . Este fragmento foi inserido no sítio Kpnl- Xbal de pPK4 descrito em JP-Kokai No. 9-322774 para construir pPKTG3. (2) Secreção de transglutaminase madura usando a seqüência de sinal da proteína de superfície de célula de C. gluiamicum ATCC 13869 C. gluiamicum ATCC 13869 foi transformado com o plasmídeo pVKTG3 ou pPKTG3 construído (em ambos os casos o gene compreendendo o promotor e o gene codificando peptídeo sinal e os 14 resíduos N-terminais de aminoácidos foram derivados de C. gluiamicum ATCC 13869, e o gene de transglutaminase maduro foi derivado de S. mobaraense) e as cepas cultivadas em meio agar CM2S compreendendo 5 mg/1 de cloranfenicol ou 25 mg/1 de canamicina foram selecionadas. As células selecionadas de C. gluiamicum ATCC13869 contendo pVITG3 ou pVKPTG3 foram então cultivadas em meio de cultura MM líquido, descrito acima, compreendendo 5 mg/1 de cloranfenicol ou 25 mg/1 de canamicina a 30°C durante 48 horas, respectivamente. Após acabar a incubação, 10 μΐ do sobrenadante da cultura foram submetidos a SDS-PAGE e então Western blot foi realizado de acordo com o método convencional usando anticorpo anti- transglutaminase, como descrito em Biosci. Biotechnol. Biochem., 58, 82- 87(1994). Como resultado, uma quantidade pequena de transglutaminase secretada tendo o peso molecular similar ao da transglutaminase madura pode ser detectada no sobrenadante da cultura de ambas as cepas.

Exemplo 3: Produção secretória de nro-transglutaminase usando gene de fusão pro-transglutaminase (gene de fusão de prepro-transglutaminase fundido de modo heterólogo) derivada de S. mobaraense IFQ13819 ligada ao peptídeo sinal da proteína de superfície de célula de C. glutamicum ATCC13869 (1) Construção of gene transglutaminase (gene de fusão prepro- transglutaminase fundido de modo heterólogo) contendo a parte pro-estrutura adicional com o peptídeo sinal da proteína de superfície de célula de C. glutamicum ATCC13869.

Os iniciadores mostrados em SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO: 21 e SEQ ID NO: 22 foram sintetizados com referência à seqüência de gene de PS2 que era a proteína de superfície de célula de C. glutamicum [Mol. Microbiol., 9, 97-109(993)]. A região de codificação para os 30, 31, 44 ou 68 resíduos N-terminais de aminoácidos (a região compreendendo 30 resíduos de aminoácidos do peptídeo de sinal) e a região 5' a montante contendo a região de promotor da proteína correspondendo a PS2 foram amplificadas respectivamente pelo Método PCR usando a combinação de SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 19, ou de SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO:20, ou de SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 21, ou de SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO:22 do DNA cromossômico de C. glutamicum ATCC 13869 preparado de acordo com o método descrito em Exemplo 1(2).

Iniciadores mostrados em SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21 e SEQ ID NO: 22 compreendem as seqüências codificando os Aminoácidos N-terminais de pro-transglutaminase a fim de construir o gene de fusão fundido com a transglutaminase tendo a parte pro-estrutura. (SEQ ID NO: 15) 5’-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3' (SEQID NO: 19) 5'-CTTCGTCTCTTCCCCCGCGCCATTGTCAGCGAATGCTGGGATAG CAACGCC-3 ’ (SEQ ID NO: 20) 5'-CTTCGTCTCTTCCCCCGCGCCATTGTCCTGAGCGAATGCTGGGA TAGCTAC-3’ (SEQ ID NO: 21) 5'-CTTCGTCTCTTCCCCCGCGCCATTGTCGTTGAAGCCGTTGTTGAT GTTGAA-3’ (SEQ ID NO: 22) 5'-CTTCGTCTCTTCCCCCGCGCCATTGTCAGTCAGGTCGCGGAGGGT TTCCTC-3’ <Texto Livre de Listagem de Seqüência> SEQ ID NOs: 15, 19, 20, 21 e 22: iniciador PCRs Por outro lado, os iniciadores mostrados em SEQ ID NO:23 e SEQ ID NO: 12 foram sintetizados com base na seqüência de gene transglutaminase determinada no Exemplo 1(1) e a região de gene pro- transglutaminase foi amplificada usando Método PCR com pUITG obtido no Exemplo 1(1). (SEQ ID NO: 12) 5'-CGCTCACATCACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3' (SEQ ID NO:23) 5'-GACAATGGCGCGGGGGAAGAGACGAAGTCC-3' <Texto Livre de Listagem de Seqüência>

SEQ ID NOs: 22 e 23 : iniciador PCR

Então, o gene de protransglutaminase fundido de modo heterólogo ligado à região respectiva codificando seus 30, 31, 44 ou 68 resíduos N-terminais de aminoácidos e a região 5' a montante compreendendo a região de promotor da proteína gene correspondendo PS2 de C. glutamicum ATCC13869, isto é, os fragmentos genes prepro-transglutaminase fundidos de modo heterólogo que foram ligados ao promotor do gene da proteína de superfície de célula de C. glutamicum ATCC13869, foi amplificado realizando PCR de cruzamento com SEQ ID NO: 15 e SEQID NO: 12 usando a mistura que compreende 1 μΐ de solução PCR da região 5' a montante contendo a região de promotor do gene da proteína correspondendo a PS2 de C. glutamicum ATCC 13869 e um da região amplificada codificando os 30, 31, 44 ou 68 resíduos de aminoácidos N-terminais da proteína, e 1 μΐ de solução PCR da região amplificada do gene para a transglutaminase tendo a parte de pro-estrutura, como os gabaritos.

Os fragmentos amplificados na faixa de cerca de 1,8 kb to 1,9 kb foram detectados por eletroforese de agarose. Estes fragmentos foram recuperados por agaroses de gel com EASYTRAP Ver. 2 (Takarashuzo Co.

Ltd.) e inseridos em sítio Smal de pVC7 como descrito em JP-Kokai No. 9- 070291 para obter pVKPTGl, pVKPTG2, pVKPTG3 e pVKPTG4, respectivamente. A seqüência de nucleotídeos dos fragmentos inseridos foi determinada de acordo com o método acima mencionado e foi confirmado que os genes de fusão esperados foram esperados.

Além disso, genes de fusão de cerca de 1,8 kb a 1,9 kb de transglutaminase tendo as partes de pro-estrutura, que foram ligadas à região respectiva codificando os 30, 31, 44 ou 68 resíduos de aminoácidos e a região 5' a montante compreendendo a região de promotor do gene da proteína correspondendo a PS2 de C. glutamicum, foi excisada por digestão de pVKPTGl, pVKPTG2, pVKPTG3 ou pVKPTG4 respectivamente com Kpnl e Xbal e foram recuperados por eletroforese de agarose . Estes fragmentos foram inseridos em sítio Kpnl-Xbal de pPK4 descrito em JP-Kokai No. 9- 322774 para construir pPKPTGl, pPKPTG2, pPKPTG3 e pPKPTG4. (2) Secreção de pro-transglutaminase usando a seqüência de sinal da proteína de superfície de célula de C. glutamicum ATCC 13869 C. glutamicum ATCC13869 foi transformado com o plasmídeo construído pVKPTGl, pVKPTG2, pVKPTG3 ,pVKPTG4, pPKPTGl, pPKPTG2, pPKPTG3 ou pPKPTG4 e as cepas cultivadas em meio agar CM2S, descrito acima, compreendendo 5 mg/1 de cloranfenicol ou 25 mg/1 de canamicina foram selecionadas. A selecionada C. glutamicum ATCC13869 abrigando pVKPTGl, pVKPTG2, pVKPTG3 ,pVKPTG4, pPKPTGl, pPKPTG2, pPKPTG3 ou pPKPTG4 foi então cultivada em meio de cultura MM, descrito acima, compreendendo 5 mg/1 de cloranfenicol ou 25 mg/1 de canamicina a 30°C durante 48 horas, respectivamente. Após terminar a incubação, 10 μΐ do sobrenadante da cultura foram submetidos a SDS- PAGE e então Western blot foi realizado usando anticorpo anti- transglutaminase como descrito em Biosci. Biotechnol. Biochem., 58, 82- 87(1994) de acordo com o método convencional. Como resultado, a secreção da quantidade similar de transglutaminase tendo a parte de pro-estrutura foi confirmada para ambos os vetores, pVC7 ou pPK4, e as diferenças significantes na quantidade secretada foram observadas dependendo da extensão dos resíduos de aminoácidos N-terminais da forma madura da proteína correspondendo a PS2. As quantidades secretadas representativas são mostradas na tabela 1.

Tabela 1. A quantidade secretada de pro-transglutaminase usando a seqüência de sinal da proteína de superfície de célula de C. glutamicum ATCC13869 Exemplo 4: Produção secretória de pro-transglutaminase usando o gene de fusão tendo a seqüência codificando a seqüência de sinal da proteína de superfície de célula de C. ammoniasenes e a pro-transglutaminase derivada de S. mobaraense IFQ13819 (1) Construção do gene transglutaminase tendo uma parte de pro-estrutura adicional e a seqüência de sinal da proteína de superfície de célula de C. ammoniagenes (gene de fusão de preprotransglutaminase fundido de modo heterólogo) Os iniciadores mostrados em SEQ ID NO:24 e SEQ ID NO:25 foram sintetizados com referência a uma seqüência de gene da proteína de superfície de célula (SlpA) [JP-Kokai No. 10-108675] de C. ammoniagenes e a região compreendendo a região 5' a montante contendo a região de promotor da proteína de superfície de célula (SlpA) gene e a região codificando os 25 resíduos de aminoácidos N-terminais (o peptídeo sinal) de SlpA foi amplificada usando Método PCR a partir do DNA cromossômico de C. ammoniagenes preparado de acordo com o método convencional. Iniciador mostrado em SEQ ID NO:25 também compreende a seqüência codificando os aminoácidos N-terminais da pro-transglutaminase a fim de construir o gene de fusão fundido com a pro-transglutaminase. (SEQ ID NO:24) 5 '-GCCC AGAAGCCC AAAATTGAGATTT-3' (SEQ ID NO:25) 5'-CTTCGTCTCTTCCCCCGCGCCATTGTCTGCCGTTGCCACAGGTGC GGCCAGC-3' <Texto Livre de Listagem de Seqüência> SEQ ID NOs: 23 e 24: iniciador PCRs O gene de fusão transglutaminase contendo uma parte de pro- estrutura adicional que foi ligada à região codificando os 25 resíduos de aminoácidos N-terminais de C. ammoniagenes e a região 5' a montante compreendendo a região de promotor do gene da proteína de superfície de célula (SlpA) (gene prepro-transglutaminase fundido de modo heterólogo) foi amplificado realizando PCR de cruzamento com SEQ ID NO:24 e SEQ ID NO: 12 usando a mistura, como os gabaritos, contendo 1 μΐ de solução PCR da região 5' amplificada a montante contendo a região de promotor do gene da proteína de superfície de célula (SlpA) e a região codificando os 25 resíduos de aminoácidos N-terminais da proteína de superfície de célula (SlpA) de C. ammoniagenes e 1 μΐ de solução PCR da região do gene para a transglutaminase tendo uma parte de pro-estrutura adicional que tinha sido amplificada no Exemplo 3(1). O fragmento amplificado de cerca de 1,7 kb foi detectado por eletroforese de agarose. Este fragmento foi recuperado a partir de gel agarose usando EASYTRAP Ver. 2 (Takarashuzo Co. Ltd.) e foi inserido em sítio Smal de pVC7 para obter pVSPTGl. (2) Conversão da região de promotor: Ligação com o promotor do gene de proteína de superfície de célula de C. glutamicum ATCC13869 Os iniciadores mostrados em SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO:26 foram sintetizados com referência a uma seqüência de gene de PS2 que é a proteína de superfície ^e célula [Mol. Microbiol., 9, 97-109(1993)] de C. glutamicum. A região 5' a montante compreendendo a região de promotor do gene para a proteína correspondendo a PS2 foi amplificada usando Método PCR a partir de DNA cromossômico de C. glutamicum ATCC13869 preparado de acordo com o método no Exemplo 1 (2). Iniciador mostrado em SEQ ID NO:26 também compreende a seqüência codificando os aminoácidos N-terminais da seqüência de sinal da proteína de superfície de célula (SlpA) de C. ammoniagenes a fim de construir o gene de fusão com gene transglutaminase tendo a parte de pro-estrutura conectada a uma seqüência de sinal da proteína de superfície de célula (SlpA) de C. ammoniagenes (gene de fusão prepro-transglutaminase fundido de modo heterólogo). (SEQ ID NO: 15) 5'-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3' (SEQ ID NO: 26) 5'-CGCAGCCAGCGATTTCATGCGTTTCATAGAGGCGAAGGCTCCTT GAATAGGT-3’ <Texto Livre de Listagem de Seqüência>

SEQ ID NO: 15, 26: iniciador PCR

Por outro lado, os iniciadores mostrados em SEQ ID NO:27 e SEQID NO: 12 foram sintetizados com base na seqüência de gene de fusão de transglutaminase tendo uma parte de pro-estrutura adicional e a seqüência de sinal da proteína de superfície de célula (SlpA) de C. ammoniagenes. A região da transglutaminase tendo uma parte de pro-estrutura adicional foi então amplificada por Método PCR a partir de pVSPTGl obtido no Exemplo 4(1) com os iniciadores. (SEQ ID NO: 12) 5'-CGCTCACATCACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3' (SEQ ID NO:27) 5'-ATGAAACGCATGAAATCGCTGGCTGCGGCG-3' <Texto Livre de Listagem de Seqüência>

SEQ ID NOs: 12 e 27: iniciador PCR O gene de fusão de transglutaminase tendo a parte de pro- estrutura, que foi ligada à região codificando os 25 resíduos de aminoácidos N-terminais da proteína de superfície de célula (SlpA) de C. ammoniagenes e à região 5' a montante contendo a região de promotor do gene da proteína correspondendo a PS2 de C. glutamicum ATCC13869, foi então amplificado por realização de PCR de cruzamento com SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 12 usando a mistura compreendendo 1 μΐ de solução PCR da região 5' amplificada a montante contendo a região de promotor do gene para a proteína correspondendo a PS2 de C. glutamicum e 1 μΐ de solução PCR da região amplificada do gene para a transglutaminase tendo a parte de pro- estrutura que tinha uma seqüência de sinal da proteína de superfície de célula (SlpA) de C. ammoniagenes (gene de prepro-transglutaminase fundido de modo heterólogo). O fragmento amplificado de cerca de 1,8 kb foi detectado por eletroforese de agarose. Este fragmento foi recuperado do gel agarose usando EASYTRAP Ver. 2 (Takarashuzo Co. Ltd.) e inserido em sítio Smal de pVC7 descrito em JP-Kokai No. 9-070291 para obter pVKSPTGl. A seqüência de nucleotídeos do fragmento inserido foi determinada de acordo com o método acima mencionado e foi confirmado que o gene de fusão esperado foi construído. O gene de fusão de cerca de 1,8 kb para transglutaminase tendo a pro-estrutura, que foi ligado à região codificando os 25 resíduos de aminoácidos N-terminais (peptídeo sinal) da proteína de superfície de célula (SlpA) de C. ammoniagenes e que compreendida a região 5' a montante contendo a região de promotor do gene da proteína correspondendo a PS2 de C. glutamicum ATCC13869, foi excisada por digestão pVKSPTGl com Kpnl e Xbal, e o fragmento foi recuperado usando eletroforese de agarose . Este fragmento foi inserido em sítio Kpnl-Xbal de pPK4 descrito em JP-Kokai No. 9-322774 para construir pPKSTGl. Ambos plasmídeos, pVKSPTGl e pPKSPTGl continham o promotor derivado de gene PS2 de C. glutamicum ATCC13869, o gene de peptídeo sinal derivado de SlpA de C. ammoniagenes e o gene transglutaminase derivado de S. mobaraense. (3) Conversão para promotor tac de E. coli Os iniciadores mostrados em SEQ ID N028 e SEQ ID NO:29 foram sintetizados com base na seqüência de plasmídeo pKK223-3 (Amersham Pharmacia Co. Ltd.) em que o promotor tac de E. coli tinha sido clonado. A região correspondendo a promotor tac foi amplificada usando Método PCR de pKK223-3 DNA. Iniciador mostrado em SEQ ID NO:29 também compreende a seqüência codificando a seqüência N-terminal de aminoácidos da seqüência de sinal da proteína de superfície de célula (SlpA) de C. ammoniagenes a fim de construir o gene de fusão tendo a parte pro- estrutura, que continha a seqüência de sinal da proteína de superfície de célula (SlpA) de C. ammoniagenes (gene de prepro-transglutaminase fundido de modo heterólogo). (SEQ ID NO:28) 5 '-GGATCCGGAGCTT ATCGACT GC ACG-3' (SEQ ID NO:29) 5'-CGCAGCCAGCGATTTCATGCGTTTCATAATTCTGTTTCCTGTGT GAAATTGT-3' <Texto Livre de Listagem de Seqüência> SEQ ID NOs:28 e 29: iniciador PCRs O gene de fusão para transglutaminase tendo uma parte de pro- estrutura adicional , que foi ligada à região codificando os 25 resíduos de aminoácidos N-terminais da proteína de superfície de célula(SlpA) de C. ammoniagenes e que continha promotor tac (gene de prepro-transglutaminase fundido de modo heterólogo), foi amplificado realizando PCR de cruzamento com SEQ ID NO:28 e SEQ ID NO: 12 usando uma mistura de 1 μΐ de solução PCR da região amplificada correspondendo o promotor tac e 1 μΐ de solução PCR da região amplificada do gene para transglutaminase tendo a parte de pro-estrutura, que continha a seqüência de sinal da proteína de superfície de célula (SlpA) de C. ammoniagenes, como os gabaritos. O fragmento amplificado de cerca de 1,5 kb foi detectado por eletroforese de agarose. Este fragmento foi recuperado do gel agarose por EASYTRAP Ver. 2 (Takarashuzo Co. Ltd.) e inserido em sítio Smal de pVC7 como descrito em JP-Kokai No. 9-070291 para obter pVTSPTGl. A seqüência de nucleotídeos do fragmento inserido foi determinada de acordo com o método acima mencionado e foi confirmado que o gene de fusão esperado foi construído. O gene de fusão com cerca de 1,5 kb para transglutaminase tendo a parte de pro-estrutura, que foi ligada à região codificando os 25 resíduos de aminoácidos N-terminais da proteína de superfície de célula(SlpA) de C. ammoniagenes e promotor tac, foi excisado por digestão de pVTSPTGl com Kpnl e Xbal e foi recuperado usando eletroforese de agarose . Este fragmento foi inserido em sítio Kpnl-Xbal de pPK4 descrito em JP-Kokai No. 9-322774 para construir pPTSPTGl. Ambos plasmídeos pVTSPTGl e pPTSPTGl continham o promotor tac derivado de E. coli, o gene de peptídeo sinal derivado de SlpA de C. ammoniagenes e o gene pro- transglutaminase derivado de S. mobaraense. (4) Secreção de pro-transglutaminase usando a seqüência de sinal da proteína de superfície de célula de C. ammoniagenes C. glutamicum ATCC13869 foi transformado com o plasmídeo construído pVKSPTGl, pVTSPTGl, pPKSPTGl, ou pPTSPTGl e as cepas cultivadas em meio agar CM2S compreendendo 5 mg/1 de cloranfenicol ou 25 mg/1 de canamicina foram selecionadas. O selecionado C. glutamicum ATCC 13869 abrigando pVKSPTGl, pVTSPTGl, pPKSPTGl, ou pPTSPTGl foi então cultivado no meio de cultura MM acima mencionado compreendendo 5 mg/1 de cloranfenicol ou 25 mg/1 de canamicina a 30°C durante 48 horas, respectivamente. Após acabar a cultura, 10 μΐ do sobrenadante da cultura foram submetidos a SDS-PAGE e então Western blot foi realizado usando anticorpo anti-transglutaminase, como descrito em Biosci. Biotechnol. Biochem., 58, 82-87(1994) de acordo com o método convencional. Como resultado, a quantidade similar de transglutaminase foi confirmada como sendo secretada para um dos vetores, pVC7 ou pPK4. As quantidades representativas da secreção são mostradas na tabela 2.

Tabela 2. A quantidade secretada de pro-transglutaminase usando a seqüência de sinal da proteína de superfície de célula de C. ammoniagenes ATCC 13869 Exemplo 5: Produção secretória de pro-transglutaminase usando o gene de fusão contendo a seqüência codificando a seqüência de sinal da proteína de superfície de célula de C. ammoniasenes e a protransglutaminase derivada de Streptoverticillium cinnamoneum IFQ12852 (1) Construção do gene de fusão compreendendo a seqüência codificando a seqüência de sinal da proteína de superfície de célula de C. ammoniagenes e a seqüência codificando a pro-transglutaminase derivada de S. cinnamoneum IF012852 A seqüência de gene de transglutaminase de S. cinnamoneum IFO12852 foi determinada [Pedido de patente JP No. 11-295649]. A região da posição 1 para posição 32 na seqüência de aminoácidos é provavelmente a seqüência para a pre-parte, da posição 33 para a posição 86 é provavelmente a seqüência para a pro-parte e da posição 87 para a posição 416 é provavelmente a seqüência para seqüência de transglutaminase madura. A seqüência de nucleotídeos e a completa seqüência de aminoácidos codificada por uma seqüência de nucleotídeos são mostradas em SEQ ID NO:30 e SEQ ID NO:31. Além disso Escherichia coli AJ13669 que tinha sido transformado com o plasmídeo pUJ-MTG contendo o gene tinha sido originalmente depositado junto ao National Institute of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science and Technology (agora, uma agência administrativa independente, National Institute of Advance Industrial Science and Technology, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566 Japão) em 14 de outubro de 1999, como FERM P- 17602 e foi transferida para depósito sob o Tratado de Budapeste em 28 de agosto de 2000, e o número de depósito de FERM BP-7287 foi conferido ao mesmo. A região de 3,5 kb cobrindo o comprimento completo do gene de prepro-transglutaminase foi primeiramente excisada a partir de pUJ-MTG com enzima de restrição BamHI, e pUCSCTG foi gerada em que uma região foi inserida no sítio BamHI de pUC19.

Iniciadores mostrados em SEQ ID NO:32 e SEQ ID NO:33 foram sintetizados, e a região do gene compreendendo a pro-transglutaminase derivada de S. cinnamoneum IFO 12852 foi amplificada pelo Método PCR usando pUCSCTG como o gabarito como previamente descrito. (SEQ ID NO:32) 5'-GGC GAT GGG GAA GAG AAG GGG-3' (SEQ ID NO:33) 5'-GGC GGA TCC TVG CGT CGA GAG GCG TGG ACT GA-3' <Texto Livre de Listagem de Seqüência > SEQID NOs:32 e 33: iniciador PCRs A região, que continha a região 5' a montante contendo a região de promotor de gene PS2, que é a proteína de superfície de célula de C. glutamicum e a região contendo a seqüência de sinal da proteína de superfície de célula SlpA de C. ammoniagenes, foi então amplificada realizando PCR usando a combinação de SEQ ID NO:34 e SEQ ID NO:35 a partir de pPKSPTGl que foi construída no Exemplo 4(2) como o gabarito.

Iniciador mostrado em SEQ ID NO:35 também continha a seqüência codificando a seqüência N-terminal de aminoácidos de pro- transglutaminase derivada de Streptoverticillium cinnamoneum IFO12852 a fim de construir o gene de fusão com a transglutaminase derivada de Streptoverticillium cinnamoneum IFO 12852. (SEQ ID NO: 34) 5'-TAC GAA TTC GAG CTC GGT ACC-3' (SEQ ID NO: 35) 5'-CCC CTT CTC TTC CCC ATC GCC TGC CGT TGC CAC AGG TGC GGC C -3’ <Texto livre de Listagem de Seqüência>

SEQ ID NO: 34 e 35: iniciadores de PCR O fragmento do gene de prepro-transglutaminase fundido de modo heterólogo, que foi ligado a uma seqüência de sinal da proteína de superfície de célula SlpA de C. ammoniagenes e a região 5' a montante compreendendo a região de promotor de gene PS2, foi amplificado realizando PCR de cruzamento com SEQ ID NO: 34 e SEQ ID NO: 33 usando a mistura compreendendo 1 μΐ de solução PCR da região amplificada codificando o gene para a pro-transglutaminase derivada de C. cinnamoneum IF012852 e 1 μΐ de solução PCR da região amplificada compreendendo a região 5' a montante contendo a região de promotor do gene PS2 e a região contendo a seqüência de sinal da proteína de superfície de célula SlpA de C. ammoniagenes, como os gabaritos. O fragmento amplificado de cerca de 1,8 kb foi detectado por eletroforese de agarose. Este fragmento foi digerido com EcoRI e BamHI, e então recuperado do gel agarose e inserido no sítio EcoRI-BamHI de pUC19 para obter pUKSPTG2'. A seqüência do fragmento inserido foi determinada de acordo com o método acima mencionado e foi confirmado que o gene de fusão foi construído como esperado. Este pUKSPTG2' foi digerido com EcoRI e terminado de modo cego com kit (Takarashuzo Co. Ltd.), e ligador Xbal (Takarashuzo Co. Ltd.) tendo a seqüência 5'-CTCTAGAG-3' em que o terminal 5' foi fosforilado e então inserido e reciclizado para construir pUKSPTG2. O gene de prepro- transglutaminase fundido de cerca de 1,8 kb (a progene transglutaminase foi derivada de S. cinnamoneum IFO12852) foi excisado por digestão de pUKSPTG2 com Xbal e foi recuperado usando eletroforese de agarose . Estes fragmentos foram inseridos em sítio Xbal de pPK4 descrito previamente para construir pPKSPTG2. O gene de prepro-transglutaminase tendo uma parte quimérica de pro-estrutura, em que o N-terminal da parte de pro-estrutura foi parcialmente substituído pela parte de pro-estrutura de S.mobaraense, foi construído (o gene de transglutaminase maduro e a parte da parte da pro- estrutura foi derivada de S. cinnamoneum IFO 12852).

Primeiro, o fragmento de cerca de 1,8 kb contendo o gene de prepro-transglutaminase de EcoRI-BamHI foi excisado a partir do plasmídeo pPKSPTGl (para a expressão de pro-transglutaminase derivada de S. mobaraense IFO 13819) que foi construída no Exemplo 4(2), e o fragmento foi inserido no sítio EcoRI-BamHI de pUC19 (pUKSPTGl). O fragmento de cerca de 1,2 kb foi excisado por digestão de pUKSPTGl com Aatll, e pUKSPTG2' foi também digerido com Aatll para preparar o fragmento de cerca de 3,3 kb removendo o fragmento de cerca de 1,2 kb. Este fragmento de cerca de 3.3 kb foi ligado ao fragmento Aatll de cerca de 1,2 kb derivado de pUKSPTGl, e clones em que o fragmento Aatll foi inserido, foram selecionados de acordo com as técnicas de engenharia genética convencionais. A fim de determinar a orientação do fragmento Aatll inserido nos clones, os clones foram sequenciados em série e os clones onde o fragmento foi inserido na orientação desejada (para codificar preprotransglutaminase) foram selecionados (pUKSPTG3').

Além disso, o sítio EcoRI de pUKSPTG3' foi também terminado de modo obtuso como descrito para pUKSPTG2' e ligador Xbal foi inserido para construir pUKSPTG3. Além disso o fragmento de l,8kb de Xbal excisado de pUKSPTG3 foi inserido em sítio Xbal de pPK4 para construir pPKSPTG3. (2) Secreção da protransglutaminase derivada de Streptoverticillium cinnamoneum IF012852 usando a seqüência de sinal da proteína de superfície de célula de C. ammoniagenes C. glutamicum ATCC13869 foi transformado com o plasmídeo pPKSPTG2 ou pPKSPTG3, e as cepas que cresceram em meio agar CM2S descrito acima compreendendo 25 mg/1 de canamicina foram selecionadas. A selecionada C. glutamicum ATCC 13 869 abrigando pPKSPTG2 ou pPKSPTG3 foi então cultivada respectivamente em meio de cultura líquido MMTG (60 g de glucose, 0,4 g de sulfato de magnésio heptaidratado, 30 g de sulfato de amônio, 1 g de dihidrogenofosfato de potássio, 0,01 g de sulfato ferroso heptaidratado, 0,01 g de sulfato de manganês (II) pentaidratado, 450 pg de cloridrato de tiamina, 450 pg de biotina, 0,15 g de DL-metionina, 50 g de carbonato de cálcio por litro de água destilada, ajustados a pH 7,5) contendo 25 mg/1 de canamicina a 30°C durante 3 dias. Após a cultura estar completa, 10 pl do sobrenadante da cultura foram submetidos a SDS-PAGE e então análise Western blot foi realizada de acordo com o método convencional com anticorpo anti-transglutaminase como previamente descrito. Este anticorpo foi um anticorpo para a transglutaminase derivada de S. mobaraense, mas também mostrou reatividade para a transglutaminase derivada de S. cinnamoneum. Conseqüentemente, a secreção da transglutaminase tendo a parte de pro-estrutura derivada de S. cinnamonieum IFO12852 foi confirmada (cerca de 30 a 50 mg/1).

Exemplo 6: Clonagem do gene de serina protease CSAMP45) e a construção e avaliação de plasmídeos de expressão (1) Construção do gene de serina protease (SAMP45) tendo a parte de pro- estrutura e a seqüência de sinal da proteína de superfície de célula de C. ammoniagenes (gene prepro-serina protease fundido de modo heterólogo (SAMP45)) A seqüência de gene de SAMP45 que é uma serina protease produzida por S. albogriseolus [J. Bacteriol., 179, 430-438(1997)] já foi determinada. Os iniciadores mostrados em SEQ ID NO:36 e SEQ ID NO:37 foram sintetizados com referência a esta seqüência e a região do gene contendo a parte N-terminal de pro-estrutura de SAMP45, SAMP45 maduro e a parte C-terminal de pro-estrutura foi amplificado usando Método PCR de acordo com o método descrito previamente . (SEQ ID NO: 36) 5'-AACGGGGAGAAC AGC ACGGCCGCCGG-3' (SEQ ID NO:37) 5'-GGCGAATTCTCCGGCGGGCCGTCACCGGT-3' <Texto Livre de Listagem de Seqüência>

SEQ ID NOs:36 e 37: iniciador PCR A região compreendendo 5'-região a montante contendo a região de promotor do gene da proteína de superfície de célula PS2 de C. glutamicum e a seqüência de sinal da proteína de superfície de célula SlpA de C. ammoniagenes foi similarmente amplificada usando Método PCR com a combinação da SEQ ID NO:38 e SEQ ID NO:39 usando pPKSPTGl construído no Exemplo 4(2) como o gabarito.

Iniciador mostrado em SEQ ID NO:39 compreende a seqüência codificando os aminoácidos N-terminais de pro-serina protease a fim de construir o gene de fusão contendo serina protease tendo a parte de pro-estrutura. (SEQ ID NO:38) 5'-GGCAAGCTTAAATTCCTGTGAATTAGCTGA-3' (SEQ ID NO:39) 5'-CGGCCGTGCTGTTCTCCCCGTTTGCCGTTGCCACAGGTGCGGCC-3' <Texto Livre de Listagem de Seqüência > SEQ ID NO:38 e 39 : iniciadores PCR para construir o gene de pro-serina protease fundido Então o fragmento de gene do gene de prepro-serina protease fundido de modo heterólogo, que foi ligado a uma seqüência de sinal da proteína de superfície de célula SlpA de C. ammoniagenes e à região 5' a montante contendo a região de promotor de PS2 gene, foi amplificado realizando PCR de cruzamento com SEQ ID NO:38 e SEQ ID NO:37 usando a mistura, como os gabaritos, que compreende 1 μΐ de solução PCR da região amplificada compreendendo o gene para a pro-estrutura N-terminal de SAMP45, SAMP45 maduro e a pro- estrutura C-terminal, e 1 μΐ de solução PCR da região amplificada compreendendo a região 5' a montante contendo a região de promotor do PS2 gene e a seqüência de sinal da proteína de superfície de célula SlpA de C. ammoniagenes, respectivamente. O fragmento amplificado de cerca de 3,9 kb foi detectado por eletroforese de gel agarose. O produto PCR foi digerido com HindIII e EcoRI, então submetido a eletroforese de gel agarose, e o fragmento de cerca de 3,9 kb foi recuperado de gel agarose e inserido em sítio HindIII-EcoRI do acima mencionado pVC7 para obter pVSSl, respectivamente. A seqüência de fragmento inserido foi determinada de acordo com o método acima mencionado e foi confirmado que o gene de fusão foi construído como esperado. (2) Secreção da serina protease usando a seqüência de sinal da proteína de superfície de célula de C. ammoniagenes C. glutamicum ATCC13869 foi transformado com o plasmídeo pVSSl e as cepas que cresceram em meio agar CM2S descrito acima compreendendo 5 mg/1 cloranfenicol foram selecionadas. A selecionada C. glutamicum ATCC13869 abrigando pVSSl foi então cultivada em meio de cultura MMTG compreendendo 5 mg/1 cloranfenicol a 30°C durante 70 horas, lml do meio de cultura foi separado no sobrenadante do meio de cultura e as células por centrifugação. As células foram colocadas em suspensão em 0,1 M tampão fosfato de sódio (pH 7,0). A atividade da serina protease foi determinada como a seguir: 50 μΐ do sobrenadante do meio da cultura ou a suspensão de células foram adicionados a 20 mM tampão fosfato de sódio(pH 7,0) contendo 0,25 mM Bz-Phe-Val-Arg-pNA (Bachem Co.

Ltd.) para dar uma quantidade total de 0,6 ml, que foi mantido a 30°C durante 20 minutos. A seguir, a reação foi terminada quando da adição de 0,4 ml de 50% ácido acético. A absorbância foi medida a 410 nm e a quantidade de p- NA (p-nitroanilida) liberada foi medida para determinar a atividade. Uma unidade da enzima foi definida como a quantidade de enzima que libera 1 pmol de pNA por um minuto. Como resultado, a atividade de serina protease não foi detectada o sobrenadante do meio de cultura, mas foi detectada na suspensão de células. O cálculo dos valores de atividade detectada e os valores de atividade específica registrados na literatura [J. Bacteriol., 179, 430-438(1997)], como tanto cerca de 9 mg/1 de serina protease foram confirmados como sendo expressos e secretados na superfície da célula.

Exemplo 7: Clonagem do gene nentidase específico para prolina fsvPEP) e construção e avaliação dos plasmídeos de expressão (1) Purificação e análise de aminoácidos N-terminais da peptidase específica para prolina (svPEP) produzida por S. mobaraense IF013819 800 mL de ISP2 meio de cultura líquido (4 g de extrato de levedura, 10 g de extrato de malte, 4 g de glucose carregada até 1L por água, ajustados a pH 7,3) foram colocados em um frasco de 5L Sakaguchi e S. mobaraense IF013819 foi inoculado da placa e cultivado por agitação do frasco a 30 °C durante 48 h a 120 rpm. O meio de cultura foi centrifugado para remover o sobrenadante da cultura e as células foram coletadas. Após lavar as células com tampão 20 mM Tris-HCl, contendo 25 mg/1 canamicina, as células resultantes foram colocadas em suspensão em tampão 0,1 M fosfato de sódio(pH 7,0) contendo 25 mg/1 canamicina. A suspensão foi agitada em gelo durante 4 h e centrif i(Trda para dar o sobrenadante que foi coletado. Após o sobrenadante ser esterilizado em filtro usando o filtro de nitrocelulose (tamanho de poro 0,22 pm Sartrius Co. Ltd.), o sobrenadante foi passado através de coluna de Butyl-Sepharose 4FF (Amersham Pharmacia Co. Ltd.) (1,6 φχ10 cm), que tinha sido pré-equilibrada com 1,5 M sulfato de amônio/ 50 mM tampão (pH 7,0) usando FPLC (Amersham Pharmacia Co. Ltd.) e eluído pelo gradiente linear de sulfato de amônio 1,5 a 0 M no mesmo tampão. As frações contendo componentes ativos foram reunidas e passadas através de coluna Phenyl-Sepharose HP (lmL, Amersham Pharmacia Co.

Ltd.) sob a mesma condição, e as frações ativas foram reunidas e dialisadas durante a noite contra 50 mM tampão fosfato de sódio (pH 7,0), a 4 °C para dar solução de enzima parcialmente purificada. A solução de enzima parcialmente purificada foi submetida a uma cromatografia em fase reversa para outra purificação . A condição da cromatografia em fase reversa foi a seguinte: Dispositivo HPLC : Bomba: HITACHI L-6300, detector: L- 4000H

Coluna : PROTEÍNA C4 214TP5410(VYDAC Co. Ltd.) Eluição : Eluição foi realizada por um gradiente linear de acetonitrila 24-40 % / 0,1% ácido trifluoroacético (20 min) em temperatura ambiente Taxa de fluxo : 1,0 ml/min.

Comprimento de onda de detecção: 280 nm A amostra de enzima que foi purificada sob a condição descrita acima foi transferida para membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF) usando Membrane Cartridge (Perkin Elmer Co. Ltd.) e a seqüência de aminoácidos N-terminal foi analisada usando sequenciador de proteína em fase gasosa PPSQ-10 (Shimazu Seisakusho Co., Ltd.). Como resultado, os 20 resíduos de aminoácidos N-terminais foram determinados, que são mostrados em SEQ ID NO:40, (SEQ ID NO:40) Gin Ala Asp Ile Lys Asp Arg Ile Leu Lys Ile Pro 1 5 10 Gly Met Lys Phe Vai Glu Glu Lys 15 20 (2) Aquisição do gene peptidase(svPEP) específico para prolina derivado de S. mobaraense IF013819 A região que é deduzida da determinada seqüência N-terminal de aminoácidos de svPEP e que tem menor degenerescência, Lys-Ile-Pro-Gly- Met-Lys-Phe-Val-Glu-Glu-Lys (SEQ ID NO:41), foi selecionada e o oligonucleotídeo sintético mostrado em SEQ ID NO: 42 foi gerado. O DNA cromossômico de S. mobaraense IF013819 preparado de acordo com o método convencional foi digerido com várias enzimas de restrição que reconhecem a seqüência de 6 nucleotídeos e então analisadas por método de hibridização Southern blot usando este oligonucleotídeo sintético como a sonda e assim uma única banda de cerca 6 kb foi detectada por divagem Saci.

Assim, o DNA cromossômico de S. mobaraense IF013819 preparado de acordo com o método acima mencionado foi digerido com Sac I e o fragmento de cerca de 6 kb foi recuperado por eletroforese de gel agarose usando EASYTRAP Ver. 2 (Takarashuzo Co. Ltd.). O fragmento recuperado foi inserido no sítio Sac I de pUC18, que foi introduzido na célula competente de Escherichia coli JM109 (Takarashuzo Co. Ltd.), assim produzindo uma biblioteca. A biblioteca gerada deste modo foi tríada para a cepa que abrigou o plasmídeo onde o fragmento de gene svPEP foi clonado, por triagem da biblioteca através de uma hibridização de colônia usando oligonucleotídeo sintético rotulado 32P mostrado em SEQ ID NO:38 como uma sonda para obter o gene pretendido. O plasmídeo recuperado desta especialmente foi designado como pUMPl. (SEQ ID NO:42) 5'-AAGATCCCCGGGATGAAGTTCGTCGAGGAGAAG-3' <Texto livre de Listagem de Seqüência>

SEQ ID NO:42 : uma sonda para svPEP A seqüência de nucleotídeos do fragmento que foi clonado como pUMPl foi determinada. A seqüência de aminoácidos codificada por este gene foi deduzida e a seqüência de aminoácidos N-terminal previamente determinada (20 resíduos) com base na proteína de enzima foi encontrada, e toda a seqüência de aminoácidos primária contendo a seqüência de sinal putativo e a parte de pro-estrutura de svPEP foi determinada, o que é mostrado em SEQ ID NO:9. Na seqüência de aminoácidos, a posição 1 a 25 é suposta como sendo a seqüência de sinal, posição 26 a 33 é suposta como sendo a estrutura pro e a posição 34 a 477 é svPEP maduro.

Escherichia coli AJ13669 que foi transformado com pUMPl foi depositado no National Institute of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science and Technology (agora, uma Agência Administrativa Independente, National Institute of Advance Industrial Science and Technology, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome Tsukuba- shi, Ibaraki-ken, 305-8566 Japão) em 15 de maio de 2000 como FERM BP- 7160 sob o Tratado de Budapeste. (3) Construção do gene de peptidase específico para prolina (svPEP) tendo a parte de pro-estrutura com a seqüência de sinal da proteína de superfície de célula de C. ammoniagenes (gene de peptidase específico para pre-proprolina (svPEP) fundido de modo heterólogo) Iniciadores mostrados em SEQ ID NO:43 e SEQ ID NO:44 foram sintetizados com referência a uma seqüência de svPEP determinada no Exemplo 7(2), e a região de gene contendo parte pro de svPEP e svPEP maduro foram amplificados por Método PCR do mesmo modo que descrito previamente usando pUMPl construído no Exemplo 7(2) como o gabarito. (SEQ ID NO: 43) 5'-GAGGCGGCGTCGATCACCGCCCC-3' (SEQ ID NO: 44) 5'-GCCAAGCTTGAAGCACCGGGCGGCGGCACC CGG-3' <Texto livre de Listagem de Seqüência> SEQ ID NO: 43 e 44: iniciador PCRs Então a região, que compreende a região 5' a montante contendo a região de promotor de PS2 gene que é o gene da proteína de superfície de célula de C. glutamicum e a região contendo a seqüência de sinal da proteína de superfície de célula SlpA de C. ammoniagenes, foi amplificada pelo método PCR de pPKSPTGl construído no Exemplo 4(2) como o gabarito usando a combinação de SEQ ID NO:38 e SEQ ID NO:45.

Iniciador mostrado em SEQ ID NO:45 compreende a seqüência codificando os aminoácidos N-terminais de svPEP a fim de construir o gene de fusão fundido para o svPEP tendo a parte pro-estrutura. (SEQ ID NO: 38) 5'-GGCAAGCTTAAATTCCTGTGAATTAGGCTGA-3' (SEQ ID NO: 45) 5'-GGGGCGGTGATCGACGCCGCCTCTGCCGTTGCCACAGGTGCG GCCA-3' <Texto livre de Listagem de Seqüência>

SEQID NOs:38 e 45 : iniciador PCR O fragmento do gene fundido de modo heterólogo de prepro- svPEP, que foi ligado a seqüência de sinal da proteína de superfície de célula SlpA de C. ammoniagenes e a região 5' a montante contendo a região de promotor de PS2 gene, foi então amplificado por realização de PCR de cruzamento com SEQ ID NO:38 e SEQ ID NO:44 usando a mistura, como os gabaritos, que compreende 1 μΐ de cada solução PCR da região contendo o gene codificando a parte de pro-estrutura de svPEP e svPEP maduro, que foram amplificados respectivamente, e 1 μΐ de solução PCR da região amplificada compreendendo a região 5' a montante contendo a região de promotor do gene PS2 e a seqüência de sinal da proteína de superfície de célula SlpA de C. ammoniagenes. (SEQ ID NO:38) 5'-GGCAAGCTTAAATTCCTGTGAATTAGCTTA-3' (SEQ ID NO:44) 5'-GCCAAGCTTGAAGCACCGGCGGCGGCACCCGG-3' <Texto livre de Listagem de Seqüência>

SEQ ID NO:38 e SEQ ID NO 44 : iniciador PCR O fragmento amplificado de cerca de 2,1 kb foi detectado por eletroforese de gel agarose. O fragmento PCR foi digerido com HindIII, e então submetido a eletroforese de gel agarose e o fragmento de cerca de 2,1 kb recuperado do gel agarose e inserido no sítio HindIII do pVSSl descrito em Exemplo 6(1) para obter pVSSSPl, respectivamente. A seqüência de fragmento inserido foi determinada de acordo com o método convencional e foi confirmado que o gene de fusão esperado foi construído. (4) Secreção da peptidase específica para prolina usando a seqüência de sinal da proteína de superfície de célula de C. ammoniagenes C. glutamicum ATCC13869 foi transformado com o plasmídeo pVSSSPl construído e as cepas que crescem em meio agar CM2S

descrito acima compreendendo 5 mg/1 cloranfenicol foram selecionadas. O selecionado C. glutamicum ATCC13869 abrigando pVSSSPl foi então cultivado em meio de cultura MMTG, descrito acima, compreendendo 5mg/l cloranfenicol a 30°C durante 70 horas. 10 ml do sobrenadante da cultura foram separados por centrifugação no sobrenadante do meio de cultura e as células . As células foram colocadas em suspensão em 0,1 M tampão fosfato de sódio(pH 7,0). A atividade de svPEP foi determinada como a seguir: 50 μΐ do sobrenadante do meio de cultura ou a suspensão de células foram adicionados a 20 mM tampão fosfato de sódio (pH 7,0) contendo 0,25 mM

Ala-Ala-Pro-pNA (Bachem Co. Ltd.) para dar uma quantidade total de 0,6 ml e a mistura foi mantida a 30°C durante 20 minutos. A seguir, a região foi terminada quando de adição de 0,4 ml de 50% ácido acético. A absorbância foi medida a 410 nm e a quantidade de p-NA (p-nitroanilida) liberada foi calculada para determinar a atividade. Uma unidade da enzima é definida como a quantidade de enzima que libera 1 pmol de pNA durante 1 minuto.

Como resultado, a atividade de svPEP não foi detectada no sobrenadante do meio de cultura, mas foi detectada na suspensão de células. O cálculo dos valores da atividade detectada e os valores da atividade específica (35,5 u/mg) descritos no exemplo 7 (1), tanto como cerca de 50 mg/1 de svPEP foi confirmado como sendo expresso e secretado na superfície da célula. (5) Clivagem da parte de pro-estrutura da transglutaminase tendo a pro- estrutura pela serina protease e protease específica para serina expressada e secretada por C. glutamicum ATCC13869 C. glutamicum ATCC13869 abrigando o plasmídeo de expressão secretório pPKSPTGl para transglutaminase tendo a parte de pro- estrutura descrita no Exemplo 4(2) foi transformado com o plasmídeo pVSSSPl construído, e as cepas cultivadas no meio agar CM2S acima mencionado compreendendo 5 mg/1 de cloranfenicol e 25 mg/1 canamicina foram selecionadas. Então o selecionado C. glutamicum ATCC13869 abrigando pVSSSPl e pPKSPTGl foi cultivado em meio de cultura MMTG, descrito acima, compreendendo 5 mg/1 cloranfenicol e 25 mg/1 canamicina a 30 μ durante 70 horas. Após acabar a cultura, 10 μΐ do sobrenadante da cultura foram submetidos a SDS-PAGE e então análise Western blot foi realizada com anticorpo anti-transglutaminase previamente descrito de acordo com o método convencional. Como resultado, foi confirmado que SAMP45 e svPEP foram normalmente expressos e secretados, e que a parte de pro- estrutura foi clivada da transglutaminase tendo a parte de pro-estrutura que também tinha sido secretada, assim a secreção da transglutaminase tendo um similar peso molecular ao da transglutaminase madura de ocorrência natural foi confirmado. A atividade de transglutaminase foi testada para o sobrenadante pelo método hidroxamato previamente descrito, que confirmou que ela continha a atividade específica similar (cerca de 20 U/mg) à da transglutaminase de ocorrência natural.

Além disso, ela foi submetida a blot de modo meio-seco sobre a membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF) de acordo com o método previamente descrito após SDS-PAGE. Após o blot, as membranas PVDF foram coloridas com azul Brilhante Coomassie , descoloridas e secadas ao ar. A porção contendo a transglutaminase madura foi excisada e analisada para a seqüência de aminoácido N-terminal usando um sequenciador de proteína.

Como resultado, foi confirmado que ela tinha a mesma seqüência N-terminal que a transglutaminase de ocorrência natural derivada de Asp partindo de S. mobaraense localizado na posição 77, que é mostrada em SEQID NO:6.

Exemplo 8: Produção secretória de fator de crescimento epidérmico humano OiEGF) usando o gene de fusão contendo a seqüência codificando a seqüência de sinal da proteína de superfície de célula de Corvnebacterium ammoniazenes ATCC6872 e a seqüência codificando fator de crescimento epidérmico humano (1) Construção de gene hEGF contendo a seqüência de sinal da proteína de superfície de célula de Corynebacterium glutamicum ATCC13869 A seqüência de gene da proteína de superfície de célula de Corynebacterium glutamicum, PS2, já foi determinada [Mol. Microbiol., 9, 97-109 (1993)]. Os iniciadores mostrados em SEQ ID NO:46 e NO:47 foram sintetizados com referência a esta seqüência.. A região do gene compreendendo a região 5' a montante e a região codificando 44 resíduos de aminoácidos N-terminais da proteína correspondendo a PS2 foram amplificadas usando método PCR do DNA cromossômico de Corynebacterium glutamicum ATCC13869 que tinha sido preparado de acordo com o método de Saito & Miura [Biochem. Biophys. Act., 72, 619 (1963)]. O iniciador mostrado como SEQ ID NO:46 continha sítio Kpnl em seu terminal 5', que foi requerido para inserir uma região em um plasmídeo.

(SEQ ID NO:46) 5’-GCTCGGTACCCAAATTCCTGTGAATTAGCTGA TTTAG-3’ (SEQ ID NO:47) 5 ’-GTTGAAGCCGTTGTTGATGTTGAA-3 ’ <Teste livre de Listagem de Seqüência>

SEQ ID NOs:46 e 47: iniciador PCR

Por outro lado, os iniciadores mostrados em SEQ ID NO:48 e NO:49 foram sintetizados. A região codificando hEGF foi amplificada por método PCR a partir de plasmídeo pT13SAhIL2-KS-hEGF(H3) (JP Kokai No. 64-2583) que contém a seqüência de genes para hEGF. Escherichia coli AJ12354 transformado com plasmídeo pT 13SAhIL2-KS-hEGF(H3) contendo o gene foi originalmente depositado junto à uma Agência Administrativa Independente, National Institute of Advance Industrial Science and Technology (Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, Ibaraki- ken, 305-8566 Japão) em 20 de novembro de 1987 e foi transferido para o depósito internacional sob o Tratado de Budapeste em 28 de março de 2002, e o número de depósito de FERM BP-7966 foi concedido ao mesmo. O iniciador mostrado como SEQ ID NO:48 contém uma seqüência codificando os aminoácidos C-terminais da seqüência de sinal de PS2 a fim de construir o gene de fusão com a região que compreende região 5' a montante e que também compreende a região codificando 44 resíduos de aminoácidos N-terminais da proteína correspondendo a PS2.

(SEQ ID NO:48) 5 ’AACATCAACAACGGCTTCAACAATTCCGATTCT GAGTGCCCT-3’ (SEQ ID NO:49) 5’-CGGCCACGATGCGTCCGGCG-3’ <Teste livre de Listagem de Seqüência>

SEQ ID NOs: 48 e 49 : iniciador PCR

Então, o gene de fusão, onde hEGF foi ligado a uma região compreendendo região 5' a montante e a região codificando 44 resíduos de aminoácidos N-terminais da proteína de superfície de célula de Corynebacterium glutamicum, foi amplificado realizando PCR de cruzamento com SEQ ID NO:46 e SEQ ID NO:49 usando a mistura, como o gabarito, contendo 1 μΐ de solução de reação PCR com a região compreendendo região 5' a montante e a região codificando 1 44 resíduos de aminoácidos N-terminais da proteína de superfície de célula de Corynebacterium glutamicum e 1 μΐ de solução de reação PCR contendo região de gene hEGF amplificado. O

fragmento de cerca de 0,9kb foi detectado por eletroforese de gel agarose. O fragmento foi recuperado de agarose gel usando EASY TRAP Ver. 2 (Takar4ashuzo Co. Ltd.). O DNA recuperado foi clivado por Kpnl e BamHI (Takar4ashuzo Co. Ltd.), purificado por sistema DNA Clean-UP (Promega), e inserido em sítio Kpnl-BamHI de plasmídeo pPK4 descrito em JP Kokai No. 9-322774 para obter pPKEGF. A seqüência de nucleotídeos do fragmento inserido foi determinada usando kit Dye Terminator Cycle Sequencing (PE

Applied Biosystems) e DNA Sequencer 373A (PE Applied Biosystems) para confirmar que o gene de fusão esperado tinha sido construído. (2) Construção de gene hEGF contendo a seqüência de sinal de Corynebacterium ammoniagenes ATCC6872 Os iniciadores mostrados em SEQ ID NO:24 e SEQ ID NO:50 foram sintetizados com referência à sequência de gene da proteína de superfície de célula (SlpA) [JP-Kokai No. 10-108675] de C. ammoniagenes e a região compreendendo a região 5' a montante contendo a região de promotor da proteína de superfície de célula (SlpA) gene e a região codificando seus 25 resíduos de aminoácidos N-terminais foi amplificada usando método PCR de DNA cromossômico de C. ammoniagenes preparado de acordo com o método descrito em Exemplo 8(1). Iniciador mostrado em SEQ ID NO:50 também continha a seqüência codificando os aminoácidos N- terminais de hEGF a fim de construir o gene de fusão fundido com hEGF. (SEQ ID NO:24) 5 ’ -GCCCAGAAGCCCAAAATTGAGATTT-3 ’ (SEQ ID NO:50) 5’ -AGGGCACTCAGAATCGGAATTTGCCGTTGCCA CAGGTGCGGCC-3 * <Teste livre de Listagem de Seqüência>

SEQ ID NOs: 24 e 50 : iniciador PCR

Os iniciadores indicados em SEQ ID NO:51 e SEQ ID NO:49 foram sintetizados a região codificando hEGF foi amplificada a partir de plasmídeo pT13SDhIL2-KS-hEGF(H3) (JP Kokai No. 64-2583) contendo a seqüência de genes hEGF. (SEQ ID NO:49) 5’-CGGCCACGATGCGTCCGGCG-3’ (SEQ ID NO:51) 5’-AATTCCGATTCTGAGTGCCCT-3’ <Teste livre de Listagem de Seqüência>

SEQ ID NOs: 49 e 51: iniciador PCR O gene de fusão, onde gene hEGF gene foi ligado à região 5' a montante e a região codificando os 25 resíduos de aminoácidos N-terminais da proteína de superfície de célula (SlpA) de C. ammoniagenes, foi amplificado realizando PCR de cruzamento com SEQ ID NO:49 e SEQ ID NO:24 usando a mistura, como os gabaritos, contendo 1 μΐ de solução PCR da região 5' a montante amplificada e a região codificando os 25 resíduos de aminoácidos N-terminais da proteína de superfície de célula (SlpA) de C. ammoniagenes e 1 μΐ de solução PCR para região de gene hEGF.

Além disso, os iniciadores indicados em SEQ ID NO:52 e SEQ ID NO:53 foram sintetizados, e a região 5' a montante da proteína correspondendo PS2 foi amplificada pelo método PCR usando o plasmídeo pKEGF obtido no Exemplo 8 (1) como o gabarito. Iniciador mostrado em SEQ ID NO:53 continha a seqüência 3'-terminal da região 5' a montante para a proteína correspondendo a PS2 e a região codificando os aminoácidos N- terminais da seqüência de sinal da proteína de superfície de célula (SlpA) de Corynebacterium ammoniagenes. (SEQ ID NO:52) 5’-GAATTCGAGCTCGGTACCCA-3’ (SEQ ID NO:53) 5’-AGCGATTTCATGCGTTTCATAGAGGCGAAGGC TCCTTGAA-3’ <Texto livre de Listagem de Seqüência>

SEQ ID NOs: 52 e 53 : iniciador PCR

Por outro lado, a região de gene hEGF contendo a seqüência de sinal da proteína de superfície de célula (SlpA) de Corynebacterium ammoniagenes foi amplificada usando os iniciadores indicados em SEQ ID

NO:54 e SEQ ID NO:49 preparados com base no gene de fusão hEGF compreendendo a seqüência de sinal e a região 5' a montante da proteína de superfície de célula (SlpA) de Corynebacterium ammoniagenes. Para PCR, polimerase de DNA Pyrobest (Takarashuzo Co. Ltd.) foi usada e a condição de reação seguiu o protocolo de instruções. (SEQ ID NO:49) 5’-CGGCCACGATGCGTCCGGCG-3’ (SEQ ID NO:54) 5’-ATGAAACGCATGAAATCGCTGGC-3’ <Teste livre de Listagem de Seqüência>

SEQ ID NOs: 49 e 54 : iniciador PCR O gene de fusão de hEGF, que foi ligado à região codificando os 25 resíduos de aminoácidos N-terminais da proteína de superfície de célula (SlpA) de Corynebacterium ammoniagenes e a região 5' a montante codificando a proteína correspondendo a PS2 de Corynebacterium glutamicum, foi então amplificado por realização de PCR de cruzamento com SEQ ID NO:52 e SEQ ID NO:49 usando a mistura compreendendo 1 μΐ de solução PCR da região 5' a montante amplificada para a proteína correspondendo a PS2 de Corynebacterium glutamicum e 1 μΐ de solução PCR da região amplificada do gene para hEGF tendo a seqüência de sinal da proteína de superfície de célula (SlpA) de Corynebacterium ammoniagenes.

Para PCR, polimerase de DNA Pyrobest (Takarashuzo Co. Ltd.) foi usada e a condição de reação seguiu o protocolo de instruções. O fragmento amplificado de cerca de 0,9kb foi detectado por eletroforese de gel agarose.

Este fragmento foi recuperado do gel agarose usando EASYTRAP Ver. 2 (Takarashuzo Co. Ltd.), digerido com Kpnl e BamHI (Takarashuzo Co. Ltd.) e foi purificado com sistema DNA Clean-UP (Promega). O fragmento foi inserido em sítio Kpnl-BamHI do plasmídeo pPK4 descrito em JP Kokai No. 9-322774 para obter pPSEGF. A seqüência de nucleotídeos do fragmento inserido foi determinada usando kit Dye Terminator Cycle Sequencing (PE

Applied Biosystems) e DNA Sequencer 373A (PE Applied Biosystems) para confirmar que o gene de fusão esperado tinha sido construído.

(3) Geração de cepas produzindo hEGF

Corynebacterium glutamicum ATCC13869 foi transformado com o pPSEGF plasmídeo de expressão de hEGF construído em (2) pelo método de electroporação para obter cepas resistentes a canamicina. As cepas obtidas foram cultivadas com agitação a 30°C durante 3 dias com meio líquido MMTG (60 g de glucose, 0,4 g de sulfato de magnésio heptaidratado, 30 g de sulfato de amônio, 1 g de dihidrogenofosfato de potássio, 0,01 g de sulfato ferroso heptaidratado, 0,01 g de sulfato de manganês (II) pentaidratado, 450 pg de cloridrato de tiamina, 450 pg de biotina, 0,15 g de DL-metionina, 50 g de carbonato de cálcio por litro de água destilada, ajustados a pH 7,5) contendo 25mg/ml de canamicina. As células foram removidas por centrifugação e 10μ1 do sobrenadante da cultura foram submetidos a SDS-PAGE. hEGF comercialmente disponível (PEPRO TECHEC LTD) foi simultaneamente submetido a eletroforese como um padrão, e coloração com azul Brilhante Coomassie (CBB) foi realizada. Os resultados mostraram que a banda foi detectada na posição correspondendo à mesma mobilidade que o padrão. Permaneceram poucas proteínas impuras no sobrenadante de cultura. (4) Determinação da quantidade de hEGF produzida pela cepa produzindo hEGF abrigando o plasmídeo pPSEGF O sobrenadante de cultura de cepa produzindo hEGF foi analisado com cohmr HPLC (YMC-AP203Ca300A.C18, tamanho de partícula 5 pm, diâmetro 4,6mm x comprimento 250mm), usando 0,1% TFA/24% acetonitrila, 0,l%TFA/44 acetonitrila como tampões, 1%/min.

gradiente linear, taxa de fluxo 1,0 ml/min e detecção a 280nm. A quantificação foi realizada por comparação da área de pico com a área observada quando o padrão hEGF foi analisado, que revelou o valor de cerca de lOOmg/L. (5) Determinação da atividade biológica de hEGF secretado por cepa produzindo hEGF abrigando o plasmídeo pPSEGF A atividade de EGF no sobrenadante de cultura da cepa produzindo hEGF foi determinada. Células MCF-7 (A.V. Krishman, Journal de Bone e research, 6, 1099-1107, 1991) foram colocadas em uma placa de 96 reservatórios em uma densidade de célula inicial de 1 x 104 por reservatórios e a diluição em série de 2 vezes do sobrenadante de cultura de cepa produzindo EGF foi adicionada aos reservatórios. A absorção de timidina foi determinada após 72 horas. A atividade foi 1,4 x 109 U/ml como calculado por comparado com o valor de hEGF padrão, 107U/mg. (6) Análise de seqüência N-terminal de aminoácidos de hEGF secretado pela cepa produzindo hEGF abrigando o plasmídeo pPSEGF

120μ1 do sobrenadante de cultura de cepa produzindo hEGF foram aplicados a coluna HPLC, e isolados usando a condição descrita para quantificação por HPLC. O pico correspondendo com a posição de eluição do hEGF padrão foi coletado. A determinação foi realizada usando sequenciador de aminoácidos em fase gasosa PPSQ-10 (Shimadzu Co.). Os resultados foram : Asn para o primeiro resíduo; Ser para o segundo resíduo; Asp para o terceiro resíduo; Ser para o quarto resíduo, respectivamente do N-terminal. Os resultados correspondem à seqüência N-terminal de aminoácidos de hEGF indicada em SEQID NO:55. (7) Determinação do peso molecular de hEGF secretado pela cepa produzindo hEGF abrigando o plasmídeo pPSEGF

120μ1 do sobrenadante de cultura de cepa produzindo hEGF foram aplicados a uma coluna HPLC e isolados usando a condição descrita em (4). O pico de hEGF eluído foi coletado. A amostra foi aplicada novamente ao mesmo HPLC para ffacionamento, que confirmou que a amostra exibiu um pico em HPLC. A amostra foi submetida a espectroscopia de massa. A determinação foi realizada usando MALDI-TOFMS (sigla para Matrix assisted laser deionization - time de flight mass spectrometer) MALDI IV (Shimadzu Co.). A média das duas medidas foi 6176. O resultado estava dentro do limite de erro de valor teórico 6217 que tinha sido calculado para o peso molecular de hEGF, considerando que se tem três ligações S-S na molécula. Assim, hEGF produzido pela cepa produzindo EGF preparada pelo método descrito foi confirmado como tendo a seqüência de aminoácidos e estrutura esperados.

Exemplo 9: Construção de Corvnebacterium zlutamicum AJ12036 melhorada na secreção de proteínas heterólogas. construção de cena de ruptura de genes de proteína de superfície de células. (PS2) derivada de AJ12036. e a estimativa da produção de proteína heteróloga usando estas cepas mutantes (1) Produção de cepa de ruptura de genes de proteína de superfície de células, (PS2) de Corynebacterium glutamicum AJ12036 Cepa resistentes a estreptomicina (Sm) AJ 12036 foi criada a partir de Corynebacterium glutamicum ATCC13869 e AJ12036 foi usado como um hospedeiro para a recombinação de genes com Corynebacterium glutamicum (Patente US. 4,822,738). Corynebacterium glutamicum (anteriormente, Brevibacterium lactofermentum) AJ 12036 foi depositado junto ao National Institute of Microbial Technology, Agency of Industrial Science and Technology (agora, uma Agência Administrativa Independente, National Institute of Advance Industrial Science and Technology, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566 Japão) em 26 de março de 1984, como FERM BP-734.

Desde que foi revelado que a cepa AJ 12036 levemente secretou a proteína de superfície de célula (PS2) no meio de cultura, supõe-se que a eficiência de secreção de proteínas pode ser ainda melhorada por condução da ruptura do gene que se tomaria completamente defeituosa na produção de PS2. Assim, a cepa defeituosa em gene PS2 completa foi construída usando recombinação homóloga, como descrito abaixo.

Os iniciadores descritos abaixo foram sintetizados com referência ao DNA cromossômico de Corynebacterium glutamicum ATCC13869 preparado de acordo com o método de Saito e Miura [Biochim.

Biophys. Acta., 72, 619 (1963)] e PCR foi realizado com a combinação de SEQ ID NOs:56 e 57, e SEQ ID NOs:58 e 59. A seqüência de gene PS de Corynebacterium glutamicum ATCC13869 foi descrita em Patente No. 5. 547. 864, e a parte da região de codificação e sua seqüência de genes 5' a montante foram descritas em SEQ ID NO:4. PCR-cruzamento com amplificado cada fragmento e a combinação dos iniciadores de SEQ ID NO: 56 e SEQ ID NO: 59 foi conduzido para amplificar o fragmento APS2 onde a região de promotor e a região N-terminal da região de codificação de gene PS2 foram deletados do gene PS2. Este fragmento foi clonado em sítio Smal de pUC19 para construir pUAPS2. pUAPS2 foi digerido com Kpnl e Xbal para excisar fragmento APS2 e pHSAPS2 foi construído por inserção do fragmento no sítio Kpnl- Xbal de pHS4 (Patente US No. 5.616.489) que é um vetor de plasmídeo sensível à temperatura derivado de pHM1519. Escherichia coli AJ12570 transformado com p plasmídeo pHS4 foi depositado junto ao National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (agora, uma Agência Administrativa Independente, National Institute of Advance Industrial Science and Technology, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566 Japão) em 11 de outubro de 1990, como FERM BP-3523. (SEQID NO:56) 5’-act ggg agg cta tct cca tt-3’ (SEQ ID NO:57) 5’-ate gat ctg ate acg tta ca-3’ (SEQ ID NO:58) 5’-tgt aac gtg ate aga tcg att cac tgg tcg aca ccg ttg a-3’ (SEQ ID NO:59) 5’-acg gaa gct acc ttc gag gt-3’ <Texto livre de Listagem de Seqüência>

SEQ ID NO:56 to SEQ ID NO:59 : iniciador PCR PHSAPS2 foi introduzido em AJ12036 por eletroporação, e a cepa defeituosa em gene PS2 completa foi obtida por recombinação homóloga como descrito na patente JP No. 2763054. Esta cepa foi designada como cepa YDK010. (2) Estimativa de produção secretória de proteínas heterólogas usando Corynebacterium glutamicum AJ12036 e cepa de ruptura de gene (PS2) de proteína de superfície de célula derivada de AJ12036 O plasmídeo de expressão de protransglutaminase pPKSPTGl, que foi descrito no Exemplo 4 (2), foi introduzido em cepas AJ12036 e YDK010 para obter os transformantes. Estes transformantes e, cepa de controle obtida por introdução de pPKSPTGl em Corynebacterium glutamicum ATCC14869 de tipo selvagem , foram usados para estimar a quantidade de produção secretória.

Similarmente, a quantidade de produção secretória foi estimada para plasmídeo de expressão secretória SAMP45, para plasmídeos de expressão secretória svPEP pVSSSPl e para plasmídeo de expressão secretória hEGF pPSEGF após obter os transformantes de cepa AJ12036 e cepa YDK010, respectivamente.

As cepas cultivadas durante a noite em meio agar CM2S compreendendo 25 pg/1 de canamicina a 30°C foram inoculadas em tubos grandes contendo 4ml de meio MMTG (Glucose 60g/L, MgS04.7H20 lg/L, MnS04.4H20 lg/L, FeS04.7H20 lg/L, (NH4)2S04 30g/L, KH2P04 l,5g/L, VB1 . HC1 450 pg/L, Biotina 450 pg/L, DL-Met 0,15g/L, pH 7,5) suplementado com 5% CaC03 e 25 pg/ml canamicina, durante 3 dias a 30°C.

Tabela 3. A quantidade de protransglutaminase produzida extracelularmente pelas cepas mutantes Tabela 4. A quantidade de SAMP45 extracelularmente produzido pelas cepas mutantes Tabela 5. A quantidade de svPEP extracelularmente produzido pelas cepas mutantes Tabela 6. A quantidade de hEGF extracelularmente produzido pelas cepas mutantes Como se nota da tabela 3 à tabela 6, a melhora notável na quantidade na produção de SAMP45, svPEP e hEGF por mudança do hospedeiro do tipo selvagem para a cepa resistente a estreptomicina AJ12036.

No entanto, somente uma leve melhora na quantidade de produção secretória foi observada por deleção completa do gene de proteína de superfície de células (PS2) da cepa AJ12036. O efeito negativo causado pela inibição competitiva de secreção de PS2 sobre a secreção de protransglutaminase ou hEGF não foi observada de modo significante nestes casos. No entanto, a secreção de PS2 não foi observada de todo na cepa defeituosa em gene PS2 completo, que contribuiu para a redução de proteínas contaminadas indesejadas no meio de cultura. Isto é um mérito durante a purificação de protransglutaminase ou hEGF.

Exemplo 10: Fatores efetivos no cultivo sobre a secreção de protransglutaminase O transformante obtido por transformação de cepa de Corinebacíerium glutamicum YDK010 com o pPKSPTGl previamente descrito foi usado para estimar a condição de cultura para a produção secretória de protransglutaminase.

A cepa cultivada durante a noite em meio agar CM2S compreendendo 25mg/l de canamicina a 30°C foi inoculada em um frasco de 500ml Sakaguchi contendo 20ml de meio líquido CM2S, e foi cultivada durante a noite a 30°C. Esta foi usada para cultura de semente.

Os efeitos de adição de CaCl2 foram estimados em jarra tipo S contendo meio líquido MMTG (Glucose 60g/L, MgSC>4 · 7H20 lg/L, MnS04 . 4H20 lg/L, FeS04.7H20 lg/L, (NH4)2S04 30g/L, KH2P04 l,5g/L, VB1 . HC1 450 pg/L, Biotina 450 pg/L, DL-Met 0,15g/L, pH 7,5) como o meio basal suplementado com 25 pg/ml canamicina. 300ml de meio foram colocados no frasco. Uma quantidade de semeadura foi de 5% (15ml) e a concentração de oxigênio dissolvido foi controlada a 3% ou menos. A cultura foi realizada a 30°C durante 3 dias.

Após o cultivo, lOpl do sobrenadante de cultura foram submetidos a SDS-PAGE e Western blotting foi realizado usando o anticorpo anti-transglutaminase acima descrito, de acordo com o método convencional.

Os resultados mostraram o efeito de adição de cálcio em que um aumento de cerca de 1,3 a 2 vezes em quantidade de secreção foi observado em grupos de adição de CaCl2 comparado com o grupo sem adição.

Tabela 7. Efeito de íon cálcio em produção secretória de protransglutaminase As condições para aeração e agitação foram ainda estudadas usando o meio MMTG contendo 0,2g/L CaCl2, que revelou que os melhores resultados foram obtidos por controle da concentração de oxigênio dissolvido a 3%, que é o limite de medida, ou menor (tabela 8).

Tabela 8. Efeito da concentração de oxigênio dissolvido sobre a produção secretória de protransglutaminase De acordo com a presente invenção, proteínas utilizáveis, por exemplo, proteínas heterólogas como transglutaminase ou fator de crescimento epidérmico humano, podem ser produzidas em uma grande quantidade e podem ser secretadas extracelularmente de modo eficiente (secreto-produção) por bactérias corineformes. A proteína produzida de acordo com os métodos da presente invenção é secretada no meio de cultura, que toma possível recuperar facilmente a proteína do meio de cultura em uma larga escala usando métodos conhecidos apropriados.

Este anexo apresenta o código de controle da listagem de sequências biológicas de que trata a Resolução INPI 228 de 11/11/2009: Código de Controle Campo 1 Campo 2 Outras Informações: - Nome do Arquivo: 080846e006.txt - Data de Geração do Código: 02-01-2014 - Hora de Geração do Código: 07:48:40 - Código de Controle: - Campo 1: AEB66951BFB84B7C

- Campo 2: 71C2C86DC4B21C8B

Claims

1. Método para produzir uma proteína heteróloga em bactérias corineformes tendo uma construção de expressão genética em que uma sequência de ácido nucleico codificando uma região de peptídeo sinal está ligada a uma sequência de ácido nucleico codificando uma proteína heteróloga, em que esta construção está operacional mente ligada a uma sequência de promotor que funciona em uma bactéria corineforme, permitindo a produção e a recuperação da referida proteína heteróloga, caracterizado pela referida bactéria corineforme ser a Corynebacterium ghtíamkum AJ12036 (FERM BP-734) ou um mutante derivado de AJ12036 (FERM BP-734) no qual o gene PS2 foi deletado.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o peptídeo sinal é um peptídeo sinal de uma proteína de superfície celular de uma bactéria corineforme,

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o peptídeo sinal é um peptídeo sinal de uma proteína de superfície celular de Corynebacterium glufamicum,

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o peptídeo sinal tem a sequência de aminoãcido de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2,

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o peptídeo sinal é um peptídeo sinal de uma proteína de superfície celular derivado de Corynebacterium ammoniagenes.

6. Método de acordo com, a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o peptídeo sinal tem a sequência dc ammoácidos dc SEQ ID NO: 3.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a cultura da bactéria corineforme mutante é conduzida em um meio contendo 2,25 mM ou mais de íon cálcio.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a cultura da bactéria corineforme mutante é conduzida controlando a concentração de oxigênio dissolvido a 3% ou menos.