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CN1200763A - 来自幽门螺杆菌的新型粘附素 - Google Patents

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CN1200763A
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S·奥登雷特
T·F·迈耶
A·比鲁姆
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Abstract

本发明涉及一种来自幽门螺杆菌的粘附基因、由其编码的多肽和针对该多肽的抗体。

Description

来自幽门螺杆菌的新型粘附素
本发明涉及来自幽门螺杆菌的新型粘附素基因alpB和由其编码的多肽。可将基因、多肽和针对该多肽的一种抗体用于诊断、预防和治疗螺杆菌感染。
很久以来已知在人胃粘膜中螺旋细菌的存在(Bizzozero，1893)。然而直到由Marshall和Warren从一个胃溃疡患者的胃粘膜中成功分离和培养了这种细菌(Marshall和Warren，1983；Marshall等，1984)才意识到这些是病原菌。首次分析表明所分离的微生物是有极高运动性而具有能够在强酸性环境中(高达大约pH1.5)存活的不寻常能力的革兰氏阴性螺旋细菌。基于生物化学和形态学特征，最后将最初被称为幽门弯曲菌的细菌归类于新确定的属“螺杆菌”(Goodwin等，1989)。
在几年内更加明确了幽门螺杆菌感染的重要性和这个发现的影响。由Taylor和Blaser的流行病学调查(1991)表明幽门螺杆菌感染在世界范围内发生，并且大约50％的人被这种细菌感染，在发展中国家感染率高于发达国家。另外观察到随着年龄的增长慢性幽门螺杆菌感染的可能性明显增加。因而幽门螺杆菌感染是人最常见的慢性细菌感染之一。
目前已知在人类中这种感染不可避免地引起细菌性胃炎(B型胃炎)的诱发。而且据推测幽门螺杆菌还在胃和十二指肠溃疡以及一些类型胃癌(腺癌)的发展中发挥起因的作用(Lee等，1993；Solnick和Tompkins，1993)。甚至连更罕见并被认为是免疫系统B细胞淋巴瘤前体的胃MALT(粘膜相关淋巴组织)淋巴瘤也可能是幽门螺杆菌感染的一个结果。对这些患者进行成功清除(全部清除)幽门螺杆菌的抗菌治疗引起胃溃疡和低级MALT淋巴瘤的治愈(Sipponen和Hyvarinen，1993；Isaacson和Spencer，1993；Stolte和Eidt，1993)。
幽门螺杆菌长期感染的一个后遗症是萎缩性胃炎，一种被看作是癌前病变的胃上皮分泌粘液、酸或胃蛋白酶的细胞的退化。根据在1980年世界性发生率最高的癌症类型的统计，胃癌是在第二位但具有下降的趋势(Parkin等，1988)。两项研究最近显示在幽门螺杆菌感染和胃癌(肠型)的发生之间有一个统计学显著的相关性，它们都得出了所有发生的胃癌中大约60％可能是由于幽门螺杆菌感染的结论(Parsonnet等，1991；Nomura等，1991)。另外，Sipponen(1992)的研究表明在许多工业化国家被感染者20％以上在他们的一生中罹患胃或十二指肠溃疡，而这个风险在具有正常胃粘膜的人中小得可忽略。这意味着这些常见的胃-十二指肠疾病必须被看作是感染性疾病，并恰当地治疗(Alper，1993)。清除已存在的慢性幽门螺杆菌感染的治疗导致胃炎、胃或十二指肠溃疡或MALT淋巴瘤的治愈。因此防止幽门螺杆菌感染的预防性治疗(如免疫)和清除已存在的螺杆菌感染的治疗可被用来治疗这些常见的胃-十二指肠疾病。
以前除了一些较高等灵长类，人是幽门螺杆菌唯一已知的天然宿主。最近，家猫也能被幽门螺杆菌感染的发现在这些细菌在人体外传播和可能的宿主问题上提出新的观点。偶尔成功的取自感染者粪便的幽门螺杆菌培养和细菌在水中存活数月的能力支持粪-口传播的假设。在家庭研究的基础上直接口-口传播也被看作是可能的。由于狭窄的生活条件和差的卫生标准与感染率正相关，在家庭内感染通常发生在童年。
经口摄入后细菌首先到达极酸的胃腔(pH1-2)。在这里通过产生使存在的尿素分解从而局部中和胃中酸性pH值的尿素酶，使得细菌的存活成为可能。通过趋化性的定位和鞭毛依赖的运动，微生物然后迁移入实际上是它们天然栖息地的碳酸氢盐缓冲的胃窦区粘膜层。在此由于酸屏障，它们处于一个只有一些竞争性的细菌种类可以接近的独特的生态学小生境中。为了达到上皮，这些微生物可能通过在胃腔(pH1-2)和上皮细胞表面(pH6-7)之间的pH梯度来定向。由于它们的螺旋形状、它们在粘液中的运动性、粘液修饰酶的产生以及最后它们生存的微需氧方式，这些细菌最适应这个小生境中的生存条件。
它们通常生活在保护它们免受如酸、胃蛋白酶和用来清除它们的药物如抗生素等外部影响的窦区深隐窝中。部分细菌(大约20％)与上皮细胞特别是产粘液细胞相关。在胃组织转化即在十二指肠中酸诱导胃上皮形成的条件下，组织转化区也在十二指肠中定位，这产生十二指肠溃疡发生的前提条件。幽门螺杆菌随着所分泌粘液的完全排泄可能被它们的粘附能力阻止，以便细菌能够持续数年、数十年甚至终生(慢性感染)。
在了解对于溃疡病幽门螺杆菌的存在和意义之前，用所谓的制酸剂或H2受体拮抗剂来治疗这些病。这些是抑制胃壁细胞分泌酸的物质。这些药物的作用通常引起溃疡的治愈，但由此并未清除这些溃疡的原因之一即幽门螺杆菌感染，故在大部分情况下在短时间后便发生溃疡的再现(复发)。
另一常用的溃疡疗法是铋治疗。各种铋盐(CBS、BSS)对幽门螺杆菌有杀菌的作用。然而只在8-32％的病例中实现了这些细菌的全部清除。该疗法明显引起细菌暂时的抑制，但中止治疗后在大多数情况下感染重新发作。长期的高剂量治疗引起该物质在肝脏、肾脏和神经系统的蓄积并具有很大的神经学副作用(Malfertheiner，1994)。
由于已经揭示了胃十二指肠溃疡病是感染性疾病，所以治疗的一个目标是通过抗生素清除病原体。然而，各种抗生素(阿莫西林、硝基呋喃、furazolidin、红霉素)的单一疗法已被证明是不令人满意的，因为在这种情况下只在0-15％的病例中实现细菌的清除。目前通过能够导致高达80％清除率的一种制酸剂(奥美拉唑)和一种抗生素(阿莫西林)的联合达到最成功的治疗。然而，由于必须推测细菌将迅速发展对抗生素的抗性，故抗生素治疗来清除幽门螺杆菌作为一种长期治疗方法是没有保证的。
因而需要一种新形式的疗法来控制幽门螺杆菌感染，特别是特异性针对幽门螺杆菌毒力因子的疫苗。毒力因子指尽管有宿主机体的免疫反应和非特异的防御反应，但仍使病原菌能够在宿主体内定位于一个特异的生态学小生境并在其中复制的病原菌的特性。因而关于毒力因子的知识帮助较好地理解一种感染性疾病的原因和机制。以前检测的幽门螺杆菌最重要的毒力因子是尿素酶、鞭毛、粘附素和细胞毒素的产生。
尿素酶，在细菌表面的一种酶，由构成高达5％全部细菌蛋白的两个亚单位(UreA，26kDa，UreB，66kDa)所组成。尿素酶将胃液中低浓度存在的尿素分解为氨和二氧化碳。根据目前的观点，细菌被导致局部胃液中酸中和的氨包围。细菌极高的运动性可以归功于使细菌能够在胃粘膜的粘液中运动并达到上皮细胞层的极性鞭毛的存在。将尿素酶基因簇(ureA-ureH)和形成鞭毛的基因(flaA，flaB)克隆到大肠杆菌中并测序，并且构建了同基因突变体。
所有分离的幽门螺杆菌菌株中大约50-60％都产生一种87kDa蛋白质，即所谓的空泡化细胞毒素，其在体外细胞培养中诱导胞浆空泡的形成。同时还克隆并在遗传学上分析了编码幽门螺杆菌细胞毒素的vacA基因。另外，推测产细胞毒素菌株比不产生这种毒素的菌株具有更高的致病能力。此外，在细胞毒素的产生和胃溃疡的发展之间发现了一种正相关性。
体外对于幽门螺杆菌对上皮细胞系粘附的研究表明细菌可以结合不同组织的许多细胞系。相反，幽门螺杆菌在宿主生物中表现出一种非常明显的物种和组织选择性粘附。因此，发现该细菌只结合于属于胃型上皮细胞的上皮细胞。由一种细菌粘附素和一种特异性细胞受体之间的一种特异性相互作用解释了这种选择性。
直至今日，已经描述了幽门螺杆菌的几种潜在的粘附素，而且克隆并测序了一个编码一种所谓的N-乙酰神经氨酸基乳糖结合血凝素的基因(hpaA)(Evans等，1993)。这是一种被猜测识别细胞表面一含有唾液酸的受体的蛋白。然而，这种粘附素对于幽门螺杆菌感染的意义是有争议的。其他潜在的粘附素只通过其分子量或其受体结合特异性进行了鉴定。这些包括一种似乎与铜绿假单胞菌的胞外酶S(一种具有ADP-核糖转移酶活性的粘附素)同源的63kDa蛋白质。另外，据推测还有一个未鉴定出的介导一种对胃上皮细胞Lewisb血型抗原的特异性结合的粘附素(Falk等，1993；Boren等，1993)。
幽门螺杆菌感染导致胃粘膜的一种慢性炎症反应(胃炎)。另外诱导了一种对幽门螺杆菌抗原的特异性系统免疫反应。然而还未完全弄清胃中分泌性抗体(sIgA)的形成。作为炎症的结果，各种免疫细胞存在于胃粘膜或粘膜下，如多形核白细胞、单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和浆细胞(Blaser，1992)。另外，幽门螺杆菌在体外激活中性粒细胞以及单核细胞和巨噬细胞(Mai等，1991)。特异性抗体和补体的实验表明了在体外通过中性粒细胞对幽门螺杆菌的快速灭活。然而，在体内情况下，这些机制并未引起病原菌的灭活。幽门螺杆菌虽然激活前面提到的防御机制，但其如何在宿主内长期存活还不清楚。
在自然条件下宿主不能对付幽门螺杆菌感染。因而更惊人的是尿素酶，幽门螺杆菌的一种重要毒力因子(见上)，作为一种疫苗具有巨大的潜力(美国专利申请USSN 07/970,996基于尿素酶的抗幽门螺杆菌感染疫苗)。
在猫螺杆菌/小鼠模型(猫螺杆菌是一种天然定位于猫的胃中并也能感染小鼠的螺杆菌)中能够表明幽门螺杆菌尿素酶或重组尿素酶B亚单位(rUreB)的经口免疫可以保护小鼠免受猫螺杆菌感染(预防性疫苗)并还可以清除已存在的感染(治疗性疫苗)(Michetti等，1994；Corthesy-Theulaz等，《胃肠病学》(Gastroenterol)，出版中)。经口免疫中的一个决定性因素是佐剂的使用，如白喉毒素，其似乎对于从产生系统性抗体到产生分泌性抗体的免疫反应的转换中是重要的。
本发明的目的是提供来自幽门螺杆菌的新的分泌性基因以及由其编码的作为疫苗潜在的候选者的多肽。
在德国专利申请195 21 312.2中描述了一个用于从幽门螺杆菌中鉴定分泌性基因的方法，其中在转座子的协助下建立了一个幽门螺杆菌的突变基因库，并分析了这个突变体库在粘附行为上的缺陷，如对人胃上皮细胞。以这种方式鉴定一个被称为alpA的粘附素基因以及一个由该基因编码的多肽。
在克隆位于alpA下游的侧翼区时，鉴定了一个来自幽门螺杆菌被称为alpB的具有在序列号1中所示核苷酸序列的新的粘附素基因和一个由该基因编码的具有在序列号1和2中所示氨基酸序列的多肽。
因此本发明的一个主要内容是一种DNA分子，其包括：
(a)在序列号1中所示的核苷酸序列
(b)在遗传密码简并性范围内与(a)的序列相应的核苷酸序列或
(c)在严格条件下与(a)或/和(b)的序列杂交的核苷酸序列。
除了在序列号1中所示的核苷酸序列和一个在遗传密码简并性范围内与该序列相应的核苷酸序列外，本发明还包括一个在严格条件下与这些序列中的某一个杂交的DNA序列。根据本发明的术语“杂交”是按照由Sambrook等的描述(《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning.ALaboratoryManual)，冷泉港实验室出版社(1989)，1.011到1.014)使用的。根据本发明，在严格条件下的杂交意味着在用1×SSC和0.1％SDS在55℃优选在62℃特别优选68℃下洗涤1小时，特别是在0.2×SSC和0.1％ SDS在45℃优选62℃特别优选68℃下洗涤1小时后仍可以观察到一个阳性杂交信号。本发明包括在这种洗涤条件下与在序列号1中所示核苷酸序列或在遗传密码简并性范围内相应的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
根据本发明的DNA分子优选编码一个具有粘附于人的细胞特别是人胃上皮细胞之能力的多肽。另外，根据本发明的DNA分子与在序列号1中所示的核苷酸序列在核苷酸水平上具有至少70％，特别优选至少80％的同源性。另外，优选DNA分子具有至少15个优选至少20个核苷酸的长度。
在序列号1中所示的粘附素基因alpB的DNA序列编码一518个氨基酸的多肽。这个被称为AlpB的多肽的氨基酸序列示于序列号1和2中。AlpB氨基酸序列的N-末端区的分析表明该多肽具有一经典的原核信号序列。AlpB和于德国专利申请195 21 312.2中所述的氨基酸序列示于序列号3和4中的多肽AlpA之间在氨基酸水平上的比较表明在两种多肽中全部氨基酸序列的46％是相同的。C-末端部分(氨基酸341-518)甚至表现出66％的相似性。
通过在alpB基因上的两个不同位点上插入转座子TnMax9而产生的alpB基因缺陷突变体并不与胃上皮细胞的组织部分结合。因为在这些alpB突变体中检测到了AlpA的稳定表达，故alpB突变体粘附的丧失一定是alpB基因的缺陷造成的。
在AlpA和AlpB之间有一个功能性的连接，因而认为AlpA和AlpB之间可能共同形成一个复合物。这种复合物可表现为一种可有效地作为功能性粘附素的异源二聚体或/和多聚体。AlpA或AlpB的任一个亚单位的丢失可以导致粘附素复合物功能的丧失，从而导致细菌的粘附缺陷。
因而，本发明的另一主要内容是含有被融合在一起的alpB基因和alpA基因序列区的一种DNA分子。特别是一种其中将上述在(a)、(b)和(c)下所定义的序列与
(d)在序列号3中所示的核苷酸序列
(e)在遗传密码简并性范围内与(d)的序列相应的核苷酸序列或
(f)在严格条件下与(d)或/和(e)的序列杂交的核苷酸序列相融合的DNA分子。
这样一种融合的DNA分子的一个优选的例子含有分别来自粘附素基因alpB(序列号1)和alpA(序列号3)一个或几个部分。这些部分的长度优选至少18个核苷酸，特别优选至少30个核苷酸而最优选至少60个核苷酸。
本发明的另一个主要内容是一种含有至少一个拷贝本发明的DNA分子的载体。这种载体可以是在其中优选将本发明的DNA序列定位于一个表达信号(启动子、操纵子、增强子等)控制下的任何原核或真核载体。原核载体的实例是如噬菌体(例如λ噬菌体)的染色体载体和如质粒的染色体外载体，其中特别优选环形质粒载体。例如由Sambrook等，同前，1到4章描述了适宜的原核载体。
在另一方面，根据本发明的载体还可以是一种如酵母载体或适于高等细胞的真核载体(例如质粒载体、病毒载体、植物载体)。例如由Sambrook等，同上，16章描述了这些载体。
而本发明的另一主要内容是一种由本发明的载体所转化的细胞。在一优选的实施方案中，细胞为原核细胞，优选革兰氏阴性原核细胞，特别优选大肠杆菌细胞。然而，在另一方面，本发明的细胞也可以为一种如真菌细胞(如酵母)、动物细胞或植物细胞的真核细胞。
本发明还涉及本发明的DNA分子所编码的多肽。这种多肽优选能够粘附于人细胞并含有(a)在序列号2中所示的氨基酸序列或(b)一种同根据(a)的序列有免疫学交叉反应的氨基酸序列。
根据本发明的多肽优选同在序列号2中所示的氨基酸序列具有至少80％最优选至少90％的同源性。
根据本发明的多肽优选是通过用本发明的DNA分子或载体转化细胞，并在进行多肽表达的条件下培养所转化的细胞，然后从细胞或/和培养上清中分离多肽来制备的。在这个过程中，根据本发明的多肽可以以融合多肽也可以以非融合多肽形式获得。
而本发明的另一主要内容是各自含有来自多肽AlpB(序列号2)和AlpA(序列号4)的一个或几个片段的融合多肽。这些片段的长度至少为6个，优选至少10个，最优选至少20个氨基酸。
由于AlpB蛋白可与DE195 21 312.2中所公布的AlpA蛋白形成一个有功能活性的复合物，本发明还涉及含有至少两个多肽元件的多肽复合物，其中第一个元件由alpB序列或由其衍生的序列编码，第二个元件由alpA序列或由其衍生的序列，特别是由一种包括
(d)在序列号3中所示的核苷酸序列
(e)在遗传密码简并性范围内与(d)的序列相应的核苷酸序列或
(f)在严格条件下与(d)或/和(e)的序列杂交的核苷酸序列的DNA分子所编码。
第二种多肽即复合物的AlpA成分优选含有序列号4中所示的氨基酸序列、与该序列至少80％且优选至少90％同源的氨基酸序列或与这些序列发生免疫学交叉反应的氨基酸序列。
本发明的多肽AlpB或其部分可被用作免疫原来制备抗体。因而本发明还涉及一种针对本发明多肽或复合物的抗体。抗体优选针对N-末端例如序列号2中所示氨基酸序列的前340个特别是前250个氨基酸。
本发明的另一方面涉及一种含有本发明的DNA分子、本发明的多肽、本发明的多肽复合物或本发明的抗体作为活性物质，并任选性地加入常见的药物辅助物质、稀释剂、添加剂和载体的药物组合物。
本发明的药物组合物一方面可用于诊断幽门螺杆菌感染。优选通过利用含有本发明的特异性针对alpB基因DNA序列的杂交探针或通过利用本发明的DNA分子作为引物的扩增来进行核酸水平上的诊断。在蛋白质水平上优选在本发明的抗体的协助下进行诊断。
在另一方面，该药物组合物还可用于预防或治疗幽门螺杆菌感染。对于治疗性应用，将AlpB多肽或其部分选择性地同AlpA多肽或其部分一起用于制备一种主动免疫疫苗或将抗体用于制备一种被动免疫疫苗。
将通过下述实施例和附图来进一步阐明本发明。
图1显示了含有调节区域和alpA基因(序列号3)5′末端的质粒pMu140的限制性图谱。通过插入转座子TnMax9(见三角形标记的TnMax9)使alpA基因失活。当质粒表达时，获得一种alpA-β-内酰胺酶融合蛋白。pMu140是来自突变基因库的原始克隆，通过再转化和同源重组从该基因库获得粘附缺陷性幽门螺杆菌菌株P1-140。
图2展示了含有alpB基因的一部分和全部alpB基因(序列号1)的质粒pMT5的限制性图谱。将复制起点orifd和来自转座子TnMax9的氯霉素转移酶基因catGC用于突变的alpA基因位点和侧翼alpB基因区的选择性反克隆。Res指TnMax9的解离位点，而IR指转座子的反向重复序列。M13-FP和M12-RP1指含有M12正向和反向测序引物的序列区域。在克隆位点SacI和StuI之间的接头区来自质粒pBluescript II KS。
图3显示粘附素AlpA和AlpB之间氨基酸序列的比较。(A)利用GCG程序BESTFIT(Devereux等，1984)进行序列比较，并覆盖完整的多肽AlpA和AlpB。垂直的线表示相同的氨基酸；点表示保守的氨基酸置换。在序列的末端注明了两序列之间的相似性或同一性程度。(B)在可能负责蛋白质整合到细菌外膜中的两种多肽的C-末端区域(位点341-518)中可看到显著高的同一性程度。以一个苯丙氨酸(F)结束的5个氨基酸的C-末端区域也是典型的，这在革兰氏阴性细菌的分泌蛋白情况下表明外膜中的插入(Struyvé等，1991)。
序列号1表示幽门螺杆菌粘附基因alpB的核苷酸序列和对应的氨基酸序列。
序列号2表示来自幽门螺杆菌的AlpB粘附多肽的氨基酸序列。
序列号3表示幽门螺杆菌粘附基因alpA的核苷酸序列和对应的氨基酸序列。
序列号4表示来自幽门螺杆菌的AlpA粘附多肽的氨基酸序列。
实施例1
一个幽门螺杆菌质粒基因库的构建
建立了一个幽门螺杆菌野生型菌株69A的染色体DNA的质粒基因库。通过Leying等(1992)的方法从幽门螺杆菌中分离染色体DNA并分别用限制性内切酶Sau3A I和Hpa II部分酶切。随后在一制备性琼脂糖凝胶中分离DNA片段并从凝胶中洗脱3-6kb的片段。将这些DNA片段连接到为此目的而特殊构建的并已用限制性酶Bgl II和Cla I切开的质粒载体pMin2中，并连接(T4连接酶)，用连接混合物转化衍生自菌株HB101的含有溶原性λ噬菌体λCH616并已经用转座子TnMax9转化的大肠杆菌菌株E181(Bayer和Roulland-dussoix，1969)中。在这个过程中获得了大约2400个独立的转化子。
将含有最小载体pMin2的大肠杆菌菌株DH5α以保藏号10007保存在“Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSM)”，Mascheroder Weg lb，D-38124 Braunschweig中。含有转座子衍生物pTnMax9的大肠杆菌菌株E181以保藏号10008保存在DSM中。
实施例2
幽门螺杆菌突变体的分离
为了进行转座子诱变，每10个转化子收集在一起，并相互诱导，这意味着总共进一步处理了190组，每个10-20个克隆。从这个独立带有突变的幽门螺杆菌基因的突变中分离了191个氨苄青霉素抗性的大肠杆菌质粒克隆。从大肠杆菌中分离这192个质粒并用于幽门螺杆菌菌株69A的再转化。从这些在编码分泌蛋白的基因中可能突变了的192个转化中分离了135个幽门螺杆菌突变体。然后在对已丧失结合Kato III上皮细胞能力的幽门螺杆菌突变体的筛选检测中检测幽门螺杆菌突变体群。
为此，用FITC标记突变体并在37℃同上皮细胞培养1小时。通过用一荧光显微镜观察直接进行粘附检测。在这种情况下发现了2个表现出粘附性大大降低的突变体(P1-140和P1-179a号)。
两个突变体在第二个粘附模型即人胃的组织切片中也表现出缺乏粘附性。幽门螺杆菌野生型菌株和所有其它突变体在这个模型中仍表现出了强的粘附性。
在图1中展示了用来制备突变体菌株P1-140的质粒pMu140。质粒pMu179a(未示)用来制备突变体菌株P1-179a。两个质粒分别转化到幽门螺杆菌69A中导致证明在细菌染色体中无二次突变发生的确定的粘附缺陷，而不是在克隆的粘附素基因中TnMax9的插入导致所观察到的幽门螺杆菌突变体表型。由转座子TnMax9灭活的质粒克隆pMu140和pMu179基因的作图和测序表明两个克隆是同样的基因，只是转座子被插入不同的位点。因为所编码的蛋白是一种脂蛋白，即由一脂质锚锚定在膜中的蛋白质，故对应的基因被称为AlpA(粘附相关脂蛋白A)。我们从膜蛋白和某些保守蛋白在蛋白C-末端序列(C-末端苯丙氨酸；struyve等，1991)的计算机二级结构预测所得的资料支持嵌入革兰氏阴性细菌外膜的整合膜蛋白的观点。
实施例3
alpB粘附基因的鉴定
在AlpB基因位点的遗传学鉴定过程中，将侧翼基因组序列克隆到大肠杆菌中并测序。通过从幽门螺杆菌染色体反克隆(back-cloning)TnMax9插入实现下游alpA侧翼区域的克隆。用限制性内切酶SalI和StuI切割突变体P1-179a(见实施例2)的染色体DNA，用T4连接酶将所形成的DNA片段同来自质粒pBluescript II KS多接头的SacI-Hinc II片段环化，并转化到大肠杆菌E131感受态细胞中，并用氯霉素筛选。
由于只有通过TnMax9在染色体中插入的复制起点orifd和定位在TnMax9中的氯霉素抗性基因才能发生复制与增殖，故所获得的所有转化子均应含有突变的alpA基因并具有侧翼序列。进一步分析了所获重组质粒中的一个pMT5(图2)。
pMT5的测序和由此构建的亚克隆表明在alpA基因后(终止密码子后67个核苷酸)有另一个编码一个518个氨基酸的多肽并被称为alpB(序列号1和2)开放读框的起点。基于遗传学结构，可以设想一个操纵子、alpA和alpB可能由同一个启动子转录(多顺反子mRNA)。
AlpB基因产物具有与AlpA完全相同数目的氨基酸。AlpB多肽序列N-末端区的分析表明存在一个经典的代表分泌性多肽的原核信号序列。AlpA和AlpB之间在氨基酸水平上的比较显示全部多肽有46％的相同性。C-末端部分(氨基酸341-518)显示66％的相同性(图3)。
实施例4
粘附基因AlpA和AlpB之间的功能联系
为了研究AlpA和AlpB之的功能联系，在alpB基因的不同位点上(位点97和位点1108)引入两个TnMax9转座子插入并通过自然转化转入幽门螺杆菌69a的基因组中。通过DNA印迹杂交证实转座子在幽门螺杆菌染色体中的正确插入以及因而alpB基因的失活。
分析所获得的alpB缺陷突变体结合胃上皮细胞的能力。发现两种alpB突变体不结合来自组织切片的胃上皮细胞。
通过免疫印迹能够证实AlpA在alpB突变体中的稳定表达。这表明，AlpB直接负责alpB突变体的粘附缺陷。作为结构预测和两种多肽C-末端区域高度同源性的结果，可以设想AlpB也是被插入到细菌外膜中而存在，并且可能与AlpA形成一个复合物。这个复合物可能以一个异二聚体或多聚体的集合物作为有效的功能性粘附素。而一个亚单位无论AlpA或AlpB的缺失都导致粘附素复合物功能的丧失，因而可以引起细菌的粘附缺陷。
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                        序列表
(1)一般信息：
   (i)申请人：
      (A)姓名：Max-Planck-Gesellschaft zur Foerderung der
             Wissenschaften e.V.Berlin
      (B)街：Hofgartenstr.2
      (C)城市：慕尼黑
      (E)国家：德国
      (F)邮政编码：80539
   (ii)发明题目：来自幽门螺杆菌的新型粘附素
   (iii)序列数：4
   (iv)计算机可读形式：
      (A)媒体类型：软盘
      (B)计算机：IBM PC兼容
      (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
      (D)软件：PatentIn Release #1.0，版本#1.30(EPA)
(2)序列号1的资料：
   (i)序列特征：
      (A)长度：1557个碱基对
      (B)类型：核苷酸
      (C)成线类型：双链
      (D)拓扑结构：线性
   (ii)分子类型：基因组DNA
   (vi)初始来源：
      (A)生物：幽门螺杆菌
   (vii)直接来源：
      (B)克隆：alpB
   (ix)特征：
      (A)名称：CDS
   (B)位置：1..1554
(xi)序列描述：序列号1：ATG ACA CAA TCT CAA AAA GTA AGA TTC TTA GCC CCT TTA AGC CTA GCG        48Met Thr Gln Ser Gln Lys Val Arg Phe Leu Ala Pro Leu Ser Leu Ala1               5                  10                  15TTA AGC TTG AGC TTC AAT CCA GTG GGC GCT GAA GAA GAT GGG GGC TTT        96Leu Ser Leu Ser Phe Ash Pro Val Gly Ala Glu Glu Asp Gly Gly Phe
         20                  25                  30ATG ACC TTT GGG TAT GAA TTA GGT CAG GTG GTC CAA CAA GTG AAA AAC       144Met Thr Phe Gly Tyr Glu Leu Gly Gln Val Val Gln Gln Val Lys Asn
     35                  40                  45CCG GGT AAA ATC AAA GCC GAA GAA TTA GCC GGC TTG TTA AAC TCT ACC       192Pro Gly Lys Ile Lys Ala Glu Glu Leu Ala Gly Leu Leu Asn Ser Thr
 50                  55                  60ACA ACA AAC AAC ACC AAT ATC AAT ATT GCA GGC ACA GGA GGC AAT GTC       240Thr Thr Asn Ash Thr Asn Ile Asn Ile Ala Gly Thr Gly Gly Asn Val65                  70                  75                  80GCC GGG ACT TTG GGC AAC CTT TTT ATG AAC CAA TTA GGC AAT TTG ATT       288Ala Gly Thr Leu Gly Asn Leu Phe Met Asn Gln Leu Gly Asn Leu Ile
            85                   90                  95GAT TTG TAT CCC ACT TTG AAC ACT AGT AAT ATC ACA CAA TGT GGC ACT       336Asp Leu Tyr Pro Thr Leu Asn Thr Ser Asn Ile Thr Gln Cys Gly Thr
        100                 105                 110ACT AAT AGT GGT AGT AGT AGT AGT GGT GGT GGT GCG GCC ACA GCC GCT       384Thr Asn Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Gly Gly Ala Ala Thr Ala Ala
    115                 120                 125GCT ACT ACT AGC AAT AAG CCT TGT TTC CAA GGT AAC CTG GAT CTT TAT       432Ala Thr Thr Ser Asn Lys Pro Cys Phe Gln Gly Asn Leu Asp Leu Tyr
130                 135                 140AGA AAA ATG GTT GAC TCT ATC AAA ACT TTG AGT CAA AAC ATC AGC AAG       480Arg Lys Met Val Asp Ser Ile Lys Thr Leu Ser Gln Asn Ile Ser Lys145                 150                 155                 160AAT ATC TTT CAA GGC AAC AAC AAC ACC ACG AGC CAA AAT CTC TCC AAC       528Asn Ile Phe Gln Gly Asn Asn Asn Thr Thr Ser Gln Asn Leu Ser Asn
            165                 170                 175CAG CTC AGT GAG CTT AAC ACC GCT AGC GTT TAT TTG ACT TAC ATG AAC       576Gln Leu Ser Glu Leu Asn Thr Ala Ser Val Tyr Leu Thr Tyr Met Asn
        180                 185                 190TCG TTC TTA AAC GCC AAT AAC CAA GCG GGT GGG ATT TTT CAA AAC AAC       624Ser Phe Leu Asn Ala Asn Asn Gln Ala Gly Gly Ile Phe Gln Asn Asn
    195                 200                 205ACT AAT CAA GCT TAT GGA AAT GGG GTT ACC GCT CAA CAA ATC GCT TAT       672Thr Asn Gln Ala Tyr Gly Asn Gly Val Thr Ala Gln Gln Ile Ala Tyr
210                 215                 220ATC CTA AAG CAA GCT TCA ATC ACT ATG GGG CCA AGC GGT GAT AGC GGT       720Ile Leu Lys Gln Ala Ser Ile Thr Met Gly Pro Ser Gly Asp Ser Gly225                 230                 235                 240GCT GCC GCA GCG TTT TTG GAT GCC GCT TTA GCG CAA CAT GTT TTC AAC       768Ala Ala Ala Ala Phe Leu Asp Ala Ala Leu Ala Gln His Val Phe Asn
            245                 250                 255TCC GCT AAC GCC GGG AAC GAT TTG AGC GCT AAG GAA TTC ACT AGC TTG       816Ser Ala Asn Ala Gly Asn Asp Leu Ser Ala Lys Glu Phe Thr Ser Leu
        260                 265                 270GTG CAA AAT ATC GTC AAT AAT TCT CAA AAC GCT TTA ACG CTA GCC AAC       864Val Gln Asn Ile Val Asn Asn Ser Gln Asn Ala Leu Thr Leu Ala Asn
    275                 280                 285AAC GCT AAC ATC AGC AAT TCA ACA GGC TAT CAA GTG AGC TAT GGC GGG       912Asn Ala Asn Ile Ser Asn Ser Thr Gly Tyr Gln Val Ser Tyr Gly Gly
290                 295                 300AAT ATT GAT CAA GCG CGA TCT ACC CAA CTA TTA AAC AAC ACC ACA AAC       960Asn Ile Asp Gln Ala Arg Ser Thr Gln Leu Leu Asn Asn Thr Thr Asn305                 310                 315                 320ACT TTG GCT AAA GTT AGC GCT TTG AAT AAC GAG CTT AAA GCT AAC CCA      1008Thr Leu Ala Lys Val Ser Ala Leu Asn Asn Glu Leu Lys Ala Asn Pro
            325                 330                 335TGG CTT GGG AAT TTT GCC GCC GGT AAC AGC TCT CAA GTG AAT GCG TTT      1056Trp Leu Gly Asn Phe Ala Ala Gly Asn Ser Ser Gln Val Asn Ala Phe
        340                 345                 350AAC GGG TTT ATC ACT AAA ATC GGT TAC AAG CAA TTC TTT GGG GAA AAC      1104Asn Gly Phe Ile Thr Lys Ile Gly Tyr Lys Gln Phe Phe Gly Glu Asn
    355                 360                 365AAG AAT GTG GGC TTA CGC TAC TAC GGC TTC TTC AGC TAT AAC GGC GCG      1152Lys Asn Val Gly Leu Arg Tyr Tyr Gly Phe Phe Ser Tyr Asn Gly Ala
370                375                 380GGC GTG GGT AAT GGC CCT ACT TAC AAT CAA GTC AAT TTG CTC ACT TAT      1200Gly Val Gly Asn Gly Pro Thr Tyr Asn Gln Val Asn Leu Leu Thr Tyr385                 390                 395                 400GGG GTG GGG ACT GAT GTG CTT TAC AAT GTG TTT AGC CGC TCT TTT GGT      1248Gly Val Gly Thr Asp Val Leu Tyr Asn Val Phe Ser Arg Ser Phe Gly
            405                 410                 415AGT AGG AGT CTT AAT GCG GGC TTC TTT GGG GGG ATC CAA CTC GCA GGG      1296Ser Arg Ser Leu ASn Ala Gly Phe Phe Gly Gly Ile Gln Leu Ala Gly
        420                 425                 430GAT ACT TAC ATC AGC ACG CTA AGA AAC AGC TCT CAG CTT GCG AGC AGA      1344Asp Thr Tyr Ile Ser Thr Leu Arg Asn Ser Ser Gln Leu Ala Ser Arg
    435                 440                 445CCT ACA GCG ACG AAA TTC CAA TTC TTG TTT GAT GTG GGC TTA CGC ATG      1392Pro Thr Ala Thr Lys Phe Gln Phe Leu Phe Asp Val Gly Leu Arg Met
450                 455                 460AAC TTT GGT ATC TTG AAA AAA GAC TTG AAA AGC CAT AAC CAG CAT TCT      1440Asn Phe Gly Ile Leu Lys Lys Asp Leu Lys Ser His Asn Gln His Ser465                 470                 475                 480ATA GAA ATC GGT GTG CAA ATC CCT ACG ATT TAC AAC ACT TAC TAT AAA      1488Ile Glu Ile Gly Val Gln Ile Pro Thr Ile Tyr Asn Thr Tyr Tyr Lys
            485                 490                 495GCT GGC GGT GCT GAA GTG AAA TAC TTC CGC CCT TAT AGC GTG TAT TGG      1536Ala Gly Gly Ala Glu Val Lys Tyr Phe Arg Pro Tyr Ser Val Tyr Trp
        500                 505                 510GTC TAT GGC TAC GCC TTC TAA                                          1557Val Tyr Gly Tyr Ala Phe
    515
(2)序列号2的资料：
   (i)序列特征
      (A)长度；518个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (D)拓扑结构：线性
   (ii)分子类型：蛋白质
   (xi)序列描述：序列号2：Met Thr Gln Ser Gln Lys Val Arg Phe Leu Ala Pro Leu Ser Leu Ala1               5                  10                  15Leu Ser Leu Ser Phe Asn Pro Val Gly Ala Glu Glu Asp Gly Gly Phe
         20                  25                  30Met Thr Phe Gly Tyr Glu Leu Gly Gln Val Val Gln Gln Val Lys Asn
     35                  40                  45Pro Gly Lys Ile Lys Ala Glu Glu Leu Ala Gly Leu Leu Asn Ser Thr
 50                  55                  60Thr Thr Asn Asn Thr Asn Ile Asn Ile Ala Gly Thr Gly Gly Asn Val65                  70                  75                  80Ala Gly Thr Leu Gly Asn Leu Phe Met Asn Gln Leu Gly Asn Leu Ile
             85                  90                  95Asp Leu Tyr Pro Thr Leu Asn Thr Ser Asn Ile Thr Gln Cys Gly Thr
        100                 105                 110Thr Asn Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Gly Gly Ala Ala Thr Ala Ala
    115                 120                 125Ala Thr Thr Ser Asn Lys Pro Cys Phe Gln Gly Asn Leu Asp Leu Tyr
130                 135                 140Arg Lys Met Val Asp Ser Ile Lys Thr Leu Ser Gln Asn Ile Ser Lys145                 150                 155                 160Asn Ile Phe Gln Gly Asn Asn Asn Thr Thr Ser Gln Asn Leu Ser Asn
            165                 170                 175Gln Leu Ser Glu Leu Asn Thr Ala Ser Val Tyr Leu Thr Tyr Met Asn
        180                 185                 190Ser Phe Leu Asn Ala Asn Asn Gln Ala Gly Gly Ile Phe Gln Asn Asn
    195                 200                 205Thr Asn Gln Ala Tyr Gly Asn Gly Val Thr Ala Gln Gln Ile Ala Tyr
210                 215                 220Ile Leu Lys Gln Ala Ser Ile Thr Met Gly Pro Ser Gly Asp Ser Gly225                 230                 235                 240Ala Ala Ala Ala Phe Leu Asp Ala Ala Leu Ala Gln His Val Phe Asn
            245                 250                 255Ser Ala Asn Ala Gly Asn Asp Leu Ser Ala Lys Glu Phe Thr Ser Leu
        260                 265                 270Val Gln Asn Ile Val Asn Asn Ser Gln Asn Ala Leu Thr Leu Ala Asn
    275                 280                 285Asn Ala Asn Ile Ser Asn Ser Thr Gly Tyr Gln Val Ser Tyr Gly Gly
290                 295                 300Asn Ile Asp Gln Ala Arg Ser Thr Gln Leu Leu Asn Asn Thr Thr Asn305                 310                 315                 320Thr Leu Ala Lys Val Ser Ala Leu Asn Asn Glu Leu Lys Ala Asn Pro
            325                 330                 335Trp Leu Gly Asn Phe Ala Ala Gly Asn Ser Ser Gln Val Asn Ala Phe
        340                 345                 350Asn Gly Phe Ile Thr Lys Ile Gly Tyr Lys Gln Phe Phe Gly Glu Asn
    355                 360                 365Lys Asn Val Gly Leu Arg Tyr Tyr Gly Phe Phe Ser Tyr Asn Gly Ala
370                 375                 380Gly Val Gly Asn Gly Pro Thr Tyr Asn Gln Val Asn Leu Leu Thr Tyr385                 390                 395                 400Gly Val Gly Thr Asp Val Leu Tyr Asn Val Phe Ser Arg Ser Phe Gly
            405                 410                 415Ser Arg Ser Leu Asn Ala Gly Phe Phe Gly Gly Ile Gln Leu Ala Gly
        420                 425                 430Asp Thr Tyr Ile Ser Thr Leu Arg Asn Ser Ser Gln Leu Ala Ser Arg
    435                 440                 445Pro Thr Ala Thr Lys Phe Gln Phe Leu Phe Asp Val Gly Leu Arg Met
450                 455                 460Asn Phe Gly Ile Leu Lys Lys Asp Leu Lys Ser His Asn Gln His Ser465                 470                 475                 480Ile Glu Ile Gly Val Gln Ile Pro Thr Ile Tyr Asn Thr Tyr Tyr Lys
            485                 490                 495Ala Gly Gly Ala Glu Val Lys Tyr Phe Arg Pro Tyr Ser Val Tyr Trp
        500                 505                 510val Tyr G1y Tyr Ala phe
    515
(2)序列号3的资料：
   (i)序列特征：
      (A)长度：1557个碱基对
      (B)类型：核苷酸
      (C)成线类型：双链
      (D)拓扑结构：线性
   (ii)分子类型：基因组DNA
   (vi)初始来源：
      (A)生物：幽门螺杆菌
   (vii)直接来源：
      (B)克隆：alpA
   (ix)特征：
      (A)名称：CDS
      (B)位置：1..1554
   (xi)序列描述：序列号3：ATG ATA AAA AAG AAT AGA ACG CTG TTT CTT AGT CTA GCC CTT TGC GCT        48Met Ile Lys Lys Asn Arg Thr Leu Phe Leu Ser Leu Ala Leu Cys Ala
520                 525                 530AGC ATA AGT TAT GCC GAA GAT GAT GGA GGG TTT TTC ACC GTC GGT TAT        96Ser Ile Ser Tyr Ala Glu Asp Asp Gly Gly Phe Phe Thr Val Gly Tyr535                 540                 545                 550CAG CTC GGG CAA GTC ATG CAA GAT GTC CAA AAC CCA GGC GGC GCT AAA       144Gln Leu Gly Gln Val Met Gln Asp Val Gln Asn Pro Gly Gly Ala Lys
            555                 560                 565AGC GAC GAA CTC GCC AGA GAG CTT AAC GCT GAT GTA ACG AAC AAC ATT       192Ser Asp Glu Leu Ala Arg Glu Leu Asn Ala Asp Val Thr Asn Asn Ile
        570                 575                 580TTA AAC AAC AAC ACC GGA GGC AAC ATC GCA GGG GCG TTG AGT AAC GCT       240Leu Asn Asn Asn Thr Gly Gly Asn Ile Ala Gly Ala Leu Ser Asn Ala
    585                 590                 595TTC TCC CAA TAC CTT TAT TCG CTT TTA GGG GCT TAC CCC ACA AAA CTC       288Phe Ser Gln Tyr Leu Tyr Ser Leu Leu Gly Ala Tyr Pro Thr Lys Leu
600                 605                 610AAT GGT AGC GAT GTG TCT GCG AAC GCT CTT TTA AGT GGT GCG GTA GGC       336Asn Gly Ser Asp Val Ser Ala Asn Ala Leu Leu Ser Gly Ala Val Gly615                 620                 625                 630TCT GGG ACT TGT GCG GCT GCA GGG ACG GCT GGT GGC ACT TCT CTT AAC       384Ser Gly Thr Cys Ala Ala Ala Gly Thr Ala Gly Gly Thr Ser Leu Asn
            635                 640                 645ACT CAA AGC ACT TGC ACC GTT GCG GGC TAT TAC TGG CTC CCT AGC TTG       432Thr Gln Ser Thr Cys Thr Val Ala Gly Tyr Tyr Trp Leu Pro Ser Leu
        650                 655                 660ACT GAC AGG ATT TTA AGC ACG ATC GGC AGC CAG ACT AAC TAC GGC ACG       480Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Ile Gly Ser Gln Thr Asn Tyr Gly Thr
    665                 670                 675AAC ACC AAT TTC CCC AAC ATG CAA CAA CAG CTC ACC TAC TTG AAT GCG       528Asn Thr Asn Phe Pro Asn Met Gln Gln Gln Leu Thr Tyr Leu Asn Ala
680                 685                 690GGG AAT GTG TTT TTT AAT GCG ATG AAT AAG GCT TTA GAG AAT AAG AAT       576Gly Asn Val Phe Phe Asn Ala Met Asn Lys Ala Leu Glu Asn Lys Asn695                 700                 705                 710GGA ACT AGT AGT GCT AGT GGA ACT AGT GGT GCG ACT GGT TCA GAT GGT       624Gly Thr Ser Ser Ala Ser Gly Thr Ser Gly Ala Thr Gly Ser Asp Gly
            715                 720                 725CAA ACT TAC TCC ACA CAA GCT ATC CAA TAC CTT CAA GGC CAA CAA AAT       672Gln Thr Tyr Ser Thr Gln Ala Ile Gln Tyr Leu Gln Gly Gln Gln Asn
        730                 735                 740ATC TTA AAT AAC GCA GCG AAC TTG CTC AAG CAA GAT GAA TTG CTC TTA       720Ile Leu Asn Asn Ala Ala Asn Leu Leu Lys Gln Asp Glu Leu Leu Leu
    745                 750                 755GAA GCT TTC AAC TCT GCC GTA GCC GCC AAC ATT GGG AAT AAG GAA TTC       768Glu Ala Phe Asn Ser Ala Val Ala Ala Asn Ile Gly Asn Lys Glu Phe
760                 765                 770AAT TCA GCC GCT TTT ACA GGT TTG GTG CAA GGC ATT ATT GAT CAA TCT       816Asn Ser Ala Ala Phe Thr Gly Leu Val Gln Gly Ile Ile Asp Gln Ser775                 780                 785                 790CAA GCG GTT TAT AAC GAG CTC ACT AAA AAC ACC ATT AGC GGG AGT GCG       864Gln Ala Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Asn Thr Ile Ser Gly Ser Ala
            795                 800                 805GTT ATT AGC GCT GGG ATA AAC TCC AAC CAA GCT AAC GCT GTG CAA GGG       912Val Ile Ser Ala Gly Ile Asn Ser Asn Gln Ala Asn Ala Val Gln Gly
        810                 815                 820CGC GCT AGT CAG CTC CCT AAC GCT CTT TAT AAC GCG CAA GTA ACT TTG       960Arg Ala Ser Gln Leu Pro Asn Ala Leu Tyr Asn Ala Gln Val Thr Leu
    825                 830                 835GAT AAA ATC AAT GCG CTC AAT AAT CAA GTG AGA AGC ATG CCT TAC TTG      1008Asp Lys Ile Asn Ala Leu Asn Asn Gln Val Arg Ser Met Pro Tyr Leu
840                 845                 850CCC CAA TTC AGA GCC GGG AAC AGC CGT TCA ACG AAT ATT TTA AAC GGG      1056Pro Gln Phe Arg Ala Gly Asn Ser Arg Ser Thr Asn Ile Leu Asn Gly855                 860                 865                 870TTT TAC ACC AAA ATA GGC TAT AAG CAA TTC TTC GGG AAG AAA AGG AAT      1104Phe Tyr Thr Lys Ile Gly Tyr Lys Gln Phe Phe Gly Lys Lys Arg Asn
            875                 880                 885ATC GGT TTG CGC TAT TAT GGT TTC TTT TCT TAT AAC GGA GCG AGC GTG      1152Ile Gly Leu Arg Tyr Tyr Gly Phe Phe Ser Tyr Asn Gly Ala Ser Val
        890                 895                 900GGC TTT AGA TCC ACT CAA AAT AAT GTA GGG TTA TAC ACT TAT GGG GTG      1200Gly Phe Arg Ser Thr Gln Asn Asn Val Gly Leu Tyr Thr Tyr Gly Val
    905                 910                 915GGG ACT GAT GTG TTG TAT AAC ATC TTT AGC CGC TCC TAT CAA AAC CGC      1248Gly Thr Asp Val Leu Tyr Asn Ile Phe Ser Arg Ser Tyr Gln Asn Arg
920                 925                 930TCT GTG GAT ATG GGC TTT TTT AGC GGT ATC CAA TTA GCC GGT GAG ACC      1296Ser Val Asp Met Gly Phe Phe Ser Gly Ile Gln Leu Ala Gly Glu Thr935                 940                 945                 950TTC CAA TCC ACG CTC AGA GAT GAC CCC AAT GTG AAA TTG CAT GGG AAA      1344Phe Gln Ser Thr Leu Arg Asp Asp Pro Asn Val Lys Leu His Gly Lys
            955                 960                 965ATC AAT AAC ACG CAC TTC CAG TTC CTC TTT GAC TTC GGT ATG AGG ATG      1392Ile Asn Asn Thr His Phe Gln Phe Leu Phe Asp Phe Gly Met Arg Met
        970                 975                 980AAC TTC GGT AAG TTG GAC GGG AAA TCC AAC CGC CAC AAC CAG CAC ACG      1440Asn Phe Gly Lys Leu Asp Gly Lys Ser Asn Arg His Asn Gln His Thr
    985                 990                 995GTG GAA TTT GGC GTA GTG GTG CCT ACG ATT TAT AAC ACT TAT TAC AAA      1488Val Glu Phe Gly Val Val Val Pro Thr Ile Tyr Asn Thr Tyr Tyr Lys
1000                1005                1010TCA GCA GGG ACT-ACC GTG AAG TAT TTC CGT CCT TAT AGC GTT TAT TGG      1536Ser Ala Gly Thr Thr Val Lys Tyr Phe Arg Pro Tyr Ser Val Tyr Trp1015                1020                1025                1030TCT TAT GGG TAT TCA TTC TAA                                          1557Ser Tyr Gly Tyr Ser Phe
            1035
(2)序列号4的资料：
   (i)序列特征：
      (A)长度：518个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (D)拓扑结构：线性
   (ii)分子类型：蛋白质
   (xi)序列描述：序列号4：Met Ile Lys Lys Asn Arg Thr Leu Phe Leu Ser Leu Ala Leu Cys Ala1               5                  10                  15Ser Ile Ser Tyr Ala Glu Asp Asp Gly Gly Phe Phe Thr Val Gly Tyr
         20                  25                  30Gln Leu Gly Gln Val Met Gln Asp Val Gln Asn Pro Gly Gly Ala Lys
     35                 40                   45Ser Asp Glu Leu Ala Arg Glu Leu Asn Ala Asp Val Thr Asn Asn Ile
 50                  55                  60Leu Asn Asn Asn Thr Gly Gly Asn Ile Ala Gly Ala Leu Ser Asn Ala65                  70                  75                  80Phe Ser Gln Tyr Leu Tyr Ser Leu Leu Gly Ala Tyr Pro Thr Lys Leu
             85                  90                  95Ash Gly Ser Asp Val Ser Ala Asn Ala Leu Leu Ser Gly Ala Val Gly
        100                 105                 110Ser Gly Thr Cys Ala Ala Ala Gly Thr Ala Gly Gly Thr Ser Leu Asn
    115                 120                 125Thr Gln Ser Thr Cys Thr Val Ala Gly Tyr Tyr Trp Leu Pro Ser Leu
130                 135                140Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Ile Gly Ser Gln Thr Asn Tyr Gly Thr145                 150                 155                 160ASn Thr Asn Phe Pro Asn Met Gln Gln Gln Leu Thr Tyr Leu Asn Ala
            165                 170                 175Gly Asn Val Phe Phe Asn Ala Met Asn Lys Ala Leu Glu Asn Lys ASn
        180                 185                 190Gly Thr Ser Ser Ala Ser Gly Thr Ser Gly Ala Thr Gly Ser Asp Gly
    195                 200                 205Gln Thr Tyr Ser Thr Gln Ala Ile Gln Tyr Leu Gln Gly Gln Gln Asn
210                 215                 220Ile Leu Asn Asn Ala Ala Asn Leu Leu Lys Gln Asp Glu Leu Leu Leu225                 230                 235                 240Glu Ala Phe Asn Ser Ala Val Ala Ala Asn Ile Gly Asn Lys Glu Phe
            245                 250                 255Asn Ser Ala Ala Phe Thr Gly Leu Val Gln Gly Ile Ile Asp Gln Ser
        260                 265                 270Gln Ala Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Asn Thr Ile Ser Gly Ser Ala
    275                 280                 285Val Ile Ser Ala Gly Ile Asn Ser Asn Gln Ala Asn Ala Val Gln Gly
290                 295                 300Arg Ala Ser Gln Leu Pro Asn Ala Leu Tyr Asn Ala Gln Val Thr Leu305                 310                 315                 320Asp Lys Ile Asn Ala Leu Asn Asn Gln Val Arg Ser Met Pro Tyr Leu
            325                 330                 335Pro Gln Phe Arg Ala Gly Asn Ser Arg Ser Thr Asn Ile Leu Asn Gly
        340                 345                 350Phe Tyr Thr Lys Ile Gly Tyr Lys Gln Phe Phe Gly Lys Lys Arg Asn
    355                 360                 365Ile Gly Leu Arg Tyr Tyr Gly Phe Phe Ser Tyr Asn Gly Ala Ser Val
370                 375                 380Gly Phe Arg Ser Thr Gln Asn Asn Val Gly Leu Tyr Thr Tyr Gly Val385                 390                 395                 400Gly Thr Asp Val Leu Tyr Asn Ile Phe Ser Arg Ser Tyr Gln Asn Arg
            405                 410                 415Ser Val Asp Met Gly Phe Phe Ser Gly Ile Gln Leu Ala Gly Glu Thr
        420                 425                 430Phe Gln Ser Thr Leu Arg Asp Asp Pro Asn Val Lys Leu His Gly Lys
    435                 440                 445Ile Asn Asn Thr His Phe Gln Phe Leu Phe Asp Phe Gly Met Arg Met
450                 455                 460Asn Phe Gly Lys Leu Asp Gly Lys Ser Asn Arg His Asn Gln His Thr465                 470                 475                 480Val Glu Phe Gly Val Val Val Pro Thr Ile Tyr Asn Thr Tyr Tyr Lys
            485                 490                 495Ser Ala Gly Thr Thr Val Lys Tyr Phe Arg Pro Tyr Ser Val Tyr Trp
        500                 505                 510Ser Tyr Gly Tyr Ser Phe
    515
            BUDAPEST TREATY ON THE INTERNATIONAL
        RECOGNTTION OF THE DEPOSTT OF MICROORGANISMS
            FOR THE PURPOSES OF PATENT PROCEDURE
                    INTERNATIONAL FORMMax-planck-Institutfür BiologieSpemannstr.3472076 Tübingen                       RECEIPT IN THE CASE OF AN ORIGINAL DEPOSTT
                                  issued pursuant to Rule 7.1 by the
                                  INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORTTY
                                  identified at the bottom of this page 1  where Rule 6.4(d)applies.such date Is the date on which the status of international depositary authority was nequired.Form DSM-BP/4(sole page)07/94
            BUDAPEST TREATY ON THE INTERNATIONAL
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                     INTERNATIONAL FORMMax-Planck-Institutfür BiologieSpemannstr.3472076 Tübingen                        VIABILITY STATEMENT
                                   issued pursuant to Rule 10.2 by the
                                   INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY
                                   identified at the bottom of this page 1    Indicate the date of original deposit or，where a new deposit or a transfer has been made，the most recent relevant date(date of the new deposit or
 date of the transfer).2    In the cases referred to in Rule 10.2(a)(ii)and(iii)，refer to the most recent vinbility test.3    Mark with a cross the applicable box.4    Fill in if the Information has been requested and if the results of the lest were negative.Form DSM-BP/9(sole page)07/94
            BUDAPEST TREATY ON THE INTERNATIONAL
        RECOGNITION OF THE DEPOSIT OF MICROORGANISMS
            FOR THE PURPOSES OF PATENT PROCEOURE
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                                   INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY
                                   identified at the bottom of this page
Figure A9619780200311
1    Where Rule 6.4(d)applies，such date is the date on which the status of international depositary authority was nequired.Form DSM-BP/4(sole pagc)07/94
            BUDAPEST TREATY ON THE INTERNATIONAL
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            FOR THE PURPOSES OF PATENT PROCEDURE
                      INTERNATIONAL FORMMax-Planck-Institutfür BiologieSpemannstr.3472076 Tübingen                         VIABILITY STATEMENT
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                                    identified at the bottom af this page 1    Indicate the date of original deposit or，where a new deposit or a transfer has been made，the most recent relevant date(date of the new deposit or
 date of the transfer).2    In the cases referred to in Rule 10.2(a)(ii)and(iii)，refer to the most recent vinbility test.3    Mark with a cross the applicable box.4    Fill in if the information has been requested and if the results of the lest were negative.Form DSM-BP/9(sole page)07/94

Claims (19)

1.DNA分子，其包括
(a)序列号1中所示的核苷酸序列
(b)在遗传密码简并性的范围内与(a)的序列相应的核苷酸序列或
(c)在严格条件下与(a)或/和(b)的序列杂交的核苷酸序列。
2.权利要求1中所要求的DNA分子，其在核酸水平上与序列号1中所示的核苷酸序列具有至少80％的同源性。
3.权利要求1或2中所要求的DNA分子，其长度具有至少15个核苷酸。
4.权利要求1至3中任何一项所要求的DNA分子，其编码一种能够粘附于人细胞的多肽。
5.权利要求1至4中任何一项所要求的DNA分子，其与下列序列融合：
(d)序列号3中所示的核苷酸序列
(e)在遗传密码简并性的范围内与(d)的序列相应的核苷酸序列或
(f)在严格条件下与(d)或/和(e)的序列杂交的核苷酸序列。
6.载体，其含有至少一个拷贝的权利要求1至5中任何一项所要求的DNA分子。
7.细胞，其由权利要求6中所要求的载体转化。
8.多肽，其由权利要求1至5中任何一项所要求的DNA分子编码。
9.权利要求8中所要求的多肽，其包括
(a)序列号2中所示的氨基酸序列
(b)同来自(a)的序列至少80％同源的氨基酸序列
(c)同(a)或/和(b)的序列有免疫学交叉反应的氨基酸序列。
10.权利要求8或9中所要求的多肽，其能够粘附于人的细胞。
11.多肽复合物，其含有至少两种多肽成分，其中第一种成分是由权利要求1至4的任何一项中所要求的DNA分子编码，第二种成分是由包括
(d)序列号3中所示的核苷酸序列，
(e)在遗传密码简并性的范围内与(d)的序列相应的核苷酸序列或
(f)在严格条件下与(d)或/和(c)的序列杂交的核苷酸序列的DNA分子编码。
12.权利要求11中所要求的复合物，其第二种成分包括
(a)序列号4中所示的氨基酸序列，
(b)与序列(a)至少80％同源的氨基酸序列，
(c)与(a)或/和(b)的序列有免疫学交叉反应的氨基酸序列。
13.制备权利要求8到10中任何一项中所要求的多肽的方法，其中用权利要求1到5的任何一项中所要求的DNA分子或权利要求6中所要求的载体转化一种细胞，在多肽表达的条件下培养所转化的细胞并从细胞或/和培养上清中分离多肽。
14.权利要求8到10的任何一项中所要求的多肽作为免疫原来制备抗体的用途。
15.针对权利要求8到10的任何一项中所要求的多肽，或针对权利要求11或12中所要求的复合物的抗体。
16.权利要求15中所要求的抗体，其针对序列号2中所示氨基酸序列的N-末端。
17.药物组合物，其含有权利要求1到5的任何一项中所要求的DNA分子、权利要求8到10的任何一项中所要求的多肽、权利要求11或12中所要求的多肽复合物或权利要求15或16中所要求的抗体作为活性成分，任选性地加入常用药物辅助物质、稀释剂、添加剂和载体。
18.权利要求17中所要求的药物组合物在幽门螺杆菌感染诊断中的应用。
19.权利要求17中所要求的药物组合物在制备用于预防或治疗幽门螺杆菌感染的药物中的应用。
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