CN110025664B - 用于防治脑梗死和/或血管性痴呆的药物组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于防治脑梗死和/或血管性痴呆的药物组合物及其应用，药物组合物是由葛根总黄酮提取物、丹参总酚酸提取物和总丹参酮提取物组成，该药物组合物中有效成分的比例如下：以葛根素计的葛根总黄酮提取物、以丹酚酸B计的丹参总酚酸提取物和以丹参酮计的总丹参酮提取物的重量比为10:(2‑50):(0.2‑5)，该药物组合物可应用于防治脑梗死和/或血管性痴呆的药物中，可以取得显著的疗效。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有防治脑梗死和/或血管性痴呆作用的药物组合物及相应药物的应用，特别是由植物提取物成分为有效成分的相应组合物的新应用。
背景技术
脑梗死(cerebral infarction，CI)是缺血性卒中(ischemic stroke)的总称，包括脑血栓形成、腔隙性梗死和脑栓塞等，约占全部脑卒中的70％，是脑血液供应障碍引起脑部病变。脑梗死是由于脑组织局部供血动脉血流的突然减少或停止，造成该血管供血区的脑组织缺血、缺氧导致脑组织坏死、软化，并伴有相应部位的临床症状和体征，如偏瘫、失语等神经功能缺失的症候。本病属于祖国医学“中风病”的范畴，以本虚标实为主，瘀血阻络是脑梗死的基本病机，活血化瘀是其基本治疗法则。中医药治疗脑梗死有几千年的历史，从单纯地追求临床疗效逐步深入到机制研究，已证实中药具有多靶点、多途径的作用特点和优势，符合脑梗死病理生理复杂的发展过程。
脑梗死是导致中老年人残疾甚至死亡的主要疾病之一，不仅可以引起肢体偏瘫、麻木、言语不利等症状，还可引起记忆力下降、失语、失认等不同程度的认知功能障碍，甚至发生痴呆。脑梗死后认知功能障碍是脑梗死最常见的并发症，可能由血管原因、神经变性或其他混杂因素引起，25％-83％的脑梗死患者会立即或延迟出现认知功能障碍，影响神经功能、日常生活能力及社会适应能力的恢复。有文献报道即使只出现轻度认知功能障碍，也会增加脑梗死患者的死亡率。血管性痴呆(vascular dementia，VD)是脑梗死患者的常见并发症，对患者生活质量及生命健康造成了严重影响。临床医学认为，血管性痴呆是因脑梗死导致的认知功能、记忆功能障碍疾病，是脑梗死多发并发症类型，随着脑梗死患者不断增多，脑梗死后血管性痴呆发病率随之持续增长，其发病率在老年痴呆总发病率中居于第2位。据2012年世界卫生组织评估，现今全球已有约3560万人患有痴呆症，而2050年全球痴呆症患者将达到1.15亿人本病已成为世界重大的公共卫生问题，现代医学对VD尚无确切有效的治疗药物或特异性方法，中医药以整体观与辨证论治为指导思想，在治疗VD方面具有自身的特色和优势。中国传统医家已经认识到痴呆与瘀血息息相关。现代研究也证实了瘀阻脑络证是VD的常见证候，一项研究报道约50％的VD患者辩证为瘀阻脑络证(田金洲等，老年期痴呆的中医药研究思路，中国医药学报，2000，15(5)：52-54)，另一项研究则报道瘀阻脑络证是血管性痴呆最常见的中医证型(时晶等，血管性认识损害的中医证候特征，中医杂志，2012，53(5)：503-506)。然而目前VD的中药治疗研究多关注于补肾法，对活血化瘀法治疗VD的临床研究相对较少，中医理论认为，邪实是导致VD进展的关键因素，因此，活血化瘀在治疗VD上有很大潜力。
葛根、丹参为常用的活血化瘀中药。文献报道葛根素注射液、丹参注射液、丹参酮IIA磺酸钠注射液用于治疗脑梗死有一定的疗效。由于丹参酮难溶于水，丹参水煎液(临床汤剂)、丹参注射液中主要有效成分为水溶性丹参酚酸，不含或仅含少量的丹参酮类成分。申请人CN101953887B的中国专利公开了一种防治糖尿病并发症，以丹参总酚酸、总丹参酮和葛根总黄酮为有效成分的组合物。
发明内容
本发明提供了以丹参总酚酸、总丹参酮和葛根总黄酮为有效成分制成的药物组合物的新应用，该药物组合物可以应用于防治脑梗死和/或血管性痴呆。
药物组合物是由葛根总黄酮提取物、丹参总酚酸提取物和总丹参酮提取物组成，当其应用于防治脑梗死和/或血管性痴呆的药物中时，该药物组合物中有效成分的比例如下：以葛根素计的葛根总黄酮提取物、以丹酚酸B计的丹参总酚酸提取物和以丹参酮计的总丹参酮提取物的重量比为10:(2-50):(0.2-5)。
一种具体的应用方案是，防治脑梗死和/或血管性痴呆的药物组合物由葛根总黄酮提取物、丹参总酚酸提取物和总丹参酮提取物组成，以葛根素计的葛根总黄酮提取物、以丹酚酸B计的丹参总酚酸提取物和以丹参酮计的总丹参酮提取物的重量比为10:(5-20):(0.5-2)。
另一种具体的应用方案是，防治脑梗死和/或血管性痴呆的药物组合物由葛根总黄酮提取物、丹参总酚酸提取物和总丹参酮提取物组成，以葛根素计的葛根总黄酮提取物、以丹酚酸B计的丹参总酚酸提取物和以丹参酮计的总丹参酮提取物的重量比为10:(2-20):(0.2-2)。
另一种具体的应用方案是，防治脑梗死和/或血管性痴呆的药物组合物由葛根总黄酮提取物、丹参总酚酸提取物和总丹参酮提取物组成，以葛根素计的葛根总黄酮提取物、以丹酚酸B计的丹参总酚酸提取物和以丹参酮计的总丹参酮提取物的重量比为10:(21-50):(2.1-5)。
在上述方案的药物组合物比例范围内，至少当所述的以葛根素计的葛根总黄酮提取物、以丹酚酸B计的丹参总酚酸提取物和以丹参酮计的总丹参酮提取物的重量比为10:10:1时，可以取得非常显著的防治脑梗死和/或血管性痴呆的效果。
为尽量减少和避免在所述各提取物中存在过多种类和/或比例量的其它成分可能产生或带来的不利影响，上述的各个方案中组合物中所述相应提取物的更好形式是，所述的葛根总黄酮提取物中的葛根素重量含量≥20％，和/或所述的丹参总酚酸提取物中的丹酚酸B重量含量≥50％，和/或所述的总丹参酮提取物中的丹参酮重量含量≥20％。可以理解为，实施本发明的技术方案时，药物组合物至少满足“葛根总黄酮提取物中的葛根素重量含量≥20％、丹参总酚酸提取物中的丹酚酸B重量含量≥50％、总丹参酮提取物中的丹参酮重量含量≥20％”三个条件中的任意一个，更好的是药物组合物同时满足这三个条件，以使上述组合物的质量及其效果能有更可靠的保证和提高。
CN104189073A公开了丹参总酚酸提取物的制备方法，该方法还可以同时获得总丹参酮提取物。在上述形式的组合物中，所述的丹参总酚酸提取物和/或总丹参酮提取物，除可以采用目前已有报道和/或使用的各种方法得到外，优选采用的是本申请人在中国专利CN104189073A中报道的方法制备得到的丹参总酚酸提取物和/或总丹参酮提取物。即，将粉碎后的丹参在温度≥20℃的条件下，用体积含量80±5％乙醇渗漉提取，收集的渗漉液除去乙醇后调pH值≤4，沉淀并固液分离，得到总丹参酮提取物(沉淀)；固液分离后的水溶液用大孔树脂吸附后，先用pH值≤7的水洗脱除杂，再用体积含量为40％-80％的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液并除去溶剂，得到丹参总酚酸提取物。
对于上述形式的组合物中所述的葛根总黄酮提取物，可以采用目前常规的大孔吸附树脂分离纯化方法制备得到，即葛根用水或乙醇体积含量≤80％的乙醇水溶液提取，水提取液或由乙醇水溶液提取液除去乙醇后的水溶液，经大孔树脂吸附后用水洗涤除杂，再用50％-80％乙醇(v/v)洗脱，洗脱液浓缩干燥，得到葛根总黄酮提取物；其中，所述的大孔树脂为HPD-100、HPD-300或D101。
上述方法中所述对葛根的水或水-醇溶液提取，包括目前已有报道和/或使用的渗漉法、回流法、超声法、搅拌温浸等常规方法。
在上述组合物的基础上，以上述的组合物为有效成分，与药物中可以接受的辅助和/或添加成分，按照目前常规的工艺和方法，可以制备成具有相应防治脑梗死和/或血管性痴呆的药物。例如，作为一种优选的形式，是以上述的组合物为有效成分，与在口服制剂中可以被接受的崩解剂、赋形剂、润滑剂、粘合剂、填充剂等常用的辅助/添加成份混合后，按相应的现有常规工艺和方法处理，即可制成为相应的片剂、丸剂、胶囊剂，或适当形式的缓释剂、控释剂等口服型制剂的药物。
众所周知，中药药效作用的发挥，具有多成分、多靶点、多途径的协同整合作用。现有研究表明，葛根总黄酮提取物中除葛根素外，还含有3′-羟基葛根素、3-甲氧基葛根素、大豆苷、大豆苷元等黄酮成分，这些成分除能产生与葛根素相似的作用外，也还具有其自身独有的特点；总丹参酮提取物中除丹参酮IIA外，还含有隐丹参酮、丹参酮I等同类成分，除也具有丹参酮IIA相似的功效外，还具有其自身的一些特点；同样，丹参总酚酸提取物中除丹酚酸B外，还含有丹酚酸A、丹酚酸C、迷迭香酸、紫草酸等，除可具有与丹酚酸B相似的作用外，也还具有其自身独特的特点。
通过对葛根、丹参的有效成分的进一步研究意外发现，丹参总酚酸配伍葛根总黄酮能明显增强葛根总黄酮抗脑梗死和血管性痴呆的作用，更进一步地加入总丹参酮，不仅有利于提高抗脑梗死和血管性痴呆的药效，也有利于综合利用中药材的有效成分。
深入研究及实验结果表明，这些成分的组合，除可分别对目前已知的葛根素、丹参酚酸B、丹参酮IIA的作用有所加强外，还可以在其各自的防治脑梗死和/或血管性痴呆综合作用上，特别是在各提取物组合后的综合作用方面，起到显著的相互协同增效及互补的作用，而且不仅能使组合后的药效作用明显优于相应比例量的由单一葛根素、丹参酚酸B和/或丹参酮IIA组成的药物组合物，同时还避免了为获得单一成分的葛根素、丹参酚酸B和/或丹参酮IIA成分，而使包括3′-羟基葛根素、3-甲氧基葛根素、大豆苷、大豆苷元、丹酚酸A、丹酚酸C、迷迭香酸、紫草酸、隐丹参酮、丹参酮I等其它更多有益有效成分的丢失和浪费，使中药材资源得到更充分和更好的利用，并显著降低了生产成本和价格，惠及民生。因此在药物经济学和药效作用方面都更具有显著的优越性。
本发明发现了将葛根总黄酮提取物、丹参总酚酸提取物和总丹参酮提取物为有效成分用于防治脑梗死和/或血管性痴呆的药物中，具有显著的防治作用，提高了葛根、丹参的药用价值，并综合利用了中药材的有效成分。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
丹参粉末(粉碎过10目筛)，在温度约30℃条件下，按渗漉法常规操作，用含醇量80％(v/v)的乙醇水溶液(以下均同此)渗漉提取，以约3mL/min·kg的速度渗漉，收集8倍量的渗漉液，减压回收除尽乙醇，加水稀释至约0.5g/mL(以生药计，以下同)，调节pH值3(优选用盐酸)，静置沉淀，过滤或离心，得到总丹参酮提取物；过滤或离心后的水溶液上HPD-100大孔吸附树脂柱，先用2倍柱床体积的水洗涤除杂，再用50％乙醇洗脱，收集3倍柱床体积的乙醇洗脱液，回收除去溶剂，得到丹参总酚酸提取物。
葛根粉碎，加水回流提取2次，第一次加水13倍，第二次加水10倍，每次1小时，过滤，合并滤液，通过HPD-100大孔吸附树脂柱，先用2倍柱床体积的水洗，弃去水液，再用50％乙醇洗脱，收集2.5倍柱床体积的乙醇洗脱液，回收除去溶剂，得到葛根总黄酮提取物。
上述各提取物中相应有效成分的含量分别见表1-表3(以下均同此)。
分别取上述葛根总黄酮提取物100g(以葛根素计)、丹参总酚酸提取物100g(以丹酚酸B计)和总丹参酮提取物10g(以丹参酮计)，加辅料淀粉1000g，混合均匀，制粒，压制5000片，即得本发明所述的片剂。
实施例2
丹参粉末(粉碎过20目筛)，在温度20-25℃条件下，按渗漉法常规操作，用75％(v/v)乙醇渗漉提取，以2-3mL/min·kg的速度渗漉，收集8-10倍量的渗漉液，减压回收除尽乙醇，加水稀释至约0.2g/mL(以生药计)，用盐酸调节pH值4，静置沉淀，过滤或离心，得到总丹参酮提取物；过滤或离心后的水溶液上D101大孔吸附树脂柱，先用3倍柱床体积、pH值4的酸水洗涤后，再用4倍柱床体积的40％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收除去溶剂，得到丹参总酚酸提取物。
葛根粉碎，加水回流提取3次，第一次加水10倍，第二次和第三次各加水8倍，每次1小时，过滤，合并滤液，通过D101大孔吸附树脂柱，先用3倍柱床体积的水洗，弃去水液，再用70％乙醇洗脱，收集2倍柱床体积的乙醇洗脱液，回收除去溶剂，得到葛根总黄酮提取物。
分别取上述葛根总黄酮提取物100g(以葛根素计)、丹参总酚酸提取物500g(以丹酚酸B计)和总丹参酮提取物50g(以丹参酮计)，加入到PEG-6000熔融液中，充分搅拌均匀，在滴丸机中制成10000粒滴丸，即得本发明所述的滴丸剂型药物。
实施例3
丹参粉末(粉碎过40目筛)，在温度25-30℃条件下，按渗漉法常规操作，用85％乙醇渗漉提取，以3-4mL/min·kg的速度渗漉，收集10-12倍量的渗漉液，减压回收除尽乙醇，加水稀释至约1g/mL生药，用盐酸调节pH值2，静置沉淀，过滤或离心，得到总丹参酮提取物；过滤或离心后的水溶液上HPD-300大孔吸附树脂柱，先用3倍柱床体积的水洗涤后，再用3倍柱床体积的80％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收除去溶剂，得到丹参总酚酸提取物。
葛根粉碎，加水回流提取3次，第一次加水12倍，第二次和第三次各加水10倍，每次0.5小时，过滤，合并滤液，通过HPD-300大孔吸附树脂柱，先用2.5倍柱床体积的水洗，弃去水液，再用60％乙醇洗脱，收集2.5倍柱床体积的乙醇洗脱液，回收除去溶剂，得到葛根总黄酮提取物。
分别取上述葛根总黄酮提取物100g(以葛根素计)、丹参总酚酸提取物20g(以丹酚酸B计)和总丹参酮提取物2g(以丹参酮计)，加辅料适量，干压制粒，装制胶囊5000粒，即得本发明所述的胶囊剂。
实施例4
葛根粉碎，用50％乙醇水溶液回流提取2次，第一次加12倍，第二次加10倍，每次2小时，滤过，合并滤液，回收除去乙醇，水溶液上HPD-100大孔树脂柱，用2.5倍柱床体积水洗涤除杂，再用3倍50％乙醇洗脱，乙醇洗脱液或回收除尽乙醇后的水溶液，经聚醚砜超滤膜分离除杂，回收除去溶剂，得到葛根总黄酮提取物。
取上述葛根总黄酮提取物100g(以葛根素计)和实施例1的丹参总酚酸提取物50g(以丹酚酸B计)和总丹参酮提取物5g(以丹参酮计)，加辅料淀粉1000g，混合均匀，制粒，压制5000片，即得本发明所述的片剂。
实施例5
分别取实施例1的葛根总黄酮提取物100g(以葛根素计)、丹参总酚酸提取物200g(以丹酚酸B计)和总丹参酮提取物2g(以丹参酮计)，加辅料适量，干压制粒，装制胶囊5000粒，即得本发明所述的胶囊剂。
实施例6
分别取实施例3的葛根总黄酮提取物100g(以葛根素计)、丹参总酚酸提取物20g(以丹酚酸B计)和总丹参酮提取物50g(以丹参酮计)，加辅料适量，干压制粒，装制胶囊5000粒，即得本发明所述的胶囊剂。
以下通过具体的药学研究和药效学实验结果证明本发明的有益效果。
一、药学实验研究
实验1不同提取方法对提取物收率和含量的影响
丹参、葛根分别粉碎，各称取200g，按下述方法制备。
1、丹参分别加水回流提取2次，第一次加水13倍，第二次加水10倍，每次1小时，滤过，滤液合并，减压回收、浓缩，干燥，得到丹参提取物(A)。
2、葛根分别加水回流提取2次，第一次加水13倍，第二次加水10倍，每次1小时，滤过，滤液合并，减压回收、浓缩，干燥，得到葛根提取物(B)。
3、丹参和葛根(1：1)分别加水回流提取2次，第一次加水13倍，第二次加水10倍，每次1小时，滤过，滤液合并，减压回收、浓缩，干燥，得到丹参葛根提取物(C)。
上述各提取物(A、B、C)和上述实施例中的葛根总黄酮提取物、丹参总酚酸提取物、总丹参酮提取物，按下述方法进行含量测定。
葛根素：按2015版中国药典一部葛根项下的方法(P.333页)测定。
丹酚酸B、丹参酮ⅡA、丹参酮：按2015版中国药典一部丹参项下的方法(P.76页)测定，其中，丹参酮含量包括丹参酮IIA、隐丹参酮和丹参酮I。
表1丹参总酚酸提取物收率和含量
| 丹参总酚酸提取物 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 丹参提取物A | 丹参葛根提取物C |
| 收率(％) | 6.7 | 6.3 | 6.4 | 33.1 | 29.8 |
| 丹酚酸B含量(％) | 53.7 | 56.8 | 54.9 | 7.2 | 4.1 |
表2总丹参酮提取物收率和含量
| 总丹参酮提取物 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 丹参提取物A | 丹参葛根提取物C |
| 收率(％) | 1.4 | 1.5 | 1.3 | 33.1 | 29.8 |
| 丹参酮含量(％) | 22.3 | 21.8 | 23.6 | — | — |
| 丹参酮ⅡA含量(％) | 12.2 | 11.5 | 13.0 | — | — |
注：“—”示未检出(低于检测限)
表3葛根黄酮提取物收率和含量
由表1-3可以看出，实施例1至4，葛根总黄酮中的葛根素含量大于20％，丹参总酚酸提取物中的丹酚酸B含量大于50％，总丹参酮提取物中的丹参酮含量大于20％。丹参水煎提取物(A)和丹参葛根水煎提取物(C)均不含丹参酮，且水煎提取物中丹酚酸B或葛根素含量低。
二、药效学实验研究
以实施例1所述的葛根总黄酮提取物、丹参总酚酸提取物和总丹参酮提取物为有效成分制成的本发明药物组合物作为试验药物进行的下述药效实验，可以表明本发明药物组合物所具有的有益效果。
实验2对内皮细胞和神经元缺氧再给氧的保护作用
1、实验方法：参见鄂征主编的《组织培养和分子生物细胞学技术》，北京：北京出版社，1994年12月，438页。
(1)MTT法测定内皮细胞存活率
致密单层细胞经药物作用后，用冰冷的PBS溶液洗涤2次，加入0.5mg/ml MTT溶液100μl，37℃掺入4小时，吸去残留液体，加入酸化异丙醇显色溶液100μl，30分钟内在波长595nm处用酶标仪测吸光度A值。观察试验药物对培养细胞生存的影响。
(2)MTT法测定神经元存活率
细胞培养10天后，向每孔加入0.5％的MTT 10μl继续培养4小时，吸弃培养液，加入二甲亚砜(DMSO)200μl/孔，待颗粒溶解后置于酶标仪上，在波长570nm处检测各孔的吸光度A值。观察试验药物对培养神经元生存的影响。
(3)培养细胞缺氧/再给细氧模型
正常培养基用95％N2和5％CO2混合气体平衡30分钟后，获得缺氧培养基。细胞用缺氧培养基悬浮后置培养板，放入缺氧仓内(持续通入95％N2和5％CO2混合气体为此缺氧环境)，37℃孵育2小时(缺氧时间)后，立即更换正常的培养基，再孵育4小时(再给氧)。以未经处理细胞作为对照。
(4)药物给予方法
试验药物用培养基配制成6ug/ml的浓度。其中，Ⅰ～Ⅶ组，分别为以实施例1方法制备的葛根总黄酮提取物、丹参总酚酸提取物、总丹参酮提取物(分别以葛根素、丹酚酸B、丹参酮计)的不同比例形式的组合物/药物；Ⅷ组为与Ⅰ组中相应量的由单一成分的葛根素A：丹酚酸B：丹参酮IIA(质量比＝10:10:1)的组合物；Ⅸ～Ⅺ组分别为与实施例1中对应的单一组分的葛根总黄酮提取物(以葛根素计)、丹参总酚酸提取物(以丹酚酸B计)、总丹参酮提取物(以丹参酮计)；Ⅻ组为专利文献CN201110009037.7中丹酚酸B：丹参酮IIA：阿魏酸：藁本内酯：葛根素(质量比＝6：0.4：0.2：1：5)的组合物。缺氧期间药物用缺氧培养基配制，再给氧期间药物用普通培养基配制。
2、实验结果
(1)对内皮细胞缺氧2小时再给氧4小时损伤的保护作用
新生牛脑微血管内皮细胞经缺氧2小时再给氧4小时后，产生明显的死亡现象，MTT检测表明，缺氧再给氧(H/R)组细胞吸光度明显减小，经本发明试验药物保护的细胞均呈现出非常明显的保护作用(Ⅰ～Ⅴ)，与对照组比较P<0.01，如表4所示。此外，由表4还可以清楚地看出：
1)本发明药物组合物葛根总黄酮提取物：丹参总酚酸提取物：总丹参酮提取物按重量配比10:10:1比例配伍(分别以葛根素、丹酚酸B、丹参酮计)，对内皮细胞缺氧再给氧(H/R)的保护作用最佳(Ⅰ)；
2)缺失丹参总酚酸提取物的组合物10:0:1(Ⅵ)、缺失总丹参酮提取物的组合物10:10:0(Ⅶ)，或仅以Ⅰ组中相应量的葛根素：丹酚酸B：丹参酮IIA(10:10:1)的单一成分组合物(Ⅷ)，以及专利文献CN201110009037.7中丹酚酸B：丹参酮IIA：阿魏酸：藁本内酯：葛根素(6：0.4：0.2：1：5)的组合物(Ⅻ)，与Ⅰ组比较P<0.05。
(2)对培养神经元缺氧2小时再给氧4小时损伤的保护作用
新生大鼠脑神经元经缺氧2小时再给氧4小时后，产生明显的死亡现象，MTT检测表明，缺氧再给氧(H/R)组细胞吸光度明显减小，经本发明试验药物保护的细胞均呈现出非常明显的保护作用(Ⅰ～Ⅴ)，与对照组比较P<0.01，如表5所示。此外，由表5还可以清楚地看出：
1)本发明药物组合物葛根总黄酮提取物：丹参总酚酸提取物：总丹参酮提取物按重量配比10:10:1比例配伍(分别以葛根素、丹酚酸B、丹参酮计)，对神经元缺氧再给氧(H/R)的保护作用最佳(Ⅰ)；
2)缺失丹参总酚酸提取物的组合物10:0:1(Ⅵ)、缺失总丹参酮提取物的组合物10:10:0(Ⅶ)，或仅以Ⅰ组中相应量的葛根素：丹酚酸B：丹参酮IIA(10:10:1)的单一成分组合物(Ⅷ)，以及专利文献CN201110009037.7中丹酚酸B：丹参酮IIA：阿魏酸：藁本内酯：葛根素(6：0.4：0.2：1：5)的组合物(Ⅻ)，无明显的保护作用(P＞0.05)。
表4本发明药物组合物对内皮细胞缺氧再给氧(H/R)的保护作用
注：x±s，n＝6，与对照组比较：**P<0.01，*P<0.05；与Ⅰ组比较：#P<0.05。
表5本发明药物组合物对神经元缺氧再给氧(H/R)的保护作用
注：x±s，n＝6，与对照组比较：**P<0.01，*P<0.05。
实验3对栓线法大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型的治疗作用
1、试验动物：SD大鼠150只，随机分为10组。
2、试验方法：参见徐江平等《中国中西医结合急救杂志》，2003；10(1)：31。
按组分别灌胃给予受试药物或溶剂对照，连续给予7天，末次给药后2小时按下述方法进行手术。
将大鼠用10％水合氯醛3ml/kg腹腔注射麻醉，颈正中切口，分离并结扎右侧颈总动脉近心端、颈外动脉及其分支动脉。分离右侧颈内动脉，沿颈内动脉向下分离翼颚动脉，根部结扎该分枝。在颈内动脉近端备线、远端放置动脉夹，颈总动脉分叉处切口，插入4－0尼龙线，其深度为17～20mm，栓线进入颈内动脉，入颅至大脑前动脉，阻断大脑中动脉所有血流来源。撤掉动脉夹，扎紧备线，外留1cm长线头，缝合皮肤。缺血2小时后再灌注，勿需再次麻醉和切开皮肤，轻轻提拉所留线头至有阻力时提示尼龙线头端已至颈总动脉切口处，使血流再通。假手术组除不插线外，其余步骤同上。
存活鼠再灌注24h后，观察大鼠行为变化，进行行为评分。参考Zea Longa的五分制评分标准：0分，正常，无神经损伤症状；1分，不能完全伸展对侧前爪；2分，向外侧转圈；3分，向对侧倾倒；4分，不能自发行走，意识丧失。然后快速断头取实验鼠大脑，一部分分别称量左、右大脑半球湿重，置160℃烤箱内24小时后称干重，按以下公式计算脑组织含水量：脑组织含水量(％)＝(湿重－干重)/湿重×100％；另一部分在前连合平面切下厚约2mm冠状脑片，立刻置于2％TTC溶液中，37℃孵育30分钟。梗塞区呈现白色，非梗塞区呈现红色。数码相机拍摄记录，用Medbrain 2.0软件测出脑片总体积及梗塞区体积，并计算梗塞区占整个脑组织的百分比(％)；另一部分作组织形态学观察：脑组织经固定后，冠状切取大脑，常规脱水，石蜡包埋制片，HE染色，光镜检验。
3、试验药物及剂量设置：
试验药物Ⅰ：葛根总黄酮提取物：丹参总酚酸提取物：总丹参酮提取物(10：10：1)，大鼠给药剂量为70mg/kg(以葛根素、丹酚酸B、丹参酮计)。
试验药物Ⅱ：葛根总黄酮提取物：丹参总酚酸提取物：总丹参酮提取物(10：50：5)，大鼠给药剂量为70mg/kg(以葛根素、丹酚酸B、丹参酮计)。
试验药物Ⅲ：葛根总黄酮提取物：丹参总酚酸提取物：总丹参酮提取物(10：2：0.2)，大鼠给药剂量为70mg/kg(以葛根素、丹酚酸B、丹参酮计)。
试验药物Ⅳ：葛根总黄酮提取物：丹参总酚酸提取物：总丹参酮提取物(10：10：0)，大鼠给药剂量为70mg/kg(以葛根素、丹酚酸B计)。
试验药物V：葛根总黄酮提取物：丹参总酚酸提取物：总丹参酮提取物(10：0：1)，大鼠给药剂量为70mg/kg(以葛根素、丹参酮计)。
试验药物Ⅵ：葛根总黄酮提取物：丹参总酚酸提取物：总丹参酮提取物(0：10：1)，大鼠给药剂量为70mg/kg(以丹酚酸B、丹参酮计)。
试验药物Ⅶ：葛根素：丹酚酸B：丹参酮IIA(10：10：1)，大鼠给药剂量为70mg/kg(相当于试验药物Ⅰ中相应量的葛根素+丹酚酸B+丹参酮IIA单一成分纯品组合物)。
4、药物配制：用4％Tween-80混匀，再用纯净水配制成所需浓度，按1ml/100g灌胃给药(例如给药剂量为70mg/kg，按1ml/100g灌胃给药，药物用4％Tween-80混匀后，再用纯净水配制成7mg/ml的浓度，200g体重大鼠则灌胃2ml)。
5、溶剂对照：4％Tween 80的纯净水按1ml/100g灌胃。
6、给药途径：灌胃给药。
7、给药次数：均连续给药7日，每日1次。
8、观察指标及观察时间：观察大鼠行为、脑梗塞体积、组织形态学的变化。观察时间为再灌注24小时。
9、试验结果：见表6。
(1)对行为的影响：假手术组大鼠均无异常行为，神经行为评分为0；溶剂对照组大鼠出现不能完全伸展、对侧前爪向外侧转圈或向对侧倾倒的神经损伤症状，行为评分为1.70±0.76；试验药物Ⅰ～Ⅲ组均可显著降低大鼠神经行为评分，同溶剂对照组比较有非常显著差异(P<0.05，P<0.01)；而试验药物Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ组无明显差异(P＞0.05)。
表6对大鼠缺血2小时再灌注24小时的神经病学评分、大脑半球含水量及脑梗塞体积的影响
注：与假手术组比较，##P<0.01；与溶剂对照组比较，*P<0.05,**P<0.01。与Ⅰ组比较：#P<0.05。
(2)对脑组织含水量的影响：溶剂对照组缺血-再灌注一侧(大脑右半球)脑组织含水量非常显著高于假手组。试验药物Ⅰ～Ⅲ组脑组织含水量均显著低于溶剂对照组(P<0.05，P<0.01)；而试验药物Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ组无明显差异(P＞0.05)。
(3)对脑梗塞体积的影响：假手术组脑组织无梗塞，溶剂对照组缺血侧脑组织有梗塞现象，梗塞区占全脑组织的百分比为28.7±7.1％。试验药物Ⅰ～Ⅶ组均可显著缩小缺血侧脑组织梗塞体积，与溶剂对照组相比有非常显著差异(P<0.05，P<0.01)；同时试验药物Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ组与Ⅰ组比较有明显差异(P<0.05)。
(4)对组织形态学的影响：假手术组两侧脑组织正常，溶剂对照组、试验药物Ⅰ～Ⅶ组非缺血侧脑组织均正常。对于缺血侧脑半球：溶剂对照组出现脑组织出血坏死及脑组织严重水肿、灶性坏死，试验药物Ⅰ～Ⅶ组均可缩小出血坏死灶；且试验药物Ⅰ～Ⅲ组的出血坏死灶明显小于Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ组。
上述对比实验结果充分表明，以本发明所述的组合物作为有效药用成分的相应药物，可明显缩小脑缺血再灌注损伤引起的脑组织出血坏死灶、减轻神经细胞和神经纤维的损伤。
实验4对血管性痴呆小鼠认知功能障碍的改善作用
1、试验药物及剂量设置
试验药物Ⅰ：葛根总黄酮提取物：丹参总酚酸提取物：总丹参酮提取物(10：10：1)，小鼠给药剂量为90mg/kg(以葛根素、丹酚酸B、丹参酮计)。
试验药物Ⅱ：葛根总黄酮提取物：丹参总酚酸提取物：总丹参酮提取物(10：50：5)，小鼠给药剂量为90mg/kg(以葛根素、丹酚酸B、丹参酮计)。
试验药物Ⅲ：葛根总黄酮提取物：丹参总酚酸提取物：总丹参酮提取物(10：2：0.2)，小鼠给药剂量为90mg/kg(以葛根素、丹酚酸B、丹参酮计)。
试验药物Ⅳ：葛根总黄酮提取物：丹参总酚酸提取物：总丹参酮提取物(10：10：0)，小鼠给药剂量为90mg/kg(以葛根素、丹酚酸B计)。
试验药物V：葛根总黄酮提取物：丹参总酚酸提取物：总丹参酮提取物(10：0：1)，小鼠给药剂量为90mg/kg(以葛根素、丹参酮计)。
试验药物Ⅵ：葛根总黄酮提取物：丹参总酚酸提取物：总丹参酮提取物(0：10：1)，小鼠给药剂量为90mg/kg(以丹酚酸B、丹参酮计)。
试验药物Ⅶ：葛根素：丹酚酸B：丹参酮IIA(10：10：1)，小鼠给药剂量为90mg/kg(相当于试验药物Ⅰ中相应量的葛根素+丹酚酸B+丹参酮IIA单一成分纯品组合物)。
药物配制：用4％Tween-80混匀，再用纯净水配制成所需浓度，按1ml/100g灌胃给药。
溶剂对照：4％Tween 80的纯净水按1ml/100g灌胃。
2、试验动物：健康雄性C57BL6/G小鼠，体重在(25±2)g，小鼠随机分为假手术(Sham)组、VD模型组，药物治疗组，每组12只。
3、试验方法：参见祁敏芳等《遵义医学院学报》，2012；35(5)：371。
3.1血管性痴呆小鼠模型建立
小鼠术前禁食8h，禁水4h。10％水合氯醛(0.35mL/100g)腹腔注射将小鼠麻醉，在小鼠颈部做正中切口，沿两侧胸锁乳突肌内侧缘钝性分离出左右两侧颈总动脉(CCA)，0号线挂过，用动脉夹夹闭双侧颈总动脉造成脑组织缺血，夹闭10min，再灌注20min，反复3次，之后碘伏消毒并逐层缝合切口，术后用80万U青霉素抗感染治疗3d。sham组只进行双侧颈总动脉的分离，不进行缺血再灌注的夹闭。术前3d、术后28d分别给予药物组小鼠试验药物，每日1次。疗程为28d，Sham组和VD模型组小鼠按等容量给予溶剂对照，次数及疗程同药物组。
3.2小鼠空间学习与记忆能力的测定
Morris水迷宫是一个直径约为100cm的圆形水池，水深约33cm，水温保持在(23±1)℃，平台高度约30cm，平台顶端的平面6cm×6cm，将平台没于水下3～4cm，在实验过程中，水池周围的参照物保持不变，水池分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4个象限，分别设有4个放小鼠入水的起点，各组小鼠在术前与术后28d进行Morris水迷宫实验，实验分为前5d的定位航行实验与第6d的空间探索实验。
3.2.1定位航行实验 历时5d，实验前1d先将每只小鼠放入水中进行适应性训练，再将小鼠放在平台上停留20s，使其对平台产生记忆，实验总时间为120s，实验过程中有图像自动监视系统追踪小鼠的游泳轨迹，并记录小鼠跳上平台的时间。每只小鼠每天分别从4个不同象限放入水中，每个象限各放入一次，取平均值作为每天逃避潜伏期。实验中，小鼠在120s内跳上平台并停留3s后，作为一次记录，若未在120s内跳上平台的小鼠将采用人为引导的方式将其放在平台上并停留3s，记录时间为120s，每组小鼠在经历一个象限的实验后休息20min，再进入下一个象限的实验。
3.2.2空间探索实验 在实验进行的第6d，撤去水池中的平台，在同一入水点将小鼠面朝池壁放入水中，Morris水迷宫系统自动记录其在120s内跨过原平台相应位置的次数。
4、结果(提高VD小鼠的学习记忆能力)
4.1定位航行实验 历时5d，随着训练次数的增多，各组小鼠逃避潜伏期都有不同程度的缩短，在术后28d，VD模型组小鼠的逃避潜伏期明显比Sham组时间长(P<0.01)；试验药物Ⅰ～Ⅶ组小鼠逃避潜伏期均明显比VD模型组时间短(P<0.05，P<0.01)，同时试验药物Ⅳ～Ⅶ组与Ⅰ组比较有明显差异(P<0.05)(见表7)。
表7各组小鼠定位航行实验逃避潜伏期比较(n＝6，
)
注：与Sham组比较，##P<0.01；与VD组比较，*P<0.05，**P<0.01。与Ⅰ组比较：
P<0.05。
4.2空间探索实验 术前Sham组、VD模型组、药物组穿越平台次数差异无统计学意义(P>0.05)；术后28d，VD模型组穿过平台次数明显少于Sham组(P<0.01)。试验药物Ⅰ～Ⅶ组穿过平台次数均明显多于VD模型组(P<0.05，P<0.01)，同时试验药物Ⅳ～Ⅶ组与Ⅰ组比较有明显差异(P<0.05)(见表8)。
表8各组小鼠空间探索实验穿越平台次数比较(n＝6，
)
| 组别 | 手术前 | 术后28天 |
| 空白对照(Sham组) | 8.92±3.38 | 9.15±2.83 |
| 模型对照(VD组) | 9.25±3.41 | 2.79±0.61<sup>##</sup> |
| 试验药物Ⅰ | 9.07±3.15 | 5.46±1.35<sup>**</sup> |
| 试验药物Ⅱ | 8.94±3.02 | 4.97±1.02<sup>**</sup> |
| 试验药物Ⅲ | 9.36±3.84 | 5.13±1.26<sup>**</sup> |
| 试验药物Ⅳ | 9.11±2.97 | 4.23±1.07<sup>*▽</sup> |
| 试验药物Ⅴ | 9.30±3.16 | 4.08±1.02<sup>*▽</sup> |
| 试验药物Ⅵ | 9.25±3.23 | 4.12±0.96<sup>*▽</sup> |
| 试验药物Ⅶ | 8.96±3.08 | 4.36±1.13<sup>*▽</sup> |
注：与Sham组比较，##P<0.01；与VD组比较，*P<0.05，**P<0.01。与Ⅰ组比较：▽P<0.05。
实验5对实验性血管性痴呆大鼠空间学习记忆能力的影响
220-240g大鼠170只，Morris水迷宫训练3天后进行合格动物筛选，以4次均能在60s内找到站台的合格。取合格动物100只，按体重分层随机均分为10组，分别为空白对照组、模型对照组、试验药物Ⅰ-Ⅶ组，及阳性对照(DH)组。试验药物Ⅰ为葛根总黄酮提取物：丹参总酚酸提取物：总丹参酮提取物(10：10：1)，大鼠给药剂量为70mg/kg(以葛根素、丹酚酸B、丹参酮计)；试验药物Ⅱ为葛根总黄酮提取物：丹参总酚酸提取物：总丹参酮提取物(10：20：2)，大鼠给药剂量为70mg/kg(以葛根素、丹酚酸B、丹参酮计)；试验药物Ⅲ为葛根总黄酮提取物：丹参总酚酸提取物：总丹参酮提取物(10：5：0.5)，大鼠给药剂量为70mg/kg(以葛根素、丹酚酸B、丹参酮计)；试验药物Ⅳ为葛根总黄酮提取物：丹参总酚酸提取物：总丹参酮提取物(10：10：0)，大鼠给药剂量为70mg/kg(以葛根素、丹酚酸B计)。试验药物V为葛根总黄酮提取物：丹参总酚酸提取物：总丹参酮提取物(10：0：1)，大鼠给药剂量为70mg/kg(以葛根素、丹参酮计)；试验药物Ⅵ为葛根总黄酮提取物：丹参总酚酸提取物：总丹参酮提取物(0：10：1)，大鼠给药剂量为70mg/kg(以丹酚酸B、丹参酮计)；试验药物Ⅶ为葛根素：丹酚酸B：丹参酮IIA(10：10：1)，大鼠给药剂量为70mg/kg(相当于试验药物Ⅰ中相应量的葛根素+丹酚酸B+丹参酮IIA单一成分纯品组合物)。药物配制：用4％Tween-80混匀，再用纯净水配制成所需浓度，按1ml/100g灌胃给药；溶剂对照：4％Tween 80的纯净水按1ml/100g灌胃。
按上述试验药物及剂量灌胃给予相应受试物，每日1次，连续60日；第50日腹腔注射硝普钠2mg/kg，分离双侧颈总动脉，夹闭10min，放开10min后再夹闭10min，随后放开，缝合。第57日给药45min后进行训练，连续3日，每日4次，每次不超过60s，以每日逃避潜伏期为指标；第60日给药后45min进行空间探索试验，以60s内平台穿越次数为指标。结果如表9所示。
表9对实验性血管性痴呆大鼠空间学习记忆能力的影响
| 组别 | 逃避潜伏期(s) | 平台穿越次数(次) |
| 空白对照 | 21.7±9.8 | 3.2±1.5 |
| 模型对照 | 42.5±14.9<sup>##</sup> | 1.2±0.6<sup>##</sup> |
| 试验药物Ⅰ | 27.3±10.1* | 2.2±0.9** |
| 试验药物Ⅱ | 28.8±9.3* | 2.0±0.7* |
| 试验药物Ⅲ | 29.6±11.5* | 1.9±0.8* |
| 试验药物Ⅳ | 32.4±11.9 | 1.7±0.7 |
| 试验药物Ⅴ | 31.3±10.6 | 1.5±0.6 |
| 试验药物Ⅵ | 33.2±11.7 | 1.6±0.7 |
| 试验药物Ⅶ | 32.1±10.4 | 1.8±0.9 |
| 阳性对照(安理申) | 34.7±12.2 | 1.9±0.7* |
注：与对照组比较，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。
结果显示，实验性血管痴呆大鼠可出现空间学习记忆障碍，其在水迷宫中的逃避潜伏期延长而穿越平台次数降低(P<0.01)。给予试验药物Ⅰ～Ⅲ连续60日，可不同程度改善血管性痴呆大鼠的空间学习记忆能力，表现为逃避潜伏期较模型组缩短，穿越平台次数则有所增加(P<0.05，P<0.01)；而试验药物Ⅳ～Ⅶ组无明显差异(P＞0.05)。
尽管参照本发明的解释性实施例对本发明进行了描述，但是，应该理解，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本申请公开的原则范围和精神之内。更具体地说，在本申请公开的范围内，可以对主题组合布局的组成部件和/或布局进行多种变型和改进。除了对组成部件和/或布局进行的变型和改进外，对于本领域技术人员来说，其他的用途也将是明显的。
Claims (4)
1.一种药物组合物在制备防治脑梗死和/或血管性痴呆的药物中的应用，所述药物组合物是由葛根总黄酮提取物、丹参总酚酸提取物和总丹参酮提取物组成，其特征在于药物组合物中，以葛根素计的葛根总黄酮提取物、以丹酚酸B计的丹参总酚酸提取物和以丹参酮计的总丹参酮提取物的重量比为10:(2-50):(0.2-5)；
所述的丹参总酚酸提取物和/或总丹参酮提取物，为采用以下方法制备得到的丹参总酚酸提取物和/或总丹参酮提取物：将粉碎后的丹参在温度≥20℃的条件下，用体积含量80±5％乙醇渗漉提取，收集的渗漉液除去乙醇后调pH值≤4，得到总丹参酮提取物沉淀；固液分离后的水溶液用大孔树脂吸附后，先用pH值≤7的水洗脱除杂，再用体积含量为40％-80％的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收除去溶剂，得到丹参总酚酸提取物；
所述的葛根总黄酮提取物的制备方法为：葛根用水或乙醇体积含量≤80％的乙醇水溶液提取，水提取液或由乙醇水溶液提取液除去乙醇后的水溶液，经大孔树脂吸附后用水洗涤除杂，再用50％-80％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收除去溶剂，得到葛根总黄酮提取物；其中，所述的大孔树脂为HPD-100、HPD-300或D101。
2.如权利要求1所述的药物组合物在制备防治脑梗死和/或血管性痴呆的药物中的应用，其特征在于所述的以葛根素计的葛根总黄酮提取物、以丹酚酸B计的丹参总酚酸提取物和以丹参酮计的总丹参酮提取物的重量比为10:(5-20):(0.5-2)。
3.如权利要求1所述的药物组合物在制备防治脑梗死和/或血管性痴呆的药物中的应用，其特征在于所述的以葛根素计的葛根总黄酮提取物、以丹酚酸B计的丹参总酚酸提取物和以丹参酮计的总丹参酮提取物的重量比为10:10:1。
4.如权利要求1-3任意一项所述的药物组合物在制备防治脑梗死和/或血管性痴呆的药物中的应用，其特征在于所述的葛根总黄酮提取物中的葛根素重量含量≥20％，和/或所述的丹参总酚酸提取物中的丹酚酸B重量含量≥50％，和/或所述的总丹参酮提取物中的丹参酮重量含量≥20％。
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