CN103083408A

CN103083408A - 一种中药提取物组合物、其制备方法及其用途

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Publication number: CN103083408A
Application number: CN2011103315974A
Authority: CN
Inventors: 杨洪军; 许海玉; 黄璐琦; 张迎春; 陈晓萌
Original assignee: Institute of Materia Medica of CACMS
Current assignee: Institute of Materia Medica of CACMS
Priority date: 2011-10-27
Filing date: 2011-10-27
Publication date: 2013-05-08
Anticipated expiration: 2031-10-27
Also published as: CN103083408B

Abstract

本发明涉及一种中药提取物组合物、其制备方法及其用途。所述组合物由分别从延胡索和白芷生药中得到的提取物组成。所述组合物可用于治疗和/或预防由气滞血瘀所致的多种疼痛及抑郁症，具有安全、有效、可控等特点。

Description

一种中药提取物组合物、其制备方法及其用途

技术领域

本发明涉及一种中药提取物组合物。具体地说，所述组合物是以延胡索(Rhizoma corydalis)和白芷(Angelica dahurica)各自的提取物为原料制备而得的。本发明还涉及所述中药提取物组合物的制备方法及其用途。

背景技术

疼痛是与组织损伤或潜在的组织损伤相关的一种不愉快的感觉和情感经历，也是人类最早感受和认识的疾病。疼痛不仅使患者丧失工作能力，导致经济收入下降或者失去工作，而且使慢性疼痛者的人格独立性受到威胁，患者会感到生活失去兴趣和意义，严重者导致家庭破裂、自杀甚至危及社会。1999年在维也纳召开的第9届世界疼痛大会上首次提出“疼痛不仅仅是一种症状，也是一种疾病”，“免除疼痛是全人类的权利”。

中医学的起源和理论特色与痛证的诊疗实践密切相关。依据祖国医学理论：身体内外产生一种难以忍受的苦楚叫痛。孟庆云认为痛证理论发展经历了以寒热病因、气血病机及作用于经脉、五脏类分为标志的《内经》时代；从外感、内伤分证，确立痛证辨证论治体系的仲景时代；以李东垣、朱丹溪为代表深化和创立痛证病机学说，从气、血、痰、郁立法论治的金元时代；突破“痛无补法”禁区，倡导温补治痛诸法的明代温补学派时代(孟庆云，中医痛证理论发展之历程，上海中医药杂志[J].1999，33(3)：4-6)。中医认为疼痛的发病机制有：不通则痛；不荣则痛；不正则痛等。中医学认为，人身经脉流行，气血环转，上下内外，无有已时。若病邪相加，气行不畅，血运不调，气血不通，则出现疼痛。对于疼痛的治疗，从古至今一直以辨证论治为主流，以疼痛的病因病机为切入点，以“通”立法。关节疼痛遵循通则不痛，荣则不痛，正则不痛的法则。清代高士宗所论“通之三法，各有不同，调气和血，调血和气，通也……虚者助之使通，寒者温之使通……”。对于关节疼痛来说，活血行气、疏通经络为基本治疗原则，以活血药、理气药为常用基本中药，以达到改善症状，祛除致痛病邪和消除或缓解其疼痛病机的目的。

元胡止痛片系延胡索和白芷的复方，具有理气、活血、止痛的功效，常用于治疗气滞血瘀的胃痛、胁痛、头痛及痛经(中国国家药典委员会，中国药典[M].北京：化学工业出版社，2005：362)。现在研究证明，元胡止痛片具有良好的镇痛效果(杨倩，王四旺.延胡索乙素与白芷总香豆素、总挥发油配伍药效学比较研究，现代生物医学进展[J].2009，9(15)：2814-2816.)。延胡索止痛的化学成分主要为延胡索甲素(d-corydaline)、延胡索乙素(dl-THP)、延胡索癸素(corydalis J)、延胡索丑素(corydalis L)，其中以dl-THP的镇痛作用最强，延胡索丑素次之，延胡索甲素、延胡索癸素再次(郑汉臣，蔡少青.药用植物学与生药学[M].第四版.北京：人民卫生出版社，2006：284)。白芷止痛的化学成分主要为欧前胡素(imperatorin)、异欧前胡素(isoimperatorin)、氧化前胡素(oxypeucedanin)等香豆素类物质和甲基环癸烷、Agidol、1-十四碳烯等挥发油物质(张富强，聂红等人.南京中医药大学学报(自然科学版)[J].2002，18(3)：190-192)。

抑郁症是指以显著而持续的情绪低落、活动能力减退、思维与认知功能迟缓为主要临床特征的一类心境障碍。随着社会的发展，人们生活工作节奏的加快，人们承受着生活压力增大所导致的越来越大的精神压力，造成情绪低落、沮丧、抑郁及精神失常等问题，使得抑郁症的发病率不断提高，影响了现代人的生活。抗抑郁症药物的临床应用受其耐药性和副作用等缺点的限制，而传统中医药在治疗抑郁症方面有着丰富的经验和大量的文献记载。中医学虽无“抑郁症”之名，但从其发病特点和临床变现看，与中医学的“郁病”、“百合病”、“脏躁”、“癫症”、“惊悸”等神志病有一定联系。现代药理学实验证明，抑郁症与体内单胺氧化酶(MAO)的活性密切相关。从中药中分离得到的活性成分，则可以影响MAO的活性。例如，从紫金龙中分离得到的原阿片碱在TST实验及5-HTP诱导的小鼠甩头实验中，显示出良好的抗抑郁活性；另外，从补骨脂中分离得到的补骨脂次素等香豆素，可以显著降低小鼠在FST实验中的不动时间，对其自主活动无影响，可增加脑内5-羟色胺和多巴的含量水平(朱琳，抗抑郁植物药的研究进展，医药导报[J].2010，29(10)：1287-1291)。

发明内容

本发明涉及一种中药提取物组合物，其由分别从延胡索和白芷生药中得到的提取物组成，所述提取物的制备方法如下所示：

延胡索提取物的制备方法：取延胡索药材粉末，用2-4倍量的40％-80％的乙醇/水浸泡，加热回流2-4小时，收集提取液，再加入1-3倍量的40％-80％的乙醇/水加热回流1-3小时，收集提取液，合并二次提取液，过滤，滤液浓缩至无醇味；选用离子交换树脂色谱法纯化，回收溶剂，真空干燥，得浸膏，粉碎，过筛，得延胡索提取物。

白芷提取物的制备方法：取白芷药材粉末，用4-6倍量的50％-90％的乙醇/水浸泡，加热回流2-4小时，收集提取液，再加入4-6倍量的50％-90％的乙醇/水加热回流1-3小时，收集提取液，合并二次提取液，过滤，滤液浓缩至无醇味；选用大孔树脂色谱法纯化，回收溶剂，真空干燥，得黄棕色粉末，无水乙醇洗涤，回收乙醇，真空干燥，得浸膏，粉碎，过筛，得白芷提取物。

所述中药提取物组合物中延胡索提取物和白芷提取物按照重量份数配比，其重量份数比为1-100∶1-50，优选重量份数比为10-100∶5-50，更优选重量份数比为20-100∶10-50。

所述中药提取物组合物还可包含任一药学上可接受的载体，其包括稀释剂、赋形剂、填充剂、润湿剂、崩解剂、矫味剂和粘合剂等。

另外，本发明还涉及一种制备所述中药提取物组合物的方法。首先按照上述方法分别从延胡索和白芷生药中取得相应的提取物；其次将两种中药提取物按照具体的重量份数比混合，最后加入适量的载体后混匀以制备任一药学上可接受的剂型，如注射剂、输液剂、合剂、片剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、丸剂、滴丸剂、颗粒剂、贴剂和巴布剂等，优选为硬胶囊剂。

本发明还涉及所述中药提取物组合物在制备治疗和/或预防由气滞血瘀所致的疼痛的药物中的用途，所述疼痛可包括胃痛、胁痛、头痛以及痛经。此外，本发明还涉及所述中药提取物组合物在制备治疗和/或预防抑郁症的药物中的用途。所述中药提取物组合物的使用方法和使用剂量取决于多种因素，如患者的年龄、体重、性别、健康状况、饮食以及病征的持续时间和严重程度等。本领域技术人员根据上述因素可以容易地决定其使用方法和使用剂量。

本发明中的中药提取物组合物是发明人从中医活血化瘀理气止痛的理论出发，在沿袭传统验方——元胡止痛方并且运用现代科技明确延胡索和白芷两味生药各自的活性成分的基础上，将两味生药的提取物进行组合而制成。经药效学试验(小鼠扭体实验和热板实验)证明：本发明的提取物组合物可有效减少试验时间内小鼠的扭体和舔爪次数，进而表明所述提取物组合物在治疗和预防疼痛方面与传统成方制剂相比具有相同或更优的效果。

本发明的发明人对延胡索和白芷两味生药中与镇痛相关的17种主要的活性单体(见表1)进行抗抑郁活性网络靶标预测，如图1所示。

表1用于抗抑郁活性预测的17种活性单体

从图中可以看出，所述17种单体成分绝大多数都作用于ABO和HSP90AA1靶点蛋白，二者与血小板减少症有关。同时，所述17种分子大多数作用于CYP2C9、GSK3B、HSPA8、MAOB、NR3C1、PDE4B、PDE4D、PDE5A和SULT1A1靶点蛋白，这些靶点蛋白均与忧郁症密切有关，同时MAOB还与肌肉僵直疾病有关。经抗抑郁试验(小鼠强迫游泳试验等)证明：本发明的中药成分组合物可有效缩短小鼠强迫游泳的不动时间并可有效对抗由利血平所致的小鼠体温下降、眼睑下垂和运动不能的体征，进而表明所述组合物在治疗和预防抑郁症方面与阳性对照药(氟西汀)相比具有相同或更优的效果。

对所述中药成分组合物进行长期毒性试验，其结果证明口服给药安全；并且由于本发明的组合物是由两味生药经特殊的提取分离过程而得到的提取物组合而成，相较于传统成方制剂具有较高的可控性，为所述组合物的生产制备标准化以及疗效可控性奠定了物质基础。

附图说明

图1显示了延胡索和白芷中17种活性单体的抗抑郁活性预测结果。

图2显示了本发明的中药提取物组合物对大鼠舒张血管活性的影响。结果表明，各组提取物组合物均具有显著的舒张血管作用(P＜0.05)。

具体实施方式

下面结合具体的实施例进一步阐述本发明的中药提取物组合物。下列实施例只为说明本发明，而不应将其理解为对本发明的限制。

除特殊说明以外，下述实施例中的实验方法均为本领域技术人员所熟知的常规方法；所述试剂和实验材料均可从商业途径获得。

下述实施例中所用的延胡索和白芷均符合中华人民共和国药典2005年版一部正文各药材项下的有关规定。经鉴定，各药材名称与实物相符，质量均符合药典标准。

1.本发明的中药提取物组合物的制备

1.1材料

延胡索购自河北省安国中药材有限公司，产自河北省，样品保存于中国中医科学院中药研究所，批号为yp0031；白芷购自河北省安国中药材有限公司，产自杭州，样品保存于中国中医科学院中药研究所，批号为yp0032；NaOH(分析纯，天津市大陆化学试剂厂)；无水乙醇(分析纯，济南汇丰达化工开发有限公司)；氨水(分析纯，济南世纪通达化工有限公司)；盐酸(分析纯，太仓博之源化学有限公司)；纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)；732型阳离子交换树脂(上海汇珠树脂有限公司)；D101-1型大孔树脂(安徽三星树脂科技有限公司)；胶囊壳(浙江省中意胶囊有限公司)。

1.2提取物制备实施例

提取物制备实施例1：

延胡索提取物1：

取延胡索500g，用2倍量的70％乙醇浸泡30小时，加热回流3小时，收集提取液，再加入2倍量的70％乙醇加热回流2小时，收集提取液，合并二次提取液，过滤，滤液浓缩成无醇味。选用732型阳离子交换树脂湿法装柱，径高比约为1∶10，上样，上样量为延胡索药材与树脂体积比为1∶1(g/mL)，用5BV的纯化水以0.5BV/h的洗脱速度除杂。然后用4BV的含氨水的70％乙醇洗脱，洗脱速度为1BV/h，回收溶剂，减压干燥，得浸膏，粉碎，过筛，得延胡索提取物1。

白芷提取物1：

取白芷药材粉末500g，加入6倍量的60％乙醇浸泡30小时，加热回流3小时，收集提取液，再加入6倍量的60％乙醇加热回流2小时，收集提取液，合并二次提取液，过滤，滤液浓缩成无醇味。选用D101-1型大孔树脂湿法装柱，上样，静置吸附30min，用2BV的10％乙醇以1.0mL/min的流速除杂，弃除杂液，再用3BV含0.5％NaOH的30％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，用稀盐酸调pH值至3-4，回收乙醇，真空干燥得黄棕色粉末，然后用无水乙醇洗涤，回收乙醇，真空干燥，得浸膏，粉碎过筛，得白芷提取物1。

提取物制备实施例2：

延胡索提取物2：

取延胡索500g，用4倍量的50％乙醇浸泡20小时，加热回流3小时，收集提取液，再加入4倍量的50％乙醇加热回流2小时，收集提取液，合并二次提取液，滤过，滤液浓缩成无醇味。选用732型阳离子交换树脂湿法装柱，径高比约为1∶10，上样，上样量为延胡索药材与树脂体积比为1∶1(g/mL)，用5BV的纯化水以0.5BV/h的洗脱速度除杂。然后用4BV的含氨水的70％乙醇洗脱，洗脱速度为1BV/h，回收溶剂，减压干燥，得浸膏，粉碎，过筛，得延胡索提取物2。

白芷提取物2：

取白芷药材粉末500g，加入7倍量的50％乙醇浸泡20小时，加热回流3小时，收集提取液，再加入7倍量的50％乙醇加热回流2小时，收集提取液，合并二次提取液，滤过，滤液浓缩成无醇味。选用D101-1型大孔树脂湿法装柱，上样，静置吸附30min，用2BV的10％乙醇以1.0mL/min的流速除杂，弃除杂液，再用3BV含0.5％NaOH的30％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，用稀盐酸调pH值至3-4，回收乙醇，真空干燥得黄棕色粉末，然后用无水乙醇洗涤，回收乙醇，真空干燥，得浸膏，粉碎过筛，得白芷提取物2。

提取物制备实施例3：

延胡索提取物3：

取延胡索500g，用3倍量的60％乙醇浸泡24小时，加热回流3小时，收集提取液，再加入3倍量的60％乙醇加热回流2小时，收集提取液，合并二次提取液，过滤，滤液浓缩成无醇味。选用732型阳离子交换树脂湿法装柱，径高比约为1∶10，上样，上样量为延胡索药材与树脂体积比为1∶1(g/mL)，用5BV的纯化水以0.5BV/h的洗脱速度除杂。然后用4BV的含氨水的70％乙醇洗脱，洗脱速度为1BV/h，回收溶剂，减压干燥，得浸膏，粉碎，过筛，得延胡索提取物3。

白芷提取物3：

取白芷药材粉末500g，加入5倍量70％乙醇浸泡24小时，加热回流3小时，收集提取液，再加入5倍量的70％乙醇加热回流2小时，收集提取液，合并二次提取液，过滤，滤液浓缩成无醇味。选用D101-1型大孔树脂湿法装柱，上样，静置吸附30min，用2BV的10％乙醇以1.0mL/min的流速除杂，弃除杂液，再用3BV含0.5％NaOH的30％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，用稀盐酸调pH值至3-4，回收乙醇，真空干燥得黄棕色粉末，然后用无水乙醇洗涤，回收乙醇，真空干燥，得浸膏，粉碎过筛，得白芷提取物3。

1.3中药提取物组合物制备实施例

组合物A制备实施例：

取上述延胡索提取物1和白芷提取物1，按照重量份数比为20∶50将两种提取物混合均匀，可加入药学上可接受的载体，填充入胶囊壳中，制得所述中药提取物组合物A的硬胶囊剂。

组合物B制备实施例：

取上述延胡索提取物2和白芷提取物2，按照重量份数比为60∶30将两种提取物混合均匀，可加入药学上可接受的载体，填充入胶囊壳中，制得所述中药提取物组合物B的硬胶囊剂。

组合物C制备实施例：

取上述延胡索提取物3和白芷提取物3，按照重量份数比为100∶10将两种提取物混合均匀，可加入药学上可接受的载体，填充入胶囊壳中，制得所述中药提取物组合物C的硬胶囊剂。

2.通过外翻肠囊法研究中药提取物组合物的药效物质基础

基于延胡索和白芷的活性物质基础以及质量标准方面的现有文献，本发明的发明人确定了用于研究本发明的组合物中的药效物质基础的17个化学单体成分(分别是欧前胡素、异欧前胡素、蛇床子素、原阿片碱、盐酸小檗碱、延胡索乙素、东莨菪内酯、花椒毒素、氧化前胡素、佛手柑内酯、四氢小檗碱、茴芹内酯、α-别隐品碱、白当归素、白当归脑、黄连碱和紫堇碱)，并将上述化学单体应用于外翻肠囊法吸收成分研究实验中。

2.1材料

2.1.1仪器

ALC-M型组织-器官水浴系统(上海奥尔科特生物科技有限公司)，BP110S型电子分析天平(Sartorius公司)；Agilent 1200系列高效液相色谱系统(G1312A二元泵，G1314AVWD检测器)，MTN-2800W型氮吹仪(AUTO SCIENCE公司)，GTR16-2型高速离心机(北京时代北利离心机有限公司)，KH3200E型超声波清洗器(昆山和创超声仪器有限公司)。

2.1.2药品与试剂

乙腈(色谱纯，Fisher公司)、甲醇(色谱纯，Fisher公司)、蒸馏水(中国中医研究院中药研究所自制)、纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)。其它所用对照品如表2所示：

表2外翻肠囊法吸收成分研究所用对照品列表

2.1.3动物

SD大鼠，雄性，体重250±10g，由北京大学医学部实验动物科学部提供，合格证号：SCXK(京)2006-0008。

2.1.4台氏(Tyrode)缓冲液

将8.0g NaCl、0.28g KCl、1.0g NaHCO₃、0.05g NaH₂PO₄和0.1gMgCl₂溶于500mL蒸馏水中，密闭冷藏；将0.2g CaCl₂溶于500mL蒸馏水中密闭冷藏；临用前在不断搅拌下将二者均匀混合，加入1.0g葡萄糖即得。

2.2实验方法

2.2.1元胡止痛片的17个指标成分的测定方法

采用文献中报道的方法测定17个指标成分，具体操作方法详见Yingchun Zhang，Haiyu Xu，Xiaomeng Chen等人，Journal ofPharmaceutical and Biomedical Analysis.56(2011)：497-504。其中，色谱和质谱条件如下所示：

色谱条件：Agilent XDB C₁₈色谱柱(4.6mm×50mm，1.8μm)；流动相：A：0.3％甲酸水(氨水调PH＝2.7)，B：乙腈；梯度洗脱程序如下：0-4min，20-40％B；4-6min，40-80％B；6-8.5min，80％B；流速：0.6ml/min；Agilent 1200 RRLC色谱仪(Agilent)。

质谱条件：Agilent RRLC-QQQ(Agilent)；正离子模式检测；电喷雾毛细管电压：4000V；喷雾压力：38psi；氮气：流量为10L/min，温度为345℃；扫描范围：m/z 100-500。各个化合物的质谱优化条件如表3所示：

表3 17个化合物的质谱优化条件

2.2.2元胡止痛方供试液的制备

将延胡索、白芷药材分别粉碎，过40目筛，分别取延胡索粉末200g和白芷粉末100g，加入4倍量70％乙醇，浸泡1h，回流两次，每次提取2小时，过滤，合并滤液，回收溶剂，减压干燥，得到浸膏。将浸膏用台氏液溶解，分别制成低、中、高浓度的混悬液，每毫升含生药量分别为40mg、80mg、160mg，以供肠外翻试验使用。

2.2.3肠外翻操作

将实验前禁食12h的大鼠称重后，断颈椎处死，沿腹中线和腹白线分别剪开皮肤与肌肉。考察的肠段区间均为10cm，从幽门以下10cm处开始向下量取10cm为第一空肠段；间隔10cm后再量取10cm为第二空肠段；从回盲瓣以上5cm处开始向上量取10cm为回肠段。将剪下的肠管放入0℃台氏液中冲洗，至无肠内容物为止。将自制硅胶套管的软端插入肠管，用丝线结扎，小心将肠道翻转。用0℃台氏液冲洗内表面，将另一端用丝线结扎成囊状。将肠管放入盛有25ml 37℃恒温台氏液的麦氏浴管中，开始提供混合气体(95％O₂和5％CO₂)。向肠管中注入2ml台氏液，然后将肠管放入不同浓度(代表大、中、小三个给药剂量)的含药台氏液中。给药120min后，分别取出三段肠内所有肠液，合并肠液。样品放入干净的EP管中，于-20℃直立保存待用。实验结束后将肠管纵向剖开，自然摊于滤纸上测量长度和宽度，记录吸收面积A。

2.2.4供试品溶液的制备

在不同时间点分别从肠管取300μL，精确量取250μL后用氮气吹干，加入25μL 70％甲醇溶解，用0.22μm滤膜过滤，注入10μL后，用RRLC-QQQ-MS系统分析，代入标准曲线计算浓度。

2.2.5统计方法

药物累计吸收量按Q＝C_nV计算。Q为药物各时间点累积吸收量。

2.3结果及讨论

上述试验是在文献基础上进行的，采用RRLC-QQQ-MS的分析方法，能够在9min内对17个指标成分进行定性及定量分析，分析时间较短，同时该方法具有较低的检测限和定量限，灵敏度较高。空白肠吸收液对17个指标成分的色谱行为和质谱行为没有干扰，可以应用已经建立好的方法进行肠吸收液的分析。对于不同给药剂量的元胡止痛方被三段肠吸收的累计吸收量如表4所示：

从表4中可以看出，提取液中含量较高的成分依次为：紫堇碱＞黄连碱＞欧前胡素＞原阿片碱＞异欧前胡素＞α-别隐品碱＞四氢小檗碱；而在肠吸收液中含量较高的成分依次为：原阿片碱＞紫堇碱＞α-别隐品碱＞延胡索乙素＞黄连碱＞白当归素＞欧前胡素。由此可见，元胡止痛方中的17个成分含量和比例在给药前后发生了较大变化，对肠吸收液中化学成分的分析，有助于明确元胡止痛方的药效物质基础。另外，元胡止痛方中17个指标成分的吸收率如表5所示：

表5元胡止痛方中17个指标成分的吸收率

从表5中可以看出，白当归脑、白当归素、延胡索乙素三个成分的吸收率比较高，最终是从低浓度向高浓度进行转运，属于主动运输；东莨菪内酯、原阿片碱、α-别隐品碱、欧前胡素、蛇床子素等成分在高剂量和中剂量的肠吸收累计吸收量基本相等，肠吸收液浓度基本相同，说明这些成分存在饱和现象，其吸收与肠道转运蛋白有关；四氢小檗碱、紫堇碱等成分在高、中、低给药剂量中的吸收率没有显著差异，这些成分可能通过被动扩散吸收。

3.药效学试验

根据肠外翻试验的结果，在肠吸收液中含量较高的成分有原阿片碱、紫堇碱、α-别隐品碱、延胡索乙素、黄连碱、白当归素、欧前胡素，说明这些成分药效活性值得进一步研究。本发明的发明人按照国家食品药品监督局《药品注册管理办法》的规定要求，设计试验方案，进行了下述药效学试验研究(对大鼠胸主动脉环的舒张血管作用、扭体试验、热板试验、抗抑郁试验和长期毒性试验)。

3.1对大鼠胸主动脉环的舒张血管作用

3.1.1材料

3.1.1.1药品

按照上述实施例中所述方法分别制得中药提取物组合物A、B、C的硬胶囊剂，0.3g/粒。阳性对照药：元胡止痛片(四川蜀中制药厂，批号：100502)。

3.1.1.2动物

SPF级SD大鼠，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物合格证号：SCXK(京)2006-009。

3.1.2实验方法

3.1.2.1试验动物分组

选择SD大鼠，体重为220-250g，雌性，随机分为阴性对照组(空白)、阳性对照组(元胡止痛片组)、提取物组合物A组、提取物组合物B组和提取物组合物C组。

3.1.2.2供试药液的制备

取三种提取物组合物A、B、C的硬胶囊，去除硬胶囊皮，粉碎，过6号筛，加入台氏液制备成各组提取物组合物的供试药液(各组浓度均为0.1765g生药/ml)；元胡止痛片去包衣，粉碎，过6号筛，加入台氏液制备成阳性对照组(浓度为0.1765g生药/ml)；空白台氏液为阴性对照组。按照上述肠外翻操作，分别制备肠吸收液，每次三个肠段，每个肠管大约制备2ml左右，分别合并肠液，分别获得各组肠吸收液供试药液。将制备的肠吸收液供试药液冷冻存放在-20℃冰箱中备用。

3.1.2.3大鼠胸主动脉环制备

取雄性SD大鼠，颈部脱臼，剪开胸腔，迅速取出胸主动脉条，放置于4℃的K-H液中，并置于冰上分离。小心剥去附在胸主动脉的脂肪及结缔组织，横切成2-3mm长的血管环。将血管环悬挂于预置5mlK-H液的浴槽中，温度恒定为37.0±0.2℃，持续通入95％O₂和5％CO₂的混合气体。标本的一端固定，另一端经张力换能器连接ALC-M离体组织器官实验系统，记录实验过程中张力的变化。稳定过程先以0g张力开始，维持30min后，调节其基础张力至1g，平衡1h，期间每隔20min更换一次K-H液。主动脉环稳定后，用KCl(60mmol/L)刺激，待收缩幅度稳定后用K-H液洗脱，以激发最大收缩并使血管收缩状态更稳定。

3.1.2.4大鼠胸主动脉环的收缩和舒张功能的测定

用K-H液清洗血管环数次，使其保持基础张力。然后用KCl(60mmol/L)诱发最大收缩幅度为100％，分别加入按照3.1.2.2项制备的各组供试药液，以给药后的血管张力舒张幅度与KCl诱发最大收缩幅度之间的比率作血管舒张作用的量效曲线；药物引起的收缩幅度均以第二次KCl(60mmol/L)引起的最大收缩幅度为相对标准值，以百分比表示。

3.1.2.5统计分析

舒张率为给药后血管张力与KCl引起的血管最大收缩张力相比所下降的幅度。不同质量浓度下的实验结果均以

形式表示，Origin 8.0软件用于拟合上述量效曲线并计算出最大效应(Emax)和半最大效应浓度(ED50)。

3.1.3结果及讨论

本发明的中药提取物组合物对大鼠胸主动脉的舒张作用如图1所示。从图1中可以看出，提取物组合物A、B、C各组均表现出舒张血管活性，与阴性对照相比，提取物组合物A、B、C对血管的舒张活性均具有显著性(P＜0.05)；与元胡止痛片阳性对照组相比，等剂量的提取物组合物A、B、C的舒张血管活性没有显著性差异，说明提取物组合物A、B、C与元胡止痛片具有等效性。

3.2扭体试验

3.2.1材料

3.2.1.1药品

按照上述实施例中的所述方法分别制得中药提取物组合物A、B、C的硬胶囊剂，0.3g/粒。阳性对照药：元胡止痛片(四川蜀中制药厂，批号：100502)。

3.2.1.2动物

SPF级昆明种小鼠，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物合格证号：SCXK(京)2006-0009。

3.2.2实验方法

选择昆明种小鼠50只，雌雄各半，体重18-22g，随机分成5组：生理盐水组、提取物组合物A组、提取物组合物B组、提取物组合物C组和阳性对照组(元胡止痛片组)。于实验前三天，将第2、3、4组分别灌服提取物组合物A(5g生药量/kg)、提取物组合物B(5g生药量/kg)和提取物组合物C(5g生药量/kg)；将第1组和第5组分别灌服生理盐水和元胡止痛片(5g生药量/kg)，每日一次，共5天。末次给药后40min，向各组小鼠腹膜内注射0.7％的醋酸溶液(0.1mL/10g体重)，分别记录注射醋酸溶液后10min和20min内各组小鼠扭体次数(扭体反应表现为腹部收缩、躯体扭曲，后肢伸展及臂部抬高)，并计算疼痛抑制百分率。

3.2.3结果及讨论

提取物组合物A、B、C对小鼠扭体试验的影响如表6所示。从表5中可以看出，提取物组合物A、B、C各组对小鼠扭体反应均有明显的抑制作用(P＜0.05-0.001)；与元胡止痛片相比，同剂量的提取物组合物A、B、C对小鼠扭体作用没有显著性差异，具有等效性。

表6提取物组合物对小鼠扭体试验的影响

**P＜0.01 *P＜0.05

3.3热板致痛试验

3.3.1材料

3.3.1.1药品

3.3.1.2动物

3.3.2实验方法

选择昆明种小鼠，体重18-22g，雌雄各半，先预测每只二次痛阀的均值。方法：将小鼠置于55℃恒温烧杯中，以出现诋后是反应作为观察指标。将痛阈值在10-30秒的小鼠40只，随机分成5组，将第2、3、4组分别灌服提取物组合物A(5g生药量/kg)、提取物组合物B(5g生药量/kg)和提取物组合物C(5g生药量/kg)；将第1组和第5组分别灌服生理盐水和元胡止痛片(5g生药量/kg)，每天1次，共5天。最后一次给药后15′、30′、1.0h、1.5h、2.0h、3.5h和7.0h测定并记录痛反应时间(大于60秒者按60秒计算)。

3.3.3结果及讨论

提取物组合物A、B、C对小鼠热板致痛试验的影响如表7所示。从表7中可以看出，A、B、C三组提取物组合物能显著提高小鼠的痛阀(P＜0.05-0.001)；与元胡止痛片相比，等剂量的提取物组合物A、B、C没有显著性差异，具有等效性。

3.4抗抑郁试验

3.4.1材料

3.4.1.1仪器

DT21TB电子体温计(上海医用仪表厂)；Agilent 1100LC型色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；DECADE II SDC型电化学检测器(荷兰ANTEC公司)；Biofuge Stratos低温高速离心机(德国)；VCX130型超声破碎仪(美国SONICS)。

3.4.1.2药品与试剂

按照上述实施例中的所述方法分别制得中药提取物组合物A、B、C的硬胶囊剂，0.3g/粒。盐酸氟西汀分散片(生产厂：PATHEONFRANCE，分包装厂：礼来苏州制药有限公司，批号J20050122)；利血平注射液(广东邦民制药厂有限公司，批号090918)；去甲肾上腺素(NE)、5-羟色胺(5-HT)、多巴胺(DA)、5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)、高香草酸(HVA)均为Sigma产品。色谱级甲醇(Fisher)，磷酸二氢钠、辛烷磺酸钠、乙二胺四乙酸、氯化钾为进口分析纯，其他试剂均为国产分析纯。

3.4.1.3动物

3.4.2实验方法

3.4.2.1小鼠强迫游泳试验

正常小鼠按照随机区组法分为空白对照组、氟西汀组(给药剂量为0.033g/kg)、中药提取物组合物A、B、C的硬胶囊剂(分为三组)，每组10只。提取物组合物各组均按5g生药量/kg体重的剂量给药，每日一次，连续给药7天，为空白对照组施用去离子水。于末次给药后1h进行实验。将单个小鼠置于高20cm、直径18cm、水深10cm、水温23±2℃的水缸中，观察时间为6分钟，最初的2分钟为小鼠对环境的适应时间，记录后4分钟内累计的不动时间(s)。

3.4.2.2小鼠利血平拮抗试验

正常小鼠按照随机区组法分为空白对照组、模型组、阳性药氟西汀组(给药剂量为0.033g/kg)、中药提取物组合物A、B、C的硬胶囊剂(分为三组)，每组10只。各组均按5g生药量/kg体重的剂量给药，每日一次，连续给药7天，空白对照组和模型组施用去离子水。于末次给药后立即腹腔注射1mg/kg的利血平，空白对照组小鼠注射等量生理盐水。120分钟后进行眼睑下垂和运动不能的观测，计算对抗百分率(眼睑下垂对抗百分率＝[1-睁眼不能动物只数/动物总数]×100％；运动不能对抗百分率＝[1-运动不能动物只数/动物总数]×100％)；180分钟后进行体温下降的观测，测量小鼠肛温24小时后迅速断头取出大脑，称重。加入组织裂解液，每10mg组织加入50μL裂解液(含0.01％的L-半胱氨酸、0.2mol/L的高氯酸、0.5mmol/L的EDTA钠，内标为0.002μg/L的DHBA)；在冰浴中超声破碎10s后，于4℃15000rpm离心30min，取上清液再以相同转速离心30min，再取上清用0.22μm滤膜过滤，取20μL采用高效液相色谱法进行小鼠脑内神经递质的测定。

色谱条件：Column C18色谱柱(4.6×150mm，5μm)；流动相为甲醇∶缓冲液＝10∶90，缓冲液为含100mmol/L磷酸二氢钠、0.75mmol/L辛烷磺酸钠，0.027mmol/L乙二胺四乙酸和8mmol/L氯化钾的水溶液；流速为1.0mL/min。

3.4.2.3统计分析

所有数据均以

表示，采用SPSS 13.0统计软件，小鼠强迫游泳试验和单胺类神经递质的含量结果采用单因素方差分析(one-wayANOVA)，利血平拮抗试验结果采用X²检验。

3.4.3结果及讨论

3.4.3.1对小鼠强迫游泳的影响

从表8中可以看出，与空白对照组相比，氟西汀组和中药提取物组合物A、B、C各组均可显著缩短小鼠强迫游泳的不动时间。

表8对小鼠强迫游泳不动时间的影响(

n＝10)

与空白对照组相比较，*P＜0.05，**P＜0.01

3.4.3.2对利血平致小鼠体温、眼睑下垂和运动不能的影响

从表9可以看出，模型组腹腔注射利血平后表现出体温下降、眼睑下垂、运动不能等体征，与正常对照组相比均有显著性差异；中药提取物组合物A、B、C的硬胶囊剂各组均能显著对抗由利血平所致的小鼠体温下降，与模型组比较具有显著性差异。

表9对利血平致小鼠体温、眼睑下垂和运动不能的影响(

n＝10)

注：与空白对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；

与模型组相比，^△P＜0.05，^△△P＜0.01

3.4.3.3对利血平致小鼠脑内单胺类神经递质及其代谢产物含量的影响

如表10所示，与空白对照组比较，模型组小鼠脑NE、5-HT、5-HIAA、DA、HVA含量明显降低；与模型组比较，提取物组合物A、B、C均可显著提高小鼠脑内NE、5-HT含量；组合物B组显著增加5-HIAA含量；组合物C组增加5-HIAA含量；组合物A组和组合物B组均可提高小鼠脑内DA含量；组合物B组可提高小鼠脑内HVA含量。

表10对利血平致小鼠脑内单胺类神经递质的影响(

n＝10)

注：与空白对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；

与模型组相比，^△P＜0.05，^△△P＜0.01

3.5长期毒性试验

本发明的发明人还对本发明的中药提取物组合物进行了长期毒性试验研究，结果表明：对9周龄大鼠连续180天灌服(试验共设四组：高、中、低(给药量分别为5.4g/kg、2.7g/kg、1.35g/kg，分别相当于临床成人日用量的120、60、30倍)三个剂量组和空白对照组，在给药90天、180天及停药30天后，分别处死大鼠，检查各组动物血液指标和血液生化学指标。对所有动物心、肝、脾、肺、肾、脑、胸腺、肾上腺等脏器进行肉眼观察，并称重计算脏器指数，同时对空白对照和高剂量组动物心、肝、脾、肺、肾、脑(大脑、小脑、脑干)、垂体、坐骨神经、脊髓(颈段、胸段、腰段)、甲状腺、胸腺、胰腺、肾上腺、唾液腺、食道、胃、十二指肠、回肠、结肠、膀胱、淋巴结、气管、主动脉进行病理形态检查。与空白对照组相比，不同给药周期的各给药组动物的上述指标均未发现明显异常，血液学和生化学指标均在正常值范围内。因此，本发明的各组提取物组合物采用口服途径给药是安全的。

Claims

1.一种中药提取物组合物，其特征在于所述组合物由分别从延胡索和白芷生药中得到的提取物组成，其中：

所述延胡索提取物经以下方法取得：

取延胡索药材粉末，用质量浓度为2-4倍量的40％-80％的乙醇/水浸泡，加热回流2-4小时，收集提取液，再加入质量浓度为1-3倍量的40％-80％的乙醇/水加热回流1-3小时，收集提取液，合并二次提取液，过滤，滤液浓缩至无醇味；选用离子交换树脂色谱法纯化，回收溶剂，真空干燥，得浸膏，粉碎，过筛，得延胡索提取物；

所述白芷提取物经以下方法取得：

取白芷药材粉末，用质量浓度为4-6倍量的50％-90％的乙醇/水浸泡，加热回流2-4小时，收集提取液，再加入质量浓度为4-6倍量的50％-90％的乙醇/水加热回流1-3小时，收集提取液，合并二次提取液，过滤，滤液浓缩至无醇味；选用大孔树脂色谱法纯化，用稀盐酸调节pH值，回收溶剂，真空干燥，得黄棕色粉末，无水乙醇洗涤，回收乙醇，真空干燥，得浸膏，粉碎，过筛，得白芷提取物；

并且所述组合物中延胡索提取物和白芷提取物的重量份数比为1-100∶1-50。

2.根据权利要求1所述的中药提取物组合物，其特征在于所述组合物中延胡索提取物和白芷提取物的重量份数比为10-100∶5-50。

3.根据权利要求1至2任一项所述的中药提取物组合物，其特征在于所述组合物中延胡索提取物和白芷提取物的重量份数比为20-100∶10-50。

4.根据权利要求1至3任一项所述的中药提取物组合物，其特征在于所述组合物还可包含任一药学上可接受的载体，其包括稀释剂、赋形剂、填充剂、润湿剂、崩解剂、矫味剂和粘合剂等。

5.一种制备根据权利要求1所述的中药提取物组合物的方法，其特征在于首先按照权利要求1中的方法分别从延胡索和白芷生药中取得相应的提取物；其次将两种中药提取物按照具体的重量份数比混合，最后加入适量的载体后混匀以制备任一药学上可接受的剂型，如注射剂、输液剂、合剂、片剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、丸剂、滴丸剂、颗粒剂、贴剂和巴布剂等，优选为硬胶囊剂。

6.根据权利要求1所述的中药提取物组合物在制备治疗和/或预防由气滞血瘀所致的疼痛的药物中的用途，其中所述疼痛包括胃痛、胁痛、头痛以及痛经等。

7.根据权利要求1所述的中药提取物组合物在制备治疗和/或预防抑郁症的药物中的用途。