CN1237148C

CN1237148C - α－1，4－葡聚糖裂解酶在制备1，5－D－脱水果糖中的应用

Info

Publication number: CN1237148C
Application number: CNB031452663A
Authority: CN
Inventors: 于书坤; K·博伊森; K·M·卡拉格赫; M·博伊科; J·尼尔森; J·马库森; T·M·I·E·克里斯藤森
Original assignee: Danisco AS
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 1993-10-15
Filing date: 1994-10-15
Publication date: 2006-01-18
Anticipated expiration: 2014-10-15
Also published as: GB2296717B; JP4217221B2; CA2174116C; GB9605417D0; EP0723593B1; NZ275423A; ATE305518T1; JP2005133102A; DE69434497T2; WO1995010616A3; JPH09505988A; AU695355B2; RU2140988C1; CN1510106A; BR9407838A; CN1137294A; CN1192104C; CA2174116A1; DE69434497D1; AU7937994A

Abstract

本发明描述了制备糖1，5-D-脱水果糖的方法。该方法包含用α-1，4-葡聚糖裂解酶处理α-1 ， 4-葡聚糖，其中所用的酶基本上是纯化形式。在优选的实施方案中，如果葡聚糖除α-1，4-键外，还含有不同于该键的其它键，则将α-1，4-葡聚糖裂解酶与能打开这些其它键的合适试剂结合使用。

Description

α-1，4-葡聚糖裂解酶在制备 1，5-D-脱水果糖中的应用

本申请是1994年10月15日提交的，申请号为94194430.1，发明名称为“α-1，4-葡聚糖裂解酶在制备1，5-D-脱水果糖中的应用”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及-种酶，特别是α-1，4-葡聚糖裂解酶(“GL”)在从以α-1，4-葡聚糖为基础的底物中制备1，5-D-脱水果糖(“AF”)中的应用。

本发明还涉及糖，特别是1，5-D-脱水果糖(“AF”)作为抗氧化剂，特别是作为食料和饮料的抗氧化剂的应用。

本发明涉及1，5-D-脱水果糖(“AF”)作为增甜剂，特别是作为食料和饮料，优选人类食料和饮料中的增甜剂的应用。

背景技术

FR-A-2617502和Baute等在Phytochemistry[1988]Vol.27No.11 pp3401-3403中报道了以明显的酶促反应在普通羊肚菌中生产AF。AF的产量相当低。尽管提到了可能的酶促反应，但两篇文献都没有提供任何酶的氨基酸序列资料，更不用说任何核苷酸序列资料。这些文献认为AF可能是制备抗生素吡喃酮羟基羟甲基吡喃酮(microthecin)的前体。

Yu等在Biophysica Acta([1993]Vol 1156 pp313-320)中报道了从红海藻中制备GL并用它降解α-1，4-葡聚糖以生产AF。AF的产量相当低。尽管提到了酶GL，但该文献未提供任何该酶的氨基酸序列，更不用说编码该酶的任何核苷酸序列。该文献还认为GL的来源就是藻类。

典型的以α-1，4-葡聚糖为基础的底物是淀粉。现在已发现淀粉在工业上的广泛用途主要是因为它们是廉价的天然物质。

淀粉降低酶可分成不同类。淀粉水解酶产生葡萄糖或葡萄糖寡聚物。第二组淀粉降解酶是磷酸化酶，它在无机磷酸盐存在的条件下从淀粉产生葡萄糖-1-磷酸。

AF也可经化学合成(见Lichtenthaler在Tetrahedron LettersVol 22 pp1429-1432中的工作)。然而，该化学合成涉及许多步骤而且并不产生大量的AF。

因此生产AF的化学合成途径非常昂贵。

于是需要一种以廉价和简便的方式且还能大量产生AF的方式制备AF的方法。

另外，通常用抗氧化剂抑制诸如食品的物质具有有害影响的氧。两种通常使用的抗氧化剂是GRINDOX 142和GRINDOX 1029。这些抗氧化剂含有许多成份且生产相当昂贵。

因此需要具有简单和廉价形式的抗氧化剂。

此外，在食品和饮料制备中通常使用增甜剂。然而许多增甜剂制备昂贵且复杂。

因此，需要具有简单和廉价形式的增甜剂。

发明内容

根据本发明，提供了一种制备糖1，5-D脱水果糖的方法，包括用酶α-1，4-葡聚糖裂解酶处理α-1，4-葡聚糖，其特征在于该酶以基本纯的形式使用。

如果葡聚糖除了α-1，4-键外还含有不同于该键的其它键时，优选的是将α-1，4-葡聚糖裂解酶与能打开这类其它键的合适试剂(如水解酶，优选葡聚糖水解酶)结合使用。

优选地，葡聚糖是淀粉或以化学或酶促法制备的淀粉片段。如果以酶促法制备，该反应可在加入α-1，4-葡聚糖裂解酶前进行或可同时进行该反应。合适的试剂可以是辅助酶。优选的辅助酶是α-或β-淀粉酶。优选使用脱支酶。更优选的辅助酶是至少一种支链淀粉酶(pullanase)或异淀粉酶(isoamylase)。

优选地，α-1，4-葡聚糖裂解酶结合到支持物上，或更优选的是以溶解的形式。

优选地，该酶从真菌，优选Morchella costata，或普通羊肚菌，或从真菌感染的藻类，优选Gracilariopsis lemaneiformis或仅从藻类优选的从Gracilariopsis lemaneiformis中分离。

优选地，使用未被该酶降解的凝胶从真菌或从真菌感染的藻类或仅从藻类中分离和/或进一步纯化该酶。

优选地，该凝胶以糊精或其衍生物为基础。

优选地，该凝胶是环糊精，更优选β一环糊精。

优选地，该酶包含氨基酸序列SEQ.ID.No.1的氨基酸序列SEQ.ID.No.2或氨基酸序列SEQ.ID.No.5或氨基酸序列SEQ.ID.No.6，或其任何变异体。

在另外优选的实施方案中，该酶包含在SEQ.ID.No.s9-11中所示的任何一个氨基酸序列或其任何变异体。

术语“其任何变异体”是指在所得的酶具有裂解酶活性的前提下对该序列进行一个氨基酸的任意取代，改变，修饰，置换，缺失或增加。

优选的是该酶与支链淀粉或糊精结合使用。

优选的是从编码该酶的核苷酸序列中表达来获得该酶。

优选的是所述核苷酸序列是DNA序列。

优选的是所述DNA序列包含与SEQ.ID.No.3或SEQ.ID.No.4或SEQ.ID.No.7或SEQ.ID.No.8中的任何序列相同，或互补，或基本上同源，或含任何合适的密码子取代的序列。

在另外的优选的实施方案中，DNA序列包含与SEQ.ID.No.s12-14所示的序列相同，或互补，或基本上同源，或含任何合适的密码子取代的任何一个序列。

术语“基本上同源”包括有关结构和/或核苷酸成份和/或生物学活性的同源性。

术语“含任何合适的密码子取代”包含在所得的酶具有裂解酶活性的前提下用编码相同氨基酸的另一密码子进行任何密码子置换或取代或对其进行的任何增加或缺失。

换句话说，本发明还包括修饰的DNA序列，其中至少一个核苷酸缺失，取代或修饰或其中至少插入一个增加的核苷酸以便编码具有葡聚糖裂解酶活性的多肽，优选具有增加的裂解酶活性。

优选使用高浓度-例如最高至25％溶液浓度的淀粉。

优选在缓冲液存在的条件用该酶处理底物。

优选在基本上纯的水存在的条件下用该酶处理底物。

优选在不存在辅助因子的条件下用该酶处理底物。

根据本发明，还提供了制备糖1，5-D-脱水果糖的方法，包括用酶α-1，4-葡聚糖裂解酶处理α-1，4-葡聚糖，其特征在于该酶含有氨基酸序列SEQ.ID.No.1或氨基酸序列SEQ.ID.No.2或氨基酸序列SEQ.ID.No.5或氨基酸序列SEQ.ID.No.6，或氨基酸序列SEQ.ID.No.s9-11中的任何一个序列，或其任何变异体。

根据本发明还提供了以本发明的方法制备的糖1，5-D-脱水果糖。

以¹³C NMR证实和表征了以本方法制备的AF。

本方法的-个关键的优势是可以比以前大得多的数量制备糖1，5-D-脱水果糖且该方法比已知方法相对更简便和更廉价。例如现在该糖的制备量可以是例如大于100g，如500g，与此相比，背景技术的方法仅生产更少的量，如微克量。

GL可催化的典型反应可概括如下：

1).支链淀粉→AF+有限糊精

2).直链淀粉→AF+有限糊精

3).糊精→AF+葡萄糖

在反应1)中，两种产物的比率取决于支链淀粉的结构或α-1，6-糖苷键在支链淀粉分子中的分布。

在反应2)和3)中，产物比率取决于底物聚合度(DP)数值。在反应3中，AF与葡萄糖之间的比率取决于DP。例如，如果糊精含10个葡萄糖单元，则AF∶葡萄糖的比率是9∶1。

本发明的另一优势是可基本上降低含不同于α-1，4-键之键的葡聚糖，而以前仅达到部分降解。1，5-D-脱水果糖前体的基本上降解是导致增加1，5-D-脱水果糖产量的因素之一。

其它优选是，AF是天然存在的物质，因此从人类的角度看具有潜力。例如，它可由AF脱水酶转变成抗生素羟基羟甲基吡喃酮。已知抗生素在食品生物防腐中的用途，它是食品技术的重要方面。然而，到现在为止，AF及还有羟基羟甲基吡喃酮的制备具有许多缺陷。例如仅可少量生产。另外，方法昂贵。

本发明通过提供AF及还有其它产品如羟基羟甲基吡喃酮的更大量生产和更廉价的生产克服了这些问题。以这一方式可制备克到千克量的AF。

进一步的优势是裂解酶在4℃至少稳定1年并能冻干而不损失活性。

另一优势是裂解酶直接从淀粉产生AF而不需要任何辅助因子存在。

另一优势是酶可在纯水中使用。这一结果是非常惊人的。

根据本发明裂解酶的简单特性，可期望AF的生产成本可与葡萄糖的成本相提并论。本发明的裂解酶不必需要一般非常昂贵的任何辅助因子存在，这一点特别具有优势。

一般来说，α-1，4-葡聚糖可用作该酶的底物。

可使用淀粉作为优选的底物。

在优选的方法中，可使用可溶的或胺化的淀粉或淀粉水解产物。可经过化学或酶促方法制备淀粉水解产物。

如果使用部分降解淀粉的酶，该酶可在加入裂解酶或任何其它额外的淀粉降解试剂，如葡聚糖水解酶之前加入，它们也可同时加入。

裂解酶可将葡聚糖转变为AF。该酶可从非还原端附着到底物上并仅仅不转化还原糖。可用本文已描述的一些已知方法去掉残留的葡萄糖。

使用本文描述的反应可大量生产纯的AF。

在一个实施方案中，经过在β-环糊精Sepharose上进行亲和色谱，在Mono Q HR 5/5上进行离子交换色谱和在Superose 12柱上进行凝胶过滤从真菌感染的藻类(如Gracilariopsis lemaneiformis)纯化α-1，4-葡聚糖裂解酶。纯化的酶从α-1，4-葡聚糖中产生1，5-脱水-D-果糖。

从真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis中分离的真菌裂解酶的特征在于当使用支链淀粉时，最适pH为3.5-7.5，最适温度为50℃，pI为3.9。

在另一实施方案中，经过在β-环糊精Sepharose上进行亲和色谱，在Mono Q HR 5/5上进行离子交换色谱和在Superose 12柱上进行凝胶过滤从真菌Morchella costata中纯化α-1，4-葡聚糖裂解酶。纯化的酶从α-1，4-葡聚糖产生1，5-脱水-D-果糖。

经过在pH梯度为3至9的凝胶上进行等电聚焦测定真菌裂解酶显示pI大约为5.4。经过在8-25％梯度凝胶上进行SDS-PAGE测定分子量为110kDa。酶表现出pH最佳范围为pH5-7。发现最适温度在30-45℃之间。

在另一实施方案中，经过在β-环糊精Sepharose上进行亲和色谱，在Mono Q HR 5/5上进行离子交换色谱和在Superose 12柱上进行凝胶过滤从普通羊肚菌真菌中纯化α-1，4-葡聚糖裂解酶。纯化的酶从α-1，4-葡聚糖中产生1，5-脱水-D-果糖。

在另一实施方案中，经过在β-环糊精Sepharose上进行亲和色谱，在Mono Q HR 5/5上进行离子交换色谱和在Superose 12柱上进行凝胶过滤从藻类如Gracilariopsis lemaneiformis纯化α-1，4-葡聚糖裂解酶。纯化的酶从α-1，4-葡聚糖中产生1，5-脱水-D-果糖。

对于根据本发明的几个GL酶，裂解酶催化反应的典型pH和温度最适值如下：

GL 来源	最适pH	最适pH范围	最适温度
GL 来源	最适pH	最适pH范围	最适温度	M.costata	6.5	5.5-7.5	37℃；40℃^a
普通羊肚菌	6.4	5.9-7.6	43℃；48℃^a	M.costata	6.5	5.5-7.5	37℃；40℃^a
普通羊肚菌	6.4	5.9-7.6	43℃；48℃^a	真菌感染的Gracilariopsislemaneiformis	3.8	3.7-4.1	40℃；45℃^a

^a使用糖原作底物测定的参数；使用支链淀粉作底物测定其它参数。

本发明的酶将直链淀粉和支链淀粉转变成1，5-脱水果糖。

在试验的麦芽糖类中，发现裂解酶对麦芽糖表现出较低活性，对麦芽三糖和麦芽七糖活性更低，对麦芽四糖和麦芽五糖活性最高。在这些麦芽糖中，酶对高达10mg/ml的浓度不表现底物抑制。

已测序了各个优选来源的酶并随后提供了其氨基酸序列。后面还提供了编码该酶的DNA序列。

因此，本发明描述了一种新的淀粉降低酶，称为新的α-1，4一葡聚糖裂解酶。这是首次纯化和表征的一种酶。

如上所述，本发明还涉及AF的一些特殊用途。

特别是本发明涉及1，5-D-脱水果糖(“AF”)作为一种抗氧化剂，特别是作为食品和饮料的抗氧化剂的应用。

因此根据本发明，提供了1，5-D-脱水果糖(AF)作为抗氧化剂的应用。

优选AF作为或用于食用物质。

优选AF用于或作为食品或饮料。

优选AF与其它抗氧化剂结合使用。

优选根据本发明的方法制备AF。

AF用作抗氧化剂的主要优势是它是天然产物，不可代谢，易于生产，水溶性且一般无毒性。

因此在优选的实施方案中本发明涉及纯AF的酶促制备法，纯的AF作为有吸引力的水溶性抗氧化剂可用于食品和非食品用途。在本申请的实施例中给出了在食品配方中AF作为抗氧化剂的应用。

在所附实施例中可见AF可与已知高质量的商品食物抗氧化剂相比。

非食品例子包括在聚合物化学中用作聚合物合成过程中的氧清除剂。另外，AF还可用于生物可降解性塑料的合成。

实验表明，AF可作为有效的还原剂(抗氧化剂)，因为它易于将3，5-二硝基水杨酸还原成3-氨基-5-硝基水杨酸。

AF是天然存在的物质，因此它在用作可接受的抗氧化剂时有巨大潜力。AF也可经AF脱水酶转变成抗生素羟基羟甲基吡喃酮。已知抗生素在食品生物保护中的应用，它是食品生物技术的一个重要方面。

另一方面，本发明还涉及1，5-D-脱水果糖作为增甜剂的应用，特别是作为食品和饮料优选人类食品和饮料的增甜剂。

因此根据本发明的该方面提供了1，5-D-脱水果糖作为增甜剂的应用。

优选AF用作或用于人类食品或饮料。

可以任意所需的量，如5％的溶液或100mg/kg到500mg/kg使用AF。

使用AF作为增甜剂的优势在于它是天然产物，一般无毒性，水溶性，不可代谢并易于生产。

因此本发明还涉及AF作为增甜剂的新应用。

优选根据本发明的方法制备AF。

本发明的其它方面包括：

一种制备α-1，4-葡聚糖裂解酶(GL)的方法，包括从真菌感染的藻类，真菌或藻类本身中分离该酶；

一种包含氨基酸序列SEQ.ID.No.1或SEQ.ID.No.2或SEQ.ID.No.5或SEQ.ID.No.6或其任何变异体的酶；

一种包含氨基酸序列SEQ.ID.No.9或SEQ.ID.No.10或SEQ.ID.No.11或其任何变异体的酶；

一种编码α-1，4-葡聚糖裂解酶的核苷酸序列，其中优选该序列不在其天然环境中(即，它不形成能表达该酶的细胞生物体的部分天然基因组)，其中优选该核苷酸序列是DNA序列；

一种核苷酸序列，其中的DNA序列包含至少一种与SEQ.ID.No.3或SEQ.ID.No.4或SEQ.ID.No.7或SEQ.ID.No.8中的任何一种相同，或互补，或基本同源，或含任何合适的密码子取代的序列，其中优选该序列以分离的形式存在。

一种核苷酸序列，其中DNA序列包含至少一种与SEQ.ID.No.12或SEQ.ID.No.13或SEQ.ID.No.14中任何一种相同，或互补，或基本同源，或含任何合适的密码子取代的序列，其中优选该序列是分离的形式。

β-环糊精在纯化一种酶，优选GL中的应用。

本发明其它优选的实施方案包括下列任意一个：作为导入本文所述的DNA序列的结果而具有产生AF之能力的转化宿主生物：这种转化的宿主生物是一种微生物，其中优选该宿主生物选自细菌，霉菌，真菌和酵母；优选该宿主生物选自糖酵母属，克鲁维氏酵母属，曲霉属，木霉属，汉逊氏酵母属，毕赤氏酵母属，芽孢杆菌属，链霉菌属，埃希氏杆菌属，如米曲霉，啤酒糖酵母，枯草芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，大肠杆菌；一种制备1，5-D-脱水果糖的方法，包括使用表达编码α-1，4-葡聚糖裂解酶的核苷酸序列的转化宿主生物，其中优选该核苷酸序列是DNA序列，其中优选该DNA序列是上文描述的序列之一；一种掺入了上文所述的核苷酸序列的载体，其中优选该载体是一种复制型载体，其中优选该载体是含有启动子序列下游之核苷酸序列的表达载体，优选该裁体包含一种标记(如抗性标记)；用这种载体转化的细胞生物体或细胞系。一种生产α-1，4-葡聚糖裂解酶或编码该酶的任意核苷酸序列或其部分之产物的方法，包含培养用该载体转染的生物体(或细胞系的细胞)并回收该产物。

特别是在表达系统中，优选分泌该酶以简化其纯化。为做到这点，将编码成熟酶的DNA与来自选定生物的信号序列启动子和终止子融合。

为了在黑色曲霉中表达，将gpdA(来自构巢曲霉的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因)启动子和信号序列与编码成熟的裂解酶DNA 5′端融合。来自黑色曲霉trpC基因的终止子序列放到该基因的3′端(Punt，P.J.et al.1991-(1991)：J.Biotech.17，19-34)。将该构建体插入到含有大肠杆菌复制起点和选择起点和黑色曲霉选择标记的载体中。黑色曲霉选择标记的例子是amdS基因，argB基因，pyrG基因，hygB基因，BmlR基因，它们都曾用于转化子的选择。将该质粒转化进黑色曲霉并以转化子的培养基中回收成熟的裂解酶。最终该构建体可转化进蛋白酶缺陷型菌株中以减少培养基中该裂解酶的蛋白裂解性降解(Archer D.B.et al.1992-Biotechnol.Lett.14，357-362)。

除了黑色曲霉作宿主之外，可使用已知其好表达系统的其它工业重要微生物，如米曲霉，曲霉属种类，木霉属种类，啤酒糖酵母，克鲁维氏酵母属种类，汉逊氏酵母属种类，毕赤氏酵母属种类，枯草芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，芽孢杆菌属种类，链霉属种类或大肠杆菌。

根据布达佩斯条约于1994年6月20日将下列样品保藏于认可的保藏单位(The National Collections of Industrial andMarine Bacteria Limited at 23 St.Machar Drive，Aberdeen，Scotland，United Kingdom)：

含质粒pGL1的大肠杆菌(NCIMB 40652)-[参考DH5α-pGL1]；

和含质粒pGL2的大肠杆菌(NCIMB 40653)-[参考DH5α-pGL2]。

下列样品根据布达佩斯条约于1994年10月11日作为保藏品被认可的保藏单位(The Culture Collection of Algae andProtozoa(CCAP)at Dunstaffnage Marine Laboratory PO Box 3，Oban，Argyll，Scotland，United Kingdom，PA34 4AD)接受：真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis(CCAP 1373/1)-[参考GLQ-1(青岛)]。

因此，本发明高度优选的实施方案包括可从存在于质粒中的GL编码序列表达获得的GL酶.该质粒是保藏物NCIMB 40652或保藏物NCIMB 40653的主体；可从作为保藏物CCAP 1373/1主体的真菌感染的藻类中获得的GL酶。

根据布达佩斯条约，下列样品于1994年10月3日保藏在认可的保藏单位(The National Collections of Industrial andMarine Bacteria Limited(NCIMB)at 23St.Machar Drive，Aberdeen，Scotland，United Kingdom，AB 2 1RY)：含质粒pMC的大肠杆菌(NCIMB 40687)-[参考DH5α-pMC]：含质粒pMV1的大肠杆菌(NCIMB 40688)-[参考DH5α-pMV1]；含质粒pMV2的大肠杆菌(NCINB 40689)-[参考DH5α-pMV2]。

质粒pMC是含从Morchella costata构建的基因组文库中分离的4.1kb片段的pBluescript IIKS。该片段含编码α-1，4-葡聚糖裂解酶的基因。

质粒pMV1是含从普通羊肚菌构建的基因组文库中分离的2.45kb片段的pBluescript IIKS。该片段含编码α-1，4-葡聚糖裂解酶的基因5′端。

质粒MV2是含从普通羊肚菌构建的基因组文库中分离的3.1kb片段的pPUC19。该片段含编码α-1，4-葡聚糖裂解酶的基因3′端。

在下面讨论中，MC代表Morchella costata，MV代表普通羊肚菌。

如上所述，普通羊肚菌的GL编码序列包含在两个质粒中。参考图15，pMV1含从位置454到位置2902的核苷酸，pMV2含从位置2897(包括该位置)下游的核苷酸。参考图12和13，为了连接编码序列，可用限制性酶EcoRI和BamHI消化pMV2，然后将有关片段插入用限制性酶EcoRI和BamHI消化的pMV1中。

因此本发明高度优选的实施方案包括可从存在于质粒中的GL编码序列的表达获得的GL酶，该质粒是保藏物NCIMB 40689或保藏物NCIMB 40688和保藏物NCIMB 40689的主体。

根据布达佩斯条约，下列样品于1994年10月11日被认可的保藏单位(The Culture Collection of Algae and Protozoa(CCAP)at Dunstaffnage Marine Laboratory PO Box 3，Oban，Argyll，Scotland.United Kingdom，PA34 4AD)作为保藏物接受：

真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis(CCAP 1373/2)-[参考GLSC-1(California)]。

因此本发明高度优选的实施方案包括可从作为保藏品CCAP 1373/2主体的藻类获得的GL酶。

本发明将仅以实施例的方式进行描述。

附图说明

在下面实施例中，以附图作参考，其中：

图1显示了染色的真菌感染的藻类；

图2显示了染色的真菌感染的藻类；

图3显示了真菌菌丝切片；

图4显示了真菌感染的藻类切片；

图5显示了真菌感染的藻类切片；

图6显示了pGL1的质粒图谱；

图7显示了pGL2的质粒图谱；

图8显示了SEQ.I.D.No.3的氨基酸序列，表明了测序的肽片段的位置；

图9显示了SEQ.I.D.No.1与SEQ.I.D.No.2的序列比较；

图10是显微照片；

图11显示了pMC的质粒图谱；

图12显示了pMV1的质粒图谱；

图13显示了pMV2的质粒图谱；

图14显示了从Morchella costata获得的基因组DNA的GL编码序列和部分5′和3′非翻译区；

图15显示了从普通羊肚菌获得的基因组DNA的GL编码序列和部分5′和3′非翻译区；

图16显示了来自Morchella costata和普通羊肚菌的GL编码序列和非翻译区的比较；

图17列出了SEQ.I.D.No.5的氨基酸序列，显示测序的肽片段的位置；

图18列出了SEQ.I.D.No.6的氨基酸序列，显示了测序的肽片段的位置；

图19显示了存在和缺乏AF时的耗氧图；

图20显示了TLC板。

更详细地说，图1显示了钙粉白染色，显示了Gracilariopsislemaneiformis上部和下部的真菌(108×和294×)。

图2显示了带有真菌的Gracilariopsis lemaneiformis的PAS/苯胺蓝黑染色。真菌具有明显更高含量的碳水化合物。

图3显示了显微照片，显示了生长于藻类细胞原壁(w)之间的含两薄壁的真菌菌丝(f)的纵切和横切切片。注意在藻类叶绿体中的类囊体膜(箭头)。

图4显示了用克隆2探针的反义检测(上排)，似乎局限于以钙粉白染色的连续切片所示的真菌(下排)处(46×和108×)。

图5显示了发现用克隆2探针的强烈反义检测信号在Gracilariopsis lemaneiformis的真菌上(294×)。

图6显示了质粒pGL1的图谱，它是含有从真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis构建的基因组文库中分离的3.8kb片段的pBluescript IIKS。该片段含有编码α-1，4-葡聚糖裂解酶的基因。

图7显示了质粒pGL2的图谱，它是含有从真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis构建的基因组文库中分离的3.6kb片段的pBluescript IIKS。该片段含编码α-1，4-葡聚糖裂解酶的基因。

图9显示了SEQ.I.D.No.1(GL1)与SEQ.I.D.No.2(GL2)的序列比较。GL1的残基总数是1088，GL2的残基总数是1091。在所做的比较中，使用结构-遗传模型(打开缺口花费：10；连接缺口花费：2)。在图9中显示两个对比的残基相同的符号是“·：”；显示两个对比的残基相似的符号是“.”。说成是“相似”的氨基酸是：A，S，T；D，E；N，Q；R，K；I，L，M，V；F，Y，W。总的来说有845个氨基酸相同(即77.67％)；60个氨基酸相似(5.51％)。GL1中插入的缺口数为3，GL2中插入的缺口数是2。

图10是显示在藻类细胞壁(w)之间生长的真菌菌丝(f)的显微照片。注意藻类细胞中的红藻淀粉粒(s)和类囊体(箭头)。线段＝2μm。

在图14中，碱基总数是4726，DNA序列组成是：1336A；1070C；1051G；1269T。ATG起始密码子以黑体字表示。内含子下面划线。终止密码子以斜体字表示。

在图15中，碱基总数是4670，DNA序列组成是：1253A；1072C；1080G；1265T。ATG起始密码子以黑体字表示。内含子下面划线。终止密码子以斜体字表示。

在图16中，两个对比的序列是从MC(残基总数：1066)和MV(残基总数1070)获得的序列。使用的比较模型是结构-遗传模型(打开缺口花费：10；连接缺口花费：2)。在本图中，表示两对比的残基相同的符号是“：”。表示两对比的残基相似的符号是“.”。说成是“相似”的氨基酸是：A，S，T；D，E；N，Q；R，K；I，L，M，V：F，Y，W。总的来说，相同：920(86.30％)；相似51(4.78％)。在MC中插入的缺口数为1，在MV中插入的缺口数是1。

在所述的序列表中：SEQ.I.D.No.5是从Morchella costata获得的GL的氨基酸序列；SEQ.I.D.No.6是从普通羊肚菌获得的GL的氨基酸序列；SEQ.I.D.No.7是从Norchella costata获得的GL的核苷酸编码序列；SEQ.I.D.No.8是从普通羊肚菌获得的GL的核苷酸编码序列。

在SEQ.I.D.No.5中，残基总数是1066。GL酶的氨基酸组成为：

46Ala 13Cys 25His 18Met 73Thr

50Arg 37Gln 54Ile 43Phe 23Trp

56Asn 55Glu 70Leu 56Pro 71Tyr

75Asp 89Gly 71Lys 63Ser 78Val

在SEQ.I.D.No.6中，残基总数是1070。GL酶的氨基酸组成为：

51Ala 13Cys 22His 17Met 71Thr

50Arg 40Gln 57Ile 45Phe 24Trp

62Asn 58Glu 74Leu 62Pro 69Tyr

74Asp 87Gly 61Lys 55Ser 78Val

具体实施方式

实验

1.可溶性酶系统：

1.1.pH对从真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis中分离的裂解酶的稳定性和活性的影响。

在37℃试验了两种缓冲系统，命名为浓度为5mM的HOAc-NaOAc和柠檬酸钠-柠檬酸。试验的pH范围为从pH3到pH5.2。裂解酶在3.6到4.2的pH范围内显示最大活性。在pH3时，酶的稳定性和活性减少大约90％。在pH5.2时，活性减少大约64％。然而在此pH下酶比在pH3下更稳定，而在pH5.2下获得的AF产量是pH3.8下获得的AF产量的75％。在HOAc-NaOAc缓冲液中获得的AF产量比在柠檬酸缓冲液中略高。这不是由于在AF试验方法中两种缓冲液(在AF试验混合物中终浓度是125μM)的任何偏差影响。

1.2.温度对裂解酶的活性和稳定性的影响：

本实验在最适pH范围内进行。在25℃下AF生产线型增长到至少9天。这表明在9天内裂解酶无活性和稳定性损失。随着温度的升高，酶稳定性减小。

在下列温度下酶活性的半寿期为：

30℃ 5天

37℃ 2.5天

40℃ 不超过1天

50℃ 不超过1天

1.3.底物浓度对裂解酶稳定性和AF产量的影响：

观察到支链淀粉和糊精对裂解酶具有稳定效应，而最小的底物麦芽糖没有。这一点以可溶性酶系统和固相酶系统来证实。

随着支链淀粉浓度增加到高达25％，AF产量也增加。至于糊精，当浓度超过30％(试验了30％，40％和50％)时AF产量减少。

1.4.裂解酶的活化和灭活

未发现金属离子为活性所必需，令人惊奇的是该酶催化的反应可在纯水中进行。向反应混合物中加入高达20mM的EDTA对活性很少有影响的事实清楚地证实对于根据本发明的裂解酶的活性来说，金属离子是不必要的。

这意味着在AF纯化步骤中，从反应系统中去掉盐的离子交换色谱步骤可省去，如果水用作反应介质的话。然而，反应混合物包含浓度为0.85％(0.145M)的NaCl时可将AF产量增加1倍。

1.5.底物特异性

当淀粉浓度变高时，溶解后冷却的淀粉倾向于形成坚硬的凝体。因此，使用部分降解的淀粉作为1，4-葡聚糖裂解酶的底物具有优势。

试验了从M.costata分离的α-1，4-葡聚糖裂解酶对不同寡聚糖的特异性。这些寡聚糖是麦芽糖(G2)，麦芽三糖(G3)，麦芽四糖(G4)，麦芽五糖(G5)，麦芽六糖(G6)和麦芽七糖(G7)。寡聚糖以8mg/ml的浓度溶于水。酶试验含150μl底物G2/G3/G4/G5/G6/G7，120μl 0.1M MES pH6.3和30μl纯化的酶。反应混合物在30C培养60分钟。随后经煮沸3分钟终止反应并加入900μl无水乙醇进行沉淀。4℃以20,000×g离心5分钟后将上清液转移到新的eppendorf管中并冻干。

冷冻干燥的样品溶于1000μ1 H₂O中并通过0.22μm Millipore滤膜过滤，随后加样25μl到Dranex HPLC上。

1.7 HPLC

分析程序

在由GPM-2泵和用于脉冲安培计检测方式的PED检测器组成的Dionex 4500i色谱系统中进行分析。

阴离子交换柱是Dionex的CarboPac PA-100(4×250mm)和CarboPac PA-100保护柱。

洗脱液是200mM氢氧化钠(A)，500mM乙酸钠(B)和18M欧姆去离子水(C)。泵以2种不同的方式(方法1和方法2)运行：

方法1：

时间，分	0.0	3.0	3.1	26.9	29.0
时间，分	0.0	3.0	3.1	26.9	29.0	％A	10	10	50	50	10
％B	0	0	0	32	0	％A	10	10	50	50	10
％B	0	0	0	32	0	％C	90	90	50	18	90

方法2：

时间，分	0.0	30
时间，分	0.0	30	％A	10	10
％B	0	0	％A	10	10
％B	0	0	％C	90	90

标准品：

葡萄糖，麦芽糖，麦芽三糖，麦芽四糖，麦芽五糖，麦芽六糖和麦芽七糖(都来自Sigma)和1，5-脱水果糖用作标准品。所有化合物均溶于18M欧姆的去离子水中，用前通过0.22μm Millipore滤膜过滤。

1.7. 结果：

分析表明从M.costata分离的纯化酶确实能使用麦芽寡聚糖作底物形成1，5-脱水果糖。

当使用麦芽糖作底物时，几乎不形成1，5-脱水果糖，但当使用其它麦芽寡聚糖(G3-G7)时，产生高产量的该化合物。

很清楚当使用更长的麦芽寡聚糖时可获得更高产量的1，5-脱水果糖。

这一观察结果与裂解酶从底物非还原端形成1，5-脱水果糖而葡萄糖分子末端未变化的理论非常吻合。

1.8. AF的形成

M.costata的α-1，4-葡聚糖裂解酶将淀粉水解成终产物1，5-脱水果糖。终产物经HPLC，方法2显示。酶试验含500μl支链淀粉(20mg/ml，溶于H₂O)、400μl 0.1M MES pH6.3和100μl纯化酶。在30C保温反应混合物，保温30或120分钟后经煮沸终止反应。加入3体积的无水乙醇沉淀高分子寡聚糖类，按上面所述离心和冻干样品。样品溶于125μl H₂O中并取25μl上样到HPLC柱上。

HPLC洗脱图清楚地表明M.costata的α-1，4-葡聚糖裂解酶经水解淀粉产生1，5-脱水果糖。保温30和120分钟后发现相当量的1，5-脱水果糖，表明酶活性不受终产物1，5-脱水果糖的抑制。

以这种方式制备的AF ¹³C NMR光谱(水)表明它采取产生下列信号的一个主要形式：δ93.5(夸脱，C-2)，81.5(CH，C-5)，77.7(CH，C-3)，72.6(CH₂，C-1)，69.8(CH，C-4)，62.0(CH₂，C-6)。根据H-H C-H和C-H 2D相关光谱进行排列。

1.6.裂解酶与支链淀粉酶和异淀粉酶的协同效应。

从表1可见，在反应混合物中包含支链淀粉酶的是增加AF的产量大约15-23％，这一增加值取决于使用的底物是可溶性淀粉还是支链淀粉。

表1在AF生产中支链淀粉酶和裂解酶的协同作用：

底物	裂解酶	支链淀粉酶	AF产率(％)	Glc产率(％)
底物	裂解酶	支链淀粉酶	AF产率(％)	Glc产率(％)	可溶性淀粉	+-	-+	510	00.37
	+	+	66.0	3.9	可溶性淀粉	+-	-+	510	00.37
	+	+	66.0	3.9	支链淀粉	+	-	48.0	0
	-	-	0	0.33	支链淀粉	+	-	48.0	0
	-	-	0	0.33		+	+	71.3	3.7

+，加入的酶，-，省去的酶。

反应混合物合0.3ml 2％马铃薯支链淀粉(Sigma)/水或0.3ml 2％可溶性淀粉(Merch)，2μl裂解酶和0.36单位的所示支链淀粉酶(BM)。

在30℃反应进行1天。在反应终止时，取样进行AF和GLc分析。

至于异淀粉酶，其优势在于裂解酶的最适pH与假单胞菌属异淀粉酶的最适pH(pH3.0-4.5)重叠。然而问题是异淀粉酶产生的过量的长链直链淀粉会从溶液中沉淀出来而不再适合于作为裂解酶的底物。如果直链淀粉的链不太长，可期望裂解酶与异淀粉酶会产生有效的协同作用。

2.固相酶系统

经过使用琥珀酰胺活化的Sepharose(Affigel 15凝胶，Bio-Rad)和戊二醛活化的Silica凝胶(BM)完成裂解酶的固相化。在Affigel 15凝胶上固相化后酶活性的恢复率在40％到50％之间。固相化后可能仍有一些酶较活跃，但由于位阻底物不能进入，特别是对于象淀粉一样的大分子。工业上使用的固相酶通常活性恢复率为大约50％。

对于Affigel 15凝胶固相化的裂解酶，最令人感兴趣的事是在pH5.5下其稳定性有很大的改进。当柱在这一pH下进行操作时，稳定性至少有16天长。考虑到支链淀粉酶的最适pH为大约pH5.5，pH改变在稳定性中非常重要。这是裂解酶和支链淀粉酶在具有相同物理一化学环境的相同反应器中发生有效的协同作用的前提条件。可溶性裂解酶的最适pH在3.6和4.2之间，在该pH范围内，支链淀粉酶表现出很小的活性或无活性。

使用硅胶固相裂解酶的活性恢复率非常高，大约80-100％。然而当柱不在pH3.8和pH5.5下操作时硅胶固相酶不稳定。可能有些裂解酶吸附到硅胶珠表面并在每次洗柱后缓慢从硅胶上释放。因此可能是吸附的裂解酶造成了高恢复率和柱活性的减少。

3.AF的纯化

3.1.裂解酶-支链淀粉/可溶淀粉系统

在该系统中，反应终止时反应系统含AF，极限糊精，裂解酶和缓冲盐。经乙醇(终浓度50％)沉淀从大分子(极限糊精和裂解酶)中分离AF。使用Amicon YM3膜(截下3,000D的分子量)经超滤分离未沉淀的低分子量支链淀粉。在旋转蒸发器中经在40℃蒸发去掉乙醇。经过混合的离子交换剂从AF中去掉缓冲盐。经冷冻干燥获得纯化的固体AF。

3.2.裂解酶一支链淀粉酶/支链淀粉/可溶性淀粉系统

在该系统中终产物是AF和葡萄糖。如果制备至少基本上纯的AF样品，必须去掉副产物葡萄糖。这可经过酶方法完成。首先经葡萄糖氧化酶将葡萄糖转变成葡萄糖酸和过氧化氢。

需要过氧化氢酶消除形成的H₂O₂。H₂O₂可将AF氧化成目前结构未知的2种新化合物。在AF制品中的其它杂质是AF的氧化产物。观察到经空气水平的氧，特别是在高温，高AF浓度和长时间暴露下AF可被缓慢氧化。

葡萄糖酸可与缓冲盐一起经离子交换色谱去掉。

在该系统中，作为选择可用淀粉转葡萄糖苷酶水解低分子量的支链淀粉分子来代替使用超滤法。

3.3.AF的纯度检查。

经TLC，Dionex和NMR证实AF制品的纯度。

3.4.脱水果糖抗氧化活性分析。

电化学氧消耗：

方法

在Jorgensen和Skibsted(Z.Lebensm.Unters.Forsch.(1993)196：423-429)描述的甲基亚油酸乳剂中研究AF的活性，对该乳剂作了轻微的修改：向作为乳化剂的5.00ml溶于具有pH＝5.8且含0.2w/w％Tween 20的5.0mM磷酸盐缓冲水溶液的1.33mM甲基亚油酸乳剂中加入下列浓度的AF：0，15，146和680μM。经过加入50μl 0.26M甲基肌红蛋白(MMb)至终浓度为0.26mM起动该系统的氧化。起动反应后立即将样品注射到恒温(25.0±0.1℃)的70μl密封电池中，有效地排除氧向系统的扩散。经Clark电级(与PC资料收集程序相连)测量氧的消费。每30秒登记相对氧浓度(％)。

结果

与不同样品的氧消耗相对应的曲线如图19所示。对于未加AF的样品，在样品注射后立即可见氧浓度的相对减少。对于含AF的样品，在曲线结束前观察到对数期且氧浓度减少。与未加AF的样品相比在对数期后仅观察到氧消耗率的微量减少。对具有最高量AF的样品，观察到最长的对数期。对这些样品还观察到耗氧率更低，这经过与对照(0μM)斜率相比这些曲线斜率更小来观察。

ESR分析：

方法：

经过与H₂O₂(0.17mM)和FeSO₄(4.8μM)的Fenton反应产生羟基。产生的基团以5，5-二甲基-1-二氢吡咯N-氧化物(DMPO，9.7mM)捕获。以1.3mM和6.3mM的浓度加入AF。以浓度为0.25mg/ml(克数相当于1.26mM AF)分析迷迭香(Rosmarinusofficinalis L.)的水溶性提取物。120秒后在室温(20±1℃)下进行测量并在300秒后对相同的反应混合物重复测量，使用下面分光计装置：中心场3475.60G；清除宽度55G；微波功率20mW：调节频率100KHz；调节距离1.01G；接受器放大1.00·10⁵；转变时间81.92毫秒，恒定时间163.84毫秒，清除时间83.89秒。

结果

以DMPO捕获产生的羟基。自旋加合物产生特征性的1∶2∶2∶1ESR光谱。光谱峰高与产生的自旋加合物量成比例。DMPO和AF的加入在自旋陷阱和AF之间形成竞争。峰高的降低表明AF较好的清除活性。

表：ESR-光谱的峰高。H₂O₂＝0.17mM，Fe²⁺＝4.8μM。

脱水果糖[mM]	迷迭香提取物[mg/ml]	峰高[120s]	峰高[300s]
脱水果糖[mM]	迷迭香提取物[mg/ml]	峰高[120s]	峰高[300s]	0	0	2475	2780
1.3	0	2634	2545	0	0	2475	2780
1.3	0	2634	2545	6.3	0	1781	1900
				6.3	0	1781	1900

可见在1.3mM AF浓度时无羟基清除活性，在6.3mM AF时峰高减小，表明产生的部分羟基被AF清除。

4.AF作为抗氧化剂的应用

实施例4.1

AF作抗氧化剂在50％蛋黄酱中的应用

在饮食供应和零售交易中，50％蛋黄酱用于色拉，打开的夹心面包片等。50％蛋黄酱油含量低使其适于低热量应用。

典型的蛋黄酱组合物如下：

大豆油 50.0％

龙蒿醋(10％) 4.0％

蛋黄 3.5％

糖 3.0％

盐 1.0％

山梨酸钾 0.1％

水 35.2％

MAYODAN 602 3.0％

柠檬调味品10251 0.2％

MAYODAN 602可保证良好的稳定的油分散和所需的粘度，从而使50％蛋黄酱具有较长的货架寿命。

调味品10251是天然柠檬调味品，它使蛋黄酱具有新鲜的柠檬口味。

典型的蛋黄酱以下列方法制备：

1)干燥混合MAYODAN 602，糖和盐。以1份粉末2份油的比例分散于油中。

2)向水中加入调味品和山梨酸钾并注入Koruma混合器中。加入1)。

3)加入蛋黄酱。

4)在真空中连续加油。

5)已(缓慢)加入2/3的油后。将剩下的1/3的油与龙蒿醋混合并加入。

下面资料表明，当将AF作为抗氧化剂加入蛋黄酱中时，结果可比得上已知的食品抗氧化剂GRINDOX 142和GRINDOX 1029。

GRINDOX 142：

抗坏血酸棕榈酸酯 10％

丙基没食子酸 20％

柠檬酸 10％

食品级乳化剂 60％

25℃的形态膏状

颜色灰色至浅棕色

密度 1.1g/ml

(所有百分数均是重量百分数)。

GRINDOX 1029：

抗坏血酸棕榈酸酯 20％

天然生肓酚 20％

食品级乳化剂 60％

在25℃的形态膏状

颜色亮棕色

在25℃的密度 1.0g/ml

(所有百分数均是重量百分比)。

在试验程序中，向蛋黄酱中加入抗氧化剂使抗氧化剂浓度大约为500ppm。然后将蛋黄酱放入80℃含纯O₂的弹型量热计中。再测量产品发生大量氧化的潜伏期。

结果如下：

样品 IP(小时)

1.空白 28,0

2.+500ppm GRINDOX 142 35,0

3.+500ppm GRINDOX 1029 33,3

4.+550ppm GRINDOX 1029 34,3

5.+500ppm 1，5脱水果糖-D- 32,0

(IP小时＝潜伏期)

这些结果表明AF是优良的食品抗氧化剂并可比得上已知的食品抗氧化剂GRINDOX 142或GRINDOX 1029。

实施例4.2

AF作为抗氧化剂在色拉调味汁中的应用

含50％油的酸乳酪色拉调味汁

含50％油的酸乳酪色拉调味汁用于色拉，马铃薯，生蔬菜色拉，肉，鱼和煮过的蔬菜。

组成：

大豆油 50.0％

酸乳酪(普通) 39.0％

醋(10％) 3.5％

糖 3.0％

蛋黄 2.0％

盐 1.0％

山梨酸钾 0.1％

MAYODAN 525 1.4％

掩盖酸味的调味2072 0.02％

MAYODAN 525提供了极好的乳剂稳定性，防止凝固，确保均匀的油分散和粘度，改善了生产过程的耐受性并保证其货架寿命长。

调味品2072是特性相同，掩盖了酸味的调味品，它减小了酸味而不影响其pH值。

加工过程：

1.将干燥的MAYODAN 525，糖和盐混合。以1份粉末比2份油的比例分散于油中。

2.将调味品，山梨酸钾和酸乳酪加入Koruma混合器中。加入1)。

3.加入蛋黄。

4.在真空中连续加油。

5.加入2/3的油(缓慢)后，将醋与剩余的1/3的油混合并加入。

6.如果需要就加入香料。

试验结果：

样品： IP小时 PF

1.空白 37.2 1.00

2.500ppm脱水果糖 39.5 1.06

3.800ppm GRINDOX 1032 43.3 1.07

(IP-潜伏期)；(PF-保护系数)

保护系数(PF)：

对于每个温度下的AF定义为：

PF＝加入了抗氧化剂的油的IP/未加入抗氧化剂的相同油的IP。

寿命延长(LE)％：

LE＝(PF-1.0)×100

6. α-1，4-葡聚糖裂解酶的制备

前言：

至于本发明进一步的实施方案，用于制备AF的α-1，4-葡聚糖裂解酶可从真菌感染的藻类中分离，优选真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis，更优选来自青岛(中国)的真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis。

作为选择，可从真菌中获得该酶。例如，真菌可以是Discinaperlata，Discina parma，Gyromitra gigas，Gyromitra infula，Mitrophora hybrida，尖顶羊肚菌，Morchella costata弹丝羊肚菌，Morchella hortensis，Morchella rotunda普通羊肚菌，疣孢褐盘菌，Sarcosphaera eximia，Disciotis venosa，可食鹿花菌，卷曲马鞍菌，空隙马鞍菌，Leptopodia elastica，指状钟菌和羊肚菌属的其它种类中任意一种。优选该真菌是Morchella costata或普通羊肚菌。

至于本发明进一步的实施方案，用于制备AF的α-1，4-葡聚糖裂解酶可仅从藻类中分离，优选Gracilariopsis lemaneiformis，更优选来自Santa Cruz(加利福利亚)的Gracilariopsislemaneiformis。

最初的酶纯化可按Yu等(出处同上)描述的方法进行。然而，优选的是最初的酶纯化包括一种最优化的程序，其中所用的固相支持物在纯化步骤中不分解。该凝胶支持物还具有的优势是它与标准实验室蛋白质纯化装置相配伍。这种最优化的纯化方法的细节在下文描述。用已知的蛋白质纯化的标准技术终止纯化。

使用互补电泳技术易于确定酶的纯度。

A.来源＝真菌感染的藻类：

下面序列资料用于产生下述PCR反应的引物并用于检查以各自的核苷酸序列产生的氨基酸序列。

来自真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis的肽集合的氨基酸序列：

Tyr Arg Trp Gln Glu Val Leu Tyr Thr Ala Met Tyr Gln Asn Ala

Ala Phe Gly Lys Pro Ile Ile Lys Ala Ala Ser Met Tyr Asn Asn

Asp Ser Asn Val Arg Arg Ala Gln Asn Asp His Phe Leu Leu Gly

Gly His Asp Gly Tyr Arg Ile Leu Cys Ala Pro Val Val Trp Glu

Asn Ser Thr Glu Arg Glu Leu Tyr Leu Pro Val Leu Thr Gln Trp

Tyr Lys Pne Gly Pro Asp Phe Asp Thr Lys Pro Leu Glu Gly Ala

用于产生引物A和B的氨基酸序列(27-34)(Met Tyr Asn Asn Asp Ser Asn Val)

引物A：

ATG TA(TC) AA(CT) AA(CT) GA(CT) TC(GATC) AA(CT) GT 128种混合

引物B

ATG TA(TC) AA(CT) AA(CT) GA(CT) AG(CT) AA(CT) GT 64种混合

用于生产引物C的氨基酸序列(40-50)(Gly Gly His Asp Gly Tyr)：

引物C：

TA(GATC)CC (GA)TC (GA)TG (GATC)CC (GATC)CC 256种混合

[该序列与互补链相对应]。

用于生产引物E的氨基酸序列(74-79)(Gln Trp Tyr Lys PheGly)：

引物E：

GG(GATC) CC(GA) AA(CT) TT(GA) TAC CA(CT) TG 64种混合

[该序列与互补链相对应]。

用于产生引物F1和F2的氨基酸序列(1-6)(Tyr Arg Trp Gln Glu Val)：

引物F1

TA(TC) CG(GATC) TGG CA(GA) GA(GA) GT 32种混合

引物F2

TA(TC) AG(GA) TGG CA(GA) GA(GA) GT 16种混合

首次PCR扩增获得的序列(克隆1)：

ATGTACAACA ACGACTCGAA CGTTCGCAGG GCGCAGAACG ATCATTTCCT

TCTTGGCGGC CACGACGGTT A

Met Tyr Asn Asn Asp Ser Asn Val Arg Arg Ala Gln Asn Asp His Phe Leu Leu Gly

Gly His Asp Gly

第二次PCR扩增获得的序列(克隆1)：

ATGTACAACA ACGACTCGAA CGTTCGCAGG GCGCAGAACG ATCATTTCCT

TCTTGGTGGA CATGATGGAT ATCGCATTCT GTGCGCGCCT GTTGTGTGGG

AGAATTCGAC CGAACGNGAA TTGTACTTGC CCGTGCTGAC CCAATGGTAC

AAATTCGGCC C

Met Tyr Asn Asn Asp Ser Asn Val Arg Arg Ala Gln Asn Asp His Phe Leu Leu Gly

Gly His Asp Gly Tyr Arg Ile Leu Cys Ala Pro Val Val Trp Glu Asn Ser Thr Glu

Arg Giu Leu Tyr Leu Pro Val Leu Thr Gln Trp Tyr Lys Phe Giy Pro

第三次PCR扩增获得的序列(克隆2)：

TACAGGTGGC AGGAGGTGTT GTACACTGCT ATGTACCAGA

ATGCGGCTTT CGGGAAACCG ATTATCAAGG CAGCTTCCAT

GTACGACAAC GACAGAAACG TTCGCGGCGC ACAGGATGAC

CACTTCCTTC TCGGCGGACA CGATGGATAT CGTATTTTGT

GTGCACCTGT TGTGTGGGAG AATACAACCA GTCGCGATCT

GTACTTGCCT GTGCTGACCA GTGGTACAAA TTCGGCCC

Tyr Arg Trp Gln Glu Val Leu Tyr Thr Ala Met Tyr Gln Asn Ala Ala Phe Gly Lys

Pro Ile Lys Ala AIa Ser Met Tyr Asp Asn Asp Arg Asn Val Arg Gly Ala Gln Asp

Asp His Phe Leu Leu Gly Gly His Asp Gly Tyr Arg Ile Leu Cys Ala Pro Val Val

Trp Glu Asn Thr Thr Ser Arg Asp Leu Tyr Leu Pro Val Leu Thr Lys Trp Tyr Lys

Phe Gly

A.1.Gracilariopsis lemaneiformis的细胞学研究：

A.1.1.1.Gracilariopsis lemaneiformis中真菌感染的检测：

对在中国收集的Gracilariopsis lemaneiformis进行徒手切片或石蜡包埋材料切片。以光学显微镜检术仔细研究切片材料。在Gracilariopsis lemaneiformis中清楚地检测到真菌菌丝。

Gracilariopsis lemaneiformis的叶状体由以高度有序且几乎以对称方式存在的细胞组成。G.lemaneiformis的管状叶状体由大型无色中央细胞被延长的、纤细的椭圆形细和小而圆的带红色色素的外周细胞包围组成。所有藻类细胞类型的特征在于有厚的细胞壁。大多数真菌菌丝发现在大型细胞的中央层和外周层之间的界面上。这些细胞可清楚地从藻类细胞中区分，因为它们是长圆柱形。观察到菌丝的生长是在高度有序的藻类细胞之间无规则生长。菌丝最通常的方向是沿藻类叶状体的主轴方向。偶尔也检测到向中央和外周的侧向分枝。菌丝不会与藻类内生/附生的第二世代混淆。

已知钙粉白染色含几丁质和纤维素的组织。与几丁质的反应需要4个共价连接的末端N-2酰葡糖胺残基。普遍接受纤维素几乎局限于高等植物，尽管在有些藻类中可能存在微量纤维素。还已知在江蓠属中不存在几丁质。

发现钙粉白染色区与切片的Gracilariopsis lemaneiformis材料中的真菌菌丝细胞壁相对应。

当在紫外灯下观察时，相对于江蓠属组织淡蓝色的背景菌丝呈现清楚的白色(见图1)。几丁质是大多数真菌的主要细胞壁成份，但在江蓠属中缺失。根据这些观察结果，我们得出结论，所研究的藻类被真菌感染。发现研究的Gracilariopsis lemaneiformis切片中40％的下部被真菌菌丝感染。发现研究的Gracilariopsis lemaneiformis切片中25％的藻类顶端被感染。

用过碘酸希夫氏(PAS)染料和苯胺兰黑染色切片的Gracilariopsis lemaneiformis揭示了与藻类细胞相比真菌细胞内的碳水化合物含量明显更高(见图2)。番红O和孔雀绿染色表现出与在真菌感染的高等植物中所发现的真菌细胞相同的颜色反应。

吖啶橙与切片的Gracilariopsis lemaneiformis的反应显示出真菌清楚的无规则生长。

A.1.1.2.电子显微镜检术

用钙粉白检测到真菌的带有15μm厚切片的载玻片在2％OsO₄中固定，用水洗涤并在二甲氧基丙烷和无水乙醇中脱水。在玻璃片的每个切片上加一滴丙酮与Sparr树脂1∶1的混合物，1小时后用1滴纯树脂代替。树脂填充的明胶包埋胶囊面朝下放在切片上并4℃放置过夜。在55℃聚合8小时后，经过浸入液氮可从载玻片上分离附着于树脂块上的厚切片。

修块并用切片机上的钻石刀片切成100nM厚的切片。切片在醋酸铀水溶液和在柠檬酸铅中染色。在电子显微镜下以80KV检查切片。

研究证实了光学显微镜的观察结果并提供了产生裂解酶的G.1amneiformis中国品种被真菌性寄生物或共生物感染的进一步证据。

真菌菌丝由50至100μm长，直径仅几微米的管状细胞构成。细胞依次排列，相邻细胞之间有隔膜壁。偶尔也见分枝。菌丝在藻类叶状体厚细胞壁之间生长而不穿透细胞壁或损伤细胞。已知这种称为真菌藻类共生体的共生关系也发生于一些丝状海洋真菌和大型海洋藻类之间(DonK and Bruning，1992-Eeology of aquatic fungi inand on algae。In Reisser，W.(ed)：Algae and Symbioses：Plants，Animals，Fungi，Viruses，Interactions Explored.Biopress Ltd.，Bristol.)。

检查图10的显微照片，可注意到藻类和真菌细胞之间的一些区别。与藻类几个μm厚的细胞壁相反，真菌细胞壁仅100-200nm厚。在藻类细胞中可见植物典型的细胞器，如具有类囊体膜的叶绿体以及红藻淀粉粒，但在真菌中未发现。

红藻细胞间连接的特征在于称为纹孔栓或纹孔连接的特殊结构。该结构是凸出的电子致密核心且它们是藻类分类学中的重要特征(Pueschel，C.M.：An expanded survey of the Ultrastructureof Red algal pit plugs，J.Phycot.25，625，(1989))。在我们的材料中，在藻类叶状体中常观察到这种连接，但在真菌细胞间从未发现。

A.1.2.原位杂交实验：

原位杂交技术是根据对mRNA的反义核糖核苷酸序列的杂交的原理进行的。该技术用于显示显微切片中存在所说的mRNA的区域。在本发明的特定情况下，该技术用于定位Gracilariopsislemaneiformis切片中的α-1，4-葡聚糖裂解酶。

A.1.2.1.用于原位杂交的³⁵S标记的探针的制备：

将第三次PCR扩增的2386p的PCR片段(称为克隆2(见上面))克隆进pGEM-32f(+)载体(Promega)。以SP6启动子趋动反义RNA的转录，以T7启动子趋动有意义RNA的转录。使用具有下列修改的核糖核酸酶保护试验试剂盒(Ambion)。将转录子通过6％测序凝胶以去掉未掺入的核苷酸并用含有体外转录试剂盒(Ambion)中的T7RNA聚合酶的洗脱缓冲液洗脱。反义转录子含23个非编码的核苷酸，而有意义转录子含39个核苷酸。为进行杂交，使用10⁷cpm/ml的³⁵S标记的探针。

基本上按照Langedale等(1988)所述进行原位杂交。发现最适的杂交温度为45℃。45℃洗涤后用Kodak K-5照相乳胶覆盖切片并在5℃黑暗中放置3天(参考文献：Langedale，J.A.，Rothermel，B.A.and Nelson，7，(1988)。Genes and development 2：106-115，Cold Spring Harbour Laboratory)。

在使用针对α-1，4-葡聚糖裂解酶mRNA的核糖核苷酸探针的原位杂交实验中，在Gracilariopsis lemaneiformis中检测到的真菌菌丝上和周围显示出强烈的杂交信号(见图4和5)。认为这有力地表明产生了α-1，4-葡聚糖裂解酶。在两种Gracilariopsislemaneiformis藻类组织中检测到微弱的随机背景反应。用有意义和反义探针都观察到这种反应。仅用反义探针获得了对真菌菌丝的强烈染色。

以在45℃杂交的标准杂交条件和洗涤步骤获得这些结果。在50℃观察不到对真菌的染色，而背景染色仍相同。对于有意义和反义探针而言，将温度升高到55℃明显地且同等地减小了背景染色。

根据使用互补染色程序的细胞学研究，可得出结论Gracilariopsis lemaneiformis被真空感染。在藻类组织的下部感染最显著。

在切片的Gracilariopsis lemaneiformis材料上原位杂交结果清楚地表明：杂交局限于发现真菌感染的区域(见图4)。结果表明：α-1，4-葡聚糖裂解酶mRNA似乎局限于Gracilariopsislemaneiformis上真菌感染的区域。根据这些观察结果，我们得出结论：在真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis上检测到α-1，4-葡聚糖裂解酶活性。

A.2.酶的纯化和表征：

按下面方法进行从真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis材料中纯化α-1，4-葡聚糖裂解酶。

A.2.1.材料和方法

经过滤收获藻类并用0.9％NaCl洗涤。经匀浆破碎细胞，接着在50mM柠檬酸-NaOH pH6.2(缓冲液A)中在冰上超声处理6×3分钟。以25,000×g离心40分钟去掉细胞碎片。在该程序中获得的上清液认为是无细胞提取物并在8-25％梯度凝胶上分离后用于活性染色和Western印迹。

A.2.2.以β-环糊精Sepharose凝胶分离

无细胞提取物直接上样到预先用缓冲液A平衡的β-环糊精Sepharose凝胶4B柱(2.6×18cm)上。用3体积的缓冲液A和2体积合1M NaCl的缓冲液A洗柱。用含2％糊精的缓冲液A洗脱α-1，4-葡聚糖裂解酶。汇集活性馏分并将缓冲液换成20mM双-tris丙烷-HCl(pH7.0，缓冲液B)。

将活性组分上样到预先用缓冲液B平衡的Mono Q HR 5/5柱上。用缓冲液B以0.3M线性梯度洗脱真菌裂解酶。

作为选择可将β-环糊精Sepharose色谱后获得的裂解酶制备浓缩到150μl并上样到Superose 12柱上，在FPLC条件下操作。

A.2.3.α-1，4-葡聚糖裂解酶活性和测定底物特异性，pH和温度最适值的条件。

试验α-1，4-葡聚糖裂解酶活性的反应混合物含10mg/ml支链淀粉和25mM Mes-NaOH(pH6.0)。反应在30℃下进行30分钟并经过加入3，5-二硝基水杨酸试剂终止反应。室温静置10分钟后在550nm下测光密度。

A.3. 来自真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis α-1，4- 葡聚糖裂解酶的氨基酸测序：

A.3.1.裂解酶的氨基酸测序

用来自溶组织梭状芽孢杆菌的内切蛋白酶Arg-C或来自Lysobacter enzymogenes的内切蛋白酶Lys-C(两者都是测序级，购自Boehringer Mannheim，德国)消化裂解酶。为了用内切酶Arg-C消化，将冷冻干燥的裂解酶(0.1mg)溶于50μl 10M尿素，50mM甲胺，0.1M Tris-HCl，pH7.6中。用N₂覆盖后将加入10μ1 50mMDTT和5mM EDTA的蛋白质变性并在N₂中50℃下还原10分钟。随后加入1μg溶于10μl 50mM Tris-HCl，pH8.0中的内切蛋白酶Arg-C，用N₂覆盖并在37℃进行消化6小时。为了进行随后的半胱氨酸诱导，加入12.5μl 100mM碘乙酰胺，将溶液在室温黑暗中及N₂存在的条件下保温15分钟。

为了用内切蛋白酶Lys-C消化，将冻干的裂解酶(0.1mg)溶于50μl 8M尿素，0.4M NH₄HCO₃，pH8.4中。用N₂覆盖并加入5μl 45mM DTT后，将蛋白质变性并在50℃和N₂存在的条件下还原15分钟。冷却到室温后，加入5μl 100mM碘乙酰胺以便在黑暗中N₂存在的条件下室温诱导半胱氨酸15分钟。

随后，加入90μl水和5μg溶于50μl 50mM麦黄酮和10mMEDTA，pH8.0的内切蛋白酶Lys-C并在N₂存在的条件下37℃消化24小时。

使用溶剂A：0.1％TFA的水溶液和溶剂B：溶于乙腈的0.1％TFA经过在VYDAC C18柱(0.46×15cm；10μm；The SeparationsGroup：California)上进行反相HPLC分离所得的多肽。在使用脉冲液体快速循环在Applied Biosystems 476A测序仪上测序前使用相同的溶剂系统在Develosil C18柱(0.46×10cm；3μM；Dr.OleSchou，Novo Nordisk，Denmark)上对选择的肽进行再次色谱。

来自真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis的酶的氨基酸序列资料在下面，特别是以SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2显示。

SEQ.ID.No.1具有：

残基数：1088

氨基酸组成(包括信号序列)

＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝

61Ala 15Cys 19His 34Met 78Thr

51Arg 42Gln 43Ile 53Phe 24Trp

88Asn 53Glu 63Leu 51Pro 58Tyr

79Asp 100Gly 37Lys 62Ser 77Val

SEQ.ID.No.2具有：

残基数：1091

氨基酸组成(包括信号序列)

＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝

58Ala 16Cys 14His 34Met 68Thr

57Arg 40Gln 44Ile 56Phe 23Trp

84Asn 47Glu 69Leu 51Pro 61Tyr

81Asp 102Gly 50Lys 60Ser 76Val

A.3.2.N-末端分析：

研究表明天然葡聚糖裂解酶1的N端序列被封闭。基本上按LeGendre等(1993)[Purification of proteins and peptidesby SDS-PAGE；In：Matsudaira，P.(ed.)A.practical guide toprotein and peptide purification for microsequencing，2ndedition：Academic Press Inc.，San Diego；pp.74-101]所述用无水TFA在40℃处理印迹到PVDF膜上的葡聚糖裂解酶30分钟完成去封闭。得到的序列是TALSDKQTA，它与来自葡聚糖裂解酶1的克隆的序列(SEQ.ID.No.1上从51到59位置的序列)相匹配且表明葡聚糖裂解酶1的N-端残基是N-乙酰苏氨酸。SEQ.ID.No.1的序列位置1到50代表信号序列。

A.4. 编码真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis的α-1，4 -葡聚糖裂解酶的基因之DNA测序

A.4.1.分子生物学方法

按Saunders(1993)所述并进行下列修改来分离DNA：经ELUTIP-d(Schleicher & Schuell)纯化代替凝胶纯化从DNA中去掉多糖(参考文献：Saunders，G.W.(1993)，Gel purification of redalgal genomic DNA：An inexpensive and rapid method for theisolation of PCR-friendly DNA。Journal of Phycology 29(2)：251-254and Scheleicher & Schuell：ELUTIP-d.Rapid Methodfor Purification and Concentration of DNA.)

A.4.2PCR

有关DNA分子的制备经过使用Gene Amp DNA扩增试剂盒(PerkinElmer Cetus，USA)并根据厂家说明书进行，除了Taq聚合酶在后来加入(见PCR循环)且温度循环变成如下：

PCR循环：

循环次数 ℃ 时间(分)

1 98 5

60 5

加入Taq聚合酶和油：

35 94 1

47 2

72 3

1 72 20

A.4.3 PCR片段的克隆：

按供应者的说明书将PCR片段克隆进pT7 Blue(来自Novagen)。

A.4.4 DNA测序：

使用自动阅读测序试剂盒(Pharmacia)和Pharmacia LKB A.L.F.DNA测序仪，基本上根据Sanger等(1979)的双脱氧方法测序双链DNA。(参考文献：Sanger.F.，Nicklen，S.and Coulson，A.R.(1979)。DNA sequencing with chain-determihating inhibitors.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74：5463-5467.)。

序列如SEQ.ID.No.s1和2所示。简单地说：

SEQ.ID.No.3具有：

碱基总数：3267

DNA序列组成：850A；761C；871G；785T。

SEQ.ID.No.4具有：

碱基总数：3276

DNA序列组成：889A；702C；856G；829T。

A.4.5文库的筛选：

按照厂家说明书对从Stratagene获得的λZap文库进行筛选，除了预杂交和杂交在2×SSC，0.1％SDS，10×Denhardt′s和100μg/ml变性鱼精DNA中进行。向杂交溶液中加入³²P标记的变性探针。在55℃进行杂交过夜。滤膜在2×SSC，0.1％SDS中洗两次并在1×SSC，0.1％SDS中洗两次。

A.4.6探针

经过用合适的限制性酶消化从pT7 blue载体中分离克隆的PCR片段。经琼脂糖凝胶电泳从载体中分离片段并以Agarase(BoehringerMannheim)从琼脂糖中纯化该片段。由于该片段仅90-240bp长，在使用Prime-It随机引物试剂盒(Stratagene)或Ready to Go DNA标记试剂盒(Pharmacia)以³²P-dCTP标记前，对分离的片段进行连接反应。

A.4.7结果

A.4.7.1编码α-1，4-葡聚糖裂解酶的PCR DNA片段的产生：

来自α-1，4一葡聚糖裂解酶的三个重叠的胰酶肽氨基酸序列用于产生混合的寡核苷酸，它可用作PCR 引物(见上面给出的序列)。

在第一次PCR扩增中，引物A/B(见上面)用作上游引物，引物C(见上面)用作下游引物。预期PCR产物的大小为71个碱基对。

在第二次PCR扩增中，引物A/B用作上游引物，E用作下游引物。预期PCR产物的大小是161个碱基对。

在第三次PCR扩增中，引物F1(见上面)和F2(见上面)用作上游引物，E用作下游引物。预期PCR产物的大小为238个碱基对。

在2％LNT琼脂糖凝胶上分析PCR产物并从凝胶上切下预期大小的片段，用Agarase(Boehringer Mannheim)处理，克隆进pT7blue载体(Novagen)中并测序。

从第一次和第二次PCR扩增克隆的片段编码与测序的肽相对应的氨基酸(见上面)。第三次扩增的克隆(见上面)与测序的肽仅具有大约87％的同源性。

A.4.7.2用克隆的PCR片段对基因组文库的筛选

用上述克隆进行的文库筛选产生2个克隆。一个克隆含SEQ.ID.No.4的核苷酸序列(基因2)。另一克隆含SEQ.ID.No.3的一些序列(从碱基对1065下游)(基因1)。

以RACE(cDNA末端的迅速扩增)程序(Michael，A.F.，Michael，K.D. & Martin，G.R.(1988).Rroc.Natl.Acad.Sci.USA 85：8998-99002)使用Gibco BRL的5′race系统获得SEQ.ID.No.3的5′端。根据Collinge等(Collinge，D.B.，Milligan D.E.，Dow，J.M.，Scofield，G.& Daniels，M.J.(1987).Plant Mol Biol 8：405-414)的方法分离总RNA。根据厂商方案，使用1μg总RNA进行5′race。根据厂商方案将第二次扩增的PCR产物克隆进pT7 blue载体。测序3个独立的PCR克隆以弥补PCR错误。

使用下面的寡核苷酸作为上游引物：GCTCTAGAGC ATGTTTTCAACCCTTGCG，含序列GL1(即SEQ.ID.No.3)bp 1573-1593的互补序列之引物用作下游引物再进行PCR以便在上述克隆紧接ATG起始密码子之前加入XbaI和NdeI限制性位点。

基因1(即SEQ.ID.No.3)的完整序列的产生经过将该基因的3′端以来自基因组克隆的BamHI-HindIII片段克隆进StratagenepBluescript IIKS+载体中并将PCR产生的该基因的5′端以XbaI-BamHI片段克隆到3′端前来完成。

将基因2以HindIII钝端片段克隆进Stratagene pBluescriptIISK+载体EcoRV位点。经SacI消化，接着重新连接去掉部分3′非翻译序列。经过用HindIII和NarI消化并在下面退火寡核苷酸存在的条件下重新连接在紧靠起始ATG之前导入HindIII和HpaI限制性位点：

AGCTTGTTAAC ATGTATCCAACCCTCACCTTCGTGG

ACAATTGTACATAGGTTGGGAGTGGAAGCACCGC

在测序的克隆中发现没有内含子。

将克隆1型(SEQ.ID.No.3)与所有10个肽序列进行序列对比显示出1Q0％的相同性。从真菌感染的藻类Gracilariopsislemaneiformis分离的基因编码的两个蛋白质序列的序列对比表现出大约78％的相同性，表明两个基因都编码α-1，4-葡聚糖裂解酶。

A.5GL基因在微生物中的表达

(例如：毕赤氏酵母属裂解酶转化子和曲霉属裂解酶转化子的分析)

将编码GL的DNA序列导入微生物以生产高比活及高产量的酶。

关于这点，将基因1(即SEQ.ID.No.3)以NotI-HindIII钝端片段(使用Amersham International DNA钝端试剂盒)克隆进用EcoRI消化且钝端化(使用Amersham International DNA钝端试剂盒)的毕赤氏酵母表达载体pHIL-D2(含AOX1启动子)中以便在巴斯德毕赤氏酵母中表达(根据Invitrogen提供的毕赤氏酵母表达试剂盒中记载的方案)。

在另一实施方案中，将基因1(即SEQ.ID.No.3)以NotI-HindIII钝端片段(使用Amersham International DNA钝端试剂盒)克隆进用SmaI消化的曲霉属表达载体pBARMTE1(含Neuroperacrassa的甲基色氨酸抗性启动子)中以便在黑色曲霉中表达(Pallet al(1993)Fungal Genet Newslett.Vol 40Pages.59-62)。根据Daboussi等(Curr Genet(1989)Vol 15 pp453-456)的方法使用融胞酶Sigma L-2773和融胞酶Sigma L-8012制备原生质体。原生质体的转化按照Buxton等(Gene(1985)Vol 37 pp207-214)记载的方案进行，除了在涂布转化的原生质体时按照Punt等(Methods in Enzymology(1992)Vol 216 pp447-457)阐述的方案但使用0.6％渗压稳定的顶级琼脂糖。

结果表明在转化的巴斯德毕赤氏酵母和黑色曲霉中观察到了裂解酶活性。

A.5.1.一般方法：

无细胞提取物的制备：

以9000rpm离心5分钟收获细胞，用0.9％NaCl洗涤并重悬于破碎缓冲液(50mM磷酸钾，pH7.5，含1mM EDTA，和5％甘油)中。使用玻璃珠和Vortex处理破碎细胞。破碎缓冲液含1mM PMSF(蛋白酶抑制剂)。以9000rpm离心5分钟后再以20,000×g离心5分钟获得裂解酶提取物(上清液)。

以碱性3，5-二硝基水杨酸试剂(DNS)试验裂解酶的活性。

将1体积的裂解酶提取物与等体积的4％支链淀粉溶液混合。然后在控制的温度下保温反应混合物，以特定的间隔取样并分析AF。

还使用放射活性方法分析了裂解酶活性。

反应混合物含10μl ¹⁴C-淀粉溶液(1μCi；Sigma ChemicalsCo.)和10μl裂解酶提取物。反应混合物在25℃静置过夜，然后在通常的TLC系统中分析。使用Instant Imager(Pachard InstrumentCo.，Inc，Meriden，CT)检测产生的放射活性AF。

电泳和Western印迹。

使用8-25％梯度凝胶和PhastSystem(Pharmacia)进行SDS-PAGE。还在PhastSystem半干燥转移单位上进行Western印迹。

产生的抗从青岛(中国)收集的红海藻中纯化的裂解酶之第一抗体以1∶100稀释使用。与碱性磷酸酶连接的猪抗兔IgG(Dako A/S，Glostrup，Denmark)用作第二抗体并1∶1000稀释使用。

I部分：含上述构建体的毕赤氏酵母属转化子的分析

结果：

1.培养5天后测定裂解酶活性(根据手册)并证明B系列的所有样品中的活性在细胞内。

B系列样品： 11 12 13 15 26 27 28 29 30

比活性： 139 81 122 192 151 253 199 198 150

^*比活定义为在含2％(w/v)糖原，1％(w/v)甘油，溶于10mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)的反应混合物中每mg蛋白质每分钟释放的AF nmol值。反应温度为45℃；反应时间为60分钟。

样品B27的时间过程如下。图1中也提供了该数据。

时间(分) 0 10 20 30 40 50 60

比活 0 18 54 90 147 179 253

试验条件同上，除了时间进行变动。

2.Western-印迹分析。

全部样品的CFE显示出具有与天然裂解酶相对应的分子量的带型。

在巴斯德毕赤氏酵母细胞内表达的MC-裂解酶
在巴斯德毕赤氏酵母细胞内表达的MC-裂解酶		培养物名称	比活性^*
A18	10	培养物名称	比活性^*
A18	10	A20	32
A21	8	A20	32
A21	8	A22	8
A24	6	A22	8

II部分，曲霉属转化子

结果：

I.培养5天后测定裂解酶活性(基础培养基合0.2％酪蛋白酶促水解产物)，以碱基3，5-二硝基水杨酸试剂分析。

1)培养基的裂解酶活性分析

在生长于含0.2％支链淀粉的培养基中的35个培养物中。5.4+和5.9+的培养基中分别含0.13g AF/升和0.44g/升。结果表明从细胞中分泌了活性裂解酶。在无细胞提取物中也可测量出裂解酶活性。

2)无细胞提取物中的裂解酶活性分析。

培养物名称	比活性^*
培养物名称	比活性^*	5.4+	51
5.9+	148	5.4+	51
5.9+	148	5.13	99
5.15	25	5.13	99
5.15	25	5.19	37

^*比活性定义为在25℃时每mg蛋白质每分钟产生的AF nmol数。

+表示加入0.2％的支链淀粉。

结果表明GL的基因1在黑色曲霉细胞内表达。

用转化的E.coli进行实验(使用Qiagen的Qia表达载体试剂盒中的克隆载体pQE30)显示了酶的表达，该酶可被抗从真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis纯化的酶的抗体识别。

B.来源＝真菌

B.1. 来自真菌Morchella costata的α-1，4-葡聚糖裂解酶的酶纯化和表征

B.1.1.材料和方法：

真菌Morchella costata从美国典型培养物收集中心(ATCC)获得。使用ATCC推荐的培养基在摇床中25℃生长真菌。经过滤收获菌丝并用0.9％NaCl洗涤。

经过匀浆并随后在50mM柠檬酸-NaOH pH6.2(缓冲液A)中在冰上声处理6×3分钟破碎真菌细胞。经过以25,000×g离心40分钟去掉细胞碎片。在该程序中获得的上清液当作无细胞提取物，在8-25％梯度凝胶上分离后用于活性染色和Western印迹。

B.1.2.在β-环糊精Sepharose凝胶分离

将无细胞提取物直接上样到预先用缓冲液A平衡的β-环糊精Sepharose凝胶4B柱(2.6×18cm)上。用3体积的缓冲液A和2体积含1M NaCl的缓冲液A洗柱。用含2％糊精的缓冲液A洗脱α-1，4-葡聚糖裂解酶。汇集活性组分并将缓冲液换成20mM双-tris丙烷-HCl(pH7.0，缓冲液B)。

将活性馏分上样到预先用缓冲液B平衡的Mono Q HR 5/5柱上。用缓冲液B以0.3M NaCl的线型梯度洗脱真菌裂解酶。作为选择，可将β-环糊精Sepharose色谱后获得的裂解酶制品浓缩到150μl并上样到Sepharose 12柱上，在FPLC条件下操作。

B.1.3.α-1，4-葡聚糖裂解酶活性试验和测定底物特异性，pH和温度最适值的条件

试验α-1，4-葡聚糖裂解酶活性的反应混合物含10mg/ml支链淀粉和25mM Mes-NaOH(pH6.0)。

反应在30℃进行30分钟并经过加入3，5-二硝基水杨酸试剂终止反应。室温静置10分钟后在550nm处测定密度。当使用无细胞提取物时向试验混合物中加入10mM EDTA。

试验混合物中的底物支链淀粉可用其它底物取代，反应温度可按说明书中的限定进行变动。

在pH最适值研究中，反应混合物含以10mg/ml溶于40mM缓冲液中的支链淀粉或麦芽四糖。所用的缓冲液是甘氨酸-NaOH(pH2.0-3.5)，HoAc-NaoAc(pH3.5-5.5)，Mes-NaOH(pH5.5-6.7)，Mops-NaOH(6.0-8.0)和N-二(羟乙基)甘氨酸-NaOH(7.6-9.0)。反应在30℃进行30分钟。在温度最适值研究中，反应条件与上面相同，除了在所有实验中均使用缓冲液Mops-NaOH(pH6.0)。反应温度如说明书所示进行变动。

分别使用8-25％梯度凝胶和pH梯度为3-9的凝胶在PhastSystem(Pharmacia，Sweden)上进行SDS-PAGE，天然-PAGE和等电聚焦。电泳后，根据厂家(Pharmacia)推荐的程序以银染染色凝胶。糖蛋白被适于PhastSystem的PAS染色。为进行活性染色，在自然条件下6℃进行电泳。

电泳后，在1％可溶性淀粉存在的条件下30℃将凝胶保温过夜。经过用I₂/KI溶液染色显示真菌裂解酶的活性带。

B.1.4.结果：

B.1.4.1.α-1，4-葡聚糖裂解酶的纯化，分子量和等电点。

发现真菌裂解酶吸附到用β-环糊精Sepharose，淀粉和RedSepharose填充的柱子上。以β-环糊精Sepharose 4B凝胶和淀粉填充的柱用于纯化目的。

以该步骤获得的裂解酶制品仅含微量分子量高于真菌裂解酶的污染蛋白质。可经过在Mono Q HR 5/5上进行离子交换色谱或更高效地经过在Superose 12上凝胶过滤去掉杂质。

纯化酶表现为无色且在可见光区不显示光吸收。在SDS-PAGE上估测时测定的分子量是110kDa。

经过在具有pH梯度为3-9的凝胶上等电聚焦测定时纯化的真菌裂解酶显示出等电点为pI5.4。在自然凝胶电泳中，酶表现为一条单一的带。经活性染色检测时，该带表现为淀粉降解活性。根据从中提取酶的培养物的时间，该酶在自然和等电聚焦凝胶中显示出要么是一条清晰的带，要么是具有相同迁移率和pI的更分散的带。

B.1.4.2.真菌裂解酶催化反应的pH和温度最适值

发现真菌裂解酶催化反应的pH最适值的pH范围在pH5到pH7之间。

B.1.4.3.底物特异性：

纯化的真菌裂解酶降解从麦芽糖到第七糖的麦芽糖类。然而，降解率不同。对麦芽四糖具有最高活性(活性为100％)，接着是麦芽六糖(97％)，麦芽七糖(76％)，麦芽三糖(56％)，对麦芽糖观察到最低活性(2％)。

真菌裂解酶也降解支链淀粉，直链淀粉和糖原(将测定基％)。真菌裂解酶是外切裂解酶而不是内切裂解酶，因为它降解对硝基苯基α-D-麦芽七糖但不降低还原端封闭的对硝基苯基α-D-麦芽七糖。

B.1.5.普通羊肚菌

用于普通羊肚菌α-1，4-葡聚糖裂解酶的酶纯化和鉴定的方案与上面用于Morchella costata的方案相同(结果相似)。

B.2. 真菌α-1，4-葡聚糖裂解酶的氨基酸测序：

B.2.1.裂解酶的氨基酸测序：

用溶组织梭状芽孢杆菌内切蛋白酶Arg-C或Lysobacterenzymogenes内切蛋白酶Lys-C(两者都是测序级，购自BoehringerMannheim，德国)消化裂解酶。为了用内切蛋白酶Arg-C进行消化，将冻干的裂解酶(0.1mg)溶于50μl 10M尿素，50mM甲胺，0.1MTris-HCl，pH 7.6中。用N₂覆盖并加入10μl 50mM DTT和5mMEDTA后，变性蛋白质并在N₂条件下50℃还原10分钟。随后加入溶于10μl 50mM Tris-HCl，pH8.0中的1μg内切蛋白酶Arg-C并在37℃进行消化6小时。为了随后的半胱氨酸诱导，加入12.5μl100mM碘乙酰胺并将溶液在N₂条件下黑暗中室温保温15分钟。

为了用内切蛋白酶Lys-C消化，将冻干的裂解酶(0.1mg)溶于50μl 8M尿素，0.4M NH₄HCO₃，pH8.4中。用N₂覆盖并加入5μl 45mM DTT后，变性蛋白质并在N₂条件下50℃还原15分钟。冷却到室温后，加入5μl 100mM碘乙酰胺以便在N₂条件下黑暗中室温诱导半胱氨酸15分钟。随后加入90μl水和溶于50μl 50mM麦黄酮和10mM EDTA，pH8.0中的5μg内切蛋白酶Lys-C并在N₂条件下37℃消化24小时。

使用溶剂A：0.1％ TFA水溶液和溶剂B：0.1％ TFA的乙腈溶液在VYDAC C18柱(0.46×15cm；10μm；The Separations Group；California)上以反相HPLC分离所得的肽。在使用脉冲液体快速循环在Applied Biosystems 476A测序仪上测序前使用相同的溶剂系统在Develosil C18柱(0.46×10cm；3μm；Dr.Ole Schou，NovoNordisk，Denmark)上对选择的肽进行再次色谱。

来自真菌Morchella costata的酶的氨基酸序列资料如图17所示。

来自真菌普通羊肚菌的酶的氨基酸序列资料如图18所示。

B.3.编码真菌α-1，4-葡聚糖裂解酶的基因之DNA测序

B.3.1.分子生物学方法：

按Dellaporte等(1983-Plant Mol Biol Rep Vol 1 pp19-21)所述分离DNA。

B.3.2.PCR

经过使用Gene Amp DNA扩增试剂盒(Perkin Elmer Cetus，USA)并根据厂家说明书进行有关DNA分子的制备，除了Taq聚合酶在后来加入(见PCR循环)且将温度循环改成如下：

PCR循环：

循环次数 C 时间(分)

1 98 5

60 5

加入Taq聚合酶和油：

35 94 1

47 2

72 3

1 72 20

B.3.3PCR片段的克隆：

按照提供者的说明将PCR片段克隆进pT7 Blue(来自Novagen)。

B.3.4DNA测序：

基本上按照Sanger等(1977)的双脱氧方法，使用自动阅读测序试剂盒(Pharmacia)和Pharmacia LKB A.L.F.DNA测序仪测序双链DNA。(参考文献：Sanger.F.，Nicklen，S.and Coulson，A.R.(1979)。DNA sequencing with chain-determinatinginhibitors。Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74：5463-5467)。

B.3.5文库的筛选：

根据厂家说明书对从Stratagene获得的λZap文库进行筛选，除了预杂交和杂交在2×SSC，0.1％SDS，10×Denhardt′s和100μg/ml变性鱼精DNA中进行。

向杂交溶液中加入³²P标记的变性探针。在55℃进行杂交过夜。滤膜在2×SSC，0.1％SDS中洗两次，在1×SSC，0.1％SDS中洗两次。

B.3.6探针

经过用合适的限制性酶消化从pT7 blue载体中分离克隆的PCR片段。经琼脂糖凝胶电泳从载体中分离片段并以Agarase(BoehringerMannheim)从琼脂糖中纯化该片段。由于该片段仅90-240bp长，在使用³²P-dCTP，使用Prime-It随机引物试剂盒(Stratagene)或Ready to Go DNA标记试剂盒(Pharmacia)标记前，对分离的片段进行连接反应。

B.3.7.结果

B.3.7.1.编码α-1，4-葡聚糖裂解酶的PCR DNA片段的产生。

α-1，4-葡聚糖裂解酶的3个重迭的胰酶肽的氨基酸序列(如下面所示)用于产生混合的寡核苷酸，它用作从MC和MV分离的DNA之扩增的PCR引物。

Lys Asn Leu His Pro Gln His Lys Met Leu Lys Asp Tnr Val Leu Asp Ile Val Lys

Pro Gly His Gly Glu Tyr Val Gly Trp Gly Glu Met Gly Gly Ile Gln Phe Met Lys

Glu Pro Thr Phe Met Asn Tyr Phe Asn Phe Asp Asn Met Gln Tyr Gln Gln Val Tyr

Ala Gln Gly Ala Leu Asp Ser Arg Glu Pro Leu Tyr His Ser Asp Pro Phe Tyr

在第一次PCR扩增中，引物A1/A2(见下面)用作上游引物，引物B1/B2(见下面)用作下游引物。

引物A1：CA(GA)CA(CT)AA(GA)ATGCT(GATC)AA(GA)GA(CT)AC

引物A2：CA(GA)CA(CT)AA(GA)ATGTT(GA)AA(GA)GA(CT)AC

引物B1：TA(GA)AA(GATC)GG(GA)TC(GA)CT(GA)TG(GA)TA

引物B2：TA(GA)AA(GATC)GG(GA)TC(GATC)GA(GA)TG(GA)TA

在2％LMT琼脂糖凝胶上分析PCR产物，从凝胶上切下预期大小的片段并用Agarase(Boehringer Mannheim)处理，克隆进pT7 blue载体(Novagen)中并测序。

从PCR扩增克隆的片段编码与测序的肽(见上面)相对应的氨基酸并在每个例子中增加了2个内含子序列。对于MC，PCR扩增的DNA序列与参照图14从位置1202到位置1522所示的序列相对应。对于MV，PCR扩增的DNA序列与参照图15中从位置1218到位置1535所示的序列相对应。

B.3.7.2用克隆的PCR片段对基因组文库进行筛选。

对于每种来源，用上述克隆对文库的筛选产生2个克隆。对于MC，两个克隆接合形成图14所示的序列(见下面)。对于MV，以上面描述的方式可结合两个克隆形成图15所示的序列。

为了在MC克隆中紧接ATG起始密码子之前加入PstI，PvuII，AscI和NcoI限制性位点，使用下面的寡核苷酸作为上游引物：AAACTGCAGCTGGCGCGCC ATGGCAGGATTTTCTGAT含图4 bp1297-1318的互补序列的引物作为下游引物再进行一次PCR。

经过将基因5′端以来自基因组克隆之一(第一克隆)的BglII-EcoRI片段克隆进Stratagene pBluescript II KS+载体的BamHI-EcoRI位点产生MC的完整序列。用EcoRI和EcoRV消化修饰的pBluescript II KS+载体后经过连接来自另一基因组克隆(第二克隆)的NspV(已钝端化，使用Amersham International DNA钝端试剂盒)-EcoRI片段将该基因的3′端克隆进修饰的pBluescript IIKS+载体中。然后，将该基因的中间部分片段以来自第一克隆的EcoRI片段的形式克隆进进一步修饰的pBluescript II KS+载体中，这经过将该片段连接到用EcoRI消化的进一步修饰的pBluescript IIKS+载体中实现。

B.4.GL基因在微生物中的表达

可将编码GL的DNA序列导入微生物中以便生产高比活和高产量的该酶。

关于这点，将MC基因(图14)以XbaI-XhoI钝端化(使用Amersham International DNA钝端试剂盒)片段克隆进用EcoRI消化且钝端化(使用Amersham International的DNA钝端试剂盒)的毕赤氏酵母属表达载体pHIL-D2(含AOX1启动子)中以便在巴斯德毕赤氏酵母中表达(根据Invitrogen提供的毕赤氏酵母属表达试剂盒中记载的方案)。

在另一实施方案中，将MC基因1(与图14相同，除了按上述经PCR导入限制性位点进行修饰)以PvuII-XhoI钝端化片段(使用Amersham International DNA钝端试剂盒)克隆进用SmaI消化的曲霉属表达载体pBARMTE1(含来自Neuropera crassa的甲基色氨酸抗性启动子)中以便在黑色曲霉中表达(Pall et al(1993)FungalGenet Newslett.Vol 40pages 59-62)。根据Daboussi等(CurrGenet(1989)Vol 15 pp453-456)使用溶胞酶Sigma L-2773和溶胞酶Sigma L-8012制备原生质体。接着根据Buxton等(Gene(1985)Vol 37 pp207-214)记载的方案进行原生质体的转化，除了涂布转化的原生质体按照Punt等(Methods in Enzymology(1992)Vol 216 pp447-457)阐述的方案进行但使用0.6％等渗稳定的顶级琼脂糖。

结果表明在转化的巴斯德毕赤氏酵母和黑色曲霉中观察到裂解酶活性。

毕赤氏酵母属裂解酶转化子和曲霉属

裂解酶转化子的分析

一般方法：

无细胞提取物的制备：

以9000rpm离心5分钟收获细胞，用0.9％NaCl洗涤并重悬于破碎缓冲液(50mM磷酸钾，pH7.5，含1mM EDTA和5％甘油)中。使用玻璃珠和vortex处理破碎细胞。破碎缓冲液含1mM PMSF(蛋白酶抑制剂)。以9000rpm离心5分钟，接着以20,000×离心5分钟获得裂解酶提取物(上清液)。

以碱性3，5-二硝基水杨酸试剂(DNS)试验裂解酶活性。

将1体积的裂解酶提取物与等体积4％支链淀粉溶液混合。然后在控制的温度下保温反应混合物，以限定的时间间隔取样并分析AF。

也使用放射活性方法分析了裂解酶活性。

反应混合物含10μl ¹⁴C-淀粉溶液(1μCi；Sigma ChemicalsCo.)和10μl裂解酶提取物。反应混合物在25℃静置过夜，然后在通常的TLC系统中分析。使用Instant Imager(Pachard InstrumentCo.，Inc.，Meriden，CT)检测产生的放射活性AF。

电泳和Western印迹

使用8-25％梯度凝胶和PhastSystem(Pharmacia)进行SDS-PAGE。也在PhastSystem的半干燥转移单位上进行了Western印迹。产生的抗从青岛(中国)收集的红海藻中纯化的裂解酶之第一抗体以1∶100稀释使用。与碱性磷酸酶连接的猪抗兔IgG(Dako A/S，Glostrup，Denmark)用作第二抗体并以1∶1000稀释使用。

I部分，含上述构建体的毕赤氏酵母属转化子的分析

^*比活性定义为在25℃下每mg蛋白质每分钟产生的AF nmol值。

II部分：曲霉属转化子

结果：

I.培养5天后(含0.2％酪蛋白酶促水解产物的基础培养基)以碱性3，5-二硝基水杨酸试剂分析来测定裂解酶活性：

无细胞提取物中的裂解酶活性分析：

培养物名称	比活性^*
培养物名称	比活性^*	8.13	11
8.16	538	8.13	11
8.16	538	8.19	37

^*比活性定义为在25℃下每mg蛋白质每分钟产生的AF nmol值。

结果表明：在黑色曲霉细胞内表达MC-裂解酶。

II，以放射活性方法试验裂解酶活性

下列培养物的无细胞提取物含¹⁴C标记的AF。

51+，54+，55+，59+，512，513，514，515，516，518，519。

使用¹⁴C-淀粉作底物的α-1，4-葡聚糖裂解酶反应之降解产物的TLC如图20所示。将反应混合物上样到TLC上。泳道号与培养物名称相对应：1，512；2，513；3，514；4，515；5，516：6，517；7，518；8，519；9，520。快速移动点是AF。

C.来源＝藻类本身

用于酶纯化和从Gracilariopsis lemaneiformis(从Santa Cruz获得)获得的α-1，4-葡聚糖裂解酶的鉴定之方案基本上与上面所述的方案(例如，用于Morchella costata的方案)相同(结果相似)。

1.从加利福利亚收集的无寄生物的红海藻Gracilariopsis

lemaneiformis的α-1，4-葡聚糖裂解酶的鉴定

裂解酶的氨基酸组成在下表中给出：

氨基酸残基每种残基的mol％

Asx 15.42

Thr 5.24

Ser 6.85

GLx 9.46

Pro 5.46

Gly 9.08

Ala 5.38

1/2Cys 1.57

Val 6.60

Met 2.90

Ile 3.66

Leu 6.00

Tyr 6.00

Phe 4.37

His 1.65

Lys 4.44

Arg 4.17

Trp 1.75

总计： 100.00

2.序列分析：

比较来自加利福利亚藻类的肽序列与来自中国真菌感染的藻类的氨基酸序列表明两蛋白质序列之间显示出高度同源性(从PCR片段产生的氨基酸序列与中国藻类GL的相应序列之间有78％到80％的相同性)。

从加利福利亚藻类的两个序列产生了3个寡核苷酸以产生大约970bp的PCR片段。

引物1：ATGAC(GATC)AA(CT)TA(CT)AA(CT)TA(CT)GA(CT)AA

引物2：(AG)TG(GATC)GGCATCAT(GATC)GC(GATC)GG(GATC)AC

引物3：GTCAT(GA)TC(CT)TGCCA(GATC)AC(GA)AA(GA)TC

在第一次PCR扩增中引物1用作上游引物，引物2用作下游引物。在第二次PCR扩增中，引物1用作上游引物，引物3用作下游引物。产生了一个预期大小的PCR片段并将它克隆进Novagen pT 7blue载体中。测序了含PCR片段的3个独立的质粒，可见这三个克隆的PCR片段含来自3个不同蛋白质的肽序列的密码子。这表明在加利福利亚藻类中至少有3种不同的编码α-1，4-葡聚糖裂解酶的基因。

3.在达到最大速度一半时的底浓度对支链淀粉是3.76mg/ml，对糖原是3.37mg/ml。

4.下面给出了裂解酶对各种底物的降解率：

底物	释放的AF(nmol)
底物	释放的AF(nmol)	麦芽糖	657
麦芽三糖	654	麦芽糖	657
麦芽三糖	654	麦芽四糖	670
麦芽五糖	674	麦芽四糖	670
麦芽五糖	674	麦芽六糖	826
麦芽七糖	865	麦芽六糖	826
麦芽七糖	865	糊精20	775
糊精15	775	糊精20	775
糊精15	775	糊精10	844
支链淀粉	732	糊精10	844
支链淀粉	732	糖原	592

反应条件：反应混合物含10mM HOAc-NaOAc(pH3.8)。底物浓度是10mg/ml。加入裂解酶和水后的终体积是100μl。在45℃下的反应时间为40分钟。

裂解酶不能降解出芽短梗孢糖，黑曲霉四糖，海藻糖，异麦芽糖，葡萄糖，α-，β-和γ-环糊精。裂解酶降解6-α-葡糖基麦芽糖和nigerose，尽管其降解速率缓慢。

5.当使用支链淀粉作底物时裂解酶的温度最适值为48℃，当使用糖原作底物时为50℃。在50℃时，糖原反应性与支链淀粉相似；在50℃以下，支链淀粉是比糖原更好的底物。

6.裂解酶的pH最适值范围在pH3.5和pH7.0之间；最适pH为3.8。在pH试验中所用的缓冲液是甘氨酸-HCl(pH2.2-3.6)；NaOAc-HOAc(pH3.5-5.5)：Mes-NaOH(pH5.5-6.7)；Mops-NaOH(pH6.0-8.0)和N-二(羟乙基)甘氨酸-NaOH(pH7.6-9.0)。所用的全部缓冲液是40mM。

7.终浓度为2mM时，对氯汞苯甲酸(PCMB)抑制96％的裂解酶活性，表明-SH基团对酶活性是必需的。

7.进一步的研究

7.1醇类在增加从真菌感染的藻类中纯化的裂解酶活性和稳定性中的影响。

以下面浓度(0％，1％，5％和10％)试验了1-丙醇，2-丙醇和1-丁醇。1-丙醇的最佳浓度为5％，保温6天后可增加34％的AF产率：2-丙醇的最佳浓度1％，保温10天后可增加20％的AF产率；1-丁醇的最佳浓度5％，保温3天后增加52％的AF产率。

以下列浓度(0，1，3，5，7，9，11，13，15％)试验了乙醇。保温7天后的最佳浓度为5％，它能增加12％的AF产率。对于10天保温，最佳浓度为3％，它能增加16％的AF产率。

1-丙醇的影响：

1-丙醇浓度反应时间(天)

(v/v) 0 1 3 6 10

AF产量(μmol)

0％ 0 84 261 451 689

1％ 0 80 280 530 803

5％ 0 115 367 605 853

10％ 0 107 307 456 583

7.2.不同反应介质对真菌感染的藻类纯化的裂解酶和M.costata及普通羊肚菌的真菌裂解酶产生AF的影响。

2.1.来自真菌感染的藻类的裂解酶

结果(见下表)表明：最佳反应介质是5mM的HOAc-NaOAc(pH 3.9)(BACE for short)和含mM浓度的Na₂-EDTA。使用纯水或0.85％NaCl作反应介质的AF生产减小了产率。在BACE中含有0.85％NaCl时也减少AF产率。

反应介质反应时间(天)

0 1 3 8

AF产量(μmol)

BACE 0 229 498 575

水 0 46 128 217

NaCl(0.85％) 0 123 239 249

BACE+NaCl(0.85％)0 153 281 303

2.2.下列缓冲液：Mes-NaOH，Mops-NaOH，Hepes-NaOH，和N-二(羟乙基)甘氨酸-NaOH是M.costata和普通羊肚菌裂解酶的最适反应介质。在HOAc-NaOAc缓冲液中，裂解酶不稳定，因此使用该缓冲系统引起AF产率减少。

7.3.内切淀粉酶和脱支酶对AF生产的影响

3.1.内切淀粉酶的影响

用于AF生产的淀粉可首先经内切淀粉酶或经酸水解液化。

与天然淀粉相比，内切淀粉酶降解的淀粉更适于作裂解酶的底物。在用于裂解酶催化的反应的温度下，淀粉具有有限的溶解力。用内切淀粉酶处理淀粉导致葡萄糖产量增加。关于AF生产，发现还原物质为大约10-15％(根据干物质)时最适于作为裂解酶底物，而用内切淀粉酶进一步处理成19％的还原物质时不再适合于裂解酶。

3.2.支链淀粉酶和异淀粉酶的影响。

从下面结果可见，在pH4.5和5.0时异淀粉酶和支链淀粉酶都增加AF产率达50％。反应系统由加入或不加异淀粉酶或支链淀粉酶(MegaZyme Ltd.)的真菌感染的红藻裂解酶组成。支链淀粉用作底物。在仅有裂解酶存在的条件下产生的AF表达为100％

反应介质的pH

加入的酶 3.5 4.5 5.0

仅有裂解酶 100 100 100

裂解酶+异淀粉酶 136 152 150

裂解酶+支链淀粉酶 132 158 155

4.真菌裂解酶对各种底物的有关降解率

4.1.M.costata裂解酶

用麦芽四糖观察到的活性表达为100％。

底物浓度麦芽糖麦芽三糖麦芽四糖麦芽五糖麦芽六糖麦芽七糖糊精10^*糊精15^*糊精20^*可溶性淀粉支链淀粉糖原

2mg/ml0.540.6100107.186.682.2-^**-----

4mg/ml1.658.6100100.198.281.5------

10mg/ml2.256.010099.795.975.768.361.146.692.9106.5128.5

^*数字表示还原物质的干重含量。

^**，未检测到。

4.2.普通羊肚菌裂解酶

用麦芽四糖观察到的活性处理为100％。全部底物的终浓度为1Omg ml^-1。

底物	活性(％)
底物	活性(％)	麦芽糖	10.1
麦芽三糖	49.8	麦芽糖	10.1
麦芽三糖	49.8	麦芽四糖	100.0
麦芽五糖	79.3	麦芽四糖	100.0
麦芽五糖	79.3	麦芽六糖	92.4
麦芽七糖	73.9	麦芽六糖	92.4
麦芽七糖	73.9	糊精10	62
糊精15	45	糊精10	62
糊精15	45	糊精20	37
可溶淀粉	100.5	糊精20	37
可溶淀粉	100.5	支链淀粉	139.9
糖原	183.3	支链淀粉	139.9

来自M.costata和普通羊肚菌的裂解酶不能降解下列糖类。

对于海藻糖，6-α-葡糖基麦芽糖，nigerose，黑曲霉四糖，葡萄糖，异麦芽糖，α-，β-和γ-环糊精，出芽短梗孢糖和非还原端封闭的对硝基苯基α-D-麦芽七糖，将这些底物与真菌裂解酶保温48小时后，在TLC板上检测不到AF。

7.5.裂解酶催化反应的pH和温度最适值：

GL来源	最适pH	最适pH范围	最适温度
GL来源	最适pH	最适pH范围	最适温度	M.costata	6.5	5.5-7.5	37℃；40℃^a
普通羊肚菌	6.4	5.9-7.6	43℃；48℃^a	M.costata	6.5	5.5-7.5	37℃；40℃^a
普通羊肚菌	6.4	5.9-7.6	43℃；48℃^a	真菌感染的Gracilariopsislemaneiformis	3.8	3.7-4.1	40℃；45℃^a

7.6.糖原对真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis的裂解酶的稳定影响。

结果表明当使用糖原作底物代替支链淀粉时，温度越高，反应率越高。

反应温度

底物 25℃ 30℃ 45℃

支链淀粉 0.818^a 1.133^a 1.171^a

糖原 0.592^a 0.904^a 1.861^a

糖原和支链淀粉之间相对反应率的比率(％)

72.4 79.8 158.9

^a，相对反应率

7.7.裂解酶的分子量和pI值：

使用SDS-PAGE在梯度凝胶(8-25％)上估测真菌感染的G.lemaneiformis裂解酶，明显无真菌的G.lemaneiformis裂解酶的两种形式，M.costata和普通羊肚菌裂解酶的分子量为110,000±10,000道尔顿。

真菌感染的G.lemaneiformis裂解酶的pI为大约3.9。对于普通羊肚菌裂解酶，pI为大约pH4.6，M.costata裂解酶的pI为大约5.0。这些值经过在具有pH梯度从3到9的凝胶上等电聚焦获得。

从氨基酸组成推断的pI值：真菌感染的G.lemaneiformis裂解酶为4.58，M.costata裂解酶为6.30。

7.8.经Western印迹对裂解酶进行免疫学试验。

结果表明：以Western印迹揭示了抗藻类裂解酶的抗体可识别无细胞提取物中和纯化形式的真菌裂解酶。抗从中国收集的藻类的藻类裂解酶纯化形式的抗体也识别从加利福利亚Sant Cruz收集的藻类的裂解酶。

GL来源与抗真菌感染的G.lemaneiformis

GL抗体的反应性

真菌感染的G.lemaneiformis 强烈

加利福利亚G.lemaneiformis

的GL两种形式强烈

M.costata 中等

普通羊肚菌中等

7.9.真菌裂解酶的可逆的和不可逆的抑制剂

9.1.可逆的抑制剂，葡萄糖和麦芽糖。

当使用支链淀粉作底物时，在10mg/ml的底物浓度下，当存在0.1M葡萄糖时，M.costata裂解酶活性减小19.3％；当使用糖原作底物时，活性不受影响。在0.1M麦芽糖存在的条件下对糖原和支链淀粉基活性分别减小48.8％和73.4％。

底物浓度抑制剂

葡萄糖麦芽糖

支链淀粉 1％(2％) 19.3％(7％) 73.4％(67.2％)

糖原 1％(2％) 0.000(-) 48.8％(49.7％)

似乎0.1M葡萄糖的抑制是竞争性的，因为随着底物从1％增加到2％，抑制从19.3％减小到7％，而0.1M麦芽糖的抑制是非竞争性的，因为底物的增加不明显影响抑制程度。

对于普通羊肚菌裂解酶，当使用支链淀粉或糖原作底物时，0.1M葡萄糖和麦芽糖不抑制反应。

底物	葡萄糖	麦芽糖
底物	葡萄糖	麦芽糖	支链淀粉(1％)	28％	80％
糖原(1％)	5％	57％	支链淀粉(1％)	28％	80％

9.2.可逆的抑制剂deoxyjirimycin

使用支链淀粉作底物，在最终底物浓度为2％时，25μMdeoxyjirimycin的存在使藻类裂解酶和M.costata裂解酶活性减小10.4％。在100μM时，两种裂解酶的活性完全丧失。

9.3.不可逆抑制剂：PCMB

在相同的试验条件下，当存在2mM PCMB时，M.costata裂解酶活性减小60％，真菌感染的红藻裂解酶减小98％。这意味着真菌裂解酶对重金属抑制的敏感性小得多。

7.10.实验室规模生产AF的实施例

反应器含1000g糊精(经过用Termamyl将淀粉处理成最终还原物为10％获得)，终体积为4.6升(HOAC-NaOAc，pH3.9，含5mMNa₂-EDTA)。经过加入3mg从真菌感染的藻类纯化的裂解酶。反应在室温下进行。在第19天，加入另一批裂解酶(4mg)。

反应时间(天)

0 1 7 13 19 24 31

产生的AF(克)

0 18 116 195 264 500 668

10.2.使用¹⁴C-淀粉产生¹⁴C-AF

将不均匀标记的¹⁴C-淀粉(340μCi，从Sigma获得)真空干燥以去掉其包含的乙醇，然后溶于2ml水中。经过加入20μl从真菌感染的藻类纯化的裂解酶和20μl支链淀粉酶(MegaZyme Ltd.)起动反应。反应在30℃下进行过夜。在反应中止时，使用截留分子量为10,000的滤膜过滤反应混合物以去掉酶和未反应的淀粉分子。

使用Waters HPLC在Ca₂碳水化合物柱(Chrompack)上进行过滤。使用水作洗脱液。流速为0.5ml/分。AF可有效地从葡萄糖和麦芽糖中分离出来。合并的AF馏分冻干，获得总共140μCi ¹⁴C-AF。

这些发现涉及本发明更进一步的方面，称为可增加反应介质(优选醇类)疏水性的试剂在增强根据本发明的裂解酶的稳定性和活性中的应用。这种增强的稳定性导致AF产率增加。

对于本领域的技术人员而言，不偏离本发明的范围而对本发明进行的其它修改将是显而易见的。

序列描述

(1)一般资料：

(i)申请人：

(A)名称：DANISCO A/S

(B)街道：Langebrogade 1

(C)城市：哥本哈根

(D)州：哥本哈根K

(E)国家：丹麦

(F)邮编(编码)：DK-1001

(ii)发明题目：酶的应用

(iii)序列数：39

(iv)计算机可读形式：

(A)媒体类型：Floppy盘

(B)计算机：IBM PC兼容机

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.25(EPO)

(v)当前申请资料：

申请号：WO PCT/EP94/03397

(2)SEQ ID NO：1资料：

(i)序列特征：

(A)长度：1088个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑：线型

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：

Met Phe Ser Thr Leu Ala Phe Val Ala Pro Ser Ala Leu Gly Ala Ser

1 5 10 15

Thr Phe Val Gly Ala Glu Val Arg Ser Asn Val Arg Ile His Ser Ala

20 25 30

Phe Pro Ala Val His Thr Ala Thr Arg Lys Thr Asn Arg Leu Asn Val

35 40 45

Ser Met Thr Ala Leu Ser Asp Lys Gln Thr Ala Thr Ala Gly Ser Thr

50 55 60

Asp Asn Pro Asp Gly Ile Asp Tyr Lys Thr Tyr Asp Tyr Val Gly Val

65 70 75 80

Trp Gly Phe Ser Pro Leu Ser Asn Thr Asn Trp Phe Ala Ala Gly Ser

85 90 95

Ser Thr Pro Gly Gly Ile Thr Asp Trp Thr Ala Thr Met Asn Val Asn

100 105 110

Phe Asp Arg Ile Asp Asn Pro Ser Ile Thr Val Gln His Pro Val Gln

115 120 125

Val Gln Val Thr Ser Tyr Asn Asn Asn Ser Tyr Arg Val Arg Phe Asn

130 135 140

Pro Asp Gly Pro Ile Arg Asp Val Thr Arg Gly Pro Ile Leu Lys Gln

145 150 155 160

Gln Leu Asp Trp Ile Arg Thr Gln Glu Leu Ser Glu Gly Cys Asp Pro

165 170 175

Gly Met Thr Phe Thr Ser Glu Gly Phe Leu Thr Phe Glu Thr Lys Asp

180 185 190

Leu Ser Val Ile Ile Tyr Gly Asn Phe Lys Thr Arg Val Thr Arg Lys

195 200 205

Ser Asp Gly Lys Val Ile Met Glu Asn Asp Glu Val Gly Thr Ala Ser

210 215 220

Ser Gly Asn Lys Cys Arg Gly Leu Met Phe Val Asp Arg Leu Tyr Gly

225 230 235 240

Asn Ala Ile Ala Ser Val Asn Lys Asn Phe Arg Asn Asp Ala Val Lys

245 250 255

Gln Glu Gly Phe Tyr Gly Ala Gly Glu Val Asn Cys Lys Tyr Gln Asp

260 265 270

Thr Tyr Ile Leu Glu Arg Thr Gly Ile Ala Met Thr Asn Tyr Asn Tyr

275 280 285

Asp Asn Leu Asn Tyr Asn Gln Trp Asp Leu Arg Pro Pro His His Asp

290 295 300

Gly Ala Leu Asn Pro Asp Tyr Tyr Ile Pro Met Tyr Tyr Ala Ala Pro

305 310 315 320

Trp Leu Ile Val Asn Gly Cys Ala Gly Thr Ser Glu Gln Tyr Ser Tyr

325 330 335

Gly Trp Phe Met Asp Asn Val Ser Gln Ser Tyr Met Asn Thr Gly Asp

340 345 350

Thr Thr Trp Asn Ser Gly Gln Glu Asp Leu Ala Tyr Met Gly Ala Gln

355 360 365

Tyr Gly Pro Phe Asp Gln His Phe Val Tyr Gly Ala Gly Gly Gly Met

370 375 380

Glu Cys Val Val Thr Ala Phe Ser Leu Leu Gln Gly Lys Glu Phe Glu

385 390 395 400

Asn Gln Val Leu Asn Lys Arg Ser Val Met Pro Pro Lys Tyr Val Phe

405 410 415

Gly Phe Phe Gln Gly Val Phe Gly Thr Ser Ser Leu Leu Arg Ala His

420 425 430

Met Pro Ala Gly Glu Asn Asn Ile Ser Val Glu Glu Ile Val Glu Gly

435 440 445

Tyr Gln Asn Asn Asn Phe Pro Phe Glu Gly Leu Ala Val Asp Val Asp

450 455 460

Met Gln Asp Asn Leu Arg Val Phe Thr Thr Lys Gly Glu Phe Trp Thr

465 470 475 480

Ala Asn Arg Val Gly Thr Gly Gly Asp Pro Asn Asn Arg Ser Val Phe

485 490 495

Glu Trp Ala His Asp Lys Gly Leu Val Cys Gln Thr Asn Ile Thr Cys

500 505 510

Phe Leu Arg Asn Asp Asn Glu Gly Gln Asp Tyr Glu Val Asn Gln Thr

515 520 525

Leu Arg Glu Arg Gln Leu Tyr Thr Lys Asn Asp Ser Leu Thr Gly Thr

530 535 540

Asp Phe Gly Met Thr Asp Asp Gly Pro Ser Asp Ala Tyr Ile Gly His

545 550 555 560

Leu Asp Tyr Gly Gly Gly Val Glu Cys Asp Ala Leu Phe Pro Asp Trp

565 570 575

Gly Arg Pro Asp Val Ala Glu Trp Trp Gly Asn Asn Tyr Lys Lys Leu

580 585 590

Phe Ser Ile Gly Leu Asp Phe Val Trp Gln Asp Met Thr Val Pro Ala

595 600 605

Met Met Pro His Lys Ile Gly Asp Asp Ile Asn Val Lys Pro Asp Gly

610 615 620

Asn Trp Pro Asn Ala Asp Asp Pro Ser Asn Gly Gln Tyr Asn Trp Lys

625 630 635 640

Thr Tyr His Pro Gln Val Leu Val Thr Asp Met Arg Tyr Glu Asn His

645 650 655

Gly Arg Glu Pro Met Val Thr Gln Arg Asn Ile His Ala Tyr Thr Leu

660 665 670

Cys Glu Ser Thr Arg Lys Glu Gly Ile Val Glu Asn Ala Asp Thr Leu

675 680 685

Thr Lys Phe Arg Arg Ser Tyr Ile Ile Ser Arg Gly Gly Tyr Ile Gly

690 695 700

Asn Gln His Phe Gly Gly Met Trp Val Gly Asp Asn Ser Thr Thr Ser

705 710 715 720

Asn Tyr Ile Gln Met Met Ile Ala Asn Asn Ile Asn Met Asn Met Ser

725 730 735

Cys Leu Pro Leu Val Gly Ser Asp Ile Gly Gly Phe Thr Ser Tyr Asp

740 745 750

Asn Glu Asn Gln Arg Thr Pro Cys Thr Gly Asp Leu Met Val Arg Tyr

755 760 765

Val Gln Ala Gly Cys Leu Leu Pro Trp Phe Arg Asn His Tyr Asp Arg

770 775 780

Trp Ile Glu Ser Lys Asp His Gly Lys Asp Tyr Gln Glu Leu Tyr Met

785 790 795 800

Tyr Pro Asn Glu Met Asp Thr Leu Arg Lys Phe Val Glu Phe Arg Tyr

805 810 815

Arg Trp Gln Glu Val Leu Tyr Thr Ala Met Tyr Gln Asn Ala Ala Phe

820 825 830

Gly Lys Pro Ile Ile Lys Ala Ala Ser Met Tyr Asn Asn Asp Ser Asn

835 840 845

Val Arg Arg Ala Gln Asn Asp His Phe Leu Leu Gly Gly His Asp Gly

850 855 860

Tyr Arg Ile Leu Cys Ala Pro Val Val Trp Glu Asn Ser Thr Glu Arg

865 870 875 880

Glu Leu Tyr Leu Pro Val Leu Thr Gln Trp Tyr Lys Phe Gly Pro Asp

885 890 895

Phe Asp Thr Lys Pro Leu Glu Gly Ala Net Asn Gly Gly Asp Arg Ile

900 905 910

Tyr Asn Tyr Pro Val Pro Gln Ser Glu Ser Pro Ile Phe Val Arg Glu

915 920 925

Gly Ala Ile Leu Pro Thr Arg Tyr Thr Leu Asn Gly Glu Asn Lys Ser

930 935 940

Leu Asn Thr Tyr Thr Asp Glu Asp Pro Leu Val Phe Glu Val Phe Pro

945 950 955 960

Leu Gly Asn Asn Arg Ala Asp Gly Met Cys Tyr Leu Asp Asp Gly Gly

965 970 975

Val Thr Thr Asn Ala Glu Asp Asn Gly Lys Phe Ser Val Val Lys Val

980 985 990

Ala Ala Glu Gln Asp Gly Gly Thr Glu Thr Ile Thr Phe Thr Asn Asp

995 1000 1005

Cys Tyr Glu Tyr Val Phe Gly Gly Pro Phe Tyr Val Arg Val Arg Gly

1010 1015 1020

Ala Gln Ser Pro Ser Asn Ile His Val Ser Ser Gly Ala Gly Ser Gln

1025 1030 1035 1040

Asp Met Lys Val Ser Ser Ala Thr Ser Arg Ala Ala Leu Phe Asn Asp

1045 1050 1055

Gly Glu Asn Gly Asp Phe Trp Val Asp Gln Glu Thr Asp Ser Leu Trp

1060 1065 1070

Leu Lys Leu Pro Asn Val Val Leu Pro Asp Ala Val Ile Thr Ile Thr

1075 1080 1085

(2)SEQ ID NO：2资料：

(i)序列特征：

(A)长度：1091个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑：线型

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：

Met Tyr Pro Thr Leu Thr Phe Val Ala Pro Ser Ala Leu Gly Ala Arg

1 5 10 15

Thr Phe Thr Cys Val Gly Ile Phe Arg Ser His Ile Leu Ile His Ser

20 25 30

Val Val Pro Ala Val Arg Leu Ala Val Arg Lys Ser Asn Arg Leu Asn

35 40 45

Val Ser Met Ser Ala Leu Phe Asp Lys Pro Thr Ala Val Thr Gly Gly

50 55 60

Lys Asp Asn Pro Asp Asn Ile Asn Tyr Thr Thr Tyr Asp Tyr Val Pro

65 70 75 80

Val Trp Arg Phe Asp Pro Leu Ser Asn Thr Asn Trp Phe Ala Ala Gly

85 90 95

Ser Ser Thr Pro Gly Asp Ile Asp Asp Trp Thr Ala Thr Met Asn Val

100 105 110

Asn Phe Asp Arg Ile Asp Asn Pro Ser Phe Thr Leu Glu Lys Pro Val

115 120 125

Gln Val Gln Val Thr Ser Tyr Lys Asn Asn Cys Phe Arg Val Arg Phe

130 135 140

Asn Pro Asp Gly Pro Ile Arg Asp Val Asp Arg Gly Pro Ile Leu Gln

145 150 155 160

Gln Gln Leu Asn Trp Ile Arg Lys Gln Glu Gln Ser Lys Gly Phe Asp

165 170 175

Pro Lys Met Gly Phe Thr Lys Glu Gly Phe Leu Lys Phe Glu Thr Lys

180 185 190

Asp Leu Asn Val I1e Ile Tyr Gly Asn Phe Lys Thr Arg Val Thr Arg

195 200 205

Lys Arg Asp Gly Lys Gly Ile Met Glu Asn Asn Glu Val Pro Ala Gly

210 215 220

Ser Leu Gly Asn Lys Cys Arg Gly Leu Met Phe Val Asp Arg Leu Tyr

225 230 235 240

Gly Thr Ala Ile Ala Ser Val Asn Glu Asn Tyr Arg Asn Asp Pro Asp

245 250 255

Arg Lys Glu Gly Phe Tyr Gly Ala Gly Glu Val Asn Cys Glu Phe Trp

260 265 270

Asp Ser Glu Gln Asn Arg Asn Lys Tyr Ile Leu Glu Arg Thr Gly Ile

275 280 285

Ala Met Thr Asn Tyr Asn Tyr Asp Asn Tyr Asn Tyr Asn Gln Ser Asp

290 295 300

Leu Ile Ala Pro Gly Tyr Pro Ser Asp Pro Asn Phe Tyr Ile Pro Met

305 310 315 320

Tyr Phe Ala Ala Pro Trp Val Val Val Lys Gly Cys Ser Gly Asn Ser

325 330 335

Asp Glu Gln Tyr Ser Tyr Gly Trp Phe Met Asp Asn Val Ser Gln Thr

340 345 350

Tyr Met Asn Thr Gly Gly Thr Ser Trp Asn Cys Gly Glu Glu Asn Leu

353 360 365

Ala Tyr Met Gly Ala Gln Cys Gly Pro Phe Asp Gln His Phe Val Tyr

370 375 380

Gly Asp Gly Asp Gly Leu Glu Asp Val Val Gln Ala Phe Ser Leu Leu

385 390 395 400

Gln Gly Lys Glu Phe Glu Asn Gln Val Leu Asn Lys Arg Ala Val Met

405 410 415

Pro Pro Lys Tyr Val Phe Gly Tyr Phe Gln Gly Val Phe Gly Ile Ala

420 425 430

Ser Leu Leu Arg Glu Gln Arg Pro Glu Gly Gly Asn Asn Ile Ser Val

435 440 445

Gln Glu Ile Val Glu Gly Tyr Gln Ser Asn Asn Phe Pro Leu Glu Gly

450 455 460

Leu Ala Val Asp Val Asp Met Gln Gln Asp Leu Arg Val Phe Thr Thr

465 470 475 480

Lys Ile Glu Phe Trp Thr Ala Asn Lys Val Gly Thr Gly Gly Asp Ser

485 490 495

Asn Asn Lys Ser Val Phe Glu Trp Ala His Asp Lys Gly Leu Val Cys

500 505 510

Gln Thr Asn Val Thr Cys Phe Leu Arg Asn Asp Asn Gly Gly Ala Asp

515 520 525

Tyr Glu Val Asn Gln Thr Leu Arg Glu Lys Gly Leu Tyr Thr Lys Asn

530 535 540

Asp Ser Leu Thr Asn Thr Asn Phe Gly Thr Thr Asn Asp Gly Pro Ser

545 550 555 560

Asp Ala Tyr Ile Gly His Leu Asp Tyr Gly Gly Gly Gly Asn Cys Asp

565 570 575

Ala Leu Phe Pro Asp Trp Gly Arg Pro Gly Val Ala Glu Trp Trp Gly

580 585 590

Asp Asn Tyr Ser Lys Leu Phe Lys Ile Gly Leu Asp Phe Val Trp Gln

595 600 605

Asp Met Thr Val Pro Ala Met Met Pro His Lys Val Gly Asp Ala Val

610 615 620

Asp Thr Arg Ser Pro Tyr Gly Trp Pro Asn Glu Asn Asp Pro Ser Asn

625 630 635 640

Gly Arg Tyr Asn Trp Lys Ser Tyr His Pro Gln Val Leu Val Thr Asp

645 650 655

Met Arg Tyr Glu Asn His Gly Arg Glu Pro Met Phe Thr Gln Arg Asn

660 665 670

Met His Ala Tyr Thr Leu Cys Glu Ser Thr Arg Lys Glu Gly Ile Val

675 680 685

Ala Asn Ala Asp Thr Leu Thr Lys Phe Arg Arg Ser Tyr Ile Ile Ser

690 695 700

Arg Gly Gly Tyr Ile Gly Asn Gln His Phe Gly Gly Met Trp Val Gly

705 710 715 720

Asp Asn Ser Ser Ser Gln Arg Tyr Leu Gln Met Met Ile Ala Asn Ile

725 730 735

Val Asn Met Asn Met Ser Cys Leu Pro Leu Val Gly Ser Asp Ile Gly

740 745 750

Gly Phe Thr Ser Tyr Asp Gly Arg Asn Val Cys Pro Gly Asp Leu Met

755 760 765

Val Arg Phe Val Gln Ala Gly Cys Leu Leu Pro Trp Phe Arg Asn His

770 775 780

Tyr Gly Arg Leu Val Glu Gly Lys Gln Glu Gly Lys Tyr Tyr Gln Glu

785 790 795 800

Leu Tyr Met Tyr Lys Asp Glu Met Ala Thr Leu Arg Lys Phe Ile Glu

805 810 815

Phe Arg Tyr Arg Trp Gln Glu Val Leu Tyr Thr Ala Met Tyr Gln Asn

820 825 830

Ala Ala Phe Gly Lys Pro Ile Ile Lys Ala Ala Ser Met Tyr Asp Asn

835 840 845

Asp Arg Asn Val Arg Gly Ala Gln Asp Asp His Phe Leu Leu Gly Gly

850 855 860

His Asp Gly Tyr Arg Ile Leu Cys Ala Pro Val Val Trp Glu Asn Thr

865 870 875 880

Thr Ser Arg Asp Leu Tyr Leu Pro Val Leu Thr Lys Trp Tyr Lys Phe

885 890 895

Gly Pro Asp Tyr Asp Thr Lys Arg Leu Asp Ser Ala Leu Asp Gly Gly

900 905 910

Gln Met Ile Lys Asn Tyr Ser Val Pro Gln Ser Asp Ser Pro Ile Phe

915 920 925

Val Arg Glu Gly Ala Ile Leu Pro Thr Arg Tyr Thr Leu Asp Gly Ser

930 935 940

Asn Lys Ser Met Asn Thr Tyr Thr Asp Lys Asp Pro Leu Val Phe Glu

945 950 955 960

Val Phe Pro Leu Gly Asn Asn Arg Ala Asp Gly Met Cys Tyr Leu Asp

965 970 975

Asp Gly Gly Ile Thr Thr Asp Ala Glu Asp His Gly Lys Phe Ser Val

980 985 990

Ile Asn Val Glu Ala Leu Arg Lys Gly Val Thr Thr Thr Ile Lys Phe

995 1000 1005

Ala Tyr Asp Thr Tyr Gln Tyr Val Phe Asp Gly Pro Phe Tyr Val Arg

1010 1015 1020

Ile Arg Asn Leu Thr Thr Ala Ser Lys Ile Asn Val Ser Ser Gly Ala

1025 1030 1035 1040

Gly Glu Glu Asp Met Thr Pro Thr Ser Ala Asn Ser Arg Ala Ala Leu

1045 1050 1055

Phe Ser Asp Gly Gly Val Gly Glu Tyr Trp Ala Asp Asn Asp Thr Ser

1060 1065 1070

Ser Leu Trp Met Lys Leu Pro Asn Leu Val Leu Gln Asp Ala Val Ile

1075 1080 1085

Thr Ile Thr

1090

(2)SEQ ID NO：3资料：

(i)序列特征：

(A)长度：3267个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：

ATGTTTTCAA CCCTTGCGTT TGTCGCACCT AGTGCGCTGG GAGCCAGTAC CTTCGTAGGG 60

GCGGAGGTCA GGTCAAATGT TCGTATCCAT TCCGCTTTTC CAGCTGTGCA CACAGCTACT 120

CGCAAAACCA ATCGCCTCAA TGTATCCATG ACCGCATTGT CCGACAAACA AACGGCTACT 180

GCGGGTAGTA CAGACAATCC GGACGGTATC GACTACAAGA CCTACGATTA CGTCGGAGTA 240

TGGGGTTTCA GCCCCCTCTC CAACACGAAC TGGTTTGCTG CCGGCTCTTC TACCCCGGGT 300

GGCATCACTG ATTGGACGGC TACAATGAAT GTCAACTTCG ACCGTATCGA CAATCCGTCC 360

ATCACTGTCC AGCATCCCGT TCAGGTTCAG GTCACGTCAT ACAACAACAA CAGCTACAGG 420

GTTCGCTTCA ACCCTGATGG CCCTATTCGT GATGTGACTC GTGGGCCTAT CCTCAAGCAG 480

CAACTAGATT GGATTCGAAC GCAGGAGCTG TCAGAGGGAT GTGATCCCGG AATGACTTTC 540

ACATCAGAAG GTTTCTTGAC TTTTGAGACC AAGGATCTAA GCGTCATCAT CTACGGAAAT 600

TTCAAGACCA GAGTTACGAG AAAGTCTGAC GGCAAGGTCA TCATGGAAAA TGATGAAGTT 660

GGAACTGCAT CGTCCGGGAA CAAGTGCCGG GGATTGATGT TCGTTGATAG ATTATACGGT 720

AACGCTATCG CTTCCGTCAA CAAGAACTTC CGCAACGACG CGGTCAAGCA GGAGGGATTC 780

TATGGTGCAG GTGAAGTCAA CTGTAAGTAC CAGGACACCT ACATCTTAGA ACGCACTGGA 840

ATCGCCATGA CAAATTACAA CTACGATAAC TTGAACTATA ACCAGTGGGA CCTTAGACCT 900

CCGCATCATG ATGGTGCCCT CAACCCAGAC TATTATATTC CAATGTACTA CGCAGCACCT 960

TGGTTGATCG TTAATGGATG CGCCGGTACT TCGGAGCAGT ACTCGTATGG ATGGTTCATG 1020

GACAATGTCT CTCAATCTTA CATGAATACT GGAGATACTA CCTGGAATTC TGGACAAGAG 1080

GACCTGGCAT ACATGGGCGC GCAGTATGGA CCATTTGACC AACATTTTGT TTACGGTGCT 1140

GGGGGTGGGA TGGAATGTGT GGTCACAGCG TTCTCTCTTC TACAAGGCAA GGAGTTCGAG 1200

AACCAAGTTC TCAACAAACG TTCAGTAATG CCTCCGAAAT ACGTCTTTGG TTTCTTCCAG 1260

GGTGTTTTCG GGACTTCTTC CTTGTTGAGA GCGCATATGC CAGCAGGTGA GAACAACATC 1320

TCAGTCGAAG AAATTGTAGA AGGTTATCAA AACAACAATT TCCCTTTCGA GGGGCTCGCT 1380

GTGGACGTGG ATATGCAAGA CAACTTGCGG GTGTTCACCA CGAAGGGCGA ATTTTGGACC 1440

GCAAACAGGG TGGGTACTGG CGGGGATCCA AACAACCGAT CGGTTTTTGA ATGGGCACAT 1500

GACAAAGGCC TTGTTTGTCA GACAAATATA ACTTGCTTCC TGAGGAATGA TAACGAGGGG 1560

CAAGACTACG AGGTCAATCA GACGTTAAGG GAGAGGCAGT TGTACACGAA GAACGACTCC 1620

CTGACGGGTA CGGATTTTGG AATGACCGAC GACGGCCCCA GCGATGCGTA CATCGGTCAT 1680

CTGGACTATG GGGGTGGAGT AGAATGTGAT GCACTTTTCC CAGACTGGGG ACGGCCTGAC 1740

GTGGCCGAAT GGTGGGGAAA TAACTATAAG AAACTGTTCA GCATTGGTCT CGACTTCGTC 1800

TGGCAAGACA TGACTGTTCC AGCAATGATG CCGCACAAAA TTGGCGATGA CATCAATGTG 1860

AAACCGGATG GGAATTGGCC GAATGCGGAC GATCCGTCCA ATGGACAATA CAACTGGAAG 1920

ACGTACCATC CCCAAGTGCT TGTAACTGAT ATGCGTTATG AGAATCATGG TCGGGAACCG 1980

ATGGTCACTC AACGCAACAT TCATGCGTAT ACACTGTGCG AGTCTACTAG GAAGGAAGGG 2040

ATCGTGGAAA ACGCAGACAC TCTAACGAAG TTCCGCCGTA GCTACATTAT CAGTCGTGGT 2100

GGTTACATTG GTAACCAGCA TTTCGGGGGT ATGTGGGTGG GAGACAACTC TACTACATCA 2160

AACTACATCC AAATGATGAT TGCCAACAAT ATTAACATGA ATATGTCTTG CTTGCCTCTC 2220

GTCGGCTCCG ACATTGGAGG ATTCACCTCA TACGACAATG AGAATCAGCG AACGCCGTGT 2280

ACCGGGGACT TGATGGTGAG GTATGTGCAG GCGGGCTGCC TGTTGCCGTG GTTCAGGAAC 2340

CACTATGATA GGTGGATCGA GTCCAAGGAC CACGGAAAGG ACTACCAGGA GCTGTACATG 2400

TATCCGAATG AAATGGATAC GTTGAGGAAG TTCGTTGAAT TCCGTTATCG CTGGCAGGAA 2460

GTGTTGTACA CGGCCATGTA CCAGAATGCG GCTTTCGGAA AGCCGATTAT CAAGGCTGCT 2520

TCGATGTACA ATAACGACTC AAACGTTCGC AGGGCGCAGA ACGATCATTT CCTTCTTGGT 2580

GGACATGATG GATATCGCAT TCTGTGCGCG CCTGTTGTGT GGGAGAATTC GACCGAACGC 2640

GAATTGTACT TGCCCGTGCT GACCCAATGG TACAAATTCG GTCCCGACTT TGACACCAAG 2700

CCTCTGGAAG GAGCGATGAA CGGAGGGGAC CGAATTTACA ACTACCCTGT ACCGCAAAGT 2760

GAATCACCAA TCTTCGTGAG AGAAGGTGCG ATTCTCCCTA CCCGCTACAC GTTGAACGGT 2820

GAAAACAAAT CATTGAACAC GTACACGGAC GAAGATCCGT TGGTGTTTGA AGTATTCCCC 2880

CTCGGAAACA ACCGTGCCGA CGGTATGTGT TATCTTGATG ATGGCGGTGT GACCACCAAT 2940

GCTGAAGACA ATGGCAAGTT CTCTGTCGTC AAGGTGGCAG CGGAGCAGGA TGGTGGTACG 3000

GAGACGATAA CGTTTACGAA TGATTGCTAT GAGTACGTTT TCGGTGGACC GTTCTACGTT 3060

CGAGTGCGCG GCGCTCAGTC GCCGTCGAAC ATCCACGTGT CTTCTGGAGC GGGTTCTCAG 3120

GACATGAAGG TGAGCTCTGC CACTTCCAGG GCTGCGCTGT TCAATGACGG GGAGAACGGT 3180

GATTTCTGGG TTGACCAGGA GACAGATTCT CTGTGGCTGA AGTTGCCCAA CGTTGTTCTC 3240

CCGGACGCTG TGATCACAAT TACCTAA 3267

(2)SEQ ID NO：4资料：

(i)序列特征：

(A)长度：3276个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：

ATGTATCCAA CCCTCACCTT CGTGGCGCCT AGTGCGCTAG GGGCCAGAAC TTTCACGTGT 60

GTGGGCATTT TTAGGTCACA CATTCTTATT CATTCGGTTG TTCCAGCGGT GCGTCTAGCT 120

GTGCGCAAAA GCAACCGCCT CAATGTATCC ATGTCCGCTT TGTTCGACAA ACCGACTGCT 180

GTTACTGGAG GGAAGGACAA CCCGGACAAT ATCAATTACA CCACTTATGA CTACGTCCCT 240

GTGTGGCGCT TCGACCCCCT CAGCAATACG AACTGGTTTG CTGCCGGATC TTCCACTCCC 300

GGCGATATTG ACGACTGGAC GGCGACAATG AATGTGAACT TCGACCGTAT CGACAATCCA 360

TCCTTCACTC TCGAGAAACC GGTTCAGGTT CAGGTCACGT CATACAAGAA CAATTGTTTC 420

AGGGTTCGCT TCAACCCTGA TGGTCCTATT CGCGATGTGG ATCGTGGGCC TATCCTCCAG 480

CAGCAACTAA ATTGGATCCG GAAGCAGGAG CAGTCGAAGG GGTTTGATCC TAAGATGGGC 540

TTCACAAAAG AAGGTTTCTT GAAATTTGAG ACCAAGGATC TGAACGTTAT CATATATGGC 600

AATTTTAAGA CTAGAGTTAC GAGGAAGAGG GATGGAAAAG GGATCATGGA GAATAATGAA 660

GTGCCGGCAG GATCGTTAGG GAACAAGTGC CGGGGATTGA TGTTTGTCGA CAGGTTGTAC 720

GGCACTGCCA TCGCTTCCGT TAATGAAAAT TACCGCAACG ATCCCGACAG GAAAGAGGGG 780

TTCTATGGTG CAGGAGAAGT AAACTGCGAG TTTTGGGACT CCGAACAAAA CAGGAACAAG 840

TACATCTTAG AACGAACTGG AATCGCCATG ACAAATTACA ATTATGACAA CTATAACTAC 900

AACCAGTCAG ATCTTATTGC TCCAGGATAT CCTTCCGACC CGAACTTCTA CATTCCCATG 960

TATTTTGCAG CACCTTGGGT AGTTGTTAAG GGATGCAGTG GCAACAGCGA TGAACAGTAC 1020

TCGTACGGAT GGTTTATGGA TAATGTCTCC CAAACTTACA TGAATACTGG TGGTACTTCC 1080

TGGAACTGTG GAGAGGAGAA CTTGGCATAC ATGGGAGCAC AGTGCGGTCC ATTTGACCAA 1140

CATTTTGTGT ATGGTGATGG AGATGGTCTT GAGGATGTTG TCCAAGCGTT CTCTCTTCTG 1200

CAAGGCAAAG AGTTTGAGAA CCAAGTTCTG AACAAACGTG CCGTAATGCC TCCGAAATAT 1260

GTGTTTGGTT ACTTTCAGGG AGTCTTTGGG ATTGCTTCCT TGTTGAGAGA GCAAAGACCA 1320

GAGGGTGGTA ATAACATCTC TGTTCAAGAG ATTGTCGAAG GTTACCAAAG CAATAACTTC 1380

CCTTTAGACG GGTTAGCCGT AGATGTGGAT ATGCAACAAG ATTTGCGCGT GTTCACCACG 1440

AAGATTGAAT TTTGGACGGC AAATAAGGTA GGCACCGGGG GAGACTCGAA TAACAAGTCG 1500

GTGTTTGAAT GGGCACATGA CAAAGGCCTT GTATGTCAGA CGAATGTTAC TTGCTTCTTG 1560

AGAAACGACA ACGGCGGGGC AGATTACGAA GTCAATCAGA CATTGAGGGA GAAGGGTTTG 1620

TACACGAAGA ATGACTCACT GACGAACACT AACTTCGGAA CTACCAACGA CGGGCCGAGC 1680

GATGCGTACA TTGGACATCT GGACTATGGT GGCGGAGGGA ATTGTGATGC ACTTTTCCCA 1740

GACTGGGGTC GACCGGGTGT GGCTGAATGG TGGGGTGATA ACTACAGCAA GCTCTTCAAA 1800

ATTGGTCTGG ATTTCGTCTG GCAAGACATG ACAGTTCCAG CTATGATGCC ACACAAAGTT 1860

GGCGACGCAG TCGATACGAG ATCACCTTAC GGCTGGCCGA ATGAGAATGA TCCTTCGAAC 1920

GGACGATACA ATTGGAAATC TTACCATCCA CAAGTTCTCG TAACTGATAT GCGATATGAG 1980

AATCATGGAA GGGAACCGAT GTTCACTCAA CGCAATATGC ATGCGTACAC ACTCTGTGAA 2040

TCTACGAGGA AGGAAGGGAT TGTTGCAAAT GCAGACACTC TAACGAAGTT CCGCCGCAGT 2100

TATATTATCA GTCGTGGAGG TTACATTGGC AACCAGCATT TTGGAGGAAT GTGGGTTGGA 2160

GACAACTCTT CCTCCCAAAG ATACCTCCAA ATGATGATCG CGAACATCGT CAACATGAAC 2220

ATGTCTTGCC TTCCACTAGT TGGGTCCGAC ATTGGAGGTT TTACTTCGTA TGATGGACGA 2280

AACGTGTGTC CCGGGGATCT AATGGTAAGA TTCGTGCAGG CGGGTTGCTT ACTACCGTGG 2340

TTCAGAAACC ACTATGGTAG GTTGGTCGAG GGCAAGCAAG AGGGAAAATA CTATCAAGAA 2400

CTGTACATGT ACAAGGACGA GATGGCTACA TTGAGAAAAT TCATTGAATT CCGTTACCGC 2460

TGGCAGGAGG TGTTGTACAC TGCTATGTAC CAGAATGCGG CTTTCGGGAA ACCGATTATC 2520

AAGGCAGCTT CCATGTACGA CAACGACAGA AACGTTCGCG GCGCACAGGA TGACCACTTC 2580

CTTCTCGGCG GACACGATGG ATATCGTATT TTGTGTGCAC CTGTTGTGTG GGAGAATACA 2640

ACCAGTCGCG ATCTGTACTT GCCTGTGCTG ACCAAATGGT ACAAATTCGG CCCTGACTAT 2700

GACACCAAGC GCCTGGATTC TGCGTTGGAT GGAGGGCAGA TGATTAAGAA CTATTCTGTG 2760

CCACAAAGCG ACTCTCCGAT ATTTGTGAGG GAAGGAGCTA TTCTCCCTAC CCGCTACACG 2820

TTGGACGGTT CGAACAAGTC AATGAACACG TACACAGACA AAGACCCGTT GGTGTTTGAG 2880

GTATTCCCTC TTGGAAACAA CCGTGCCGAC GGTATGTGTT ATCTTGATGA TGGCGGTATT 2940

ACTACAGATG CTGAGGACCA TGGCAAATTC TCTGTTATCA ATGTCGAAGC CTTACGGAAA 3000

GGTGTTACGA CGACGATCAA GTTTGCGTAT GACACTTATC AATACGTATT TGATGGTCCA 3060

TTCTACGTTC GAATCCGTAA TCTTACGACT GCATCAAAAA TTAACGTGTC TTCTGGAGCG 3120

GGTGAAGAGG ACATGACACC GACCTCTGCG AACTCGAGGG CAGCTTTGTT CAGTGATGGA 3180

GGTGTTGGAG AATACTGGGC TGACAATGAT ACGTCTTCTC TGTGGATGAA GTTGCCAAAC 3240

CTGGTTCTGC AAGACGCTGT GATTACCATT ACGTAG 3276

(2)SEQ ID N0：5资料：

(i)序列特征：

(A)长度：1066个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑：线型

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：

Met Ala Gly Phe Ser Asp Pro Leu Asn Phe Cys Lys Ala Glu Asp Tyr

1 5 10 15

Tyr Ser Val Ala Leu Asp Trp Lys Gly Pro Gln Lys Ile Ile Gly Val

20 25 30

Asp Thr Thr Pro Pro Lys Ser Thr Lys Phe Pro Lys Asn Trp His Gly

35 40 45

Val Asn Leu Arg Phe Asp Asp Gly Thr Leu Gly Val Val Gln Phe Ile

50 55 60

Arg Pro Cys Val Trp Arg Val Arg Tyr Asp Pro Gly Phe Lys Thr Ser

65 70 75 80

Asp Glu Tyr Gly Asp Glu Asn Thr Arg Thr Ile Val Gln Asp Tyr Met

85 90 95

Ser Thr Leu Ser Asn Lys Leu Asp Thr Tyr Arg Gly Leu Thr Trp Glu

100 105 110

Thr Lys Cys Glu Asp Ser Gly Asp Phe Phe Thr Phe Ser Ser Lys Val

115 120 125

Thr Ala Val Glu Lys Ser Glu Arg Thr Arg Asn Lys Val Gly Asp Gly

130 135 140

Leu Arg Ile His Leu Trp Lys Ser Pro Phe Arg Ile Gln Val Val Arg

145 150 155 160

Thr Leu Thr Pro Leu Lys Asp Pro Tyr Pro Ile Pro Asn Val Ala Ala

165 170 175

Ala Glu Ala Arg Val Ser Asp Lys Val Val Trp Gln Thr Ser Pro Lys

180 185 190

Thr Phe Arg Lys Asn Leu His Pro Gln His Lys Met Leu Lys Asp Thr

195 200 205

Val Leu Asp Ile Val Lys Pro Gly His Gly Glu Tyr Val Gly Trp Gly

210 215 220

Glu Met Gly Gly Ile Gln Phe Met Lys Glu Pro Thr Phe Met Asn Tyr

225 230 235 240

Phe Asn Phe Asp Asn Met Gln Tyr Gln Gln Val Tyr Ala Gln Gly Ala

245 250 255

Leu Asp Ser Arg Glu Pro Leu Tyr His Ser Asp Pro Phe Tyr Leu Asp

260 265 270

Val Asn Ser Asn Pro Glu His Lys Asn Ile Thr Ala Thr Phe Ile Asp

275 280 285

Asn Tyr Ser Gln Ile Ala Ile Asp Phe Gly Lys Thr Asn Ser Gly Tyr

290 295 300

Ile Lys Leu Gly Thr Arg Tyr Gly Gly Ile Asp Cys Tyr Gly Ile Ser

305 310 315 320

Ala Asp Thr Val Pro Glu Ile Val Arg Leu Tyr Thr Gly Leu Val Gly

325 330 335

Arg Ser Lys Leu Lys Pro Arg Tyr Ile Leu Gly Ala His Gln Ala Cys

340 345 350

Tyr Gly Tyr Gln Gln Glu Ser Asp Leu Tyr Ser Val Val Gln Gln Tyr

355 360 365

Arg Asp Cys Lys Phe Pro Leu Asp Gly Ile His Val Asp Val Asp Val

370 375 380

Gln Asp Gly Phe Arg Thr Phe Thr Thr Asn Pro His Thr Phe Pro Asn

385 390 395 400

Pro Lys Glu Met Phe Thr Asn Leu Arg Asn Asn Gly Ile Lys Cys Ser

405 410 415

Thr Asn Ile Thr Pro Val Ile Ser Ile Asn Asn Arg Glu Gly Gly Tyr

420 425 430

Ser Thr Leu Leu Glu Gly Val Asp Lys Lys Tyr Phe Ile Met Asp Asp

435 440 445

Arg Tyr Thr Glu Gly Thr Ser Gly Asn Ala Lys Asp Val Arg Tyr Met

450 455 460

Tyr Tyr Gly Gly Gly Asn Lys Val Glu Val Asp Pro Asn Asp Val Asn

465 470 475 480

Gly Arg Pro Asp Phe Lys Asp Asn Tyr Asp Phe Pro Ala Asn Phe Asn

485 490 495

Ser Lys Gln Tyr Pro Tyr His Gly Gly Val Ser Tyr Gly Tyr Gly Asn

500 505 510

Gly Ser Ala Gly Phe Tyr Pro Asp Leu Asn Arg Lys Glu Val Arg Ile

515 520 525

Trp Trp Gly Met Gln Tyr Lys Tyr Leu Phe Asp Met Gly Leu Glu Phe

530 535 540

Val Trp Gln Asp Mer Thr Thr Pro Ala Ile His Thr Ser Tyr Gly Asp

545 550 555 560

Met Lys Gly Leu Pro Thr Arg Leu Leu Val Thr Ser Asp Ser Val Thr

565 570 575

Asn Ala Ser Glu Lys Lys Leu Ala Ile Glu Thr Trp Ala Leu Tyr Ser

580 585 590

Tyr Asn Leu His Lys Ala Thr Trp His Gly Leu Ser Arg Leu Glu Ser

595 600 605

Arg Lys Asn Lys Arg Asn Phe Ile Leu Gly Arg Gly Ser Tyr Ala Gly

610 615 620

Ala Tyr Arg Phe Ala Gly Leu Trp Thr Gly Asp Asn Ala Ser Asn Trp

625 630 635 640

Glu Phe Trp Lys Ile Ser Val Ser Gln Val Leu Ser Leu Gly Leu Asn

645 650 655

Gly Val Cys Ile Ala Gly Ser Asp Thr Gly Gly Phe Glu Pro Tyr Arg

660 665 670

Asp Ala Asn Gly Val Glu Glu Lys Tyr Cys Ser Pro Glu Leu Leu Ile

675 680 685

Arg Trp Tyr Thr Gly Ser Phe Leu Leu Pro Trp Leu Arg Asn His Tyr

690 695 700

Val Lys Lys Asp Arg Lys Trp Phe Gln Glu Pro Tyr Ser Tyr Pro Lys

705 710 715 720

His Leu Glu Thr His Pro Glu Leu Ala Asp Gln Ala Trp Leu Tyr Lys

725 730 735

Ser Val Leu Glu Ile Cys Arg Tyr Tyr Val Glu Leu Arg Tyr Ser Leu

740 745 750

Ile Gln Leu Leu Tyr Asp Cys Met Phe Gln Asn Val Val Asp Gly Met

755 760 765

Pro Ile Thr Arg Ser Met Leu Leu Thr Asp Thr Glu Asp Thr Thr Phe

770 775 780

Phe Asn Glu Ser Gln Lys Phe Leu Asp Asn Gln Tyr Met Ala Gly Asp

785 790 795 800

Asp Ile Leu Val Ala Pro Ile Leu His Ser Arg Lys Glu Ile Pro Gly

805 810 815

Glu Asn Arg Asp Val Tyr Leu Pro Leu Tyr His Thr Trp Tyr Pro Ser

820 825 830

Asn Leu Arg Pro Trp Asp Asp Gln Gly Val Ala Leu Gly Asn Pro Vai

835 840 845

Glu Gly Gly Ser Val Ile Asn Tyr Thr Ala Arg Ile Val Ala Pro Glu

850 855 860

Asp Tyr Asn Leu Phe His Ser Val Val Pro Val Tyr Val Arg Glu Gly

865 870 875 880

Ala Ile Ile Pro Gln Ile Glu Val Arg Gln Trp Thr Gly Gln Gly Gly

885 890 895

Ala Asn Arg Ile Lys Phe Asn Ile Tyr Pro Gly Lys Asp Lys Glu Tyr

900 905 910

Cys Thr Tyr Leu Asp Asp Gly Val Ser Arg Asp Ser Ala Pro Glu Asp

915 920 925

Leu Pro Gln Tyr Lys Glu Thr His Glu Gln Ser Lys Val Glu Gly Ala

930 935 940

Glu Ile Ala Lys Gln Ile Gly Lys Lys Thr Gly Tyr Asn Ile Ser Gly

945 950 955 960

Thr Asp Pro Glu Ala Lys Gly Tyr His Arg Lys Val Ala Val Thr Gln

965 970 975

Thr Ser Lys Asp Lys Thr Arg Thr Val Thr Ile Glu Pro Lys His Asn

980 985 990

Gly Tyr Asp Pro Ser Lys Glu Val Gly Asp Tyr Tyr Thr Ile Ile Leu

995 1000 1005

Trp Tyr Ala Pro Gly Phe Asp Gly Ser Ile Val Asp Val Ser Lys Thr

1010 1015 1020

Thr Val Asn Val Glu Gly Gly Val Glu His Gln Val Tyr Lys Asn Ser

1025 1030 1035 1040

Asp Leu His Thr Val Val Ile Asp Val Lys Glu Val Ile Gly Thr Thr

1045 1050 1055

Lys Ser Val Lys Ile Thr Cys Thr Ala Ala

1060 1065

(2)SEQ ID NO：6资料：

(i)序列特征：

(A)长度：1070个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑：线型

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：

Met Ala Gly Leu Ser Asp Pro Leu Asn Phe Cys Lys Ala Glu Asp Tyr

1 5 10 15

Tyr Ala Ala Ala Lys Gly Trp Ser Gly Pro Gln Lys Ile Ile Arg Tyr

20 25 30

Asp Gln Thr Pro Pro Gln Gly Thr Lys Asp Pro Lys Ser Trp His Ala

35 40 45

Val Asn Leu Pro Phe Asp Asp Gly Thr Met Cys Val Val Gln Phe Val

50 55 60

Arg Pro Cys Val Trp Arg Val Arg Tyr Asp Pro Ser Val Lys Thr Ser

65 70 75 80

Asp Glu Tyr Gly Asp Glu Asn Thr Arg Thr Ile Val Gln Asp Tyr Met

85 90 95

Thr Thr Leu Val Gly Asn Leu Asp Ile Phe Arg Gly Leu Thr Trp Val

100 105 110

Ser Thr Leu Glu Asp Ser Gly Glu Tyr Tyr Thr Phe Lys Ser Glu Val

115 120 125

Thr Ala Val Asp Glu Thr Glu Arg Thr Arg Asn Lys Val Gly Asp Gly

130 135 140

Leu Lys Ile Tyr Leu Trp Lys Asn Pro Phe Arg Ile Gln Val Val Arg

145 150 155 160

Leu Leu Thr Pro Leu Val Asp Pro Phe Pro Ile Pro Asn Val Ala Asn

165 170 175

Ala Thr Ala Arg Val Ala Asp Lys Val Val Trp Gln Thr Ser Pro Lys

180 185 190

Thr Phe Arg Lys Asn Leu His Pro Gln His Lys Met Leu Lys Asp Thr

195 200 205

Val Leu Asp Ile Ile Lys Pro Gly His Gly Glu Tyr Val Gly Trp Gly

210 215 220

Glu Met Gly Gly Ile Glu Phe Met Lys Glu Pro Thr Phe Met Asn Tyr

225 230 235 240

Phe Asn Phe Asp Asn Met Gln Tyr Gln Gln Val Tyr Ala Gln Gly Ala

245 250 255

Leu Asp Ser Arg Glu Pro Leu Tyr His Ser Asp Pro Phe Tyr Leu Asp

260 265 270

Val Asn Ser Asn Pro Glu His Lys Asn Ile Thr Ala Thr Phe Ile Asp

275 280 285

Asn Tyr Ser Gln Ile Ala Ile Asp Phe Gly Lys Thr Asn Ser Gly Tyr

290 295 300

Ile Lys Leu Gly Thr Arg Tyr Gly Gly Ile Asp Cys Tyr Gly Ile Ser

305 310 315 320

Ala Asp Thr Val Pro Glu Ile Val Arg Leu Tyr Thr Gly Leu Val Gly

325 330 335

Arg Ser Lys Leu Lys Pro Arg Tyr Ile Leu Gly Ala His Gln Ala Cys

340 345 350

Tyr Gly Tyr Gln Gln Glu Ser Asp Leu His Ala Val Val Gln Gln Tyr

355 360 365

Arg Asp Thr Lys Phe Pro Leu Asp Gly Leu His Val Asp Val Asp Phe

370 375 380

Gln Asp Asn Phe Arg Thr Phe Thr Thr Asn Pro Ile Thr Phe Pro Asn

385 390 395 400

Pro Lys Glu Met Phe Thr Asn Leu Arg Asn Asn Gly Ile Lys Cys Ser

405 410 415

Thr Asn Ile Thr Pro Val Ile Ser Ile Arg Asp Arg Pro Asn Gly Tyr

420 425 430

Ser Thr Leu Asn Glu Gly Tyr Asp Lys Lys Tyr Phe Ile Met Asp Asp

435 440 445

Arg Tyr Thr Glu Gly Thr Ser Gly Asp Pro Gln Asn Val Arg Tyr Ser

450 455 460

Phe Tyr Gly Gly Gly Asn Pro Val Glu Val Asn Pro Asn Asp Val Trp

465 470 475 480

Ala Arg Pro Asp Phe Gly Asp Asn Tyr Asp Phe Pro Thr Asn Phe Asn

485 490 495

Cys Lys Asp Tyr Pro Tyr His Gly Gly Val Ser Tyr Gly Tyr Gly Asn

500 505 510

Gly Thr Pro Gly Tyr Tyr Pro Asp Leu Asn Arg Glu Glu Val Arg Ile

515 520 525

Trp Trp Gly Leu Gln Tyr Glu Tyr Leu Phe Asn Met Gly Leu Glu Phe

530 535 540

Val Trp Gln Asp Met Thr Thr Pro Ala Ile His Ser Ser Tyr Gly Asp

545 550 555 560

Met Lys Gly Leu Pro Thr Arg Leu Leu Val Thr Ala Asp Ser Val Thr

565 570 575

Asn Ala Ser Glu Lys Lys Leu Ala Ile Glu Ser Trp Ala Leu Tyr Ser

580 585 590

Tyr Asn Leu His Lys Ala Thr Phe His Gly Leu Gly Arg Leu Glu Ser

595 600 605

Arg Lys Asn Lys Arg Asn Phe Ile Leu Gly Arg Gly Ser Tyr Ala Gly

610 615 620

Ala Tyr Arg Phe Ala Gly Leu Trp Thr Gly Asp Asn Ala Ser Thr Trp

625 630 635 640

Glu Phe Trp Lys Ile Ser Val Ser Gln Val Leu Ser Leu Gly Leu Asn

645 650 655

Gly Val Cys Ile Ala Gly Ser Asp Thr Gly Gly Phe Glu Pro Ala Arg

660 665 670

Thr Glu Ile Gly Glu Glu Lys Tyr Cys Ser Pro Glu Leu Leu Ile Arg

675 680 685

Trp Tyr Thr Gly Ser Phe Leu Leu Pro Trp Leu Arg Asn His Tyr Val

690 695 700

Lys Lys Asp Arg Lys Trp Phe Gln Glu Pro Tyr Ala Tyr Pro Lys His

705 710 715 720

Leu Glu Thr His Pro Glu Leu Ala Asp Gln Ala Trp Leu Tyr Lys Ser

725 730 735

Val Leu Glu Ile Cys Arg Tyr Trp Val Glu Leu Arg Tyr Ser Leu Ile

740 745 750

Gln Leu Leu Tyr Asp Cys Met Phe Gln Asn Val Val Asp Gly Met Pro

755 760 765

Leu Ala Arg Ser Met Leu Leu Thr Asp Thr Glu Asp Thr Thr Phe Phe

770 775 780

Asn Glu Ser Gln Lys Phe Leu Asp Asn Gln Tyr Met Ala Gly Asp Asp

785 790 795 800

Ile Leu Val Ala Pro Ile Leu His Ser Arg Asn Glu Val Pro Gly Glu

805 810 815

Asn Arg Asp Val Tyr Leu Pro Leu Phe His Thr Trp Tyr Pro Ser Asn

820 825 830

Leu Arg Pro Trp Asp Asp Gln Gly Val Ala Leu Gly Asn Pro Val Glu

835 840 845

Gly Gly Ser Val Ile Asn Tyr Thr Ala Arg Ile Val Ala Pro Glu Asp

850 855 860

Tyr Asn Leu Phe His Asn Val Val Pro Val Tyr Ile Arg Glu Gly Ala

865 870 875 880

Ile Ile Pro Gln Ile Gln Val Arg Gln Trp Ile Gly Glu Gly Gly Pro

885 890 895

Asn Pro Ile Lys Phe Asn Ile Tyr Pro Gly Lys Asp Lys Glu Tyr Val

900 905 910

Thr Tyr Leu Asp Asp Gly Val Ser Arg Asp Ser Ala Pro Asp Asp Leu

915 920 925

Pro Gln Tyr Arg Glu Ala Tyr Glu Gln Ala Lys Val Glu Gly Lys Asp

930 935 940

Val Gln Lys Gln Leu Ala Val Ile Gln Gly Asn Lys Thr Asn Asp Phe

945 950 955 960

Ser Ala Ser Gly Ile Asp Lys Glu Ala Lys Gly Tyr His Arg Lys Val

965 970 975

Ser Ile Lys Gln Glu Ser Lys Asp Lys Thr Arg Thr Val Thr Ile Glu

980 985 990

Pro Lys His Asn Gly Tyr Asp Pro Ser Lys Glu Val Gly Asn Tyr Tyr

995 1000 1005

Thr Ile Ile Leu Trp Tyr Ala Pro Gly Phe Asp Gly Ser Ile Val Asp

1010 1015 1020

Val Ser Gln Ala Thr Val Asn Ile Glu Gly Gly Val Glu Cys Glu Ile

1025 1030 1035 1040

Phe Lys Asn Thr Gly Leu His Thr Val Val Val Asn Val Lys Glu Val

1045 1050 1055

Ile Gly Thr Thr Lys Ser Val Lys Ile Thr Cys Thr Thr Ala

1060 1065 1070

(2)SEQ ID N0：7资料：

(i)序列特征：

(A)长度：3201个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：

ATGGCAGGAT TTTCTGATCC TCTCAACTTT TGCAAAGCAG AAGACTACTA CAGTGTTGCG 60

CTAGACTGGA AGGGCCCTCA AAAAATCATT GGAGTAGACA CTACTCCTCC AAAGAGCACC 120

AAGTTCCCCA AAAACTGGCA TGGAGTGAAC TTGAGATTCG ATGATGGGAC TTTAGGTGTG 180

GTTCAGTTCA TTAGGCCGTG CGTTTGGAGG GTTAGATACG ACCCTGGTTT CAAGACCTCT 240

GACGAGTATG GTGATGAGAA TACGAGGACA ATTGTGCAAG ATTATATGAG TACTCTGAGT 300

AATAAATTGG ATACTTATAG AGGTCTTACG TGGGAAACCA AGTGTGAGGA TTCGGGAGAT 360

TTCTTTACCT TCTCATCCAA GGTCACCGCC GTTGAAAAAT CCGAGCGGAC CCGCAACAAG 420

GTCGGCGATG GCCTCAGAAT TCACCTATGG AAAAGCCCTT TCCGCATCCA AGTAGTGCGC 480

ACCTTGACCC CTTTGAAGGA TCCTTACCCC ATTCCAAATG TAGCCGCAGC CGAAGCCCGT 540

GTGTCCGACA AGGTCGTTTG GCAAACGTCT CCCAAGACAT TCAGAAAGAA CCTGCATCCG 600

CAACACAAGA TGCTAAAGGA TACAGTTCTT GACATTGTCA AACCTGGACA TGGCGAGTAT 660

GTGGGGTGGG GAGAGATGGG AGGTATCCAG TTTATGAAGG AGCCAACATT CATGAACTAT 720

TTTAACTTCG ACAATATGCA ATACCAGCAA GTCTATGCCC AAGGTGCTCT CGATTCTCGC 780

GAGCCACTGT ACCACTCGGA TCCCTTCTAT CTTGATGTGA ACTCCAACCC GGAGCACAAG 840

AATATCACGG CAACCTTTAT CGATAACTAC TCTCAAATTG CCATCGACTT TGGAAAGACC 900

AACTCAGGCT ACATCAAGCT GGGAACCAGG TATGGTGGTA TCGATTGTTA CGGTATCAGT 960

GCGGATACGG TCCCGGAAAT TGTACGACTT TATACAGGTC TTGTTGGACG TTCAAAGTTG 1020

AAGCCCAGAT ATATTCTCGG GGCCCATCAA GCCTGTTATG GATACCAACA GGAAAGTGAC 1080

TTGTATTCTG TGGTCCAGCA GTACCGTGAC TGTAAATTTC CACTTGACGG GATTCACGTC 1140

GATGTCGATG TTCAGGACGG CTTCAGAACT TTCACCACCA ACCCACACAC TTTCCCTAAC 1200

CCCAAAGAGA TGTTTACTAA CTTGAGGAAT AATGGAATCA AGTGCTCCAC CAATATCACT 1260

CCTGTTATCA GCATTAACAA CAGAGAGGGT GGATACAGTA CCCTCCTTGA GGGAGTTGAC 1320

AAAAAATACT TTATCATGGA CGACAGATAT ACCGAGGGAA CAAGTGGGAA TGCGAAGGAT 1380

GTTCGGTACA TGTACTACGG TGGTGGTAAT AAGGTTGAGG TCGATCCTAA TGATGTTAAT 1440

GGTCGGCCAG ACTTTAAAGA CAACTATGAC TTCCCCGCGA ACTTCAACAG CAAACAATAC 1500

CCCTATCATG GTGGTGTGAG CTACGGTTAT GGGAACGGTA GTGCAGGTTT TTACCCGGAC 1560

CTCAACAGAA AGGAGGTTCG TATCTGGTGG GGAATGCAGT ACAAGTATCT CTTCGATATG 1620

GGACTGGAAT TTGTGTGGCA AGACATGACT ACCCCAGCAA TCCACACATC ATATGGAGAC 1680

ATGAAAGGGT TGCCCACCCG TCTACTCGTC ACCTCAGACT CCGTCACCAA TGCCTCTGAG 1740

AAAAAGCTCG CAATTGAAAC TTGGGCTCTC TACTCCTACA ATCTCCACAA AGCAACTTGG 1800

CATGGTCTTA GTCGTCTCGA ATCTCGTAAG AACAAACGAA ACTTCATCCT CGGGCGTGGA 1860

AGTTATGCCG GAGCCTATCG TTTTGCTGGT CTCTGGACTG GGGATAATGC AAGTAACTGG 1920

GAATTCTGGA AGATATCGGT CTCTCAAGTT CTTTCTCTGG GCCTCAATGG TGTGTGCATC 1980

GCGGGGTCTG ATACGGGTGG TTTTGAACCC TACCGTGATG CAAATGGGGT CGAGGAGAAA 2040

TACTGTAGCC CAGAGCTACT CATCAGGTGG TATACTGGTT CATTCCTCTT GCCGTGGCTC 2100

AGGAACCATT ATGTCAAAAA GGACAGGAAA TGGTTCCAGG AACCATACTC GTACCCCAAG 2160

CATCTTGAAA CCCATCCAGA ACTCGCAGAC CAAGCATGGC TCTATAAATC CGTTTTGGAG 2220

ATCTGTAGGT ACTATGTGGA GCTTAGATAC TCCCTCATCC AACTACTTTA CGACTGCATG 2280

TTTCAAAACG TAGTCGACGG TATGCCAATC ACCAGATCTA TGCTCTTGAC CGATACTGAG 2340

GATACCACCT TCTTCAACGA GAGCCAAAAG TTCCTCGACA ACCAATATAT GGCTGGTGAC 2400

GACATTCTTG TTGCACCCAT CCTCCACAGT CGCAAAGAAA TTCCAGGCGA AAACAGAGAT 2460

GTCTATCTCC CTCTTTACCA CACCTGGTAC CCCTCAAATT TGAGACCATG GGACGATCAA 2520

GGAGTCGCTT TGGGGAATCC TGTCGAAGGT GGTAGTGTCA TCAATTATAC TGCTAGGATT 2580

GTTGCACCCG AGGATTATAA TCTCTTCCAC AGCGTGGTAC CAGTCTACGT TAGAGAGGGT 2640

GCCATCATCC CGCAAATCGA AGTACGCCAA TGGACTGGCC AGGGGGGAGC CAACCGCATC 2700

AAGTTCAACA TCTACCCTGG AAAGGATAAG GAGTACTGTA CCTATCTTGA TGATGGTGTT 2760

AGCCGTGATA GTGCGCCGGA AGACCTCCCA CAGTACAAAG AGACCCACGA ACAGTCGAAG 2820

GTTGAAGGCG CGGAAATCGC AAAGCAGATT GGAAAGAAGA CGGGTTACAA CATCTCAGGA 2880

ACCGACCCAG AAGCAAAGGG TTATCACCGC AAAGTTGCTG TCACACAAAC GTCAAAAGAC 2940

AAGACGCGTA CTGTCACTAT TGAGCCAAAA CACAATGGAT ACGACCCTTC CAAAGAGGTG 3000

GGTGATTATT ATACCATCAT TCTTTGGTAC GCACCAGGTT TCGATGGCAG CATCGTCGAT 3060

GTGAGCAAGA CGACTGTGAA TGTTGAGGGT GGGGTGGAGC ACCAAGTTTA TAAGAACTCC 3120

GATTTACATA CGGTTGTTAT CGACGTGAAG GAGGTGATCG GTACCACAAA GAGCGTCAAG 3180

ATCACATGTA CTGCCGCTTA A 3201

(2)SEQ ID NO：8资料：

(i)序列特征：

(A)长度：3213个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：

ATGGCAGGAT TATCCGACCC TCTCAATTTC TGCAAAGCAG AGGACTACTA CGCTGCTGCC 60

AAAGGCTGGA GTGGCCCTCA GAAGATCATT CGCTATGACC AGACCCCTCC TCAGGGTACA 120

AAAGATCCGA AAAGCTGGCA TGCGGTAAAC CTTCCTTTCG ATGACGGGAC TATGTGTGTA 180

GTGCAATTCG TCAGACCCTG TGTTTGGAGG GTTAGATATG ACCCCAGTGT CAAGACTTCT 240

GATGAGTACG GCGATGAGAA TACGAGGACT ATTGTACAAG ACTACATGAC TACTCTGGTT 300

GGAAACTTGG ACATTTTCAG AGGTCTTACG TGGGTTTCTA CGTTGGAGGA TTCGGGCGAG 360

TACTACACCT TCAAGTCCGA AGTCACTGCC GTGGACGAAA CCGAACGGAC TCGAAACAAG 420

GTCGGCGACG GCCTCAAGAT TTACCTATGG AAAAATCCCT TTCGCATCCA GGTAGTGCGT 480

CTCTTGACCC CCCTGGTGGA CCCTTTCCCC ATTCCCAACG TAGCCAATGC CACAGCCCGT 540

GTGGCCGACA AGGTTGTTTG GCAGACGTCC CCGAAGACGT TCAGGAAAAA CTTGCATCCG 600

CAGCATAAGA TGTTGAAGGA TACAGTTCTT GATATTATCA AGCCGGGGCA CGGAGAGTAT 660

GTGGGTTGGG GAGAGATGGG AGGCATCGAG TTTATGAAGG AGCCAACATT CATGAATTAT 720

TTCAACTTTG ACAATATGCA ATATCAGCAG GTCTATGCAC AAGGCGCTCT TGATAGTCGT 780

GAGCCGTTGT ATCACTCTGA TCCCTTCTAT CTCGACGTGA ACTCCAACCC AGAGCACAAG 84O

AACATTACGG CAACCTTTAT CGATAACTAC TCTCAGATTG CCATCGACTT TGGGAAGACC 900

AACTCAGGCT ACATCAAGCT GGGTACCAGG TATGGCGGTA TCGATTGTTA CGGTATCAGC 960

GCGGATACGG TCCCGGAGAT TGTGCGACTT TATACTGGAC TTGTTGGGCG TTCGAAGTTG 1020

AAGCCCAGGT ATATTCTCGG AGCCCACCAA GCTTGTTATG GATACCAGCA GGAAAGTGAC 1080

TTGCATGCTG TTGTTCAGCA GTACCGTGAC ACCAAGTTTC CGCTTGATGG GTTGCATGTC 1140

GATGTCGACT TTCAGGACAA TTTCAGAACG TTTACCACTA ACCCGATTAC GTTCCCTAAT 1200

CCCAAAGAAA TGTTTACCAA TCTAAGGAAC AATGGAATCA AGTGTTCCAC CAACATCACC 1260

CCTGTTATCA GTATCAGAGA TCGCCCGAAT GGGTACAGTA CCCTCAATGA GGGATATGAT 1320

AAAAAGTACT TCATCATGGA TGACAGATAT ACCGAGGGGA CAAGTGGGGA CCCGCAAAAT 1380

GTTCGATACT CTTTTTACGG CGGTGGGAAC CCGGTTGAGG TTAACCCTAA TGATGTTTGG 1440

GCTCGGCCAG ACTTTGGAGA CAATTATGAC TTCCCTACGA ACTTCAACTG CAAAGACTAC 1500

CCCTATCATG GTGGTGTGAG TTACGGATAT GGGAATGGCA CTCCAGGTTA CTACCCTGAC 1560

CTTAACAGAG AGGAGGTTCG TATCTGGTGG GGATTGCAGT ACGAGTATCT CTTCAATATG 1620

GGACTAGAGT TTGTATGGCA AGATATGACA ACCCCAGCGA TCCATTCATC ATATGGAGAC 1680

ATGAAAGGGT TGCCCACCCG TCTGCTCGTC ACCGCCGACT CAGTTACCAA TGCCTCTGAG 1740

AAAAAGCTCG CAATTGAAAG TTGGGCTCTT TACTCCTACA ACCTCCATAA AGCAACCTTC 1800

CACGGTCTTG GTCGTCTTGA GTCTCGTAAG AACAAACGTA ACTTCATCCT CGGACGTGGT 1860

AGTTACGCCG GTGCCTATCG TTTTGCTGGT CTCTGGACTG GAGATAACGC AAGTACGTGG 1920

GAATTCTGGA AGATTTCGGT CTCCCAAGTT CTTTCTCTAG GTCTCAATGG TGTGTGTATA 1980

GCGGGGTCTG ATACGGGTGG TTTTGAGCCC GCACGTACTG AGATTGGGGA GGAGAAATAT 2040

TGCAGTCCGG AGCTACTCAT CAGGTGGTAT ACTGGATCAT TCCTTTTGCC ATGGCTTAGA 2100

AACCACTACG TCAAGAAGGA CAGGAAATGG TTCCAGGAAC CATACGCGTA CCCCAAGCAT 2160

CTTGAAACCC ATCCAGAGCT CGCAGATCAA GCATGGCTTT ACAAATCTGT TCTAGAAATT 2220

TGCAGATACT GGGTAGAGCT AAGATATTCC CTCATCCAGC TCCTTTACGA CTGCATGTTC 2280

CAAAACGTGG TCGATGGTAT GCCACTTGCC AGATCTATGC TCTTGACCGA TACTGAGGAT 2340

ACGACCTTCT TCAATGAGAG CCAAAAGTTC CTCGATAACC AATATATGGC TGGTGACGAC 2400

ATCCTTGTAG CACCCATCCT CCACAGCCGT AACGAGGTTC CGGGAGAGAA CAGAGATGTC 2460

TATCTCCCTC TATTCCACAC CTGGTACCCC TCAAACTTGA GACCGTGGGA CGATCAGGGA 2520

GTCGCTTTAG GGAATCCTGT CGAAGGTGGC AGCGTTATCA ACTACACTGC CAGGATTGTT 2580

GCCCCAGAGG ATTATAATCT CTTCCACAAC GTGGTGCCGG TCTACATCAG AGAGGGTGCC 2640

ATCATTCCGC AAATTCAGGT ACGCCAGTGG ATTGGCGAAG GAGGGCCTAA TCCCATCAAG 2700

TTCAATATCT ACCCTGGAAA GGACAAGGAG TATGTGACGT ACCTTGATGA TGGTGTTAGC 2760

CGCGATAGTG CACCAGATGA CCTCCCGCAG TACCGCGAGG CCTATGAGCA AGCGAAGGTC 2820

GAAGGCAAAG ACGTCCAGAA GCAACTTGCG GTCATTCAAG GGAATAAGAC TAATGACTTC 2880

TCCGCCTCCG GGATTGATAA GGAGGCAAAG GGTTATCACC GCAAAGTTTC TATCAAACAG 2940

GAGTCAAAAG ACAAGACCCG TACTGTCACC ATTGAGCCAA AACACAACGG ATACGACCCC 3000

TCTAAGGAAG TTGGTAATTA TTATACCATC ATTCTTTGGT ACGCACCGGG CTTTGACGGC 3060

AGCATCGTCG ATGTGAGCCA GGCGACCGTG AACATCGAGG GCGGGGTGGA ATGCGAAATT 3120

TTCAAGAACA CCGGCTTGCA TACGGTTGTA GTCAACGTGA AAGAGGTGAT CGGTACCACA 3180

AAGTCCGTCA AGATCACTTG CACTACCGCT TAG 3213

(2)SEQ ID NO：9资料：

(i)序列特征：

(A)长度：317个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑：线型

(ii)分子类型：肽

(ix)特征：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：201

(D)其它资料：/注＝“X指misc氨基酸”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：

Met Thr Asn Tyr Asn Tyr Asp Asn Leu Asn Tyr Asn Gln Pro Asp Leu

1 5 10 15

Ile Pro Pro Gly His Asp Ser Asp Pro Asp Tyr Tyr Ile Pro Met Tyr

20 25 30

Phe Ala Ala Pro Trp Val Ile Ala His Gly Tyr Arg Gly Thr Ser Asp

35 40 45

Gln Tyr Ser Tyr Gly Trp Phe Leu Asp Asn Val Ser Gln Ser Tyr Thr

50 55 60

Asn Thr Gly Asp Asp Ala Trp Ala Gly Gln Lys Asp Leu Ala Tyr Met

65 70 75 80

Gly Ala Gln Cys Gly Pro Phe Asp Gln His Phe Val Tyr Glu Ala Gly

85 90 95

Asp Gly Leu Glu Asp Val Val Thr Ala Phe Ser Tyr Leu Gln Gly Lys

100 105 110

Glu Tyr Glu Asn Gln Gly Leu Asn Ile Arg Ser Ala Met Pro Pro Lys

115 120 125

Tyr Val Phe Gly Phe Phe Gln Gly Val Phe Gly Ala Thr Ser Leu Leu

130 135 140

Arg Asp Ash Leu Pro Ala Gly Glu Asn Asn Val Ser Leu Glu Glu Ile

145 150 155 160

Val Glu Gly Tyr Gln Asn Gln Asn Val Pro Phe Glu Gly Leu Ala Val

165 170 175

Asp Val Asp Met Gln Asp Asp Leu Arg Val Phe Thr Thr Arg Pro Ala

180 185 190

Phe Trp Thr Ala Asn Lys Val Gly Xaa Gly Gly Asp Pro Asn Asn Lys

195 200 205

Ser Val Phe Glu Trp Ala His Asp Arg Gly Leu Val Cys Gln Thr Asn

210 215 220

Val Thr Cys Phe Leu Lys Asn Glu Lys Asn Pro Tyr Glu Val Asn Gln

225 230 235 240

Ser Leu Arg Glu Lys Gln Leu Tyr Thr Lys Ser Asp Ser Leu Asp Asn

245 250 255

Ile Asp Phe Gly Thr Thr Pro Asp Gly Pro Ser Asp Ala Tyr Ile Gly

260 265 270

His Leu Asp Tyr Gly Gly Gly Val Glu Cys Asp Ala Leu Phe Pro Asp

275 280 285

Trp Gly Arg Pro Asp Val Ala Gln Trp Trp Gly Asp Ash Tyr Lys Lys

290 295 300

Leu Phe Ser Ile Gly Leu Asp Phe Val Trp Gln Asp Met

305 310 315

(2)SEQ ID NO：10资料：

(i)序列特征：

(A)长度：323个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑：线型

(ii)分子类型：肽

(ix)特征：

(A)名称/键：修饰的位点

(B)位置：272

(D)其它资料：/注＝“X是misc氨基酸”

(ix)特征：

(A)名称/键：修饰的位点

(B)位置：273

(D)其它资料：/注＝“X是misc氨基酸”

(ix)特征：

(A)名称/键：修饰的位点

(B)位置：274

(D)其它资料：/注＝“X是misc氨基酸”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：

Met Thr Asn Tyr Asn Tyr Asp Asn Tyr Asn Tyr Asn Gln Ser Asp Leu

1 5 10 15

Ile Ala Pro Gly Tyr Pro Ser Asp Pro Asn Phe Tyr Ile Pro Met Tyr

20 25 30

Phe Ala Ala Pro Trp Val Val Val Lys Gly Cys Ser Gly Asn Ser Asp

35 40 45

Glu Gln Tyr Ser Tyr Gly Trp Phe Met Asp Asn Val Ser Gln Thr Tyr

50 55 60

Met Asn Thr Gly Gly Thr Ser Trp Asn Cys Gly Glu Glu Asn Leu Ala

65 70 75 80

Tyr Met Gly Ala Gln Cys Gly Pro Phe Asp Gln His Phe Val Tyr Gly

85 90 95

Asp Gly Asp Gly Leu Glu Asp Val Val Gln Ala Phe Ser Leu Leu Gln

100 105 110

Gly Lys Glu Phe Glu Asn Gln Val Leu Asn Lys Arg Ala Val Met Pro

115 120 125

Pro Lys Tyr Val Phe Gly Tyr Phe Gln Gly Val Phe Gly Ile Ala Ser

130 135 140

Leu Leu Arg Glu Gln Arg Pro Glu Gly Gly Asn Asn Ile Ser Val Ser

145 150 155 160

Glu Ile Val Glu Gly Tyr Gln Ser Asn Asn Phe Pro Leu Glu Gly Leu

165 170 175

Ala Val Asp Val Asp Met Gln Gln Asp Leu Arg Cys Ser Ser Pro Leu

180 185 190

Lys Ile Glu Phe Trp Thr Ala Asn Lys Val Gly Thr Gly Gly Asp Ser

195 200 205

Asn Asn Lys Ser Val Phe Glu Trp Ala His Asp Lys Gly Leu Val Cys

210 215 220

Gln Thr Asn Val Thr Cys Phe Leu Arg Asn Asp Asn Gly Gly Ala Asp

225 230 225 240

Tyr Glu Val Asn Gln Thr Leu Arg Glu Lys Gly Leu Tyr Thr Lys Asn

245 250 255

Asp Ser Leu Thr Asn Thr Asn Phe Gly Thr Thr Asn Asp Gly Pro Xaa

260 265 270

Xaa Xaa Tyr Ile Gly His Leu Asp Tyr Gly Gly Gly Gly Asn Cys Asp

275 280 285

Ala Leu Phe Pro Asp Trp Gly Arg Pro Gly Val Ala Glu Trp Trp Gly

290 295 300

Asp Asn Tyr Ser Lys Leu Phe Lys Ile Gly Leu Asp Phe Val Trp Gln

305 310 315 320

Asp Met Thr

(2)SEQ ID NO：11资料：

(i)序列特征：

(A)长度：202个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑：线型

(ii)分子类型：肽

(ix)特征：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：43

(D)其它资料：/注＝“X是misc氨基酸”

(ix)特征：

(A)名称/键：修饰位点

(B)位置：176

(D)其它资料：/注＝“X是misc氨基酸”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：

Met Thr Asn Tyr Asn Tyr Asp Asn Leu Asn Tyr Asn Gln Pro Asp Val

1 5 10 15

Val Pro Pro Gly Tyr His Asp His Pro Asn Tyr Tyr Ile Pro Met Tyr

20 25 30

Tyr Ala Ala Pro Trp Leu Val Val Gln Gly Xaa Ala Gly Thr Ser Lys

35 40 45

Gln Tyr Ser Tyr Gly Trp Phe Met Asp Asn Val Ser Gln Ser Tyr Met

50 55 60

Asn Thr Gly Asp Thr Ala Trp Asn Cys Gly Gln Glu Asn Leu Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gly Ala Gln Tyr Gly Pro Phe Asp Gln His Phe Val Tyr Gly Asp

85 90 95

Gly Asp Gly Leu Glu Asp Val Val Lys Ala Phe Ser Phe Leu Gln Gly

100 105 110

Lys Glu Phe Glu Asp Lys Lys Leu Asn Lys Arg Ser Val Met Pro Pro

115 120 125

Lys Tyr Val Phe Gly Phe Phe Gln Gly Val Phe Gly Ala Leu Ser Leu

130 135 140

Leu Lys Gln Asn Leu Pro Ala Gly Glu Asn Asn Ile Ser Val Gln Glu

145 150 155 160

Ile Val Glu Gly Tyr Gln Asp Asn Asp Tyr Pro Phe Glu Gly Leu Xaa

165 170 175

Val Asp Val Asp Met Gln Asp Asp Leu ArG Val Phe Thr Thr Lys Pro

180 185 190

Glu Tyr Trp Ser Ala Asn Met Val Gly Glu

195 200

(2)SEQ ID NO：12资料：

(i)序列特征：

(A)长度：953个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(573，″″)

(D)其它资料：/注＝“g是misc核酸”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(601，″″)

(D)其它资料：/注＝“g是misc核酸”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：

ATGACAAACT ATAATTATGA CAATTTGAAC TACAATCAAC CGGACCTCAT CCCACCTGGC 60

CATGATTCAG ATCCTGACTA CTATATTCCG ATGTACTTTG CGGCACCATG GGTGATCGCA 120

CATGGATATC GTGGCACCAG CGACCAGTAC TCTTATGGAT GGTTTTTGGA CAATGTATCC 180

CAGTCCTACA CAAACACTGG CGATGATGCA TGGGCTGGTC AGAAGGATTT GGCGTACATG 240

GGGGCACAAT GTGGGCCTTT CGATCAACAT TTTGTGTATG AGGCTGGAGA TGGACTTGAA 300

GACGTTGTGA CCGCATTCTC TTATTTGCAA GGCAAGGAAT ATGAGAACCA GGGACTGAAT 360

ATACGTTCTG CAATGCCTCC GAAGTACGTT TTCGGATTTT TCCAAGGCGT ATTCGGAGCC 420

ACATCGCTGC TAAGGGACAA CTTACCTGCC GGCGAGAACA ACGTCTCTTT GGAAGAAATT 480

GTTGAAGGAT ATCAAAATCA GAACGTGCCA TTTGAAGGTC TTGCTGTGGA TGTTGATATG 540

CAAGATGACT TGAGAGTGTT CACTACGAGA CCGGCGTTTT GGACGGCAAA CAAGGTGGGG 600

GAAGGCGGTG ATCCAAACAA CAAGTCAGTG TTTGAGTGGG CACATGACAG GGGCCTTGTC 660

TGCCAGACGA ATGTAACTTG CTTCTTGAAG AACGAGAAAA ATCCTTACGA AGTGAATCAG 720

TCATTGAGGG AGAAGCAGTT GTATACGAAG AGTGATTCCT TGGACAACAT TGATTTTGGA 780

ACTACTCCAG ATGGGCCTAG CGATGCGTAC ATTGGACACT TAGACTACGG TGGTGGTGTG 840

GAGTGTGATG CACTATTCCC AGACTGGGGT CGACCAGACG TGGCTCAATG GTGGGGCGAT 900

AACTACAAGA AACTATTCAG CATTGGTCTC GACTTCGTAT GGCAAGACAT GAC 953

(2)SEQ ID NO：13资料：

(i)序列特征：

(A)长度：969个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(814..821，″″)

(D)其它资料：/注＝“每个在(且包括)814和821之

间的g是misc核酸”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：

ATGACAAACT ACAACTACGA CAACTATAAC TACAACCAGT CAGATCTTAT TGCTCCAGGA 60

TATCCTTCCG ACCCGAACTT CTACATTCCC ATGTATTTTG CAGCACCTTG GGTAGTTGTT 120

AAGGGATGCA GTGGCAACAG CGATGAACAG TACTCGTACG GATGGTTTAT GGATAATGTC 180

TCCCAAACTT ACATGAATAC TGGTGGTACT TCCTGGAACT GTGGAGAGGA GAACTTGGCA 240

TACATGGGAG CACAGTGCGG TCCATTTGAC CAACATTTTG TGTATGGTGA TGGAGATGGT 300

CTTGAGGATG TTGTCCAAGC GTTCTCTCTT CTGCAAGGCA AAGAGTTTGA GAACCAAGTT 360

CTGAACAAAC GTGCCGTAAT GCCTCCGAAA TATGTGTTTG GTTACTTTCA GGGAGTCTTT 420

GGGATTGCTT CCTTGTTGAG AGAGCAAAGA CCAGAGGGTG GTAATAACAT CTCTGTTTCA 480

GAGATTGTCG AAGGTTACCA AAGCAATAAC TTCCCTTTAG AGGGGTTAGC CGTAGATGTG 540

GATATGCAAC AAGATTTGCG GTGTAGTTCA CCACTGAAGA TTGAATTTTG GACGGCAAAT 600

AAGGTAGGCA CCGGGGGAGA CTCGAATAAC AAGTCGGTGT TTGAATGGGC ACATGACAAA 660

GGCCTTGTAT GTCAGACGAA TGTTACTTGC TTCTTGAGAA ACGACAACGG CGGGGCAGAT 720

TACGAAGTCA ATCAGACATT GAGGGAGAAG GGTTTGTACA CGAAGAATGA CTCACTGACG 780

AACACTAACT TCGGAACTAC CAACGACGGG CCGGGGGGGG GGTACATTGG ACATCTGGAC 840

TATGGTGGCG GAGGGAATTG TGATGCACTT TTCCCAGATT GGGGTCGACC GGGTGTGGCT 900

GAATGGTGGG GTGATAACTA CAGCAAGCTC TTCAAAATTG GTCTGGACTT CGTGTGGCAA 960

GATATGACA 969

(2)SEQ ID NO：14资料：

(i)序列特征：

(A)长度：607个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(128，″″)

(D)其它资料：/注＝“g是misc核酸”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(232，″″)

(D)其它资料：/注＝“g是misc核酸”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(249，″/)

(D)其它资料：/注＝“g是misc核酸”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(526，″″)

(D)其它资料：/注＝“g是misc核酸”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：

ATGACAAACT ACAATTACGA CAACTTGAAC TACAACCAAC CAGACGTCGT TCCTCCAGGT 60

TATCACGACC ATCCCAACTA CTACATTCCA ATGTACTACG CAGCACCGTG GTTGGTCGTT 120

CAGGGATGCG CGGGGACATC GAAGCAATAC TCGTACGGTT GGTTTATGGA CAATGTCTCT 180

CAGTCGTACA TGAACACTGG AGATACGGCG TGGAACTGCG GACAGGAAAA CGTGGCATAC 240

ATGGGCGCGC AATACGGGCC ATTTGATCAG CACTTTGTGT ATGGTGATGG AGATGGCCTT 300

GAAGATGTCG TCAAAGCGTT CTCCTTTCTT CAAGGAAAGG AGTTCGAAGA CAAAAAACTC 360

AACAAGCGTT CTGTAATGCC TCCGAAGTAC GTGTTTGGTT TCTTCCAGGG TGTTTTCGGT 420

GCACTTTCAC TGTTGAAGCA GAATCTGCCT GCCGGAGAGA ACAACATCTC AGTGCAAGAG 480

ATTGTGGAGG GTTACCAGGA TAACGACTAC CCCTTTGAAG GGCTCGCGGT AGATGTTGAT 540

ATGCAAGATG ATCTGCGAGT GTTTACTACC AAACCAGAAT ATTGGTCGGC AAACATGGTA 600

GGCGAAG 607

(2)SEQ ID NO：15资料：

(i)序列特征：

(A)长度：90个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑：线型

(ii)分子类型：肽

(xi)序列描述：SEQ ID NO：15：

Tyr Arg Trp Gln Glu Val Leu Tyr Thr Ala Met Tyr Gln Asn Ala Ala

1 5 10 15

Phe Gly Lys Pro Ile Ile Lys Ala Ala Ser Met Tyr Asn Asn Asp Ser

20 25 30

Asn Val Arg Arg Ala Gln Asn Asp His Phe Leu Leu Gly Gly His Asp

35 40 45

Gly Tyr Arg Ile Leu Cys Ala Pro Val Val Trp Glu Asn Ser Thr Glu

50 55 60

Arg Glu Leu Tyr Leu Pro Val Leu Thr Gln Trp Tyr Lys Phe Gly Pro

65 70 75 80

Asp Phe Asp Thr Lys Pro Leu Glu Gly Ala

85 90

(2)SEQ ID NO：16资料：

(i)序列特征：

(A)长度：23个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(6，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是T或C”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(9，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是C或T”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(12，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是C或T”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(15，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是C或T”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(18，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是G或A或C”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(21，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是C或T”

(xi)序列描述：SEQ ID N0：16：

ATGTANAANA ANGANTCNAA NGT 23

(2)SEQ ID NO：17资料：

(i)序列特征：

(A)长度：23个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(6，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是T或C”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(9，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是C或T”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(12，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是C或T”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(15，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是C或T”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(18，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是C或T”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(21，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是C或T”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：17：

ATGTANAANA ANGANAGNAA NGT 23

(2)SEQ ID NO：18资料：

(i)序列特征：

(A)长度：17个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(3，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是G或A或T或C”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(6，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是G或A”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(9，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是G或A”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(12，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是G或A或T或C”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(15，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是G或A或T或C”

(xi)序列描述：SEQID NO：18：

TANCCNTCNT GNCCNCC 17

(2)SEQ ID NO：19资料：

(i)序列特征：

(A)长度：20个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(3，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是G或A或T或C”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(6，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是G或A”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(9，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是C或T”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(12，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是G或A”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(18，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是C或R”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：19：

GGNCCNAANT TNTACCANTG 20

(2)SEQ ID NO：20资料：

(i)序列特征：

(A)长度：17个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(3，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是T或C”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(6，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是G或A或T或C”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(12，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是G或A”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(15，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是G或A”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：20：

TANCGNTGGC ANGANGT 17

(2)SEQ ID NO：21资料：

(i)序列特征：

(A)长度：17个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(3，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是T或C”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(6，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是G或A”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(12，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是G或A”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(15，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是G或A”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：21：

TANAGNTGGC ANGANGT 17

(2)SEQ ID N0：22资料：

(i)序列特征：

(A)长度：71个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑：线型

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：22：

ATGTACAAGA ACGACTCGAA CGTTCGCAGG GCGCAGAACG ATCATTTCCT TCTTGGCGGC 60

CACGACGGTT A 71

(2)SEQ ID NO：23资料：

(i)序列特征：

(A)长度：23个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑：线型

(ii)分子类型：肽

(xi)序列描述：SEQ ID NO：23：

Met Tyr Asn Asn Asp Ser Asn Va1 Arg Arg A1a Gln Asn Asp His Phe

1 5 10 15

Leu Leu Gly Gly His Asp Gly

20

(2)SEQ ID NO：24资料：

(i)序列特征：

(A)长度：160个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑：线型

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：24：

ATGTACAACA ACGACTCGAA CGTTCGCAGG GCGCAGAACG ATCATTTCCT TCTTGGTGGA 60

CATGATGGAT ATCGCATTCT GTGCGCGCCT GTTGTGTGGG AGAATTCGAC CGAACGGAAT 120

TGTACTTGCC CGTGCTGACC CAATGGTACA AATTCGGCCC 160

(2)SEQ ID NO：25资料：

(i)序列特征：

(A)长度：54个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑：线型

(ii)分子类型：肽

(xi)序列描述：SEQ ID NO：25：

Met Tyr Asn Asn Asp Ser Asn Val Arg Arg Ala Gln Asn Asp His Phe

1 5 10 15

Leu Leu Gly Gly His Asp Gly Tyr Arg Ile Leu Cys Ala Pro Val Val

20 25 30

Trp Glu Asn Ser Thr Glu Arg Glu Leu Tyr Leu Pro Val Leu Thr Gln

35 40 45

Trp Tyr Lys Phe Gly Pro

50

(2)SEQ ID NO：26资料：

(i)序列特征：

(A)长度：238个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑：线型

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：26：

TACAGGTGGC AGGAGGTGTT GTACACTGCT ATGTACCAGA ATGCGGCTTT CGGGAAACCG 60

ATTATCAAGG CAGCTTCCAT GTACGACAAC GACAGAAACG TTCGCGGCGC ACAGGATGAC 120

CACTTCCTTC TCGGCGGACA CGATGGATAT CGTATTTTGT GTGCACCTGT TGTGTGGGAG 180

AATACAACCA GTCGCGATCT GTACTTGCCT GTGCTGACCA GTGGTACAAA TTCGGCCC 238

(2)SEQ ID NO：27资料：

(i)序列特征：

(A)长度：79个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑：线型

(ii)分子类型：肽

(xi)序列描述：SEQ ID NO：27：

Tyr Arg Trp Gln Glu Val Leu Tyr Thr Ala Met Tyr Gln Asn Ala Ala

1 5 10 15

Phe Gly Lys Pro Ile Ile Lys Ala Ala Ser Met Tyr Asp Asn Asp Arg

20 25 30

Asn Val Arg Gly Ala Gln Asp Asp His Phe Leu Leu Gly Gly His Asp

35 40 45

Gly Tyr Arg Ile Leu Cys Ala Pro Val Val Trp Glu Asn Thr Thr Ser

50 55 60

Arg Asp Leu Tyr Leu Pro Val Leu Thr Lys Trp Tyr Lys Phe Gly

65 70 75

(2)SEQ ID NO：28资料：

(i)序列特征：

(A)长度：28个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线型

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：28：

GCTCTAGAGC ATGTTTTCAA CCCTTGCG 28

(2)SEQ ID NO：29资料：

(i)序列特征：

(A)长度：36个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：29：

AGCTTGTTAA CATGTATCCA ACCCTCACCT TCGTGG 36

(2)SEQ ID NO：30资料：

(i)序列特征：

(A)长度：34个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑：线型

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：30：

ACAATTGTAC ATAGGTTGGG AGTGGAAGCA CCGC 34

(2)SEQ ID NO：31资料：

(i)序列特征：

(A)长度：75个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑：线型

(ii)分子类型：肽

(xi)序列描述：SEQ ID NO：31：

Lys Asn Leu His Pro Gln His Lys Met Leu Lys Asp Thr Val Leu Asp

1 5 10 15

Ile Val Lys Pro Gly His Gly Glu Tyr Val Gly Trp Gly Glu Met Gly

20 25 30

Gly Ile Gln Phe Met Lys Glu Pro Thr Phe Met Asn Tyr Phe Asn Phe

35 40 45

Asp Asn Met Gln Tyr Gln Gln Val Tyr Ala Gln Gly Ala Leu Asp Ser

50 55 60

Arg Glu Pro Leu Tyr His Ser Asp Pro Phe Tyr

65 70 75

(2)SEQ ID NO：32资料：

(i)序列特征：

(A)长度：23个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线型

(ii)分子类型：cDNA

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(3，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是G或A”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(6，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是C或T”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(9，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是G或A”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(15，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是G或A或T或C”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(18，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是G或A”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(21，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是C或T”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：22：

CANCANAANA TGCTNAANGA NAC 23

(2)SEQ ID NO：33资料：

(i)序列特征：

(A)长度：23个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线型

(ii)分子类型：cDNA

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(3，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是G或A”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(6，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是C或T”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(9，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是G或A”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(15，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是G或A”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(18，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是G或A”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(21，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是C或T”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：33：

CANCANAANA TGTTNAANGA NAC 23

(2)SEQ ID NO：34资料：

(i)序列特征：

(A)长度：20个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线型

(ii)分子类型：cDNA

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(3，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是G或A”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(6，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是G或A或T或C”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(9，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是G或A”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(12，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是G或A”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(15，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是G或A”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(18，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是G或A”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：34：

TANAANGGNT CNCTNTGNTA 20

(2)SEQ ID NO：35资料：

(i)序列特征：

(A)长度：20个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线型

(ii)分子类型：cDNA

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(3，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是G或A”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(6，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是G或A或T或C”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(9，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是G或A”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(12，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是G或A或T或C”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(15，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是G或A”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(18，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是G或A”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：35：

TANAANGGNT CNGANTGNTA 20

(2)SEQ ID NO：36资料：

(i)序列特征：

(A)长度：37个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线型

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：36：

AAACTGCAGC TGGCGCGCCA TGGCAGGATT TTCTGAT 37

(2)SEQ ID NO：37资料：

(i)序列特征：

(A)长度：23个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线型

(ii)分子类型：cDNA

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(6，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是G或A或T或C”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(9，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是C或T”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(12，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是C或T”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(15，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是C或T”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(18，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是C或T”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(21，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是C或T”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：37：

ATGACNAANT ANAANTANGA NAA 23

(2)SEQ ID NO：38资料：

(i)序列特征：

(A)长度：21个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线型

(ii)分子类型：cDNA

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(1，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是A或G”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(4，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是G或A或T或C”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(13，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是G或A或T或C”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(16，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是G或A或T或C”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(19，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是G或A或T或C”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：38：

NTGNGGCATC ATNGCNGGNA C 21

(2)SEQ ID NO：39资料：

(i)序列特征：

(A)长度：23个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：线型

(ii)分子类型：cDNA

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(6，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是G或A”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(9，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是C或T”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(15，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是G或A或T或C”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(18，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是G或A”

(ix)特征：

(A)名称/键：misc_区别

(B)位置：置换(21，″″)

(D)其它资料：/注＝“N是G或A”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：39：

GTCATNTCNT GCCANACNAA NTC 23

Claims

1.1，5-D-脱水果糖作为抗氧化剂的用途。

2.权利要求1的用途，其中1，5-D-脱水果糖被加入到食品或饮料中。

3.权利要求1的用途，其中1，5-D-脱水果糖被加入到聚合物中。