CN102068440B - 治疗心脑血管疾病的药物组合物及制备方法 - Google Patents

Abstract

治疗心脑血管疾病的药物组合物及制备方法。该药物组合物以丹酚酸B、丹参酮IIA、阿魏酸、藁本内酯、葛根素为有效成分，与药物中可以接受的辅助添加成分共同组成，有效成分的重量组成为丹酚酸B 2～10份，丹参酮IIA 0.1～0.5份，阿魏酸0.1～0.5份，藁本内酯0.4～2份，葛根素2～10份。试验显示，该药物组合物可明显缩小脑缺血再灌注损伤引起的脑组织出血坏死灶、减轻神经细胞和神经纤维的损伤。

Description

治疗心脑血管疾病的药物组合物及制备方法

技术领域

本发明涉及一种治疗心脑血管疾病的药物组合物，特别是一种由天然药物的有效成分组成的药物组合物，及其制备方法。

背景技术

心脑血管疾病是一种常见和多发性病，尤以中老年人群的发病率高，严重危害中老年人的身体健康和生活质量。传统的单味中药及其复方药物对心脑血管疾病有较好的预防和治疗作用，如丹参具有祛瘀止痛，活血通经，清心除烦之功效，常被用于心脑血管疾病的预防和治疗，其水溶性有效成分为包括丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸C等多种丹参酚酸成分(杜冠华等：基础医学与临床，2000；(5)：10)，其中丹酚酸B含量最高(丹参中含量约为4％)。丹参酚酸及其主要成分对心脑血管的保护作用主要表现为：(1)对脑缺血再灌注引起的脑损伤有保护作用，可以减少脑组织中MDA含量，对脑缺血再灌注引起的记忆功能障碍有明显的改善作用。(2)对心肌缺血再灌注引起的心肌细胞损伤和心律失常有显著的保护作用，对实验性在体血栓形成有剂量依赖性抑制作用，对多种因素引起的血小板聚集均有显著的抑制作用。丹参脂溶性有效成分为包括丹参酮I、丹参酮IIA、丹参酮IIB、隐丹参酮等多种丹参酮成分，其中以丹参酮IIA含量最高。药理实验和临床观察的研究证明丹参酮对心脑血管疾病有确切的疗效，主要作用有：(1)抑制血管平滑肌细胞增殖，(2)抑制血管内膜增生，(3)改善冠状动脉，(4)减轻心肌缺血再灌注损伤，(5)防止心肌肥厚，(6)防治心率失常，(7)减轻脑缺血缺氧损伤，(8)防治脑缺血再灌注损伤等(谭为华等：贵阳中医学院学报，2007；29(3)：52-54)。

川芎具有活血行气，祛风止痛之功效，主要有效成分为川芎挥发油、酚酸类等成分。文献报道川芎挥发油具有改善微循环，增加脑血流量的作用，可使微血管解痉，增加毛细血管开放数目，加快血流速度，使聚集的红细胞解聚等。川芎挥发油主要成分包括藁本内酯、丁基苯酞、丁烯基苯酞等，其中藁本内酯含量最高，川芎药材和川芎油中藁本内酯的含量分别约为1.5％、20-50％。酚酸类成分也是川芎中重要的活性成分，具有抗血栓、降血脂，防治冠心病等药理活性，其中阿魏酸具有抗动脉粥样硬化，抗血小板聚集，抗氧化，抗菌消炎等活性(张玲等：现代中药研究与实践，2009，23(4)：41)，川芎酚酸主要代表性成分为阿魏酸、阿魏酰奎尼酸、绿原酸、咖啡酸等。

葛根具有解肌退热，生津，透疹，升阳止泻之功效，葛根有效成分包括葛根素、大豆苷、大豆苷元、3’-羟基葛根素、3’-甲氧基葛根素等黄酮类成分，对高血钾和去甲肾上腺素引起的血管痉挛有明显的松弛作用，能显著对抗反复性脑缺血脑组织含水量、Ca²⁺及丙二醛的含量升高，抑制Ca²⁺-ATPase及超氧化物歧化酶活性的降低，显著延长小鼠断头后的呼吸持续时间，对脑缺血有保护作用。葛根素具有降血脂、保护心肌、改善微循环、抗氧化等作用。《中华人民共和国药典》2010年版一部收载的愈风宁心片，即为单味葛根原料经加工制成的药品，具有解痉止痛，增强脑及冠脉血流量的作用；此外，葛根素注射液是治疗心脑血管疾病的常用药物。《中华人民共和国药典》2010年版一部收载的葛根分为野葛和粉葛二种，其中野葛中葛根素(大于2.4％)和总黄含量很高，粉葛中葛根素(大于0.3％)和总黄含量较低，故一般提取葛根素和黄酮类成分首选野葛投料。

以上述丹参、川芎、葛根为原料制备的“通脉制剂”(通脉冲剂和通脉口服液)，收载于卫生部药品标准中药成方制剂第四册和第二十册，临床中已广泛使用，主要药效作用有：(1)抗血栓，(2)扩张冠状动脉、抗心肌缺血，(3)解痉、改善微循环，(4)抗脑缺血、缺氧等。通脉制剂的处方为：丹参500g、川芎500g、葛根500g，以上三味药材，加水煎煮二次，第一次1.5小时，第二次1小时，趁热滤过，合并滤液，按常规方法制成冲剂或口服液。

公开号CN1839931A中国专利报道了一种治疗心脑血管疾病的药物组合物，由丹参总酚酸、川芎挥发油和葛根总黄酮组成，其提取原料分别为丹参、川芎和葛根，其中，丹参和葛根分别采用水提、大孔吸附树指法分离得到丹参酚酸提取物和葛根黄酮提取物，川芎采用超临界二氧化碳萃取得到川芎挥发油提取物。

试验显示，上述药物的组成仍分别存在一些不足之处，不仅影响了药物有益疗效的充分发挥，也导致了药用原料的浪费。

发明内容

针对上述情况，本发明首先提供一种以上述组合方式为基础，能有利于药物疗效充分发挥的治疗心脑血管疾病的药物组合物，并在此基础上进一步提供该药物组合物的制备方法。

本发明治疗心脑血管疾病的药物组合物，以丹酚酸B、丹参酮IIA、阿魏酸、藁本内酯、葛根素为有效成分，与药物中可以接受的辅助添加成分共同组成。所说有效成分的重量组成为：丹酚酸B 2～10份，丹参酮IIA 0.1～0.5份，阿魏酸0.1～0.5份，藁本内酯0.4～2份，葛根素2～10份。

上述的药物组合物中，所说有效成分的优选重量组成是：丹酚酸B 6份，丹参酮IIA 0.4份，阿魏酸0.2份，藁本内酯1份，葛根素5份。

在药物组合物的组成中，所说的有效成分丹酚酸B、丹参酮IIA、阿魏酸、藁本内酯、葛根素，可以为购自于市售相应商品的单一纯品形式的成分，也可以按目前已有文献报道的方法提取或制备得到。例如，目前对阿魏酸的全化学合成方式已有报道和/或使用；由适当的天然药用原料提取丹酚酸B、丹参酮IIA、阿魏酸、藁本内酯、葛根素等成分的方法目前也已有报道和/使用，且后者的提取方式通常可以更为简便和常用。例如，所说有效成分丹酚酸B允许采用含有所说量的来自药用原料丹参的丹参酚酸提取物替换；有效成分丹参酮IIA允许采用含有所说量的来自药用原料丹参的丹参酮提取物替换；有效成分阿魏酸允许采用含有所说量的来自药用原料川芎的川芎酚酸提取物替换；有效成分藁本内酯允许采用含有所说量的来自药用原料川芎的川芎挥发油提取物替换；有效成分葛根素允许采用含有所说量的来自药用原料葛根的葛根黄酮提取物替换。这里所说的替换，在实际应用中，可以根据实际情况，只针对其中的一种或几种有效成分的替换，也可以是针对全部有效成分的替换。

进一步，在采用由天然药用原料提取物进行替换时，对所用的提取物除可以采用目前已知的相应方法进行纯化后得到的单一纯净形式的所说有效成分外，还允许采用在含有所说有效成分的同时，还含有主要存在于其提取物中的同类成分和/或对本发明组合物药效作用无不利影响的其它成分或杂质。如，在丹参酚酸提取物中，除丹酚酸B外，还允许含有如丹酚酸A、丹参酸C等其它成分；在丹参酮提取物中除丹参酮IIA外，还允许含有如丹参酮I、丹参酮IIB、隐丹参酮等其它成分；在川芎酚酸提取物中，除阿魏酸外，还允许含有如阿魏酰奎尼酸、咖啡酸、生物碱等其它成分；在川芎挥发油提取物中，除藁本内酯外，还允许含有如川芎内酯、丁苯酞等苯酞类成分和脂肪油类成分等其它成分；葛根黄酮提取物中除葛根素外，还允许含有如大豆甙、3′-羟基葛根素、3′-甲氧基葛根素等其它成分。试验显示，在本发明的上述药物组合物中，采用以含有所说比例量的丹酚酸B、丹参酮IIA、阿魏酸、藁本内酯、葛根素有效成分，或同时还存在有所说其它成分的相应丹参酚酸提取物、丹参酮提取物、川芎酚酸提取物、川芎挥发油提取物、葛根黄酮提取物进行替换，一般不会对所说药物有效成分的药效作用有明显的干扰或不利影响，可以具有同样的效果。

本发明上述的药物组合物，优选的是以所说的有效成分，与口服药物中可以接受的常规辅助添加成分制备而成的相应口服药物制剂。例如，与在口服制剂中可以被接受的崩解剂、赋形剂、润滑剂、粘合剂、填充剂等常用的辅助添加成份混合后，按相应的常规工艺方法处理，制成的片剂、丸剂、颗粒剂、胶囊剂或适当形式的缓释剂、控释剂等固体制剂形式的口服药物；或是与常用的增溶剂、乳化剂、润湿剂、起泡或消泡剂等表面活性剂、稀释剂、防腐剂、稳定剂、矫味剂、增稠剂等混合，按相应的常规工艺方法处理，制成为水剂、糖浆等液体制剂形式的口服药物。

其中，填充剂可以包括如常用的淀粉、糊精、糖粉、预胶化淀粉、乳糖、葡萄糖、微晶纤维素、碳酸钙、硫酸钙、碳酸氢钙等；

黏合剂可以包括如常用的羟丙甲纤维素、聚维酮、淀粉浆、糊精浆、糖浆、胶浆、海藻酸钠、聚乙二醇、桃胶、阿拉伯胶等；

崩解剂可以包括如常用的交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮、羧甲基淀粉钠、羟丙基淀粉、低取代羟丙基纤维素柠檬酸、酒石酸、酸酐、碳酸氢钠、碳酸钠等；

润滑值剂可以包括如常用的硬脂酸镁(钠)、滑石粉、微粉硅胶、液体石蜡、聚乙二醇等；

软胶囊剂中的基质可以包括如常用的植物油(如色拉油、蓖麻油、氢化大豆油等)、聚乙二醇(如PEG 300、PEG 400、PEG 6000等)；以及常用的亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠、抗坏血酸、半胱氨酸、叔丁基对羟基茴香醚、二丁甲苯酚、维生素E等抗氧化剂；

口服缓控释制剂中的阻滞剂可包括如常用的蜂蜡、巴西棕榈蜡、氢化植物油、硬脂醇、单硬脂酸甘油酯、醋酸纤维素酞酸酯、L-或S-丙烯酸树脂、羟丙甲纤维素酞酸酯、醋酸羟丙甲纤维素琥珀酸酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙甲纤维素、聚维酮、卡波普、海藻酸钠、脱乙酰壳聚糖、乙基纤维素、聚甲基丙烯酸酯、无毒聚氯乙烯、聚乙烯、乙烯-醋酸乙烯共聚物、硅橡胶；以及如明胶、聚维酮、羧甲基纤维素钠、聚乙烯醇、右旋糖酐等常用的增稠剂；

以及必要时所用的环糊精包合物，表面活性剂等常用的稳定剂，和/或如柠檬酸、富马酸、谷氨酸、L-天冬氨酸、乳酸、乳糖酸、半乳糖酸、葡萄糖醛酸、抗坏血酸、盐酸、醋酸等常用的生理可用的pH值调节剂等。这些常规使用的辅助添加成分，可以根据不同制剂和/或需要选择使用。

如上述，在制备本发明所述的药物组合物时，所说的有效成分可以采用含有所说比例量的丹酚酸B、丹参酮IIA、阿魏酸、藁本内酯、葛根素的相应提取物替换。所说的这些提取物可以采用下述方式提取得到。例如：

所说有效成分中的丹参酮提取物采用下述方式之一制备得到：

方法1：以超临界二氧化碳循环逆流方式对粉碎后的丹参进行萃取后分离，得到有效成分丹参酮提取物；

方法2：用体积含量≥80％的乙醇溶液对粉碎后的丹参进行提取后，提取液除去乙醇，沉淀，过滤，得到有效成分丹参酮提取物；

方法3：用体积含量≥80％的乙醇溶液对粉碎后的丹参进行提取，提取液除去乙醇，浓缩，干燥，得到有效成分丹参酮提取物。

所说有效成分中的丹参酚酸提取物采用下述方式之一制备得到：

方法1：由药用原料丹参提取丹参酮提取物后，剩余物经水或体积含量≤80％的乙醇-水混合溶剂提取，回收溶媒，浓缩，干燥，得到有效成分丹参酚酸提取物；

方法2：由药用原料丹参提取丹参酮提取物后，剩余物经水或体积含量≤80％的乙醇-水混合溶剂提取，水提液或除去乙醇后的提取液，经大孔树脂柱吸附和水洗涤除杂后，用乙醇体积含量为40～80％的醇-水混合液洗脱，收集洗脱液并除去乙醇，浓缩，干燥，得到有效成分丹参酚酸提取物。

所说有效成分中的川芎挥发油提取物采用下述方式之一制备得到：

方法1：以超临界二氧化碳循环逆流方式对粉碎后的川芎进行萃取后，分离，得到有效成分川芎挥发油提取物；

方法2：取川芎，粉碎，用低沸点的有机溶剂提取，分离除去提取有机溶剂后，得到有效成分川芎挥发油提取物，所说的提取溶剂为石油醚、汽油、6号溶剂油、正己烷和环己烷中的至少一种；

方法3：取川芎，用体积含量≥80％的乙醇溶液进行提取，提取液除去乙醇，浓缩，干燥，得到有效成分川芎挥发油提取物。

所说有效成分中的川芎酚酸提取物采用下述方式之一制备得到：

方法1：由药用原料川芎提取川芎挥发油提取物后，剩余物以水或体积含量≤80％的乙醇-水混合溶剂提取，回收溶媒，浓缩，干燥，得到有效成分川芎酚酸提取物；

方法2：由药用原料川芎提取川芎挥发油提取物后，剩余物以水或体积含量≤80％的乙醇-水混合溶剂提取，水提液或除去乙醇后的提取液，经大孔树脂柱吸附和水洗涤除杂后，用乙醇体积含量为30～70％的醇-水混合液洗脱，收集洗脱液并除去乙醇，浓缩，干燥，得到有效成分川芎酚酸提取物。

所说有效成分中的葛根黄酮提取物采用下述方式之一制备得到：

方法1：葛根粉碎，水煎煮后过滤，滤液经大孔树脂柱吸附和水洗涤除杂后，用乙醇体积含量为60～80％的醇-水混合液洗脱，收集洗脱液并除去乙醇，浓缩，干燥，得到有效成分的葛根黄酮提取物；

方法2：葛根粉碎，用水或体积含量≤80％的乙醇-水混合溶剂提取，回收溶媒，浓缩，干燥，得到有效成分的葛根黄酮提取物。

上述提取制备过程中所说的上述所说的大孔树脂柱中所用的大孔树脂，一般可以选择目前使用最为广泛的HPD-100或D101型号的树脂。

中药复方药物的独特疗效优势，体现在其复方中多成分、多靶点的协同整合作用。本发明上述的药物组合物是用丹参、川芎、葛根各自的主要有效成分丹酚酸B、丹参酮IIA、阿魏酸、藁本内酯、葛根素为有效成分，完全克服了目前虽采用同类或相似的药用原料、但由于损失或完全丢失了其中的一种或几种有效成分的同类药物的缺陷，使药用原料中的各种有效成分能充分发挥其各自及其协同的有益效果，显著提高了疗效，也大大提高了药用原料的利用率，减少了药用原料的浪费。

以下通过实施例的具体实施方式再对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换或变更，均应包括在本发明的范围内。

具体实施方式

实施例1

分别称取市购单一纯品成分形式的商品丹酚酸B 60g、阿魏酸2g、葛根素50g，丹参酮IIA 4g、藁本内酯10g和药用辅料适量作为原料。丹酚酸B、阿魏酸和葛根素加入药用PEG400溶解后，再加入丹参酮IIA、藁本内酯和药用辅料，混匀，备用。按体积比3∶1.2∶3取药用明胶、甘油和水，制成囊材后，将上述备用药液和囊材在软胶囊压制机上压制成软胶囊，每粒重0.5g，即为本发明的胶囊剂药物。

实施例2

分别将同样的丹酚酸B 20g、丹参酮II A 1g、阿魏酸5g、葛根素20g，微粉化，加入到PEG-6000熔融液中，再加入藁本内酯20g，搅拌混匀，在滴丸机中制成1000粒滴丸，即为本发明的滴丸剂药物。

实施例3

分别称取同样的丹酚酸B 100g、阿魏酸1g、葛根素100g、丹参酮IIA 5g和藁本内酯4g，加药用辅料适量，按常规方法压片，制成1000片，包薄膜衣，即为本发明的片剂药物。

实施例4

取药用原料丹参的粗粉100kg，采用超临界流体CO₂循环逆流萃取、分离，萃取压力35MPa，萃取温度50℃，夹带剂为95％乙醇，萃取时间4小时，分离器解析压力10Mpa，解析温度30℃，得到含有效成分的丹参酮提取物。提取后的丹参药渣再分别加水8倍、6倍和6倍，于70℃动态搅拌温浸提取3次，过滤，滤液通过装有150立升HPD-100大孔树脂(河北沧州宝恩化工有限公司生产)吸附柱，用300立升水洗涤除杂，再用450立升50％v/v乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇，浓缩至稠膏，于65℃减压干燥，得到丹参酚酸提取物。

取药用原料川芎的粗粉100kg，超临界流体CO₂循环逆流萃取和分离，萃取压力40MPa，萃取温度60℃，萃取剂CO₂用量1000公斤/时，萃取时间5小时，分离器解析压力10Mpa，解析温度50℃，得到川芎挥发油提取物。其川芎药渣再分别加水12、10倍，回流提取2次，过滤，滤液通过装有120立升HPD-100大孔树脂吸附柱，用200立升水洗涤除杂，再用350立升50％v/v乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇，浓缩，减压干燥，得到川芎酚酸提取物。

取药用原料葛根(野葛)的粗粉100kg，分别加水10、8、6倍，煎煮3次，过滤，滤液调节pH值至4～5，通过装有200立升D141大孔树脂(中蓝晨光化工研究院生产)吸附柱，用300立升水洗涤除杂，再用500立升70％v/v乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇，浓缩至稠膏，干燥，得到葛根黄酮提取物。

分别称取含丹酚酸B 50g的上述丹参酚酸提取物、含阿魏酸3g的川芎酚酸提取物、含葛根素60g的葛根黄酮提取物、含丹参酮II A 3g的丹参酮提取物，和含藁本内酯4g的川芎挥发油提取物，加药用辅料适量，按常规方法压片，制成3000片，包薄膜衣，即为本发明的片剂药物。

实施例5

取药用原料丹参的粗粉100kg，用体积含量95％的乙醇回流提取2次，提取液回收乙醇，浓缩，干燥，得到含有效成分丹参酮的提取物。经上述乙醇提取后的丹参药渣再用体积含量60％的乙醇回流提取，减压回收溶媒，浓缩，干燥，得到含有效成分丹参酚酸的提取物。

取药用原料川芎的粗粉100kg，用体积含量95％的乙醇回流提取3次，提取液回收乙醇，浓缩，干燥，得到含有效成分川芎挥发油的提取物。经该乙醇提取后的川芎药渣再用体积含量70％的乙醇回流提取，减压回收溶媒，浓缩，干燥，得到含有效成分川芎酚酸的提取物。

取药用原料葛根的粗粉100kg，用体积含量70％的乙醇回流提取3次，回收溶媒，浓缩，干燥，得到含有效成分葛根黄酮的提取物。

分别称取上述丹参酚酸提取物100g(以丹酚酸B计)、川芎酚酸提取物5g(以阿魏酸计)、葛根黄酮提取物20g(以葛根素计)、丹参酮提取物5g(以丹参酮IIA计)和川芎挥发油提取物10g(以藁本内酯计)，加药用辅料适量，按常规方法制成胶囊5000粒，即为本发明的胶囊剂药物。

实施例6

将药用原料丹参粗粉100kg，用体积含量90％的乙醇回流提取3次，提取液除去乙醇，静置沉淀、过滤，得到含有效成分丹参酮的提取物，过滤母液备用。上述经乙醇提取后的丹参药渣再用体积含量50％的乙醇回流提取2次，提取液除去乙醇，与备用的丹参酮过滤母液合并，经D101大孔树脂柱吸附和水洗涤除杂后，用体积含量为70％的乙醇洗脱，收集洗脱液并除去乙醇，浓缩，干燥，得到含有效成分丹参酚酸的提取物。

将药用原料川芎粗粉100kg，用石油醚或6号溶剂油回流提取3次，分离除去溶媒得到含有效成分川芎挥发油的提取物；上述经石油醚或6号溶剂油提取后的川芎药渣再以水回流提取3次，水提液经D101大孔树脂柱吸附和水洗涤除杂后，用体积含量为60％的乙醇洗脱，收集洗脱液并除去乙醇，浓缩，干燥，得到含有效成分川芎酚酸的提取物。

将药用原料葛根粗粉100kg用水煎煮提取2次，过滤，水提液经HPD-100大孔树脂柱吸附和水洗涤除杂后，用体积含量为70％的乙醇洗脱，收集洗脱液并除去乙醇，浓缩，干燥，得到含有效成分葛根黄酮的提取物。

分别称取上述丹参酚酸提取物20g(以丹酚酸B计)、川芎酚酸提取物1g(以阿魏酸计)、葛根黄酮提取物100g(以葛根素计)、丹参酮提取物1g(以丹参酮IIA计)，微粉化，加入到PEG-6000熔融液中，再加入川芎挥发油提取物20g(以藁本内酯计)，搅拌混匀，在滴丸机中制成5000粒滴丸，即为本发明的滴丸剂型药物。

以丹酚酸B、丹参酮IIA、阿魏酸、藁本内酯、葛根素为主要有效药用成分制成的本发明药物组合物作为试验药物进行的下述实验，可以表明本发明药物组合物所具有的有益效果。

实验1  对内皮细胞和神经元缺氧再给氧的保护作用

1、实验方法：参见鄂征主编的《组织培养和分子生物细胞学技术》，北京：北京出版社，1994年12月，438页。

(1)MTT法测定内皮细胞存活率

致密单层细胞经药物作用后，用冰冷的PBS溶液洗涤2次，加入0.5mg/ml MTT溶液100μl，37℃掺入4小时，吸去残留液体，加入酸化异丙醇显色溶液100μl，30分钟内在波长595nm处用酶标仪测吸光度A值。观察试验药物对培养细胞生存的影响。

(2)MTT法测定神经元存活率

细胞培养10天后，向每孔加入0.5％的MTT 10μl继续培养4小时，吸弃培养液，加入二甲亚砜(DMSO)200μl/孔，待颗粒溶解后置于酶标仪上，在波长570nm处检测各孔的吸光度A值。观察试验药物对培养神经元生存的影响。

(3)培养细胞缺氧/再给细氧模型

正常培养基用95％N₂和5％CO₂混合气体平衡30分钟后，获得缺氧培养基。细胞用缺氧培养基悬浮后置培养板，放入缺氧仓内(持续通入95％N₂和5％CO₂混合气体为此缺氧环境)，37℃孵育2小时(缺氧时间)后，立即更换正常的培养基，再孵育4小时(再给氧)。以未经处理细胞作为对照。

(4)药物给予方法

试验药物用培养基配制成10ug/ml的浓度，缺氧期间药物用缺氧培养基配制，再给氧期间药物用普通培养基配制。

2、实验结果

(1)对内皮细胞缺氧2小时再给氧4小时损伤的保护作用

新生牛脑微血管内皮细胞经缺氧2小时再给氧4小时后，产生明显的死亡现象，MTT检测表明，缺氧再给氧(H/R)组细胞吸光度明显减小，经试验药物保护的细胞均呈现出非常明显的保护作用，与对照组比较P＜0.01，如表1所示。此外，由表1还可以清楚地看出：本发明药物组合物以重量配比6∶0.4∶0.2∶1∶5比例配伍对内皮细胞缺氧再给氧(H/R)的保护作用最佳。

(2)对培养神经元缺氧2小时再给氧4小时损伤的保护作用

新生大鼠脑神经元经缺氧2小时再给氧4小时后，产生明显的死亡现象，MTT检测表明，缺氧再给氧(H/R)组细胞吸光度明显减小，经试验药物保护的细胞均呈现出非常明显的保护作用，与对照组比较P＜0.01，如表2所示。此外，由表2还可以清楚地看出：本发明药物组合物以6∶0.4∶0.2∶1∶5比例配伍对神经元缺氧再给氧(H/R)的保护作用最佳。

表1  本发明药物组合物对内皮细胞缺氧再给氧(H/R)的保护作用

x±s，n＝6，与对照组比较：^**P＜0.01。

*表示丹酚酸B∶丹参酮IIA∶阿魏酸∶藁本内酯∶葛根素(纯品重量配比)。

表2  本发明药物组合物对神经元缺氧再给氧(H/R)的保护作用

x±s，n＝6，与对照组比较：^**P＜0.05。

*表示丹酚酸B∶丹参酮IIA∶阿魏酸∶藁本内酯∶葛根素的重量配比。

实验2  对小鼠耐缺氧能力的影响

1、试验动物：ICR小鼠90只，随机分为9组。

2、实验方法：

取小鼠90只，体重为18-22g，随机分为9组，每组10只，雌雄各半，分别作为本发明试验药物组(丹酚酸B∶丹参酮IIA∶阿魏酸∶藁本内酯∶葛根素)的高、低剂量组、灯盏花素组和模型组(给以等量的生理盐水)。于实验前6天，每天灌胃给药一次，以不同浓度等容积给药0.1ml/10g体重。第7天最后一次给药后30分钟，将小鼠置于装有25g钠石灰的60ml密闭广口瓶中，记录小鼠的死亡时间。

3、剂量设置：小鼠低剂量为50mg/kg，高剂量为100mg/kg。

4、溶剂对照：生理盐水按0.1ml/10g灌胃。

5、给药途径：灌胃给药。

6、给药次数：1次/日，均给药7日。

7、观察指标及观察时间：观察小鼠在缺氧环境下生存的时间。实验结果见表3。

表3  对小鼠耐缺氧能力的影响

☆表示丹酚酸B∶丹参酮IIA∶阿魏酸∶藁本内酯∶葛根素的重量配比。与模型组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01

8、结论：本发明试验药物-丹酚酸B∶丹参酮IIA∶阿魏酸∶藁本内酯∶葛根素(2∶0.5∶0.5∶0.4∶2、10∶0.1∶0.1∶2∶10、6∶0.4∶0.2∶1∶5)的低剂量组和高剂量组均可显著延长小鼠在缺氧状态下的存活时间，与模型组相比有非常显著差异(P＜0.01)，如表4所示。表明以丹酚酸B、丹参酮IIA、阿魏酸、藁本内酯、葛根素作为有效药用成分，组成本发明试验药物，可显著延长小鼠在缺氧状态下的存活时间。此外，由表4还可以清楚地看出，在相同剂量的条件下，试验药物6∶0.4∶0.2∶1∶5组的药效活性优于2∶0.5∶0.5∶0.4∶2和10∶0.1∶0.1∶2∶10组，说明本发明药物组合物中丹酚酸B、丹参酮IIA、阿魏酸、藁本内酯、葛根素按6∶0.4∶0.2∶1∶5的配比为优。

实验3  对栓线法大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型的治疗作用

1、试验动物：SD大鼠264只，随机分为11组。

2、试验方法：参见徐江平等《中国中西医结合急救杂志》，2003；10(1)：31。

按组分别灌胃给予受试药物或溶剂对照，连续给予7天，末次给药后2小时按下述方法进行手术。

将大鼠用10％水合氯醛3ml/kg腹腔注射麻醉，颈正中切口，分离并结扎右侧颈总动脉近心端、颈外动脉及其分支动脉。分离右侧颈内动脉，沿颈内动脉向下分离翼颚动脉，根部结扎该分枝。在颈内动脉近端备线、远端放置动脉夹，颈总动脉分叉处切口，插入4-0尼龙线，其深度为17～20mm，栓线进入颈内动脉，入颅至大脑前动脉，阻断大脑中动脉所有血流来源。撤掉动脉夹，扎紧备线，外留1cm长线头，缝合皮肤。缺血2小时后再灌注，勿需再次麻醉和切开皮肤，轻轻提拉所留线头至有阻力时提示尼龙线头端已至颈总动脉切口处，使血流再通。假手术组除不插线外，其余步骤同上。

存活鼠再灌注24后，观察大鼠行为变化，进行行为评分。参考Zea Longa的五分制评分标准：0分，正常，无神经损伤症状；1分，不能完全伸展对侧前爪；2分，向外侧转圈；3分，向对侧倾倒；4分，不能自发行走，意识丧失。然后快速断头取实验鼠大脑，一部分分别称量左、右大脑半球湿重，置160℃烤箱内24小时后称干重，按以下公式计算脑组织含水量：脑组织含水量(％)＝(湿重-干重)/湿重×100％；另一部分在前连合平面切下厚约2mm冠状脑片，立刻置于2％TTC溶液中，37℃孵育30分钟。梗塞区呈现白色，非梗塞区呈现红色。数码相机拍摄记录，用Medbrain 2.0软件测出脑片总体积及梗塞区体积，并计算梗塞区占整个脑组织的百分比(％)；另一部分作组织形态学观察：脑组织经固定后，冠状切取大脑，常规脱水，石蜡包埋制片，HE染色，光镜检验。

3、试验药物及剂量设置：

试验药物I：以丹酚酸B、丹参酮IIA、阿魏酸、藁本内酯和葛根素为有效成分，其重量比为6∶0.4∶0.2∶1∶5。大鼠给药剂量为100.8mg/kg。

试验药物II：以实施例4中的丹参酚酸提取物、丹参酮提取物、川芎酚酸提取物、川芎挥发油提取物和葛根黄酮提取物为有效成分，其中丹酚酸B、丹参酮IIA、阿魏酸、藁本内酯、葛根素的重量比为6∶0.4∶0.2∶1∶5。大鼠给药剂量为100.8mg/kg(以丹酚酸B、丹参酮IIA、阿魏酸、藁本内酯和葛根素的重量计)。

试验药物III：以实施例5中的丹参酚酸提取物、丹参酮提取物、川芎酚酸提取物、川芎挥发油提取物和葛根黄酮提取物为有效成分，其中丹酚酸B、丹参酮IIA、阿魏酸、藁本内酯、葛根素的重量比为6∶0.4∶0.2∶1∶5。大鼠给药剂量为100.8mg/kg(以丹酚酸B、丹参酮IIA、阿魏酸、藁本内酯和葛根素的重量计)。

试验药物IV：以丹酚酸B、藁本内酯和葛根素为有效成分，其重量比为6∶1∶5。大鼠给药剂量为96mg/kg。

试验药物V：以实施例4中的丹参酚酸提取物、川芎挥发油提取物和葛根黄酮提取物为有效成分，其中丹酚酸B、藁本内酯、葛根素的重量比为6∶1∶5。大鼠给药剂量为96mg/kg(以丹酚酸B、藁本内酯和葛根素的重量计)。

试验药物VI：以实施例5中的丹参酚酸提取物、川芎挥发油提取物和葛根黄酮提取物为有效成分，其中丹酚酸B、藁本内酯、葛根素的重量比为6∶1∶5。大鼠给药剂量为96mg/kg(以丹酚酸B、藁本内酯和葛根素的重量计)。

试验药物VII：以实施例6中的丹参酚酸提取物、丹参酮提取物、川芎酚酸提取物、川芎挥发油提取物和葛根黄酮提取物为有效成分，其中丹酚酸B、丹参酮IIA、阿魏酸、藁本内酯、葛根素的重量比为6∶0.4∶0.2∶1∶5。大鼠给药剂量为100.8mg/kg(以丹酚酸B、丹参酮IIA、阿魏酸、藁本内酯和葛根素的重量计)。

试验药物VIII：以实施例6中的丹参酚酸提取物、川芎挥发油提取物和葛根黄酮提取物为有效成分，其中丹酚酸B、藁本内酯、葛根素的重量比为6∶1∶5。大鼠给药剂量为96mg/kg(以丹酚酸B、藁本内酯和葛根素的重量计)。

4、药物配制：用4％Tween-80混匀，再用纯净水配制成所需浓度，按1ml/100g灌胃给药。

5、溶剂对照：4％Tween 80的纯净水按1ml/100g灌胃。

6、给药途径：灌胃给药。

7、给药次数：均连续给药7日，每日1次。

8、观察指标及观察时间：观察大鼠行为、脑梗塞体积、组织形态学的变化。观察时间为再灌注24小时。

9、试验结果：见表4。

(1)对行为的影响：假手术组大鼠均无异常行为，神经行为评分为0；溶剂对照组大鼠出现不能完全伸展、对侧前爪向外侧转圈或向对侧倾倒的神经损伤症状，行为评分为1.75±0.58；试验药物I～VIII组均可显著降低大鼠神经行为评分，同溶剂对照组比较有非常显著差异(P＜0.01)。

表4  对大鼠缺血2小时再灌注24小时的神经病学评分、大脑半球含水量及脑梗塞体积的影响

与假手术组比较，^##P＜0.01；与溶剂对照组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01。

表中：“试验药物V”即为CN1839931A专利文献的药物；

“试验药物II”即为上述实施例4的本发明药物组合物。

(2)对脑组织含水量的影响：溶剂对照组缺血-再灌注一侧(大脑右半球)脑组织含水量非常显著高于假手组。试验药物I～VIII组脑组织含水量均显著低于溶剂对照组。

(3)对脑梗塞体积的影响：假手术组脑组织无梗塞，溶剂对照组缺血侧脑组织有梗塞现象，梗塞区占全脑组织的百分比为30.4±6.5％。试验药物I～VI组均可显著缩小缺血侧脑组织梗塞体积，与溶剂对照组相比有非常显著差异(P＜0.01)；且试验药物I、II、III、VII组分别与IV、V、VI、VIII组比较有显著差异(P＜0.05)。

(4)对组织形态学的影响：假手术组两侧脑组织正常，溶剂对照组、试验药物I～VIII组非缺血侧脑组织均正常。对于缺血侧脑半球：溶剂对照组出现脑组织出血坏死及脑组织严重水肿、灶性坏死，试验药物I～VIII组均可缩小出血坏死灶；且试验药物IV、V、VI、VIII组的出血坏死灶明显小于I、II、III、VII组。

(5)试验药物I～III、VII组的结果还清楚显示，以含有相当比例量丹酚酸B的丹参酚酸提取物、含有相当比例量丹参酮IIA的丹参酮提取物、含有相当比例量阿魏酸的川芎酚酸提取物、含有相当比例量藁本内酯的川芎挥发油提取物和含有相当比例量葛根素的葛根黄酮提取物作为有效药物成分，对本发明药物组合物的药效作用不会产生干扰或不利影响。

(6)试验药物I/IV组、II/V组、III/VI组和VII/VIII组结果比较分析显示，本发明药物组合物中的丹参酮II A、阿魏酸以及含有相当比例量丹参酮II A的丹参酮提取物、含有相当比例量阿魏酸的川芎酚酸提取物，对所述药物组合物的药效作用有着十分重要的影响，与丹酚酸B、藁本内酯和葛根素配伍组合具有协同增效作用。

表4实验结果表明：由试验药物I/IV组、II/V组、III/VI组和VII/VIII组结果比较分析显示，本发明药物组合物中的丹参酮II A、阿魏酸以及含有同样比例量丹参酮II A的丹参酮提取物、含有同样比例量阿魏酸的川芎酚酸提取物，对所述药物组合物的药效作用有着十分重要的影响，与丹酚酸B、藁本内酯和葛根素配伍组合具有协同增效作用。而且，药物组合物中的有效成分丹酚酸B可以替换为由药用原料丹参得到的丹参酚酸提取物，丹参酮IIA可以替换为由药用原料丹参得到的丹参酮提取物，阿魏酸可以替换为由药用原料川芎得到的川芎酚酸提取物，藁本内酯可以替换为由药用原料川芎得到的川芎挥发油提取物，葛根素可以替换为由药用原料葛根得到的葛根黄酮提取物。

上述实验结果充分表明，以丹酚酸B、丹参酮II A、阿魏酸、藁本内酯和葛根素作为有效药用成分，组成本发明的试验药物，可明显缩小脑缺血再灌注损伤引起的脑组织出血坏死灶、减轻神经细胞和神经纤维的损伤。

Claims (14)

1.治疗心脑血管疾病的药物组合物，其特征是以丹酚酸B、丹参酮IIA、阿魏酸、藁本内酯、葛根素为有效成分，与药物中可以接受的辅助添加成分共同组成，所说有效成分的重量组成为：丹酚酸B 2～10份，丹参酮IIA 0.1～0.5份，阿魏酸0.1～0.5份，藁本内酯0.4～2份，葛根素2～10份。

2.如权利要求1所述的药物组合物，其特征是所说的有效成分的重量组成为：丹酚酸B 6份，丹参酮II A 0.4份，阿魏酸0.2份，藁本内酯1份，葛根素5份。

3.治疗心脑血管疾病的药物组合物，其特征是以来自药用原料丹参的丹参酚酸提取物、丹参酮IIA、阿魏酸、藁本内酯、葛根素为有效成分，与药物中可以接受的辅助添加成分共同组成，所说有效成分的重量组成为：含有丹酚酸B 2～10份的丹参酚酸提取物，丹参酮IIA0.1～0.5份，阿魏酸0.1～0.5份，藁本内酯0.4～2份，葛根素2～10份。

4.治疗心脑血管疾病的药物组合物，其特征是以丹酚酸B、来自药用原料丹参的丹参酮提取物、阿魏酸、藁本内酯、葛根素为有效成分，与药物中可以接受的辅助添加成分共同组成，所说有效成分的重量组成为：丹酚酸B 2～10份，含有丹参酮II A 0.1～0.5份的丹参酮提取物，阿魏酸0.1～0.5份，藁本内酯0.4～2份，葛根素2～10份。

5.治疗心脑血管疾病的药物组合物，其特征是以丹酚酸B、丹参酮IIA、来自药用原料川芎的川芎酚酸提取物、藁本内酯、葛根素为有效成分，与药物中可以接受的辅助添加成分共同组成，所说有效成分的重量组成为：丹酚酸B 2～10份，丹参酮IIA0.1～0.5份，含有阿魏酸0.1～0.5份的川芎酚酸提取物，藁本内酯0.4～2份，葛根素2～10份。

6.治疗心脑血管疾病的药物组合物，其特征是以丹酚酸B、丹参酮II A、阿魏酸、来自药用原料川芎的川芎挥发油提取物、葛根素为有效成分，与药物中可以接受的辅助添加成分共同组成，所说有效成分的重量组成为：丹酚酸B 2～10份，丹参酮IIA0.1～0.5份，阿魏酸0.1～0.5份，含有藁本内酯0.4～2份的川芎挥发油提取物，葛根素2～10份。

7.治疗心脑血管疾病的药物组合物，其特征是以丹酚酸B、丹参酮II A、阿魏酸、藁本内酯、来自药用原料葛根的葛根黄酮提取物为有效成分，与药物中可以接受的辅助添加成分共同组成，所说有效成分的重量组成为：丹酚酸B 2～10份，丹参酮HA0.1～0.5份，阿魏酸0.1～0.5份，藁本内酯0.4～2份，含有葛根素2～10份的葛根黄酮提取物。

8.如权利要求1至7之一所述的药物组合物，其特征是为口服制剂。

9.制备权利要求1至8之一所述治疗心脑血管疾病的药物组合物的方法，其特征是分别由药用原料丹参、川芎和葛根得到所说的有效成分后，按所说比例与药物中可以接受的辅助添加成分制备而成。

10.如权利要求4所述治疗心脑血管疾病的药物组合物的制备方法，其特征是所说有效成分中的丹参酮提取物采用下述方式之一制备得到：

方法1：以超临界二氧化碳循环逆流方式对粉碎后的丹参进行萃取后分离，得到有效成分丹参酮提取物；

方法2：用体积含量≥80％的乙醇溶液对粉碎后的丹参进行提取后，提取液除去乙醇，沉淀，过滤，得到有效成分丹参酮提取物；

方法3：用体积含量≥80％的乙醇溶液对粉碎后的丹参进行提取，提取液除去乙醇，浓缩，干燥，得到有效成分丹参酮提取物。

11.如权利要求3所述所述所述治疗心脑血管疾病的药物组合物的制备方法，其特征是所说有效成分中的丹参酚酸提取物采用下述方式之一制备得到：

方法1：由药用原料丹参提取丹参酮提取物后，剩余物经水或体积含量≤80％的乙醇-水混合溶剂提取，回收溶媒，浓缩，干燥，得到有效成分丹参酚酸提取物；

方法2：由药用原料丹参提取丹参酮提取物后，剩余物经水或体积含量≤80％的乙醇-水混合溶剂提取，水提液或除去乙醇后的提取液，经大孔树脂柱吸附和水洗涤除杂后，用乙醇体积含量为40～80％的醇-水混合液洗脱，收集洗脱液并除去乙醇，浓缩，干燥，得到有效成分丹参酚酸提取物。

12.如权利要求6所述治疗心脑血管疾病的药物组合物的制备方法，其特征是所说有效成分中的川芎挥发油提取物采用下述方式之一制备得到：

方法1：以超临界二氧化碳循环逆流方式对粉碎后的川芎进行萃取后，分离，得到有效成分川芎挥发油提取物；

方法2：取川芎，粉碎，用低沸点的有机溶剂提取，分离除去提取有机溶剂后，得到有效成分川芎挥发油提取物，所说的提取溶剂为石油醚、汽油、6号溶剂油、正己烷和环己烷中的至少一种；

方法3：取川芎，用体积含量≥80％的乙醇溶液进行提取，提取液除去乙醇，浓缩，干燥，得到有效成分川芎挥发油提取物。

13.如权利要求5所述治疗心脑血管疾病的药物组合物的制备方法，其特征是所说有效成分中的川芎酚酸提取物采用下述方式之一制备得到：

方法1：由药用原料川芎提取川芎挥发油提取物后，剩余物以水或体积含量≤80％的乙醇-水混合溶剂提取，回收溶媒，浓缩，干燥，得到有效成分川芎酚酸提取物；

方法2：由药用原料川芎提取川芎挥发油提取物后，剩余物以水或体积含量≤80％的乙醇-水混合溶剂提取，水提液或除去乙醇后的提取液，经大孔树脂柱吸附和水洗涤除杂后，用乙醇体积含量为30～70％的醇-水混合液洗脱，收集洗脱液并除去乙醇，浓缩，干燥，得到有效成分川芎酚酸提取物。

14.如权利要求7所述治疗心脑血管疾病的药物组合物的制备方法，其特征是所说有效成分中的葛根黄酮提取物采用下述方式之一制备得到：

方法1：葛根粉碎，水煎煮后过滤，滤液经大孔树脂柱吸附和水洗涤除杂后，用乙醇体积含量为60～80％的醇-水混合液洗脱，收集洗脱液并除去乙醇，浓缩，干燥，得到有效成分的葛根黄酮提取物；

方法2：葛根粉碎，用水或体积含量≤80％的乙醇-水混合溶剂提取，回收溶媒，浓缩，干燥，得到有效成分的葛根黄酮提取物。