CN1225276C - 一种赤芍注射液的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种赤芍注射液的制备方法，该方法是以中药赤芍为原料经醇提、正丁醇萃取或大孔树脂柱层析纯化后，加入适量注射用药用辅料和注射用水进行制备，包括小水针和大输液。本发明方法制备的注射液稳定性好、有效期长，可用于肌肉注射、静脉注射或静脉滴注。经药效学试验表明：该注射液能明显改善脑梗塞大鼠的行为障碍，减小脑梗塞面积，显著降低梗塞脑组织含水量，减轻脑组织的脂质过氧化损伤，提高小鼠脑耐急性缺氧的能力，对脑梗塞具有良好的治疗作用。

Description

一种赤芍注射液的制备方法

技术领域

本发明涉及一种赤芍注射液的制备方法。

背景技术

赤芍为传统常用中药，来源于毛茛科植物芍药Paeonia Lactiflora Pall.或川赤芍Paeonia veilchii Lyncn的干燥根。收载于《中华人民共和国药典》2000年版一部，具有清热凉血、散瘀止痛的功效，临床用于温毒发斑、吐血衄血、目赤肿痛、肝郁胁痛、经闭通经、跌扑损伤等症。近年来的药理研究表明，赤芍具有保护心脏、增加冠脉血流量、抗血栓形成及动脉粥样硬化、镇静镇痛、抗炎抗菌、抗氧化等多方面药理作用。植物化学研究结果表明，赤芍的主要有效成分为芍药苷、芍药内酯苷、羟基芍药苷等单萜类化合物。目前临床上使用的赤芍注射液为水醇法制备的小水针，有效成分含量低，质量不够稳定，影响了治疗效果。目前临床上迫切需要有效成分含量高、质量稳定、有效期长、疗效高的赤芍注射液。

发明内容

本发明的目的在于提供一种有效成分含量高、疗效高、质量稳定、有效期长的赤芍注射液的制备方法，包括小水针和大输液的制备方法，该注射液可用于肌肉注射、静脉注射或静脉滴注。

本发明提供的一种赤芍注射液的制备方法，该方法包括以下三个步骤：

(1)提取：取赤芍药材，切片，每次用4～12倍量60～80％的乙醇回流提取2～4次，每次0.5～3小时，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至相对密度为1.15～1.25的浓缩液，加入2～5倍量的水，搅拌均匀，冷藏12～72小时，高速离心，上清液减压浓缩至相对密度1.25～1.30的清膏，加乙醇使含醇量至80～85％，搅匀，冷藏12～48小时，滤取上清液加氨水调pH至8.0，冷藏12～48小时，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至相对密度为1.05～1.18的浓缩液，得提取液；

(2)纯化：取上述提取液，采用正丁醇萃取法或大孔树脂柱层析法制得纯化物；

(3)配制：取上述纯化物，加注射用水溶解，调pH至5.0～5.5，加热煮沸5～10分钟，冷藏，滤过，滤液用截留分子量3000的超滤膜超滤，取滤液加注射用水和注射用药用辅料，搅拌溶解，调pH至6.0～7.0，用0.22μm的微孔滤膜滤过，滤液灌封、灭菌、质检，制得注射液。

上述制备方法步骤(2)中所述的正丁醇萃取法是：取提取液，每次用等体积的正丁醇萃取，共萃取3～6次，合并萃取液，减压回收、干燥，即得纯化物；所述的大孔树脂柱层析法是：取提取液，加到大孔吸附树脂层析柱上，先用提取液重量10～50倍的水洗脱，弃去洗脱液，再用提取液重量10～50倍的10～30％乙醇洗脱，收集此洗脱液，减压回收、浓缩、干燥，即得纯化物；步骤(3)所述的注射用药用辅料为甘露醇、氯化钠、山梨醇、葡萄糖、果糖、亚硫酸氢钠中的一种或几种。

本发明方法制备的赤芍注射液有很好的稳定性，经稳定性试验研究表明有效期长达2.1年，大大超过目前赤芍注射液1.5年的有效期；澄明度、色泽、pH值、热源、刺激性等指标均符合《中国药典》有关注射剂的规定；可用于肌肉注射、静脉滴注或静脉注射给药。本发明方法制备的注射液具有使用方便、起效迅速、生物利用度高、效果确切等优点，经药效学试验表明：该注射液能明显改善脑梗塞大鼠的行为障碍，减小脑梗塞面积，显著降低梗塞脑组织含水量，减轻脑组织的脂质过氧化损伤，提高小鼠脑耐急性缺氧的能力，对脑梗塞具有良好的治疗作用。

具体实施方式

实施例1

取赤芍药材400g，切成饮片，用6倍量70％乙醇回流提取2次，第一次2小时，第二次1小时，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至相对密度为1.18(50℃)的清膏，加4倍量的水搅匀、冷藏24小时，高速离心(20000r/min)，上清液减压浓缩至相对密度1.25(50℃)的清膏，加乙醇使含醇量至85％，冷藏24小时，滤取上清液加氨水调pH至8.0，冷藏24小时，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至相对密度为1.08(50℃)的浓缩液，每次用等体积水饱和的正丁醇萃取4次，合并萃取液，减压回收正丁醇并浓缩至相对密度为1.25(50℃)的稠膏，真空干燥，得赤芍提取物。取赤芍提取物，加注射用水600ml溶解，用40％氢氧化钠溶液调pH至5.0～5.5，加热煮沸5分钟，放冷，冷藏24小时，滤过，滤液用截留分子量3000的超滤膜超滤，取滤液加注射用水至1000ml，再加0.05％的亚硫酸氢钠和0.8％的氯化钠，用40％氢氧化钠溶液调pH至6.0～7.0，用0.22um的微孔滤膜滤过，滤液灌封于100ml的输液瓶中，灭菌、质检，即制得本发明注射液——大输液。

实施例2

取赤芍药材300g，切成饮片，用8倍量60％乙醇回流提取3次，每次1.5小时，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至相对密度为1.23(50℃)的清膏，加3倍量的水搅匀、冷藏36小时，高速离心(20000r/min)，上清液减压浓缩至相对密度1.27(50℃)的清膏，加乙醇使含醇量至80％，冷藏48小时，滤取上清液加氨水调pH至8.0，冷藏28小时，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至相对密度为1.14(50℃)的浓缩液，加到大孔吸附树脂层析柱上，先用浓缩液重量30倍的水洗脱，弃去洗脱液，再用浓缩液重量30倍的20％乙醇洗脱，收集此洗脱液，减压回收、浓缩、干燥，即得纯化物。取此纯化物，加注射用水800ml溶解，用40％氢氧化钠溶液调pH至5.0～5.5，加热煮沸6分钟，放冷，冷藏24小时，滤过，滤液用截留分子量3000的超滤膜超滤，取滤液加注射用水至1000ml，再加0.04％的亚硫酸氢钠、0.2％的氯化钠4.8％的甘露醇，用40％氢氧化钠溶液调pH至6.0～7.0，用0.22um的微孔滤膜滤过，滤液灌封于250ml的输液瓶中，灭菌、质检，即制得本发明注射液——大输液。

实施例3

取赤芍药材1000g，切成饮片，用8倍量70％乙醇回流提取3次，每次1小时，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至相对密度为1.16(50℃)的清膏，加5倍量的水搅匀、冷藏36小时，高速离心(20000r/min)，上清液减压浓缩至相对密度1.26(50℃)的清膏，加乙醇使含醇量至85％，冷藏24小时，滤取上清液加氨水调pH至8.0，冷藏30小时，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至相对密度为1.10(50℃)的浓缩液，每次用等体积水饱和的正丁醇萃取5次，合并萃取液，减压回收正丁醇并浓缩至相对密度为1.25(50℃)的稠膏，真空干燥，得赤芍提取物。取赤芍提取物，加注射用水800ml溶解，用40％氢氧化钠溶液调pH至5.0～5.5，加热煮沸5分钟，放冷，冷藏24小时，滤过，滤液用截留分子量3000的超滤膜超滤，取滤液加注射用水至1000ml，再加0.05％的亚硫酸氢钠和0.2％的氯化钠，用40％氢氧化钠溶液调pH至6.0～7.0，用0.22um的微孔滤膜滤过，滤液灌封于2～10ml的安瓿中，灭菌、质检，即制得本发明注射液——小水针。

主要药效学试验

1对大鼠大脑中动脉栓线法局灶性脑缺血模型(MACO)的治疗作用

1.1实验方法

造模方法：将280-300g雄性SD大鼠用10％水合氯醛3ml/kg腹腔注射(ip)麻醉，颈正中切口，分离、结扎右侧颈总动脉、颈外动脉及其分支动脉。分离右侧颈内动脉，沿颈内动脉向下分离翼颚动脉，根部结扎该分支。在颈内动脉近端备线、远端放置动脉夹，颈总动脉分叉处切口，插入4-0尼龙线，其深度为17～20mm，栓线进入颈内动脉，入颅至大脑前动脉，阻断大脑中动脉所有血流来源。撤掉动脉夹，扎紧备线，外留1cm长线头，缝合皮肤。缺血1小时后静脉注射(iv)给药或iv生理盐水。缺血2h后再灌注，勿需再次麻醉和切开皮肤，轻轻提拉所留线头至有阻力时提示尼龙线头端已至颈总动脉切口处，血流再通。假手术组除不插线外，其余步骤同上。

实验分组与给药：(1)假手术组；(2)模型(溶剂治疗)组；(3)本发明注射液iv小剂量组；(4)本发明注射液iv中剂量组(5)本发明注射液iv大剂量组；(6)丹参注射液iv治疗组。

于造模后30min与12h分别按各剂量给药一次。

观察指标：

(1)神经病学评分

存活鼠再灌注24h后，观察大鼠行为学变化，进行神经病学评分。

参考Zea Longa的5分制评分标准：

0分，无神经损伤症状；

1分，不能完全伸展对侧前爪；

2分，向外侧转圈；

3分，向对侧倾倒；

4分，不能自发行走，意识丧失。

(2)脑梗塞范围的测定：进行上述两项指标测定后大鼠断头取脑，去掉嗅球、小脑和低位脑干后切成5片，以红四氮唑(TTC)染色。正常组织经染色后呈红色，梗塞组织呈白色。计算梗塞组织重量占总脑重的百分比作为梗塞范围。

(3)脑含水量测定：神经病学评分后，快速断头取鼠大脑。一部分分别称左右脑半球湿重，置100℃烤箱烘干至恒重，按以下公式计算脑组织含水量，脑组织含水量(％)＝(湿重-干重)/湿重×100％。

(4)脑组织生化指标的测定：将部分动物取脑组织进行均浆测定脑组织中SOD、LPO含量。

(5)病理检查：另一部分10％福尔马林中固定，经脱水、包埋、切片、染色等步骤制备组织切片，进行病理组织学检查。

1.2结果

1.2.1一般观察

经过脑梗塞的大鼠麻醉清醒后即有偏瘫样症状出现。主要表现为不同程度的手术对侧前肢内收，肩内旋，肌张力降低，推右肩向对侧移动，抵抗阻力降低，甚至有些动物还出现不停地向一侧转圈现象。表1显示，与模型组(生理盐水治疗)比较，术后24h的行为评分本发明各剂量治疗组和丹参治疗组均有明显低的行为学评分，统计分析有显著差异(P＜0.01)。术后模型组动物的一般状态较差，活动减少，大多数动物体重有所下降，而各治疗组动物一般状况均有明显的改善。

选取各实验组前8只大鼠进行神经病学评分，iv本发明注射液高、中组大鼠与模型组比较，大鼠的行为障碍明显地改善(P＜0.01)，有些动物几乎完全恢复正常。假手术组动物行为无异常(见表1)。

表1本发明注射液对大鼠大脑中动脉梗塞后的神经病学评分影响(x±s)

组别	剂量(g/kg)	n	神经病学评分
				假手术	-	10	0
模型	-	9	1.6±0.77
				丹参	10ml/kg	8	0.8±0.75*
本发明	8	8	0.5±0.32**
					4	9	0.6±0.57**
	2	9	0.9±0.83*

与模型组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001

1.2.2大鼠脑梗塞范围的观察及本发明注射液对梗塞范围的影响

由表2可以看出，脑缺血再灌注24h后脑组织梗塞程度明显，梗塞面积占总脑面积的36.68±10.51％。本发明注射液和丹参注射液给药后，使脑梗塞面积百分比明显下降。假手术组动物未见脑梗塞发生。

表2本发明注射液对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用(x±s)

组别	n	剂量(g/kg)	梗塞面积(％)
				模型组	9	0	36.68±10.51
丹参组	8	10ml/kg	13.32±4.77***
				本发明	8	2	19.96±7.28**
本发明	8	4	12.13±7.45***
				本发明	9	8	8.05±2.51***

与模型组比较，^**P＜0.01，^***P＜0.001。

1.2.3脑含水量

从表3可以看出，各组大鼠未梗塞的左侧大脑的湿重，干重均无明显的差别；而对于梗塞的右侧脑组织，模型组脑含水量显著高于假手术组；本发明注射液大剂量组和中剂量组则显著低于模型对照组，而与假手术组接近，本发明注射液小剂量组的脑含水量虽有降低趋势，但与模型对照组相比无统计学意义，丹参注射液治疗组也有降低脑含水量的作用。

表3脑梗塞大鼠脑含水量的比较(x±s，n＝8)

组别 剂量(g/kg)	左脑			右脑
							湿重(mg)	干重(mg)	含水量(％)	湿重(mg)	干重(mg)	含水量(％)
	假手术	784.6±34.2	180.1±10.9	77.0±0.93	793.1±55.2	182.8±17.9							77.0±0.93
模型组							813.1±20.6	187.1±11.8	77.0±1.32	838.1±64.2	171.6±12.1	79.5±0.73**
	丹参10ml/kg	813.6±41.5	186.9±14.8	77.0±1.01	862.6±29.6	181.8±10.3							78.3±1.37#
本发明2							814.9±39.9	188.1±18.1	76.9±1.43	847.1±42.8	179.0±5.51	78.7±0.29
	本发明4	826.0±37.9	189.8±10.7	77.0±1.14	833.0±53.7	179.5±11.9							78.4±1.05#
本发明8							835.1±38.8	190.8±18.9	77.2±1.35	865.8±45.9	193.0±15.0	77.7±0.88##

与假手术组比较，^**P＜0.01；与模型组比较：^#P＜0.05，^##P＜0.01。

1.2.4脑组织超氧化物岐化酶、脂质过氧化物水平的变化

造模后24h观察，模型组大鼠脑组织LPO含量均较正常组显著增高，SOD含量显著降低。丹参组及本发明注射液大、中剂量组与模型组比较，LPO含量均降低；本发明注射液组SOD含量均增高。提示本发明注射液能升高组织SOD含量，降低LPO水平，从而减轻脑组织的脂质过氧化损伤。见表4。

表4本发明注射液对大鼠脑匀浆SOD、LPO含量的影响(x±s)

组别	LPO(nmol/100mg.Pro)	SOD(U/mg.Pro)
			正常对照组	256.11±88.21	17.36±2.31*
模型组	378.88±105.78	13.12±3.98
			丹参组	292.23±85.87*	20.61±3.83**
本发明大剂量组	249.11±96.28**	25.43±4.25**
			本发明中剂量组	293.09±48.39**	20.31±3.61**
本发明小剂量组	311.26±144.39	19.25±3.57*

1.2.5大鼠脑梗塞后组织形态学变化及本发明注射液的影响

大鼠经脑梗塞术后24h，病灶侧脑表面苍白、无光，脑表面血管较对侧充血，血管数目也有所增多，位于嗅束和大脑下静脉之间的一段大脑中动脉颜色变暗。术后48h病灶侧脑组织水肿明显，随时间延长逐渐出现软化。在光镜下观察脑组织切片，可见大脑中动脉内有血栓形成，血栓成分主要是血小板、红细胞和纤维蛋白，表现为混合血栓的特征。脑组织主要呈缺血性改变，随时间延长，缺血软化灶范围和深度有所增加。假手术组无明显病理改变。

经本发明治疗后的动物，肉眼即可见大脑中动脉较对照组动物红润，组织切片示血栓明显减轻甚至完全溶解。脑组织缺血程度减轻，只有小片软化灶。而丹参组的动物，血栓也明显减轻。各实验组大脑组织病理学改变如下：

假手术组：神经元及脑实质细胞结构基本正常，细胞核未见肿胀，核仁清楚，虎斑清晰可见，细胞周围间隙略扩大，毛细血管内有轻微充血，呈轻度变性水肿改变。

模型(生理盐水治疗)组：左侧大脑半球结构基本正常，呈轻度水肿改变；右侧见神经元及脑实质细胞周围间隙明显扩大，细胞核肿胀明显，核仁模糊，脑实质内有出血，毛细血管周围间隙扩大，成变性，坏死，出血改变。

丹参注射液组：左侧脑细胞结构未见异常，仅见细胞周围间隙略增大，呈轻度变形，水肿表现。右侧神经元及细胞核轻度肿胀，核仁不清，脑实质细胞周围间隙增大，毛细血管周围有少量渗出性出血，呈变性，水肿及出血改变。

本发明注射液大剂是量组：左侧脑细胞结构未见异常，细胞周围间隙略增宽，呈轻度变形改变。右侧神经元及脑实质细胞、毛细血管周围间隙略增大，神经元细胞核轻度肿胀，核仁清楚，可见较多胞质细胞增生现象。呈变性，水肿改变。

本发明注射液中剂是量组：左侧脑细胞结构未见异常，细胞周围间隙略增大，呈轻度变形改变。右侧神经元及脑实质细胞、毛细血管周围间隙略增大，神经元细胞核轻度肿胀，核仁不见，可见较多胶质细胞增生，呈变性，水肿改变。

本发明注射液小剂量组：左侧脑细胞结构未见异常，细胞周围间隙略增大。神经元及脑实质细胞、毛细血管周围间隙略增大，细胞轻度水肿，核仁不清，毛细血管内有充血，周围间隙增大，呈变性，水肿改变。

2.对小鼠急性脑出血的影响

昆明种小鼠50只，体重18-22g，随机分成5组，每组10只，用药组分别iv给予本发明注射剂4g/kg，8g/kg，16g/kg；阳性对照组丹参注射液20ml/kg，生理盐水组iv等容量的5％葡萄糖注射液。连续给药3d，末次给药后30min将小鼠逐只断头，立即按秒表记录小鼠断头后至张口喘气停止时间、张口次数以及凝血时间。结果见表5。

结果表明，本发明注射液各剂量组给药后均能明显延长小鼠断头张口次数及呼吸时间，凝血时间也延长，以本发明低剂量组最为显著。表明本发明可提高小鼠脑耐急性缺氧的能力，改善脑能量代谢，并且具有活血化瘀之功效。

表5本发明注射液对小鼠急性脑缺血以及凝血时间的影响(n＝10)

组别	剂量(g/kg)	张口次数	张口呼吸连续时间(s)	凝血时间(s)
					5％葡萄糖注射液	-	11.8±2.0	14.2±2.3	49.6±16.5
本发明低剂量组	4	16.1±3.3**	17.9±2.7**	86.1±61.2**
					本发明中剂量组	8	13.9±2.6*	19.1±2.2**	75.1±19.1*
本发明高剂量组	16	14.8±3.4*	19.2±1.8**	76.2±16.3*
					丹参组	20ml/kg	14.8±3.4*	19.7±3.0**	60.1±21.2*

与5％葡萄糖注射液组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01

以上实验结果表明，本发明对脑梗塞具有良好的的治疗作用。

Claims (4)

1、一种赤芍注射液的制备方法，该方法包括以下三个步骤：

(1)提取：取赤芍药材，切片，每次用4～12倍量60～80％的乙醇回流提取2～4次，每次0.5～3小时，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至相对密度为1.15～1.25的浓缩液，加入2～5倍量的水，搅拌均匀，冷藏12～72小时，高速离心，上清液减压浓缩至相对密度1.25～1.30的清膏，加乙醇使含醇量至80～85％，搅匀，冷藏12～48小时，滤取上清液加氨水调pH至8.0，冷藏12～48小时，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至相对密度为1.05～1.18的浓缩液，得提取液；

(2)纯化：取上述提取液，采用正丁醇萃取法或大孔树脂柱层析法制得纯化物；

(3)配制：取上述纯化物，加注射用水溶解，调pH至5.0～5.5，加热煮沸5～10分钟，冷藏，滤过，滤液用截留分子量3000的超滤膜超滤，取滤液加注射用水和注射用药用辅料，搅拌溶解，调pH至6.0～7.0，用0.22μm的微孔滤膜滤过，滤液灌封、灭菌、质检，制得注射液。

2、根据权利要求1所述的赤芍注射液的制备方法，其特征在于步骤(2)所述的正丁醇萃取法是：取提取液，每次用等体积的正丁醇萃取，共萃取3～6次，合并萃取液，减压回收、干燥，即得纯化物。

3、根据权利要求1所述的赤芍注射液的制备方法，其特征在于步骤(2)所述的大孔树脂柱层析法是：取提取液，加到大孔吸附树脂层析柱上，先用提取液重量10～50倍的水洗脱，弃去洗脱液，再用提取液重量10～50倍的10～30％乙醇洗脱，收集此洗脱液，减压回收、浓缩、干燥，即得纯化物。

4、根据权利要求1所述的赤芍注射液的制备方法，其特征在于步骤(3)所述的注射用药用辅料为甘露醇、氯化钠、山梨醇、葡萄糖、果糖、亚硫酸氢钠中的一种或几种。