WO1997011182A1

WO1997011182A1 - Neues adhäsin aus helicobacter pylori

Info

Publication number: WO1997011182A1
Application number: PCT/EP1996/004124
Authority: WO
Inventors: Rainer Haas; Stefan Odenbreit; Thomas F. Meyer; André Blum; Irène CORTHESY-THEULAZ
Original assignee: Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V., Berlin
Priority date: 1995-09-22
Filing date: 1996-09-20
Publication date: 1997-03-27
Also published as: ZA967974B; EP0853670A1; NZ319160A; BR9610558A; IL123775A0; AU7131496A; AU712447B2; JP2000513203A; DE19535321A1; MX9802213A; CA2232730A1; US6096521A; KR19990063649A; CN1200763A

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Adhärenzgen AlpB aus Helicobacter pylori und das davon codierte Polypeptid. Dieses Gen wurde durch Transposon TnMax9-Insertion (Mutagenese) vom Chromosom aus H-pylori erfolgt und wird durch die Klonierung und Sequenzierung der stromabwärts gelegenen AlpA-flankierenden Region Charakterisiert. Diese zwei Adhärenzgene gehören wahrscheinlich zum selben Operon und werden vermutlich von einem einzigen Promoter aus transkribiert.

Description

Neues Adhäsin aus Helicobacter pylori

Beschreibung

Die vorliegende Erfindung betrifft das neue Adhärenzgen alpB aus Helicobacter pylori und das davon codierte Polypeptid. Das Gen, das Polypeptid und ein gegen das Polypeptid gerichteter Antikörper können zur Diagnose, Prävention und Behandlung einer Helicobacter-Infektion eingesetzt werden.

Das Auftreten von spiralförmigen Bakterien in der menschlichen Magenschleimhaut ist seit langem bekannt (Bizzozero, 1893) . Die Tatsache, daß es sich dabei um pathogene Keime handelt, wurde jedoch erst mit der erfolgreichen Isolierung und Kultivierung dieses Bakteriums durch Marshall und Warren (Warren and Marshall, 1983; Marshall et al . , 1984) aus der Magenschleimhaut eines Patienten mit einem Magengeschwür (Ulcus ventriculi) realisiert. Wie erste Analysen ergaben, handelte es sich bei den isolierten Mikroorganismen um gramnegative, spiralförmige Bakterien mit extrem hoher Beweglichkeit und der ungewöhnlichen Fähigkeit im stark sauren Milieu (bis ca. pH 1,5) zu überleben. Ursprünglich als Campylobacter pylori bezeichnet, wurden die Keime schließlich aufgrund biochemischer und morphologischer Eigenschaften in die neu gegründete Gattung "Helicobacter" eingruppiert (Goodwin et al . , 1989) .

Schon innerhalb weniger Jahre wurde die Bedeutung der Helicobacter pylori-Infektion und die Tragweite dieser Entdeckung klar. Epidemiologische Untersuchungen von Taylor und Blaser (1991) zeigten, daß die H. pylori Infektion weltweit auftritt, und daß ca. 50% der Bevölkerung mit diesem Bakterium infiziert sind, wobei die Infektionsrate in den Entwicklungsländern höher ist als in industrialisierten Ländern. Ferner beobachtet man, daß die Wahrscheinlichkeit einer chronischen H. pylori-Infektion mit steigendem Lebensalter drastisch zunimmt. Damit zählt die H. pylori- Infektion zu den häufigsten chronischen bakteriellen Infektionen des Menschen.

Heute weiß man, daß die Infektion zwangsläufig zur Auslösung einer bakteriellen Gastritis (Typ-B Gastritis) beim Menschen führt. Ferner geht man davon aus, daß H. pylori auch eine ursächliche Rolle bei der Entstehung von Magen- und Zwölffingerdarmgeschwüren (Ulcus ventriculi und Ulcus duodeni) sowie bei einigen Formen des Magenkarzinoms (Adenokarzinom) spielt (Lee et al . , 1993; Solnick and Tompkins, 1993) . Auch die seltener auftretenden MALT (Mucosa Associated Lymphoid Tissue) Lymphome des Magens, die als Vorstufen von B-Zeil-Tumoren des Immunsystems angesehen werden, sind vermutlich eine Folge der H. pylori-Infektion. Eine antibakterielle Behandlung entsprechender Patienten mit erfolgreicher Eradikation (totaler Elimination) von H. pylori führt sowohl zu einer Abheilung von Magengeschwüren als auch von "low grade" MALT Lymphomen (Sipponen and Hyvärinen, 1993; Isaacson and Spencer, 1993; Stolte and Eidt, 1993) .

Eine Folge der Langzeitinfektion mit H. pylori ist die atrophische Gastritis, eine Degeneration der Schleim-, Säure¬ oder Pepsinproduzierenden Zellen des Magenepithels, die als eine präkanzeröse Läsion angesehen werden muß. Nach einer Statistik der 1980 weltweit am häufigsten aufgetretenen Krebsarten steht das Magenkarzinom an zweiter Stelle, allerdings mit rückläufiger Tendenz (Parkin et al . , 1988) . Zwei Studien zeigten kürzlich eine statistisch signifikante Korrelation zwischen der H.pylori- Infektion und dem Auftreten des Magenkarzinoms (intestinaler Typ) ; beide kamen zu dem Schluß, daß ca. 60% aller auftretenden Magenkarzinome wahrscheinlich auf eine H. pylori- Infektion zurückzuführen sind (Parsonnet et al . , 1991; Nomura et al . , 1991) . Weiterhin zeigen Untersuchungen von Sipponen (1992) , daß in vielen industrialisierten Ländern mehr als 20% der Infizierten im Laufe ihres Lebens an einem Ulkus des Magens oder des Duodenums erkranken, während bei Personen mit normaler Magenmukosa dieses Risiko vernachlässigbar gering ist. Dies bedeutet, daß diese häufigen ga s t roduodena 1 en Erkrankungen als Infektionskrankheiten betrachtet und entsprechend behandelt werden müssen (Alper, 1993) . Eine Behandlung, die eine bereits bestehende chronische H. pylori-Infektion eliminiert, führt zur Abheilung einer Gastritis, eines Magen- bzw. Zwölffingerdarmgeschwürs oder eines MALT-Lymphoms. Damit kann eine prophylaktische Behandlung, die eine H. pylori-Infektion verhindert (z. B. Impfung) sowie eine Behandlung die eine bereits bestehende H. pylori-Infektion eliminiert, zur Behandlung dieser häufigen gastroduodenalen Erkrankungen einge¬ setzt werden.

Neben einigen höheren Primaten war der Mensch bisher als einziger natürlicher Wirt für H. pylori bekannt. Der relativ neue Befund, daß auch die Hauskatze mit H. pylori infiziert sein kann, wirft ein neues Licht auf die Frage der Übertragung und eines möglichen Reservoirs für diese Bakterien außerhalb des menschlichen Organismus. Die gelegentlich erfolgreiche Anzüchtung von H. pylori aus dem Stuhl infizierter Personen und die Fähigkeit der Bakterien über Monate im Wasser zu überleben, unterstützen die Hypothese einer fäkal-oralen Übertragung. Auch die direkte oral-orale Transmission wird aufgrund von Familienstudien als wahrscheinlich angesehen. Die Infektion erfolgt meist im Kindesalter innerhalb der Familie, wobei enge räumliche Lebensverhältnisse und geringer Hygienestandard positiv mit der Häufigkeit der Infektion korrelieren.

Nach der oralen Aufnahme gelangen die Bakterien zunächst in das extrem saure Magenlumen (pH 1 - 2) . Dort wird durch die Produktion des Enzyms Urease, das zur Spaltung des vorhandenen Harnstoffs und damit zur lokalen Neutralisierung des sauren pH-Wertes im Magen führt, das Überleben der Bakterien ermöglicht. Mittels chemotaktischer Orientierung und flagellenabhängiger Motilität bewegen sich die Keime dann in die Bicarbonat-gepufferte Schleimschicht der Antrumregion des Magens, ihrem eigentlichen natürlichen Habitat. Dort befinden sie sich in einer einzigartigen ökologischen Nische, die aufgrund der Säurebarriere nur für wenige konkurrierende Bakterienarten zugänglich ist. Vermutlich orientieren sich die Keime an dem pH-Gradienten zwischen Lumen (pH 1-2) und Epithel¬ zelloberfläche (pH 6-7) , um zum Epithel zu gelangen. Durch ihre spiralige Form, ihre Beweglichkeit im viskosen Schleim, die Produktion von Mukus-modifizierenden Enzymen und schließlich durch eine mikroaerophile Lebensweise sind diese Keime optimal an die Lebensbedingungen in diesem Habitat angepaßt .

Sie halten sich meist in den tiefen Krypten der Antrumregion auf, wo sie vor äußeren Einflüssen wie z. B. Säure, Pepsin, aber auch vor Medikamenten zu ihrer Eradikation wie z. B. Antibiotika geschützt sind. Ein Teil der Population (ca. 20%) ist eng mit Epithelzellen assoziiert, vor allem mit Schleim-produzierenden Zellen. Unter der Voraussetzung einer gastralen Metaplasie, d. h. der Säure-induzierten Ausbildung von gastralem Epithel im Duodenum, kommt es auch zur Kolonisierung metaplastischer Areale im Duodenum, wodurch die Voraussetzungen zur Entstehung des Zwölffingerdarm-Geschwürs (Ulcus duodeni) geschaffen sind. Durch ihre Fähigkeit zur Adhärenz wird vermutlich eine komplette Ausscheidung der Helicobacter mit dem abgestoßenen Schleim verhindert, so daß die Bakterien für Jahre, Jahrzehnte oder gar lebenslang persistieren können (chronische Infektion) .

Bevor die Existenz und die Bedeutung des H. pylori für die Ulkuserkrankungen bekannt waren, wurden diese durch sog. Antazida, oder H₂-Rezeptorantagonisten behandelt. Dabei handelt es sich um Substanzen, welche die Säuresekretion der Magenparietalzellen inhibieren. Unter dem Einfluß dieser Arzneimittel kommt es meist zur Abheilung von Geschwüren, da jedoch eine der Ursachen dieser Geschwüre, nämlich die H. pylori-Infektion, damit nicht eliminiert wird, kommt es in den meisten Fällen nach kurzer Zeit zu einem erneuten Auftreten der Ulzeration (Rezidiv) . Eine weitere, häufig angewandte Therapie bei Ulzerationen ist die Wismut-Behandlung. Verschiedene Wismutsalze (CBS, BSS) haben einen bakteriziden Effekt auf H. pylori. Eine totale Eradikation des Keimns wird jedoch nur in 8 - 32% der Fälle erreicht. Die Behandlung führt anscheinend zu einer vorübergehenden Suppression des Keims, aber nach Absetzen der Behandlung kommt es in den meisten Fällen wieder zum Aufflackern der Infektion. Eine längerdauernde Therapie mit hohen Dosen führt zu einer Akkumulation der Substanz in Leber, Niere und im Nervensystem und hat beträchtliche neurologische Nebenwirkungen (Malfertheiner, 1994) .

Seit der Erkenntnis, daß es sich bei den gastroduodenalen Ulkuserkrankungen um Infektionskrankheiten handelt, ist ein Ziel der Behandlung die Eradikation der Erreger durch Antibiotika. Die Monotherapie mit verschiedenen Antibiotika (Amoxicillin, Nitrofuran, Furazolidin, Erythromycin u. a.) stellte sich jedoch als nicht zufriedenstellend heraus, da es auch hier nur bei 0 - 15% der Fälle zur Eradikation der Keime kommt . Die erfolgreichste Behandlung wird zur Zeit durch eine Kombination eines Säureblockers (Ompeprazol) mit einem Antibiotikum (Amoxicillin) erreicht, die zu Eradikationsraten bis zu 80% führen kann (Malfertheiner, 1994) . Auf Dauer ist eine Antibiotika-Behandlung zur Eliminierung von H. pylori jedoch nicht erfolgversprechend, da mit einer raschen Resistenzentwicklung der Bakterien gegen Antibiotika gerechnet werden muß.

Daher besteht ein Bedürfnis nach neuen Therapieformen für die Bekämpfung einer H. pylori-Infektion, insbesondere nach Impf¬ stoffen, die spezifisch gegen Virulenzfaktoren von H. pylori gerichtet sind. Als Virulenzfaktoren bezeichnet man die Eigen¬ schaften eines pathogenen Bakteriums, die ihm die Fähigkeit verleihen, eine bestimmte ökologische Nische im Körper des Wirts zu kolonisieren und sich dort trotz der Immunantwort und der unspezifischen Abwehrmechanismen des Wirtsorganismus zu vermehren. Kenntnisse über Virulenzfaktoren helfen somit den Ablauf und die Mechanismen einer Infektionskrankheit besser zu verstehen. Die wichtigsten bisher untersuchten Virulenzfaktoren von H. pylori sind die Urease, die Flagellen, die Adhäsine und die Produktion eines Cytotoxins.

Die Urease, ein Enzym auf der Oberfläche der Bakterien, besteht aus 2 Untereinheiten (UreA, 26 kDa, UreB, 66 kDa) , die bis zu 5% des gesamten bakteriellen Proteins ausmachen. Die Urease spaltet den im Magensaft in geringer Konzentration vorkommenden Harnstoff in Ammoniak und Kohlendioxid. Nach der gängigen Modellvorstellung umgibt sich das Bakterium mit einer Wolke von Ammoniak, was zur lokalen Neutralisierung der Säure des Magensaftes führt. Die außerordentlich hohe Beweglichkeit der Bakterien kann auf das Vorhandensein von polaren Flagellen zurückgeführt werden, die es dem Bakterium erlauben, sich im viskosen Mukus der Magenschleimhaut zu bewegen und dadurch die Epithelzellschicht zu erreichen. Sowohl das Urease-Gencluster (ureA - ureH) als auch die Gene zur Ausbildung der Flagellen (flaA, flaB) wurden in E. coli kloniert und sequenziert und es wurden isogene Mutanten hergestellt.

Ungefähr 50 - 60% aller isolierten H. pylori-Stämme produzieren ein 87 kDa Protein, das sogenannte vakuolisierende Cytotoxin, das bei in vitro Zellkulturen die Ausbildung von cytoplasmatischen Vakuolen bewirkt. Auch das vacA-Gen, das für das Cytotoxin von H. pylori kodiert, wurde inzwischen kloniert und genetisch charakterisiert. Es wird ferner vermutet, daß die Cytotoxin-produzierenden Stämme ein höheres pathogenes Potential besitzen, als Stämme, die dieses Toxin nicht produzieren. Weiterhin wurde eine positive Korrelation zwischen der Produktion des Cytotoxins und der Ausbildung von Magengeschwüren gefunden.

Untersuchungen zur Adhärenz von H. pylori an Epithelzellinien in vitro zeigen, daß die Bakterien an viele Zellinien von unterschiedlichen Geweben binden können. Im Wirtsorganismus dagegen zeigt H. pylori eine sehr ausgeprägte spezies- und gewebeselektive Adhärenz (Tropismus) . So findet man die Bakterien nur an Epithelzellen gebunden, die dem gastralen Typ von Epithelzellen angehören. Diese Selektivität wird durch eine spezifische Interaktion zwischen einem bakteriellen Adhäsin und einem spezifischen zellulären Rezeptor erklärt.

Es wurden bisher mehrere potentielle Adhäsine von H. pylori beschrieben und ein Gen (hpaA) , das für ein sogenanntes N-Acetyl- Neuraminyllactose-bindendes Hemagglutinin kodiert, wurde kloniert und sequenziert (Evans et al . , 1993) . Dabei handelt es sich um ein Protein, das einen sialinsäurehaltigen Rezeptor auf den Epithelzellen erkennen soll . Die Bedeutung dieses Adhäsins für die H. pylori-Infektion ist jedoch umstritten. Andere potentielle Adhäsine sind entweder nur durch ihr Molekulargewicht oder ihre Rezeptorbindungsspezifität charakterisiert. Dazu zählt ein 63 kDa Protein, das zum Exoenzym S von Pseudomonas aeruginosa, einem Adhäsin mit ADP-Ribosyltransferase-Aktivität, homolog zu sein scheint. Ferner vermutet man ein noch nicht identifiziertes Adhäsin, welches eine spezifische Bindung an das Lewis^b-Blut- gruppenantigen der Magenepithelzellen vermittelt (Falk et al . , 1993; Boren et al . , 1993) .

Die Infektion mit H. pylori führt zu einer chronischen Entzün- dungsreaktion der Magenmukosa (Gastritis) . Ferner wird eine spezifische systemische Immunantwort gegen H. pylori-Antigene induziert, die Bildung von sekretorischen Antikörpern im Magen (slgA) ist allerdings noch nicht eindeutig geklärt. Durch die Entzündung befinden sich verschiedene Immunzellen in der Magenmukosa und Submukosa, z. B. polymorphkernige Leukozyten, Monozyten, Makrophagen, Lymphozyten und Plasmazellen (Blaser, 1992) . Weiterhin aktiviert H. pylori sowohl Neutrophile als auch Monozyten und Makrophagen in vitro (Mai et al. , 1991) . In vitro zeigen Versuche mit spezifischen Antikörpern und Komplement eine rasche Inaktivierung von H. pylori durch Neutrophile. In der in vivo Situation führen diese Mechanismen jedoch nicht zur Inaktivierung der pathogenen Bakterien. Wie H. pylori über lange Zeit im Wirt überlebt obwohl dieser die obengenannten Abwehrmechanismen aktiviert, ist unklar.

Der Wirt ist nicht in der Lage, unter natürlichen Bedingungen mit der H. pylori-Infektion fertig zu werden. Um so überraschender war es deshalb, daß die Urease, ein essentieller Virulenzfaktor von H. pylori (s. o.) , ein hohes Potential als Vakzine besitzt (US- Patentanmeldung USSN 07/970,996 "Urease-based Vaccine against Helicobacter Infection") .

Im Helicobacter felis / Maus Modell (H. felis ist eine Heli¬ cobacter Spezies, die natürlicherweise im Magen der Katze kolonisiert und auch die Maus infizieren kann) konnte gezeigt werden, daß die H. pylori Urease, bzw die rekombinante Urease B Untereinheit (rUreB) bei oraler Vakzinierung, sowohl die Maus vor einer H. felis-Infektion schützen kann (präventive Vakzine) , als auch eine bereits bestehende Infektion eliminieren kann (therapeutische Vakzine) (Michetti et al. , 1994; Corthesy-Theulaz et al . , Gastroenterol . , im Druck) . Entscheidend bei der oralen Vakzinierung war der Einsatz von Adjuvantien wie z. B. Choleratoxin, das u. a. zur Konversion der Immunreaktion von der Produktion von systemischen Antikörpern zu sekretorischen Antikörpern wichtig zu sein scheint .

Die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe bestand darin, neue sekretorische Gene aus Helicobacter pylori und davon codierte Polypeptide, die potentielle Kandidaten für Impfstoffe sind, bereitzustellen.

In der deutschen Patentanmeldung 195 21 312.2 wird ein Verfahren zur Identifizierung sekretorischer Gene aus Helicobacter pylori beschrieben, bei dem man mit Hilfe eines Transposons eine Mutantengenbank von H. pylori anlegt und diese Mutantenkollektion auf Mutanten mit Defekten im Adhärenzverhalten , z.B. gegenüber menschlichen Magenepithelzellen analysiert. Auf diese Weise konnte ein als alpA bezeichnetes Adhäsingen und ein von diesem Gen codiertes Polypeptid identifiziert werden.

Bei Klonierung der stromabwärts gelegenen alpA-flankierenden Region wurde jetzt ein neues, als alpB-bezeichnendes Adhäsingen aus H. pylori mit der in SEQ ID NO.1 gezeigten Nucleotidsequenz und ein von diesem Gen codiertes Polypeptid mit der in SEQ ID NO.l und 2 gezeigten Aminosäuresequenz identifiziert.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein DNA- Molekül, das

(a) die in SEQ ID NO.l dargestellte Nucleotidsequenz,

(b) eine der Sequenz gemäß (a) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nucleotidsequenz oder

(c) eine mit den Sequenzen gemäß (a) oder/und (b) unter stringenten Bedingungen hybridisierende Nucleotidsequenz umfaßt .

Neben der in SEQ ID NO.l gezeigten Nucleotidsequenz und einer dieser Sequenz im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechenden Nucleotidsequenz umfaßt die vorliegende Erfindung auch noch eine DNA-Sequenz, die mit einer dieser Sequenzen unter stringenten Bedingungen hybridisiert . Der Begriff "Hybridisierung" gemäß vorliegender Erfindung wird wie bei Sambrook et al (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) , 1.101 bis 1.104) verwendet. Gemäß vorliegender Erfindung spricht man von einer Hybridisierung unter stringenten Bedingungen, wenn nach Waschen für eine Stunde mit 1 X SSC und 0,1% SDS bei 55 °C, vorzugsweise bei 62 °C und besonders bevorzugt bei 68 °C, insbesondere für eine Stunde in 0,2 X SSC und 0,1% SDS bei 55 °C, vorzugsweise bei 62 °C und besonders bevorzugt bei 68 °C noch ein positives Hybridisierungssignal beobachtet wird. Eine unter derartigen Waschbedingungen mit einer der in SEQ ID NO.l gezeigten Nucleotidsequenz oder einer damit im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechenden Nucleotidsequenz hybridisierende Nucleotidsequenz wird von der vorliegenden Erfindung umfaßt.

Vorzugsweise codiert das erfindungsgemaße DNA-Molekül für ein Polypeptid mit der Fähigkeit zur Adhärenz an humane Zellen, insbesondere an humane Magenepithelzellen. Weiterhin ist bevor¬ zugt, daß das erfindungsgemäße DNA-Molekül auf Nucleotidebene eine Homologie von mindestens 70%, besonders bevorzugt von mindestens 80% zu der in SEQ ID NO.l dargestellten Nucleotidsequenz aufweist. Weiterhin ist bevorzugt, daß das DNA-Molekül eine Länge von mindestens 15, besonders bevorzugt von mindestens 20 Nucleotiden aufweist.

Die in SEQ ID NO.l gezeigte DNA-Sequenz des Adhäsingens alpB codiert für ein Polypeptid von 518 Aminosäuren. Die Aminosäuresequenz dieses als AlpB bezeichneten Polypeptids ist in SEQ ID NO.l und 2 gezeigt. Eine Analyse der N-terminalen Region der Aminosäuresequenz von AlpB läßt vermuten, daß das Polypeptid eine klassische prokaryontische Signalsequenz besitzt . Ein Vergleich auf Aminosäureebene zwischen AlpB und dem in der deutschen Patentanmeldung 195 21 312.2 beschriebenen Polypeptid AlpA, dessen Aminosäuresequenz in SEQ ID NO.3 und 4 dargestellt ist, zeigt, daß beide Polypeptide eine Identität über die gesamte Aminosäuresequenz von 46% aufweisen. Der C- terminale Teil (Aminosäuren 341-518) zeigt sogar eine Identität von 66% .

Defektmutanten im alpB-Gen, die durch Insertion des Transposons TnMax9 an zwei verschiedenen Positionen des alpB-Gens hergestellt wurden, zeigen keine Bindung an Gewebeschnitte von Magenepithelzellen. Da eine stabile Expression von AlpA in diesen alpB-Mutanten nachgewiesen werden konnte, muß der Defekt des alpB-Gens direkt für den Adhärenzverlust der alpB-Mutante verantwortlich sein.

Ein fünktioneller Zusammenhang zwischen AlpA und AlpB besteht darin, daß AlpB und AlpA zusammen vermutlich einen Komplex bilden können. Dieser Komplex könnte als heterodimeres oder/und multimeres Aggregat vorliegen, das als funktionelles Adhäsin wirksam ist. Der Verlust einer Untereinheit, sei es AlpA oder AlpB, kann bereits zu Funktionsverlusten des Adhäsinkomplexes und damit zu Adhärenzdefekten der Bakterien führen.

Noch ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein DNA-Molekül, das Sequenzbereiche des alpB-Gens und des alpA- Gens fusioniert miteinander umfaßt. Insbesondere ist dies ein DNA-Molekül, bei dem die vorstehend unter (a) , (b) und (c) definierte Sequenz fusioniert ist mit

(d) der in SEQ ID NO.3 dargestellten Nucleotidsequenz,

(e) einer der Sequenz gemäß (d) im Rahmen der Degeneration des des genetischen Codes entsprechenden Nucleotidsequenz oder

(f) einer mit den Sequenzen gemäß (d) oder/und (c) unter stringenten Bedingungen hybridisierenden Nucleotidsequenz .

Ein bevorzugtes Beispiel für ein derartiges fusioniertes DNA- Molekül enthält jeweils einen oder mehrere Abschnitte aus den Adhäsingenen alpB (SEQ ID NO.l) und alpA (SEQ ID NO.3) . Die Länge dieser Abschnitte ist vorzugsweise mindestens 18 Nucleotide, besonders bevorzugt mindestens 30 Nucleotide und am meisten bevorzugt mindestens 60 Nucleotide.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Vektor, der mindestens eine Kopie eines erfindungsgemäßen DNA- Moleküls enthält. Dieser Vektor kann ein beliebiger prokaryontischer oder eukaryontischer Vektor sein, auf dem sich die erfindungsgemäße DNA-Sequenz vorzugsweise unter Kontrolle eines Expressionssignals (Promotor, Operator, Enhancer etc.) befindet. Beispiele für prokaryontische Vektoren sind chromosomale Vektoren, wie etwa Bakteriophagen (z. B. Bakteriophage λ) und extrachromosomale Vektoren, wie etwa Plasmide, wobei zirkuläre Plasmidvektoren besonders bevorzugt sind. Geeignete prokaryontische Vektoren sind z. B. bei Sambrook et al . , Supra, Kapitel 1 bis 4, beschrieben.

Andererseits kann der erfindungsgemäße Vektor auch ein eukaryontischer Vektor sein, z. B. ein Hefevektor oder ein für höhere Zellen geeigneter Vektor (z. B. ein Plasmidvektor, viraler Vektor, Pflanzenvektor) . Derartige Vektoren sind beispielsweise bei Sambrook et al, Supra, Kapitel 16, beschrieben.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Zelle, die mit einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Zelle eine prokaryontische Zelle, vorzugsweise eine gram-negative prokaryontische Zelle, besonders bevorzugt eine E. coli-Zelle. Andererseits kann die erfindungsgemäße Zelle jedoch auch eine eukaryontische Zelle sein, wie etwa eine Pilzzelle (z. B. Hefe) , eine tierische oder eine pflanzliche Zelle.

Die Erfindung betrifft auch ein Polypeptid, welches von einem erfindungsgemäßen DNA-Molekül codiert ist. Vorzugsweise besitzt das Polypeptid die Fähigkeit zur Adhärenz an humane Zellen und umfaßt (a) die in SEQ ID NO.2 dargestellte Aminosäuresequenz oder (b) eine mit der Sequenz gemäß (a) immunologisch kreuzreagierende Aminosäuresequenz .

Besonders bevorzugt weist das erfindungsgemäße Polypeptid eine Homologie von mindestens 80% und am meisten bevorzugt von mindestens 90% mit der in SEQ ID NO.2 dargestellten Aminosäuresequenz auf .

Die Herstellung von erfindungsgemäßen Polypeptiden erfolgt vorzugsweise dadurch, daß man eine Zelle mit einem erfindungs¬ gemäßen DNA-Molekül oder Vektor transformiert, die transformierte Zelle unter Bedingungen kultiviert, bei denen eine Expression des Polypeptids stattfindet und das Polypeptid aus der Zelle oder/und aus dem Kulturüberstand isoliert. Dabei kann das erfindungsgemäße Polypeptid sowohl als Fusionspolypeptid als auch als Nicht-Fusionspolypeptid gewonnen werden. Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Fusionspolypeptide, die jeweils einen oder mehrere Abschnitte aus den Polypeptiden AlpB (SEQ ID NO.2) und AlpA (SEQ ID NO.4) enthalten. Die Länge dieser Abschnitte beträgt mindestens 6, vorzugsweise mindestens 10 und besonders bevorzugt mindestens 20 Aminosäuren.

Da das AlpB-Protein einen funktioneil aktiven Komplex mit dem in DE 195 21 312.2 offenbarten AlpA-Protein bilden kann, betrifft die vorliegende Erfindung auch einen Polypeptidkomplex, der mindestens zwei Polypeptidkomponenten enthält, wobei die erste Komponente codiert ist von der alpB- Sequenz oder einer davon abgeleiteten Sequenz und wobei die zweite Komponente codiert ist von der alpA-Sequenz oder einer davon abgeleiteten Sequenz, insbesondere von einem DNA-Molekül, das

(d) die in SEQ ID NO.3 dargestellte Nucleotidsequenz,

(e) eine der Sequenz gemäß (d) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nucleotidsequenz oder

(f) eine mit den Sequenzen gemäß (d) oder/und (e) unter stringenten Bedingungen hybridi ierende Nucleotidsequenz umfaßt .

Vorzugsweise umfaßt das zweite Polypeptid, d.h. AlpA-Komponente des Komplexes, die in SEQ ID NO.4 dargestellte Aminosäuresequenz, eine mit dieser Sequenz mindestens 80% und vorzugsweise mindestens 90% homologe Aminosäuresequenz oder eine mit diesen Sequenzen immunologisch kreuzreagierende Aminosäuresequenz .

Das erfindungsgemäße Polypeptid AlpB oder Teile davon können als Immunogen zur Herstellung von Antikörpern verwendet werden. Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch einen Antikörper, der gegen ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder einen erfindungsgemäßen Komplex gerichtet ist. Vorzugsweise ist der Antikörper gegen den N-Terminus, z. B. die ersten 340 und insbesondere die 250 Aminosäuren der in SEQ ID NO.2 dargestellten Aminosäuresequenz gerichtet .

Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung, die als Wirkstoff ein erfindungsgemäßes DNA-Molekül, ein erfindungsgemäßes Polypeptid, einen erfindungsgemäßen Polypeptidkomplex oder einen erfindungsgemäßen Antikörper, gegebenenfalls zusammen mit üblichen pharmazeutischen Hilfs-, Verdünnungs- , Zusatz- und Trägermitteln enthält .

Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann einerseits zur Diagnostik einer Helicobacter pylori-Infektion verwendet werden. Die Diagnostik auf Nucleinsäureebene erfolgt vorzugsweise durch Verwendung von Hybridisierungs-sonden, welche eine erfindungsgemäße, für das alpB-Gen spezifische DNA- Sequenz enthalten, oder durch Amplifikation unter Verwendung erfindungsgemäßer DNA-Moleküle als Primer. Auf Proteinebene erfolgt die Diagnostik vorzugsweise mit Hilfe der erfindungsgemäßen Antikörper.

Andererseits kann die pharmazeutische Zusammensetzung auch zur Prävention oder Bekämpfung einer Helicobacter pylori-Infektion verwendet werden. Vorzugsweise werden für therapeutische Anwendungen das AlpB-Polypeptid oder Teile davon gegebenenfalls zusammen mit dem AlpA-Polypeptid oder Teilen davon zur Herstellung eines aktiven Impfstoffs oder der Antikörper zur Herstellung eines passiven Impfstoffs verwendet .

Weiterhin soll die Erfindung durch die nachfolgenden Beispiele und Abbildungen erläutert werden.

Abb. 1 zeigt eine Restriktionskarte des Plasmids pMul40, welches die regulatorische Region und das 5' -Ende des alpA-Gens (SEQ ID NO.3) enthält. Das alpA-Gen wird durch Insertion des Transposons TnMax9 inaktiviert (siehe Dreieck mit Beschriftung TnMax9) . Bei Expression des Plasmids wird ein alpA-ß-Lactamase- Fusionsprotein erhalten. pMul40 ist der ursprüngliche Klon aus der Mutanten-Genbank, aus dem durch Retransformation und homologe Rekombination der adhärenzdefekte H. pylori-Stamm Pl-140 erhalten wurde.

Abb. 2 zeigt eine Restriktionskarte des Plasmids pMT5, welches einen Teil des alpA-Gens und das gesamte alpB-Gen (SEQ ID NO.l) enthält. Der Replikations- ursprung ori_fd und das Chloramphenicol-Transferase Gen cat_GC aus dem Transposon TnMax9 wurden zur selektiven Rückklonierung des mutierten alpA-Genlocus und der flankierenden alpB-Genregion benutzt. Res bedeutet die Resolution site von TnMax9 und die IR die invertierten Repeats des Transposons. M13-FP und M13- RP1 bedeuten Bereiche, welche die Sequenzen der M13- FORWARD bzw. -REVERSE Sequenzier-Primer enthalten. Die Polylinker-Region zwischen den Klonierungsstellen Sacl und StuI stammt aus dem Plasmid pBluescript II KS.

Abb. 3 zeigt einen einen Aminosäuresequenzvergleich der Adhäsine AlpA und AlpB. (A) Der Sequenzvergleich wurde mit dem GCG-Programm BESTFIT durchgeführt

(Devereux et al . , 1984) und umfaßt die gesamten Polypeptide AlpA und AlpB. Senkrechte Striche bedeuten identische Aminosäuren; Punkte zeigen konservative Aminosäureaustausche an. Der Grad der Ähnlichkeit bzw. Identität zwischen beiden Sequenzen ist am Ende der Sequenz angegeben. (B) Ein signifikant höherer Identitätsgrad ist in der C- terminalen Region beider Polypeptide festzustellen

(Position 341-518) , die vermutlich für die Integration der Proteine in die äußere Bakterienmembran verantwortlich ist. Typisch ist auch die C-terminale Region von fünf Aminosäuren, die mit einem Phenylalanin (F) endet, was bei einem sekretierten Protein eines gramnegativen Bakteriums auf eine Insertion in die äußere Membran hinweist (Struyve et al . , 1991) .

SEQ ID NO.l zeigt die Nucleotidsequenz des H. pylori- Adhärenzgens alpB und die entsprechende Aminosäuresequenz .

SEQ ID NO.2 zeigt die Aminosäuresequenz des AlpB- Adhärenzpolypeptids aus H. pylori.

SEQ ID NO.3 zeigt die Nucleotidsequenz des H. pylori- Adhärenzgens alpA und die entsprechende Aminosäuresequenz .

SEQ ID NO.4 zeigt die Aminosäuresequenz des AlpA- Adhärenzpolypeptids aus H. pylori.

Beispiel 1

Herstellung einer H. pylori-Plasmid-Genbank

Es wurde eine Plasmidgenbank von der chromosomalen DNA des H. pylori-Wildtyp Stammes 69A angelegt. Dazu wurde die chromosomale DNA nach der Methode von Leying et al . ( 1992) aus H. pylori isoliert und mit den Restriktionsendonukleasen Sau3AI und Hpall jeweils partiell gespalten. Anschließend wurden die DNA-Fragmente auf einem präparativen Agarosegel aufgetrennt und Fragmente von 3 - 6 kb wurden aus dem Gel eluiert . Diese DNA-Fragmente wurden in den speziell dafür konstruierten Plasmidvektor pMin2, der mit den Restriktionsenzymen Bglll und Clal geschnitten war, ligiert (T4-Ligase) und der Ligationsansatz wurde in den E. coli-Stamm E181, ein den lysogenen λ-Phagen XCH616 enthaltendes Derivat des Stammes HB101 (Bayer und Roulland-Dussoix, 1969) transformiert, der bereits mit dem Transposon TnMax9 transformiert war. Dabei wurden ca. 2400 unabhängige Transformanden erhalten. Der den Minimalvektor pMin2 enthaltende E.coli Stamm DH5α ist bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) , Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, unter dem Aktenzeichen 10007 hinterlegt. Der das Transposon-Derivat pTnMax9 enthaltende E.coli Stamm E 181 ist bei DSM unter dem Aktenzeichen 10008 hinterlegt.

Beispiel 2

Isolierung von H. pylori-Mutanten

Zur Durchführung der Transposon-Mutagenese wurden jeweils 10 Transformanden vereinigt und gemeinsam induziert, wodurch insgesamt 190 Pools ä 10-20 Klonen weiterbehandelt wurden. Aus dieser Mutagenese wurden 191 Ampicillin-resistente E. coli- Plasmidklone isoliert, die unabhängige mutierte H. pylori-Gene trugen. Diese 192 Plasmide wurden aus E. coli isoliert und zur Retransformation des H. pylori-Stammes 69A benutzt. Aus diesen 192 Transformationen wurden 135 H. pylori-Mutanten isoliert, die in Genen mutiert sein sollten die für sekretorische Proteine kodieren. Die H. pylori-Mutantenkollektion wurde dann in einem Screening Assay auf H. pylori-Mutanten getestet, die ihre Fähigkeit an KatoIII Epithelzellen zu binden, verloren hatten.

Hierzu wurden die Mutanten mit FITC markiert und 1 h bei 37 °C gemeinsam mit den Epithelzellen kultiviert. Der Test auf Adhärenz erfolgte direkt durch Betrachtung mit einem Fluoreszenzmikroskop. Dabei wurden 2 Mutanten gefunden (Nr. Pl- 140 und Pl-179a) , die eine stark verminderte Adhärenz zeigten.

Beide Mutanten zeigten auch in dem zweiten Adhärenz-Modell, den Gewebeschnitten von menschlichen Magen, keine Adhärenz. Der H. pylori-Wildtyp-Stamm sowie alle weiteren Mutanten zeigten auch in diesem Modell eine starke Adhärenz.

Das zur Erzeugung des Mutantenstammes Pl-140 verwendete Plasmid pMul40 ist in Abb. 1 dargestellt. Zur Erzeugung des Mutanten¬ stammes Pl-179a wurde das Plasmid pMul79a (nicht gezeigt) ver¬ wendet. Unabhängige Transformationen beider Plasmide in H. pylori 69A führten zu dem identifizierten Adhärenzdefekt, was belegte, daß keine sekundären Mutationen im bakteriellen Chromosom aufgetreten waren, sondern die TnMax9 Insertion im klonierten Adhäsingen zu dem beobachteten Phänotyp der H. pylori-Mutanten führte. Die Kartierung und Sequenzierung der durch das Transposon TnMax9 inaktivierten Gene der Plasmidklone pMul40 und pMul79 zeigte, daß es sich bei beiden Klonen um dasselbe Gen handelte, das Transposon war nur an verschiedenen Stellen insertiert. Da es sich bei dem kodierten Protein um ein Lipoprotein handelt, also ein Protein, das mit einem Lipidanker in der Membran verankert ist, bezeichneten wir das entsprechende Gen als AlpA, adherence- associated lipoprotein A) . Unsere Daten aus Computer-Sekundärstrukturvorhersagen von Membranproteinen und von bestimmten konservierten Proteinsequenzen am C-Terminus des Proteins (C-terminales Phenylalanin) (Struyve et al . , 1991) sprechen für ein in die äußere Membran der gramnegativen Bakterien eingelagertes integrales Membranprotein.

Beispiel 3

Identifizierung des alpB-Adhärenzgens

Im Zuge der genetischen Charakterisierung des alpA-Genlocus wurden die flankierenden genomischen Sequenzen in E. coli kloniert und sequenziert. Die Klonierung der stromabwärts gelegenen alpA-flankierenden Region erfolgte über die Rückklonierung der TnMax9-Insertion vom Chromosom aus H. pylori. Chromosomale DNA der Mutante Pl-179a (siehe Beispiel 2) wurde mit den Restriktionsendonukleasen Sacl und StuI geschnitten, die enstandenen DNA-Fragmente zusammen mit einem Sacl-HincII-Fragment aus dem Polylinker des Plasmids pBluescript II KS unter Verwendung von T4-Ligase zirkularisiert und in kompetente E. coli E131 Zellen transformiert, wobei eine Selektion auf Chloramphenicol erfolgte.

Alle erhaltenen Transformanten sollten das mutierte alpA-Gen enthalten und flankierende Sequenzen aufweisen, da die Replikation und Propagierung nur über den chromosomal durch TnMax9 inserierten Replikationsursprung ori_fd und durch das auf TnMax9 lokalisierte Chloramphenicol-Resistenzgen erfolgen konnten. Eines der erhaltenen rekombinanten Plasmide pMT5 (Abb. 2) wurde weiter analysiert.

Eine Sequenzierung von pMT5 und davon hergestellten Subklonen zeigt im Anschluß an das alpA-Gen (67 Nucleotide nach Stopcodon) den Start eines weiteren offenen Leserasters, welcher für ein Polypeptid von 518 Aminosäuren codiert und als alpB bezeichnet wurde (SEQ ID NO.l und 2) . Aufgrund der genetischen Organisation kann man von einem Operon ausgehen und vermutlich werden alpA und alpB von einem einzigen Promotor aus transkribiert (polycystronische mRNA) .

Das AlpB-Genprodukt weist exakt die gleiche Anzahl an Aminosäuren auf wie AlpA. Eine Analyse der N-terminalen Region der AlpB-Polypeptidsequenz liefert Hinweise auf das Vorhandensein einer klassischen prokaryontischen Signalsequenz, was auf ein sekretorisches Polypeptid hinweist . Ein Vergleich auf Aminosäureebene zwischen AlpA und AlpB zeigt eine Identität über das gesamte Polypeptid von 46%. Der C-terminale Teil (Aminosäuren 341-518) zeigt eine Identität von 66% (Abb. 3) .

Beispiel 4

Funktionieller Zusammenhang der Adhärenzgene AlpA und AlpB

Um einen funktionellen Zusammenhang zwischen AlpA und AlpB zu untersuchen, wurden zwei TnMax9 Transposon-Insertionen an verschiedenen Positionen in das alpB-Gen eingeführt (Pos. 97 und Pos. 1108) und durch natürliche Transformation ins Genom von H. pylori 69a transferiert. Die korrekte Insertion des Transposons in das H. pylori Chromosom und damit die Inaktivierung des alpB-Gens wurde durch Southern-Blot- Hybridisierung verifiziert.

Die resultierenden alpB-Defektmutanten wurden auf ihre Fähigkeit zur Bindung an Magenepithellzellen analysiert. Es wurde gefunden, daß beide alpB-Mutanten keine Bindung an Magenepithellzellen aus Gewebeschnitten zeigten.

Die stabile Expression von AlpA in der alpB-Mutante konnte durch einen Immunoblot nachgewiesen werden. Damit ist gezeigt, daß AlpB direkt für den Adhärenzdefekt der alpB-Mutante verantwortlich ist. Aufgrund der Strukturvorhersage und der hohen Homologie im C-terminalen Bereich beider Polypeptide kann man annehmen, daß auch AlpB in die äußere bakterielle Membran insertiert vorliegt und gegebenenfalls mit AlpA einen Komplex bilden kann. Dieser Komplex kann als heterodimeres oder multimeres Aggregat als funktionelles Adhäsin wirksam sein, während der Verlust einer Untereinheit, sei es AlpA oder AlpB, bereits zum Funktionsverlust des Adhäsin-Komplexes und damit ggf . zum Adhärenzdefekt der Bakterien führt .

Literatur

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Warren, J.R., Marshall, B. (1983) Unidentified curved bacilli on gastric epithelium in active chronic gastritis . Lancet i : 1273- 1275.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:

(i) ANMELDER:

(A) NAME: Max-Planck-Gesellschaft zur Foerderung der

Wissenschaften e.V. Berlin

(B) STRASSE: Hofgartenstr. 2

(C) ORT: Muenchen

(E) LAND: Deutschland

(F) POSTLEITZAHL: 80539

(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Neues Adhaesin aus Helicobacter pylori

(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 4

(iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:

(A) DATENTRÄGER: Floppy disk

(B) COMPUTER: IBM PC compatible

(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS

(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.30

(EPA)

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 1557 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: beides

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA

(vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:

(A) ORGANISMUS: Helicobacter pylori

(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:

(B) CLON(E) : alpB

(ix) MERKMAL:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS

(B) LAGE:1..1554

( xi ) SEQUENZBESCHREIBUNG : SEQ ID NO : 1 :

ATG ACA CAA TCT CAA AAA GTA AGA TTC TTA GCC CCT TTA AGC CTA GCG 48

Met Thr Gin Ser Gin Lys Val Arg Phe Leu Ala Pro Leu Ser Leu Ala 1 5 10 15

TTA AGC TTG AGC TTC AAT CCA GTG GGC GCT GAA GAA GAT GGG GGC TTT 96

Leu Ser Leu Ser Phe Asn Pro Val Gly Ala Glu Glu Asp Gly Gly Phe 20 25 30 ATG ACC TTT GGG TAT GAA TTA GGT CAG GTG GTC CAA CAA GTG AAA AAC 144 Met Thr Phe Gly Tyr Glu Leu Gly Gin Val Val Gin Gin Val Lys Asn 35 40 45

CCG GGT AAA ATC AAA GCC GAA GAA TTA GCC GGC TTG TTA AAC TCT ACC 192 Pro Gly Lys Ile Lys Ala Glu Glu Leu Ala Gly Leu Leu Asn Ser Thr 50 55 60

ACA ACA AAC AAC ACC AAT ATC AAT ATT GCA GGC ACA GGA GGC AAT GTC 240 Thr Thr Asn Asn Thr Asn Ile Asn Ile Ala Gly Thr Gly Gly Asn Val 65 70 75 60

GCC GGG ACT TTG GGC AAC CTT TTT ATG AAC CAA TTA GGC AAT TTG ATT 288 Ala Gly Thr Leu Gly Asn Leu Phe Met Asn Gin Leu Gly Asn Leu Ile 85 90 95

GAT TTG TAT CCC ACT TTG AAC ACT AGT AAT ATC ACA CAA TGT GGC ACT 336 Asp Leu Tyr Pro Thr Leu Asn Thr Ser Asn Ile Thr Gin Cys Gly Thr 100 105 110

ACT AAT AGT GGT AGT AGT AGT AGT GGT GGT GGT GCG GCC ACA GCC GCT 384 Thr Asn Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Gly Gly Ala Ala Thr Ala Ala 115 120 125

GCT ACT ACT AGC AAT AAG CCT TGT TTC CAA GGT AAC CTG GAT CTT TAT 432 Ala Thr Thr Ser Asn Lys Pro Cys Phe Gin Gly Asn Leu Asp Leu Tyr 130 135 140

AGA AAA ATG GTT GAC TCT ATC AAA ACT TTG AGT CAA AAC ATC AGC AAG 480 Arg Lys Met Val Asp Ser Ile Lys Thr Leu Ser Gin Asn Ile Ser Lys 145 150 155 160

AAT ATC TTT CAA GGC AAC AAC AAC ACC ACG AGC CAA AAT CTC TCC AAC 528 Asn Ile Phe Gin Gly Asn Asn Asn Thr Thr Ser Gin Asn Leu Ser Asn 165 170 175

CAG CTC AGT GAG CTT AAC ACC GCT AGC GTT TAT TTG ACT TAC ATG AAC 576 Gin Leu Ser Glu Leu Asn Thr Ala Ser Val Tyr Leu Thr Tyr Met Asn 180 185 190

TCG TTC TTA AAC GCC AAT AAC CAA GCG GGT GGG ATT TTT CAA AAC AAC 624 Ser Phe Leu Asn Ala Asn Asn Gin Ala Gly Gly Ile Phe Gin Asn Asn 195 200 205

ACT AAT CAA GCT TAT GGA AAT GGG GTT ACC GCT CAA CAA ATC GCT TAT 672 Thr Asn Gin Ala Tyr Gly Asn Gly Val Thr Ala Gin Gin Ile Ala Tyr 210 215 220

ATC CTA AAG CAA GCT TCA ATC ACT ATG GGG CCA AGC GGT GAT AGC GGT 720 Ile Leu Lys Gin Ala Ser Ile Thr Met Gly Pro Ser Gly Asp Ser Gly 225 230 235 240

GCT GCC GCA GCG TTT TTG GAT GCC GCT TTA GCG CAA CAT GTT TTC AAC 768 Ala Ala Ala Ala Phe Leu Asp Ala Ala Leu Ala Gin His Val Phe Asn 245 250 255

TCC GCT AAC GCC GGG AAC GAT TTG AGC GCT AAG GAA TTC ACT AGC TTG 816 Ser Ala Asn Ala Gly Asn Asp Leu Ser Ala Lys Glu Phe Thr Ser Leu 260 265 270

GTG CAA AAT ATC GTC AAT AAT TCT CAA AAC GCT TTA ACG CTA GCC AAC 864 Val Gin Asn Ile Val Asn Asn Ser Gin Asn Ala Leu Thr Leu Ala Asn 275 280 285 AAC GCT AAC ATC AGC AAT TCA ACA GGC TAT CAA GTG AGC TAT GGC GGG 912 Asn Ala Asn Ile Ser Asn Ser Thr Gly Tyr Gin Val Ser Tyr Gly Gly 290 295 300

AAT ATT GAT CAA GCG CGA TCT ACC CAA CTA TTA AAC AAC ACC ACA AAC 960 Asn Ile Asp Gin Ala Arg Ser Thr Gin Leu Leu Asn Asn Thr Thr Asn 305 310 315 320

ACT TTG GCT AAA GTT AGC GCT TTG AAT AAC GAG CTT AAA GCT AAC CCA 1008 Thr Leu Ala Lys Val Ser Ala Leu Asn Asn Glu Leu Lys Ala Asn Pro 325 330 335

TGG CTT GGG AAT TTT GCC GCC GGT AAC AGC TCT CAA GTG AAT GCG TTT 1056 Trp Leu Gly Asn Phe Ala Ala Gly Asn Ser Ser Gin Val Asn Ala Phe 340 345 350

AAC GGG TTT ATC ACT AAA ATC GGT TAC AAG CAA TTC TTT GGG GAA AAC 1104 Asn Gly Phe Ile Thr Lys Ile Gly Tyr Lys Gin Phe Phe Gly Glu Asn 355 360 365

AAG AAT GTG GGC TTA CGC TAC TAC GGC TTC TTC AGC TAT AAC GGC GCG 1152 Lys Asn Val Gly Leu Arg Tyr Tyr Gly Phe Phe Ser Tyr Asn Gly Ala 370 375 ^" 380

GGC GTG GGT AAT GGC CCT ACT TAC AAT CAA GTC AAT TTG CTC ACT TAT 1200 Gly Val Gly Asn Gly Pro Thr Tyr Asn Gin Val Asn Leu Leu Thr Tyr 385 390 395 400

GGG GTG GGG ACT GAT GTG CTT TAC AAT GTG TTT AGC CGC TCT TTT GGT 1248 Gly Val Gly Thr Asp Val Leu Tyr Asn Val Phe Ser Arg Ser Phe Gly 405 410 415

AGT AGG AGT CTT AAT GCG GGC TTC TTT GGG GGG ATC CAA CTC GCA GGG 1296 Ser Arg Ser Leu Asn Ala Gly Phe Phe Gly Gly Ile Gin Leu Ala Gly 420 425 430

GAT ACT TAC ATC AGC ACG CTA AGA AAC AGC TCT CAG CTT GCG AGC AGA 1344 Asp Thr Tyr Ile Ser Thr Leu Arg Asn Ser Ser Gin Leu Ala Ser Arg 435 440 445

CCT ACA GCG ACG AAA TTC CAA TTC TTG TTT GAT GTG GGC TTA CGC ATG 1392 Pro Thr Ala Thr Lys Phe Gin Phe Leu Phe Asp Val Gly Leu Arg Met 450 455 460

AAC TTT GGT ATC TTG AAA AAA GAC TTG AAA AGC CAT AAC CAG CAT TCT 1440 Asn Phe Gly Ile Leu Lys Lys Asp Leu Lys Ser His Asn Gin His Ser 465 470 475 480

ATA GAA ATC GGT GTG CAA ATC CCT ACG ATT TAC AAC ACT TAC TAT AAA 1488 Ile Glu Ile Gly Val Gin Ile Pro Thr Ile Tyr Asn Thr Tyr Tyr Lys 485 490 495

GCT GGC GGT GCT GAA GTG AAA TAC TTC CGC CCT TAT AGC GTG TAT TGG 1536 Ala Gly Gly Ala Glu Val Lys Tyr Phe Arg Pro Tyr Ser Val Tyr Trp 500 505 510

GTC TAT GGC TAC GCC TTC TAA 1557

Val Tyr Gly Tyr Ala Phe 515 ( 2 ) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 2 :

( i ) SEQUENZKENNZEI CHEN :

(A ) LÄNGE : 518 Aminosäuren

( B ) ART : Aminosäure ( D ) TOPOLOGIE : l inear

( i i ) ART DES MOLEKÜLS : Protein

( xi ) SEQUENZBESCHRE IBUNG : SEQ ID NO : 2 :

Met Thr Gin Ser Gin Lys Val Arg Phe Leu Ala Pro Leu Ser Leu Ala 1 5 10 15

Leu Ser Leu Ser Phe Asn Pro Val Gly Ala Glu Glu Asp Gly Gly Phe 20 25 30

Met Thr Phe Gly Tyr Glu Leu Gly Gin Val Val Gin Gin Val Lys Asn 35 40 45

Pro Gly Lys Ile Lys Ala Glu Glu Leu Ala Gly Leu Leu Asn Ser Thr 50 55 60

Thr Thr Asn Asn Thr Asn Ile Asn Ile Ala Gly Thr Gly Gly Asn Val 65 70 75 80

Ala Gly Thr Leu Gly Asn Leu Phe Met Asn Gin Leu Gly Asn Leu Ile 85 90 95

Asp Leu Tyr Pro Thr Leu Asn Thr Ser Asn Ile Thr Gin Cys Gly Thr 100 105 110

Thr Asn Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Gly Gly Ala Ala Thr Ala Ala 115 120 125

Ala Thr Thr Ser Asn Lys Pro Cys Phe Gin Gly Asn Leu Asp Leu Tyr 130 135 140

Arg Lys Met Val Asp Ser Ile Lys Thr Leu Ser Gin Asn Ile Ser Lys 145 150 155 160

Asn Ile Phe Gin Gly Asn Asn Asn Thr Thr Ser Gin Asn Leu Ser Asn 165 170 175

Gin Leu Ser Glu Leu Asn Thr Ala Ser Val Tyr Leu Thr Tyr Met Asn 180 185 190

Ser Phe Leu Asn Ala Asn Asn Gin Ala Gly Gly Ile Phe Gin Asn Asn 195 200 205

Thr Asn Gin Ala Tyr Gly Asn Gly Val Thr Ala Gin Gin Ile Ala Tyr 210 215 220

Ile Leu Lys Gin Ala Ser Ile Thr Met Gly Pro Ser Gly Asp Ser Gly 225 230 235 240

Ala Ala Ala Ala Phe Leu Asp Ala Ala Leu Ala Gin His Val Phe Asn 245 250 255

Ser Ala Asn Ala Gly Asn Asp Leu Ser Ala Lys Glu Phe Thr Ser Leu 260 265 270

Val Gin Asn Ile Val Asn Asn Ser Gin Asn Ala Leu Thr Leu Ala Asn 275 280 285 Asn Ala Asn Ile Ser Asn Ser Thr Gly Tyr Gin Val Ser Tyr Gly Gly 290 295 300

Asn Ile Asp Gin Ala Arg Ser Thr Gin Leu Leu Asn Asn Thr Thr Asn 305 310 315 320

Thr Leu Ala Lys Val Ser Ala Leu Asn Asn Glu Leu Lys Ala Asn Pro 325 330 335

Trp Leu Gly Asn Phe Ala Ala Gly Asn Ser Ser Gin Val Asn Ala Phe 340 345 350

Asn Gly Phe Ile Thr Lys Ile Gly Tyr Lys Gin Phe Phe Gly Glu Asn 355 360 365

Lys Asn Val Gly Leu Arg Tyr Tyr Gly Phe Phe Ser Tyr Asn Gly Ala 370 375 380

Gly Val Gly Asn Gly Pro Thr Tyr Asn Gin Val Asn Leu Leu Thr Tyr 385 390 395 400

Gly Val Gly Thr Asp Val Leu Tyr Asn Val Phe Ser Arg Ser Phe Gly 405 410 415

Ser Arg Ser Leu Asn Ala Gly Phe Phe Gly Gly Ile Gin Leu Ala Gly 420 425 430

Asp Thr Tyr Ile Ser Thr Leu Arg Asn Ser Ser Gin Leu Ala Ser Arg 435 440 445

Pro Thr Ala Thr Lys Phe Gin Phe Leu Phe Asp Val Gly Leu Arg Met 450 455 460

Asn Phe Gly Ile Leu Lys Lys Asp Leu Lys Ser His Asn Gin His Ser 465 470 475 480

Ile Glu Ile Gly Val Gin Ile Pro Thr Ile Tyr Asn Thr Tyr Tyr Lys 485 490 495

Ala Gly Gly Ala Glu Val Lys Tyr Phe Arg Pro Tyr Ser Val Tyr Trp 500 505 510

Val Tyr Gly Tyr Ala Phe 515

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3 :

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 1557 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: beides

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA

(vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:

(A) ORGANISMUS: Helicobacter pylori

(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:

(B) CLON(E) : alpA ( ix ) MERKMAL :

(A ) NAME/SCHLÜSSEL : CDS

(B ) LAGE . l . . 1554

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:

ATG ATA AAA AAG AAT AGA ACG CTG TTT CTT AGT CTA GCC CTT TGC GCT 48 Met Ile Lys Lys Asn Arg Thr Leu Phe Leu Ser Leu Ala Leu Cys Ala 520 525 530

AGC ATA AGT TAT GCC GAA GAT GAT GGA GGG TTT TTC ACC GTC GGT TAT 96 Ser Ile Ser Tyr Ala Glu Asp Asp Gly Gly Phe Phe Thr Val Gly Tyr 535 540 545 550

CAG CTC GGG CAA GTC ATG CAA GAT GTC CAA AAC CCA GGC GGC GCT AAA 144 Gin Leu Gly Gin Val Met Gin Asp Val Gin Asn Pro Gly Gly Ala Lys 555 560 565

AGC GAC GAA CTC GCC AGA GAG CTT AAC GCT GAT GTA ACG AAC AAC ATT 192 Ser Asp Glu Leu Ala Arg Glu Leu Asn Ala Asp Val Thr Asn Asn Ile 570 575 580

TTA AAC AAC AAC ACC GGA GGC AAC ATC GCA GGG GCG TTG AGT AAC GCT 240 Leu Asn Asn Asn Thr Gly Gly Asn Ile Ala Gly Ala Leu Ser Asn Ala 585 590 595

TTC TCC CAA TAC CTT TAT TCG CTT TTA GGG GCT TAC CCC ACA AAA CTC 288 Phe Ser Gin Tyr Leu Tyr Ser Leu Leu Gly Ala Tyr Pro Thr Lys Leu 600 605 610

AAT GGT AGC GAT GTG TCT GCG AAC GCT CTT TTA AGT GGT GCG GTA GGC 336 Asn Gly Ser Asp Val Ser Ala Asn Ala Leu Leu Ser Gly Ala Val Gly 615 620 625 630

TCT GGG ACT TGT GCG GCT GCA GGG ACG GCT GGT GGC ACT TCT CTT AAC 384 Ser Gly Thr Cys Ala Ala Ala Gly Thr Ala Gly Gly Thr Ser Leu Asn 635 640 645

ACT CAA AGC ACT TGC ACC GTT GCG GGC TAT TAC TGG CTC CCT AGC TTG 432 Thr Gin Ser Thr Cys Thr Val Ala Gly Tyr Tyr Trp Leu Pro Ser Leu 650 655 660

ACT GAC AGG ATT TTA AGC ACG ATC GGC AGC CAG ACT AAC TAC GGC ACG 480 Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Ile Gly Ser Gin Thr Asn Tyr Gly Thr 665 670 675

AAC ACC AAT TTC CCC AAC ATG CAA CAA CAG CTC ACC TAC TTG AAT GCG 528 Asn Thr Asn Phe Pro Asn Met Gin Gin Gin Leu Thr Tyr Leu Asn Ala 680 685 690

GGG AAT GTG TTT TTT AAT GCG ATG AAT AAG GCT TTA GAG AAT AAG AAT 576 Gly Asn Val Phe Phe Asn Ala Met Asn Lys Ala Leu Glu Asn Lys Asn 695 700 705 710

GGA ACT AGT AGT GCT AGT GGA ACT AGT GGT GCG ACT GGT TCA GAT GGT 624 Gly Thr Ser Ser Ala Ser Gly Thr Ser Gly Ala Thr Gly Ser Asp Gly 715 720 725

CAA ACT TAC TCC ACA CAA GCT ATC CAA TAC CTT CAA GGC CAA CAA AAT 672 Gin Thr Tyr Ser Thr Gin Ala Ile Gin Tyr Leu Gin Gly Gin Gin Asn 730 735 740 ATC TTA AAT AAC GCA GCG AAC TTG CTC AAG CAA GAT GAA TTG CTC TTA 720 Ile Leu Asn Asn Ala Ala Asn Leu Leu Lys Gin Asp Glu Leu Leu Leu 745 750 755

GAA GCT TTC AAC TCT GCC GTA GCC GCC AAC ATT GGG AAT AAG GAA TTC 768 Glu Ala Phe Asn Ser Ala Val Ala Ala Asn Ile Gly Asn Lys Glu Phe 760 765 770

AAT TCA GCC GCT TTT ACA GGT TTG GTG CAA GGC ATT ATT GAT CAA TCT 816 Asn Ser Ala Ala Phe Thr Gly Leu Val Gin Gly Ile Ile Asp Gin Ser 775 780 785 790

CAA GCG GTT TAT AAC GAG CTC ACT AAA AAC ACC ATT AGC GGG AGT GCG 864 Gin Ala Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Asn Thr Ile Ser Gly Ser Ala 795 800 805

GTT ATT AGC GCT GGG ATA AAC TCC AAC CAA GCT AAC GCT GTG CAA GGG 912 Val Ile Ser Ala Gly Ile Asn Ser Asn Gin Ala Asn Ala Val Gin Gly 810 815 820

CGC GCT AGT CAG CTC CCT AAC GCT CTT TAT AAC GCG CAA GTA ACT TTG 960 Arg Ala Ser Gin Leu Pro Asn Ala Leu Tyr Asn Ala Gin Val Thr Leu 825 830 835

GAT AAA ATC AAT GCG CTC AAT AAT CAA GTG AGA AGC ATG CCT TAC TTG 1008 Asp Lys Ile Asn Ala Leu Asn Asn Gin Val Arg Ser Met Pro Tyr Leu 840 845 850

CCC CAA TTC AGA GCC GGG AAC AGC CGT TCA ACG AAT ATT TTA AAC GGG 1056 Pro Gin Phe Arg Ala Gly Asn Ser Arg Ser Thr Asn Ile Leu Asn Gly 855 860 865 870

TTT TAC ACC AAA ATA GGC TAT AAG CAA TTC TTC GGG AAG AAA AGG AAT 1104 Phe Tyr Thr Lys Ile Gly Tyr Lys Gin Phe Phe Gly Lys Lys Arg Asn 875 880 885

ATC GGT TTG CGC TAT TAT GGT TTC TTT TCT TAT AAC GGA GCG AGC GTG 1152 Ile Gly Leu Arg Tyr Tyr Gly Phe Phe Ser Tyr Asn Gly Ala Ser Val 890 895 900

GGC TTT AGA TCC ACT CAA AAT AAT GTA GGG TTA TAC ACT TAT GGG GTG 1200 Gly Phe Arg Ser Thr Gin Asn Asn Val Gly Leu Tyr Thr Tyr Gly Val 905 910 915

GGG ACT GAT GTG TTG TAT AAC ATC TTT AGC CGC TCC TAT CAA AAC CGC 1248 Gly Thr Asp Val Leu Tyr Asn Ile Phe Ser Arg Ser Tyr Gin Asn Arg 920 925 930

TCT GTG GAT ATG GGC TTT TTT AGC GGT ATC CAA TTA GCC GGT GAG ACC 1296 Ser Val Asp Met Gly Phe Phe Ser Gly Ile Gin Leu Ala Gly Glu Thr 935 940 945 950

TTC CAA TCC ACG CTC AGA GAT GAC CCC AAT GTG AAA TTG CAT GGG AAA 1344 Phe Gin Ser Thr Leu Arg Asp Asp Pro Asn Val Lys Leu His Gly Lys 955 960 965

ATC AAT AAC ACG CAC TTC CAG TTC CTC TTT GAC TTC GGT ATG AGG ATG 1392 Ile Asn Asn Thr His Phe Gin Phe Leu Phe Asp Phe Gly Met Arg Met 970 975 980

AAC TTC GGT AAG TTG GAC GGG AAA TCC AAC CGC CAC AAC CAG CAC ACG 1440 Asn Phe Gly Lys Leu Asp Gly Lys Ser Asn Arg His Asn Gin His Thr 985 990 995 GTG GAA TTT GGC GTA GTG GTG CCT ACG ATT TAT AAC ACT TAT TAC AAA 1488 Val Glu Phe Gly Val Val Val Pro Thr Ile Tyr Asn Thr Tyr Tyr Lys 1000 1005 1010

TCA GCA GGG ACT ACC GTG AAG TAT TTC CGT CCT TAT AGC GTT TAT TGG 1536 Ser Ala Gly Thr Thr Val Lys Tyr Phe Arg Pro Tyr Ser Val Tyr Trp 1015 1020 1025 1030

TCT TAT GGG TAT TCA TTC TAA 1557

Ser Tyr Gly Tyr Ser Phe 1035

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 518 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure (D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:

Met Ile Lys Lys Asn Arg Thr Leu Phe Leu Ser Leu Ala Leu Cys Ala 1 5 10 15

Ser Ile Ser Tyr Ala Glu Asp Asp Gly Gly Phe Phe Thr Val Gly Tyr 20 25 30

Gin Leu Gly Gin Val Met Gin Asp Val Gin Asn Pro Gly Gly Ala Lys 35 40 45

Ser Asp Glu Leu Ala Arg Glu Leu Asn Ala Asp Val Thr Asn Asn Ile 50 55 60

Leu Asn Asn Asn Thr Gly Gly Asn Ile Ala Gly Ala Leu Ser Asn Ala 65 70 75 80

Phe Ser Gin Tyr Leu Tyr Ser Leu Leu Gly Ala Tyr Pro Thr Lys Leu 85 90 95

Asn Gly Ser Asp Val Ser Ala Asn Ala Leu Leu Ser Gly Ala Val Gly 100 105 110

Ser Gly Thr Cys Ala Ala Ala Gly Thr Ala Gly Gly Thr Ser Leu Asn 115 120 125

Thr Gin Ser Thr Cys Thr Val Ala Gly Tyr Tyr Trp Leu Pro Ser Leu 130 135 140

Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Ile Gly Ser Gin Thr Asn Tyr Gly Thr 145 150 155 160

Asn Thr Asn Phe Pro Asn Met Gin Gin Gin Leu Thr Tyr Leu Asn Ala 165 170 175

Gly Asn Val Phe Phe Asn Ala Met Asn Lys Ala Leu Glu Asn Lys Asn 180 185 190

Gly Thr Ser Ser Ala Ser Gly Thr Ser Gly Ala Thr Gly Ser Asp Gly 195 200 205

Gin Thr Tyr Ser Thr Gin Ala Ile Gin Tyr Leu Gin Gly Gin Gin Asn 210 215 220 Ile Leu Asn Asn Ala Ala Asn Leu Leu Lys Gin Asp Glu Leu Leu Leu 225 230 235 240

Glu Ala Phe Asn Ser Ala Val Ala Ala Asn Ile Gly Asn Lys Glu Phe 245 250 255

Asn Ser Ala Ala Phe Thr Gly Leu Val Gin Gly Ile Ile Asp Gin Ser 260 265 270

Gin Ala Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Asn Thr Ile Ser Gly Ser Ala 275 280 285

Val Ile Ser Ala Gly Ile Asn Ser Asn Gin Ala Asn Ala Val Gin Gly 290 295 300

Arg Ala Ser Gin Leu Pro Asn Ala Leu Tyr Asn Ala Gin Val Thr Leu 305 310 315 320

Asp Lys Ile Asn Ala Leu Asn Asn Gin Val Arg Ser Met Pro Tyr Leu 325 330 335

Pro Gin Phe Arg Ala Gly Asn Ser Arg Ser Thr Asn Ile Leu Asn Gly 340 345 350

Phe Tyr Thr Lys Ile Gly Tyr Lys Gin Phe Phe Gly Lys Lys Arg Asn 355 360 365

Ile Gly Leu Arg Tyr Tyr Gly Phe Phe Ser Tyr Asn Gly Ala Ser Val 370 375 380

Gly Phe Arg Ser Thr Gin Asn Asn Val Gly Leu Tyr Thr Tyr Gly Val 385 390 395 400

Gly Thr Asp Val Leu Tyr Asn Ile Phe Ser Arg Ser Tyr Gin Asn Arg 405 410 415

Ser Val Asp Met Gly Phe Phe Ser Gly Ile Gin U u Ala Gly Glu Thr 420 425 430

Phe Gin Ser Thr Leu Arg Asp Asp Pro Asn Val Lys Leu His Gly Lys 435 440 445

Ile Asn Asn Thr His Phe Gin Phe Leu Phe Asp Phe Gly Met Arg Met 450 455 460

Asn Phe Gly Lys Leu Asp Gly Lys Ser Asn Arg His Asn Gin His Thr 465 470 475 480

Val Glu Phe Gly Val Val Val Pro Thr Ile Tyr Asn Thr Tyr Tyr Lys 485 490 495

Ser Ala Gly Thr Thr Val Lys Tyr Phe Arg Pro Tyr Ser Val Tyr Trp 500 505 510

Ser Tyr Gly Tyr Ser Phe 515 BUDAPEST- VERTRAG UE≡R DIE INTERN ATfONAL . ^ERKENNUNG DER HINTERLEGUNG VCW MIKROORGAN, . .1EN TUR DIE ZWECKE VON PATENTVERFAHREN

INTERNATIONALES FORMBLATT

Max-Planck-Insεicut für 3ιoloσιe Spemannstr. 34

72075 Tübmσen EMPFANGSBESTÄTIGUNG BEI ERSTHINTERLEGUNG ausgestellt gemaO Regel 7 I von der unten angegebenen INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE

I KXNNZEICHNUNG DES MIKROORGANISMUS

Vom HINTERLEGER zugeteiltes Bezugszeichen Von der INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE zugeteilte EINGANGSNUMMER

DH5or (pMιn2 )

DSM 10007

II WISSENSCHAFTLICHE BESCHREIBUNG UND/ODER VORGESCHLAGENE TAXONOMISCHE BEZEICHNUNG

Mit dem unter 1 bezeichneten Mikroorganismus wurde

(X ) eine wissenschaftliche Beschreioung

(X ) eine vorgeschlagene taλonomische Bezeichnung eineereichL (Zutreffendes ankreuzen)

III EΓNGANG UND ANNÄHME

Diese intemationale Hinterlegungsstelle nimmt den unter I bezeichneten Mikroorganismus an der bei ihr am 1 9 9 D - 0 5 - 2 6 (Datum der Erslhinterlegung,)¹ eingegangen ist

IV EINGANG DES ANTRAGS AUF UMWANDLUNG

Der unter I bezeichnete Mikroorganismus ist bei diese- Internationalen Hinterlegungsstelle am eingegangen (Datum der Erslhinterlegung) und ein Antrag auf Umwandlung dieser Erslhinterlegung in eine Hinterlegung gemäß

Budapester Vervag ist am eingegangen (Datum des Eingangs des Antrags auf Umw andlung)

V INTERNATIONA LE HINTERLEGUNGSSTELLE

Name DSM-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Unιerschrιft(en) der zur Vertretung der internationalen Hinterlegungsstelle MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH befugten Person(en) oder des (der) von ihr ermächtigten Bediensteten

Anschrift Mascheroder Weg I b D-38 124 Braunschweig ^"^ ^-^"^T.

Datum 1995 - 05 - 3 1

' Falls Regel 6 4 Buchstabe d zutrifft, ist dies der Zeitpunkt, zu dem der Status einer iniernauonaien Hinterlegungsstelle erworben worden ist Foπnblaπ DSM-BP/4 (einzige Seite ) 07/94 BUDAPESTER VERTRAG ÜBER DIE INTERNATlΦNλ ^NERKENNUNG DER HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN FUR DIE ZWECKE VON PATENTVERFAHREN

INTERNATIONALES FORMBLATT

Max-Planck-Institut fur Biologie SDemannsrr. 34

72076 Tubingen LEBENSFAHIGKEITSBESCHEΓNIGUNG ausgestellt gemäß Regel 102 von der unten angegebenen INTERNATIONALEN HrNTERLEGUNGSSTELLE

Angabe des Datums der Ersthinterlegung Wenn eine erneute Hinterlegung oder eine Weiterleitung vorgenommen worden ist. Angabe des Datum. der jeweils letzten erneuten Hinterlegung oder Weiterleitung

In den in Regel 10 2 Buchstabe a Ziffer ιι und in vorgesehenen Fallen Angabe der letzten Lcbeπsf-higkeiuprufung

ZuircfTendes ankreuzen

Ausfüllen wenn die Angaben beantragt worden Sind und wenn die Ergebnisse der Prüfung negativ waren

formblaπ DSM-BP/9 (einzige Seite) 07/94 BUDAPESTER VERTRA G ÜBER DIE rNTΕRNkTtO_/NAn_ξ Ar ..rΛENNUNG DER HINTERLEGUNG VON MIKROORGAN1S FUR DIE ZWECKE VON PATENTVERFAHRJEN

INTERNATIONALES FORMBLATT

Max-Planck-Institut für Biologie Spemannstr. 34

72076 Tübingen EMPFANGSBESTÄTIGUNG BEI ERSTHINTERLEGUNG ausgestellt gemäß Regel 7 1 von der unten angegebenen INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE

I KENNZEICHNUNG DES MIKROORGANISMUS

Vom HINTERLEGER zugeteiltes Bezugszeichen Von der INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE zugeteilte ErNGANGSNUMMER.

E181 ( pTnMax9 )

DSM 10008

Mit dem unter I bezeichneten Mikroorganismus wurde

(X ) eine wissenschaftliche Beschreibung

(X ) eine vorgeschlagene taxonomische Bezeichnung etneereicht (Zutreffendes ankreuzen)

III EINGANG UND ANNAHME

Diese internationale Hinterlegungsstelle nimmt den unter I bezeichneten Mikroorganismus an der bei ihr am 1 9 9 5 - 0 5 - 2 6 (Datum der Erslhinterlegung)' eingegangen ist

IV EINGANG DES ANTRAGS AUF UMWANDLUNG

Der unter I bezeichnete Mikroorganismus ist bei dieser Iniernauonaien Hinterlegungsstelle am eingegangen (Damm der Erslhinterlegung) und ein Anuag auf Umwandlung dieser Erslhinterlegung in eine Hinterlegung gemäß

Budapester Vertrag ist am eingegangen (Datum des £ι-gangs des Antrags auf Umwandlung)

V INTERNATIONALE HINTERLEGUNGSSTELLE

Name DSM-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Unιerschπfι(en) der zur Vertretung der internationalen Hinterlegungsstelle MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH befugten Pcrsoπ(en) oder des (der) von ihr ermächtigten Bediensteten

Anschrift Mascheroder Weg I b DOS 124 Braunschweig

Datum 1995 - 05 - 3 1

' Falls Regel 6 4 Duchsube d zutrifft, 4SI dies der Zeitpunkt zu dem der Sutus einer internationalen Hinterlegungsstelle erworben worden isi Formblatt DSM-BP/4 (einzige Seite) 07/94 BUDAPESTER VERTRAG ÜBER DIE INTERN ATπlOrVAl JERXENNUNG DER HINTERLEGUNG VON MIKROORGAN ^•ΛEN FUR DIE ZWECKE VON PATENTVERFAHREN

INTERNATIONALES FORMBLATT

Max-Planck-Institut fur Biologie Soemannstr. 34

72076 Tübingen LEBENSFAHIGKEITSBESCHEINIGUNG ausgestellt gemSC Regel 10 2 von der unten angegebenen

INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE

I HINTERLEGER II KENNZEICHNUNG DES MIKROORGANISMUS

Name Max- Planck - Ins t ltut Von der INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE für Biologie zugeteilte EINGANGSNUMMER Anschrift Spemannstr . 34 DSM 10008

72076 Tübingen Datum der Hinterlegung oder Weiterleitung'

199 5 - 05 - 26

Hl LEBENSFAHIGKEITSBESCHEΓNIGUNG

Die Lebensfähigkeit des unter II genannten Mikroorganismus ist am 19 95 - 05 - 29 ' geprüft worden Zu diesem Zeitpunkt war der Mikroorganismus

(X)' lebensfähig

( )' nicht mehr lebensfähig

IV BEDINGUNGEN UNTER DENEN DIE LEBENSFAHIGK£rTSPRUFUNG DURCHGEFÜHRT WORDEN IST

V INTERNATIONALE HINTERLEGUNGSSTELLE

Name DSM-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Unterschrιfι(en) der zur Vertretung der internauonalen Hinterlegun-sstellc MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH befugten Pcrson(en) oder des (der) von ihr ermächtigten Bediensteten

Anschrift Mascheroder Weg I b D-38124 Braunschweig ^ *γ A~*J A %^_

Datum 1995 - 05 - 3 1

Angabe des Datums der Erslhinterlegung Wenn eine emeute Hinterlegung oder eine Weiterleitung vorgenommen worden ist Angabe des Datums der jeweils letzten erneuten Hinterlegung oder Weiterleitung

In den in Regel 10 2 Buchstabe a Ziffer n und in vorgesehenen Fallen Angabe der letzten Lcbensfalugkeiisprufung

Zutreffendes ankreuzen

Ausfüllen wenn die Angaben beantragt worden <ιnd und wenn die Ergebnisse der Prüfung negativ waren

formblatt DSM-BP/9 (einzige Seite) 07/94

Claims

Patentansprüche

1 . DNA-Molekül , dadurch gekennzeichnet , daß es

(a) die in SEQ ID NO.l dargestellte Nucleotidsequenz,

(c) eine mit den Sequenzen gemäß (a) oder/und (b) unter stringenten Bedingungen hybridisierende Nucleotidsequenz umfaßt.

2. DNA-Molekül nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es auf Nucleotidebene eine Homologie von mindestens 80% zu der in SEQ ID NO.l dargestellten Nucleotidsequenz aufweist .

3. DNA-Molekül nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Länge von mindestens 15 Nucleotiden aufweist.

4. DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es für ein Polypeptid mit der Fähigkeit zur Adhärenz an humane Zellen codiert.

5. DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4, das fusioniert ist mit

(d) der in SEQ ID NO.3 dargestellten Nucleotidsequenz,

(e) einer der Sequenz gemäß (d) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechenden Nucleotidsequenz oder

(f) einer mit den Sequenzen gemäß (d) oder/und (e) unter stringenten Bedingungen hybridisierenden Nucleotidsequenz .

6. Vektor, dadurch gekennzeichnet, daß er mindestens eine Kopie eines DNA-Moleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 5 enthält.

7. Zelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einem Vektor nach Anspruch 6 transformiert ist .

8. Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, daß es von einem DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5 codiert ist .

9. Polypeptid nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es

(a) die in SEQ ID NO.2 dargestellte Aminosäuresequenz,

(b) eine mit der Sequenz aus (a) mindestens 80% homologe Aminosäuresequenz,

(c) eine mit den Sequenzen gemäß (a) oder/und (b) immunologisch kreuzreagierende Aminosäuresequenz umfaßt .

10. Polypeptid nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß es die Fähigkeit zur Adhärenz an humane Zellen besitzt .

11. Polypeptidkomplex, enthaltend mindestens zwei Polypeptidkomponenten, wobei die erste Komponente codiert ist von einen DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und wobei die zweite Komponente codiert ist von einem DNA- ^" 40 ^"

Molekül, das

(d) die in SEQ ID NO.3 dargestellte Nucleotidsequenz,

(f) eine mit den Sequenzen gemäß (d) oder/und (e) unter stringenten Bedingungen hybridisierende Nucleotidsequenz umfaßt.

12. Komplex nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Komponente

(a) die in SEQ ID NO.4 dargestellte Aminosäuresequenz,

(b) eine mit der Sequenz (a) mindestens 80% homologe Aminosäuresequenz,

13. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Zelle mit einem DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5 cder einem Vektor nach Anspruch 6 transformiert, die transformierte Zelle unter Bedingungen kultiviert, bei denen eine Expression des Polypeptids stattfindet und das Polypeptid aus der Zelle oder/und dem Kulturüberstand isoliert.

14. Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 8 bis 10 als Immunogen zur Erzeugung von Antikörpern.

15. Antikörper gegen ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 8 bis 10 oder einen Komplex nach Anspruch 11 oder 12.

16. Antikörper nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß er gegen den N-Terminus der in SEQ ID NO.2 dargestellten Aminosäuresequenz gerichtet ist.

17. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Wirkstoff ein DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5, ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 8 bis 10, einen Polypeptidkomplex nach Anspruch 11 oder 12, oder einen Antikörper nach Anspruch 15 oder 16, gegebenenfalls zusammen mit üblichen pharmazeutischen Hilfs-, Verdünnungs- , Zusatz- und Trägermitteln enthält.

18. Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 17 zur Diagnostik einer Helicobacter pylori- Infektion.

19. Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 17 zur Herstellung eines Mittels für die Prävention oder Bekämpfung einer Helicobacter pylori- Infektion.