CN112143741A - 一种生物膜基因岛GIVal43097及其切除方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生物膜基因岛GIVal43097及其切除方法。所述的生物膜基因岛GIVal43097，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明利用分子生物学手段，通过鉴定增强生物膜形成的基因岛并定向切除，一方面消除了其携带的基因，另一方面阻止了基因岛的水平传播，同时最大程度的保护了菌群平衡，是一种消除细菌生物膜的新颖策略，以达到减弱致病性弧菌生物膜的目的。

Description

一种生物膜基因岛GIVal43097及其切除方法

技术领域：

本发明属于生物化学与分子生物学领域，具体涉及一种生物膜基因岛GIVal43097及其切除方法。

背景技术：

生物膜是细菌在环境中的主要存在形式。生物膜(biofilm)，也被译为生物被膜，是细菌在生命体或无生命体的表面，通过其分泌的多糖、蛋白质、DNA等胞外基质相互黏连形成的细菌群落。生物膜中的胞外分泌物为微生物的生存提供屏障，生物膜状态下的细菌对环境的压力有更好的耐受性，因此生物膜又被称为细菌的半休眠状态。生物膜的存在形式多种多样，包括固体和液体介质之间形成的固液生物膜或称附着性生物膜，气体和液体介质之间形成的气液生物膜，以及气体和固体介质之间由细菌群落组成的气固生物膜。2014年的一篇美国国立卫生院的文章指出，生物膜参与了超过60％的微生物感染过程。一些致病性细菌可以调控生物膜的形成来增强其致病能力，如人类病原菌霍乱弧菌进入肠道时，通过调控生物膜的大量形成，使自身能很好的适应人肠道内的酸性环境，保护自身免受胆汁和低pH的影响，维持致病能力；而当霍乱弧菌开始侵染人体时，会通过抑制胞内多聚糖的表达，促使生物膜变薄从而利于侵染宿主。珊瑚致病菌溶珊瑚弧菌侵染鹿角珊瑚时迅速在珊瑚黏液表层形成生物膜，然后诱导毒力因子的表达，发挥致病性。

研究表明基因岛、原噬菌体等水平转移元件参与生物膜的形成与调控。比如，希瓦氏菌MR-1中原噬菌体CP4So的切离可增强宿主菌的生物膜，提高宿主在低温下的存活率。同时，形成生物膜会进一步调控原噬菌体等水平转移元件的切离和释放。比如，大肠杆菌K-12形成生物膜时，其基因组上CP4-57原噬菌体会发生切离，进一步促进群体生物膜的形成。绿脓杆菌生物膜形成过程中Pf丝状原噬菌体大量复制和释放，增强细菌的致病性。然而，目前生物膜的研究对象主要集中在大肠杆菌模式菌及人和动物病原菌中，围绕其致病性作用及机理开展，海洋细菌中生物膜研究相对较少。弧菌中一些种类，比如，溶藻弧菌、溶珊瑚弧菌能引起珊瑚致病，生物膜的存在增强了其致病性。因此，目前很迫切需要鉴定调控这些致病菌中生物膜形成的基因岛，同时建立一种高效、定向的基因岛切除方法，最终减弱细菌生物膜的形成。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供一种溶藻弧菌中调控细菌生物膜形成的基因岛GIVal43097。

所述的生物膜基因岛GIVal43097，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二个目的是提供鸟苷酸环化酶基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1的1907-2812位碱基所示或如SEQ ID NO.1的5342-6748位碱基所示。

本发明还提供了上述鸟苷酸环化酶基因在促进细菌生物膜形成中的应用。

本发明的第三个目的是提供敲除生物膜基因岛GIVal43097中的dgc137基因在减少生物膜合成中的应用。

本发明的第四个目的是提供一种切离酶alpA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的15008-15217位碱基所示序列的反向互补序列。

本发明的第五个目的是提供过量表达切离酶alpA介导生物膜基因岛GIVal43097的切除中的应用，从而进一步去除生物体内细菌生物膜的形成，例如溶藻弧菌Vibrioalginolyticus SCSIO 43097生物膜的形成。

本发明的第六个目的是提供一种生物膜基因岛GIVal43097的切除方法，其是在含生物膜基因岛GIVal43097的生物体内超表达切离酶alpA。

目前的细菌生物膜清除方法都是利用物理化学手段去除或抑制，在生物体内的应用极大受限。本发明利用分子生物学手段，通过鉴定增强生物膜形成的基因岛并定向切除，一方面消除了其携带的基因，另一方面阻止了基因岛的水平传播，同时最大程度的保护了菌群平衡，是一种消除细菌生物膜的新颖策略，以达到减弱致病性弧菌生物膜的目的。

相比现有技术优势如下：

1.本发明利用分子生物学手段去除生物体内细菌生物膜。目前的生物膜去除方法，主要是针对一些医疗器械或体表慢性伤口上的生物膜，因为用的都是机械处理或者化学物质处理的方法，不能直接用于生物体内细菌形成的生物膜的去除。

2.利用基因岛自身编码的切离酶过量表达介导基因岛切除，是特异性的敲除方法，相比化学物质处理的方法，不会对菌群平衡造成破坏。

3.高效性，利用现有的物理化学方法去除生物膜，选择的化学试剂需要实验测试，去除效果无法估计。而利用切离酶超量表达的方法切除基因岛效率接近100％。

附图说明：

图1是基因岛GIVal43097的序列分析(A)及生物膜相关蛋白Dgc137(B)、Dgc139(C)和Dgc140(D)的结构域分析和敲除PCR检测；

图2是基因岛GIVal43097上生物膜相关基因的鉴定。基因dgc137、dgc139和dgc140敲除突变株Δdgc137，Δdgc139和Δdgc140，以及基因岛GIVal43097切除株ΔGIVal43097(简写为ΔGI，下同)的气液生物膜(A)、固液生物膜(B)和气固生物膜(C)表型检测；以及dgc137基因回补的气固生物膜、气液生物膜(D)和固液生物膜(E)，WT是野生型，其中wt/pBBR1Cm代表在野生型中表达空载体，Δdgc137/pBBR1Cm代表在Δdgc137中表达空载体，Δdgc137/pDgc137代表在Δdgc137中表达含dgc137回补质粒的pBBR1Cm，ΔGI/pBBR1Cm代表ΔGI中表达空载体。

图3是切离酶AlpA介导基因岛GIVal43097切离的模式图(A)及切除效率(B)，以及基因岛GIVal43097缺失突变株的固液生物膜(C)、气固生物膜(D)和气液生物膜(E)检测，43097为含有GIVal43097的野生型菌株。

图4是基因岛GIVal43097上关键基因dgc137、dgc139和dgc140在铜绿假单胞菌PAO1中异源表达后的固液生物膜(A)和气固生物膜(B)检测，PAO1/pHERD20T为PAO1中表达空载体的对照。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

一、Vibrio alginolyticus SCSIO 43097基因组DNA的提取：

-80℃保存的菌株Vibrio alginolyticus SCSIO 43097，划线2216E培养基平板，30℃培养箱静置过夜；挑取单菌落于含25ml新鲜2216E培养基的250ml三角瓶中，25℃培养箱，220rpm震荡培养12小时；以1:100转接于含25ml新鲜的2216E培养基的250ml三角瓶中,220rpm震荡培养5-6小时(至对数期)；12,000rpm离心1min，收集菌体，去除上清；采用细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN，BEIJING)进行总DNA提取，由此得到SCSIO 43097基因组DNA，可用于SCSIO 43097的全基因组测序和注释分析，利用Mauve软件与近缘细菌Vibrioalginolyticus ATCC 33787进行序列比对，发现SCSIO 43097含有一个22kb左右的基因岛，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该基因岛编码1个整合酶、1个切离酶、3个鸟苷酸环化酶以及16个假定蛋白(表1和图1A)。

表1基因岛GIVal43097所含基因的功能注释

二、基因岛GIVal43097上生物膜相关基因的鉴定

据文献报道，鸟苷酸环化酶参与C-di-GMP的合成，进而调控细菌生物膜，因此推测该基因岛可能调控宿主菌生物膜的形成。GIVal43097基因岛上含有三个含有GGDEF结构域的编码鸟苷酸环化酶的基因dgc137，dgc139和dgc140。设计特异性引物(表2)，利用pMBLcas9载体对这三个基因进行分别敲除，最终获得了三个单基因敲除突变株Δdgc137，Δdgc139和Δdgc140(图1B-D)。实验发现，dgc137敲除后生物膜明显减少，dgc139和dgc140的敲除对生物膜没有明显影响(图2)。综上表明，dgc137是SCSIO 43097形成大量生物膜的必须基因。

表2本发明中使用的引物

Vibrio alginolyticus SCSIO 43097中基因敲除和基因回补的方法如下：

本研究选用了依赖于CRISPR/Cas9系统的质粒pMBLcas9(构建方法参见文献：Wanget al.,Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2019,74(9),2559–2565)进行基因敲除。首先，利用引物(表2)通过PCR扩增得到上下游同源臂以及sgRNA的基因片段；对同源臂和sgRNA片段进行纯化，对pMBLcas9进行AhdI酶切，采用ClonExpress MultiS试剂盒(Vazyme)进行多片段重组，将重组片段通过化学转化法导入大肠杆菌WM3064感受态细胞中，测序验证重组质粒。随后利用接合转移方法对重组质粒转移至V.alginolyticus SCSIO43097中。简要的说以含有重组质粒的WM3064为供体菌，以SCSIO 43097为受体菌进行接合转移实验，对供体菌和受体菌分别培养至OD₆₀₀为1.0，以6000rpm转速离心2分钟收集菌体，用培养基各洗2次，去掉上清后各用50μL的LB重悬，混匀两种菌体后点至含有0.3mM的DAP的LB平板上。过夜培养后用接种环挑取菌苔划线至含有氯霉素(15μg/mL)的2216E平板。将抗性平板上得到的接合子，利用wF/wR引物PCR确定正确的敲除株，由此实现对dgc137，dgc139和dgc140的敲除，获得三个单基因敲除突变株Δdgc137，Δdgc139和Δdgc140。

本研究利用质粒pBBR1Cm(构建方法参见文献：Zeng et al.,Appl MicrobiolBiotechnol,2015,99,10127–10139)对基因dgc137进行回补。首先，利用引物(表2中的dgc137-pBBR1Cm-F和dgc137-pBBR1Cm-R)通过PCR扩增基因dgc137的编码区和启动子区域；对PCR片段进行纯化，采用ClonExpress II One Step Cloning Kit试剂盒(Vazyme)进行重组插入pBBR1Cm载体的SalI和KpnI位点；通过化学转化法导入大肠杆菌WM3064感受态细胞中，测序验证dgc137回补质粒。随后，利用含有0.3mM的DAP的LB平板通过接合转移方法将dgc137回补质粒转入单基因敲除突变株Δdgc137中。过夜培养后用接种环挑取菌苔划线至含有氯霉素(15μg/mL)的2216E平板，检测获得正确的转化子，由此实现对dgc137的回补，得到回补菌株Δdgc137/pDgc137。

三、切离酶AlpA在V.alginolyticus SCSIO 43097中表达和对基因岛GIVal43097的定向切除：

切离酶AlpA在SCSIO 43097的表达采用pHGECm载体构建(构建方法参见文献：Wanget al.,Environmental Microbiology,2017,19(11):4620–4637)。首先，利用引物(表2)通过PCR扩增得到基因岛GIVal43097自身编码的切离酶基因alpA，将PCR片段连接至pHGECm载体EcoRI和BamHI酶切位点之间，通过化学转化法导入大肠杆菌WM3064感受态细胞中，测序验证重组质粒pHGECm-alpA，获得的菌株是WM3064/pHGECm-alpA。以WM3064/pHGECm-alpA为供体菌，以SCSIO 43097为受体菌进行接合转移实验，利用培养基对菌液进行清洗重悬，混匀后点至含有0.3mM的DAP的LB平板上。过夜培养后用接种环挑取菌苔划线至含有氯霉素(30μg/mL)的LB平板，验证获得重组菌。对正确的重组菌株43097/pHGECm-alpA进行过夜活化，1/100转接至含25ml含有氯霉素(15μg/mL)的新鲜2216E培养基中，至OD₆₀₀＝1.0左右时添加IPTG，在30℃摇床中，220rpm震荡培养6-8小时，对菌液进行接种环划线至LB平板，获得单菌落，利用43097GI-wF/-wR引物确定正确的基因岛切除突变株，由此得到基因岛GIVal43097定向切除的突变株ΔGIVal43097。

四、基因岛切除株(单基因敲除突变株Δdgc137，Δdgc139和Δdgc140，以及突变株ΔGIVal43097)的生物膜表型检测：

1、固液生物膜测定：

首先，挑取单克隆菌株接种于含25mL2216E培养基的三角瓶中，30℃培养过夜。随后，对过夜培养的菌液稀释至OD₆₀₀＝0.05转接至新鲜2216E培养基中，并分别取250μL稀释后的培养液于96孔板中，以只添加2216E培养基的样品作为空白对照。然后将96孔板置于30℃恒温培养箱中静置培养(培养过程中勿晃动)，分别培养2h，4h，6h或8h后用酶标仪测定OD₆₂₀的数值。将培养液轻轻倒出，用自来水轻轻浸洗96孔板5次，将游离的菌体洗去，加入280μL的0.1％的结晶紫溶液染色。室温静置20min后将结晶紫溶液倒掉，继续用干净的自来水轻轻浸洗96孔板5次，将游离的结晶紫洗去，再把96孔培养板倒置在吸水滤纸上除去残余的水，自然风干后，加入300μL无水乙醇，静置5-10min让结晶紫充分溶解。最后，用酶标仪读取96孔板的OD₅₄₀数值。每个菌株做3个重复，每个重复做3个平行。固液生物被膜的数值计算采用Sample(OD540 nm)-Blank(OD540 nm)/Sample(OD620 nm)-Blank(OD620 nm)。

2、气液生物膜的测定：

首先，挑取单克隆接种于含25mL2216E培养基的三角瓶中，30℃培养过夜。其次，再对过夜培养的菌液稀释至OD₆₀₀＝0.05转接至新鲜2216E培养基中，吸取4mL稀释后的菌液于10mL的玻璃试管中。在30℃培养箱中静置培养，每天进行多次观察并记录、拍照(注意观察的时候不要晃动试管)。

3、气固生物膜的测定：

首先，挑取单克隆接种于含25mL2216E培养基的三角瓶中，30℃培养过夜。吸取10μL菌液至含有FeCl₃的海水LB培养基、LB培养基或其他营养培养基的平皿上，在30℃培养箱中静置培养，每天进行观察并记录、拍照菌落形态。

基因岛GIVal43097的编码基因dgc137能显著增强宿主弧菌的生物膜形成。同时，基因岛是基因水平转移的重要载体，普遍具有水平转移能力，可在同一个生态位的不同种属细菌间传播，因此，建立基因岛从基因组上直接切除的方法，不仅可以去除基因岛所含基因，也消除了其传播能力。研究发现，基因岛编码的切离酶AlpA可以介导基因岛的切除(图3A和B),我们用此方法获得了基因岛缺失突变株ΔGIVal43097。随后，我们比较了基因岛缺失突变株ΔGIVal43097和野生株的生物膜形成能力，结果表明GIVal43097的缺失显著减少宿主菌固液生物膜、气固生物膜和气液生物膜的形成能力(图3C-E)。

五、基因岛上生物膜关键基因的异源表达(dgc137、dgc139和dgc140在铜绿假单胞菌PAO1中分别表达)的生物膜表型检测：

基因dgc137、dgc139和dgc140在铜绿假单胞菌PAO1中表达采用pHERD20T载体构建(构建方法参见文献：Li et al.,Molecular Microbiology,2019,111(2),495-513)。首先，利用引物(表2)通过PCR分别扩增得到基因dgc137、dgc139和dgc140的编码区，将PCR片段连接至pHERD20T载体NcoI和HindIII酶切位点之间，通过化学转化法导入大肠杆菌WM3064感受态细胞中，测序验证重组质粒pdgc137、pdgc139、pdgc140。以含有重组质粒的WM3064为供体菌，以PAO1为受体菌进行接合转移实验，利用培养基对菌液进行清洗重悬，混匀后点至含有0.3mM的DAP的LB平板上，37℃培养6h后，用接种环挑取菌苔划线至含有羧苄青霉素(100μg/mL)的LB平板上，由此获得基因岛上相关基因在铜绿假单胞菌中异源表达的重组菌PAO1/pdgc137、PAO1/pdgc139和PAO1/pdgc140。以转入空载体pHERD20T的作为对照-PAO1/pHERD20T。

对正确的重组菌株进行37℃培养过夜活化，随后，对过夜培养的菌液稀释至OD₆₀₀＝0.05转接至新鲜的含有羧苄青霉素(100μg/mL)和10mM阿拉伯糖的LB培养基中，并分别取250μL稀释后的培养液于96孔板中，以只添加LB培养基的样品作为空白对照。然后将96孔板置于37℃恒温培养箱中静置培养(培养过程中勿晃动)，分别培养2h后用酶标仪测定OD₆₂₀的数值。将培养液轻轻倒出，用自来水轻轻浸洗96孔板5次，将游离的菌体洗去，加入280μL的0.1％的结晶紫溶液染色。室温静置20min后将结晶紫溶液倒掉，继续用干净的自来水轻轻浸洗96孔板5次，将游离的结晶紫洗去，再把96孔培养板倒置在吸水滤纸上除去残余的水，自然风干后，加入300μL无水乙醇，静置5-10min让结晶紫充分溶解。最后，用酶标仪读取96孔板的OD₅₄₀数值。每个菌株做3个重复，每个重复做3个平行。固液生物被膜的数值计算采用Sample(OD540 nm)-Blank(OD540 nm)/Sample(OD620nm)-Blank(OD620 nm)。

通过上述方法对重组菌的生物膜形成能力进行检测，发现dgc137显著增强PAO1的生物膜形成能力；dgc140也能增强PAO1的生物膜形成能力，但能力相对dgc137较弱；dgc139对PAO1的生物膜形成能力无影响，与空载体pHERD20T无差异(图4)。

序列表

<110> 中国科学院南海海洋研究所

<120> 一种生物膜基因岛GIVal43097及其切除方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21792

<212> DNA

<213> 珊瑚弧菌(Vibrio alginolyticusSCSIO 43097)

<400> 1

tccatgtggt gggtaaatcg aactctgaat cttgtaatgt cttccaaaat ccaggtttaa 60

attttaattt gttgttttta tttggttttt aatttctcct tgtccaagga tgtctttagc 120

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tgattttttg catgttgatt aaactgcttt tgaacgcgag ctaagtgcag agctatttgg 4320

ttttcatcat gcattcgtac caaacaagca aacccatcag agtgtattcg tgatgagaga 4380

agaggaaaga ccgtatgaga gtcaatagat tgtgcgatat cctttagaaa ctgactactt 4440

ttcgtaaaac cgaggtgatc ggctatgggt ttaaagttat caatatcaag aagaaaaaga 4500

acgtagtgtt catcttcttt ggcactttgg attttttgtt ctaggtagcg aaaaaatacc 4560

aaagggctgt gtaaaccggt tacagagtca atgtcattcg cttgttcaag ttctcgattg 4620

ttctttttta ccagtcccca cagcaataaa gatgtgacca ctacaaataa cattcccttc 4680

agtgattgaa ccaaggtata gacttgtgta ttgctcgata ggagttctac tgctttatct 4740

gagaaccaaa cccatagcga cgcaaacaca aagtaagtaa aaacgaactt agtggaggat 4800

tttatatctc ttttcatact gaccacagta ttatttgtgt actgcccatg agtaagttta 4860

tacttaaata agtaaattat cattaaattg catgtcaatc tagaggcaca tcactaaagt 4920

gtttaaaatg ttacatcgag catcaatcac agactgttag ggctattctg gcgttttaat 4980

gtatgttggt tagtcacttc ttggagttac tctctatggg gttttgctca agataactct 5040

aagtaaggag tgatgtttca tacagagtat tcaaaggtct gattaagtct ttgagttagt 5100

atagatctgt gagtggcaat gtcttttata tctaatgaaa aaatggatga tttaacttat 5160

ggagtatatg gaggaaatgt aacagatgag ggataagtta aatctgagaa agttaattct 5220

gtgcctgagt gtgttcagtg tactagtcac tcttcttaat acttttcact ccatatatag 5280

agttcagcat gagctgctag ttaacaatac catagagtcc aaccgtgtat atgccgttaa 5340

aatggcggaa ataacggata cttttattga ttatgcttta tcccaactag agtacagcgc 5400

accgataatc agccgtagaa tgcttgagcc gcttgtattg cagcaagagg caaatcgatt 5460

gcgaactcaa accgactctt tcaactctgt cgtaattgtt aatgcggacg gcgtcatcat 5520

atcggtttca ccagaaacta ttgaagtgaa aggtgttcaa ttaactgaag aaagcgcgtt 5580

acagtctcta aatgcgaaaa ctccacttat cacgaatcca tttgtatccc ctgctggcaa 5640

ctatttgaca agcatgtcgt atcctatctt ttctgaaaac ggcgattact taggctatgt 5700

tgcgggaacc atctacctcg atcaaaaaaa tatattaagg acaattcttg ggcagcatag 5760

ttacaaagat gggtcatatt tgtatgttgt cgataagcat cagacgttga tttatcaccc 5820

tgatccgcaa cgaattggag aagttattac taataacgaa gcaataagag cggtaagtcg 5880

tggtgaggaa gggggaaaag ctatcgttaa ctcccatagc gttggcatgc tctctggata 5940

cgcgcccgta aaacatgctg gctggggggt tattgctgag aagccagaag agcgcgtttt 6000

gtctatgctt gacgatcaaa tgtggcatat gtttatagag tcactcccag ttagtgttct 6060

tatatttttg attatttggg tttcttcgat ttttatatcg aaacctttat ggcaattagc 6120

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gccttggtat tttgaagcgt catacttgaa acgttcattt ctcagcacgt tcaatattgt 6240

atccagcact attgatcagc tgcacctaga tactttaact gatcccatga ctgggctact 6300

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tgtgctagct ttggatcttg attactttaa aaaagtgaat gatagctttg gtcatgatgt 6420

cggcgatgat ttattagtca gtgtggcaag tatgatcaag gctcaggcac gagaagttga 6480

tattgtttgc cgctctggtg gcgaagagtt tatcgttttc ttagtcaaaa cggacataca 6540

tcaggctaaa ctcgttgccg agagaattcg taaatatatt gcattaaaca agtttgatgc 6600

agtagggcat gttacgattt ctatcggagt gtctcattgg tcagcagaag atgagccgat 6660

tagcgcgact cttaaacgtg ccgatgatgc tctttatcaa gctaaacata atggtaggaa 6720

tcgcgccgaa atcgctctct tcaagtgaga ggcctgaaat taatgatata gccccattat 6780

gcgcagtgct taagtattag gaaggtcatt gctccttcct aatacctgat ttcaagtatt 6840

ttgaagaaca gaagtcgggg cgaattagtt ttgataggtg gctagaggta gttatttcac 6900

gagacttctg cttcgtttct ttaccatctg ccctcagcat cgtcagccga gtgatatgtt 6960

gagttattcc cttcaaattt cagccgacca aaactttcac ataatacatc aagagtgatg 7020

tcgctttcta agatggtttc tacaggtact gcgagagttt catcgtctga gaaatcgtta 7080

atatccagtt gatagcgctc aaagctgtgt tgttcttcgt cagttaaaga tgacttaagt 7140

ttgtgctcaa atactcgacc atataaccag catttgatat ttcctagtga aaattcaata 7200

agcggtgctt caccataaat cccatccatt cgattgttgg cttttagcat agagtgaacc 7260

gttaatatta ttgccacact gtatgatctt cctgcaacct gtagttcagg acgcgcaagc 7320

tcacaccagt gatccgaaga agatagctcg tacagtttat tgcttctaat cgttgctgcg 7380

tcaatgacct cttcgcgtaa gtagggatga gaatgagccg ttccaatgta ttgataatcc 7440

tcgccgaaca ctttagcgat atcttttttt attgaaagag agagtgggtt ccattcaact 7500

gaagagcgtt ttcttttagc tgatgtttca acagaaacat gatttatcgt acatttaaat 7560

gggtgggctt tattcgcata tccccaaagg tgggccgctg tctctatgga gactgatttt 7620

ctgccctcat gctttatcgc ataagcctct aaaccagcca tgattagctc aaatatcgca 7680

cttttactga ctgaaattgt cgcggtcatt ttctcttggt tcctattatt gacggttatt 7740

ttcgtagttt gatgagaggt aagacacaag agttattggg cgaactctac atgttctttc 7800

agtttgtttt tatagcgctc ataaagcgaa tcccatacat cttcacttac catgactagt 7860

ggtaagtatt cttcaaaaat gacaccactg tcgtcagggt aggcaagctc ggtataagca 7920

taacgtgggc catctacata aagcgcttcc caacattcga tgcattcatc tttaaaccac 7980

tcttttgtga ttggctcagg gccgttaccc agaagatgaa ttaagttctt agaatcgaag 8040

aaatgatgtt cttcactttt gatatcaaac aggtagctag aaaatagagt gatggctctt 8100

ctgcagaaat accataatcg caacattgaa actgcgcagg tgattgaaga gctgatacag 8160

tgggcgaaag agatgcaagc tgacgctgag atgatggaaa aactggggct ttccactgat 8220

gaaattgcgt tttaccgtgc attggtcacc aacgaggcat ctgtgcgcac cttaggcgat 8280

gacaacttgc gccaactcgc tattgaactc acgcaccaac tgcgtaaatc ggctactgta 8340

tattggcaga aacgagaaag cgtgcgtgct cggatgcgca accttgtacg ccgtttattg 8400

cgtcgctaga aatatccacc tgatgccgca gaagaggcaa ttaagctggt tctggatcaa 8460

gctgaagtgc tggctgacgg gtggtatgcg gcatgattaa atgaaaggca aggtctgata 8520

gccttgcctt tctattagtg ctgacattgg tcctgtctta tcatcccact ttctgctgaa 8580

tattatttaa agtgtgtttg tatttagaga atgatccctg tagttttctt ttcctcttta 8640

ggcttaacga cttttggctt cgcatgctct gtatgctttc gttttgactt cgtataagcg 8700

gacttacgtg caatactatg attttcgatt tctgcaatat ttccttttac tacttttgca 8760

taggcaaact taggcaatac tttggtcact tcaatggtcg caactttgat ttcatcgtgg 8820

cctaaactct cttttgtcac aggatcgata aatttttcac ccaaattgaa gacatcaaag 8880

tattgtcctt gcttaactgt attgccgccc gagttcaaaa ctaaagagcc attatcgcca 8940

actaaaacca ctaacggata aatgttatct tttagttggt taaatatttt tttcgaagca 9000

atatcaacca gaagattcaa attgtttcta cttgaagtgg ttggaatagt tgctgaccat 9060

ttcacttgat tattgacaac atcgagaatt tgaaatttta ccaaaacttt agagctatag 9120

taggttttca catctttaat gctttcccct gtgagctcta cggtacgtga gttatcgacg 9180

acactttcgt tagtgttagc agtaacaacc tgaccagtta caaaatactg taacgttggg 9240

tcgagtttgt catatagtac tttgaacttt cggtcttgca ccaaaagttc ttcgactttt 9300

ttgccgataa tagtgccttt tgggccagaa aaactaccaa tagcgattgt tcttcttttg 9360

gcattttgat cttttatttt ctctctaggg tcaacctcaa ccttaacctc taactttacc 9420

tcacagccat aacttgaaca cttttcatgt agcactttgt acttaacgtt ccctcgcgag 9480

tatgttgcag tgccatctgc catagagtcg tttaactgtt ttgtctttcc gtcgttaatt 9540

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ttctcataac ttgcagcact agataaacat gagaataagc ttgctgcgca aagtagtata 9720

agccttttat tcatgttaaa aatccgccac atcaaacata tcttccgatt cagccgagtt 9780

aatgttatca gagagagttt ctgctcccag ggcttcttgc tccagctttt cagcactcat 9840

tccacttgcc atattttttg cactcacaat cttcttagga tgccaaacga gtaccgtccc 9900

caccatttca tgccccatca cagggtgctt acgacgccat tcaaactcag tacttacacc 9960

agtcatattt tgtacacttg atgtcattga agcactttgt tgaacggatt tgattaattc 10020

attagttaag cctggggact ttttgcgaac agcacctgtt atcaaatcga actgctcagc 10080

tttactgaca cggttttctt ctgaagttga ctcttggaaa tcgccattca gattataggt 10140

ttgtgccaag ctcgcccaag cgttgttcgt tgcaaagctc ttagctgctt tacgttcaat 10200

ttttctttcc gttggtgagg atgtataagt aacgcctgct tgaccgtatg aaatcaacat 10260

gggatagccg tcggagtcat agctaacttg agttcctacc ttcagatata gactgtcttt 10320

ttggttatag aacatatcgt agatagatgt cattttaggg ttagctttat ctttctgtgg 10380

tgtaatttga ccgccggaat cgatcattgc acgaacttga tctcgtttat ttgcagacaa 10440

agcaagaaca accccaactg tcccttgacc agaatctctg atttcttcat aggttttgat 10500

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tttaaataga tcgcgcttga tcgatggtgg ggctgcttca aactcttttg gatcaatccc 10620

catttcttgt aattctgcat caagtttacc ttctagcacc gcaaccactt tatctaagaa 10680

gctcgccatc tgagagtcac tcttaaaatc ctcttcagtc ggggtcggca agccgctatt 10740

ttttgtcatg gagtaaagca tgttattttc gacactggta tttagtgttt gtaagtattc 10800

tttttgcgcc tctaatacgg ccttatctaa tgctgctact cgaaactctg cccatcgagg 10860

gtcattgcga tctgccatga tttcagcaga accagaataa ataaatacac tatgttgctt 10920

accctgttta tataaggtgc gttttacgtt tgacacataa gcatcaagct tttcatcaat 10980

ggcatcagtg gtatcaacat cgttttgaac ttggaccaca tctttatcgg tttgtttgcc 11040

cgcagcctct tctgttattt ctgctaccgt tgttgtatct actaaattac cttcttgaga 11100

tgcatgtgtt ggtaatgaca agccagcgat taccattgct gtaaataatt ggtttaattt 11160

catttttaat cacctaaccc tctaactaaa agtaatgggc agctttcact gcccatcatt 11220

tgacgctacc taccagctca cacttgagcc atccgctacc ttgccgacta ctcgctctcc 11280

ttcccaatac gctaaaccat tttctatatt ggttagtgac atttggaaat agtactcaat 11340

tcgtgtatct ccgttatcta gagttgagtc tcgctgaagg attttgcctg ataggctaaa 11400

gtctggggct agtacttggt tatctccttt gacacttgcc tgtttgacca ttttggaatt 11460

ttttaaatca cgcatttttt ttgtggcatc gtcctcaccg aatgcagttg ttactaagaa 11520

ttttcctgat tgaagtaact ttactcttaa agatttggtt agctgatcag tgtctaagcg 11580

ctgcatagtg tcattctcaa tgccacttac ataaataatg tatcgaccac caacatctgc 11640

ttgagggtga gtcatcaatt tattagaaat aatgtcatca gccatttcat ttgctgcttt 11700

cgagaaatca gcgtaagaga gggctgctac cacatttgtc gttgtatcag cagcatcaat 11760

ataagatgtg gttgttttac aaccaaccaa gctcatcgca gctacaacag ctgcaattgt 11820

caattttttc atgtttatcc ttaaatattt acgactttta cggatggttc tattaatgga 11880

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gtgaaagatc ctgcctttat ttcaactgta ttgtgtttgg ctttgattcg agttgcttga 12000

tattcactcg gtagggctga gaaagttcga atatcagcac cagtagtcac catttgtaaa 12060

atggctaatg catcaccaag taaagcgttt tcatctttaa cttgtttttg agcgatggtt 12120

tttaatgtta ctcgggtgat ttcacgagct aaaatatatg gaaactcctg atcgaattcg 12180

gcactaatta tcttatccat atctgcaata gtgctggtct ttgaaccatt aattgtaatg 12240

ctgtcaaatg ttgtaccgcg ttttttcaag gtaggaattg cgataccagc ataagataca 12300

ttgttagaca gtaagaaaat tggcagatca attcgacgct cttctttcac tggcgatttg 12360

ccattttcaa aaatcaccca aacttgatct tttagcctag attggcttgg atttttaacc 12420

atactacgtg ccaattgata gtccgctttg gcagcaggtg aaccagtaag agagtgtaca 12480

cgcttgaaag agttagcagc tttttcaaag tctgacttag atttacctgt gatgagtaaa 12540

tgaagaccgt aagagtatgt agtaaaaggg tttacgtagc cttcataagg tttccattgg 12600

ccttgctcaa tacctgcttt ttttagtgta ttttgtgtca aatccgattc tatggtctgc 12660

tttaccaaag cgcttgactc accagcttca gactccagtt cttcgcttcg ctccttaatg 12720

atatctgcaa aatgttgagc tgctctacgc tgtcgctctt ctgctctatt tagttcaacg 12780

cgagcatttt gatagtcatg aagtgatata aaattccatg ctttaatggt atttgtcatg 12840

atgccgtcgt aatgcgcttg ttcgtaagcc aacatggcgt catttccaac cattgaacca 12900

ataagctcaa ctccctcaga agcagtactt tccgtatctt cttctttcat cattatttct 12960

gtttcatcaa gcagcttggt ggataattcg tattcacctg catagttcaa gcttgcacca 13020

gcttgcaatg tccatagtag gtcgcttgtt tcacctgaat cgttatcgta gccagcatgt 13080

tctaaggcta cttgagatgc tcccgaaaag tcaccagaat caagctttga attgaagcta 13140

tcgaagtcgt ttctctgcat catacttgta cagcctgaca acataaccat actgatcgca 13200

ctgctaatta gttttatatt cattgacttt attgttatct aaatgattga atttttgaac 13260

tagaatcacc ttatactcac aaatagcact gcaatcaagc tcttaatgtg tggttaatta 13320

acacttttag tattatccga ttattgaatg ctatttattt gatttatgtc attaggctca 13380

catgcgtctc ttgtctttga aagttgagtg tatctactaa acgtaagcga atatctattg 13440

ttatcagtag ggaagctctt cttatctcaa ttggaccatt tcattatgtg tagtagtaat 13500

gaaaggaatt tcagatagat attatcttcg tgtatatccc aacggtttca tttttaggag 13560

ctttttatgc acgaaaacaa ctactatttt gatggtcctg tcacagcaaa taaggtgctc 13620

gacgcggctg ctgaaatcct tgctacacgg gctctccgag gcgatcagta ttgcaatccc 13680

gaagcaacaa aaacctattt atcttgcaaa ttaaaacacc atgaaagaga ggtgtttgcg 13740

gtgatgtttc tagataatca gcatcgtctt attgcttttg aaaagctctt ctttggcaca 13800

atagattcgg caagtgtcta tcccagagaa gtcctcaaag cggctttaaa agtcaatgcc 13860

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aaacaaatta cgcaaaggct caaagaggct ttagcgctgg tggacattcg agttcttgat 13980

catatcgtgg ttggcgatag tgccatctct tttgcagaga gggggctact atgatccaga 14040

aaacatcggg tgaactggaa ttgcaggata gctttcatcg agcattgctt ttggtaatcc 14100

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attaccagac agggcagggg cttcatccca ttgaaattca atttcgtcgt acatcggtca 14220

gtgaagattg gcaggttgtt tgcttagcga gttttcttat tcggaaaata aaccgagtga 14280

gatggagcct gaactctact ttcatctctt caatctttgg tgttatcaac cagatagcgg 14340

tgctgcaagt cttgcagacc cgcaagtgaa agcgctgtta gatacttggc tgaacgcgct 14400

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cattttcgag acaaaagcta tagcgcggaa gaggggggat atcatccggt tgagattggc 14700

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gaatcaatca aacttctgat tgtggtaatc ccaactgttc atctcgctct gtcactcttt 15060

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attgacttgg tacttgtgat tcttgatggt agctcacgcg atttaggtac acctatcacc 15720

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gtattgcgtg caacaggggt ttatctaaag cccgtctact acgttgcggg gcactgtgat 15960

ggattggcca agcaacggcc ctataacctt tccaagttgc tgtatttgat tgttgaacgt 16020

ttaccaaaaa ataaacggct cttactggcg aatcgcacgc tttcccctcg acatgagaat 16080

tggaaagaca acgatgccag tgattacaac aaaaaaacca gtcttagttt gtgggaggca 16140

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ctctcttcga cataagttgt cgcaaccacc ttttaatatc aactcattga ataatatata 16380

aaggatatct ctcatgaaac ctattgtaat taccgcagca ctaacactgc tcatgacctt 16440

tactgcgtct gctgagggct acaaagtcga atacaaagac atcaacaccc gatggggacc 16500

aaagacgaaa atatatgtaa cgtccctctt tgactactcg actgtcttca ggatcgaagt 16560

taaccgaggt aactgtgaag tcgctagacc agaaacacca aagattaccg tcaacaagaa 16620

taagtacagt caatctgaag agttactcaa aaacatgagc aaccctgatt acaaaaagcc 16680

ctccagtaac aacaagtcta gtggtgtgaa atggcttcct tattccgaag tggatttgaa 16740

gtacggagag tctactggtt atgtcactac aatgccctgt agagtcctac aaattgacat 16800

tcactctagt gaagggagtt accgctttaa tgcggattaa acaactgaaa ggccacaagg 16860

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aaggcttact ttcaagtttt gctaaatagc tgacacggta aaaagcctga ttgtattggt 16980

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aaatcgcact acttgcttgc ccgaccgtaa taccgattgc acttgcccaa gccttagcaa 17100

ccatccctga aacgtattca cccgtaagat catcataagg ccctattcct tgaaaaacat 17160

caccattgag caatatggct acgtgatagt gaggatacac tgaagtgact atctctctac 17220

accagataaa tcgaggttga gagtggcggt tgtgcttctt acgttttaga taagcacaca 17280

tgatagcttt gaaggactct tggaacttag taatctgttt gccagttacc ccgttaaccg 17340

gataaccatc cgggtaatgt aaatcaaatc gcattagccg tgttcgaggg tattggctta 17400

acgcataatc gaaagtcttc ttgatttttc gtaagtactt tggttcaagg gcccctttgt 17460

tggtattgaa actcaatggc ataccgttga tgtgtaactt acatgcattg ttgatgttat 17520

tcatttctat cattcctatt ggttagtgtt ctcaataggt agataggttg ttgtaattaa 17580

ttagataagg ttcatataaa tactattatt accgacagtt tttcactccc ttcctccagc 17640

cacgcatctt tgctcgacaa ggcgtcctgt agcttcaaaa cttgcaaaag ttactctgat 17700

aaaaagttag gccccccgtt tgagaaggag tctctgattt ttctcattga taccaatcgc 17760

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ataagcaaga aattcgatta acttattgac tttctctttc tcaagcttaa gtgttgacca 17880

ggcaaaatgt tcacgtataa cacgctcata ccactcaatg tctgtacaaa cctttccttc 17940

gacattgatg aacttaatga tttcactttc aataaagtaa tctatgtgtt ctgcaaactc 18000

tttattgcat tttacgtcag caactttttg aaataataaa ggtattgtga ggttgtaaac 18060

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cccagattcc gtagcctcac ttaaaagatg ggtaagcatt aagcgatttg acagcgtcaa 18360

ctctttagca tgctgattac tataccaaag atgattcatc cacctcctca tatagatggg 18420

gcgttgttca aactgactac tcaactcatc aaaatcaatg cctgtaagtt gatagcgtgt 18480

gactggtctt cctcgttttc taggtacttc tttctcaggt atcaagagaa taacttttgc 18540

ctctatcaat aagcgtagac agcgccttat aaggcgttct gaggcttggt attttcgggc 18600

catatataga acaggttttc tgtaaaaatt gtctgattcg gcatccaaat acataagcag 18660

cagtagcatt ctagcttcag cgtttagttt gtcattctct tggaaagtcc agtttacaat 18720

cataaaatca catttatatt tatttatagg gcgttttggt atgtatatta cttggttttt 18780

ctttctatgt ccttggacta cgtccaaaga catagttata gtgtgaagga tgccaactat 18840

attaaaaacg ctggaagcta gagtgatatg agtgagaaaa aaatacgtcc attagaaggt 18900

tttagtttca acaatgaatc tcatgtgaaa tggttaaata cgtatctagc aaaagccaaa 18960

actaatccaa ttgtcgaaaa gcattacttt gggttatttc agttatcagc atcacctaaa 19020

aaacgacttc aaaatttttt tatagattgt aaaaattcag ctgatggtag agagatctgg 19080

ttacttatgc atggagcttg ggggaaaagg tcgagaagag aaaagcaaaa gcggaagggg 19140

aaaaaacagt ataattttga actcacgata gaatttggtc aaaatcttca agctttagcc 19200

acaaagaggg gacagactca gcagaaggtt cttgaagagc ttgtaaatgg ttcattaaca 19260

tcaatgctcg aagttcgaaa gttacaagaa actgatagaa ttctatcact agaagctaca 19320

gccaatacca cgttagaaaa ggagttaggc tctgctcgaa aaaaaatttt agagttggag 19380

tcaaaaattg cgactcttaa aaaagagaac cttcacaagg cctctgaaag cgacaatgtt 19440

tctactaacc atcatgcaga tgaaccgtta caactgactc tagaaagaaa aggtcgttca 19500

attattcaca tgcagccaaa ggacagtgac caagactaag catctttaca ctataaatac 19560

cactagtaga gctggtggct aggcgcttgg tgtgagtatt aacatgaagg agatcgggtt 19620

attgagtgat cagcttgggt gaaaatacac acttggtgtg cttaatgtaa ggaaattgtc 19680

tgcttactgc atgtgagcat ataacgcgct gtcagcgctg actatccaca tgaacatgtt 19740

gcttattttt gcgaactagc atctaacagt taataaaatc actgtcttta aatacagcga 19800

tggtttacac tttttgcgtt atatcaaccg gattatgtaa actatttgga cgaaattgga 19860

ataaaaaatg aaagcatatc acacatacag tgctgtagac gttgcatgga gcttgctcaa 19920

gcatgcgaaa gagcaaggta aatgcttctc caatttgcag ctacaaaaac ttacctatgt 19980

ttgtcatggt ttatcattgg cacacttcca gcgtcctctc gtcgtagatg atgtatttgc 20040

ttggaagttt ggtccagtgg tgccatctgt ttactttcgc tttaaatctt acggtagtag 20100

tgtgatcact gaacaatgtg atgtagcact agaccaagaa agtgagtcta ttgttaaaga 20160

tgtagtctct aagctgggcc atttgacggg gcctcaactt gtagatttaa ctcaccgcga 20220

aggaagtcca tggcatcagg tatgggatgg cacacaccaa aaagtgattc cggaccattt 20280

gattcaagcc cattacactc aaatcaaaca atccggacga acagctagcc tgtgagtaac 20340

aaagaaaata gtgtcgtcag tttttacatt gacgacactc ccacagctga acaagcttca 20400

aaaaccttcc aagacgacta cgaactggac tttcaagatt ttatagaaag aacggtaaat 20460

gaaagtgctg ctgaagactt ctcgtactca aataatggag taaagaaagc tggaagacgg 20520

cttcgcaaga gagagggcga cctcaagtca gctactgcta caatccaaca gtttcgagcc 20580

gcacacgaaa agccattaaa cactatcgca tatcttgttg gtcgctgttg ccgtgagctg 20640

ggtatagatg ttaaaccagt tacacggtta aagcgcttag aaacaatcgt agataagttg 20700

cagcgtaaat ctcttgatgg tgaaacggca aatgctactt gtgtaaccaa tatgaatgat 20760

attggcggct gcagggcgat ttttccggat ttaatttcat tggagaaggt gaaatctcaa 20820

ctgcaactta cagttgagaa ggtaggccga gttagaatta aagatattga tgactatatt 20880

actagtccta aacctaatga ttgtggttac cgaagcttgc atgtgattta tcgctatgac 20940

catgctagcg gtaaaagttt taacattgag gctcagctac gtactcgact tcaacatctt 21000

tgggctacta cagtggaaat tgtcgacatc ctagaaggta ccaagattaa gactcactct 21060

cacagttcaa atgaaggcaa gagcagttta caggttcagt gggaagaatt gctttcgata 21120

atgagccaat gcattgctga tgctgaaggg gctatagagt taagtgatat cgataaagcc 21180

gatttttcaa agcgtttggt cgtcttggac cgcgaaatca atgcgctaaa tcggttgagt 21240

agttttaaaa ttttatctga aaaggttaat tcttactgtg atagttccat tgagcacgta 21300

ttgctagtta ttaacgaaac ttcacgagaa ttgatcttta gtgaagagtt tgaaaattac 21360

agccaagcaa tttcagttta taacgcagct gagaaagtca ctcgtagcta ctcacgagca 21420

acctcgagac tcaataccct tctcatatcc acaaaaaata tgggccaact ttcggaagcc 21480

taccctaact atctaggcga ttgtgcctca ttcatcactc tgcttgaaga cacaatgctg 21540

tctggtgaaa gttaaataca aacctttctt gttgttattg acccttgtat ctaatcctgc 21600

ttgttaaaac gtgcccaatc tgtcatcgaa tttggtatgt gtaaaatatg gcttcctgtg 21660

atggcttgag ggttagactt tattgtcccc gtaccccaag ccgtacccag ggtgtttttt 21720

gctaaagata aaagccgttc atgtccttat tttatgcgct ctagaagcac tccagactcc 21780

atatggtggg ta 21792

Claims (9)

1.一种生物膜基因岛GIVal43097，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.鸟苷酸环化酶基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1的1907-2812位碱基所示或如SEQ ID NO.1的5342-6748位碱基所示。

3.权利要求2所述的鸟苷酸环化酶基因在促进细菌生物膜形成中的应用。

4.敲除生物膜基因岛GIVal43097中的dgc137基因在减少生物膜合成中的应用。

5.一种切离酶alpA，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1的15008-15217位碱基所示序列的反向互补序列。

6.过量表达权利要求5所述的切离酶alpA介导生物膜基因岛GIVal43097的切除中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，过量表达切离酶alpA在去除生物体内细菌生物膜的形成中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，过量表达切离酶alpA在去除溶藻弧菌Vibrio alginolyticus SCSIO 43097生物膜的形成中的应用。

9.一种生物膜基因岛GIVal43097的切除方法，其特征在于，是在含生物膜基因岛GIVal43097的生物体内超表达权利要求5所述的切离酶alpA。

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